JPS5813148B2

JPS5813148B2 - Ｈ６４６−ｓｙ３物質及びその製造法

Info

Publication number: JPS5813148B2
Application number: JP51103224A
Authority: JP
Inventors: 近藤久雄; 大谷敏夫; 中村昭四郎; 梅沢浜夫
Original assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Current assignee: Microbial Chemistry Research Foundation
Priority date: 1976-08-31
Filing date: 1976-08-31
Publication date: 1983-03-11
Also published as: JPS5331601A

Description

【発明の詳細な説明】本発明はＨ６４６−ＳＹ３物質及びその製造法に関する
もので、より詳しくは本発明者らによって発見されたス
トレプトミセス属に属する新Ｈ６４６−ＳＹＢ株を栄養
培地に好気的に培養し、その培養物から採取したＨ６４
６−ＳＹ３物質及びその製造法に関するものである。

本発明で使用されるストレプトミセスＨ６４６−ＳＹ３
株は、本発明者らが広島県比婆郡東城町で採取した土壌
から分離したもので工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託済のものである（微工研菌寄第３６４３号）。

本菌株の菌学的性状は以下に示す通りである。

１．形態Ｈ６４６−ＳＹＢ株は顕微鏡下で基中菌糸より比較的長
い真直ぐな分枝の多い気菌糸を形成し、螺旋形成及び輪
生枝は認められない。

成熟した胞子鎖は１０個以上の胞子の連鎖を認め、胞子
の大きさは０．４〜０．７Ｘ１．３〜１．５ミクロン位
で胞子の表面は平滑である。

２．各種培地における生育状態色の記載において〔〕内に示す標準はコンテイナー・コ
ーポレーション・オブ・アメリカ（Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ
ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆＡｍｅｒｉｃａ）のカ
ラー・ハーモニイ・マニュアル（Ｃｏｌｏｒｈａｒｍｏ
ｎｙｍａｎｕａｌ）を用いた０（１）シュクロース・
硝酸塩寒天培地（２７℃培養）無色の発育上に茶白の気菌糸を着生し、溶解性色素は認
められない。

（２）グルコース・アスパラギン寒天培地（２７℃培養
）発育はうす黄、気菌糸は着生せず、溶解性色素は認めら
れない。

（３）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地
５、２７℃培養）無色の発育上に茶白〜うすだいたいの気菌糸を着生し、
溶解性色素は認められない。

（４）スターチ・無機塩寒天培地（ＩＳＰ培地４、２７
℃培養）黄茶（２ｐｉ，ＭｕｓｔａｒｄＢｒｏｗｎ）の発育上
にうすたいたい（４ｅｃ，Ｂｉｓｑｕｅ）の気菌糸を着
生し、溶解性色素は認められない。

（５）チロンン寒天培地（ＩＳＰ培地７、２７℃培養）うす黄茶〜黄茶（３ｐｉ，ＧｏｌｄｅｎＢｒｏｗｎ）
の発育上に茶白の気菌糸をうつすらと着生し、溶解性色
素はわずかに茶色味を帯びる程度である。

（６）栄養寒天培地（２７℃培養）発育はうす黄茶を呈し、気菌糸は着生せず、溶解性色素
はわずかに茶色味を帯びる程度である。

（７）イースト・麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地２、２７℃
培養）うす黄茶（２ｉｅ，ＬＬＭｕｓｔａｒｄＴａｎ］の
発育上にうすだいだいの気菌糸を着生し、溶解性色素は
認められない。

（８）オートミル寒天培地（ＩＳＰ培地３、２７℃培養
）無色の発育上にうすいだいだい（４ｅｃ，Ｂｉｓ−ｑｕ
ｅ）の気菌糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（９）グリセリン・硝酸塩寒天培地（２７℃培卿うすオ
リーブ（１１／２ｚｇ，Ｇｏｌｄｅｎ０１ｉｖｅ−１１
／２ｎｉＯｌｉｖｅ）の発育上に茶山又は灰色の気菌
糸を着生し、溶解性色素は認められない。

