JPH11332592A - グルコースを出発原料としたｌ−リボースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安価なグルコースを出発原料とし、Ｌ−リボ
ースを効率よく生産する方法を提供する。 【解決手段】 グルコースを出発原料とし、数段階の生
物学的手法を用いてＬ−リボースを生産することを特徴
とするＬ−リボースの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、安価な糖を出発原
料とした多段階の生物反応によるＬ−リボースの製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、非天然型の糖類は医薬及び農薬の
中間原料として注目されている。リボースに関しては天
然型のＤ体はＤＮＡの構成糖としては勿論、種々のビタ
ミンや補酵素の構成糖として全生物界に豊富に分布して
いるにもかかわらず、非天然型のＬ体はほとんど供給の
目処が立っていないのが現状である。現在知られている
Ｌ−リボースの主な生産方法としては、Ｌ−アラビノー
スを原料としたコバルト触媒による合成法が挙げられ
る。一方、微生物を用いてＬ−リボースを生産する方法
としてはアシネトバクター・カルコアセティカス（Acin
etobacter calcoaceticus ）ＤＬ−２８株の産出する酵
素がＬ−リブロースを異性化し、Ｌ−リボースを生産す
ることが唯一報告されている（Journal of Fermentatio
n and Bioengineering Vol.81,No.6,493-497.1996 ）。

【０００３】上記の酵素反応の原料であるＬ−リブロー
スの製造方法としては、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ
によるＬ−アラビノースの異性化による方法（Methods
Enzym. Anal.(3rd Ed.)(1984)vol.6 442-449）と精製さ
れたリビトールを原料とした微生物反応により製造する
方法（Biochem. J. vol. 64:385,1956）が知られている
が、両方法とも原料であるＬ−アラビノースとリビトー
ルは安価とは言い難く、工業的規模で安定的にＬ−リブ
ロースを供給するプロセスまでは報告されていない。

【０００４】上記２通りのＬ−リブロース生産方法の一
方の原料であるリビトールの微生物による製造方法とし
てＤ−リボースを原料として酵素反応により製造する方
法（特公昭４５−２０７１号公報、特公昭４９−１２７
１８号公報）、グルコースなどの発酵により製造する方
法（特公平６−３０５９１号公報、特公平６−３０５９
２号公報、特公平６−３０５９３号公報、特公平６−３
０５９４号公報）、及び藻類の炭酸固定による方法（特
公昭４４−１６３５０号公報）が報告されている。しか
しながら、いずれの方法も工業的規模でＬ−リボースを
生産するに至ってはおらず、従って、工業的規模でＬ−
リボースを製造し、かつ生産されたＬ−リボース含有液
からＬ−リボースを高純度、高収率で単離精製する技術
は全く知られていなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】実際に従来の方法を用
いて工業的規模でＬ−リボースを生物学的に生産しよう
とした場合、種々の問題点が生じる。つまり第１段階で
ある、リビトールを製造するに当たって、従来法の中で
は安価な原料であるグルコースなどの発酵による方法が
望ましいが、この従来法でもエリスリトールなどの他の
糖アルコールは効率的に製造できても、リビトールに関
しては必ずしも満足のいく生産性を得られてはいない。

【０００６】第２段階である、リビトールをＬ−リブロ
ースに変換する技術に関して、従来法では原料のリビト
ールは精製されたものでなければならなかった。結晶リ
ビトールは原料としては極めて高価である。また上述の
発酵リビトールを利用する場合には、エリスリトールや
グリセロールといったポリアルコールが多く含まれ、こ
の中から収率よくリビトールのみを分離精製することは
極めて困難であった。そこで、工業的に安価にＬ−リブ
ロースを生産するために、リビトールを含有した発酵液
または粗精製リビトールからリビトールを精製すること
なく直接Ｌ−リブロースに変換させる方法が望まれてい
た。

【０００７】第３段階である、Ｌ−リブロースをＬ−リ
ボースに変換する反応においても、従来の技術では原料
のＬ−リブロースは精製されたものである必要があっ
た。精製Ｌ−リブロースは極めて高価な原料であり、上
述のＬ−リブロース含有液から単離精製することは極め
て困難であった。そこで目的物質であるＬ−リボースを
工業的規模で安価に生産するために、リビトールを含有
した発酵液または粗精製リビトールからリビトールを精
製することなく直接Ｌ−リブロースに変換させ、さらに
そのＬ−リブロース含有反応液からＬ−リブロースを精
製することなく直接Ｌ−リボースに変換する方法が望ま
れていた。一方、多段階生物反応による夾雑物の極めて
多いＬ−リボース含有液からのＬ−リボースの単離精製
法は全く知られていないため、有効な方法を開発する必
要があった。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上述の問
題を解決すべく鋭意検討した結果、安価な原料であるグ
ルコースを出発物質として用い、数段階の微生物反応と
精製を組み合わせることにより、重要な医農薬中間体で
ある非天然型のＬ−リボースを安価に効率よく製造でき
る方法を見出し、本発明を完成するに至った。即ち本発
明は、グルコースを出発原料とし、数段階の生物学的手
法を用いてＬ−リボースを生産することを特徴とするＬ
−リボースの製造方法に存する。

