JPH11140489A - 洗浄剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 プロトペクチン又はポリガラクツロン酸
を基質としたときの最適反応pHが７．０以上であるプロ
トペクチナーゼを含有する洗浄剤組成物。 【効果】 泥汚れに対する洗浄力が極めて強い。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は洗浄剤組成物に関
し、さらに詳細には泥汚れに対する洗浄力の優れる洗浄
剤組成物に関する。

【０００２】

【従来の技術】衣料に付着する汚れは一般に有機質汚れ
と無機質汚れとに大別することができる。このうち、無
機質汚れの代表的なものとしては、泥汚れが挙げられ
る。靴下等に付着する泥汚れは発生頻度も高く、昔から
落としにくい汚れの一つとして問題になってきた汚れで
あるが、衣料用洗剤の主成分である界面活性剤やビルダ
ーの効果は無機質汚れに対しては比較的小さい。そこ
で、この無機質汚れに対する洗浄効果を上げるため、こ
れまでに様々な技術が開発されてきた。しかし、そのほ
とんどは既存の洗剤用基剤の応用技術であり、それぞれ
難点を抱えている。例えば、カルボキシメチルセルロー
スやポリアクリル酸といったカルボン酸系ポリマーは泥
に対する分散効果を発揮するものであるが、これら高分
子ポリマーの使用はコストや生分解性の問題で十分量配
合することが難しい。また、還元剤を使用する方法も提
案されているが、場合により染色衣料の脱色を招く恐れ
もあり、配合する上で問題がある。

【０００３】一方こうした既存物質の応用以外に、酵素
により無機質汚れに対する洗浄効果を上げようとする試
みもなされてきた。酵素は特定基質にのみ作用するた
め、僅かな配合量で効果を発揮でき、洗浄剤組成物に占
める役割は今後も大きくなっていくものと予想される優
れた基剤である。特開昭５９−４９２７９号公報にはセ
ルラーゼを洗剤に配合することにより泥に対する洗浄力
が向上することが記載されている。また、特表平３−５
０４０８０号公報記載のセルラーゼには木綿含有布の手
粗さ軽減効果や汚れ除去効果があるとされている。さら
に、ペクチナーゼを配合した洗浄剤に関する特許出願と
しては、ＷＯ９５／２５７９０号公報及び特公平６−３
９５９６号公報が挙げられ、特に特公平６−３９５９６
号公報には、ペクチナーゼが泥汚れに対して効果的であ
ることが記載されている。しかしながら、これらの公報
に開示されたペクチナーゼは、その洗浄効果において不
十分であり、４０℃で１時間浸漬した後に洗浄した場合
でも満足のいく効果は得られないものであった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は泥汚れに対する洗浄力の強い洗浄剤組成物を提供する
ことにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明は、アルカリ領域
に最適反応pHを有するプロトペクチナーゼを配合するこ
とにより従来の洗浄剤に比べて極めて優れた泥汚れ洗浄
効果を有する洗浄剤組成物を提供するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】本発明において、プロトペクチナ
ーゼとは、Ｃａ²⁺，Ｍｇ²⁺や分子間結合によりペクチン
分子同士の結合、あるいはセルロース分子への結合等で
不溶化したペクチン質であるプロトペクチン（不溶性天
然ペクチン）に作用する酵素の総称である。

【０００７】「岩波生物学辞典」（第３版岩波書店、19
83年３月10日発行）や辻坂好夫編著「応用酵素学」（第
５０頁、株式会社講談社、1979年6月1日発行）による
と、プロトペクチナーゼについては、その存在が推定さ
れてはいたものの、最近まで標品として得られておら
ず、実際に酵素標品として見出されたのは最近であり報
告されているものに関しても、ごく限られたものである
（T. Sakai and M. Okushima, Agric.Biol.Chem., 42,2
427(1978), T. Sakai and M. Okushima, Agric.Biol.Ch
em.,46,667(1982)，T. Sakai and T. Sakamoto, Agric.
Biol.Chem., 54,879(1990)等）。

【０００８】また、プロトペクチナーゼの応用に関して
は、特開平６−２２０７７２号公報や「染色工業」（43
巻, No.4, p162〜173(1995)）にプロトペクチナーゼを
繊維の精練に用いることが提案されているにすぎず、洗
浄剤への配合に関する報告はない。

【０００９】プロトペクチナーゼは、ＡタイプとＢタイ
プの２種に分類されることが知られている（坂井，阪
本，繊維工学，45, 301 (1992)）。すなわち、プロトペ
クチンのポリガラクツロン酸の部分を分解して可溶化す
る酵素をＡタイププロトペクチナーゼ、またそれ以外の
部分（ペクチン質とセルロース分子が結合する部位等）
に作用する酵素をＢタイププロトペクチナーゼとして分
類するものである。本発明においては、これらＡタイプ
及びＢタイプのいずれも使用できる。

【００１０】本発明に用いられるプロトペクチナーゼの
最適反応pHはプロトペクチン又はポリガラクツロン酸を
基質とした系で７．０以上であれば良いが、洗浄力の面
から最適反応pH７．５以上のものが好ましく、さらにpH
８．０以上のものが特に好ましい。なお、最適反応pHの
測定には、当業者に公知のさまざまな緩衝液系を用いる
ことができるが、そのいずれかの緩衝液系で最適反応pH
が７．０以上であれば良い。また、基質としてはプロト
ペクチンを基質とする場合にはペクチン質を含有する綿
繊維を用いるが、測定上、含有ペクチン質量が多いもの
が好ましい。また、プロトペクチナーゼがＡタイプであ
り、ペクチナーゼ活性を有する酵素である場合にはペク
チン酸等を基質として最適反応pHを求めることができ
る。最適反応pHの測定の具体例としては、後述の実施例
に示した如く、ブリトン・ロビンソン広域緩衝液（リン
酸／酢酸／ホウ酸／水酸化ナトリウム）（日本化学会
編、新実験化学講座20，生物化学〔II〕，1229頁丸善
（株）, 1978年10月20日発行）又はグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液を用い、綿布又はポリガラクツロン酸を
基質とした系が挙げられる。

【００１１】また、本発明に用いられるプロトペクチナ
ーゼとしては、pH８．０における綿ペクチン遊離力が高
い酵素が好ましく、０．２mg／ｇ綿以上の綿ペクチン遊
離力を有する酵素が洗浄効果の面でより好ましい。ここ
で、綿ペクチン遊離力とは、綿糸（２０mg／ml）に酵素
（０．４mg／ml）を３０℃、１時間作用させたときに綿
糸１ｇから遊離するペクチン量（mg）をいい、詳細には
後述の実施例の如くして測定される。

【００１２】本発明で用いるプロトペクチナーゼとして
は、植物、細菌及び菌類に広く分布しているものを使用
でき、その起源は特に限定されないが、例えば、バチル
ス属（Bacillus）等の細菌類；トリコスポロン属（Tric
osporon）、エンドマイセス属（Endomyces）、エンドマ
イコプシス属（Endomycopsis）、サッカロマイセス属
（Saccharomyces）、シゾサッカロマイセス属（Schizos
accharomyces）、ピヒア属（Pichia）、ハンセヌラ属
（Hansenula）、デバリオマイセス属（Debaryomyce
s）、ハンセニアスポラ属（Hanseniaspora）、トルロプ
シス属（Torulopsis）、カンジダ属（Candida）、クル
イベロマイセス属（Kluyveromyces）等の酵母類；フサ
リウム属（Fusarium）、ガラクトマイセス属（Galactom
yces）、アスペルギルス属（Aspergillus）、リゾプス
属（Rhizopus）、トラメテス属（Trametes）等の糸状菌
類等が挙げられる。このうちバチルス属に属する微生物
由来のプロトペクチナーゼが特に好ましい。

【００１３】また、本発明で用いるプロトペクチナーゼ
としては、前述のようなプロトペクチナーゼ活性を有す
る限り、他の酵素活性を併せもっていてもよく、例えば
プロトペクチナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼで
あってもよい。プロトペクチナーゼ活性を有する酵素の
具体例としては、バチルス エスピーＫＳＭ−Ｐ１５株
やバチルス エスピー ＫＳＭ−３６６株の生産するペ
クチン酸リアーゼ、バチルス ズブチリス ＩＦＯ１２
１１３株由来のＢタイププロトペクチナーゼ、これらの
酵素を構成するアミノ酸配列の１又は２以上のアミノ酸
が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列を有する酵
素、及びこれらの酵素の抗体と免疫交差反応を示す酵素
が挙げられる。

【００１４】特に本発明ではＫＳＭ−Ｐ１５株由来の酵
素が好ましい。ＫＳＭ−Ｐ１５株の生産するプロトペク
チナーゼ活性を有するペクチン酸リアーゼのアミノ酸配
列を配列番号１に示す。本発明では配列番号１に示すア
ミノ酸配列又は該アミノ酸配列の１若しくは２以上のア
ミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を
有する酵素を使用することができ、詳しくは、欠失、置
換若しくは付加（以下、変異ということがある）は、プ
ロトペクチナーゼ活性とペクチン酸リアーゼ活性を失わ
ない限り特に制限されないが、配列番号１における１０
７位リジン、１２９位リジン及び１３２位アルギニンを
保存するような変異であるのが望ましい。また、変異の
程度は特に制限されないが、上記１０７位、１２９位及
び１３２位を保存する限り、配列番号１中のアミノ酸番
号３６〜１３２のうち５５．７％以上の相同性を有して
いるのが好ましく、７０％以上の相同性を有しているの
がより好ましく、８０％以上の相同性を有しているのが
特に好ましい。

【００１５】なお、バチルス エスピー ＫＳＭ−３６
６株の生産するプロトペクチナーゼ活性を有するペクチ
ン酸リアーゼの詳細な酵素学的性質は、以下の通りであ
り、その測定方法については後述している（実施例の
（III−１−Ｂ）参照）。

