JPS5886100A - 人血漿中の血液凝固因子「あ」の定量測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は血漿中に含有される因子ｘｎ（前酵素）を因子
■ａ（酵素）に活性化し、因子■ａを酵素により分解性
の基質と直接反応させることにまり人血漿中の凝固因子
ｘｎ　’（−・−ゲマン因子）を定量的に測定するため
の方法に関する。

因子■は内因性血液凝固段階を活性化する第１の因子で
あるＯこの因子は凝固機構においてのみΦ゛要な役割を
はだすのではなく、カリクレインーキニンシステ、ムに
おいても、またフィブリツリシスシステムにおいても重
要な役割を果たすので、血漿中の因子を定量測定するこ
とができるということは重要なことである。今日、最も
多く使用されている測定法は、血漿試料をカオリンと共
に恒温保持することによりハーゲマン因子（Ｈａｇｅｍ
ａｎ−Ｆａｋｔｏｒ７）　　を最大に活性化し　“、活
性化混合−をノ・−ゲマンー因−子−欠乏血漿と共に恒
温保持し、−′定の時間後恒温保持した混合物にカルシ
ウムイオンを添加することによ１）カルシウム再添加を
行ない、カルシウム再添力［１混１合物の凝固時間を測
定する。凝固時間は試料中のハーゲマン因子の濃度の関
数には′ぼ等しい（例えば、０ｓｃａｒ　Ｄ、　Ｒａｔ
ｎｏｆｆ　著”　ＴｈｒＯｍｂＯ−ｓｉｓ　ａｎｄ　Ｂ
ｌｅｅｄｉｎｇＤｉｓｏｒｄｅｒｓ　”　　１９７１年
、Ｇｅｏｒｇ　Ｔｈｉｅｍｅ　Ｖｅｒｌａｇ社、ステユ
ットガルト、第２１５〜２１８頁参照）。この測定法の
欠点は長い反応段階の結果である値を測定するの〒、多
数の反応・ξラメーターに依存するということである。

入手困難なノ１−ゲマン因子−欠７血漿を較正曲線の作
成のために必要とするということもこの発明を困難にし
ている。

因子×■から生じた因子Ｘｌ１ａの酵素的活性を、一定
の色原体のトリペプチド誘導体を分解可能な基質として
使用することにより、血漿中で直接かつ定量的に測定す
ることができるということが判明した。

本発明による方法は、血漿を活性剤を処理することによ
Ｉ）血漿中に含有される因子■を因子０　　　　　　　
　　　　　。

〔式中、Ｒ１は酵素によＩ）脱離可能な色原体又は発螢
光団置換アミン基を表わし、Ｒ２は水素を、Ｒ３は炭素
原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又はベンジ
ル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキシルメチ
ル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基を、及びＲ４
及びＩ：Ｓ Ｒ５，は水素原子を表わすか、又はＲ２は水素原子を、
及びＲ４及びＲ５は一緒になって炭素原子数３又は４の
アルキレ／基を、“及びＲ３は前記のものを表わすか１
．又はＲ２及びＲ３は一緒になって炭素原子数３〜４の
アルキレ／基を表わしＲ４は水素を表わし、かつＲ５は
炭素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又はベ
ンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキシル
メチル基又は４−′ヒドロキシベンジルメチル基を表わ
す〕のトリペプチド誘導体又は該化合物と酸との塩と反
応させ、Ｘ［ｌａ内因子より酵素的にトリペプチド誘導
体から遊離した有色の又は螢光性分解生成物Ｒ１Ｈの量
を測光波、分光測光法又は螢光測光法で測定することを
特徴とする。

活性剤としては、ケファリン及びエラゲン酸を含有する
製剤又はカオリンを使用することができる。因子■の活
性化は有利に約０°Ｃ〒実施される。因子ｘｌｌａとト
リペプチド誘導体との反応は有利に大豆トリプシンイン
ヒビターの存在下に緩衝システム中でｐＨ７，４〜８．
０、有利に７．７で、かつイオン強度０．０２５〜０．
２、有利に０．０５　ｆｆｉ火施する。