【０００９】本発明の好ましい態様として、生物学的手
法がグルコースからリビトールを生産する能力を有する
微生物を用いた、グルコースからリビトールの製造方法
（以下、「第１段階」と称することもある）を含むこ
と、生物学的手法がリビトールからＬ−リブロースを生
産する能力を有する微生物を用いた、リビトールからＬ
−リブロースの製造方法（以下、「第２段階」と称する
こともある）を含むこと、及び、生物学的手法がＬ−リ
ブロースからＬ−リボースを生産する能力を有する微生
物を用いた、Ｌ−リブロースからＬ−リボースの製造方
法（以下、「第３段階」と称することもある）を含むこ
とが挙げられる。さらに、本発明の好ましい態様とし
て、上記の生物学的手法を用いて生産したＬ−リボース
含有液をゲル型濾過材に接触させること、及び、該Ｌ−
リボース含有液に有機溶媒を添加し、Ｌ−リボースを単
独で析出させることも挙げられる。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、グルコースを出発原料とし、数段階の生物学
的手法を用いてＬ−リボースを生産することを特徴とす
るが、上記で延べた第１段階、第２段階及び／または第
３段階を経る方法がその一例として挙げられる。以下は
その方法を例として説明するが、本発明はこれに限定さ
れるものではない。本発明の第１段階で使用する微生物
としては、グルコースからリビトールを生産する能力を
有する微生物であれば、特に限定されないが、好ましく
はトリコスポロノイデス(Trichosporonoides) 属に属す
る微生物が挙げられ、さらに好ましくは、トリコスポロ
ノイデス・マディダ（Trichosporonoides.madida）、ト
リコスポロノイデス・ニグレスセンス（Trichosporonoi
des.nigrescens）、トリコスポロノイデス・エドセファ
リス（Trichosporonoides.oedocephalis）、トリコスポ
ロノイデス・メガチリエンシス（Trichosporonoides.me
gachillensis）、トリコスポロノイデス・スパチュラー
タ（Trichosporonoides.spathulata）の種に属する微生
物が挙げられ、さらに好ましくは、トリコスポロノイデ
ス・エドセファリスとトリコスポロノイデス・メガチリ
エンシスの種に属する微生物が挙げられる。例えばトリ
コスポロノイデス・マディダに属する微生物としてＣＢ
Ｓ２４０．７９が、トリコスポロノイデス・ニグレスセ
ンスに属する微生物としてＣＢＳ２６８．８１、２６
９．８１が、トリコスポロノイデス・エドセファリスに
属する微生物としてＣＢＳ５６８．８５が、トリコスポ
ロノイデス・メガチリエンシスに属する微生物としてＣ
ＢＳ５６７．８５が、トリコスポロノイデス・スパチュ
ラータに属する微生物としてＣＢＳ２４１．７９、ＣＢ
Ｓ２４２．７９Ａ、ＣＢＳ２４２．７９Ｂが挙げられ
る。なお、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチル−Ｎ’
−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンス
ルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処
理等による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組
換え法などの遺伝学的手法により誘導される組換え株な
どのいずれの株であってもよい。変異株の具体例として
はトリコスポロノイデス・メガチリエンシスＭＣＩ３４
４２株（通産省工業技術院生命工学工業技術研究所 Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６１７６）が挙げられる。

【００１１】本発明の製造方法においては、上記微生物
を１種あるいは２種以上が用いられる。次に、本発明の
第１段階での製造方法について具体的に説明する。本発
明の製造方法において微生物はグルコースを炭素源とし
て定法通り培養される。つまり、微生物は６０％（W/v
）以下、好ましくは２０〜４５％のグルコースを含む
培地に植菌される。炭素源としては本微生物が資化しう
るフルクトースなどの炭水化物、グリセロールなどのア
ルコール類、有機酸などを適宜加えることができる。さ
らにこの培地には本微生物が資化しうる窒素源が含まれ
る。窒素源としては、酵母エキス、コーンスティープリ
カー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプ
トン、魚肉エキス、肉エキスその他の有機窒素源、ある
いは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源、好ましく
は、酵母エキスやコーンスティープリカー、が適宜使用
される。培地中に含まれる窒素源の初発濃度は好ましく
は、酵母エキスの場合０．５〜４．０％、コーンスティ
ープリカーやの場合、１．０〜８．０％である。好まし
い窒素源の濃度はグルコースの濃度に影響される。上述
の炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビタミン類を
必要に応じ添加することは有効である。無機イオンとし
ては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、
マンガンイオン、モリブデンイオンその他が用いられ
る。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、パ
ントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられる。ま
た、上述のグルコースその他の炭素源、窒素源、無機イ
オン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当な時点
で追補添加してもよい。培養は好気的条件下で行う。本
発明において、本微生物はリビトール以外にエリスリト
ールとグリセロールを副生する場合があるが、リビトー
ルの生成比率を効率よくするためには十分な通気を行う
ことが重要である。培養温度は２０〜３７℃、好ましく
は２７〜３２℃で、２４時間から２週間行う。

【００１２】本発明の第２段階で使用する微生物として
は好気的反応条件下、リビトールをＬーリブロースに変
換する能力を有する微生物であれば特に限定はされない
が、リビトールからＬーリブロースを製造し、かつリビ
トール以外の副生産されたポリアルコールを資化する能
力を有する微生物が好ましく、より好ましくは、アセト
バクター(Acetobacter) 属、アルカリゲネス（Alcalige
nes ）属、アシネトバクター(Acinetobacter )属、アグ
ロバクテリウム(Agrobacterium) 属、アルスロバクター
(Arthrobacter)属、アエロモナス(Aeromonas) 属、オー
レオバクテリウム(Aureobacterium)属、バチルス(Bacil
lus)属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属, ク
レブシエラ(Klebsiella)属、オクロバクトラム(Ochroba
ctrum)属、リゾビウム(Rhizobium) 属、セラチア(Serra
tia)属, ロドバクター(Rhodobacter) 属、コリネバクテ
リウム(Corynebacterium) 属、エンテロバクター(Enter
obacter)属、グルコノバクター(Gluconobacter) 属、ミ
クロコッカス(Micrococcus) 属、パラコッカス(Paracoc
cus)属、シュードモナス（Pseudomonas ）属に属する微
生物である。特にグルコノバクター属に属する微生物が
ポリアルコールの資化性の点からも好ましい。本発明に
おいて使用するグルコノバクター（Gluconobacter ）属
に属する微生物は、例えばGluconobacter frateurii、
Gluconobacter oxydans等が挙げられる。さらに具体的
な代表株としてGluconobacter frateurii IFO 2508 、
Gluconobacter oxydans IFO 3293 が挙げられる。

【００１３】本発明において使用するアセトバクター属
に属する微生物は、例えば、Acetobactor acinus等が挙
げられ、具体的な菌株としては、Acetobactor acinus
ＦＥＲＭ Ｐ−２５０７が挙げられる。本発明において
使用するアルカリゲネス属に属する微生物は、例えばAl
caligenes aquamarinus, Alcaligenes epoxylyticus, A
lcaligenes margaritae, Alcaligenes paradoxus, Alca
ligenes xylosoxidans subsp. xylosoxidansが挙げられ
る. さらに具体的な代表株として Alcaligenes aquamar
inu FERM P-4299, Alcaligenes epoxylyticus FERM P-2
511, Alcaligenes margaritae FERM P-2512, Alcaligen
es xylosoxidans subsp. xylosoxidans IAM 12684, Alc
aligenes paradoxus Biotype I DSM66, Alcaligenes p
aradoxus Biotype II DSM30162が挙げられる。

【００１４】本発明において使用するアシネトバクター
属に属する微生物は、例えばAcinetobacter tartarogen
esが挙げられる。さらに具体的には、Acinetobacter ta
rtarogenesIFO13644が挙げられる。本発明において使用
するアルスロバクター属に属する微生物は、例えばArth
robacter atrocyaneus, Arthrobacter pascens, Arthr
obacter ramousus等が挙げられる。さらに具体的には A
rthrobacter pascens IFO12139, Arthrobacter atrocya
neus JCM 1329, Arthrobacter ramousus JCM1334等が挙
げられる。本発明において使用するアグロバクテリウム
属に属する微生物は、例えばAgrobacterium radiobacte
r, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium viscos
umが挙げられる。さらに具体的な代表株としてAgrobact
erium radiobacter NRRL B-11291, Agrobacterium tume
faciens IAM13129, Agrobacterium viscosum IFO13652
が挙げられる。