【００１６】 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH８．０〜９．０（ブリトン・ロビンソン広域緩衝液 ） （４）最適反応温度 約６０℃（pH８、トリス−塩酸緩衝液） （５）分子量 約４３ｋＤａ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動 法） （６）等電点 pH１０．３付近（等電点電気泳動法）

【００１７】また、バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１
５株の生産するプロトペクチナーゼ活性を有するペクチ
ン酸リアーゼの詳細な酵素学的性質は、以下の通りであ
り、その測定方法については後述している（実施例（II
I−２−Ｂ）参照）。

【００１８】 （１）作用 ペクチン酸（ポリガラクツロン酸）をβ−脱離反応に よってエンド的にα−１，４結合を切断すると共に非 還元末端のＣ４−Ｃ５位に二重結合を付与し不飽和ジ ガラクツロニド、あるいは不飽和オリゴガラクツロニ ドを生成する。 （２）基質特異性 プロトペクチン、ペクチン酸（ポリガラクツロン酸） 、酸可溶性ペクチン酸、ペクチンに作用する。 （３）最適反応pH pH１０．３〜１０．７（グリシン−水酸化ナトリウム 緩衝液） （４）最適反応温度 ５０〜５５℃（pH１０．５、グリシン−水酸化ナトリ ウム緩衝液） （５）分子量 約２０〜２１ｋＤａ（沈降平衡法；ＳＤＳ−ポリアク リルアミド電気泳動法では約２６ｋＤａ） （６）等電点 pH１０．３付近（等電点電気泳動法） （７）アミノ末端配列 アミノ末端配列はＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲＶＰＡＧＱＴ ＦＤＧＫを含む。

【００１９】前記アルカリプロトペクチナーゼ活性を有
する酵素の生産菌としては、前述した菌又は、それらの
変異株、あるいはこれらの酵素若しくはその変異体をコ
ードするＤＮＡ配列を有する組換えベクターで形質転換
された宿主細胞等が挙げられる。

【００２０】組換えベクターを作製するには、目的とす
る宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクター
に該遺伝子を組み込めばよい。かかるベクターとして
は、大腸菌を宿主とする場合、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９等が挙げられ、枯草菌を宿主とする場
合、ｐＵＢ１１０等が挙げられる。

【００２１】前記プロトペクチナーゼ活性を有する酵素
の生産菌及びその変異株、ならびにこれらの酵素又はそ
の変異体をコードするＤＮＡ配列を有する組換え体ＤＮ
Ａで形質転換された宿主細胞等を用いてプロトペクチナ
ーゼ活性を有する酵素を生産するには、菌株を同化性の
炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種
し、常法に従い培養すれば良い。

【００２２】かくして得られた培養液中からの目的物質
であるプロトペクチナーゼ活性を有する酵素の採取及び
精製は、一般の酵素の採取及び精製方法に準じて行うこ
とができる。このようにして得られる酵素液は、そのま
ま用いることもできるがさらに公知の方法により精製、
結晶化又は造粒化することもできる。また、洗剤用組成
物として用いる場合には、培養液を濃縮、透析した後、
噴霧乾燥し、公知の方法により造粒物を製造することも
できる。

【００２３】本発明洗浄剤組成物へのプロトペクチナー
ゼの配合量は、酵素活性を発揮し得る量であれば特に制
限されないが、前記綿ペクチン遊離力を指標にして配合
するのが好ましい。例えば上記の綿ペクチン遊離力が
０．２mg／ｇ綿以上となるような酵素標品に換算して洗
濯液中に０．００１〜５００mg／Ｌ、より好ましくは、
０．０５〜５０mg／Ｌになるように配合することが望ま
しい。本発明品プロトペクチナーゼがＡタイププロトペ
クチナーゼであり、ペクチナーゼ活性を有している場合
には、後述のペクチナーゼ活性測定法により、洗浄時濃
度１〜１００００Ｕ／Ｌ、より好ましくは５〜５０００
Ｕ／Ｌ、さらに好ましくは１０〜２０００Ｕ／Ｌとなる
ように配合してもよい。本発明による高い泥汚れ洗浄効
果を得るために重要なのは、実際に洗浄が行われるアル
カリ領域においてプロトペクチナーゼ活性を有する酵素
を配合することであり、最適反応pHが７．０以上のプロ
トペクチナーゼ、又はpH８．０において綿ペクチン遊離
力が０．２mg／ｇ綿以上であるプロトペクチナーゼを配
合するのが好適である。すなわち、本発明の実施態様と
しては、配合された洗浄剤のアルカリ溶液中において、
プロトペクチナーゼが作用し、線ペクチンの遊離が起こ
ることが重要である。

【００２４】また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の
洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成
分としては、例えば次のものが挙げられる。

【００２５】（１）界面活性剤：平均炭素数１０〜１８
のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸
塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル
基を有し、１分子内に平均０．５〜８モルのエチレンオ
キサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素
数１０〜２０のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、平
均１０〜２０の炭素原子を１分子中に有するオレフィン
スルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原子を１分子中に
有するアルカンスルホン酸塩、平均１０〜２０の炭素原
子を１分子中に有するα−スルホ脂肪酸メチルあるいは
エチルエステル塩、平均炭素数８〜２０の高級脂肪酸
塩、平均炭素数１０〜２０の直鎖又は分岐鎖のアルキル
基を有し、１分子内に平均０．５〜８モルのエチレンオ
キサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩など
のアニオン性界面活性剤；平均炭素数１０〜２０のアル
キル基を有し、１〜２０モルのエチレンオキシドを付加
したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級脂肪酸
アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付加
物、またプロピレンオキサイドとプロピレングリコール
との縮合物にエチレンオキサイドを付加させた、プルロ
ニックという名称で知られているものなどの非イオン性
界面活性剤；その他ベタイン型両性界面活性剤；スルホ
ン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活性剤、
アミノ酸型界面活性剤、カチオン性界面活性剤など。

【００２６】このうち、洗浄性を高める上で界面活性剤
は、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤を主界面
活性剤として使用することが好ましい。特に陰イオン界
面活性剤としては、炭素数１０〜１８のアルキル鎖を持
つ直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸エ
ステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸
塩、アルファスルホ脂肪酸メチルエステル塩が好まし
く、牛脂やヤシ由来の脂肪酸塩を少量配合してもよい。
また非イオン界面活性剤としてはポリオキシアルキレン
〔好ましくはオキシエチレン及び／又はオキシプロピレ
ン〕アルキルエーテルが好適である。

【００２７】これらの界面活性剤は洗浄剤組成物中０．
５〜６０重量％（以下単に％で示す）配合され、特に粉
体状洗浄剤組成物については１０〜４５％、液体洗浄剤
組成物については２０〜５０％配合することが好まし
い。また、洗浄剤組成物が漂白剤を４０％（有効酸素濃
度１０％換算）以上含有する洗浄剤である場合には、界
面活性剤は好ましくは１〜１０％より好ましくは１〜５
％配合される。

【００２８】（２）その他酵素成分 本発明の洗浄剤組成物は、 プロトペクチナーゼ以外の酵
素を含有してもよい。反応性から分類すると、ハイドロ
ラーゼ類、オキシドレダクターゼ類、リアーゼ類、トラ
ンスフェラーゼ類及びイソメラーゼ類が挙げられ、特に
好ましいのはセルラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ア
ミラーゼ、プルラナーゼ、エステラーゼ、ヘミセルラー
ゼ、パーオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ及びプ
ロトペクチナーゼ以外のペクチナ−ゼであり、市販され
ている酵素を公知の配合量で配合してもよい。例示され
る好ましい酵素としては、特開平５−２５４９２号記載
のプロテアーゼ、アルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナ
ーゼ、デュラザイム（ノボノルディクス社）、プラフェ
クト、マキサペム、プロペラーゼ（ジェネンコア社）等
のプロテアーゼや特公平４−４３１１９号記載のセルラ
ーゼ、セルザイム（ノボノルディスク社）等のセルラー
ゼ、リポラーゼ（ノボノルディスク社）、リポマックス
（ジェネンコア社）等のリパーゼ、ＷＯ９４／２６８８
１記載の液化型α−アミラーゼ、特公平７−８９９３
号、特公平７−４９５９４号記載のプルラナーゼ、特開
平６−２６４０９４号記載のα−アミラーゼ活性を有す
るアルカリプルラナーゼ、ターマミル、デュラミル（ノ
ボノルディスク社）、マキサミル、プラフェクト Ｏｘ
Ａｍ（ジェネンコア社）等のアミラーゼ等が挙げられ
る。

【００２９】これらの酵素のうち、前記プロトペクチナ
ーゼにセルラーゼ又はプロテアーゼを併用すると泥汚れ
に対する洗浄力がより向上する。また、前記プロトペク
チナーゼにセルラーゼ及びプロテアーゼを併用すると泥
汚れに対する洗浄力はさらに向上する。

【００３０】（３）漂白剤 本発明の洗浄剤組成物は、漂白剤を配合することによ
り、さらに泥汚れに対する洗浄力を向上させることがで
きる。かかる漂白剤としては、過炭酸ナトリウム、過ホ
ウ酸ナトリウム等が挙げられる。

【００３１】（４）金属イオン封鎖剤：トリポリリン酸
塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸
塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶
性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢
酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカ
ルボン酸塩など。

【００３２】このうち、結晶性アルミノ珪酸塩（合成ゼ
オライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライ
トのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平
均一次粒径０．１〜１０μｍ、特に０．１〜５μｍのも
のが好適に使用される。

【００３３】この金属イオン封鎖剤は、０〜５０％、好
ましくは５〜４０％配合される。また、リンを含有しな
い金属イオン封鎖剤を用いることがより好ましい。また
特開平７−８９７１２号公報、特開昭６０−２２７８９
５号公報及びPhys. Chem. Giasses, 7, p127-p138(196
6)、Z. Kristallogr., 129. p396-p404(1969)等に記載
されている高い金属イオン封鎖能を有する結晶性珪酸塩
も好ましく、具体的には結晶性珪酸塩としてクラリアン
ト社（旧ヘキストトクヤマ社）より市販されている「Ｓ
ＫＳ−６」（δ−Ｎａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅）を配合することが好
ましい。

