JPH11225789A

JPH11225789A - Ｌ−テアニンの製造方法

Info

Publication number: JPH11225789A
Application number: JP4890798A
Authority: JP
Inventors: Nobuyuki Aoi; 暢之青井; Yukiko Tanaka; 有希子田中; Kanari Kobayashi; 加奈理小林
Original assignee: Taiyo Kagaku KK
Current assignee: Taiyo Kagaku KK
Priority date: 1998-02-13
Filing date: 1998-02-13
Publication date: 1999-08-24
Anticipated expiration: 2018-02-13
Also published as: JP3759833B2

Abstract

(57)【要約】【課題】グルタミンとエチルアミン誘導体にグルタミ
ナーゼを作用させ、Ｌ−テアニンを製造する方法を提供
することを目的とする。【解決手段】グルタミンとエチルアミン誘導体にグル
タミナーゼを作用させることを特徴とするＬ−テアニン
の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、Ｌ−テアニンの製
造方法に関する。更に詳しくは、高濃度で反応を行うこ
とができ、かつ高い収率でＬ−テアニンを得る製造方法
に関する。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−テアニンの製造方法としては玉露の
生産用茶園において得られる茶葉乾燥物より抽出する方
法が知られている。しかし、この場合、Ｌ−テアニンは
茶葉乾燥物あたりわずか１．５％前後程度の含量である
ため、高価な原料を用いることとなりその製造コストが
非常に高くなる。また、一般の煎茶用茶園では光合成が
活発であるため、ほとんど蓄積されないのが実状であ
る。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では工業的に実用
的ではない。

【０００３】これを解決する方法としてテアニンを化学
的に合成する方法が報告されている( Chem. Pharm. Bul
l., 19(7) 1301-1307(1971), Biosci. Biotech. Bioche
m.,56(4) 689(1992))。しかし、このような有機合成反
応では収率が低く、光学異性体の分離など生成物の分離
精製等において煩雑な操作を必要とするという問題点が
指摘されている。また、植物細胞もしくは微生物を利用
した生合成法が開示されており、たとえば茶の細胞培養
による方法（特開平３−１８７３８８号）等があるが培
養細胞の増殖率が極めて低い欠点があり、実用的には難
しい。

【０００４】さらに、Pseudomonas 属細菌から得られる
グルタミナーゼをグルタミンとエチルアミンにｐＨ９−
１２の条件下で作用させることを特徴とするテアニンの
製造方法（特公平７−５５１５４）、細菌の固定化菌体
を用いることを特徴とするテアニンの製造方法（特開平
５−３２８９８６）が開示されている。しかし、エチル
アミンは沸点が１６．６℃と非常に低いため、製造する
上で揮発したエチルアミン蒸気が作業員や環境に悪影響
を及ぼしたり、反応効率の向上を目的に沸点以上の温度
で反応しようとすると特別な設備が必要となる等問題が
ある。また、これら製造法においては基質濃度が低く、
かつ製品の収率が低いため、実用上問題がある。また特
公平７−５５１５４に開示されている酵素はその精製が
煩雑であること、ｐＨおよび温度に対する酵素の安定性
に問題があること、さらに反応後の酵素と生成物の分離
操作が煩雑であること、および連続的な反応によるテア
ニンの生産が困難である等の多くの問題点を有する。更
にはピログルタミン酸等を基質として合成する方法（特
開平９−２６３５７３）も開示されているが、この方法
においてはＬ−テアニンの収率が１０％程度と極めて低
いため、実用的でない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、簡易かつ工
業的に有利なＬ−テアニンの製造方法を提供することを
課題とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らはＬ−テアニ
ンの製造方法に関し、鋭意研究を重ねた結果、グルタミ
ンとエチルアミン誘導体の混合物にグルタミナーゼもし
くはグルタミナーゼ産生菌を作用させることにより、Ｌ
−テアニンを高い収率で得ることができ、かつ、高濃度
で反応を行うことができることを見い出し、本発明を完
成するに到った。即ち、本発明の要旨は、グルタミンと
エチルアミン誘導体の混合物にグルタミナーゼもしくは
グルタミナーゼ産生菌を作用させることを特徴とするＬ
−テアニンの製造方法に関する。

【０００７】

【発明の実施の形態】本発明におけるエチルアミン誘導
体は、特に限定するものではないが、エチルアミン塩酸
塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン酸塩、オレイン酸塩
などの脂肪酸塩、塩化金酸塩、Ｎ−ベンゼンスルホニル
化物、Ｎ−ρ−トルエンスルホニル化物などが挙げら
れ、好ましくはエチルアミンハロゲン酸塩であり、更に
好ましくはエチルアミン塩酸塩である。ここにおいてグ
ルタミンに対するエチルアミン誘導体の混合量はモル比
で１倍〜７倍、好ましくは１．５倍〜４倍である。

