JPH1146760A - 耐酸性カタラーゼの製造法 - Google Patents
耐酸性カタラーゼの製造法Info
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- JPH1146760A JPH1146760A JP22718697A JP22718697A JPH1146760A JP H1146760 A JPH1146760 A JP H1146760A JP 22718697 A JP22718697 A JP 22718697A JP 22718697 A JP22718697 A JP 22718697A JP H1146760 A JPH1146760 A JP H1146760A
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- catalase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】強酸性pHの環境下での安定性が極めて良い耐酸
性カタラーセ゛の製造法に関する。 【構成】アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillu
s carbonarius）に属する菌株を栄養培地で培養し、培
養物中に耐酸性カタラーゼを産生せしめ、これを採取す
る方法。
性カタラーセ゛の製造法に関する。 【構成】アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillu
s carbonarius）に属する菌株を栄養培地で培養し、培
養物中に耐酸性カタラーゼを産生せしめ、これを採取す
る方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、耐酸性カタラーゼの製
造法に関する。より詳細には、アスペルギルス・カーボ
ナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株を
栄養培地で培養し、培養物中に耐酸性カタラーゼを産生
せしめ、これを採取する耐酸性カタラーゼの製造方法に
関する。
造法に関する。より詳細には、アスペルギルス・カーボ
ナリウス（Aspergillus carbonarius）に属する菌株を
栄養培地で培養し、培養物中に耐酸性カタラーゼを産生
せしめ、これを採取する耐酸性カタラーゼの製造方法に
関する。
【０００２】本発明の耐酸性カタラーゼは、強酸性pHの
環境下での安定性が極めて良いため、食品加工、臨床検
査等に使用される他、特に半導体排水の処理等に好適に
使用されうる。
環境下での安定性が極めて良いため、食品加工、臨床検
査等に使用される他、特に半導体排水の処理等に好適に
使用されうる。
【０００３】
【従来の技術】従来、微生物由来のカタラーゼとして、
アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フミ
コーラ（Humicola）等の黴の産生するカタラーゼ（特公
平5-153975号、特開平2-76579号、特開平6-506347
号）、サッカロマイセス（Sacchromyces）、ハンセヌラ
（Hansenula）等の酵母の産生するカタラーゼ（特開昭6
0-83579号、特開昭63-3788号）及びバチルス・アルカロ
ファシエンス（Bacillus alkalofaciense）等の細菌の
産生するカタラーゼ（特公昭49-4956号）等が知られて
いる。
アスペルギルス・テレウス（Aspergillus terreus）、
アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、フミ
コーラ（Humicola）等の黴の産生するカタラーゼ（特公
平5-153975号、特開平2-76579号、特開平6-506347
号）、サッカロマイセス（Sacchromyces）、ハンセヌラ
（Hansenula）等の酵母の産生するカタラーゼ（特開昭6
0-83579号、特開昭63-3788号）及びバチルス・アルカロ
ファシエンス（Bacillus alkalofaciense）等の細菌の
産生するカタラーゼ（特公昭49-4956号）等が知られて
いる。
【０００４】一方、豚及び牛の肝臓等に由来する動物性
カタラーゼも知られいる。
カタラーゼも知られいる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記した微生物及び動
物由来のカタラーゼは、何れも強酸性pHの環境下での安
定性が悪く、半導体排水の処理等に使用するには不利で
あった。
物由来のカタラーゼは、何れも強酸性pHの環境下での安
定性が悪く、半導体排水の処理等に使用するには不利で
あった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者は、従
来のカタラーゼに比較して強酸性pHの環境下での安定性
の良い耐酸性カタラーゼを求め、新たな給源を探索した