【００３４】（５）再汚染防止剤：ポリエチレングリコ
ール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、
ポリビニルピロリドン等が用いられる。このうち、カル
ボン酸系ポリマーは、再汚染防止作用の他、金属イオン
を封鎖する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分
散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル
酸、メタクリル酸、イタコン酸等のホモポリマーないし
コポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーと
マレイン酸と共重合したものが好適であり、分子量が数
千〜１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマ
ー以外に、ポリグリシジル酸塩等のポリマー、カルボキ
シメチルセルロース等のセルロース誘導体並びにポリア
スパラギン酸塩などのアミノカルボン酸系のポリマーも
金属イオン封鎖能、分散能及び再汚染防止能を有するの
で好ましい。再汚染防止剤は２０％以下、好ましくは１
０％以下、もっとも好ましくは１〜５％配合される。

【００３５】（６）アルカリ剤 アルカリ剤としては、従来より知られているアルカリ剤
を配合することが好ましい。アルカリ剤としては、粉末
洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウ
ム等のアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、
３号等の非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。こ
れら、無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格
形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れ
た洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとし
ては、セスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなど
が挙げられ、またトリポリリン酸塩等のリン酸塩もアル
カリ剤としての作用を有する。また液体洗剤に使用され
るアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に、水酸化
ナトリウムならびにモノ、ジ又はトリエタノールアミン
を使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用
できる。本発明において、アルカリ剤は、組成物中に
０．０１〜６０％、さらに１〜５０％、特に１〜２０％
配合することが好ましい。

【００３６】（７）その他の成分としては、硫酸ナトリ
ウム等の増量剤、特開平６−３１６７００号公報記載及
びテトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）等の漂
白活性化剤、ホウ素化合物及び亜硫酸ナトリウム等の酵
素安定剤、非晶質アルミノ珪酸塩などの吸油性担体、シ
リコーン／シリカ系等の消泡剤、酸化防止剤、蛍光染
料、青味付剤並びに香料等の従来から公知の成分を公知
の配合量で配合することができる。上記成分として具体
的には特開平８−２１８０９３号公報第４頁右欄１８行
目〜７頁左欄１７行目に記載されているものを使用する
ことができる。

【００３７】本発明の洗浄剤組成物は、上記プロトペク
チナーゼ及び上記公知の成分を組み合せて常法に従い、
製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に応じて
選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等とする
ことができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣料用洗
浄剤、漂白洗浄剤等として使用することができるが、特
に衣料用洗浄剤として好適に使用することができる。衣
料用顆粒状洗浄剤とする場合、基本的には、別途製造し
た洗剤生地に別に造粒した酵素粒子をドライブレンドす
る方法が好適である。

【００３８】

【実施例】

Ｉ．各種測定法 （Ｉ−１）最適反応pHの測定法 プロトペクチンを基質とした場合 反応系での綿繊維の終濃度が２％（ｗ／ｖ）となるよう
な基質溶液１．９ml（ブリトン・ロビンソン広域緩衝液
／pH３〜１２）に、適当濃度の酵素溶液０．１mlを加え
て３０℃にて１時間反応させた。反応液を遠心分離（30
00rpm,５分，４℃）した上清０．２５mlに氷冷濃硫酸
（９６％）３mlを添加して混合した。さらに、０．２５
mlのカルバゾール溶液（０．２％カルバゾール／１００
％エタノール）を加えて混合し、８０℃の湯浴中にて２
０分間発色させた。２０分間水冷した後、５２５nmでの
吸光度を測定した。遊離したペクチン量を同時に作成し
たＤ−ガラクツロン酸の検量線より算出した。綿ペクチ
ンはプロトペクチンであり、これを遊離・可溶化する酵
素は、すなわちプロトペクチナーゼである。最も高い綿
ペクチン遊離量を示したpHを最適反応pHとした。なお、
本測定法に用いる基質である綿繊維としては、ペクチン
質を含有する各種綿布や綿糸等が使用できるが、測定
上、よりペクチン質含量の多いものが好ましく、シュウ
酸アンモニウム抽出法（後述）では５mg／ｇ綿以上とな
るようなものが特に好ましい。また、本測定法に用いる
緩衝液は、ブリトン・ロビンソン広域緩衝液以外の緩衝
液であってもよい。酵素によっては特定の緩衝液が酵素
活性に影響を与える場合があること等から、目的・場面
に応じて当業者に公知の任意の緩衝液系を用いてよい。

【００３９】ポリガラクツロン酸を基質とした場合 反応系でのポリガラクツロン酸（PG；ICN Biomedicals
社，オハイオ）終濃度が０．５％、塩化カルシウムの終
濃度が０．５mMとなるような基質溶液０．９ml（ブリト
ン・ロビンソン広域緩衝液／pH３〜１２）に、適当濃度
の酵素溶液０．１mlを加えて、３０℃、２０分間反応さ
せた。反応後１mlのＤＮＳ溶液（３，５−ジニトロサリ
チル酸０．５％，水酸化ナトリウム１．６％，酒石酸カ
リウムナトリウム３０％）を加え、５分間煮沸して還元
糖を発色させた。発色後直ちに氷冷し（１５分程度）、
４mlのイオン交換水を加えて混合し、遠心分離（3000rp
m,10分）した上清の５３５nmでの吸光度を測定した。生
成した還元糖量を同時に作成したＤ−ガラクツロン酸の
検量線から算出して酵素活性値を求め、活性値が最大で
あるpHを最適反応pHとした。なお、本測定法に用いる緩
衝液は、ブリトン・ロビンソン広域緩衝液以外の緩衝液
であってもよい。酵素によっては特定の緩衝液が活性に
影響を与える場合があること等から、目的・場面に応じ
て当業者に公知の任意の緩衝液系を用いてよい。

【００４０】（Ｉ−２）綿ペクチン遊離力（pH８．０）
の測定法 反応系での綿糸の終濃度が２％（ｗ／ｖ）となるような
基質溶液１．９ml（終濃度５０mMトリス−塩酸緩衝液／
pH８．０）に終濃度０．４mg／mlとなるような酵素溶液
０．１mlを加えて、３０℃、１時間反応させた。反応液
を遠心分離（3000rpm,５分，４℃）した上清０．２５ml
に氷冷濃硫酸（９６％）３mlを添加して混合した。さら
に０．２５mlのカルバゾール溶液（０．２％カルバゾー
ル／１００％エタノール）を加えて混合し、８０℃の湯
浴中にて２０分間発色させた。２０分間水冷したのち５
２５nmでの吸光度を測定した。遊離したペクチン量を同
時に作成したＤ−ガラクツロン酸の検量線より算出し
た。この値から綿１ｇから遊離したペクチン量を算出
し、pH８．０における綿ペクチン遊離力とした。綿ペク
チンはプロトペクチンであり、綿ペクチン遊離力を有す
る酵素は、すなわちアルカリ領域でプロトペクチナーゼ
活性を有する酵素である。なお、本測定法に用いる基質
である綿糸としては、ペクチン質含量がシュウ酸アンモ
ニウム抽出法（後述）で１．５〜２．５mg／ｇ綿となる
糸を用いる。本発明ではカネボウカタン糸の３０番手や
４０番手等を使用した。

【００４１】（Ｉ−３）綿ペクチンのシュウ酸アンモニ
ウム抽出法と定量 シュウ酸アンモニウム抽出法により綿繊維からペクチン
質を抽出・定量した。０．５％シュウ酸アンモニウム溶
液に１％（ｗ／ｖ）となるよう細断綿を加えて抽出操作
を行い、カルバゾール硫酸法にて抽出ペクチン量を定量
した。抽出定量操作は「静岡県浜松工業技術センター研
究報告」（No. 4, p17〜22(1994)）記載の方法に準じて
行った。

【００４２】（Ｉ−４）酵素粉末のペクチナーゼ活性値
の測定 反応系でのポリガラクツロン酸（PG；ICN Biomedicals
社，オハイオ）終濃度が０．５％、塩化カルシウムの終
濃度が０．５mMとなるような基質溶解緩衝液０．９ml
に、適当濃度の酵素溶液０．１mlを加えて、３０℃、２
０分間反応させた。なお、基質溶液の緩衝液系は、測定
酵素がアルカリ酵素である場合には終濃度５０mMグリシ
ン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．０）を、酸性酵
素である場合には終濃度１０mMクエン酸緩衝液（pH５．
０）を用いた。反応後１mlのＤＮＳ溶液（３，５−ジニ
トロサリチル酸０．５％，水酸化ナトリウム１．６％，
酒石酸カリウムナトリウム３０％）を加え、５分間煮沸
して還元糖を発色させた。発色後直ちに氷冷し（１５分
程度）、４mlのイオン交換水を加えて混合し、遠心分離
（3000rpm,10分）して上清の５３５nmでの吸光度を測定
した。生成した還元糖量を同時に作成したＤ−ガラクツ
ロン酸検量線から算出し、酵素活性値を求めた。なお、
酵素活性は１分間に１μmol のガラクツロン酸等量の還
元糖を生成する酵素量を１Ｕと定義した。

【００４３】（Ｉ−５）セルラーゼ活性測定法 反応系でのカルボキシメチルセルロース（CMC：Sunrose
A01MC, DS＝0.65-0.75, DP＝250, 日本製紙（株））終
濃度が１．０％、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液
（pH１０．０）の終濃度が１００mMとなるような基質溶
液０．９mlに、適当濃度の酵素溶液０．１mlを加えて、
４０℃、２０分間反応させた。反応後１mlのＤＮＳ溶液
（３，５−ジニトロサリチル酸０．５％，水酸化ナトリ
ウム１．６％，酒石酸カリウムナトリウム３０％）を加
え、５分間煮沸して還元糖を発色させた。発色後直ちに
氷冷し（１５分程度）、４mlのイオン交換水を加えて混
合した後５３５nmでの吸光度を測定した。生成した還元
糖量を同時に作成したＤ−グルコース検量線から算出
し、酵素活性値を求めた。なお、酵素活性は１分間に１
μmol のグルコース当量の還元糖を生成する酵素量を１
Ｕと定義した。