【０００８】本発明におけるグルタミナーゼの起源は微
生物、植物、動物など特に限定されるものではない。好
ましくは微生物由来のものであり、更に好ましくは、Ps
eudomonas 属等の細菌、Saccharomyces 属等の酵母、As
pergillus 属等のかび等の由来の酵素である。特に好ま
しくは、Pseudomonas 属の微生物由来のグルタミナーゼ
であって、最も好ましくは、Pseudomonas nitroreducen
s ，Pseudomonas aptata、またはPsedomonas denitrifi
cans由来のグルタミナーゼである。グルタミナーゼは粗
製で用いても良いが、精製して用いることが更に好まし
い。精製方法は、公知のいかなる酵素精製法を用いても
良く、カラムクロマトグラフィー、溶媒を用いた分配、
透析、限外濾過、電気泳動、中性塩による分別塩析、ア
ルコール、アセトンを用いる分別沈殿法、ＨＰＬＣを例
示することができる。このうち溶媒分配および各種クロ
マトグラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせることが好まし
い。あるいはまた、これら酵素を公知の方法で固定化し
て用いても良い。さらにＣＭ−セルロースカラムクロマ
トグラフィー、セファデックスＧ１５０カラムクロマト
グラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグ
ラフィー、ブチルトヨパールカラムクロマトグラフィー
を行うことにより、ディスク電気泳動的に単一な標品が
得られる。精製率は２５０倍、回収率は１０％である。

【０００９】ここにおいてグルタミナーゼを作用させる
液性条件は、好ましくはｐＨ９〜１２、更に好ましくは
ｐＨ９〜１１．５である。また、温度は５℃〜５０℃が
好ましく、３０℃〜４５℃が更に好ましい。また、グル
タミン濃度は通常１〜２Ｍ、エチルアミン誘導体濃度は
グルタミン１Ｍに対して通常１．５Ｍ以上が好ましく、
グルタミナーゼの添加量は０．３Ｕ／ｍｌ以上が好まし
いが、０．３〜３Ｕ／ｍｌであることが更に好ましい。

【００１０】本発明のグルタミナーゼ産生菌とは、グル
タミナーゼを産生する能力を有する菌のことであり、Ps
eudomonas 属細菌、Saccharomyces 属等の酵母、Asperi
gillus属等のかび等を例示することができる。これらグ
ルタミナーゼ産生菌は生菌あるいは、菌体粉砕物、固定
化菌体いずれでも良い。ここにおいて菌体の粉砕物とは
培養した菌体を水性媒体中で超音波粉砕あるいは磨砕等
して細胞膜を破壊したものである。固定化菌体とはある
一定の空間に閉じ込められた状態にある微生物菌体であ
り、くり返し、連続的に酵素反応を行うことができ、反
応後、微生物菌体を回収し、再利用できる状態にある微
生物菌体のことである。本発明のグルタミンとエチルア
ミン誘導体の混合物にグルタミナーゼを作用させるにあ
たって、グルタミン酸の生成を抑制する目的で金属イオ
ンを併用しても良い。使用できる金属イオンを列挙する
と、ニッケル、コバルト、カドミウム、亜鉛であり、好
ましくはニッケルである。

【００１１】グルタミンとエチルアミンの誘導体からＬ
−テアニンを合成した後、必要に応じて精製しても良
い。精製の方法は濃縮、膜による分離・濃縮、イオン交
換樹脂、溶媒分配、透析、晶析、各種クロマトグラフィ
ー、ＨＰＬＣの１つあるいは２つ以上の組み合わせによ
るものである。ここにおいて好ましい精製方法は、カラ
ムクロマトグラフィーと晶析を組み合わせる方法であ
る。また精製物質がＬ−テアニンであることの確認は、
精製物質をアミノ酸アナライザー、ペーパークロマトグ
ラフィーにかけると、標準物質と同じ挙動を示し、塩酸
あるいはグルタミナーゼで加水分解処理を行うと、グル
タミン酸とエチルアミンを生じ、グルタミナーゼによっ
て加水分解されたことから、エチルアミンがグルタミン
酸のγ位に結合していたことが確認でき、また、加水分
解で生じたグルタミン酸がＬ型であることも、グルタミ
ン酸デヒドロゲナーゼ（GluDH)により確認でき、精製物
質がＬ−テアニンであることが確認できる。

