ES2210733T3 - Compuesto detergente. - Google Patents
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Abstract
La invención se refiere a composiciones detergentes que contienen protopectinasa cuyo pH óptimo para la reacción es 7,0 p mayor cuando se emplea protopectina o ácido poligalacturónico como sustrato. La composición detergente tiene notables propiedades de detergencia contra barro del suelo.
Description
Compuesto detergente.
La presente invención se refiere a un compuesto
detergente, y más particularmente a un compuesto detergente que
tiene excelentes características detergentes contra la suciedad
producida por barro.
La suciedad que se adhiere a los tejidos se
clasifica en general en suciedad orgánica y suciedad inorgánica. La
suciedad de barro es una suciedad típicamente inorgánica. La
suciedad de barro se adhiere muy habitualmente, por ejemplo, a
calcetines, y es conocida como una de las suciedades más difíciles
de eliminar. Los tensoactivos y coadyuvantes, que son componentes
activos de un detergente para prendas, tienen efectos relativamente
reducidos contra la suciedad inorgánica. Por lo tanto, se han
desarrollado una serie de tecnologías para aumentar el efecto de
lavado con respecto a suciedad inorgánica. No obstante, la mayor
parte de ellas son tecnologías aplicadas que utilizan bases
detergentes convencionales y tienen los correspondientes
inconvenientes de las mismas. Por ejemplo, los polímeros basados en
ácidos carboxílicos tales como carboximetilcelulosa o poliacrilato,
que tienen efecto dispersante de los barros, son difíciles de
incorporar en suficiente cantidad debido a costes y a
biodegradabilidad. La utilización de agentes reductores se ha
propuesto también; no obstante, también tiene el problema de
incorporación porque los agentes reductores pueden provocar en
algunos casos decoloración de las ropas teñidas.
Además de la aplicación de las substancias
convencionales mencionadas anteriormente, se han hecho intentos de
utilizar una enzima para incrementar el efecto de lavado contra
suciedad inorgánica. Dado que las enzimas actúan exclusivamente
sobre un substrato específico, ejercen efectos para una pequeña
cantidad de incorporación. Por lo tanto, una enzima es una base
detergente excelente y se espera que juegue papeles más
significativos en compuestos detergentes. La solicitud de Patente
japonesa a inspección pública (kokai) Nº
59-49279 da a conocer que la incorporación de
celulasa en un detergente incrementa el poder de lavado con
respecto a barros. Asimismo, la Publicación PCT Kohyo Nº
3-504080 da a conocer cierta celulasa que reduce la
aspereza de las telas que contienen algodón y que tiene efectos en
la eliminación de la suciedad. Además, el documento WO95/25790 y la
publicación japonesa (kokoku) Nº 6-39596 dan
a conocer un detergente que contiene pectinasa. En particular, la
publicación de Patente japonesa (kokoku) Nº
6-39596 da a conocer que la pectinasa es eficaz
contra suciedad de barro. No obstante, la pectinasa que se da a
conocer en estas publicaciones de patente muestra un efecto de
lavado insuficiente incluso en el caso en que el lavado es llevado
a cabo después de un pre-empapado a 40ºC durante una
hora.
Teniendo en cuenta lo anterior, un objetivo de la
presente invención consiste en dar a conocer un compuesto
detergente que tiene excelentes características detergentes contra
la suciedad por barro.
Los inventores han descubierto que, en
comparación con el caso de los detergentes convencionales, se puede
obtener un carácter detergente especialmente excelente contra la
suciedad por barro por la incorporación de protopectinasa que tiene
un pH óptimo para la reacción en la región alcalina, lo cual ha
conducido a conseguir la presente invención.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
da a conocer un compuesto detergente que comprende protopectinasa
que tiene un pH óptimo de reacción de 7,0 o superior cuando se
utiliza como substrato protopectina o ácido poligalacturónico y un
tensoactivo.
La figura 1 muestra las secuencias de ADN del
cebador 1 y cebador 2 para el clonado del gen para la liasa del
ácido péctico.
La figura 2 muestra la secuencia de ADN y una
secuencia deducida de aminoácido entre el cebador 1 y cebador 2,
así como localizaciones para el cebador 3 y cebador 4.
La figura 3 muestra el cebador 5 y el cebador 6
que se utilizan para ampliar el área completa de la liasa de ácido
péctico según la presente invención. Éstos son cebadores para
amplificación PCR descritos en el ejemplo
IV-1-C, y los fragmentos resultantes
ampliados (aproximadamente 1 kbp) son digeridos con Sal I y
a continuación ligados a pHSP64 digerido con Sal I y Sma
I.
La figura 4 muestra la inserción del gen para la
liasa de ácido péctico a un vector (pHSP64), así como el vector
creado para la expresión de la liasa de ácido péctico
pHSP-A156.
Amp: gen marcador resistente a ampicilina
Tet: gen marcador resistente a tetraciclina
En la presente invención, el término
protopectinasa se refiere colectivamente a enzimas que actúan sobre
la protopectina (pectina natural insoluble), que es una substancia
péctica insolubilizada por enlace mutuo de moléculas de pectina con
intermedio de Ca^{2+}, Mg^{2+}, o por unión intermolecular;
enlace a una molécula de celulosa; etc.
De acuerdo con "Iwanami Seibutsugaku
Jiten" (3ª edición, Iwanami Shoten, publicada en 10 de marzo
de 1983) y "Oyou Kosogaku (Applied Enzymology)"
(editada por Yoshio Tsujisaka, p. 50, Kodansha Co., Ltd., publicada
en 1 de Junio de 1979), si bien la existencia de protopectinasa se
había pronosticado, no se había extraído como muestra hasta hace
poco tiempo. En realidad, los informes sobre muestras reales de
enzimas de protopectinasa son muy limitadas (T. Sakai y M.
Okushima, Agric. Biol. Chem., 42, 2427 (1978); T. Sakai y
M.Okushima, Agric. Biol. Chem., 46, 667, (1982); T. Sakai y
T. Sakamoto, Agric. Biol. Chem., 54, 879, (1990); etc.).
En lo que respecta a las aplicaciones de la
protopectinasa, solamente la solicitud de Patente japonesa a
inspección pública (kokai) Nº 6-220772 y
"Sensyoku Kogyo (Dye Industries)" (Vol. 43, Nº 4, p.
162-173 (1995)) describen su utilización en el
lavado de fibras. Hasta el momento, no existen informes publicados
que den a conocer la incorporación de protopectinasa en un
compuesto detergente.
Se sabe que la protopectinasa es clasificada en
dos tipos; tipo A y tipo B (Sakai, Sakamoto,
"Sen-i Kogaku (Fiber Engineering)", 45,
301 (1992)). La protopectinasa de tipo A descompone una fracción de
ácido poligalacturónico en protopectina para solubilización, y la
protopectinasa de tipo B actúa sobre las fracciones restantes (por
ejemplo, lugar de enlace entre una substancia péctica y una
molécula de celulosa). Ambos tipos de protopectinasa, es decir,
tipos A y B, pueden ser utilizados en la presente invención.
La protopectinasa utilizada en la presente
invención tiene un pH óptimo para la reacción de 7,0 o superior en
un sistema de reacción en el que la protopectina o el ácido
poligalacturónico sirven como substrato. Desde el punto de vista de
carácter detergente, el Ph óptimo para la reacción es
preferentemente de 7,5 o superior, más preferentemente 8,0 o
superior. El pH óptimo para la reacción se puede medir en una serie
de sistemas tampón conocidos por los técnicos de la materia, y el
pH óptimo para la reacción debe ser de 7,0 o superior como mínimo
en uno de dichos sistemas tampón. Cuando el substrato es
protopectina, se utilizan fibras de algodón que contienen una
substancia péctica, y a efectos de medición, son preferibles los
que tienen un elevado contenido de substancia péctica. Cuando la
protopectinasa es de tipo A y tiene actividad de pectinasa, el pH
óptimo para la reacción se puede obtener por utilización, por
ejemplo, de ácido péctico como substrato. Tal como se describirá en
la sección de ejemplos a continuación, un sistema para la medición
de un pH óptimo para la reacción puede incluir un tampón universal
Britton- Robinson (ácido fosfórico/ácido acético/ácido
bórico/hidróxido sódico) ("Shin
Jikkenkagaku-koza 20," Biochemistry [II],
editado por The Chemical Society of Japan, p.1229, Maruzen K.K.,
publicado el 20 de Octubre de 1978) o un tampón
glicina-NaOH y, como substrato, una tela de algodón
o ácido poligalacturónico.
La protopectinasa que se utiliza en la presente
invención tiene preferentemente una elevada capacidad de liberación
de pectina de algodón a pH 8,0. En consideración de los efectos de
lavado, la capacidad de liberar pectina de algodón en una cantidad
de 0,2 mg/g de algodón es la más preferente. Tal como se utiliza en
esta descripción, la capacidad de liberar pectina de algodón se
define como la cantidad de pectina liberada de hilo de algodón (1 g)
después de dejar reaccionar la enzima (0,4 mg/ml) con hilo de
algodón (20 mg/ml) a 30ºC durante una hora, y se mide por un método
que se muestra en detalle en los ejemplos que se describen más
adelante.
No se impone limitación específica alguna sobre
la fuente de procedencia de la protopectinasa de la presente
invención, pudiéndose utilizar enzimas que se hallan en una amplia
variedad de plantas, bacterias y hongos. Se incluyen entre los
ejemplos una bacteria tal como un Bacillus; una levadura tal
como Tricosporon, Endomyces, Endomycopsis, Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces, Hanseniaspora,
Torulopsis, Candida, o Kluyveromyces; y un hongo tal
como Fusarium, Galactomyces, Aspergillus, Rhizopus, o
Trametes. De todos éstos, la protopectinasa derivada de
Bacillus es particularmente preferente.