【００４４】（Ｉ−６）プロテアーゼ活性測定法 アンソン−ヘモグロビン法（M. L. Anson, J. Gen. Phy
siol., 22,79(1938)）の改良法により尿素変性ヘモグロ
ビンに対する分解活性を測定した。すなわち、反応系で
の尿素変性ヘモグロビン終濃度が１．４７％、塩化カル
シウムの終濃度が０．４mM、となるような基質溶液０．
６５mlに、適当濃度の酵素溶液０．１mlを加えて、pH１
０．５、２５℃、２０分間反応させた。反応後１mlのト
リクロロ酢酸（TCA：５％ｗ／ｖ溶液）を加えて反応を
停止させ、遠心分離（3000rpm,10分）した。上清中の蛋
白をフェノール試薬により呈色させ、ＴＣＡ可溶化蛋白
量を同時に作成したチロシンの検量線から算出して酵素
活性値を求めた。なお、酵素活性は１分間に１mmolのチ
ロシン等量のＴＣＡ可溶化蛋白を生成する酵素量を１Ｕ
と定義した。

【００４５】II．アルカリプロトペクチナーゼ生産菌の
分離 II−１．バチルス エスピー ＫＳＭ−３６６株の分離 日本各地の土壌を滅菌水に懸濁したもの、あるいは花王
（株）で保存している微生物をポリガラクツロン酸を含
有する寒天平板培地に塗布し、３０℃で３〜５日間培養
を行った。菌が生育した後、１％（ｗ／ｖ）ＣＴＡＢ溶
液（セチルトリメチルアンモニウムブロマイド）を流し
込み１０分間静置した。コロニーの周辺にポリガラクツ
ロン酸の分解によるクリアーゾーンを形成した菌を選抜
してペクチン酸リアーゼ生産菌として保存し、粗酵素を
調製し種々の評価に供した。その結果、アルカリプロト
ペクチナーゼ活性を有する酵素の生産菌としてバチルス
エスピー ＫＳＭ−３６６株を得た。

【００４６】ＫＳＭ−３６６株の菌学的性質は以下の通
りである。

【００４７】 Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌 ０．６〜０．８×３〜５μｍ （ｂ）多形性 無し （ｃ）運動性 有り（周鞭毛） （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無） ０．６〜１．０×１．０〜５μｍ，中央、 準端、膨潤無し （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上での生育 乳白色、円滑あるいは葉状のコロニーを形 成 （ｈ）リトマスミルク アルカリになり、液化する

【００４８】 Ｂ 生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元 陽性 （ｂ）脱窒反応 陰性 （ｃ）ＭＲテスト 陰性（pH５．８） （ｄ）ＶＰテスト 陽性 （ｅ）インドール生成 陰性 （ｆ）硫化水素生成 陰性 （ｇ）デンプン加水分解 陽性 （ｈ）クエン酸の利用 陽性 （ｉ）無機窒素の利用 硝酸塩、アンモニウム塩を利用する （ｊ）色素の生成 無し （ｋ）ウレアーゼ 陰性 （ｌ）オキシダーゼ 陽性 （ｍ）カタラーゼ 陽性 （ｎ）生育の温度範囲 １０℃〜４５℃（至適温度は、３０℃〜４ ０℃） （ｏ）生育のｐＨ範囲 pH５〜１１（最適生育pHは、pH６〜９） （ｐ）生育における酸素の影響 嫌気条件下で生育する （ｑ）ＯＦテスト −（生育するが、色調の変化はない） （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性 １０％の塩化ナトリウムを含有する培地で 生育可能 （ｓ）糖からの酸生成 ガラクトース、キシロース、アラビノース 、シュークロース、グルコース、マンニト ール、マンノース、イノシトール、ソルビ トール、トレハロース、グリセリン、マル トース、フラクトース、ラフィノース、メ リビオース及び可溶性でんぷんから酸を生 成し、ラクトースから酸を生成しない （ｔ）グルコースからのガスの発生 無し

【００４９】以上の菌学的性質について「Bergey' s Ma
nual of Systematic Bacteriology」(Willianm & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）
に属させることが妥当である。しかし、本菌株は、４５
℃までしか生育できない点、pH１１まで生育できるとい
う点において既知のバチルス リケニホルミスとは明ら
かに異なる新規な微生物である。

【００５０】以上の結果から、本菌株はバチルス リケ
ニホルミスに属させることが妥当であるが、いくつかの
点においてこれと相違し、他の公知の菌株とも異なるの
で本菌株を工業技術院生命工学技術研究所に バチルス
エスピー （Bacillus sp.）ＫＳＭ−３６６（ＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１４７７２ ＦＥＲＭ ＢＰ−６２６２）とし
て寄託した。

【００５１】II−２．バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ
１５株の分離 前記II−１と同じ方法により、アルカリプロトペクチナ
ーゼ活性を有する酵素の生産菌としてバチルス エスピ
ー ＫＳＭ−Ｐ１５株を得た。

【００５２】ＫＳＭ−Ｐ１５株の菌学的性質を以下に示
す。

【００５３】 Ａ 形態学的性質 （ａ）細胞の形及び大きさ 桿菌 ０．３〜０．５×１．６〜２．１μ ｍ （ｂ）多形性 無し （ｃ）運動性 有り （ｄ）胞子（大きさ、形、位置、膨潤の有無） ０．６〜０．７×１．２〜１．４μｍ， 中央、準端，膨潤有り （ｅ）グラム染色 陽性 （ｆ）抗酸性 陰性 （ｇ）肉汁寒天平板培地上での生育 黄白色、点状、隆起状、全縁のコロニーを 形成 （ｈ）リトマスミルク 僅かに赤色を呈するが凝固はしない

【００５４】 Ｂ 生理学的性質 （ａ）硝酸塩の還元 陽性 （ｂ）脱窒反応 陰性 （ｃ）ＭＲテスト 陽性（pH５．５） （ｄ）ＶＰテスト 陽性 （ｅ）インドール生成 陰性 （ｆ）硫化水素生成 陰性 （ｇ）デンプン加水分解 陽性 （ｈ）クエン酸の利用 陽性 （ｉ）無機窒素の利用 硝酸塩、アンモニウム塩を利用しない （ｊ）色素の生成 無し （ｋ）ウレアーゼ 陰性 （ｌ）オキシダーゼ 陽性 （ｍ）生育の温度範囲 ２０℃〜４５℃ （ｎ）生育のpH範囲 pH７〜１０ （ｏ）生育における酸素の影響 嫌気条件下で生育する （ｐ）ＯＦテスト 生育するが色調の変化は認められない （ｑ）グルコースからのガス産生 無し （ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性 ３％塩化ナトリウム含有培地で生育で きない （ｓ）糖からの酸生成 ガラクトース、キシロース、アラビノース 、シュークロース、グルコース、マンニト ール、マンノース、トレハロース、ラクト ース、グリセリン、マルトース、フラクト ース、ラフィノース、メリビオース及び可 溶性でんぷんから酸を生成するが、イノシ トール、ソルビトールから酸生成しない

【００５５】以上の菌学的性質について「Bergey' s Ma
nual of Systematic Bacteriology」(Williams & Wilki
ns社、1984年）の記載に準じ検討したところ、本菌株は
バチルス サーキュランス（Bacillus circulans）に属
させることが妥当である。しかし、バチルス サーキュ
ランスは、一般的に非常に多様性に富む菌株であり、本
菌株の諸性質は既知のバチルス サーキュランスの諸性
質とは完全に一致しない新規な微生物である。そこで
本菌株を工業技術院生命工学技術研究所にバチルス エ
スピー （Bacillus sp.）ＫＳＭ−Ｐ１５（ＦＥＲＭ
Ｐ−１５９８７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６２４１）として寄
託した。

【００５６】III．アルカリプロトペクチナーゼ活性を
有するペクチン酸リアーゼの調製法と酵素学的性質 III−１．バチルス エスピー ＫＳＭ−３６６株の生
産するペクチン酸リアーゼ

【００５７】Ａ．酵素の調製法 バチルス エスピー ＫＳＭ−３６６株を、ペクチン質
０．５％、炭酸ナトリウム０．５％を含むニュートリエ
ントブロス０．８％で総計７２時間培養した後、培養液
を遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄み液を限外
濾過（分画分子量６０００）により濃縮した。この濃縮
液を凍結乾燥して酵素原末を得た。本酵素はプロトペク
チナーゼ活性を有しており、本酵素を以後プロトペクチ
ナーゼＡとする。

【００５８】次いでプロトペクチナーゼＡを２５mMのト
リス−塩酸緩衝液（pH７．５）に溶解し、同緩衝液にて
平衡化したスーパーＱ トヨパール６５０Ｃ（東ソー
（株））カラム（５×２０cm）に適用した。平衡化緩衝
液にて溶出される画分（カラムに非吸着な画分）を集
め、さらにこれを２０mMリン酸緩衝液（pH６．０）で平
衡化したＳＰトヨパール５５０Ｃ（東ソー（株））カラ
ム（２．５×２０cm）に添着した。０〜０．３Ｍの塩化
ナトリウムを含む同平衡化緩衝液を用いた濃度勾配溶出
法によりタンパク質を溶出させ、ペクチナーゼ活性を示
す画分を集めた。この画分を限外濾過（ＰＭ１０メンブ
レン, 分画分子量１００００，アミコン社）にて濃縮
後、１００mM塩化ナトリウム、１mM塩化カルシウムを含
む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）で平衡化した
セファクリルＳ−２００（ファルマシア社）カラム
（２．６×６０cm）に適用して同緩衝液にて溶出させ
た。溶出したほぼ単一タンパクより成るペクチナーゼ活
性画分を集めて透析、凍結乾燥して精製粉末酵素を得
た。本酵素はプロトペクチナーゼ活性を有しており、本
酵素をプロトペクチナーゼＰＡとする。