（１０）スターチ寒天培地（２７℃培養）無色の発育上
にうすだいたいの気菌糸をわずかに着生し、溶解性色素
は認められない。

（１１）リンゴ酸・石灰寒天培地（２７℃培養）うす黄
の発育上にうすだいたいの気菌糸を着生し、溶解性色素
は認められない。

（１２）セルロース（２７℃培養）発育は無色、気菌糸は着生せず、溶解性色素も認められ
ない。

（１３）ゼラチン穿刺培養１５％単純ゼラチン培地（２０℃培養）では無色〜うす
黄茶の発育上に白〜茶白の気菌糸を着生し、溶解性色素
は褐色を呈する。

グルコース・ペグトン・ゼラチン培地（２７℃培養）で
は発育は黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素は暗い黄
茶味を呈する。

（１４）脱脂牛乳（３７℃培養）発育は黄茶、気菌糸は着生せず、溶解性色素はうす黄を
呈する。

３生理的性質（１）生育温度範囲スターチ・イースト寒天〔可溶性澱粉（犬印）１．０％
、イーストエキス（犬五栄養化学ＫＫ）０．２％、紐寒
天３．５係、ｐＨ７．Ｏ）を用い、２０℃，２４℃，２
７℃，３０℃，３７℃，５０℃の各温度で試験の結果、
５０℃を除いていずれの湿度でも発育するが最適温度は
３０℃付近と思われる。

（２）ゼラチンの液化（ｉｓ％単純ゼラチン培地、２０
℃培養及びグルコース・ペプトン・ゼラチン培地、２７
℃培養）１５％単純ゼラチン培地では２１日間培養したがゼラチ
ンの液化は認められない。

グルコース・ペプトン・ゼラチン培地では培養１４日後
からわずかに液化が始まり、その程度は中程度である。

（３）脱脂牛乳の凝固・ベプトン化（脱脂牛乳、３７℃
培養）培養後、１０日目までは何ら変化が認められず、１４日
目に凝固が完了、その直後からベプトン化が始まり約２
週間で完了する。

その作用は中程度である。

（４）スターチの加水分解（スターチ・無機塩寒天培地
及びスターチ寒天培地、２７℃培養）培養後、５日目頃
からわずかに水解性が認められ、その作用は中程度であ
る。

（５）メラニン様色素の生成〔トリプトン・イースト・
ブロス（ＩＳＰ培地１）：チロシン寒天（ＩＳＰ培地７
）；ベプトン・イースト・鉄寒天培地（ＩＳＰ培地６）
、いずれも２７℃培養〕ベプトン・イースト・鉄寒天培地で陽性、トリプトン・
イースト・ブロス培地で陰性またチロシン寒天培地では
わずかにメラニン様色素の生成が認められる。

（６）炭素源の利用性〔プリドハム・ゴトリ−ブ寒天培
地（ＩＳＰ培地９）、２７℃培養〕Ｌ−アラビノース、
Ｄ−キシロース、Ｄ一グルコースをよく利用して生育し
、Ｄ−フラクトースはおそらく利用していると判定され
、シュクロース、メソーイノシトール、Ｌ−ラムノース
、ラフイノース、Ｄ−マンニトールは利用しない。

（７）硝酸塩の還元反応〔１０係硝酸カリ含有ベプトン
水（ＩＳＰ培地８）、２７℃培養〕おそらく陰性と判定
される。

（８）リンゴ酸石灰の溶解（リンゴ酸石灰寒天培地、２
７℃培養）発育周辺のリンゴ酸石灰を溶解し、その作用は強い方で
ある。

以上の性状を要約するとＨ６４６−ＳＹＢ株はストレプ
トミセス属に属し、気菌糸は輪生枝、螺旋形成ともに見
られず、胞子の表面は平滑である。

種々の培地上で発育はうす黄茶〜黄茶を呈し、気菌糸は
茶白〜うすだいたい、溶解性色素は殆んど産生しないか
、産生じた場合は、うす黄を呈する程度である。

メラニス様色素は陽性と判定され、澱粉氷解性及び蛋白
分解力は中程度である。

以上の性状から既知菌株を検索するとアクチノミセス・
ロセオビリデイス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅ
ｏｖｉｒｉｄｉｓ：ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｅ
ａｒｎａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ，１８，３７２（１９６８））が最も近
緑の種としてあげられる。