【００１５】本発明において使用するオーレオバクテリ
ウム属に属する微生物は、Aureobacterium testaceumが
挙げられる。さらに具体的な代表株として Aureobacter
iumtestaceum JCM1353 が挙げられる。本発明において
使用するバチルス属に属する微生物は、例えばBacillus
alvei, Bacillus coagulansが挙げられる。さらに具体
的な代表株としてBacillus alvei IFO3343, Bacillus c
oagulans AHU 1631 が挙げられる。本発明において使用
するブレビバクテリウム属に属する微生物は、Brevibac
terium busillum が挙げられる。さらに具体的な代表株
としてBrevibacterium busillum IAM1489 が挙げられ
る。

【００１６】本発明において使用するコリネバクテリウ
ム属に属する微生物は、 Corynebacterium flaccumfaci
ens が挙げられる。さらに具体的な代表株として Coryn
ebacterium flaccumfaciens ATCC12813 が挙げられる。
本発明において使用するエンテロバクター属に属する微
生物は、Enterobacteraerogenesが挙げられる。さらに
具体的な代表株としてEnterobacter aerogenesIFO13534
が挙げられる。本発明において使用するクレブシエラ
属に属する微生物は、例えばKlebsiellaplanticola, Kl
ebsiella oxytoca , Klebsiella terrigenaが挙げられ
る。さらに具体的な代表株としてKlebsiella planticol
a NCIB11885, Klebsiella oxytoca JCM1665, Klebsiell
a terrigena JCM1687 が挙げられる。

【００１７】本発明において使用するミクロコッカス属
に属する微生物は、例えばMicrococcus roseusが挙げら
れる。さらに具体的な代表株としてMicrococcus roseus
IFO3764 が挙げられる。本発明において使用するオク
ロバクトラム属に属する微生物は、Ochrobactrums anth
ropiが挙げられる。さらに具体的な代表株としてOchrob
actrums anthropi IAM 13993が挙げられる。本発明にお
いて使用するパラコッカス属に属する微生物は、例えば
Paracoccusdenitrificansが挙げられる。さらに具体的
な代表株としてParacoccus denitrificans IFO13301 が
挙げられる。本発明において使用するシュードモナス属
に属する微生物は、例えばPseudomonas fluorecens, Ps
eudomonas synxantha が挙げられる。さらに具体的な代
表株としてPseudomonas fluorecens IFO 3903, Pseudom
onas fluorecens ATCC13525,Pseudomonas synxantha IA
M13256 挙げられる。

【００１８】本発明において使用するアエロモナス属に
属する微生物は、例えばAeromonaspanctata、具体的に
は、Aeromonas panctata IF013288 が挙げられる。本発
明において使用するリゾビウム属に属する微生物は、例
えばRhizobium validum IF013648が挙げられる。本発明
において使用するセラチア属に属する微生物は、例えば
Serratia marcescens が挙げられ、例えばSerratia mar
cescens IF03054 、Serratia marcescens ATCC13880 が
挙げられる。本発明において使用するロドバクター属に
属する微生物は、例えばRhodobacter sphaeroides が、
例えばRhodobacter sphaeroides IF012003が挙げられ
る。

【００１９】なお、上記微生物は、ＵＶ照射、Ｎ−メチ
ルーＮ’ーニトロソグアニジン（ＮＴＧ）処理、エチル
メタンスルホネート（ＥＭＳ）処理、亜硝酸処理、アク
リジン処理などによる変異株、あるいは細胞融合もしく
は遺伝子組み換え法などの遺伝的手法により誘導される
組み換え株などいずれの株であってもよい。上記微生物
はリビトール以外の副生されたポリアルコールを資化
し、リビトールを効率的にＬーリブロースに変換できる
ので、その後のＬーリブロースの分離・精製工程におけ
る負荷を著しく軽減することが出来る。本段階において
は、上記微生物を１種あるいは２種以上が用いられる。

【００２０】次に、本発明の第２段階での製造方法につ
いて具体的に説明する。本段階で用いるリビトール発酵
液は菌体を含んでいても良いし、遠心分離などにより菌
体を除去したものでもよい。またリビトールの発酵に用
いた微生物を蒸気滅菌などにより殺菌したものでも良い
し、殺菌を行っていない発酵液でも良い。またこの発酵
液を簡便な方法を用いて精製させたものでもよい。例え
ば発酵液を除菌後、濃縮し晶析させたものでも良いし、
また、カラムクロマトグラフィーなどで部分精製させた
ものでも良い。また発酵液を適当な緩衝液、例えば、酢
酸バッファー、リン酸バッファー、トリスバッファー、
等、あるいは水を用いて希釈しても良い。あるいは濃縮
させても良い。これらの発酵液に微生物を好気的条件で
作用させ、Ｌーリブロースを生成させる。

【００２１】本発明の第２段階での微生物培養に用いる
培地は微生物が生育でき、Ｌーリブロース生産能を誘導
しかつポリアルコールの資化性を誘導する培地であれ
ば、いずれでもよい。さらに培地は液体状でも良いし固
体培地でも良い。炭素源としては本微生物が資化しうる
グルコースなどの炭水化物、グリセロールなどのアルコ
ール類、有機酸などが挙げられ、適宜一種あるいは２種
以上が選ばれる。好ましくはポリアルコールの資化性を
誘導するグリセロールなどのアルコール類が挙げられ
る。窒素源としては本微生物が資化しうる窒素源であれ
ばいずれでも良いが、好ましくは、酵母エキス、コーン
スティープリカー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプト
ン、ポリペプトン、肉エキス、魚肉エキス、その他の有
機窒素源、あるいは硝酸ナトリウム、その他の無機窒素
源が適宜１種あるいは２種使用される。培地中に含まれ
る炭素源及び窒素源の濃度は０．０１％〜２０％の間で
用いられる。炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビ
タミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機
イオンとしては、リン酸イオン、ナトリウムイオン、カ
リウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、マンガ
ンイオン、モリブデンイオン、カルシウムイオン、コバ
ルトイオン、その他金属イオン類等が適宜数種類用いら
れる。ビタミン類としては、チアミン、イノシトール、
パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられ、適宜
用いられる。また、上述のグルコースその他の炭素源、
窒素源、無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養
中の適当な時点で追補添加してもよい。