La protopectinasa utilizada en la presente
invención puede mostrar también otra actividad enzimática, siempre
que muestre la actividad de protopectinasa antes descrita. Por
ejemplo, se puede utilizar liasa de ácido péctico que muestra
actividad de protopectinasa.
Se incluye entre los ejemplos de enzimas que
muestran actividad de protopectinasa la liasa del ácido péctico
producida por Bacillus sp. KSM-P15 o
Bacillus sp. KSM-366; protopectinasa de tipo
B derivada de Bacillus subtilis IFO12113; una enzima que
tiene una secuencia de aminoácido con uno o varios aminoácidos
deleccionados, sustituidos o añadidos; y una enzima que es
inmunorreactiva con un anticuerpo de estas enzimas.
Es particularmente preferente en la presente
invención una enzima derivada de la cepa KSM-P15.
La secuencia de aminoácido de la liasa de ácido péctico que muestra
actividad de protopectinasa producida por la cepa
KSM-P15 se muestra en la Secuencia Nº1. En la
presente invención, se puede utilizar una enzima que tiene una
secuencia de aminoácido según la Secuencia 1 o una secuencia de
aminoácido de la Secuencia Nº1 con uno o varios aminoácidos
deleccionados, sustituidos o añadidos. No se imponen limitaciones
específicas en la delección, sustitución o adición (a la que se
hará referencia a continuación como mutación) siempre que la
protopectinasa y la liasa de ácido péctico no queden desactivadas,
y la mutación conserve preferentemente la lisina en posición 107,
lisina en posición 129, y arginina en la posición 132 de la
Secuencia Nº 1. Asimismo, el grado de mutación no es particularmente
limitativo siempre que se conserven las anteriormente citadas
posiciones 107, 129 y 132. Preferentemente, existe una homología de
55,7% o superior entre los aminoácidos Nos. 36 y 132 de la
Secuencia Nº1. Más preferentemente, la homología es de 70% o
superior, particularmente de 80% o superior.
A continuación se realizará una descripción más
detallada de características enzimológicas de la liasa de ácido
péctico que muestra actividad de protopectinasa producida por la
cepa Bacillus sp. KSM-366. La medición se
describe a continuación (ver Ejemplo
III-1-B).
(1) Acción
- Fraccionar el enlace \alpha-1,4 del ácido péctico (ácido poligalacturónico) a través de \beta- eliminación de forma endo y proporcionar un doble enlace en la posición C4-C5 del extremo no reducido para formar un digalacturonuro no saturado u oligo-galacturonuro no saturado.
(2) Especificidad del substrato
- Actuar sobre protopectina, ácido péctico (ácido poligalacturónico), ácido péctico soluble en ácido, y pectina.
(3) pH óptimo
- pH 8,0-9,0 (tampón universal Britton-Robinson).
(4) Temperatura óptima
- aproximadamente 60ºC (pH 8, tampón Tris-HCl).
(5) Masa molecular
- aproximadamente 43 kDa (medido por SDS-PAGE).
(6) Punto isoeléctrico
- aproximadamente pH 10,3 (enfoque isoeléctrico PAGE).
A continuación se adjunta la descripción más
detallada de las características enzimológicas de la liasa de ácido
péctico que muestra actividad protopectinasa producida por la cepa
Bacillus sp. KSM-P15. La medición de la
misma se describe a continuación (ver ejemplo
III-2-B).
(1) Acción
- Fraccionar el enlace \alpha-1,4 del ácido péctico (ácido poligalacturónico) a través de \beta- eliminación de forma endo y proporcionar un doble enlace en la posición C4-C5 del extremo no reducido para formar un digalacturonuro no saturado u oligo-galacturonuro no saturado.
(2) Especificidad del substrato
- Actuar sobre protopectina, ácido péctico (ácido poligalacturónico), ácido péctico soluble en ácido, y pectina.
(3) pH óptimo
- pH 10,3-10,7 (tampón glicina-NaOH).
(4) Temperatura óptima
- 50-55ºC (pH 10,5, tampón glicina-NaOH).
(5) Masa molecular
- aproximadamente 20-21 kDa (medido por equilibrio de sedimentación; aproximadamente 26 kDa medido por SDS-PAGE).
\newpage
(6) Punto isoeléctrico
- aproximadamente pH 10,3 (enfoque isoeléctrico PAGE).
(7) Terminal N de la Secuencia de aminoácido
incluye APTVVHETIRVPAGQTFDGK.
Los ejemplos de microorganismos que producen la
enzima antes descrita que muestra actividad de protopectinasa
incluyen los microorganismos antes descritos; variantes de los
mismos; y células hospedantes transformadas por ADN recombinante
que tiene una secuencia de ADN que codifica para estas enzimas y
mutantes de las mismas.
A efectos de crear un vector recombinante, el gen
es insertado en un vector arbitrario que es adecuado para expresión
del gen en un hospedante de interés. Se incluyen entre ejemplos del
vector pBR 322, pUC18, y pUC19 para casos en los que se utiliza
Escherichia coli como hospedante, y pUB110 para casos en los
que se utiliza Bacillus subtilis como hospedante.
A efectos de producir la enzima que muestra
actividad de protopectinasa por utilización del microorganismo
antes mencionado que produce una enzima que muestra actividad de
protopectinasa; una variante de la misma; o bien células
hospedantes transformadas por ADN recombinante que tiene una
secuencia de ADN que codifica para estas enzimas y sus mutantes, el
microorganismo puede ser inoculado en un medio del cultivo que
contiene una fuente de carbono asimilatoria, una fuente de
nitrógeno, y otras nutrientes esenciales y a continuación se
cultiva por un método general.
La substancia objetivo, es decir, una enzima que
muestra actividad de protopectinasa, puede ser recogida a partir
del caldo de cultivo obtenido de este modo y purificada por métodos
generales para la recogida y purificación de enzimas. La solución
de enzimas obtenida de este modo puede ser utilizada sin ningún
tratamiento posterior o se puede purificar adicionalmente,
cristalizándola o se puede granular por métodos conocidos. Cuando la
solución de enzima es utilizada en un compuesto detergente, el
caldo de cultivo puede ser concentrado, dializado y a continuación
secado por pulverización obteniendo gránulos por métodos
conocidos.
No se impone ninguna limitación específica en la
cantidad de protopectinasa incorporada en el compuesto detergente
de la presente invención siempre que se exprese satisfactoriamente
la actividad de enzima, y la capacidad de liberación de pectina de
algodón mencionada anteriormente puede servir como índice de la
cantidad de incorporación preferente. Por ejemplo, la
protopectinasa es incorporada en una solución de lavado en una
cantidad de 0,001-500 mg/L, más preferentemente de
0,05-50 mg/L reducida como cantidad de la muestra de
enzima, de manera que la capacidad antes mencionada de liberación
de pectina de algodón puede ser de 0,2 mg/g de algodón o superior.
Cuando la protopectinasa de la presente invención corresponde al
tipo A y muestra actividad de pectinasa, la enzima se puede
incorporar en una cantidad de 1-10.000 U/L, más
preferentemente 5-5.000 U/L, y de modo
particularmente preferente de 10-2.000 U/L como
concentración en el lavado determinada por el método de medición
antes descrito para actividad de protopectinasa.
A efectos de obtener un elevado efecto de lavado
contra suciedad de barro, es importante utilizar una enzima que
muestre actividad de protopectinasa en una región alcalina en la
que se lleve a cabo el lavado real. De manera específica, es
preferible incorporar protopectinasa con un pH de reacción óptimo
de 7,0 o superior o bien una protopectinasa con una capacidad de
liberación de pectina de algodón de 0,2 mg/g de algodón o más al pH
de 8,0. En otras palabras, es importante para la realización de la
presente invención que la protopectinasa actúe, provocando la
liberación de pectina de algodón en una solución alcalina que
contiene el detergente.
Asimismo, el compuesto detergente de la presente
invención contiene un componente de detergente conocido, cuyos
ejemplos contienen los siguientes.
Entre los ejemplos de tensoactivos se incluyen
tensoactivos aniónicos, tales como alquilbencensulfonatos lineales
que tienen un grupo alquilo C10-C18 (promedio),
alquil éter sulfonatos sobre los que se añade óxido de etileno
(promedio 0,5-8 mol/molécula), que tienen un grupo
alquilo lineal o ramificado C10-C20 (promedio),
alquil sulfatos que tienen un grupo alquilo C10-C20
(promedio), olefin sulfonatos que tienen 10-20
átomos de carbono (promedio) en la molécula, alcansulfonatos que
tienen 10-20 átomos de carbono (promedio) en la
molécula, metil o etil ésteres de un ácido graso
\alpha-sulfo que tienen 10-20
átomos de carbono (promedio) en la molécula, sales de ácidos grasos
de cadena larga C8-C20 (promedio), ácidos alquil
éter carboxílicos, sobre los que se añade óxido de etileno
(promedio 0,5-8 mol/molécula), poseyendo un grupo
alquilo lineal o ramificado C10-C20 (promedio);
tensoactivos no iónicos, tales como etoxilatos de alcohol que
tienen un grupo alquilo C10-C20 (promedio) y una
cadena de unidades de óxido de etileno (promedio
1-20 mol), alcanolamidas de ácido graso o sus
aductos de óxido de alquileno, o bien aductos de óxido de etileno
de óxido de propileno-propilén glicol condensado con
la marca comercial "Pluronic"; tensoactivos anfolíticos tipo
betaína; tensoactivos anfolíticos de tipo sulfonato; tensoactivos
de tipo éster fosfato; tensoactivos de tipo aminoácido; y
tensoactivos catiónicos.