トリペプチド誘導体の塩は鉱酸、例えばＨｅ／、ＨＢｒ
、　Ｈ２ＳＯ４父はＨ３ＰＯ４、又は有機酸、例えば蟻
酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、蓚酸、酒石
酸、安息香酸、フタル酸、三塩化酢酸又は三弗化酢酸と
の培１であってよい。

本発明によ１）使用したトリペプチド誘導体は自体公知
法で製造することができる。

前記一般式の中に）１例えば次の個々のトリペ２ＡｃＯ
Ｈ，Ｈ−Ｄ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｆ”ｐＮＡ、２Ａｃ
ＯＨ。

Ｈ−Ｄ−Ｂｕｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｆ−ｐＮＡ、２ＡｃＯＨ
，Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−（）ｌｙ−Ａｒ１ｔｌ−ｐＮＡ、２
ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｎｙａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｆ−ｐＮＡ
、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｆ−ｐＮ
Ａ、２Ａｃ（１Ｈ，Ｈ−Ｄ−Ｎ１８ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｒ
−ｐＮＡ、２ＡｃＯＨ。

Ｈ−Ｄ−１１ｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｆ−ｐＮＡ、　　２Ａｃ
ＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｒｒ−ｐＮＡ、　　
２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｔｙｒ＝Ｇｌｙ−ＡｒＳ’−ｐＮ
Ａ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｇｌｙ−Ａｒｒ−ｐ
ＮＡ。

２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ｇｌｙ−Ａｒ９−ｐＮＡ
、２ＡｃＯＨ，１−（−Ｄ−Ｐｈ８−Ｐｒｏ−Ａｒｙ−
ｐ、ＮＡ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒ
ｔ−ｐＮＡ、　　２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｐｒｏ
−Ａｒｆ！−ｐＮＡ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ｐ
ｒｏ−Ａｒｔ−ｐＮＡ。

２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−ＣＨＡ−Ｐｉｐ−Ａｒｙ−ｐＮＡ
、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−ＣＨＴ−Ｐｉｐ−Ａｒｆ−ｐＮ
Ａ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｆ−ｐ
ＮＡ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ａｒｔ−
ｐＮＡ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨＡ−Ａｒｆ
−ｐＮＡ。

２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｒｏ−ＯＨＴ−Ａｒｔ−ｐＮＡ
、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｉｐ−Ｐｈｅ−Ａｒｊ’−ｐ
ＮＡ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｉｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｆ−
ｐＮＡ、２ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｐｉｐ−ＯＨＡ−Ａｒｅ
’−ＰＮＡ　及び２Ａ　ｃ　ＯＨ・Ｈ−Ｄ−Ｐ　ｉ　ｐ
−ＯＨＴ−Ａｒｔ−ｐ　ＮＡ　。

前記の省略形は次の意味を有する： Ａｃ０Ｈ−酢酸 Ａｌａ　　＝　　アラニル Ａｒ％　　ニ　アルギニル Ｂｕｔ　　−α−アミノブチリル ＯＨＡ　　＝　　３−シクロヘキシル−アラニルＣ！Ｈ
Ｔ　　＝　　３−（４−ヒＰロキシシクロヘキシル）−
アラニル Ｇｌｙ　　ニ　グリシル エ１ｅ　　−イソロイシル Ｌｅｕ　　−ロイシル Ｎ１ｅｕ　　ニ　ノルロイシル Ｎｖａｌ−ニ　ノルバリル Ｐｈｅ　　−フェニルアラニル Ｐ　ｉ　ｐ　　−ピベコリノイル Ｐｒｏ　　二　ゾロリル ’Ｉ’ｙｒ　　−チロシル Ｖａｌ　　＝　バリル Ｄ−アミノ酸基についた２個のアミノ酸基はＬ−型であ
る。