【００２２】培養は好気的条件下で行う。培養温度は４
度から５０度の範囲で行われるが好ましくは２０から４
０度の範囲である。通気量は0.001vvm〜2vvm好ましくは
0.5〜1.5vvmの範囲で行われる。ｐＨは２〜１０、好ま
しくは３〜９の間である。培養は１０時間から２日間行
う。培養後菌体をリビトール含有反応液に作用させる。
このとき培養液を直接用いても良いし、遠心分離などに
より菌体を培養液から分離させたものを用いても良い。
またこの菌体をカラギーナン、ポリアクリルアミドゲ
ル、イオン交換樹脂、珪藻土、活性炭等に固定化させた
ものを使用しても良い。また、菌体を超音波破砕機など
で菌体を破砕したものを用いてもよい。

【００２３】反応は好気的条件下で行う。反応温度は４
度から５０度の範囲で行われるが好ましくは２０から４
０度の範囲である。ｐＨは２〜１０、好ましくは３〜８
の間である。攪拌が十分に行われていれば特に通気の必
要は無いが、好ましくは０．０１ｖｖｍ〜１ｖｖｍの間
で通気する。反応に用いる菌体量は湿潤菌体量換算でリ
ビトール含有発酵液に対し０．００１％〜５０％（重量
／体積）の間で用いられる。リビトールの濃度は特に限
定されないが、好ましくは０．１から１５％の間であ
る。含有されるポリアルコールの濃度は特に限定されな
い。反応は１時間から２週間行う。

【００２４】反応により得られたＬーリブロースは、上
記で得られた培養液を精製せずにそのまま用いても良い
し、培養終了液から公知の方法により分離精製した後に
第３段階の反応に供することもできる。即ち、培養終了
後まず微生物菌体を遠心分離等の既存の方法で除去す
る。除菌に先立ち、培養終了液に熱を加え、殺菌を行っ
てもよい。除菌された液は通常の分離方法、即ちクロマ
トグラフィーなどを用いることで容易に精製できる。工
業的には、イオン交換樹脂を用いた疑似移動相型クロマ
トグラフィーにより分離することも可能である。分離精
製の工程においては、必要に応じて脱塩、脱色など、通
常の糖の精製における操作を加えることもできる。

【００２５】本発明の第３段階で使用する微生物として
は、Ｌ−リブロースを異性化してＬ−リボースを生産す
る能力を有する微生物であれば、特に限定されないが、
好ましくはアシネトバクター属またはセルロモナス属に
属する微生物であり、更に好ましくは、アシネトバクタ
ー・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticu
s ）もしくはセルロモナス・ゲリダ（Cellulomonas ger
ida ）、セルロモナスビアゾテア（Cellulomonas biazo
tea ）またはセルロモナス・フラビゲナ（Cellulomonas
flavigena）の種に属する微生物が挙げられる。アシネ
トバクター属に属する微生物としてアシネトバクター・
カルコアセティカス（Acinetobactercalcoaceticus ）
ＤＬ−２８株、セルロモナス・ゲリダ（Cellulomonas g
erida）に属する微生物としてＪＣＭ１４９０が、セル
ロモナス・ビアゾテア（Cellulomonas biazotea ）に属
する微生物としてＡＴＣＣ４８６が、セルロモナス フ
ラビゲナ（Cellulomonas flavigena）に属する微生物と
してＡＴＣＣ４８２等が挙げられる。また上記微生物
は、細胞融合もしくは遺伝子組換え法などの遺伝学的手
法により誘導される組換え株などのいずれの株であって
もよい。また、欧州公開第８０７６８２号公報に記載の
ような酵素を用いてもよい。なお、上記微生物は、紫外
線照射やＮ- メチル- Ｎ'-ニトロ- Ｎ- ニトロソグアニ
ジン（ＮＴＧ）処理、エチルメタンスルホネート（ＥＭ
Ｓ）処理、亜硝酸処理、アクリジン処理等通常知られた
方法による変異株、あるいは細胞融合もしくは遺伝子組
み換え法などの遺伝的手法により誘導される組み換え株
などいずれの株であってもよい。

【００２６】本発明の製造方法においては、上記微生物
を１種あるいは２種以上が用いられる。次に、本発明の
第３段階の製造方法について具体的に説明する。微生物
は定法通り培養される。つまり、炭素源としては本微生
物が資化しうるグルコースなどの炭水化物、グリセロー
ルなどのアルコール類、有機酸など、好ましくはグルコ
ース、グリセロール、スクロース等が、更に好ましくは
スクロースが用いられる。またこれらの炭素源は培養中
に必要に応じて１種類あるいは複数種類適宜加えること
ができる。さらにこの培地には本微生物が資化しうる窒
素源が含まれる。窒素源としては、アミノ酸類、酵母エ
キス、大豆ペプチド、大豆粉末、コーンスティープリカ
ー、ＮＺアミン、トリプトース、ペプトン、ポリペプト
ン、肉エキス、魚肉エキスその他の有機窒素源、あるい
は硝酸ナトリウム、その他の無機窒素源、好ましくは、
酵母エキスや大豆ペプチド、ポリペプトンが適宜使用さ
れる。上述の炭素源、窒素源のほかに、無機イオンやビ
タミン類を必要に応じ添加することは有効である。無機
イオンとしては、リン酸イオン、マグネシウムイオン、
鉄イオン、マンガンイオン、モリブデンイオンその他が
用いられる。ビタミン類としては、チアミン、イノシト
ール、パントテン酸、ニコチン酸アミドなどが挙げられ
る。また、上述のスクロースその他の炭素源、窒素源、
無機イオン、ビタミン類は、必要に応じて培養中の適当
な時点で追補添加してもよい。

【００２７】培養は好気的条件下で行う。本発明におい
て、Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生産するイソメ
ラーゼを高活性に発現させるために通常０．１〜２．０
ｖｖｍ、好ましくは０．５〜２．０ｖｖｍで通気を行
う。培養温度は２０〜３７℃、好ましくは２７〜３２℃
で、１２時間から４８時間行う。培養により得られた菌
体及び／または菌体処理物を第２段階で得られたＬ−リ
ブロース含有発酵液および／または反応液と接触させ、
Ｌ−リブロースをＬ−リボースに変換させる。Ｌ−リブ
ロース含有発酵液および／または反応液はそのままこの
第３段階の反応基質として用いてもよいし、遠心分離な
どにより第１および第２段階で用いた菌体を除去したも
のでもよい。またこれらの菌体を蒸気滅菌などにより殺
菌したものでもよいし、殺菌を行っていない発酵液また
は反応液でもよい。またこの発酵液または反応液を公知
の簡便な方法を用いて精製したものでもよい。水または
適当な緩衝液を用いて希釈してもよいし、あるいは濃縮
してもよい。