De éstos, los tensoactivos aniónicos o
tensoactivos no iónicos se utilizan preferentemente como
tensoactivos activos para aumentar el carácter detergente. Son
ejemplo especialmente preferentes de tensoactivos aniónicos los
alquilbencensulfonatos lineales que tienen un grupo alquilo
C10-C18 (promedio), ésteres de alquilsulfonato,
polioxialquilén alquil éter sulfato, y metil ésteres de un ácido
graso \alpha-sulfo. Se puede añadir una pequeña
cantidad, aceite de sebo o sal de ácido graso de aceite de palma.
Son ejemplos preferentes de tensoactivos no iónicos los alquil
éteres de polioxialquileno (preferentemente oxietileno y/o
oxipropileno). Estos tensoactivos son incorporados preferentemente
en el compuesto detergente en una cantidad de
0,5-60% en peso (representado a continuación
simplemente por %), particularmente 10-45% para el
compuesto de detergente en polvo y 20-50% para el
compuesto detergente líquido. Cuando el compuesto detergente
contiene un agente blanqueante en una cantidad de 40% (contenido
efectivo de oxígeno 10%) o superior, el tensoactivo es incorporado
preferentemente en una cantidad de 1-10%, más
preferentemente 1-5%.
El compuesto detergente puede contener además una
enzima distinta de la protopectinasa. Entre los ejemplos de las
enzimas se incluyen hidrolasas, óxidorreductasas, liasas,
transferasas, e isomerasas clasificadas en términos de reactividad.
De éstas son especialmente preferentes, celulasa, proteasa, lipasa,
amilasa, pululanasa, esterasa, hemicelulasa, peroxidasa,
fenoloxidasa, y pectinasa, distintas de la protopectinasa. Se
pueden incorporar enzimas comerciales en una cantidad conocida. Se
incluyen entre los ejemplos de las enzimas preferentes proteasa,
tal como la proteasa que se describe en la solicitud de patente
japonesa a inspección pública (kokai) No.
5-25492, Alcalasa, Esperasa, Savinasa, Durazym
(Novo Nordisk A/S), Purafect, Maxapem, o Properasa (Genencor Int.
Inc.); celulasa tal como la celulasa descrita en la publicación de
patente japonesa (kokoku) No. 4-43119 o
Celluzyme (Novo Nordisk A/S); lipasa tal como Lipolasa (Nova
Nordisk A/S) o Lipomax (Genencor Int. Inc.); y amilasa, tal como
una \alpha-amilasa licuada que se describe en el
documento WO94/26881, pululanasa descrita en la publicación de
patente japonesa (kokoku) Nos. 7-8993 y
7-49594, pululanasa alcalina que tiene actividad
\alpha-amilasa, tal como se describe en la
solicitud de patente japonesa a inspección pública (kokai)
No. 6-264094, Termamyl, Duramyl (Nova Nordisk A/S),
Maxamyl, Purafect OXAm (Genencor Int. Inc.).
De éstas, la celulasa o proteasa, utilizadas
conjuntamente con la protopectinasa antes descrita, aumentan el
carácter detergente con respecto a suciedad por barro. Además, la
utilización de celulasa y proteasa conjuntamente con la
protopectinasa antes descrita, aumenta adicionalmente el carácter
detergente.
La adición de un agente blanqueante al compuesto
detergente de la presente invención tiene como resultado un
incremento adicional del carácter detergente con respecto a
suciedad de barro. Se incluyen dentro de los ejemplos de agente
blanqueante, el percarbonato sódico y el perborato sódico.
Se incluyen entre los ejemplos de agente
secuestrantes fosfatos condensados, tales como tripolifosfato,
pirofosfato, u ortofosfato; aluminosilicatos tales como ceolita;
silicatos cristalinos sintéticos por capas; nitrilotriacetatos;
etilendiamintetraacetatos; citratos; isocitratos; y poliacetal
carboxilatos.
De éstos, son particularmente preferentes los
aluminosilicatos cristalinos (ceolita sintética). Entre las
ceolitas de tipo A, X, y P, es preferible la ceolita de tipo A. La
ceolita sintética más preferentemente utilizada tiene un tamaño de
grano promedio primario de 0,1-10 \mum, en
particular 0,1-5 \mum.
El agente secuestrante en
metal-ion se puede añadir en una cantidad de
0-50%, preferentemente 5-40% y se
utilizan preferentemente agentes secuestrantes
metal-ion libres de fósforo.
También son preferibles los silicatos cristalinos
que tienen elevada capacidad secuestrante
metal-ion, tal como se describen en la solicitud de
patente japonesa a inspección pública (kokai) Nos.
7-89712 y 60-227895; Phys.
Chem. Glasses. 7, 127-138 (1966); Z.
Kristallogr., 129, 396-404 (1969), etc. Se
incluyen entre los ejemplos de los mismos
"SKS-6"
(\delta-Na_{2}Si_{2}0_{5}) que se puede
conseguir comercialmente de la firma Clariant Japan Co.
Se incluyen entre los ejemplos de agentes
anti-redepósito el polietilén glicol, polímeros de
ácido carboxílico, polivinil alcohol, y polivinilpirrolidona. De
éstos, los polímeros de ácidos carboxílicos tienen capacidad
secuestrante metal-ion y capacidad de dispersión de
suciedad de grano sólido de ropas hacia un baño de lavado y también
una acción anti-redepósito. El polímero de ácido
carboxílico comprende un homopolímero o copolímero de ácido
acrílico, ácido metacrílico, ácido itacónico, etc., y es preferible
un copolímero de ácido maleico de los monómeros antes descrito. El
peso molecular del copolímero varía preferentemente entre algunos
millares hasta 100.000. Es asimismo preferente un polímero, tal
como una sal de ácido poliglicídico, un derivado de celulosa, tal
como carboximetil celulosa, o bien un polímero de ácido
aminocarboxílico, tal como una sal de ácido poliaspártico, por el
hecho de que estas substancias tienen también capacidad
secuestrante metal-ion, capacidad dispersante y
características de prevención de reensuciamiento.
El agente anti-redepósito se
incorpora en una cantidad de 0-20%, preferentemente
0-10%, y más preferentemente
1-5%.
Se incorporan preferentemente agentes alcalinos
convencionales en el compuesto detergente. Se incluyen entre los
ejemplos de agentes alcalinos utilizados en el detergente en polvo,
carbonatos de metales alcalinos, tales como carbonato sódico
llamado en general cenizas densas ("dense ash") o cenizas
ligeras ("light ash"), y silicatos de metales alcalinos
amorfos, según JIS No. 1, 2, ó 3. Estos agentes alcalinos
inorgánicos son eficaces en la formación de granos de núcleo en el
secado de un detergente para tener capacidad de proporcionar un
detergente comparativamente duro con excelente fluidez. En lugar de
estos agentes alcalinos se pueden utilizar sesquicarbonato sódico y
bicarbonato sódico, así como fosfatos, tales como tripolifosfatos
que actúan también como agente alcalino. Se incluyen como ejemplos
de agentes alcalinos que se pueden utilizar en un detergente
líquido y actúan como contra ión con respecto a un tensoactivo, el
hidróxido sódico y mono-, di-, y trietanolamina, así como los
agentes alcalinos antes descritos. El agente alcalino se incorpora
preferentemente en el compuesto de la presente invención en una
cantidad de 0,01-60%, más preferentemente
1-50%, y de modo más preferente
1-20%.
(7) En cuanto a otros componentes, se pueden
incorporar componentes de tipo convencionalmente conocido; un
extendedor, tal como sulfato sódico; un activador de blanqueo, tal
como se describe en la solicitud de patente japonesa a inspección
pública (kokai) No. 6-316700, o bien
tetraacetiletilendiamina (TAED); un estabilizante de enzima, tal
como compuesto de boro o sulfito sódico; un substrato absorbente de
aceite, tal como aluminosilicato amorfo; un agente eliminador de
espuma, tal como un sistema de silicona/sílice; un antioxidante; un
colorante fluorescente; un agente de azulado; y un perfume en una
cantidad conocida. De manera específica, los componentes descritos
en la solicitud de patente japonesa a inspección pública
(kokai) No. 8-218093 (p.4, 1,18+ y p.7,
1,17) se pueden utilizar en los componentes antes descritos.
El compuesto detergente de la presente invención
puede ser fabricado por un método general que utiliza una
combinación de la protopectinasa antes descrita y componentes
conocidos. De acuerdo con la utilización, la forma del detergente
se puede seleccionar entre líquidos, materiales en polvo, o
materiales granulares. Asimismo, el compuesto detergente de la
presente invención puede ser utilizado como detergente para ropas y
detergente- blanqueante, preferentemente como detergente para ropas.
En el caso de fabricación de un detergente granular para ropas, una
base detergente fabricada separadamente y granos de enzima
fabricados separadamente son mezclados preferentemente en seco para
obtener de esta manera el detergente. Desde luego, la
protopectinasa no debe ser desactivada.
La presente invención se describirá a
continuación en detalle mediante ejemplos, que no se deben
considerar como limitadores de la invención.