前記トリペプチド誘導体は自体公知の化合物であす、こ
こでｐ−ニトロフェニルアミノ基は他の色原体又は発螢
光団置換アミン基、例えば１−カルセキシー２−ニトロ
−フェニル−（５）−アミノ基、１−スルホ−２−一ト
ローフェニル−（５）−アミノ基、β−ナフチルアミノ
基、４−゛メトキシーβ−ナフチルアミノ基、５−＝）
０−α−ナフチルアミノ基、キノニル−（５）−アミノ
基、８−ニトロ−キノニル−（５）−アミノ基、牛−メ
チル−クマリル−（７）−アミノ基又は１，３−ジ（メ
トキシ力ルゼニル）−フェニル−（５）−７ミノ基（５
−アミノ−イソフタル酸−ジメチルエステルから誘導）
と変換することもできる。

本発明方法の実施のために次のように行なう。

因子膚の含量を測定すべきクエン酸塩血漿を水性ケファ
リン及びエラゲン酸を含有する製剤■ 、例えばアクテア　　（Ａｃｔｉｎ■、ＤＡＤｌｎ社、
マイアミ、ＵＳＡ）又はケホテスト■（ｃｅｐｈＯｔｅ
ｓｔ、Ｆｉｒｍａ　Ｎｙｅｇａａｒｄ　＆　Ｃ○、ＡＳ
、　　オス口、ノルウェー）と混合し、この混合物を数
分間、有利に４分間低部、有利に０℃で恒温保持するこ
とにょ番）因子■を因子■ａに変換する。低温〒の作業
は、プラスマインヒビターα２−マクログロブリンとの
酵素コンプレックスの形成を抑制するために重要である
。この理由は基質として使用したトリペプチド誘導体を
このコンプレックスは酵素的に分解することができるが
、相応する遊離酵素より速硬がおそいのである。次いで
、得られた活性化混合物の部分量をテストシステムに加
える。このテストシステムは緩衝剤、例えばｐＨ７，４
〜８．０、有利に７．７及びイオン強度０．０２５〜０
．２、有利に０．０５であり、かつ大豆トリプシンイン
ヒビターを含有するトリスイミダゾール緩衝剤を前記ト
リペプチド誘導体の１つの水溶液及び活性剤（アクチン
又はケポテスト）の水溶液と混合し、かつトリペプチド
誘導体の分解を測定すべき温度で数分間、予備恒温保持
することにより製造した。次に、単位時間Ｉあた０遊離
する有色又は螢光性分解生成物のにを制光法、分光測光
法又は螢光測光法により測定する。分解生成物がｐ−ニ
トロアニリンである時、測定を有利に４０５　ｎｍ　　
で実施する。

テストシステム中に含有される大豆トリゾシンーインヒ
ピターは、因子■の因子Ｘ１ｌａへの活性化の際に同時
に活性化したプラスマーカリクレインを選択的に抑制す
ることにより、基質上ｔ７て使用したトリペプチド誘導
体に対するプラスマーカリクレインの酵素的作用を下げ
るという機能を有する。他方、大豆トリプシン−インヒ
ビターは因子Ｘ１ｌａに対し全く抑制作用を示さない。

Ａ・発明による測定法は従来公知の測定法に対し第くの
利点をもたらし、本発明による方法かつ因子ηｌを活性
化因子■ａにより直接測定することが可能であるかぎり
、その酵素活性を前記トリペプチド誘導体を用いて唯一
の工程で求めることができる。従来の方法においては因
子Ｘ［ｌａの活性は凝固時間を用いて間接的に測定する
。

凝固は因子Ｘ［ｌａにより惹起され、た内因性凝固段階
が完全に終了した後ではじめて生じる。比較可能な測定
値を得るためには、因子）Ｇｌａの凝固時間に対する影
響を調べ、かつこの目的のために較正曲線を描くために
必要な・・−ゲマンー因子−欠乏血漿を使用することが
必要である。最終測定結果が複雑に互いにかみあった酵
素的工程の経過後はし；めて得られる古い方法は多く゛
の調節不可能な欠陥源を有し、このことによ１）不正確
である。因子■を全く有さない欠乏血漿を得ることは非
常に困難である。今日、臨床実験室においては、分析を
迅速かつ正確で、なるべく人の手をわずられせない自動
分析機を使用する傾向にある。従来の方法は熟練した実
験者により時間のかかる方法で平定量的に実施すること
ができたが、本発明による測定法は前記のような自動分
析機に好適である。