【００２８】次に、異性化反応に供する菌体は培養液そ
のままを用いてもよいし、遠心分離等により集菌したも
のであってもよい。培養して得られた菌体をそのまま、
あるいは培養して得られた菌体を公知の手法で処理した
もの、即ち、アセトン処理、凍結乾燥処理、界面活性剤
処理あるいはトルエン処理など菌体を物理的または酵素
的に破砕したもの等の菌体処理物を用いることができ
る。また、これらの菌体または菌体処理物から、Ｌ−リ
ブロースに作用し、Ｌ−リボースを生産する能力を有す
る酵素画分を粗精製物あるいは精製物として取り出して
用いることも可能である。さらには、このようにして得
られた菌体、菌体処理物、酵素画分等をポリアクリルア
ミドゲル、カラギーナンゲル等の担体に固定化したもの
等を用いることも可能である。そこで本明細書におい
て、「菌体および／または該菌体処理物」の用語は、上
述の菌体、菌体処理物、酵素画分、およびそれらの固定
化物全てを含有する概念として用いられる。特に好まし
い実施形態としては菌体をトルエン処理することが挙げ
られる。Ｌ−リブロース液に菌体とトルエンを加えても
よい。好ましくは、培養終了液から菌体を濃縮分離しト
ルエン処理を行って後、異性化反応に供する。

【００２９】異性化反応は、ｐＨ４〜９．５、好ましく
はｐＨ８．５〜９．０に調整したＬ−リブロース水溶液
に上記菌体あるいは菌体処理物をリブロース１ｇ当た
り、２ユニット以上、好ましくは６ユニット以上になる
ように添加し、温度１０℃〜５０℃、好ましくは、２０
℃〜４０℃で行う。反応が進行するにつれ、反応液のｐ
Ｈが低下するため、水酸化ナトリウム等のアルカリ溶液
にてｐＨを９．０付近に制御することが好ましい。用い
た菌体の量により、反応は数秒から数日でＬ−リボース
とＬ−リブロースが平衡に達して終了する。

【００３０】以上３段階の工程により生成したＬ−リボ
ースを精製する。本発明者らは鋭意検討の結果、通常の
種々の精製技術をある順序、条件に従って組み合わせる
ことにより、分離精製するに至った。本発明の製造方法
において、Ｌ−リボースはグルコースを出発原料として
例えば、３段階の生物反応により得られるが、この様に
多段階の生物反応を行った場合、得られたＬ−リボース
含有液は、未反応のＬ−リブロース以外にも微生物由来
のタンパク質等の高分子物質、塩類、副反応で生成した
と思われる有機酸類や、ジヒドロキシアセトン、その他
少量の糖類、着色成分等の夾雑物を含む。これらの夾雑
物は精製の早い時期に出来るだけ取り除いておくこと
が、その後の精製にとって望ましい。

【００３１】反応終了後まず微生物菌体を遠心分離等の
既存の方法で除去する。除菌に先立ち、培養終了液に熱
を加え、酵素失活および澱下げを行ってもよい。さらに
除菌前または除菌後に炭酸飽充を行うことはその後の精
製に大変有効である。除菌された液はＬ−リボース以外
に未だ上述の夾雑物が多く含まれる。これらは通常の方
法、即ちクロマトグラフィーや晶析技術を用いることで
除去できる。夾雑物が多い場合は特に晶析に先立ってゲ
ル型濾過材に接触させ、夾雑物の多くを除去することが
好ましい。本発明で用いるゲル型濾過材としては、Ｌ−
リボースと他の成分とを効率よく分離することが出来る
ものであれば特に限定されないが、好ましくはカチオン
系イオン交換体が挙げられ、更に好ましくは架橋度４〜
８％のアルカリ金属またはアルカリ土類金属型のカチオ
ン系イオン交換体が挙げられる。かかるイオン交換体の
具体例としては、ＵＢＫ−５３０、ＵＢＫ−５３５、Ｕ
ＢＫ−５５０、ＵＢＫ−５５５（いずれも三菱化学製）
等が挙げられる。これらを用いてクロマト分離を行うこ
とが好ましい。

【００３２】具体的な精製手段としては、例えば上述し
たゲル型濾過材を脱塩水にてスラリー化し、十分に気泡
を除去した後分離カラムに充填する。該カラムに、充填
した濾過材容量の１／２〜１／１００、好ましくは１／
５〜１／２０量の粗Ｌ−リボース含有液を送入し、次い
で水で溶出させてＬ−リボース画分とその他の画分とに
分画する。このＬ−リボース画分を、通常知られた方法
により脱塩脱色後、晶析を行うことにより高純度のＬ−
リボースを得ることができる。また工業的には分離効率
を上げ、溶離水の使用量を減らす目的で、公知の種々の
クロマト分離手法や疑似移動床法を用いることにより、
さらに効果的な分画を行うこともできる。分離精製の工
程においては、必要に応じて脱塩、脱色など、通常の糖
の精製における操作を加えることもできる。

【００３３】最終的に精製されたＬ−リボース液には未
反応のＬ−リブロースが混在するが、この混合液よりＬ
−リボース結晶得るには、晶析によりＬ−リボースのみ
を析出させる方法が好ましい。Ｌ−リボース含有液は十
分にの濃縮され、好ましくはブリックス６０以上、さら
に好ましくはブリックス８５以上、さらに好ましくはブ
リックス９０以上に濃縮される。この濃縮シロップを４
℃に放置するとＬ−リボースのみが析出する。しかしこ
のような低温晶析では析出するまでの時間が長く、また
析出率も満足のいくものではない場合が多く、好ましく
は有機溶媒添加による方法が挙げられる。つまり、上述
の十分に濃縮されたＬ−リボース含有シロップに、シロ
ップの１／２〜１０倍量好ましくは１〜３倍量の有機溶
媒を加え、十分に攪拌後、微量のＬ−リボース結晶を加
え、４℃で２４時間放置する。添加する有機溶媒として
は、メタノール、エタノール等の低級アルコール類、ア
セトン、ヘキサン、アセトニトリル、トルエンなどが挙
げられ、好ましくはエタノール、１−プロパノール、２
−プロパノール、更に好ましくはエタノールが挙げられ
る。晶析に先立って再度クロマト分離を行い、Ｌ−リボ
ース含有液中からＬ−リブロースを除いておけば、さら
に晶析率は上昇する。