Una solución de enzima (0,1 ml) con una
concentración adecuada recibió la adición de una solución de
substrato (1,9 ml) conteniendo 0,2 M de tampón universal
Britton-Robinson (pH 3 a 12) y fibras de algodón
(2,2% (peso/volumen)). Se realizó la incubación de la mezcla
durante 1 hora a 30ºC y a continuación se sometió a centrifugación
(3000 rpm, 5 minutos, 4ºC). Al sobrenadante resultante (0,25 ml),
enfriado, se añadió y mezcló ácido sulfúrico concentrado (96%, 3
ml). Una solución de carbazol (0,25 ml; 0,2% carbazol/100% etanol)
se añadió adicionalmente y se mezcló. La mezcla resultante se dejó
que desarrollara color durante 20 minutos en un baño de agua a 80ºC
y a continuación se enfrió con agua durante 20 minutos. A
continuación, se midió la absorbancia a 525 nm. Se calculó la
cantidad de pectina liberada basándose en una curva de calibración
de ácido D-galacturónico que fue preparado
simultáneamente. Dado que la pectina de algodón es una
protopectina, la enzima que libera y solubiliza sustancias pécticas
a partir de algodón es protopectinasa. El pH al que se liberó la
cantidad mayor de pectina de algodón se definió como pH óptimo para
la reacción. Se pueden utilizar diferentes telas de algodón e hilos
de algodón como fibras de algodón que sirven como substrato en esta
medición, pero son preferentes las que contienen una cantidad
superior de substancias pécticas con el objetivo de medición, y las
que contienen, como mínimo, 5 mg de substancias pécticas por gramo
de algodón determinado por el método de extracción de oxalato
amónico, que se describirá más adelante, son especialmente
preferentes. Se pueden utilizar otros tampones distintos al tampón
universal Britton-Robinson en esta medición. Dado
que ciertos tampones pueden afectar a determinadas enzimas en su
actividad enzimática, se pueden seleccionar tampones de tipo
conocido por los técnicos de la materia, de manera arbitraria, de
acuerdo con el objetivo y las circunstancias.
Se añadió una solución de enzima (0,1 ml) con una
concentración adecuada a una solución de substrato (0,9 ml)
conteniendo 0,2 M de tampón universal
Britton-Robinson (pH 3 a 12), ácido
poligalacturónico (PG; ICN Biomedicals, Ohio; 0,56%) y cloruro
cálcico (0,56 mM). La mezcla se incubó durante 20 minutos a 30ºC.
Se añadió a la mezcla resultante 1 ml de una solución DNS (0,5%
ácido 3,5-dinitro salicílico; 1,6% hidróxido sódico;
30% tartrato sódico potásico). La mezcla fue sometida a ebullición
durante 5 minutos para desarrollar el color del azúcar reductor.
Inmediatamente después del desarrollo de color, la mezcla fue
enfriada con hielo durante 15 minutos aproximadamente, se mezcló
con 4 ml de agua desionizada, y a continuación se sometió a
centrifugación (3.000 rpm, 10 minutos). Se midió en 535 nm la
absorbancia del sobrenadante resultante. La cantidad de azúcar
reductor producido se calculó basándose en una curva de calibración
de ácido D-galacturónico que se preparó
simultáneamente. El pH al que era máxima la actividad, se definió
como pH óptimo para la reacción. Se pueden utilizar en esta
medición tampones distintos del tampón universal
Britton-Robinson. Dado que ciertos tampones pueden
afectar a determinadas enzimas en su actividad enzimática, los
tampones conocidos por los técnicos de la materia se pueden
seleccionar arbitrariamente de acuerdo con el objetivo y
circunstancias.
Una solución de enzima (0,1 ml) fue añadida a una
solución substrato (1,9 ml) conteniendo el tampón
Tris-HCl (pH 8,0, 55,6 mM) y fibras de algodón
(2,2% (peso/volumen)). La concentración final de la enzima en la
mezcla de reacción era de 0,4 mg/ml. La mezcla se dejó reaccionar
durante 1 hora a 30ºC y se sometió a centrifugación (3.000 rpm, 5
minutos, 4ºC). Al sobrenadante resultante (0,25 ml), enfriado, se
añadió y mezcló ácido sulfúrico concentrado (3 ml, 96%). También se
añadió y mezcló una solución de carbazol (0,25 ml; 0,2%
carbazol/100% etanol). La mezcla resultante se dejó que desarrollara
color durante 20 minutos en un baño de agua a 80ºC y a continuación
se enfrió con agua durante 20 minutos. A continuación se midió la
absorbancia a 525 nm. La cantidad de pectina liberada fue calculada
basándose en una curva de calibrado de ácido
D-galacturónico que se preparó simultáneamente. A
partir de ello se calculó la cantidad de pectina liberada a partir
de 1 g de algodón y se definió como la actividad de liberación de
pectina de algodón a pH 8,0. Dado que la pectina de algodón es una
protopectina, las enzimas que tienen actividad liberadora de
pectina de algodón tienen una actividad de protopectinasa en una
región alcalina. Hilos de algodón que sirven como substrato en esta
medición son los que contienen de 1,5 a 2,5 mg de substancias
pécticas por gramo de algodón, según determinación por el método de
extracción de oxalato amónico, que se describirá más adelante. Los
hilos de algodón utilizados en la presente invención incluyen hilos
de algodón de cosido con un número de contaje de hilo de 30 ó 40
fabricados por Kanebo Co.
Se extrajeron substancias pécticas, y se
determinaron cuantitativamente por el método de extracción de
oxalato amónico. La operación de extracción fue llevada a cabo al
añadir algodón finamente cortado a una solución de oxalato amónico
al 0,5% a efectos de obtener una concentración de algodón de 1%
(peso/volumen). La cantidad de substancias pécticas extraídas se
determinó por el método de sulfato carbazol. El método de extracción
y análisis cuantitativo se llevaron a cabo de acuerdo con el método
descrito en "The Research Reports by Hamamatsu Technology Center,
Shizuoka" (Nº 4, p.17-22, 1994).
Una solución de enzima (0,1 ml) con una
concentración adecuada fue añadida a una solución de substrato (0,9
ml) conteniendo un tampón, ácido poligalacturónico (PG; ICN
Biomedicals, Ohio; 0,56%) y cloruro cálcico(0,56 mM).La
mezcla se incubó durante 20 minutos a 30ºC. Como tampón para la
solución de substrato se utilizó un tampón de
glicina-NaOH (pH 10,0, concentración final: 50 mM)
para determinar una enzima alcalina, mientras que se utilizó un
tampón de ácido cítrico (pH 5,0; concentración final: 10 mM) para
determinar la enzima ácida. A la mezcla resultante se añadió 1 ml de
una solución DNS (0,5% ácido 3,5-dinitrosalicílico;
1,6% hidróxido sódico; 30% tartrato sódico potásico). La mezcla se
sometió a ebullición durante 5 minutos a efectos de desarrollar el
color de azúcar reductor. Inmediatamente después del desarrollo del
color, la mezcla fue enfriada con hielo durante 15 minutos
aproximadamente, se mezcló con 4 ml de agua desionizada y a
continuación se sometió a centrifugación (3.000 rpm, 10 minutos).
Se midió la absorbancia del sobrenadante resultante a 535 nm. Se
calculó la cantidad de azúcar reductor producido basándose en la
curva de calibrado del ácido D-galacturónico que se
preparó simultáneamente, obteniendo de esta manera la actividad
enzimática. Con respecto a la actividad enzimática, se definió la
cantidad de enzima producida reduciendo el azúcar equivalente a 1
\mumol de ácido galacturónico en un minuto como 1 U.
Se añadió una solución de enzima (0,1 ml) con una
concentración adecuada a una solución de substrato (0,9 ml)
conteniendo carboximetilcelulosa (CMC: Sunrose AO1MC, DS=0,65 a
0,75, DP=250, Nihon Seishi Co.; 1,1%) y un tampón de
glicina-NaOH (pH 10,0, 111 mM). La mezcla se incubó
durante 20 minutos a 40ºC. A la mezcla resultante se añadió 1 ml de
una solución DNS (0,5% ácido 3,5-dinitrosalicílico;
1,6% hidróxido sódico; 30% tartrato sódico potásico). La mezcla fue
sometida a ebullición durante 5 minutos a efectos de desarrollar el
color de azúcar reductor. Inmediatamente después del desarrollo del
color, la mezcla fue enfriada con hielo durante aproximadamente 15
minutos, y a continuación se mezcló con 4 ml de agua desionizada.
La absorbancia del sobrenadante resultante se midió a 535 nm. La
cantidad de azúcar reductor producida se calculó basándose en una
curva de calibración de D-glucosa preparada
simultáneamente, obteniendo por lo tanto la actividad enzimática.
Con respecto a la actividad enzimática, se definió la cantidad de
enzima que producía un equivalente de azúcar reductor de 1 \mumol
de glucosa en un minuto como 1 U.
Se determinó la actividad de degradación hacia la
hemoglobina desnaturalizada por urea por el método modificado de
Anson-Hemoglobina (M. L. Anson, J. Gen. Physiol.,
22,79, 1938) tal como se indica a continuación. Se añadió una
solución de enzima (0,1 ml) con una concentración adecuada a una
solución de substrato (0,65 ml) conteniendo hemoglobina
desnaturalizada por urea (1,70%) y cloruro cálcico (0,46 mM) en la
mezcla de reacción. La mezcla se dejó en incubación 20 minutos a pH
10,5 y 25ºC. A la mezcla resultante se añadió 1 ml de ácido
tricloroacético (TCA: 5% solución peso/volumen) a efectos de detener
la reacción. La mezcla fue sometida a centrifugación (3.000 rpm, 10
minutos). La proteína presente en el sobrenadante resultante se
dejó que desarrollara color por reactivo de fenol. La cantidad de
proteína soluble en TCA fue calculada basándose en una curva de
calibración de tirosina que se preparó simultáneamente, obteniendo
de esta manera la actividad enzimática. Con respecto a la actividad
enzimática se definió como 1 U la cantidad de enzima que producía
un equivalente de proteína soluble en TCA equivalente a 1 mmol de
tirosina en un minuto.