本発明による方法は次の例中に記載した方法で実施する
ことができる。

ｐＨ７，７及びイオン強度０．０５の、ｌ罰あたｌ）大
豆トリプシンインヒビター０．１■を含有ス；、＋　）
リスイミダゾール緩衝液０．７５ｍｔ１２Ｘ　１０−３
モル２　ＡｃＯＨ，Ｈ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｆ−
ｐＮＡ水、浴液０．２５’ｍ／及び活性化水性ケファロ
プラステン試薬（Ａｃｔｉｎ■、ＤＡＤ］ｌｆ：社、マ
イアミ、ＵＳ４）０．２０ｍ／からなるテストシステム
を４分間３７゛（〕で予備恒温保持する。正常はクエン
酸塩血漿０．１ｍ／及び水性活性ケファロプラステン試
薬０９２　ｍｅを混合し、θ℃１４分間恒温保持して得
られた低温保持物質０．０５ｍ１を予備恒温保持物質に
力ρえる。両方の成分を混合した後、因子ｘＩｌａによ
りＪ離したｐ−ニトロアニリンの量を４０５−ｎｍ−で
分光測光法により５分間連続的に測定する。１分あたり
の光学密度の上昇から因子■ａの活性を血漿ｌｄあたり
の酵素単位で計算する。