【００３４】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明するが、その要旨を越えない限り本発明の技術分
野における通常の変更をすることができる。 実施例１ １）リビトール発酵上清の製造 ３０Ｌ容量のジャーにグルコース３０％、魚肉エキス２
％からなる培地１８Ｌを入れ、トリコスポロノイデス
メガチリエンシス（ＭＣＩ３４４２）の種培養１８０ｍ
Ｌを接種した。種培養液は、予めバッフル付きフラスコ
を用いてグルコース３０％、酵母エキス１％からなる培
地中で３０℃、２日間、１６０ｒｐｍの振とう培養によ
り得られた。ジャーは３３０ｒｐｍ、１ｖｖｍ、３０℃
の条件で制御され、５日間培養を行った。得られた培養
液から遠心分離により清澄な培養上清１２Ｌを得た。こ
の発酵を５回行い、リビトール発酵上清６０Ｌを得た。
各成分の濃度はリビトール８０ｇ／Ｌ、エリスリトール
４ｇ／Ｌ、グリセロール４０ｇ／Ｌであった。

【００３５】２）粗Ｌ−リブロース液の製造 グルコノバクター・フラテウリ（Gluconobacter frateu
rii)(IFO2508) を１％グリセロール、０．５％酵母エキ
ス、０．５％ポリペプトンよりなる培地１００ｍｌを入
れた５００ｍｌバッフル付きフラスコ２本に接種した。
１６０ｒｐｍで回転する振とう培養機にセットし、３０
℃で１日間培養を行った。３０ｌジャーファーメンター
に３％グリセロール、０．５％酵母エキス、０．５％ポ
リペプトンよりなる培地を２０ｌ仕込み、１２０度２０
分殺菌した。これに先の培養液を２００ｍｌ植菌し、３
０度で、ｐＨを５以下にならないように５Ｎ水酸化ナト
リウムでコントロールしながら１日培養した。培養終了
後、培養液を遠心分離して、培養上清除き、グルコノバ
クター・フラテウリの菌体を得た。上記１）で製造した
リビトール発酵上清液を１５ｌ仕込んだ３０ｌジャーフ
ァーメンターに入れ、得られたグルコノバクターの菌体
を入れ、３０度、通気１ｖｖｍ、攪拌３３０ｒｐｍの条
件で反応した。反応１日後、反応液１ｍｌを遠心分離に
かけて菌体を除き、反応上清を下記の高速液体クロマト
グラフィー分析した。リビトールは完全に変換され、エ
リスリトール及びグリセロールは検出されなかった。生
成したＬーリブロースは７８．２ｇ／Ｌであった。グリ
セロールはジヒドロキシアセトンに変換されており、生
成量は２３．３ｇ／ｌであった。エリスリトールはエリ
スルロースに変換されていたが、生成量の測定はスタン
ダードの試薬が、純度不明瞭のため、正確な測定ができ
なかった。

【００３６】

【表１】 高速液体クロマトグラフィー分析条件 カ ラ ム： ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８Ｅ ８mmI.D.×３００mm （三菱化学株式会社製） 溶 離 液： 蒸留水 流 速： １．０ｍｌ／分 カラム温度： ６０℃ 検 出 器： ＲＩ

【００３７】３）粗Ｌ−リボース液の製造 上記２）で得られたＬ−リブロース含有発酵液に引き続
き異性化反応に供する菌体のトルエン処理物が加えられ
た。即ち、２）で得られたＬ−リブロース液は、除菌そ
の他の処理を施すことなく、同一ジャー内で連続して異
性化反応が行われた。具体的には２）の反応終了時点で
Ｌ−リブロース含有発酵液を水酸化ナトリウム水溶液に
よりｐＨ９．０に調整し、続いて下記４）で得られたト
ルエン処理菌体１Ｌを加えて、異性化反応を開始した。
ジャーは反応温度２８℃、１１２ｒｐｍに制御され、ｐ
Ｈは１０Ｎ水酸化ナトリウム水溶液にて８〜８．５の間
で緩やかに制御された。２４時間後Ｌ−リボースとＬ−
リブロースの混合比が約７：３に達し、反応は終了し
た。遠心分離により反応終了液から菌体を除き清澄な粗
Ｌ−リボース液１５．１Ｌを得た。含有するＬ−リボー
スは３９．１ｇ／Ｌ、Ｌ−リブロースは１６．０ｇ／
Ｌ、ジヒドロキシアセトンは７ｇ／Ｌであった。

【００３８】４）異性化反応用トルエン処理菌体の製造 アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacte
r calcoaceticus ）ＤＬ−２８株の種培養液をスクロー
ス ２．０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５．０ｇ／Ｌ、大豆ペ
プチド ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、Ｋ₂ ＨＰ
Ｏ₄ ３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ １ｇ／Ｌ、リジン一塩酸塩
５ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）よりなる培地２０Ｌを入れた３
０Ｌジャーに１％接種した。種培養は予め同一培地を用
いてバッフル付きフラスコで１６０ｒｐｍ、３０℃で１
２時間振とう培養して得られた。ジャーは３００ｒｐ
ｍ、１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、１６時間培養
を行った。得られた培養終了液を遠心分離して上清を除
き、１０倍濃縮菌体液を１．７Ｌを得た。この濃縮菌体
１．７Ｌトルエンを２７ｍＬ加え、１５分間激しく混合
した。

【００３９】５）粗Ｌ−リボース液の精製 ３）で得られた粗リボース液をエバポレーターにてブリ
ックス４０まで濃縮した後、カラムクロマトグラフィー
の原料に供した。特開昭６３−１５８１０５号公報に記
載された疑似移動床型のクロマト分離系（充填材が充填
された充填床の前端と後端とが流体通路で連結され、流
体の循環を可能にしたもの）において、充填材としてＮ
ａ型の強カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ−５３
０，三菱化学社製）を使用し、脱着剤として水を使用し
た。内径２８ｍｍ、充填層高５００ｍｍの直列に連結し
た４本のカラムに前記充填材を合計で１２４０ｍＬ充填
した充填床を６５℃に保ち、床内を容積流速６００ｍＬ
／ｈｒで通液し、供給はすべて第１カラム、抜き出しは
すべて第４カラムとし、下記表１に示すタイムスケジュ
ールで定常となるまで分離操作を行った。定常状態に達
した後の各画分の組成を、下記表２に示す。Ｌ−リボー
スの回収率は８１．８％であった。また、原料に含まれ
ていた着色成分も多くはＬ−リボース以外のその他の画
分に分離されており、Ｌ−リボース画分の着色はクロマ
ト分離前に比べて大幅に軽減されていた。