そこで次にアクチノミセス・ロゼオビリデイスＩＳＰ５
１７５株とＨ６４６−ＳＹ３株とを実際に比較検討した
成績について述べる。

両者の比較成績は第１表の通りである。

上表に示したようにＨ６４６−，ＳＹＢ株とアクチノミ
セス・ロゼオビリデイスＩＳＰ５１７５株との主たる相
違点はメラニン様色素の形成であるが両者はかなりよく
一致している。

従ってＨ６４６−ＳＹＢ株はアクチノミセス・ロゼオビ
リデイスに極めて近縁の種と考えられるところからＨ６
４６−ＳＹＢ株をストレプトミセス・ロゼオビリデイス
Ｈ６４６−ＳＹＢ株と同定した。

尚放線菌は一般に人工的に才たは自然界で変異を起し易
いが本発明にいうストレプトミセスＨ６４６−ＳＹＢ株
は、Ｈ６４６−ＳＹ３物質を生産し、本菌種及びその変
異菌と明確に区別されない菌はすべてこれを包含するも
のである。

本発明により、Ｈ６４６−ＳＹ３物質を製造するには、
先ず前記菌株を通常の微生物が利用し得る栄養物を含有
する培地で好気的に培養する。

栄養源としては、従来ストレプトミセス属の菌の培養に
利用されている公知のものが使用できる。

例えば炭素源としてグリコース、澱粉、グリセリン、マ
ルトース、デキス卜リン、水飴、糖蜜、シュクロース、
大豆油等が使用し得る。

窒素源としては大豆粉、小麦胚芽、肉エキス、ペプトン
、コーンステイープリカー、乾燥酵母、カザミノ酸、硫
酸アンモン、硝酸ソーダ等が使用し得る。

その他必要に応じて炭酸カルシウム、食塩、塩化カリ、
燐酸塩等の無機塩顛を添加するほか、菌の発育を助け、
Ｈ６４６−ＳＹ３物質の生産を促進するような有機及び
無機物を適当に添加することができる。

培養法としては、一般抗生物質生産の場合と同様、液体
培養法、特に深部培養法が最も適している。

培養は好気的条件丁で行われ、培養に適当な温度は２５
〜３５℃であるがより好ましくは２７〜２８℃であり、
Ｈ６４６−ＳＹ３物質の生成は２〜４日で最高に達する
。

次に培養物から目的とするＨ６４６−ＳＹ３物質を採取
するには抗生物質のための常法を利用することができる
。

例えば培養液を枦過して菌体を除去し、得られたＰ液か
ら目的物を活性炭に吸着させた後、アセトンー水−０．
５Ｎアンモニア水（８０：２０：１）で数回溶出する。

溶出液を減圧丁に濃縮、乾固し、得られる固形物を水に
溶かし、ｎ−ブタノールで数回抽出する。

抽出液を減圧下に濃縮乾固し、得られる固形物を少量の
ｎ−ブタノールーエタノールー水（８：５：２）の混合
溶剤に溶かし、溶液をシリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ
６０，メルク社製）を充填した塔を通過させ、吸着物
をローブタノールーエタノールー水（８：５：２）で溶
出し、目的物を含む分画液を得る。

次にこの分画を減圧下に濃縮することにより無色のシロ
ップ状のＨ６４６−ＳＹ３物質を得ることができる。

尚以上のようにして得たＨ６４６−ＳＹ３物質をより純
化するためには、これを水に溶かし、ＳＰ−セファデン
クスＣ−２５（Ｈ＋型）（ファ一マシア・ファイン・ケ
ミカル社）を充填したカラムを通過させた後、吸着物を
無機塩水溶液特に水−ＩＭＮａＣｌ系溶出液を用いてグ
ラジエント溶出を行い目的物を含んだ分画を集め、これ
を凍結乾燥し、乾燥品をクロロホルムで抽出し、抽出物
を減圧下に濃縮すればよい。

