JP2011120584A - 不均一凝固試験 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a)i)試料、ii)試料中のタンパク質分解性凝固因子を直接的又は間接的に活性化するための薬剤、iii)活性化凝固因子のための少なくとも1つの切断部位を有する切断可能な基質、及び、iv)切断可能な基質が結合された又はインキュベーション中に結合される固相を含有してなる反応混合物を準備してインキュベートし;(b)固相を分離し;そして、(c)固相に結合されている未切断基質の量を測定する。
【選択図】図1
Description
a.下記のものを含有してなる反応混合物を準備してインキュベートする工程;
i.試料、
ii.試料中のタンパク質分解性凝固因子を直接的又は間接的に活性化するための薬剤、
iii.活性化凝固因子のための少なくとも1つの切断部位を有する切断可能な基質、及び
iv.切断可能な基質が結合されているか又はインキュベーション中に結合される固相;
b.固相を分離する工程;並びに
c.固相に結合されている未切断基質の量を測定する工程、
を備える方法によって解決される。
−固相に結合されていない切断可能な基質、例えば合成ペプチド又は精製タンパク質、が反応混合物に添加される個別の試薬に存在していてもよい。その場合、反応混合物は、インキュベーション中に切断可能な基質が結合される固相を含有してなる。
−切断可能な基質、例えば合成ペプチド又は精製タンパク質、が既に固相に結合されており、固相と一緒に固相の構成要素として、試料及びタンパク質分解性凝固因子の活性化のための薬剤に、接触させられる。
−切断可能な基質が、試料中に天然に含有された、活性化凝固因子のための天然基質であり、これにより試料材料の構成要素として試料と共に反応混合物に供給される。その場合、反応混合物は、インキュベーション中に切断可能な天然基質が結合される固相を含有してなる。
以下の工程:
a.下記のものを含有してなる反応混合物を準備してインキュベートする工程;
i.試料、
ii.測定すべき抗凝固剤によって直接的又は間接的にその活性が影響を受ける、反応混合物に添加される個別の試薬中に存在する、一定量の活性化凝固因子、
iii.活性化凝固因子のための少なくとも1つの切断部位を有する切断可能な基質、及び
iv.切断可能な基質が結合されているか又はインキュベーション中に結合される固相;
b.固相を分離する工程;並びに
c.固相に結合されている未切断基質の量を測定する工程;
を備える方法によって解決される。
−測定すべき抗凝固剤によってその活性が直接的又は間接的に影響を受ける一定量の活性化凝固因子が使用され、ここで、活性化凝固因子は、反応混合物に添加される個別の試薬中に存在しており、
−従って、反応混合物は、タンパク質分解性凝固因子を活性化するための薬剤を含有する必要がない、
点を別として、タンパク質分解性凝固因子を測定するための方法の実施についての上記説明は、抗凝固剤を定量的に測定するための本発明に係る方法にも当てはまる。
先ず、マイクロタイタープレート(Nunc−Thermofisher、ロスキルデ、デンマーク)がモノクロナールFLAGエピトープ特異的抗体(MAK M2、Sigma Aldrich、ミュンヘン、ドイツ)でコーティングされた。引き続き、7つのアミノ酸残基、具体的には、ロイシン、バリン、プロリン、アルギニン、グリシン、フェニルアラニン及びグリシン、をこの配列で含有し、アミノ末端にFLAG−Tagエピトープを有しかつカルボキシ末端がビオチン化されている、トロンビン特異的ペプチド基質が、固相に結合されている抗FLAG抗体で、インキュベートされ、こうして固相に結合された。次いで、下記試薬が、各ウエルに下記順序で、添加された。
結果を図1に示す。
実施例1に述べたように、7つのアミノ酸残基を含有し、アミノ末端にFLAG−Tagエピトープを有し且つカルボキシ末端がビオチン化されたトロンビン特異的ペプチド基質が、抗FLAG抗体を介して固相(マイクロタイタープレート)に結合された。
50μlのフィブリン凝集阻害剤溶液(アミノ酸残基のグリシン、プロリン、アルギニン、プロリン及びアラニンをこの配列で有する合成オリゴペプチド3mg/ml);
25μlの試料;
25μlのウシ−α−トロンビン溶液(4又は40IUウシ−α−トロンビン/ml、10KIE/mlアプロチニン、150mM/L NaCl、5mg/mlウシ血清アルブミン、10mg/mlマンニトール、5μg/mlヘキサジメトリンブロミド)。