【００５９】Ｂ．酵素学的性質 （ａ）標準酵素活性測定法 ０．５mM塩化カルシウム、０．２％ポリガラクツロン酸
（シグマ社）、及び０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH
８）を含む基質溶液（３ml）を３０℃で５分間恒温した
後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希釈は１mM塩化
カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液，pH７．５
により行った）を加え反応を開始した。３０℃で２０分
間インキュベートした後、沸騰水中で５分間放置し反応
を停止した。生成した不飽和オリゴガラクツロン酸量は
２３５nmにおける吸光度を測定し、不飽和ジガラクツロ
ン酸の分子吸光係数４６００Ｍ^-1cm^-1（S. Hasegawa an
d C.W. Nagel, J. Food Sci., 31, 838(1966)）を用い
て求めた。なお、ブランクは酵素液を加えた直後に沸騰
水中で５分間放置したものを用いた。酵素１単位（１
Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μmol の不
飽和ジガラクツロン酸相当の不飽和オリゴガラクツロン
酸を生成する量とした。尚、最適反応pHを求める実験で
は２３５nmでの吸光度の増加を直接測定するタイムスキ
ャン法を用いた。

【００６０】（ｂ）最適反応pH ０．２Ｍブリトン・ロビンソン広域緩衝液（pH６．５〜
１２．０）を用いて標準酵素活性測定法に従って測定し
た。その結果、最適反応pHは８．０〜９．０であった。

【００６１】（ｃ）最適反応温度 ０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（pH８．０）中にて５℃〜
７０℃の各温度で酵素反応を行い、最適反応温度を調べ
た。その結果、本酵素は、１０℃〜７０℃の広範囲にお
いて作用し、その最適反応温度は約６０℃であった。

【００６２】（ｄ）分子量 ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミ
ド電気泳動法（１２．５％ゲル）により求めた。その結
果、本酵素の分子量は約４３ｋＤａと見積られた。

【００６３】（ｅ）等電点 pH８〜１０．５、又はpH３〜１０のアンフォライン（フ
ァルマライト，ファルマシア社）を含む５％ポリアクリ
ルアミドゲルを用いた等電点電気泳動法により求めた。
その結果、本酵素の等電点はpH１０．３付近であった。

【００６４】III−２．バチルス エスピー ＫＳＭ−
Ｐ１５株の生産するペクチン酸リアーゼ

【００６５】Ａ．酵素の調製法 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株を、III−１．
Ａ．と同様にして培養し、酵素原末を得た。本酵素はプ
ロトペクチナーゼ活性を有しており、本酵素を以後プロ
トペクチナーゼＢとする。

【００６６】次いでプロトペクチナーゼＢを１mM塩化カ
ルシウムを含む５０mMのトリス−塩酸緩衝液（pH７．
５）に溶解し、同緩衝液にて平衡化したスーパーＱ ト
ヨパール６５０Ｃ（東ソー（株））カラム（５×２０c
m）に適用した。平衡化緩衝液にて溶出される画分（カ
ラムに非吸着な画分）を集め、さらにこの画分をBio Ca
d60 HPLCシステム (日本パーゼプティブ社) を用いて精
製した。この際の使用カラムはＨＳ( スルフォプロピル
基；１×１０cm) 、使用緩衝液は０．２mM塩化カルシウ
ムを含む２０mM トリス−塩酸緩衝液（pH７．０）とし
た。同カラムに吸着したタンパクを０〜０．２Ｍの塩化
ナトリウムを含む同緩衝液を用いた濃度勾配溶出法によ
って溶出し、ほぼ単一のタンパクよりなるペクチナーゼ
活性画分を集めて、透析、凍結乾燥して精製粉末酵素を
得た。本酵素はプロトペクチナーゼ活性を有しており本
酵素をプロトペクチナーゼＰＢとする。

【００６７】Ｂ．酵素学的性質 （ａ）標準酵素活性測定法 試験管に０．３mlの０．５Ｍ グリシン−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（pH１０．５）、０．３mlの６mM 塩化カル
シウム溶液、１．７mlの脱イオン水を加え、３０℃で５
分間恒温した後、０．１mlの適当に希釈した酵素液（希
釈は１mM塩化カルシウムを含む５０mMトリス−塩酸緩衝
液、pH７．５により行った）を加えさらに５分間恒温し
た。反応は、０．６mlの１％（ｗ／ｖ）ポリガラクツロ
ン酸（ICN Biomedicals社）水溶液を添加し開始した。
３０℃で１０分間インキュベートした後、３mlの５０mM
塩酸を加え反応を停止した。生成した不飽和オリゴガ
ラクツロン酸量は２３５nmにおける吸光度を測定し、不
飽和ジガラクツロニドの分子吸光係数４６００Ｍ^-1cm^-1
（S. Hasegawa and C. W. Nagel, J. Food Sci., 31, 8
38(1966)）を用いて求めた。なお、ブランクは酵素液を
加えずに処理した反応液に３mlの５０mM塩酸を加え、そ
の後に０．１mlの酵素液を添加したものを用意した。酵
素１単位（１Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に
１μmol の不飽和ジガラクツロニド相当の不飽和オリゴ
ガラクツロニドを生成する量とした。

【００６８】（ｂ）最適反応pH ５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７〜９）、又は５０mMグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH８．５〜１１．
０）を用いて標準酵素活性測定法に従って測定した。そ
の結果、本酵素はグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液pH
１０．５中で最大の活性を示した。pH１０．３〜１０．
７の範囲内においては最高活性の９０％以上の活性を示
した。さらにpH１０．０〜１１．０の範囲内においては
最高活性の７０％以上の活性を示した。

【００６９】（ｃ）最適反応温度 ５０mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH１０．
５）中にて１０℃〜７０℃の各温度で酵素反応を行い、
最適反応温度を調べた。その結果、本酵素は、１０℃−
６５℃の広範囲において作用し、その最適反応温度は５
０〜５５℃であった。

【００７０】（ｄ）分子量 （ｄ−１）沈降平衡法による本酵素の分子量は２０．３
±１．０ｋＤａであった。

【００７１】（ｄ−２）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電
気泳動法（１５％ゲル）により求めた。その結果、本酵
素の分子量は約２６ｋＤａと見積られた。尚、標準蛋白
質として分子量マーカー（SDS-PAGE Molecular Weight
Standard, Low Range（Bio-Rad社））を用いた。

【００７２】（ｅ）等電点 pH８−１０．５のアンフォライン（ファルマライト，フ
ァルマシア社）を含む５％ポリアクリルアミドゲルを用
いた等電点電気泳動法により求めた。その結果、本酵素
の等電点はpH１０．３付近であった。

【００７３】（ｆ）アミノ末端配列 本酵素をＰｒｏＳｏｒｂフィルター（パーキンエルマー
社）にブロッティングし、プロテインシークエンサー
（６７４型，アプライドバイオシステム社製）を用いて
アミノ末端配列を決定した結果、ＡＰＴＶＶＨＥＴＩＲ
ＶＰＡＧＱＴＦＤＧＫを含んでいた。

【００７４】（ｇ）分子内アミノ酸配列 酵素をリシルエンドペプチダーゼで処理し、分子内ペプ
チドフラグメントをＣ末端フラグメント自動分取装置
（ＣＴＦＦ−１：島津製作所（株））を用いて得た。こ
のサンプルをＰｒｏＳｏｒｂフィルターにブロッティン
グし、プロティンシークエンサーによりＮ−末端アミノ
酸配列を決定したところ、ＶＶＩＧＡＰＡＡＤＧＶＨで
あった。

【００７５】（ｈ）各種化合物の影響 各種化合物を５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）中
に添加し、酵素液を加えて３０℃、１時間恒温した後に
残存活性を標準酵素活性測定法にて調べた。その結果、
本酵素は、各種界面活性剤（０．０１〜０．１％）、各
種キレート剤（０．１５〜０．２０％）、他の化合物に
より阻害されることはなかった。

【００７６】IV． バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１
５株由来のペクチン酸リアーゼ遺伝子のクローニングと
形質転換株からの該酵素の調製

【００７７】IV−１．遺伝子のクローニング Ａ．ゲノムＤＮＡの調製 バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｐ１５株を液体培地で好
気的に培養し、培養液を遠心し、菌体を回収した。得ら
れた菌体からＳａｉｔｏとＭｉｕｒａの方法（Biochim.
Biophys. Acta, 72, 619(1963)）でゲノムＤＮＡを調
製した。

【００７８】Ｂ．プライマーの調製 前記（III−２）のＢ−ｆ及びＢ−ｇの結果から、プラ
イマー１及びプライマー２を合成した（図１）。 Ｃ．クローニング このプライマー１と２を用い、バチルス エスピー Ｋ
ＳＭ−Ｐ１５のゲノムＤＮＡ（０．５μｇ）を鋳型とし
て、ＰＣＲを行った。得られた増幅断片をＰＣＲ断片精
製キット（ベーリンガー・マンハイム社）で精製した
後、プラスミドベクターｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に導
入してクローン化した。得られたクローンの塩基配列を
決定したところ、目的とするペクチン酸リアーゼ遺伝子
配列の一部が検出され、アミノ酸配列も推定できた（図
２参照）。次に、上述のＰＣＲ増幅断片の上流と下流の
領域を増幅するためにインバースＰＣＲ（inverse PC
R）を行った。図２中に認められる塩基配列、プライマ
ー３とプライマー４を用いた。ＫＳＭ−Ｐ１５株のゲノ
ムＤＮＡ（１μｇ）を、あらかじめＰｓｔＩで消化し、
フェノール／クロロホルム抽出して、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼを用いて分子内結合（環状化ＤＮＡ結合）させて鋳型
とした。ＰＣＲは、Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｓｙ
ｓｔｅｍ ＰＣＲキット（TaKaRa（株））を用いて行っ
た。その結果約２．０kbp の増幅断片が検出され、ダイ
レクトシークエンスによってこのＤＮＡ断片の配列を決
定した。Ｎ−末端アミノ酸配列から終止コドン（TAA）
の前のアミノ酸までの１９７アミノ酸からなるペクチン
酸リアーゼのアミノ酸配列及び塩基配列を配列番号１に
示した。ＫＳＭ−Ｐ１５株の生産するペクチン酸リアー
ゼ（分泌型成熟酵素）の分子量は、この配列から２０９
２４Ｄａ（約21kDa）と推定される。