以下にＨ６４６−ＳＹ３物質の理化学的性状を示す。

■．外観；無色のシロップ２，含有する元素：炭素、水素、窒素、塩素、酸素３．元素分析値（％）；炭素５０．９３へ水素８．８１％、窒素５．４９係、塩
素６．２５％、酸素２８．５２％４．Ｒｆ値；０．４２（ｎ−ブタノールーメタノールー水（８：４：
１））０．：３７（水飽和ｎ−ブタンール〕０．２７（水飽和ｎ−ブタノールー酢酸エチル（１：１
））０．８７（アセトンー水（４二１）〕５．比旋光度：大吸収を示す。

７．赤外吸収スペクトル；第２図に示す通りでその主要吸収帯はクロロホルム中、
３４００〜３２００，２９４０，２８８０，１７２０，
１６６０，１５００，１４７０，１４２０，１３８０，
１２３０，１０５０．９４０Ｃｍ−１である。

８．溶解性；水、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール及びアセ
トンに可溶、酢酸エチルに難溶、ｎーヘキサン及びベン
ゼンに不溶９．呈色反応：ニンヒドリン反応、１％過マンガン酸カリ反応及び５条
硝酸銀反応は陽性、アンスロン反応及びα−ナフトール
反応は陰性本発明のＨ６４６−ＳＹ３物質は、それ自体は極めて弱
い抗菌力しか示さないが第２表に示すように抗生物質ト
リコマイシンの効力を増強するという極めて特異な性質
を有する。

第２表から明らかなように通常トリコマイシンはコレス
テロールの存在で効力が激減するがＨ６４６−ＳＹ３物
質を添加した場合はコレステロールの存在、不存在にか
かわらずトリコマイシンの効力を増強することがわかる
。

尚本発明のＨ６４６−ＳＹ３物質はマウスに対する腹腔
内投与（４ｍｇ／マウス）では全く毒性を示さなかった
。

注）最小発育阻止濃度はグルコース栄養寒天培地で３７
℃で測定したものである。

ＩＨ６４６−ＳＹ３物質 ■ トリコマイシン ■ トリコマイシン＋コレステロール（４ｍｃｇ／ｍｌ
）■ トリコマイシン＋Ｈ６４６−ＳＹ３物質（２．５
ｍｃｇ／ｍｌ）■ トリコマイシン＋Ｈ６４６−ＳＹ３
物質（５ｍｃｇ／ｍｌ）■ トリコマイシン＋Ｈ６４６
−ＳＹ３物質（２．５ｍｃｇ／ｍｌ）＋コレステロール
（４ｍｃｇ／ｍｌ）■ トリコマイシン＋Ｈ６４６−Ｓ
Ｙ３物質（５ｍｃｇ／ｍｌ）＋コレステロール（４ｍｃ
ｇ／ｍｌ）以下に本発明を実施例により具体的に説明す
る。

実施例１１．０％マルトース及び０．４％イースト抽出物（ｐＨ
７．０）を含む培地にストレプトミセスＨ６４６−ＳＹ
３株（微工研菌寄第３６４３号）を接種し、往復振盪機
（振幅７ｃｍ、１３０ストローク／分）により２７℃で
２０時間培養を行い種菌とした。

この種菌を１．５係可溶性澱粉、１係グルコース、２０
係大豆粉、０．５％乾燥酵母（エビオス、田辺製薬製）
、０．２５％ＮａＣＩ、０．３％ＣａＣ０３、０．００
０８％ＭｎＣＩ２−４Ｈ２０、０．０００７％ＣｕＳ０
４”５Ｈ２０、０．０００２％ＺｎＳ０４・７Ｈ２０、
ｏ．ｏｏｏｉ％ＦｅＳ０４・７Ｈ２０（ｐＨ７．６滅菌
前）からなる培地１００ｍｌを入れた振盪フラスコ１２
０個に接種し、往復振盪機（振幅７ｃｍ，１３０ストロ
ーク／分）により２７℃で６５時間培養した。