Suciedades procedentes de varios lugares de Japón
suspendidas en agua esterilizada o cepas almacenadas en la
colección de microorganismos de Kao Corporation fueron aplicadas en
un medio de cultivo en placa de agar conteniendo ácido
poligalacturónico y a continuación se cultivó a 30ºC durante
3-5 días. Una vez cultivadas las bacterias se
vertió en el medio de cultivo una solución de 1% (peso/volumen) de
CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) y el medio resultante se
dejó reposar durante 10 minutos. Se seleccionaron y preservaron
bacterias que formaron zonas claras alrededor de colonias debido a
la descomposición de ácido poligalacturónico, como bacteria
productora de ácido péctico-liasa, para preparar de
esta manera una enzima cruda que fue sometida a diferentes pruebas.
De esta manera se seleccionó la cepa Bacillus sp.
KSM-366 como bacteria productora de una enzima con
actividad de protopectinasa alcalina.
Las propiedades micológicas de la cepa
KSM-366 son las siguientes:
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Un estudio de las características micológicas
descritas anteriormente basándose en la descripción de "Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co.,
1984) sugiere razonablemente que esta cepa pertenece a Bacillus
licheniformis. No obstante, la presente cepa no es capaz de
sobrevivir a una temperatura superior a 45ºC y es capaz de
sobrevivir a un pH máximo de 11. Dado que las cepas conocidas de
Bacillus licheniformis no tienen estas propiedades, esta
cepa es un nuevo microorganismo. Como consecuencia, los inventores
depositaron esta cepa, un nuevo microorganismo, en el Instituto
Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Organización de Ciencia
Industrial y Tecnología, como Bacillus sp.
KSM-366 (FERMBP-6262).
De la misma manera que se ha descrito en
II-1, se aisló la cepa de Bacillus sp.
KSM-P15 como bacteria productora de una enzima que
exhibía actividad de protopectinasa alcalina.
Las propiedades micológicas de la cepa
KSM-P15 son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Un estudio de las propiedades micológicas antes
descritas en la descripción en "Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984) sugiere
razonablemente que la cepa pertenece a Bacillus circulans,
que es una cepa que tiene muchas variantes. No obstante, la
presente cepa tiene características que no están completamente de
acuerdo con las de las cepas conocidas de Bacillus
circulans, y por lo tanto es un nuevo microorganismo. Como
consecuencia, esta cepa, un nuevo microorganismo, fue depositada en
el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Agencia de
Ciencia Industrial y Tecnología, como Bacillus sp.
KSM-P15 (FERM BP-6241).
Se cultivó la cepa Bacillus sp.
KSM-366 en un caldo nutriente (0,8%) conteniendo
substancias pécticas (0,5%) y carbonato sódico (0,5%) durante un
total de 72 horas. A continuación el caldo de cultivo fue
centrifugado para retirar las células. El sobrenadante obtenido de
este modo fue concentrado por ultrafiltración (corte 6.000 -Mr). La
solución concentrada resultante fue liofilizada, obteniendo de esta
manera polvo de enzima. El polvo de enzima obtenido de este modo
mostró actividad de protopectinasa y a continuación se designará
protopectinasa A.
A continuación la protopectinasa A fue disuelta
en 25 mM de tampón Tris-HCl (pH=7,5), y aplicada a
una columna (5 x 20 cm) de Super Q Toyopearl 650C (producto de Toso
Co.) equilibrada con el mismo tampón. Las proteínas eluidas con el
tampón de equilibrado (proteínas que no fueron adsorbidas por la
columna) fueron recogidas y a continuación cargadas en una columna
(2,5 x 20 cm) de SP Toyopearl 550C (producto de Toso Co.)
equilibrada con 20 mM de ácido fosfórico tampón (pH 6,0). La
columna fue lavada con un tampón de equilibrado y se eluyeron las
proteínas con un gradiente lineal de cloruro sódico
0-0,3 M en el tampón de equilibrado para recoger de
esta manera proteínas que muestran actividad de pectinasa. Las
fracciones obtenidas de este modo fueron concentradas por
ultrafiltración (membrana PM10 Diaflo, producto de Amicon; corte
10.000-Mr), a continuación se aplicó a una columna
(2,6 x 60 cm) de Sephacryl S-200 (producto de
Pharmacia), se equilibró con 50 mM de tampón
Tris-HCl (pH 7,5) conteniendo 100 mM de cloruro
sódico y 1 mM de cloruro cálcico, y a continuación se eluyó con el
tampón. Se recogieron y se dializaron las fracciones con actividad
de pectinasa comprendiendo casi una proteína única y a continuación
se liofilizaron, obteniendo de esta manera un material en polvo de
enzima purificado. La enzima obtenida de este modo muestra actividad
de protopectinasa y se designará protopectinasa PA.
La solución de substrato (3 ml) conteniendo 0,1 M
de tampón Tris-HCl (pH 8), 0,5 mM de cloruro
cálcico y 0,2% de ácido poligalacturónico (fabricado por Sigma) fue
incubada a 30ºC durante 5 minutos. Se añadió una solución de enzima
diluida de modo apropiado [0,1 ml, diluida con 50 mM de tampón
Tris-HCl conteniendo 1 mM de cloruro cálcico (pH
7,5)] para iniciar la reacción. La mezcla fue incubada a 30ºC
durante 20 minutos y a continuación se dejó reposar durante 5
minutos en agua hirviente para terminar la reacción enzimática. La
cantidad de ácido oligogalacturónico insaturado formado en la
reacción se determinó por medición de la absorbancia a 235 nm y
calculando con el coeficiente de extinción molar de digalacturonuro
no saturado (4600 M^{-1}cm^{-1}, Hasegawa & Nagel, J.
Food Sci., 31,838-845, 1966). Se utilizó
una muestra de pruebas que se dejó reposar durante 5 minutos en
agua hirviente inmediatamente después de la adición de la solución
de la enzima. Se define una unidad de enzima (1U) como la cantidad
de enzima que produce un equivalente de ácido oligogalacturónico no
saturado de 1 \mumol de digalacturonuro no saturado por minuto en
las condiciones de reacción antes mencionadas. En el experimento
para determinar el pH óptimo para la reacción, se utilizó el método
de tiempo de escaneado para determinar de manera directa el
incremento de absorbancia a 235 nm.
El pH óptimo para la reacción se investigó por el
método de medición de actividad enzimática estándar por utilización
de 0,2 M de tampón universal Britton-Robinson (pH
6,5-12-0). Los resultados muestran
que el pH óptimo para la reacción es 8,0-9,0.
La temperatura óptima para la reacción se
investigó por la utilización de tampón Tris-HCl 0,1
M (pH 8,0) a temperaturas comprendidas entre 5º y 70º, ambas
inclusive. Los resultados muestran que la enzima actúa en una
amplia gama de temperaturas de 10ºC-70ºC, siendo
aproximadamente 60ºC la temperatura óptima.
La masa molecular de la enzima se estimó
aproximadamente en 43 kDa por SDS-PAGE (12,5%
gel).
El punto isoeléctrico de la enzima se determinó
aproximadamente en pH 10,3 por PAGE de enfoque isoeléctrico por
utilización de gel de poliacrilamida al 5% conteniendo un anfolito
de pH 8-10,5 o pH 3-10 (Pharmalyte,
producto de Pharmacia).
De igual manera a lo descrito en
III-1 A, se cultivó la cepa Bacillus sp.
KSM-P15, y se prepararon materiales en polvo de
enzima. Los materiales en polvo de enzima muestran actividad de
protopectinasa, y se indicarán a continuación como Protopectinasa
B.
A continuación, se disolvió Protopectinasa B en
tampón Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), y se aplicó a una
columna de (5 x 20 cm) de Super Q Toyopearl 650 (producto de Toso
Co.) equilibrado con el mismo tampón. Las proteínas eluidas con el
tampón de equilibrado (proteínas que no son adsorbidas por la
columna) fueron recogidas y a continuación inyectadas en un sistema
Bio Cad60 HPLC (producto de Nihon Perceptive Co.) equipado con una
columna HS (grupo sulfopropilo; 1 x 10 cm) equilibrada con tampón
Tris-HCl 20 mM conteniendo 0,2 mM de cloruro
cálcico (pH 7,0). La proteína adsorbida en la columna fue eluida
con un ingrediente lineal de cloruro sódico 0-0,2 M
en el tampón de equilibrado, recogiendo de esta manera fracciones
que mostraron actividad de pectinasa y comprendiendo casi una
proteína única. Las fracciones obtenidas de este modo se dializaron
y liofilizaron, obteniendo de esta manera un polvo de enzima
purificado. La enzima resultante muestra actividad de protopectinasa
y se designará Protopectinasa PB.
Se colocaron un tampón de 0,5 M
glicina-NaOH (pH 10,5) (0,3 ml), cloruro cálcico 6
mM (0,3 ml) y agua desionizada (1,7 ml) en un tubo de ensayo y a
continuación se incubó a 30ºC durante 5 minutos. Se añadió al tubo
de ensayo una solución de enzima apropiadamente diluida [0,1 ml,
diluida con tampón Tris-HCl 50 mM conteniendo 1 mM
de cloruro cálcico (pH 7,5)], que se incubó posteriormente a
temperatura constante durante 5 minutos. Se añadió a la solución de
enzima para iniciar la reacción una solución acuosa de ácido
poligalacturónico (0,6 ml, 1% (peso/volumen), producto de ICN
Biochemicals Co.), y la mezcla fue incubada a 30ºC durante 10
minutos. La reacción fue cancelada por la adición de 3 ml de HCl 50
mM. La cantidad de ácido oliogalacturónico no saturado formado en
la reacción se determinó por medición de la absorbancia a 235 nm y
calculando el coeficiente de extinción molar del digalacturonuro no
saturado (4.600 M^{-1}cm^{-1}, S. Hasegawa y C.W. Nagel, J.