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】得られたＬ−リボース含有画分を分子量分
画１００００の中空糸型限外濾過膜にて濾過した後、カ
チオン交換樹脂を充填したカラムに通液し、続いてアニ
オン交換樹脂を充填したカラムに通液した。以上の脱塩
脱色工程を経たＬ−リボース含有液は無色透明である
が、場合により若干の着色成分の残ることがあった。そ
の場合は少量の活性炭を加え６０℃で１時間攪拌後、ケ
イソウ土濾過により活性炭を除くことで残る着色成分を
除いた。このようにして得られた無色透明のＬ−リボー
ス含有液をエバポレーターにてブリックス８７まで濃縮
後、シロップの２倍容量のエタノールを添加し、微量の
Ｌ−リボース結晶を種晶として加え、４℃で２４時間静
置したところ、Ｌ−リボース結晶が析出した。この結晶
を冷エタノールで数回洗浄した後乾固し、純度９９．９
％の結晶を得た。晶析率は７０％であった。尚、晶析後
の母液からエタノールを留去し、再度濃縮してエタノー
ルおよび種晶を加え、低温で放置することで２番晶、３
番晶を得ることができた。

【００４３】実施例２ １）リビトール発酵上清の製造 実施例１の１）と同様に培養を行い、培養上清１２Ｌを
得た。各成分の濃度はリビトール８０ｇ／Ｌ、エリスリ
トール５ｇ／Ｌ、グリセロール５０ｇ／Ｌであった。

【００４４】２）粗Ｌ−リブロース液の製造 グルコノバクター・フラテウリ（ＩＦＯ２５０８）を実
施例１と同様に培養して、培養液１８Ｌを得た。培養終
了後、培養液を遠心分離して培養上清を除き、菌体を１
００ｍＭのリン酸緩衝液バッファー（ｐＨ７．０）１．
８Ｌに懸濁した。３０Ｌジャーに１）で得られたリビト
ール発酵上清１２Ｌを入れ、グルコノバクター懸濁液を
１．８Ｌを加えて、３０℃にて３００ｒｐｍで攪拌し、
通気１ｖｖｍで１日間反応を行った。反応終了液を遠心
分離して菌体を除き清澄な粗Ｌ−リブロース液１２．５
Ｌを得た。生成したＬ−リブロース濃度は７５ｇ／Ｌ、
ジヒドロキシアセトン２９ｇ／Ｌであった。

【００４５】３）粗Ｌ−リボース液の製造 セルロモナス・ゲリダ（ＪＣＭ１４９０）をスクロース
２．０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５．０ｇ／Ｌ、大豆ペプ
チド ５．０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ、Ｋ ₂ ＨＰＯ
₄ ３ｇ／Ｌ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ １ｇ／Ｌ、Ｌ−リボース１５
ｇ／Ｌ（ｐＨ７．０）よりなる培地１８Ｌを入れた３０
Ｌジャーに１％接種した。種培養は予め同一培地を用い
てバッフル付きフラスコで１６０ｒｐｍ、３０℃で１８
時間振とう培養して得られた。ジャーは３００ｒｐｍ、
１ｖｖｍ、３０℃の条件で制御され、１８時間培養を行
った。得られた培養終了液を遠心分離し、集菌した。菌
体ペレットにグリシン−塩酸緩衝液（５０ｍＭ・ｐＨ
８．５）を１．８Ｌを加え均一に懸濁した後、トルエン
を６０ｍＬ加え、１５分間激しく混合した。このように
調整したトルエン処理菌体１．２Ｌを２）で得られた粗
Ｌ−リブロース液１２．５Ｌに加え、均一になるよう緩
やかに攪拌しつつ３０℃で２４時間反応を行った。途
中、１Ｎ ＮａＯＨによってｐＨ８．５に制御した。得
られた反応終了液を遠心分離して菌体を除き、さらに
０．２２μｍ孔径の精密濾過膜を通して清澄な粗Ｌ−リ
ボース液１２Ｌを得た。Ｌ−リボース濃度は３０ｇ／
Ｌ、Ｌ−リブロース濃度は１３ｇ／Ｌであった。

【００４６】４）粗Ｌ−リボース液の精製 ３）で得られた粗リボース液をエバポレーターにて濃縮
し、２．７Ｌの粗リボースシロップを得た。このシロッ
プの濃度はブリックス６３、Ｌ−リボースの対固形分比
率はＨＰＬＣのピーク面積換算で約３８％、Ｌ−リブロ
ースの比率は１５％であった。このシロップをカラムク
ロマトグラフィーの原料に供した。即ちイオン交換樹脂
ＵＢＫ−５５０（三菱化学社製）３２０ｍＬを充填した
カラム４本を直列に接続し、カラム温度を６５℃に保っ
た状態でその一方の端から流速６００ｍＬ／ｈｒで粗リ
ボースシロップ６４ｍＬを供給した。次いで水を流速６
００ｍＬ／ｈｒで送入し、シロップをカラム内で展開、
分離させながらカラム末端に移動させた。水を送入して
７８分後から目的とするＬ−リボースが流出し始めた。
さらに１２分してから流出液をＬ−リボース含有画分と
して採取を開始した。水の送入開始から１２４分後Ｌ−
リボースの流出がほぼ終わったので、サンプル回収を停
止した。このＬ−リボース含有画分中のＬ−リボースの
対固形分比率はＨＰＬＣのピーク面積換算で８０％、Ｌ
−リブロースの比率は１４％であり、Ｌ−リボースの回
収率は８０．１％であった。このＬ−リボース画分をさ
らに実施例１記載と同様の脱塩脱色処理をした後、ブリ
ックス９０まで濃縮し４℃で１ヶ月静置したところ、Ｌ
−リボース結晶が析出した。この結晶を冷アルコール等
で洗浄し、乾固したところ純度９９％のＬ−リボース結
晶が得られた。

【００４７】実施例３ 実施例１の疑似移動床法にて得られたＬ−リボース含有
画分をさらにカラムクロマトグラフィーの原料に供し
た。実施例１と同様のクロマト分離系を用い、充填材と
してＣａ型の強カチオン交換樹脂（ダイヤイオンＵＢＫ
−５５５，三菱化学社製）を使用した。下記表３に示す
タイムスケジュールで定常となるまで分離操作を行っ
た。定常状態に達した後の各画分の組成を、下記表４に
示す。Ｌ−リボースの回収率は７２．４％であった。