培養液を炉過して菌体を除き、得られ４沖液８，０００
ｍｌ（ｐＨ６．０）に２４ｇの活性炭を加え１時間かく
はんした後、活性炭をｒ取する。

活性炭を１６００ｍｇのアセトンー水−０．５Ｎアンモ
ニア水（８０：２０：１）の溶剤で、８回溶出し、溶出
液を減圧下に濃縮し、凍結乾燥する。

得られる濃縮物（４．５３２ｇ；総活性、４０．４％）
を水２０ｍｌに溶かし、１０ｍｌのｎ−ブタンールで３
回抽出する。

ブタノール層（３６ｍｌ：総活性、３８．８％）を減圧
下に濃縮し、シリカゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅ１６０、メ
ルク社製）を充填した。

５０Ｘ１．５ｃｍのカラムに通し、ｎ−ブタノールーエ
タノールー水（８：５：２）の溶剤で溶出し、１分画を
１．５ｍ／とし、１００個分画した。

Ｎｏ．２１−１００の分画を減圧Ｔに濃縮し、無色のシ
ロップ（１５５ｍｇ：頽活性、１３．０％）を得た。

このシロップ７２ｍ９を１３ｍｌの水に溶かし、ＳＰ−
セファデツクス■Ｃ−２５（Ｈ＋型）を充填した３５Ｘ
］．５ｃｍのカラムに通し、水（２００ｍｌ）−１Ｍ
ＮａＣＩ（２００ｍｌ）系の溶出剤を用いグラジエント
溶出を行い、１分画１０ｍｌ宛の分画を集めた。

Ｎｏ．１３−２４の分画を凍結乾燥し、乾燥物を２５ｍ
ｌのクロロホルムで抽出し、抽出液を減圧下に濃縮乾涸
レて無色のシロップ（３４ｍｙ；総活性９８％）を得た
。

【図面の簡単な説明】

第１図はＨ６４６−ＳＹ３物質の０．ＩＮ−ＨＣＩ−Ｍ
ｅＯＨ，０．ＩＮ−ＮａＯＨ−ＭｅＯＨ及びメタノー
ル中での紫外部吸収曲線を、第２図はクロロｔルム溶液
中で測定した赤外部吸収曲線を示す。

Claims

【特許請求の範囲】（Ｃ二４．８５、メタノール）、シリカゲルＧ薄層クロ
マトグラフイにおけるＲｆ値が０．４２（ｎ一ブタノー
ノレーメタノールー水（８：４二１）〕、０．３７（水
飽和ブタノール）、０．２７（水飽和ｎーブタノールー
酢酸エチル（１：１））、０．８７〔アセトンー水（４
：１））、水、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノー
ル及びアセトンに可溶、酢酸工チルに難溶、ｎ−ヘキサ
ン及びベンゼンに不溶性であり、ニンヒドリン反応、１
係過マンガン酸カリ反応及び５％硝酸銀反応が陽性、ア
ンスロン反応及びα−ナフトール反応が陰性であり、元
素分析値が炭素５０．９３％、水素８．８１％、窒素５
．４９％、塩素６．２５％、酸素２８．５２％であり、
紫外線スペクトルが吸収を示し、赤外線スペクトルの主
要吸収帯はクロロホルム中、３４００〜３２００，２９
４０．２８８０，１７２０，１６６０，１５００１４７
０，１４２０，１３８０，１２３０，１０５０，９４０
ｃｍ−１であるＨ６４６−ＳＹ３物質。２ストレプトミセス属に属するＨ６４６−ＳＹ３物質
生産菌株を栄養培地に培養し、Ｈ６４６−ＳＹ３物質を
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＨ６
４６−ＳＹ３物質の製造方法。