【００７９】ＫＳＭ−Ｐ１５株の産生するペクチン酸リ
アーゼのＮ−末端アミノ酸Ａｌａの直上流に存在する、
推定シグナルペクチナーゼ認識配列Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａ
ｌａと、用いた宿主のベクター由来のシグナル配列が連
結するようにプライマー５（図３参照）をデザインし
た。プライマー６（図３参照）は、ペクチン酸リアーゼ
遺伝子の終止コドン（TAA）から３７２bp下流に位置す
る２６bpからなる配列をデザインした。

【００８０】プライマー５と６を用い、ＫＳＭ−Ｐ１５
株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い、約１kbp
のＤＮＡ断片が増幅された。これをＳａｌＩで消化して
おき、ＳａｌＩとＳｍａＩで切断されたｐＨＳＰ６４
（Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56,
872(1992)）とリガーゼで連結した（図４を参照）。こ
の組換えプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１を形質転換さ
せ、寒天平板培地で生育させたところ、クリアーゾーン
を集落の囲りに形成した（実施例II参照）。得られた本
発明の遺伝子をコードする組換えプラスミドをｐＨＳＰ
−Ａ１５６と命名した。

【００８１】IV−２．酵素の調製 ｐＨＳＰ−Ａ１５６で枯草菌ＩＳＷ１２１４を形質転換
し、液体培地中で３０℃で３日間培養したところ菌体外
に著量のペクチン酸リアーゼを生産した。

【００８２】得られたペクチン酸リアーゼの粗酵素液を
前記III−２−Ａに従って精製した。本酵素はプロトペ
クチナーゼ活性を有しており、本酵素を以後プロトペク
チナーゼＲＢとする。プロトペクチナーゼＲＢのpH−活
性曲線はプロトペクチナーゼＰＢのそれとほぼ完全に一
致していた。

【００８３】Ｖ．洗浄試験 Ｖ−１．洗浄実験に使用する各種酵素の調製 （ａ）プロトペクチナーゼＡ：前記III−１−Ａ記載の
方法により調製 （ｂ）プロトペクチナーゼＰＡ：前記III−１−Ａ記載
の方法により調製 （ｃ）プロトペクチナーゼＢ：前記III−２−Ａ記載の
方法により調製 （ｄ）プロトペクチナーゼＰＢ：前記III−２−Ａ記載
の方法により調製 （ｅ）プロトペクチナーゼＲＢ：前記IV−２記載の方法
により調製

【００８４】（ｆ）プロトペクチナーゼＣ バチルス ズブチリス（Bacillus subtilis）ＩＦＯ１
２１１３株を、坂井らの方法（Agric. Biol. Chem., 5
3, 1213 (1989)）に準じて培養した後、菌体を遠心分離
し、得られた上澄み液を限外濾過（分画分子量６００
０）により濃縮した。この濃縮液を凍結乾燥して酵素原
末を得た。本酵素は綿ペクチン遊離力を有しており、本
酵素を以後プロトペクチナーゼＣとする。本酵素はペク
チナーゼ活性を有していないことからＢタイププロトペ
クチナーゼと判断された。

【００８５】（ｇ）ペクチナーゼＤ バチルス エスピー ＫＳＭ−Ｓ２７２株（工業技術院
生命工学技術研究所寄託番号FERM P-16066）を培養した
後、培養液を遠心分離して菌体を除去し、得られた上澄
み液を限外濾過（分画分子量６０００）により濃縮し
た。この濃縮液を凍結乾燥してペクチナーゼ活性を有す
る酵素原末を得た。本酵素を以後ペクチナーゼＤとす
る。プロトペクチナーゼＤは、アルカリペクチン酸リア
ーゼ活性を有していたが、プロトペクチナーゼ活性を有
していなかった。

【００８６】（ｈ）ペクチナーゼＰＤ 次いでペクチナーゼＤを１mM塩化カルシウムを含む５０
mMのトリス−塩酸緩衝液（pH７．５）に溶解し、同緩衝
液にて平衡化したスーパーＱ トヨパール６５０Ｍ（東
ソー（株））カラム（２．５×１０cm）に適用した。平
衡化緩衝液にて溶出される画分（カラムに非吸着な画
分）を集め、さらにこの画分をBio Cad 60HPLC システ
ム (日本パーゼプティブ社) を用いて精製した。この際
の使用カラムはＨＳ（スルフォプロピル基；１×１０c
m）、使用緩衝液は０．２mM塩化カルシウムを含む２０m
Mトリス−塩酸緩衝液（pH７．０）とした。同カラムに
吸着したタンパクを０〜０．２Ｍの塩化ナトリウムを含
む同緩衝液を用いた濃度勾配溶出法によって溶出し、ほ
ぼ単一のタンパクよりなるペクチナーゼ活性画分を集め
て、透析、凍結乾燥して精製粉末酵素を得た。本酵素を
ペクチナーゼＰＤとする。なおペクチナーゼＰＤは、プ
ロトペクチナーゼＰＡ、ＰＢと同様にアルカリペクチン
酸リアーゼ活性を有していたが、プロトペクチナーゼ活
性は有していなかった。

【００８７】（ｉ）市販ペクチナーゼ 以下のものを使用した。 スクラーゼＮ（三共（株）） ペクチナーゼタナベ（田辺製薬（株）） ペクトリアーゼ（キッコーマン（株）） ペクチナーゼＳＳ（ヤクルト（株）） ペクチナーゼＨＬ（ヤクルト（株））

【００８８】Ｖ−２．洗浄試験に使用する酵素の活性

【００８９】

【表１】

【００９０】１）ブリトン・ロビンソン広域緩衝液を用
いて測定。ただし、＊部は同緩衝液中では活性測定不能
のため、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液にて測定。 ２）トリス−塩酸緩衝液（pH８．０）にて測定。 ３）プロトペクチナーゼＡ，ＰＡ，Ｂ，ＰＢ，ＲＢとペ
クチナーゼＤはグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH
１０．０）、その他の酵素はクエン酸緩衝液（pH５．
０）中にて測定。 ４）Ｂタイププロトペクチナーゼ。ポリガラクツロン酸
分解活性を有しない。 ５）活性がないため測定できず。

【００９１】Ｖ−３．洗浄試験方法 １．人工泥汚れ汚染布洗浄試験 鹿沼赤玉土を木綿メリヤス布に付着させた人工泥汚れ汚
染布を調製した。４°ＤＨ硬水（71.2mg CaCO₃/l）に後
述の配合組成からなる洗剤を使用濃度に溶解し、洗剤溶
液１Ｌを調製し、ターゴトメーター用ステンレスビーカ
ーに移す。人工泥汚染布５枚を洗剤溶液中に加え、１０
０rpm 、３０℃、１０分間攪拌洗浄する。流水下で濯い
だ後、アイロンプレスして反射率測定に供した.汚染布
の原布、及び洗浄前後の汚染布の反射率を自記色彩計
（島津製作所（株））にて測定し、次式によって洗浄率
（％）を算出した。

【００９２】

【数１】

【００９３】２．泥靴下汚れ洗浄試験 スポーツソックス（綿／アクリル等の混紡・グンゼ
（株））を人に着用させ、布に用いたのと同じ泥を左右
均等に付着させた後、靴下の片側１０足（左右５足ず
つ）を比較洗剤系で、残りの１０足を試料洗剤組成系で
洗浄した。

【００９４】洗浄方法は３０℃、４°ＤＨの水３０Ｌに
後述の配合組成からなる洗剤を使用濃度に溶解し、家庭
用２槽式洗濯機で１０分間洗浄し、５分間流水濯ぎした
後、脱水して乾燥させた。

【００９５】洗浄力評価は酵素無添加洗剤（基準洗剤）
で洗浄した靴下の片側を対照として、試験組成（酵素添
加洗剤）で洗浄したもう片側の靴下と下記基準で一対比
較して判定した。判定は１０足の靴下を３名の判定者で
行い、全ての総合点数により洗浄力評価点数とした。

【００９６】 ＋２：基準洗剤より明らかに優る ＋１：基準洗剤よりやや優る ０：基準洗剤と同等 −１：基準洗剤よりやや劣る −２：基準洗剤より明らかに劣る

【００９７】Ｖ−４．洗浄試験結果 Ａ．衣料用洗浄剤における効果 （ａ）使用洗浄剤組成

【００９８】

【表２】

【００９９】ＬＡＳ：直鎖アルキル（Ｃ_12-14）ベンゼ
ンスルホン酸ソーダ（液体洗剤は酸型で配合） ＡＳ：ドデシルアルコール硫酸エステルソーダ ＡＥ−１：ポリオキシエチレンラウリルエーテル（ＥＯ
平均付加モル数４） ＡＥ−２：ポリオキシエチレンアルキル（Ｃ_12-14）エ
ーテル（ＥＯ平均付加モル数６） ＡＥＰ：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンラウ
リルエーテル（ＥＯ平均付加モル数８、ＰＯ平均付加モ
ル数３） ＡＥＳ：ポリオキシエチレンアルキル（Ｃ_10-12）エー
テル硫酸ソーダ（ＥＯ平均付加モル数２．５） 脂肪酸：ヤシ油由来脂肪酸ソーダ ゼオライト：４Ａ型ゼオライト、平均粒径３μｍ 非晶質アルミノ珪酸塩：下記合成例１記載 炭酸ソーダ：デンス粒灰 非晶質珪酸塩：ＪＩＳ２号珪酸ソーダ 結晶性珪酸塩：ＳＫＳ−６（ヘキストトクヤマ社）粉砕
品、平均粒径１５μｍ ＡＡ−ＭＡ：ソカランＣＰ５、アクリル酸−マレイン酸
共重合体（ＢＡＳＦ社） ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、平均分子量８，００
０