Food Sci., 31, 838-845, 1966). Se preparó una
muestra de prueba del modo siguiente: se añadió ácido clorhídrico
50 mM (3 ml) a una mezcla de reacción tratada sin incorporación con
la solución de enzima, y a continuación se añadió una solución de
enzima a la misma (0,1 ml). Una unidad de enzima (1U) se define como
la cantidad de enzima que produce oligalacturonuro no saturado
equivalente a 1 \mumol de digalacturonuro no saturado por minuto
en las condiciones de reacción indicadas.
El pH óptimo para la reacción fue investigado por
el método de medición de la actividad enzimática estándar
utilizando tampón Tris-HCl 50 mM (pH
7-9) o tampón glicina-NaOH 50 mM (pH
8,5-11,0). La enzima muestra la velocidad de
reacción más elevada en un tampón de glicina-NaOH
(pH 10,5). Para un pH 10,3-10,7, la actividad es
90% o más de la actividad máxima, y la actividad es 70% o más de la
actividad máxima entre pH 10 y 11.
La temperatura óptima para la reacción se
investigó por utilización de un tampón de
glicina-NaOH 50 mM (pH 10,5) a temperaturas entre
10ºC y 70ºC, ambas inclusive. Los resultados demuestran que la
enzima actúa en una amplia gama de temperaturas de
10ºC-65ºC, siendo 50-55ºC la
temperatura óptima.
(d-1) La masa molecular de la
enzima obtenida por experimento de equilibrio de sedimentación es
de 20,3 \pm 1,0 kDa.
(d-2) La masa molecular de la
enzima se estimó que era aproximadamente 26 kDa por
SDS-PAGE (15% gel). Se utilizó como proteína
estándar un marcador de peso molecular (Normas de Peso Molecular
SDS-PAGE, Gama Baja, Producto de
Bio-Rad).
El punto isoeléctrico de la enzima fue
determinado aproximadamente en pH 10,3 por el enfoque isoeléctrico
PAGE por utilización de un gel de poliacrilamida al 5% conteniendo
un anfolito de pH 8-10,5 (Pharmalyte, producto de
Pharmacia).
La enzima fue transferida a un filtro ProSorb
(Perkin-Elmer Co.) y fue analizada por utilización
de un secuenciador de proteína (modelo 674, Applied Biosystem Co.),
para determinar la secuencia de aminoácido hasta el aminoácido de
orden 20, es decir, APTVVHETIRVPAGQTFDGK.
La enzima fue tratada con lisil endopeptidasa.
Los péptidos internos fueron fraccionados a partir de la solución
tratada por utilización de un fraccionador de fragmento
C-terminal automatizado (CTFF-1:
Shimadzu Co.). La muestra fue transferida a un filtro ProSorb y se
determinó la secuencia de aminoácido de terminal N por utilización
de un secuenciador de proteína obteniendo de esta manera la
secuencia VVIGAPAADGVH.
Se añadieron varios reactivos químicos al tampón
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5). Se añadió una solución de
enzima a la misma. Después de que la mezcla fue incubada a 30ºC
durante una hora, la actividad residual fue medida por intermedio
de las condiciones estándar de ensayo. Los resultados muestran que
la enzima no es inhibida por tensoactivos
(0,01-0,1%), agentes quelantes (0,15- 0,20%), u
otros compuestos.
Se cultivó la cepa Bacillus sp.
KSM-P15 aeróbicamente en un medio de cultivo
líquido con agitación, y el caldo de cultivo fue centrifugado para
recoger las células. El ADN genómico fue preparado a partir de las
células obtenidas de acuerdo con Saito y Miura (Biochim. Biophys.
Acta, 72, 619-629, 1963).
Los cebadores 1 y 2 fueron sintetizados basándose
en los resultados del ejemplo B-f y el ejemplo
B-g de (III-2) (figura 1).
Se llevó a cabo PCR por utilización del cebador 1
y el cebador 2, y ADN genómico (0,5 \mug) de Bacillus sp.
KSM-P15 como plantilla. El fragmento amplificado
obtenido fue purificado con un equipo de purificación de fragmentos
PCR (Boehringer Mannheim) y clonado por inserción del fragmento en
el lugar Sma I de un vector plásmido pUC19. Una secuencia de gen
parcial de la liasa de ácido péctico objetivo fue detectada en la
secuencia de nucleótido determinada de varios clones obtenidos y se
dedujo asimismo la secuencia de aminoácido (ver figura 2).
A continuación, se realizó PCR inverso a efectos
de amplificar la zona de arriba y la zona de abajo del fragmento
antes descrito amplificado por PCR. Las secuencias de nucleótido
observadas en la figura 2, cebador 3 y cebador 4 fueron utilizados.
Se predigirió un ADN genómico (1 \mug) de la cepa
KSM-P15 con Pst I, se extrajo con fenol/cloroformo,
y se trató con T4 ADN ligasa para formar un enlace intramolecular
(enlace de ADN circularizado) a efectos de conseguir una plantilla.
Se realizó ensayo PCR por utilización de un equipo PCR de Sistema de
Plantilla Larga ("Long Template System") (TaKaRa Co.). Un
fragmento amplificado de aproximadamente 2,0 kbp fue detectado y se
secuenció de manera directa el fragmento de ADN. De este modo, la
secuencia de aminoácido y la secuencia de nucleótido (secuencia
número 1) de la liasa de ácido péctico comprendiendo 197
aminoácidos de la secuencia de aminoácido de terminal N al
aminoácido antes del codón de terminación (TAA). De las secuencias,
se deduce que la masa molecular de la liasa de ácido péctico
(enzima madura de tipo secreción) producida a partir de la cepa
KSM-P15 es de 20924 Da (aproximadamente 21
kDa).
El cebador 5 (figura 3) fue diseñado para enlazar
la secuencia deducida reconocedora de la señal de peptidasa de
Ala-Glu-Ala situada justamente más
arriba del aminoácido terminal N, Ala, de la liasa de ácido péctico
producido por la cepa KSM-P15 y la secuencia de
señal derivada del vector utilizado. El cebador 6 (figura 3) fue
diseñado de manera que tuviera una secuencia de 26 bp situada en
una zona más abajo (por 372 bp) desde el codón terminal (TAA) del
gen para la liasa de ácido péctico.
Se llevó a cabo PCR por utilización del cebador 5
y el cebador 6, y ADN genómico de la cepa KSM-P15
como plantilla, para amplificar de esta manera el fragmento de ADN
hasta aproximadamente un kbp. El fragmento de ADN fue digerido con
Sal I y ligado a pHSP64 (Sumitomo y otros, Biosci. Biotech.
Biochem., 56, 872, 1992) que se habían cortado con Sal I y Sma I
por utilización de una ligasa (ver figura 4).
El plásmido recombinante resultante fue
transformado en células de E. coli HB101 y los transformantes
fueron cultivados sobre el medio de placa de agar para formar zonas
claras alrededor de colonias (ver II-1 y
II-2). El plásmido recombinante obtenido de la
presente invención que codifica para el gen de la presente
invención fue designado pHSP-A156.
Se introdujo pHSP-A156 en células
de Bacillus subtilis ISW1214 y los transformantes fueron
cultivados en un medio líquido a 30ºC durante 3 días, produciendo
de esta manera extracelularmente una liasa de ácido péctico en
cantidades considerables.
La solución de liasa de ácido péctico en crudo
obtenida de este modo fue purificada de acuerdo con el
procedimiento antes descrito
III-2-A. Esta enzima mostraba
actividad de protopectinasa, y por lo tanto, esta enzima se
designará a continuación protopectinasa RB. La curva de pH con
respecto a la actividad de protopectinasa RB se encontraba casi
perfectamente de acuerdo con la de la protopectinasa PB.
(a) Protopectinasa A: preparada de acuerdo con el
procedimiento descrito en el punto anterior
III-1-A.
(b) Protopectinasa PA: preparada de acuerdo con
el procedimiento descrito en el punto anterior
III-1-A.
(c) Protopectinasa B: preparada de acuerdo con el
procedimiento descrito en el punto anterior
III-2-A.
(d) Protopectinasa PB: preparada de acuerdo con
el procedimiento descrito anteriormente en el punto
III-2-A.
(e) Protopectinasa RB: preparada de acuerdo con
el procedimiento descrito en el punto anterior
IV-2.
(f) Protopectinasa C:
Se preparó protopectinasa C del modo siguiente.
Se cultivó Bacillus subtilis IFO 12113 de acuerdo con un
método descrito por Sakai y otros (Agric., Biol. Chem. 53, 1213,
(1989)). A continuación, el caldo de cultivo fue centrifugado a
efectos de retirar las células. El supernatante resultante fue
concentrado por ultrafiltración (corte 6.000 Mr). La solución
concentrada resultante fue liofilizada, obteniendo de esta manera un
material en polvo de enzima. El material en polvo de enzima
obtenido de este modo tenía la capacidad de liberar pectina de
algodón y, por lo tanto, esta enzima se designará a continuación
Protopectinasa C. La protopectinasa C se determinó que se
clasificaba en protopectinasa de tipo B, puesto que no muestra
actividad de pectinasa.
(g) Pectinasa D:
Se preparó pectinasa D del modo siguiente. Se
cultivó Bacillus sp. KSM-S272 (National
Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial
Science and Technology, Depósito nº FERM P-16066), y
el caldo de cultivo fue centrifugado a efectos de retirar las
células. El supernatante resultante fue concentrado por
ultrafiltración (corte 6.000 Mr). La solución concentrada
resultante fue liofilizada obteniendo de esta manera un polvo de
enzima con actividad de pectinasa. Esta enzima se designará a
continuación Pectinasa D. La pectinasa D mostró actividad de liasa
de ácido péctico alcalina, pero no mostró actividad
protopectinasa.