この方法によ外ば、正常プラスマ中に１罰あた（）平均
して因子Ｘ１ｌａ　０．１５〜０．３０酵素単位が測定
される。因子■１分子は活性化の際に因子■ａ１分子を
供給するので、因子ｘ［ｌａにより求められた値は同時
にもともと血漿中に存在する因子■の量である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　血漿を活性剤で処理することにより、血漿中に含
   有さＡする因子■を因子■ａに変換し、因子ｘＩｌａを
   一般式： ％式％ 〔式中、Ｒは酵素によ（）脱離可能な色原体又は発螢光
   団置換アミン基を表わし、Ｒは水素原子を、Ｒ３は炭素
   原子数１〜４の直鎖又は−分枝鎖アルキル基、又はベン
   ジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキシルメ
   チル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基を、及びＲ
   ４及びＲ５は水素原子を表わすか、又はＲ２は水素原子
   を、及びＲ４及びＲ５は一緒になって炭素原子数３父は
   ４のアルキレン基を、及びＲ３は前記のものを表わすか
   、又はＲ２及びＲ３は一緒になって炭素原子数３〜４の
   アルキレン基を表わし、Ｒ４は水素を表わし、かつＲ５
   は炭素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又は
   ベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキシ
   ルメチル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基ヲ表わ
   す〕のトリペプチド誘導体又は該化合物と酸との塩と反
   応させ、■ａ内因子よ１】酵素的にトリペプチド誘導体
   から遊離した有色又は螢光性分解生成物Ｒ’　Ｈの量を
   測光法、分光測光法又は螢光測光法で測定することを特
   徴とする人血漿中の血液凝固因子■の定量測定法０ ２　活性剤としてケファリン及びエラゲン酸を含有する
   製剤又はカオリンを使用する特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３、　血漿を活性剤で処理することにより、血漿中にａ
   ′有される因子■を因子Ｘ１ｌａに変換し、因子Ｘ［Ｉ
   ａを一般式： １１１１ 〔式中、Ｒ１は酵素により脱離可能な色原体又は発螢光
   団置換アミン基を表わし　Ｒ２は水素原子を、Ｒ３は炭
   素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又はベン
   ジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキシルメ
   チル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基を、及びＲ
   ４及びＲ５は水素原子を表わすが、又はＲ２は水素原子
   を、及びＲ４及びＲ５は一緒になって炭素原子数３又は
   ４のアルキレン基を、及びＲ３は前記のものを表わすが
   、又・はＲ２及びＲ３は一緒になって炭素原子数３〜４
   のアルキレン基を表わし　Ｒ４は水素を表わし、かっＲ
   ５は炭素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又
   はベンジル基、ｐ−ヒドロキシベンノル基、シクロヘキ
   シルメチル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル＆４表
   わす〕のトリペプチド誘導体又は該化合物と酸との塩と
   大豆トリノシンインヒビターの存在下に反応させ、ｘＩ
   ｌａ因子により酵素的にトリペプチド誘導体から遊離し
   た有色の又は螢光性分解生成物Ｒ’Ｈの量を測光法、分
   光測光法又は螢光測光法で測定することを特徴とする人
   血漿中の血液凝固因子■の定量測定法Ｑ ４、　血漿を活性剤〒処理することにより、血漿中に含
   有される因子■を因子Ｘ１ｌａに変換し、因子Ｘｌｌ　
   ａを一般式： Ｃ式中、Ｒ１は酵素により脱離可能な色原体又は発螢光
   団置換アミノ基を表わし、Ｒ２は水素原子を、Ｒ３は炭
   素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又はベン
   ジル基、ｐ−ヒドロキシ４ンジル基、シクロへキビルメ
   チル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基を、及びＲ
   ４及びＲ５は水素原子を表わすか、又はＲ２−は水素原
   子を、及びＲ４及びＲ５は一緒になって炭素原子数３父
   は４のアルキレン基を、及びＲ３は前記のものを表わす
   か、又はＲ２及びＲ３は一緒になって炭素原子数３〜４
   のアルキレン基を表わし、Ｒ４は水素を表わし、かつＲ
   ５は炭素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又
   はぺ／ジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキ
   シルメチル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基ヲ表
   わ矛〕のトリペプチド誘導体又は該化合物と酸との塩と
   緩衝システム中でｐＨ７，４〜８゜０で、かつイオン強
   ［０，０２５〜０．２で反応させ、Ｘｌ１ａ因子により
   酵素的にトリペプチド誘導体から遊離した有色の又は螢
   光性分解生成物Ｒ’　Ｈの量を測光法、分光測光法又は
   螢光測光法で測定することを特徴とする人血漿中の血液
   凝固因子■の定量測定法。 ５　血漿を活性剤を用いて０℃１篤理することによＩ）
   、血漿中に含有される因子■を因子■ａに変換し、因子
   ｙＡａを一般式： ％式％ 〔式中、Ｒ１は酵素により脱離可能な色原体又は発螢光
   団置換アミン基を表わし、Ｒ２は水素原子を、Ｒ３は炭
   素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又はに／
   ジル基、ｐ−ヒドロキシベンジル基、シクロヘキシルメ
   チル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基を、及びＲ
   ４及びＲ５は水素原子を表わすか、又はＲ２は水素原子
   を、及びＲ４及びＲ５は一緒になって炭素原子数３又は
   ４のアルキレン基を、及びＲ３は前記のものを表わすか
   、又はＲ２及びＲ３は一緒になって炭素原子数３〜４の
   アルキレン基を表わし、Ｒ４は水素を表わし、かつＲ５
   は炭素原子数１〜４の直鎖又は分枝鎖アルキル基、又は
   ベンジル基、ｐ−ヒドロキシ４ンジル基、シクロヘキシ
   ルメチル基又は４−ヒドロキシベンジルメチル基ヲ表わ
   す〕のトリペプチド誘導体又は該化合物と酸との塩と反
   応させ、Ｘｎａ因子により酵素的にトリペプチド誘導体
   から遊離した有色の又は螢光性分解生成物Ｒ’Ｈの量を
   測光法、分光測光法又は螢光測光法で測定するこ七を特
   徴とする人血漿中の血液凝固因子店の定量測定法。 ６、式中、Ｒ’　　がｐ−ニトロフェニルアミノ基、ｌ
   −カルホキシー２−ニトロ−フェニル−（５）−アミノ
   基、ｌ−スルホ−２−ニトロ−フェニル−（５）−アミ
   ノ基、β−ナフチ。 ルアミノ基、４−メトキシ−β−ナフチルアミノ基、５
   −ニトロ−α−ナフチルアミノ基、キノニル−（５）−
   ７ミ／＆、８−ニトロ−キノニル−（５）−アミノ基、
   ４−メチル−クマリル−（７）−アミノ基又はｌ、３−
   シ（メトキシカル〜ゼニル）−フェニル−（５）−アミ
   ノ基（５−アミノ−イソフタル酸−ジメチルエステルか
   ら誘導）である特許請求の範囲＄１項記載の方法。