結果を図2に示す。
Claims (15)
- 試料中のタンパク質分解性凝固因子の活性を測定するための方法であって、
a.下記のものを含有してなる反応混合物を準備してインキュベートする工程;
i.試料、
ii.前記試料中の前記タンパク質分解性凝固因子を直接的又は間接的に活性化するための薬剤、
iii.前記活性化凝固因子のための少なくとも1つの切断部位を有する切断可能な基質、及び
iv.前記切断可能な基質が結合された又はインキュベーション中に結合される固相;
b.前記固相を分離する工程;並びに
c.前記固相に結合されている未切断基質の量を測定する工程、
を備える方法。 - 前記切断可能な基質が、前記反応混合物に添加される個別の試薬内に、存在しており、前記反応混合物が、インキュベーション中に前記切断可能な基質が結合される固相を、有する請求項1記載の方法。
- 前記切断可能な基質が3〜150のアミノ酸残基から成るペプチドを含んでなる請求項2記載の方法。
- 前記切断可能な基質が前記活性化凝固因子及び前記試料の一構成要素のための天然基質であり、前記反応混合物がインキュベーション中に前記切断可能な基質が結合される固相を含有してなる、請求項1記載の方法。
- 前記反応混合物が、前記切断可能な基質が共有結合している固相を、含有してなる請求項1記載の方法。
- 前記切断可能な基質が第1の結合対A/Bの第1の結合相手Aを有し、前記固相が前記第1の結合対A/Bの第2の結合相手Bを有し、前記切断可能な基質が前記結合相手A及びBの結合によって前記固相に結合されているか又はインキュベーション中に結合される、請求項1記載の方法。
- 前記結合相手A及びBが、それらがFLAG−Tag/抗FLAG−Tag抗体、HIS−Tag/抗HIS−Tag抗体及びフルオレセイン/抗フルオレセイン抗体の群から選ばれる結合対A/Bを形成するように、選択されている請求項6記載の方法。
- 前記切断可能な基質が第2の結合対X/Yの第1の結合相手Xを有し、前記第2の結合対X/Yの前記第2結合相手Yがシグナル発生系の一構成要素と会合している、請求項1から7のいずれか1つに記載の方法。
- 前記結合相手X及びYが、それらがビオチン/アビジン及びビオチン/ストレプトアビジンの群から選ばれる結合対X/Yを形成するように、選択されている請求項8記載の方法。
- トロンボプラスチン、第IIa因子、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、第XIIa因子、活性化タンパク質C、ヘビ毒、負荷電リン脂質、カルシウムイオン、組織因子、シリカ、カオリン、エラグ酸及びセライトからなる群から選ばれる薬剤が、タンパク質分解性凝固因子の直接的又は間接的活性化に使用される請求項1から9のいずれか1つに記載の方法。
- 前記反応混合物にフィブリン凝集阻害剤が更に添加される請求項1から10のいずれか1つに記載の方法。
- 第II因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子及びタンパク質Cから成る群から選ばれるタンパク質分解性凝固因子の活性を測定するための請求項1から11のいずれか1つに記載の方法。
- 試料中の抗凝固剤を定量的に測定するための方法であって、
a.下記のものを含有してなる反応混合物を準備してインキュベートする工程;
i.試料、
ii.測定すべき抗凝固剤によって直接的又は間接的にその活性が影響を受ける、反応混合物に添加される個別の試薬中に存在する、一定量の活性化凝固因子、
iii.前記活性化凝固因子のための少なくとも1つの切断部位を有する切断可能な基質、及び
iv.前記切断可能な基質が結合されているか又はインキュベーション中に結合される固相;
b.前記固相を分離する工程;並びに
c.固相に結合されている未切断基質の量を測定する工程、
を備える方法。 - LMWヘパリン、HMWヘパリン、ヘパリン類似物質、直接的トロンビン阻害剤及び直接的第Xa因子阻害剤から成る群から選ばれる抗凝固剤を定量的に測定するための請求項13記載の方法。
- 前記反応混合物が、第IIa因子及び第Xa因子からなる群から選ばれる一定量の活性化凝固因子を、含有してなる請求項13記載の方法。
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