(h) Pectinasa PD:
A continuación, se disolvió Pectinasa D en tampón
Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) conteniendo cloruro cálcico
1 mM. La solución fue aplicada en una columna (2,5 x 1 cm) de Super
Q Toyopearl 650 M (producto de Tosoh Co.) equilibrada con el mismo
tampón. Las proteínas eluidas con el tampón de equilibrado
(proteínas que no fueron adsorbidas en la columna) fueron recogidas
e inyectadas a un sistema HPLC Bio Cad 60 (producto de Nihon
Perceptive Co.) equipado con una columna HS (grupo sulfopropilo; 1 x
10 cm) equilibrada con tampón Tris-HCl 20 mM
conteniendo 0,2 mM de cloruro cálcico (pH 7,0). La proteína
adsorbida en la columna fue eluida con un gradiente lineal de
cloruro sódico 0-0,2 M en el tampón de equilibrado,
recogiendo de esta manera fracciones que mostraban actividad
pectinasa y que comprendían casi una proteína única. Las fracciones
obtenidas de este modo fueron dializadas y a continuación
liofilizadas, para obtener por lo tanto un polvo de enzima
purificada. Esta enzima será designada Pectinasa PD. De manera
similar a la protopectinasa PA y PB, la pectinasa PD mostró
actividad de liasa alcalina de ácido péctico, pero no mostró
actividad de protopectinasa.
\newpage
(i) Pectinasas disponibles comercialmente:
Se utilizaron las siguientes pectinasas.
Sucrasa N (Sankyo Co.)
Pectinasa Tanabe (Tanabe Seiyaku Co.)
Pectoliasa (Kikkoman Co.)
Pectinasa SS (Yakult Honsha Co.)
Pectinasa HL (Yakult Honsha Co.)
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(Tabla pasa a página
siguiente)
1) Se llevó a cabo la medición mediante la
utilización de un tampón universal Britton-Robinson
0,2 M. Los datos indicados por el asterisco fueron obtenidos por la
utilización de un tampón glicina-NaOH, dado que no
fue posible la medición con el tampón universal
Britton-Robinson.
2) La medición fue llevada a cabo utilizando
tampón Tris-HCl (pH 8,0).
3) Para la protopectinasa A, PA, B, PB, RB, y
pectinasa D, la actividad fue medida utilizando un tampón
glicina-NaOH (pH 10,0); y para las otras enzimas,
la medición fue llevada a cabo en un tampón citrato (pH 5,0).
4) Protopectinasa tipo B; no muestra
descomposición hacia ácido poligalacturónico.
5) Incapaz de medir la actividad (es decir, no
hay actividad).
Se ensuciaron piezas de ropas de algodón
tricotado (medias) con suciedad Kanuma-Akadama
(suciedad de la región de Kanuma, Japón), preparando de esta manera
piezas de ropas ensuciadas artificialmente.
Cada uno de los compuestos detergentes descritos
a continuación se disolvió en agua dura 4ºDH (71,2 mg;
CaCO_{3}/litro) a efectos de tener una concentración
predeterminada de detergente para preparar de este modo un litro de
una solución detergente. La solución detergente fue transferida a un
recipiente de acero inoxidable para un
Terg-O-Tometer. Cinco piezas de tela
ensuciada artificialmente fueron añadidas a la solución detergente,
y se lavaron a 100 rpm y 30ºC durante 10 minutos. Las piezas de
prueba fueron lavadas con agua corriente, se plancharon y a
continuación se sometieron a medición de reflectancia.
La reflectancia de la ropa original antes de su
ensuciamiento y la de las prendas antes y después de ser sometidas
a lavado se determinaron con un colorímetro de
auto-registro (Shimadzu Co.). El grado de
detergencia (%) fue calculado por utilización de la ecuación
siguiente.
Detergencia (%) = {(Reflectancia después de
lavado) - (Reflectancia antes de lavado)}/{(Reflectancia de prenda
original) - (Reflectancia antes de lavado)} x 100
Los participantes de la prueba utilizaban
calcetines para atletismo (hilatura mixta de fibras de algodón y de
hilos acrílicos; fabricados por Gunze Co.). Se aplicó a los
calcetines derecho e izquierdo en cantidades regulares barro del
mismo tipo utilizado para el ensuciamiento de las prendas antes
descritas. Se lavaron con un compuesto detergente comparativo diez
calcetines de un grupo (cinco calcetines de la izquierda y cinco
calcetines de la derecha), y los diez calcetines restantes (cinco
calcetines de la derecha y cinco calcetines de la izquierda) se
lavaron con compuestos detergentes de muestra.
La forma de lavado fue la siguiente. Cada uno de
los compuestos detergentes fue disuelto en 30 litros de agua a 30ºC
(4ºDH) para tener una concentración predeterminada. Los calcetines
fueron lavados en una máquina de lavado eléctrico de dos
recipientes de tipo doméstico durante 10 minutos, se aclararon con
agua corriente durante 5 minutos, se eliminó el agua, y a
continuación se efectuó el secado.
Para evaluar el carácter detergente, se comparó
un par de calcetines entre sí; mientras que un calcetín lavado con
detergente de referencia (detergente que no contenía enzimas)
sirvió como control, el otro calcetín lavado con un detergente de
prueba (compuesto detergente que contenía una enzima) fue evaluado
con respecto al control. Diez calcetines fueron evaluados
subjetivamente por tres jueces, y la suma de las calificaciones fue
considerada como calificación de evaluación de carácter detergente.
Las normas de evaluación fueron las siguientes.
- +2:
- Definitivamente mejor que el detergente de referencia
- +1:
- Algo mejor que el detergente de referencia
- 0:
- Comparable al detergente de referencia
- -1:
- Algo peor que el detergente de referencia
- -2:
- Definitivamente peor que el detergente de referencia
\newpage
LAS: Alquil bencensulfonato
(C12-C14) lineal sódico (para detergentes líquidos,
se formula LAS de tipo ácido)
AS: Alquilsulfatos
AE-1: Polioxietilén lauril éter
(número molar promedio de E.O. añadido = 4)
AE-2: Polioxietilén alquil éter
(C12-C14) (número molar promedio de E.O. añadido =
6)
AEP: Polioxietilén polioxipropilén lauril éter
(número de moles promedio de E.O. añadidos = 8; número de moles
promedio de P.O. añadidos = 3)
AES: Alquiletersulfato (número de moles promedio
de E.O. añadidos = 2,5)
Ácido graso: Ácido graso derivado de aceite de
palma-Na
Ceolita: Ceolita tipo 4A, tamaño promedio de
granos 3 \mum.
Aluminosilicato amorfo: Ver Ejemplo de síntesis
1.
Carbonato sódico: Cenizas densas.
Silicato amorfo: Silicato sódico JIS Nº 2.
Silicato cristalino: SKS-6
(Clariant Japan Co.), pulverizado, tamaño promedio de partículas:
15 \mum.
AA-MA: Sokalan CP5, ácido
acrílico - copolímero de ácido maleico (BASF).
PEG: Polietilén glicol, peso molecular promedio
8.000.
Ejemplo de síntesis
1
Se calentó a 40ºC una solución acuosa de
aluminato sódico (1.010g; Na_{2}O 1,55% en peso, Al_{2}O_{3}
2,30% en peso, Na_{2}O/Al_{2}O_{3}=1,11 (proporción molar)).
Mientras la solución se sometía a agitación a 1.500 rpm, se añadían
gota a gota durante 20 minutos para provocar reacción una solución
de silicato sódico acuosa (700 g; Na_{2}O 2,75% en peso,
SiO_{2}7,88% en peso, SiO_{2}/Na_{2}O=2,96 (proporción molar))
y cloruro cálcico 2H_{2}O (1,2 g). Después de completar la
adición, la mezcla fue calentada adicionalmente durante otros 15
minutos. A continuación, se recogió materia sólida por filtración y
se lavó. La torta húmeda obtenida de este modo fue llevada a estado
seco a 105ºC a una presión de 300 torr durante 10 horas. La torta
seca fue pulverizada obteniendo de esta manera un polvo de
aluminosilicato finamente dividido, que se confirmó como amorfo por
inspección de rayos X.
El análisis de absorción atómica y análisis de
emisión de plasma revelaron que el aluminosilicato amorfo obtenido
de este modo tenía la siguiente composición: Al_{2}O_{3} 21,1%
en peso, SiO_{2} 57,2% en peso, Na_{2}O 20,8% en peso, y CaO
0,9% en peso (1,65Na_{2}O \cdot 0,08CaO \cdot Al_{2}O_{3}
\cdot 4,75SiO_{2}). La capacidad de absorción de aceite era de
210 ml/100 g.
Los resultados de las pruebas en las que se llevó
a cabo el lavado por utilización de los detergentes (a) hasta (d)
con las composiciones mostradas en la Tabla 2, que recibieron
respectivamente la adición de una serie de enzimas, se describen a
continuación en (b-1) hasta
(b-5).
Tal como quedará evidente de los resultados, los
compuestos detergentes conteniendo protopectinasa de la presente
invención muestran efectos detergentes claramente más potentes que
los obtenidos a partir de compuestos detergentes que contienen
pectinasas comparativas. Además, cuando se incorporan enzimas
alcalinas tales como protopectinasa A y B, se pueden ejercer
excelentes efectos en soluciones detergentes con pH elevado. De
manera notable, estos excelentes efectos se pueden obtener incluso
cuando se omite la etapa de pre-empapado. Se
observará también que, entre las pectinasas que tienen un pH óptimo
para la reacción en la zona alcalina, la protopectinasa A y B, que
son capaces de liberar pectina de algodón, muestran excelente
carácter detergente, mientras que la pectinasa D, que no puede
liberar pectina de algodón, no muestra carácter detergente. Se
llega a la conclusión, a partir de lo anterior, de que la
protopectinasa alcalina es eficaz como componente detergente.