ところ、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillu
s carbonarius）が目的とする耐酸性カタラーゼを著量
生産し、これを採取すると共に、アスペルギルス・カー
ボナリウス（Aspergillus carbonarius）が耐酸性カタ
ラーゼを生産することは初めての知見であることによっ
て本発明を完成した。
来のカタラーゼに比較して強酸性pHの環境下での安定性
の良い耐酸性カタラーゼを求め、新たな給源を探索した
ところ、アスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillu
s carbonarius）が目的とする耐酸性カタラーゼを著量
生産し、これを採取すると共に、アスペルギルス・カー
ボナリウス（Aspergillus carbonarius）が耐酸性カタ
ラーゼを生産することは初めての知見であることによっ
て本発明を完成した。
【０００７】本発明に使用する微生物としてはアスペル
ギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）
に属する菌株であれば何れも使用できる。より具体的に
示すと、例えば公的機関に寄託され何人も入手可能な菌
株としては、アスペルギルス・カーボナリウス（Asperg
illus carbonarius）IFO 5864、アスペルギルス・カー
ボナリウス（Aspergillus carbonarius）HUT 2024、ア
スペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonar
ius）IAM 2017等が挙げられる。
ギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）
に属する菌株であれば何れも使用できる。より具体的に
示すと、例えば公的機関に寄託され何人も入手可能な菌
株としては、アスペルギルス・カーボナリウス（Asperg
illus carbonarius）IFO 5864、アスペルギルス・カー
ボナリウス（Aspergillus carbonarius）HUT 2024、ア
スペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus carbonar
ius）IAM 2017等が挙げられる。
【０００８】アスペルギルス・カーボナリウス（Asperg
illus carbonarius）に属する菌株を用いて耐酸性カタ
ラーゼを製造するための菌の培養法としては、液体培養
法、固体培養法のいずれでも良いが、より好ましくは液
体培養法が利用できる。
illus carbonarius）に属する菌株を用いて耐酸性カタ
ラーゼを製造するための菌の培養法としては、液体培養
法、固体培養法のいずれでも良いが、より好ましくは液
体培養法が利用できる。
【０００９】液体培養法としては、例えば以下のように
して行うことができる。
して行うことができる。
【００１０】使用できる培地としては、アスペルギルス
・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属す
る菌株が生育可能な培地であれば如何なるものでも良
い。例えばグルコース、シュクロース、グリセリン、デ
キストリン、糖蜜・有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、或いは、グリシン、ペプトン、酵母エキ
ス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜
鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
・カーボナリウス（Aspergillus carbonarius）に属す
る菌株が生育可能な培地であれば如何なるものでも良
い。例えばグルコース、シュクロース、グリセリン、デ
キストリン、糖蜜・有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモ
ニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸
アンモニウム、或いは、グリシン、ペプトン、酵母エキ
ス、コーン・スティープ・リカー、カゼイン加水分解
物、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウ
ム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜
鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。
【００１１】培地のpHは、例えば約３〜９、好ましくは
約5.5〜6.9程度に調整し、培養温度は通常約10〜50℃、
好ましくは約25〜30℃程度で、１〜20日間、好ましくは