【０１００】合成例１（非晶質アルミノ珪酸塩の製造方
法） アルミン酸ナトリウム水溶液（Na₂O 1.55 重量％、Al₂O
₃ 2.30重量％、Na₂O/Al₂O₃＝1.11（モル比））１０１０
ｇを４０℃に加熱し、１５００rpm の回転数で攪拌しな
がら、そこに、ケイ酸ナトリウム水溶液（Na₂O 2.75重
量％、SiO₂ 7.88重量％、SiO₂/Na₂O＝2.96（モル比））
７００ｇと塩化カルシウム２水和物１．２ｇを２０分間
かけて滴下しつつ反応させた。滴下終了後、さらに１５
分間加熱処理を行い、その後、固体を濾別、洗浄した。
得られた湿潤ケーキを、１０５℃、３００torrで１０時
間乾燥し、粉砕することによって、Ｘ線的に非晶質のア
ルミノケイ酸塩微粉末を得た。得られた非晶質アルミノ
ケイ酸塩の組成は、原子吸光分析及びプラズマ発光分析
の結果、Ａｌ₂Ｏ₃＝２１．１重量％、ＳｉＯ₂＝５７．
２重量％、Ｎａ₂Ｏ＝２０．８重量％、ＣａＯ＝０．９
重量％であった（1.65Na₂O・0.08CaO・Al₂O₃・4.75Si
O₂）。また、その吸油能は２１０ml／１００ｇであっ
た。

【０１０１】（ｂ）試験結果 上記の組成を有する洗剤（ア）〜（エ）に各種酵素を添
加して洗浄した結果を（ｂ−１）〜（ｂ−５）に示す。
これらの結果から明らかなように、本発明品プロトペク
チナーゼ配合洗剤は、諸条件下で比較品ペクチナーゼよ
りも明らかに高い洗浄効果を示す。しかもプロトペクチ
ナーゼＡやＢのようなアルカリ酵素であれば、洗液pHの
高い洗剤中で高い効果を発揮できる。また、この効果は
浸漬等を行わなくとも得ることができる。さらに同じよ
うにアルカリ至適のペクチナーゼ活性を有する酵素であ
っても、綿ペクチン遊離力を有するプロトペクチナーゼ
ＡやＢには高い洗浄効果があり、綿ペクチン遊離力がな
いペクチナーゼＤには洗浄効果が認められないことか
ら、アルカリプロトペクチナーゼが洗浄成分として有効
であることは明らかである。

【０１０２】（ｂ−１）洗剤（ア) での洗浄試験結果
（洗液pH１０．７） 洗浄条件：ターゴトメーター１００rpm、１０分、３０
℃洗浄

【０１０３】

【表３】

【０１０４】本発明品プロトペクチナーゼ配合洗剤は洗
液pHの高い重質洗剤中でも普通洗浄で高い洗浄効果を挙
げていることがわかる。一方比較品の市販ペクチナーゼ
配合洗剤はほとんど洗浄効果が認められない。また、そ
の洗浄効果の違いは泥靴下洗浄評価で一層顕著である。
また、洗浄効果は粗酵素でも認められるが、精製したプ
ロトペクチナーゼを用いれば僅かな配合量でも高い洗浄
効果が得られることがわかる。

【０１０５】（ｂ−２）洗剤（イ) での洗浄試験結果
（洗液pH１０．６） 洗浄条件：ターゴトメーター１００rpm、１０分、３０
℃洗浄

【０１０６】

【表４】

【０１０７】本発明品プロトペクチナーゼ配合洗剤はノ
ニオン活性剤を主体とする洗液pHの高い重質洗剤中でも
普通洗浄で高い洗浄効果を挙げていることがわかる。一
方比較品の市販ペクチナーゼ配合洗剤はほとんど洗浄効
果が認められない。また、洗浄効果は粗酵素でも認めら
れるが、精製したプロトペクチナーゼを用いれば僅かな
配合量でも高い洗浄効果が得られることがわかる。

【０１０８】（ｂ−３）洗剤（ウ) での洗浄試験結果
（洗液pH９．２） 洗浄条件：ターゴトメーター１００rpm、１０分、３０
℃洗浄

【０１０９】

【表５】

【０１１０】本発明品プロトペクチナーゼ配合洗剤が液
体洗剤組成中でも高い洗浄効果を挙げていることがわか
る。一方比較品の市販ペクチナーゼ配合洗剤はほとんど
洗浄効果が認められない。また、洗浄効果は粗酵素でも
認められるが、精製したプロトペクチナーゼを用いれば
僅かな配合量でも高い洗浄効果が得られることがわか
る。

【０１１１】（ｂ−４）洗剤（エ) での洗浄試験結果
（洗液pH８．０） 洗浄条件：使用濃度の６倍濃度にて１時間、４０℃浸漬
後、使用濃度とし、ターゴトメーター１００rpm、１０
分、３０℃洗浄した。

【０１１２】

【表６】

【０１１３】本発明品プロトペクチナーゼ配合洗剤が高
い洗浄効果を挙げていることがわかる。４０℃、６倍濃
度浸漬条件では比較品の市販ペクチナーゼ配合洗剤でも
若干の効果が認められるが、その効果は本発明品には及
ばない。また、洗浄効果は粗酵素でも認められるが、精
製したプロトペクチナーゼを用いれば僅かな配合量でも
高い洗浄効果が得られることがわかる。

【０１１４】（ｂ−５）洗剤（エ) での洗浄試験結果
（洗液pH８．０） 洗浄条件：ターゴトメーター１００rpm、１０分、３０
℃洗浄

【０１１５】

【表７】

【０１１６】本発明品プロトペクチナーゼ配合洗剤は浸
漬洗浄しなくても高い洗浄効果を挙げていることがわか
る。一方比較品の市販ペクチナーゼ配合洗剤は普通洗浄
だけではほとんど洗浄効果が認められない。また、洗浄
効果は粗酵素でも認められるが、精製したプロトペクチ
ナーゼを用いれば僅かな配合量でも高い洗浄効果が得ら
れることがわかる。

【０１１７】さらに、表８及び９に示す組成の洗浄剤１
００重量部にプロトペクチナーゼＡ、Ｂ、ＰＡ、ＰＢ又
はＲＢを０．１重量部配合して本発明洗浄剤組成物を調
製した。なお、粒状洗浄剤の場合には、酵素、ＰＣ、Ａ
Ｃ−１、ＡＣ−２を除いた成分で粒子化した洗剤生地
に、酵素、ＰＣ、ＡＣ−１、ＡＣ−２をそれぞれ粒子化
したものをブレンドすることにより製造する。得られた
洗浄剤は、優れた洗浄力を有し、衣料用洗浄剤として有
用である。

【０１１８】

【表８】

【０１１９】

【表９】

【０１２０】ＬＡＳ−２：アルキルベンゼンスルホン酸
「アルケンＬ（アルキル鎖の炭素数１０〜１４），日石
洗剤（株）」を４８％ＮａＯＨで中和したもの ＬＡＳ−３：アルキルベンゼンスルホン酸「アルケンＬ
（アルキル鎖の炭素数１０〜１４），日石洗剤（株）」
を５０％ＫＯＨで中和したもの ＡＳ−２：ドバノール２５サルフェート（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₅硫
酸）のソーダ塩，三菱化学（株） ＳＡＳ：Hostapur ＳＡＳ ９３（Ｃ₁₃〜Ｃ₁₈アルカンス
ルホン酸ソーダ），ヘキストジャパン（株） ＡＯＳ：アルファオレフィンスルホン酸ソーダ ＳＦＥ：パーム油由来、アルファスルホ脂肪酸メチルエ
ステルソーダ 脂肪酸塩：パルミチン酸ソーダ ＡＥＳ−２：ポリオキシエチレンアルキル（Ｃ₁₂〜
Ｃ₁₅）エーテル硫酸ソーダ（ＥＯ平均付加モル数２） ＡＥ−３：ノニデッド Ｓー３（Ｃ₁₂、Ｃ₁₃アルコール
にＥＯを平均３モル付加したもの），三菱化学（株） ＡＥ−４：ノニデッド Ｒ−７（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₅アルコール
にＥＯを平均７．２モル付加したもの），三菱化学
（株） ＡＥ−５：ソフタノール ７０（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₅ ２級アルコ
ールにＥＯを平均７モル付加したもの），日本触媒 ＡＧ：アルキル（ヤシ油由来）グルコシド（平均重合度
１．５） 吸油性担体：ＴＩＸＯＬＥＸ ２５（非晶質アルミノ珪
酸ソーダ、吸油能２３５ml／１００ｇ），コフランケミ
カル社 結晶性珪酸塩：ＳＫＳ−６（δーＮａ₂Ｓｉ₂Ｏ₅，結晶
性層状シリケート，平均粒子径２０μｍ），ヘキストト
クヤマ社 非晶質珪酸塩：ＪＩＳ１号珪酸ソーダ ＳＴＰＰ：トリポリリン酸ソーダ ＮＴＡ：ニトリロトリ酢酸ソーダ ＰＡＡ：ポリアクリル酸ソーダ、平均分子量１２０００ ＡＡ−ＭＡ：ソカランＣＰ５（アクリル酸−マレイン酸
共重合体），ＢＡＳＦ社 ＣＭＣ：サンローズＢ１Ｂ（カルボキシメチルセルロー
スソーダ），山陽国策パルプ（株）（現在、日本製紙
（株）） ＰＥＧ：ポリエチレングリコール、平均分子量６０００ ＰＶＰ：ポリビニルピロリドン、平均分子量４０００
０、Ｋ値＝２６〜３５ 蛍光染料：チノパールＣＢＳ（チバガイギー社）と、ホ
ワイテックスＳＡ（住友化学社）を重量比１：１で配合
したもの（注意：液体洗剤の場合はチノパールＣＢＳの
み配合） 香料：特開平８−２３９７００号公報の実施例記載の香
料組成を使用 酵素：サビナーゼ12.0TW（プロテアーゼ）、リポラーゼ
100T（リパーゼ）、ターマミル60T（アミラーゼ）（以
上の酵素はノボノルディスク社）、及びＫＡＣ５００
（セルラーゼ、花王）を重量比率で２：１：１：１の割
合で配合したもの（注意：液体洗剤はサビナーゼ16.0Ｌ
（プロテアーゼ、ノボノルディスク社）のみを配合） ＰＣ：過炭酸ソーダ、平均粒子径４００μｍ、メタホウ
酸ソーダにて被覆したもの ＡＣ−１：ＴＡＥＤ（テトラアセチルエレンジアミ
ン），ヘキスト社 ＡＣ−２：ラウロイルオキシベンゼンスルホン酸ソーダ