【００４８】

【表４】

【００４９】

【表５】表４

【００５０】得られたＬ−リボース画分を実施例１と同
様に脱塩脱色処理した後、ブリックス８７まで濃縮し、
２−プロパノールを２倍量と微量のＬ−リボース結晶を
加え、４℃で１２時間攪拌したところ純度９９．５％の
Ｌ−リボース結晶が得られた。なお、各実施例において
得られた培養上清に含まれるリビトールなどの糖類含量
は高速液体クロマトグラフィーにより各々下記の条件で
測定した。各糖質の保持時間は下記分析条件Ａにおい
て、グルコース１０．５７分、リビトール１２．２２
分、エリスリトール１３．３６分、グリセロール１５．
０９分である。また、下記分析条件Ｂにおいて、Ｌ−リ
ブロース２２．８分、Ｌ−リボース２４．０分である。

【００５１】

【表６】 ・高速液体クロマトグラフィー分析条件Ａ カ ラ ム： ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８ＥＨ ８mmI.D.×３００mm （三菱化学株式会社製） 溶 離 液： １Ｎ リン酸水溶液 流 速： ０．６ｍｌ／分 カラム温度： ５０℃ 検 出 器： ＲＩ ・高速液体クロマトグラフィー分析条件Ｂ カ ラ ム： ＭＣＩ ＧＥＬ ＣＫ０８ＥＣ ８mmI.D.×３００mm （三菱化学株式会社製） 溶 離 液： 水 流 速： ０．６ｍｌ／分 カラム温度： ７５℃ 検 出 器： ＲＩ

【００５２】

【発明の効果】本発明によれば、数段階の生物学的反応
により、安価なグルコースを出発原料としてＬ−リボー
スを効率よく生産することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645）

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルコースを出発原料とし、数段階の生
   物学的手法を用いてＬ−リボースを生産することを特徴
   とするＬ−リボースの製造方法。
2. 【請求項２】 生物学的手法が、グルコースからリビト
   ールを生産する能力を有する微生物を用いた、グルコー
   スからリビトールの製造方法を含むことを特徴とする請
   求項１記載の方法。
3. 【請求項３】 微生物がトリコスポロノイデス属に属す
   ることを特徴とする請求項２記載の方法。
4. 【請求項４】 微生物がトリコスポロノイデス・マディ
   ダ、トリコスポロノイデス・ニグレスセンス、トリコス
   ポロノイデス・エドセファリス、トリコスポロノイデス
   ・メガチリエンシスおよび／またはトリコスポロノイデ
   ス・スパチュラータであることを特徴とする請求項２記
   載の方法。
5. 【請求項５】 微生物がトリコスポロノイデス・エドセ
   ファリスおよび／またはトリコスポロノイデス・メガチ
   リエンシスであることを特徴とする請求項２に記載の方
   法。
6. 【請求項６】 トリコスポロノイデス属に属する微生物
   が、ＣＢＳ２４０．７９、ＣＢＳ２６８．８１、ＣＢＳ
   ２６９．８１、ＣＢＳ６４９．６６、ＣＢＳ５６８．８
   ５、ＣＢＳ５６７．８５、ＣＢＳ２４１．７９、ＣＢＳ
   ２４２．７９Ａおよび／またはＣＢＳ２４２．７９Ｂで
   あることを特徴とする請求項２に記載の方法。
7. 【請求項７】 トリコスポロノイデス属に属する微生物
   がＣＢＳ５６８．８５および／またはＣＢＳ５６７．８
   ５であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
8. 【請求項８】 生物学的手法が、リビトールからＬ−リ
   ブロースを生産する能力を有する微生物を用いた、リビ
   トールからＬ−リブロースの製造方法を含むことを特徴
   とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 【請求項９】 微生物がアセトバクター属、アルカリゲ
   ネス属、アシネトバクター属、アグロバクテリウム属、
   アルスロバクター属、アエロモナス属、オーレオバクテ
   リウム属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、クレブ
   シエラ属、オクロバクトラム属、リゾビウム属、セラチ
   ア属、ロドバクター属、コリネバクテリウム属、エンテ
   ロバクター属、グルコノバクター属、ミクロコッカス
   属、パラコッカス属および／またはシュードモナス属に
   属する微生物であることを特徴とする請求項８記載の方
   法。
10. 【請求項１０】 微生物がグルコノバクター属に属する
    ことを特徴とする請求項８に記載の方法。
11. 【請求項１１】 微生物がグルコノバクター・フラテウ
    リおよび／またはグルコノバクター・オキシダンスに属
    する微生物であることを特徴とする請求項８記載の方
    法。
12. 【請求項１２】 リビトールがリビトール以外の物質を
    含有した未精製の発酵液または該発酵液を部分精製した
    ものであることを特徴とする請求項８〜１１のいずれか
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 生物学的手法が、Ｌ−リブロースから
    Ｌ−リボースを生産する能力を有する微生物を用いた、
    Ｌ−リブロースからＬ−リボースの製造方法を含むこと
    を特徴とする請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
14. 【請求項１４】 Ｌ−リブロースからＬ−リボースを生
    産する能力を有する微生物がセルロモナス属および／ま
    たはアシネトバクター属に属することを特徴とする請求
    項１３記載の方法。
15. 【請求項１５】 微生物が、セルロモナス・ゲリダ、セ
    ルロモナス・ビアゾテアおよび／またはセルロモナス・
    フラビゲナであることを特徴とする請求項１３記載の方
    法。
16. 【請求項１６】 微生物がＪＣＭ１４９０、ＡＴＣＣ４
    ８６および／またはＡＴＣＣ４８２であることを特徴と
    する請求項１３記載の方法。
17. 【請求項１７】 Ｌ−リブロースがＬ−リブロース以外
    の物質を含有した未精製の発酵液または該発酵液を部分
    精製したものであることを特徴とする請求項１３〜１６
    のいずれかに記載の方法。
18. 【請求項１８】 グルコースを出発原料とし、数段階の
    生物学的手法を用いてＬ−リボースを生産し、得られた
    Ｌ−リボース含有液をゲル型濾過材に接触させることを
    特徴とする請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
19. 【請求項１９】 ゲル型濾過材との接触によりＬ−リボ
    ースをクロマト分離することを特徴とする請求項１８記
    載の方法。
20. 【請求項２０】 ゲル型濾過材がカチオン系のイオン交
    換体であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 グルコースを出発原料とし、数段階の
    生物学的手法を用いてＬ−リボースを生産し、得られた
    Ｌ−リボース含有液に有機溶媒を添加し、Ｌ−リボース
    を単独で析出させることを特徴とする請求項１〜２０の
    いずれかに記載の方法。
22. 【請求項２２】 有機溶媒が、低級アルコール類、アセ
    トン、ヘキサン、アセトニトリルまたはトルエンである
    ことを特徴とする請求項２１記載の方法。