６〜12日間程度好気的条件下で培養する。例えば振盪培
養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が
利用できる。
約5.5〜6.9程度に調整し、培養温度は通常約10〜50℃、
好ましくは約25〜30℃程度で、１〜20日間、好ましくは
６〜12日間程度好気的条件下で培養する。例えば振盪培
養法、ジャーファーメンターによる好気的深部培養法が
利用できる。
【００１２】また、通常の小麦フスマ等を栄養培地とす
る固体培養法により約25〜37℃程度で、３〜12日間培養
することもできる。
る固体培養法により約25〜37℃程度で、３〜12日間培養
することもできる。
【００１３】得られた培養物より菌体を除去した培養ろ
液、培養物又は固体培養抽出液から耐酸性カタラーゼを
通常の手段で単離し耐酸性カタラーゼを得ることができ
る。
液、培養物又は固体培養抽出液から耐酸性カタラーゼを
通常の手段で単離し耐酸性カタラーゼを得ることができ
る。
【００１４】例えば培養ろ液から、耐酸性カタラーゼを
単離精製するには、硫安塩析、アルコール沈降、イオン
交換樹脂を用いるクロマトグラフィー、ゲルろ過法、ヒ
ドロキシルアパタイト吸着樹脂を用いるクロマトグラフ
ィー等を用い常法により処理して、精製耐酸性カタラー
ゼを得ることができる。
単離精製するには、硫安塩析、アルコール沈降、イオン
交換樹脂を用いるクロマトグラフィー、ゲルろ過法、ヒ
ドロキシルアパタイト吸着樹脂を用いるクロマトグラフ
ィー等を用い常法により処理して、精製耐酸性カタラー
ゼを得ることができる。
【００１５】本発明の耐酸性カタラーゼは、従来のカタ
ラーゼとほぼ同様の酵素的性質を持ちながら強酸性pHの
環境下での安定性が極めて良いことに特長がある。いく
つかの酵素的性質を以下に示す。 熱安定性 ：pH4.0で１時間保持した後の残存活性は、60
℃で94％以上、70℃で70%以上である。 至適pH ：pH６に至適を持ち、pH２〜10でもpH６にお
ける活性の60％以上の活性を示す。 pH安定性 ：グリシン−塩酸バッファー（pH1.5）におい
て、30℃、２時間処理でも50％以上の残存活性を示す。
ラーゼとほぼ同様の酵素的性質を持ちながら強酸性pHの
環境下での安定性が極めて良いことに特長がある。いく
つかの酵素的性質を以下に示す。 熱安定性 ：pH4.0で１時間保持した後の残存活性は、60
℃で94％以上、70℃で70%以上である。 至適pH ：pH６に至適を持ち、pH２〜10でもpH６にお
ける活性の60％以上の活性を示す。 pH安定性 ：グリシン−塩酸バッファー（pH1.5）におい
て、30℃、２時間処理でも50％以上の残存活性を示す。
【００１６】尚、本発明において耐酸性カタラーゼ活性
の測定方法は、以下に示す通りである。
の測定方法は、以下に示す通りである。
【００１７】過酸化水素基質〔50mMリン酸塩緩衝液（pH
７）200mlに31％過酸化水素242μlを加えたもの〕を平
底試験管に５ml入れ、30℃の恒温水槽で20分間保温して
おき、これに酵素試料１ml加え、よく振りまぜ、直ちに
30℃の恒温水槽に入れ、正確に５分間反応させ、反応後
に１N硫酸溶液２mlを加え、よく振りまぜ反応を止め、
これにヨウ化カリウム溶液（10％）を１ml、モリブデン
酸アンモニウム溶液（１％）を１滴及び指示薬としてデ
ンプン試薬（0.5％）を５滴加え、この溶液を攪拌しな
がら、1/200 Nチオ硫酸ナトリウム溶液（定量用）で滴
定し、ブランクは試料の代わりにリン酸塩緩衝液１mlを
添加し、以下の計算方法でカタラーゼ活性を求めた。 1/200 Nチオ硫酸ナトリウム１ml＝2.5μM H2O2 カタラーゼ活性（U/ml）＝Ｘ×ｎ ｎ：希釈倍数 Ｘ：標準曲線のグラフよりｙ＝（Ｔ0−ＴS）×24.5／Ｔ
0×2.5×ｆのｘ軸の値Ｘを求める。 ｆ＝1/200 Nチオ硫酸ナトリウムのファクター Ｔ0＝ブランクの滴定値（ml） ＴS＝サンプルの滴定値（ml） 24.5／Ｔ0＝初発基質濃度による活性測定変化に対する
補正値
７）200mlに31％過酸化水素242μlを加えたもの〕を平
底試験管に５ml入れ、30℃の恒温水槽で20分間保温して
おき、これに酵素試料１ml加え、よく振りまぜ、直ちに
30℃の恒温水槽に入れ、正確に５分間反応させ、反応後
に１N硫酸溶液２mlを加え、よく振りまぜ反応を止め、
これにヨウ化カリウム溶液（10％）を１ml、モリブデン
酸アンモニウム溶液（１％）を１滴及び指示薬としてデ
ンプン試薬（0.5％）を５滴加え、この溶液を攪拌しな
がら、1/200 Nチオ硫酸ナトリウム溶液（定量用）で滴
定し、ブランクは試料の代わりにリン酸塩緩衝液１mlを
添加し、以下の計算方法でカタラーゼ活性を求めた。 1/200 Nチオ硫酸ナトリウム１ml＝2.5μM H2O2 カタラーゼ活性（U/ml）＝Ｘ×ｎ ｎ：希釈倍数 Ｘ：標準曲線のグラフよりｙ＝（Ｔ0−ＴS）×24.5／Ｔ