【０１２１】Ｂ．漂白洗浄剤における効果 表１０記載の組成の漂白洗浄剤を調製し、０．５％水溶
液中２０℃、３０分浸漬後、洗剤（ア）にてターゴトメ
ーターで１００rpm 、１０分、２０℃で人工泥汚染布を
洗浄した。その結果を表１０に示す。

【０１２２】

【表１０】

【０１２３】１）直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナト
リウム（炭素数１２〜１４） ２）ポリオキシエチレンアルキルエーテル（アルキル基
の炭素数１２〜１４、ＥＯ平均付加モル数１２） ３）平均分子量８０００ ４）プロトペクチナーゼＰＢを特開昭６２−２５７９９
０記載の方法に基づき、50000Ｕ／ｇ（pH１０でのペク
チナーゼ活性）造粒物としたもの ５）プロトペクチナーゼＲＢを特開昭６２−２５７９９
０記載の方法に基づき、50000Ｕ／ｇ（pH１０．０での
ペクチナーゼ活性）造粒物としたもの

【０１２４】表１０から、本発明品プロトペクチナーゼ
配合漂白洗浄剤が非常に高い泥汚れ洗浄力を有している
ことがわかる。

【０１２５】Ｃ．プロトペクチナーゼとセルラーゼ及び
／又はプロテアーゼとの併用系における効果 前記洗剤（ア）（表２参照）に下記表１１記載の配合量
にて各種酵素を添加して人工泥汚染布を洗浄した（洗液
pH１０．７、洗浄条件：ターゴトメーター１００rpm，
１０分，３０℃洗浄）。

【０１２６】

【表１１】

【０１２７】１）プロトペクチナーゼＰＢを特開昭６２
−２５７９９０記載の方法に基づき、50000Ｕ／ｇ（pH
１０．０でのペクチナーゼ活性）造粒物としたもの。 ２）プロトペクチナーゼＲＢを特開昭６２−２５７９９
０記載の方法に基づき、50000Ｕ／ｇ（pH１０．０での
ペクチナーゼ活性）造粒物としたもの。 ３）ＫＡＣ−５００（セルラーゼ，花王製）500Ｕ／
ｇ。 ４）特開平５−２５４９２号記載のプロテアーゼＫ−１
６を特開昭６２−２５７９９０記載の方法に基づき、５
Ｕ／ｇ造粒物としたもの。

【０１２８】その結果、本発明品プロトペクチナーゼと
セルラーゼ、又はプロテアーゼとを併用することで泥汚
れ洗浄効果がより向上することがわかる。また、本発明
品プロトペクチナーゼ、セルラーゼ及びプロテアーゼの
３者を併用することでさらに泥汚れ洗浄効果が向上する
ことがわかる。

【０１２９】また、こうした酵素の併用効果は下に例示
した商標名で市販されている他のセルラーゼやプロテア
ーゼでも得ることができる。 セルラーゼ：セルザイム（ノボノルディスク社） プロテアーゼ：アルカラーゼ、エスペラーゼ、サビナー
ゼ、デュラザイム（ノボノルディスク社）プラフェク
ト、マキサペム、プロペラーゼ（ジェネンコア社）

【０１３０】

【発明の効果】本発明洗浄剤組成物は、泥汚れに対する
洗浄力が極めて高く、衣料用洗浄剤として特に優れてい
る。

【０１３１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５９１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：バチルス エスピー（Bacillus sp.） 株名：ＫＳＭ−Ｐ１５ 配列 GCG CCG ACG GTC GTT CAT GAA ACG ATT CGT GTG CCT GCC GGT CAG ACG 48 Ala Pro Thr Val Val His Glu Thr Ile Arg Val Pro Ala Gly Gln Thr 5 10 15 TTT GAC GGA AAA GGG CAG ACC TAT GTG GCT AAT CCG AAT ACA TTG GGG 96 Phe Asp Gly Lys Gly Gln Thr Tyr Val Ala Asn Pro Asn Thr Leu Gly 20 25 30 GAC GGA TCG CAG GCG GAG AAT CAG AAG CCG ATC TTT CGT CTG GAG GCT 144 Asp Gly Ser Gln Ala Glu Asn Gln Lys Pro Ile Phe Arg Leu Glu Ala 35 40 45 GGG GCA AGC CTG AAA AAT GTA GTG ATT GGC GCT CCT GCC GCT GAC GGG 192 Gly Ala Ser Leu Lys Asn Val Val Ile Gly Ala Pro Ala Ala Asp Gly 50 55 60 GTG CAC TGC TAC GGG GAT TGT ACG ATT ACA AAT GTC ATC TGG GAG GAT 240 Val His Cys Tyr Gly Asp Cys Thr Ile Thr Asn Val Ile Trp Glu Asp 65 70 75 80 GTT GGT GAG GAT GCG CTG ACG CTT AAA TCG TCC GGA ACG GTG AAC ATC 288 Val Gly Glu Asp Ala Leu Thr Leu Lys Ser Ser Gly Thr Val Asn Ile 85 90 95 TCG GGC GGG GCA GCC TAC AAG GCG TAT GAC AAG GTG TTC CAA ATC AAT 336 Ser Gly Gly Ala Ala Tyr Lys Ala Tyr Asp Lys Val Phe Gln Ile Asn 100 105 110 GCA GCG GGG ACG ATC AAC ATT CGT AAC TTC AGG GCC GAT GAC ATC GGG 384 Ala Ala Gly Thr Ile Asn Ile Arg Asn Phe Arg Ala Asp Asp Ile Gly 115 120 125 AAG CTG GTT CGG CAG AAC GGA GGC ACC ACC TAC AAA GTG GTG ATG AAC 432 Lys Leu Val Arg Gln Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Lys Val Val Met Asn 130 135 140 GTG GAA AAC TGC AAC ATT TCC AGA GTG AAG GAT GCG ATC CTG AGA ACG 480 Val Glu Asn Cys Asn Ile Ser Arg Val Lys Asp Ala Ile Leu Arg Thr 145 150 155 160 GAC AGC AGC ACA AGC ACA GGA CGA ATT GTG AAT ACC CGC TAT TCT AAC 528 Asp Ser Ser Thr Ser Thr Gly Arg Ile Val Asn Thr Arg Tyr Ser Asn 165 170 175 GTG CCA ACA TTG TTC AAA GGC TTT AAA TCA GGC AAT ACC ACC GCA TCC 576 Val Pro Thr Leu Phe Lys Gly Phe Lys Ser Gly Asn Thr Thr Ala Ser 180 185 190 GGA AAT ACG CAG TAT 591 Gly Asn Thr Gln Tyr 195

【図面の簡単な説明】

【図１】ペクチン酸リアーゼ遺伝子クローニング用プラ
イマー１及び２のＤＮＡ配列を示す図である。

【図２】プライマー１とプライマー２の間のＤＮＡ配列
と推定アミノ酸配列及びプライマー３とプライマー４の
位置を示す図である。

【図３】本発明ペクチン酸リアーゼ全領域を増幅するた
めのプライマー５とプライマー６を示す図である。実施
例IV−１．Ｃ．で示したＰＣＲ増幅用プライマーで、生
成する増幅断片（約１kbp）はＳａｌＩで消化された
後、ＳａｌＩとＳｍａＩで消化されたｐＨＳＰ６４に連
結される。

【図４】ペクチン酸リアーゼ遺伝子の分泌ベクター（ｐ
ＨＳＰ６４）への導入と創製されたペクチン酸リアーゼ
発現分泌ベクターｐＨＳＰ−Ａ１５６を示す図である。 Ａｍｐ：アンピシリン耐性マーカー遺伝子 Ｔｅｔ：テトラサイクリン耐性マーカー遺伝子

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 凉松 淳 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小池 謙造 東京都墨田区文花２−１−３ 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 秦田 勇二 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式会 社研究所内 (72)発明者 妻鳥 正樹 和歌山県和歌山市湊1334 花王株式会社研 究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロトペクチン又はポリガラクツロン酸
   を基質としたときの最適反応pHが７．０以上であるプロ
   トペクチナーゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成
   物。
2. 【請求項２】 プロトペクチナーゼが、０．２mg／ｇ綿
   以上の綿ペクチン遊離力を有するプロトペクチナーゼで
   ある請求項１記載の洗浄剤組成物。
3. 【請求項３】 プロトペクチナーゼが、バチルス属に属
   する微生物由来のものである請求項１又は２記載の洗浄
   剤組成物。
4. 【請求項４】 さらに、界面活性剤を含有するものであ
   る請求項１〜３のいずれか１項記載の洗浄剤組成物。
5. 【請求項５】 さらに、セルラーゼ、プロテアーゼ又は
   それらの混合物を含有するものである請求項１〜４のい
   ずれか１項記載の洗浄剤組成物。