【００１２】また、精製の後、乾燥・粉砕しても良く、
これら乾燥・粉砕工程の前あるいは後で流動性等の粉体
特性や吸湿性等を調節する目的でデキストリン、ショ糖
脂肪酸エステル、メタリン酸ナトリウム等を添加しても
良い。また、水、アルコール、多価アルコールあるいは
それらの混合物中に溶解しても良い。以下、実施例によ
り本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに
より何ら限定されるものではない。

【００１３】

【実施例】実施例１ Pseudomonas nitroreducens IFO
12694 の培養例グルタミン酸ナトリウム０．６％、酵母エキス０．１
％、グルコース１．０％、ＫＨ₂ＰＯ₄ ０．０５％、
Ｋ₂ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ
０．０７％、ＥＤＴＡ−Ｆｅ０．０１％を含む培養液
（ｐＨ７）を用いて、３０Ｌ容のジャーファメンター
（３０℃、通気１ｖｖｍ＝２５Ｌ／分、回転数２，００
０ｒｐｍ）中、Pseudomonas nitroreducens IFO 12694
株を約２０時間培養した。実施例２菌体粉砕物の調製例実施例１で得られた培養液１７５Ｌ分の菌体を洗浄後、
３０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）７．５Ｌ
に懸濁し、５〜２０℃で超音波破砕し、菌体破砕物を得
た。

【００１４】実施例３グルタミナーゼの調製例７％アンモニア水でｐＨを７に調整しながら実施例２の
菌体破砕物を硫酸アンモニウム分画を行い、４５〜９０
％飽和画分を得た。これを０．０１Ｍリン酸カリウム緩
衝液に溶かし、同緩衝液に対して透析した。ＤＥＡＥ−
セルロースカラム（１５×６０cm）に吸着させ、グルタ
ミナーゼを０．１Ｍの食塩を含む緩衝液で溶出し、グル
タミナーゼ液を得た。実施例４グルタミン１Ｍとエチルアミン塩酸塩３Ｍをホウ酸緩衝
液（Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ、ｐＨ１１）１Ｌ中で、
実施例２で得られた菌体破砕物２５ｍｌにて３０℃、２
２時間で反応させた。反応液より６９０ｍｍｏｌのＬ−
テアニンを単離した。Ｌ−テアニンの反応液からの単離
精製は、反応液をDowex 50×８、Dowex１×２カラムク
ロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理するこ
とにより行った。

【００１５】実施例５グルタミン１Ｍとエチルアミン塩酸塩３Ｍをホウ酸緩衝
液（Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ、ｐＨ１１）１Ｌ中で、
実施例３で得られたグルタミナーゼ液３００Ｕにて３０
℃、２２時間で反応させた。反応液より７６０ｍｍｏｌ
のＬ−テアニンを単離した。Ｌ−テアニンの反応液から
の単離精製は、反応液をDowex 50×８、Dowex １×２カ
ラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理
することにより行った。実施例６グルタミン１Ｍとオレイン酸塩３Ｍをホウ酸緩衝液（Ｎ
ａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ、ｐＨ１１）１Ｌ中で、実施例
３で得られたグルタミナーゼ液３００Ｕにて３０℃、２
２時間で反応させた。反応液より５２０ｍｍｏｌのＬ−
テアニンを単離した。Ｌ−テアニンの反応液からの単離
精製は、反応液をDowex 50×８、Dowex１×２カラムク
ロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理するこ
とにより行った。

【００１６】実施例７固定化菌体の調製例可溶化した３．４％κ−カラギーナン４５０ｍｌに、実
施例１で得られた培養液８０ｇを加えすばやく撹拌後、
４℃で３０分間静置した。同量の０．３ＭＫＣｌを加
え、４℃、１時間静置したゲルを適当な大きさ（約¢２
mm×１０mm）に細断した。このゲルに０．３ＭＫＣｌ
で可溶化した１％ヘキサメチレンジアミン５００ｍｌを
加え、４℃、１０分間静置後、水洗した。さらに０．５
％グルタルアルデヒド２５０ｍｌを加え４℃、１０分間
静置後、水洗し固定化菌体を得た。固定化菌体８００ｍ
ｌをジャケット付きガラスカラム（１．７×４０cm、１
本当りの容量２００ml）４本に充填し３０℃に保温し
た。実施例８グルタミン１Ｍとエチルアミン塩酸塩３Ｍのホウ酸緩衝
液（Ｎａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ、ｐＨ９．５）を調製
し、実施例６より得られた固定化菌体を用いて４本のガ
ラスカラムをつなぎ、ＳＶ＝０．３の条件で２２日間連
続反応を行った。それぞれのカラムから出た反応液をサ
ンプリングしテアニンの生成量を測定した結果、各カラ
ムとも反応１２日目以降テアニン生成量が一定となり、
最後のカラムの反応液の場合、１Ｌ当り９５０〜９６０
ｍｍｏｌのＬ−テアニンを単離した。Ｌ−テアニンの単
離精製は、反応液を脱塩し減圧濃縮後、噴霧乾燥するこ
とにより行った。