0×2.5×ｆのｘ軸の値Ｘを求める。 ｆ＝1/200 Nチオ硫酸ナトリウムのファクター Ｔ0＝ブランクの滴定値（ml） ＴS＝サンプルの滴定値（ml） 24.5／Ｔ0＝初発基質濃度による活性測定変化に対する
補正値
【００１８】以下実施例をあげて、本発明をより具体的
に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
に説明する。本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。
【００１９】
実施例１ グルコース10.2％（W/V）、コーン・スティープ・リカ
ー2.75％（W/V）、グリシン0.5％（W/V）、NaNO3 1.5％
（W/V）、Ca(NO3)2 0.5％（W/V）、KH2PO4 0.1％（W/
V）、MgSO4・７H2O 0.05％（W/V）、FeCl3 0.01％（W/
V）、pH6.9よりなる培地100mlを500ml容の坂口フラスコ
に仕込み、121℃で30分間殺菌した。
ー2.75％（W/V）、グリシン0.5％（W/V）、NaNO3 1.5％
（W/V）、Ca(NO3)2 0.5％（W/V）、KH2PO4 0.1％（W/
V）、MgSO4・７H2O 0.05％（W/V）、FeCl3 0.01％（W/
V）、pH6.9よりなる培地100mlを500ml容の坂口フラスコ
に仕込み、121℃で30分間殺菌した。
【００２０】他方、ポテトデキストロース寒天培地で30
℃，３日間予め培養しておいたアスペルギルス・カーボ
ナリウス（Aspergillus carbonarius）IFO 5864の菌体
を前記培地に無菌的に接種し、30℃で６日間振盪攪拌培
養した。培養ろ液の耐酸性カタラーゼ活性は240 U/mlで
あった。
℃，３日間予め培養しておいたアスペルギルス・カーボ
ナリウス（Aspergillus carbonarius）IFO 5864の菌体
を前記培地に無菌的に接種し、30℃で６日間振盪攪拌培
養した。培養ろ液の耐酸性カタラーゼ活性は240 U/mlで
あった。
【００２１】実施例２ グルコース10.2％（W/V）、コーン・スティープ・リカ
ー2.75％（W/V）、グリシン0.5％（W/V）、NaNO3 1.5％
（W/V）、Ca(NO3)2 0.5％（W/V）、KH2PO4 0.1％（W/
V）、MgSO4・７H2O 0.05％（W/V）、FeCl3 0.01％（W/
V）、pH6.9よりなる培地100mlを500ml容の坂口フラスコ
に仕込み、121℃で30分間殺菌した。
ー2.75％（W/V）、グリシン0.5％（W/V）、NaNO3 1.5％
（W/V）、Ca(NO3)2 0.5％（W/V）、KH2PO4 0.1％（W/
V）、MgSO4・７H2O 0.05％（W/V）、FeCl3 0.01％（W/
V）、pH6.9よりなる培地100mlを500ml容の坂口フラスコ
に仕込み、121℃で30分間殺菌した。
【００２２】他方、ポテトデキストロース寒天培地で30
℃，３日間予め培養しておいたアスペルギルス・カーボ
ナリウス（Aspergillus carbonarius）IAM 2017の菌体
を前記培地に無菌的に接種し、30℃で６日間振盪攪拌培
養した。培養ろ液の耐酸性カタラーゼ活性は365 U/mlで
あった。
℃，３日間予め培養しておいたアスペルギルス・カーボ
ナリウス（Aspergillus carbonarius）IAM 2017の菌体
を前記培地に無菌的に接種し、30℃で６日間振盪攪拌培
養した。培養ろ液の耐酸性カタラーゼ活性は365 U/mlで
あった。
【００２３】実施例３ 実施例１で得られた培養物を東洋ろ紙 No.２を用いてろ
過、及び8000rpm，10分間の遠心分離を行い上清を得、
これを限外ろ過して濃縮し、酢酸でpHを4.0に調整後、
0.2M酢酸バッファー（pH4.0）で平衡化させたアンバー
ライト（Amberlite）CG-50（ローム・アンド・ハース社
製品）に吸着後、0.2M酢酸ナトリウム溶液にて（流速0.
3ml/min）酵素を溶出した。次いでこの溶出画分を５Ｍ
EDTA・2Naを含む0.1Mリン酸カリウムバッファー（pH6.
0）で平衡化したDEAE-SepharoseCL-6B（ファルマー社製
品）に供し、同バッファーで洗浄して、DEAE-Sepharose
未吸着画分を集め、脱塩濃縮した。得られた精製耐酸性
カタラーゼの比活性は2,200U/A280タンパク質であっ
た。また、実施例２で得られた培養物からも同様にして
比活性820U/A280タンパク質の耐酸性カタラーゼを濃縮
精製することができた。
過、及び8000rpm，10分間の遠心分離を行い上清を得、
これを限外ろ過して濃縮し、酢酸でpHを4.0に調整後、
0.2M酢酸バッファー（pH4.0）で平衡化させたアンバー
ライト（Amberlite）CG-50（ローム・アンド・ハース社
製品）に吸着後、0.2M酢酸ナトリウム溶液にて（流速0.
3ml/min）酵素を溶出した。次いでこの溶出画分を５Ｍ
EDTA・2Naを含む0.1Mリン酸カリウムバッファー（pH6.
0）で平衡化したDEAE-SepharoseCL-6B（ファルマー社製
品）に供し、同バッファーで洗浄して、DEAE-Sepharose
未吸着画分を集め、脱塩濃縮した。得られた精製耐酸性
カタラーゼの比活性は2,200U/A280タンパク質であっ
た。また、実施例２で得られた培養物からも同様にして
比活性820U/A280タンパク質の耐酸性カタラーゼを濃縮
精製することができた。
【００２４】実施例４ 実施例１及び実施例２に準じて調製した本発明の耐酸性
カタラーゼ及び市販品のアスペルギルス・ニガー（Aspe
rugillus niger）由来のカタラーゼ（カタラーゼＬＣ
「アマノ」天野製薬社製）の各々について、それらの酵
素濃度が100U/mlになるように50mMグリシン−塩酸バッ
ファー（pH1.5）で希釈し、30℃で１時間及び２時間イ
ンキュベートした後の各残存活性を測定した。
カタラーゼ及び市販品のアスペルギルス・ニガー（Aspe
rugillus niger）由来のカタラーゼ（カタラーゼＬＣ
「アマノ」天野製薬社製）の各々について、それらの酵
素濃度が100U/mlになるように50mMグリシン−塩酸バッ
ファー（pH1.5）で希釈し、30℃で１時間及び２時間イ
ンキュベートした後の各残存活性を測定した。
【００２５】その結果は、図１に示される通りである。
即ち、本発明の何れのカタラーゼも、pH1.5で１時間保
持した後では、60％以上の残存活性を有しており、且つ
又２時間保持した後でも50％以上の残存活性を有してい
るに対し、市販品のアスペルギルス・ニガー（Asperugi
llus niger）由来のカタラーゼＬＣ「アマノ」（天野製
薬社製）は、pH1.5で１時間保持した後では、５％以下
の残存活性を示し、且つ又２時間保持した後では、1.3
％の残存活性を示すにすぎない。
即ち、本発明の何れのカタラーゼも、pH1.5で１時間保
持した後では、60％以上の残存活性を有しており、且つ
又２時間保持した後でも50％以上の残存活性を有してい
るに対し、市販品のアスペルギルス・ニガー（Asperugi
llus niger）由来のカタラーゼＬＣ「アマノ」（天野製
薬社製）は、pH1.5で１時間保持した後では、５％以下
の残存活性を示し、且つ又２時間保持した後では、1.3
％の残存活性を示すにすぎない。
【００２６】
【発明の効果】本発明によって、耐酸性カタラーゼを新
たにアスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus ca
rbonarius）菌株から得ることができ、半導体排水処理
等の工業分野にそれを好適に使用することができる。
たにアスペルギルス・カーボナリウス（Aspergillus ca
rbonarius）菌株から得ることができ、半導体排水処理
等の工業分野にそれを好適に使用することができる。
【図１】本発明の耐酸性カタラーゼと市販のアスペルギ
ルス・ニガー（Asperugillus niger）由来カタラーゼと
について、pH1.5の耐酸性環境下における１時間及び２
時間経過後の残存活性を比較した図である。
ルス・ニガー（Asperugillus niger）由来カタラーゼと
について、pH1.5の耐酸性環境下における１時間及び２
時間経過後の残存活性を比較した図である。
Claims (1)
- 【請求項１】アスペルギルス・カーボナリウス（Asperg
illus carbonarius）に属する菌株を栄養培地で培養
し、培養物中に耐酸性カタラーゼを産生せしめ、これを
採取することを特徴とする耐酸性カタラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22718697A JP4025392B2 (ja) | 1997-08-07 | 1997-08-07 | 耐酸性カタラーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22718697A JP4025392B2 (ja) | 1997-08-07 | 1997-08-07 | 耐酸性カタラーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1146760A true JPH1146760A (ja) | 1999-02-23 |
| JP4025392B2 JP4025392B2 (ja) | 2007-12-19 |
Family
ID=16856846
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22718697A Expired - Fee Related JP4025392B2 (ja) | 1997-08-07 | 1997-08-07 | 耐酸性カタラーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4025392B2 (ja) |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008151999A1 (en) | 2007-06-11 | 2008-12-18 | Novozymes A/S | A process for combined biopolishing and bleach clean-up |
| WO2009035015A1 (ja) * | 2007-09-12 | 2009-03-19 | Denka Seiken Co., Ltd. | アジ化物によるカタラーゼの阻害に起因する測定誤差の低減方法 |
| JP2011517946A (ja) * | 2008-04-18 | 2011-06-23 | イーコラブ インコーポレイティド | 選択されたカタラーゼ酵素を有する殺菌過酸組成物及び無菌包装における使用の方法 |
| WO2014086659A2 (en) | 2012-12-06 | 2014-06-12 | Ahmedabad Textile Industry's Research Association | Method for enzymatical preparation of textiles |
| WO2014143773A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Lubrizol Advanced Materials, Inc. | Itaconic acid polymers |
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| EP3553172A1 (en) | 2012-08-16 | 2019-10-16 | Novozymes A/S | Method for treating textile with endoglucanase |
-
1997
- 1997-08-07 JP JP22718697A patent/JP4025392B2/ja not_active Expired - Fee Related
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