【００１７】比較例１グルタミン１Ｍとエチルアミン３Ｍをホウ酸緩衝液（Ｎ
ａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ、ｐＨ１１）１Ｌ中で、実施例
３より得られたグルタミナーゼ液３００Ｕにて３０℃、
２２時間で反応させた。反応液より３９０ｍｍｏｌのＬ
−テアニンを単離した。Ｌ−テアニンの反応液からの単
離精製は、反応液をDowex 50×８、Dowex １×２カラム
クロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理する
ことにより行った。

【００１８】比較例２グルタミン１Ｍとエチルアミン３Ｍをホウ酸緩衝液（Ｎ
ａ₂Ｂ₄Ｏ₇−ＮａＯＨ、ｐＨ１１）３Ｌ中で、実施例
３より得られたグルタミナーゼ液３００Ｕにて３０℃、
２２時間で反応させた。反応液より５００ｍｍｏｌのＬ
−テアニンを単離した。Ｌ−テアニンの反応液からの単
離精製は、反応液をDowex 50×８、Dowex １×２カラム
クロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処理する
ことにより行った。これら実施例及び比較例よりエチル
アミンに比べ、本願発明のエチルアミン塩酸塩では、高
濃度で反応を行うことができ、かつ高い収率でＬ−テア
ニンを得ることができることは明らかである。

【００１９】本発明の実施態様をあげれば以下の通りで
ある。（１）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物にグル
タミナーゼを作用させることを特徴とするＬ−テアニン
の製造方法。（２）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物に微生
物由来のグルタミナーゼを作用させることを特徴とする
Ｌ−テアニンの製造方法。（３）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物に植物
由来のグルタミナーゼを作用させることを特徴とするＬ
−テアニンの製造方法。（４）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物に動物
由来のグルタミナーゼを作用させることを特徴とするＬ
−テアニンの製造方法。

【００２０】（５）グルタミンとエチルアミン誘導体の
混合物にグルタミナーゼ産生菌を作用させることを特徴
とするＬ−テアニンの製造方法。（６）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物にグル
タミナーゼ産生菌の生菌を作用させることを特徴とする
Ｌ−テアニンの製造方法。（７）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物にグル
タミナーゼ産生菌の菌体破砕物を作用させることを特徴
とするＬ−テアニンの製造方法。（８）グルタミンとエチルアミン誘導体の混合物にグル
タミナーゼ産生菌の固定化菌体を作用させることを特徴
とするＬ−テアニンの製造方法。

【００２１】（９）エチルアミン誘導体がハロゲン酸塩
である前記（１）〜（８）いずれか記載の製造方法。（１０）エチルアミン誘導体が脂肪酸塩である前記
（１）〜（８）いずれか記載の製造方法。（１１）エチルアミン誘導体が塩化金酸塩である前記
（１）〜（８）いずれか記載の製造方法。（１２）エチルアミン誘導体がＮ−ベンゼンスルホニル
化物である前記（１）〜（８）いずれか記載の製造方
法。（１３）エチルアミン誘導体がＮ−ρ−トルエンスルホ
ニル化物である前記（１）〜（８）いずれか記載の製造
方法。（１４）エチルアミン誘導体が塩酸塩である前記（１）
〜（８）いずれか記載の製造方法。

【００２２】

【発明の効果】本発明によって新規なＬ−テアニンの効
率的な製造方法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を
可能にすることができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】グルタミンとエチルアミン誘導体の混合
物にグルタミナーゼを作用させることを特徴とするＬ−
テアニンの製造方法。
【請求項２】グルタミンとエチルアミン誘導体の混合
物にグルタミナーゼ産生菌を作用させることを特徴とす
るＬ−テアニンの製造方法。
【請求項３】エチルアミン誘導体がハロゲン酸塩であ
る請求項１または２記載のＬ−テアニンの製造方法。