Condiciones de lavado:
Terg-O-Tometer 100 rpm, 10 minutos,
30ºC.
\newpage
Tal como es evidente de la Tabla 3, las
protopectinasas de la presente invención proporcionan un carácter
detergente mejorado incluso cuando se incorporan en un detergente
potente y se utilizan en un líquido de lavado con pH elevado. Como
contraste, los compuestos detergentes comparativos que contienen
pectinasas de tipo comercial no muestran virtualmente efecto. La
diferencia en carácter detergente entre la presente invención y los
productos comparativos es más clara en la evaluación de carácter
detergente con respecto a calcetines enfangados. Además, se
observará que, si bien el carácter detergente se reconoce con
preparados de enzimas en crudo, las enzimas purificadas
proporcionan una detergencia mejorada incluso con pequeñas
cantidades de utilización solamente.
Condiciones de lavado:
Terg-O-Tometer 100 rpm, 10 minutos,
30ºC.
Tal como es evidente de la Tabla 4, las
protopectinasas de la presente invención proporcionan un carácter
detergente mejorado incluso cuando se incorporan en un detergente
potente que contiene un tensoactivo no iónico como ingrediente
principal y poseyendo un elevado valor de pH del líquido de lavado.
Como contraste, compuestos detergentes comparativos que contienen
pectinasas de tipo comercial no muestran virtualmente efecto. Se
observará que, si bien la detergencia se reconoce con preparados de
enzimas en crudo, las protopectinasas purificadas proporcionan una
detergencia mejorada solamente con pequeñas cantidades de
utilización.
Condiciones de lavado:
Terg-O-Tometer 100 rpm, 10 minutos,
30ºC.
Tal como parece de la Tabla 5, es evidente que
las protopectinasas de la presente invención proporcionan un
carácter detergente mejorado aunque se incorporen en un compuesto
detergente líquido. Como contraste, los compuestos detergentes
comparativos que contienen pectinasas de tipo comercial no muestran
virtualmente efecto. Además, se observará que, si bien se reconoce
carácter detergente con preparados de enzimas en crudo, las
protopectinasas purificadas proporcionan carácter detergente
mejorado solamente con pequeñas cantidades de utilización.
Condiciones de lavado: se
pre-empaparon materiales a lavar en una solución
detergente a 40ºC con una concentración seis veces la de la
utilización real. A continuación, la concentración fue reducida a
la de la utilización real, y los materiales fueron lavados en un
Terg-O-Tometer a 100 rpm y a 30ºC
durante 10 minutos.
Tal como parece de la Tabla 6, es evidente que
las protopectinasas de la presente invención proporcionan carácter
detergente mejorado. Cuando se realiza un
pre-empapado en una solución detergente a 40ºC con
una concentración de seis veces, los compuestos detergentes
comparativos que contienen pectinasas de tipo comercial mostraron
un cierto efecto. No obstante, el efecto era mucho menor que el
obtenido por medio de los productos de la invención. Se observará
que, si bien el carácter detergente se reconoce con preparados de
enzimas en crudo, las protopectinasas purificadas proporcionan un
carácter detergente incrementado solamente con pequeñas cantidades
utilizadas.
Condiciones de lavado:
Terg-O-Tometer 100 rpm, 10 minutos,
30ºC.
Tal como queda evidente de la Tabla 7, resulta
claro que, en ausencia de empapado previo, las protopectinasas de
la presente invención proporcionan un carácter detergente mejorado.
Por el contrario, compuestos detergentes comparativos que contienen
pectinasas de tipo comercial no muestran virtualmente efecto
alguno. Si bien el carácter detergente se reconoce con preparados
de enzimas en crudo, las enzimas purificadas proporcionan un
carácter detergente mejorado solamente con pequeñas cantidades
utilizadas.
Además, los compuestos detergentes de la presente
invención fueron preparados con incorporación de 0,1 partes en peso
de las Protopectinasas A, B, PA, PB, o RB en 100 partes en peso de
los compuestos detergentes mostrados en las tablas 8 y 9. Cuando se
formaron compuestos detergentes granulares, se granularon en primer
lugar ingredientes distintos de las enzimas, PC,
AC-1, y AC-2 para preparar un
detergente base, y a continuación se granularon respectivamente las
enzimas PC, AC-1, y AC-2 y se
mezclaron con los gránulos del detergente base. Los compuestos
detergentes obtenidos de este modo presentan un excelente carácter
detergente y son útiles en el lavado de ropas.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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LAS-2: Producto obtenido por
neutralización de ácido alquilbencén sulfónico "Alkene L"
(número de carbonos de la cadena alquílica: 10-14;
producto de Nisseki Senzai Co.) con NaOH 48%.
LAS-3: Producto obtenido por
neutralización de ácido alquilbencén sulfónico "Alkene L"
(número de carbonos de la cadena alquílica: 10-14;
producto de Nisseki Senzai Co.) con KOH 50%.
AS-2: Sal sódica de Dovanol 25
sulfato (ácido sulfúrico C12-C15) (producto de
Mitsubishi Kagaku Co.).
SAS: Hostapur SAS93, (alcano sulfonato sódico)
(producto de Clariant Japan Co.).
AOS: \alpha-olefinsulfonato
sódico
SFE: Derivado del aceite de palma. Metil éster
sódico de un ácido-\alpha-sulfo
graso.
Sal de ácido graso: palmitato sódico
AES-2: Sulfato sódico de
polioxietilén alquil (C12-C15) éter (número molar
promedio de E.O. añadido = 2).
AE-3: Nonidet S-3
(producto obtenido por adición a un alcohol C12 o C13 E.O. en una
cantidad de 3 moles de promedio) (fabricado por Mitsubishi Kagaku
Co.).
AE-4: Nonidet R-7
(producto obtenido por adición a un alcohol C12-C15
E.O. en una cantidad de 7,2 moles de promedio) (fabricado por
Mitsubishi Kagaku Co.).
AE-5: Softanol 70 (producto
obtenido por adición a un alcohol secundario C12-C15
E.O. en una cantidad de 7 moles de promedio) (fabricado por Nippon
Shokubai Co.).
AG: Alquil glucósido (derivado de aceite de
palma)(grado promedio de polimerización: 1,5).
Portador absorbente de aceite: Tixolex 25
(aluminosilicato sódico amorfo; fabricado por Kofran Chemical;
capacidad de absorción de aceite: 235 ml/100 g).
Silicato cristalino: SKS-6;
\delta-Na_{2}Si_{2}O_{5}; silicato laminado
cristalino; tamaño promedio de ranos: 20 \mum; fabricado por
Clariant Japan Co.
Silicato amorfo: silicato sódico JIS No.1
STPP: Tripolifosfato sódico
NTA: Nitrilotriacetato sódico
PAA: Poliacrilato sódico; peso molecular
promedio: 12.000.
AA-MA: Sokalan CP5; copolímero de
ácido acrílico-ácido maleico (fabricado BASF).
CMC: Sunrose B1B;
carboximetilcelulosa-Na; fabricado por Nihon Seishi
Co.).
PEG: Polietilén glicol; peso molecular promedio
6.000.
PVP: Polivinilpirrolidona; peso molecular
promedio 40.000; número K: 26-35.
Colorante fluorescente: A 1:1 mezcla de Tinopal
CBS (fabricado por Ciba Geigy) y Whitex SA (fabricado por Sumitomo
Chemical Co.). (Nota: En el caso de detergentes líquidos, se
incorporó Tinopal CBS solo.)
Perfume: Formulada de acuerdo con el compuesto de
perfume descrito en la sección de Ejemplos de la solicitud de
patente japonesa a inspección pública (kokai) No.
8-239700.
Enzimas: Mezcla 2:1:1:1 de Savinase 12,0 TW
(proteasa), Lipolase 100T (lipasa), Termamyl 60T (amilasa), todas
ellas fabricadas por Novo Nordisk A/S, y KAC 500 (celulasa,
fabricada por Kao Co.). (Nota: En el caso de detergentes líquidos,
se incorporó solamente Savinasa 16,0L (proteasa; fabricada por Novo
Nordisk A/S)).
PC: Percarbonato sódico; tamaño promedio
partículas 400 \mum; recubierto con metaborato sódico.
AC-1: TAED, tetraacetiletilén
diamina; fabricado por Clariant Co., Ltd.
AC-2: Lauroiloxibencén sulfonato
sódico
Se prepararon detergentes de blanqueo con las
composiciones mostradas en la Tabla 10. Se impregnaron trozos de
telas ensuciadas artificialmente con barro en una solución acuosa
al 0,5% de cada uno de los detergentes (20ºC, 30 minutos), y a
continuación se lavaron mediante utilización de
Terg-O-Tometer a 100 rpm y 20ºC
durante 10 minutos. Los resultados se muestran en la Tabla 10.
\newpage
Se comprende de la Tabla 10 que los compuestos
detergentes que contienen protopectinasa, según la presente
invención, muestran un notable carácter detergente con respecto a
suciedad por barro.
Se incorporó una serie de enzimas mostradas en la
Tabla 11 en el detergente antes mencionado (a) en cantidades que se
han indicado en la Tabla 11, y se lavaron prendas de tela ensuciada
artificialmente con utilización de los compuestos detergentes
resultantes (pH de los líquidos de lavado: 10,7; condiciones de
lavado: Terg-O-Tometer 100 rpm, 10
minutos, 30ºC).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
De los resultados anteriores, se comprenderá que
cuando se utilizan las protopectinasas de la presente invención en
combinación con celulasa o proteasa, se puede obtener un efecto
detergente incrementado. Además, cuando se utilizan las
protopectinasas de la presente invención en combinación con
celulasa y proteasa a efectos de conseguir un sistema de tres
componentes, se obtiene un efecto detergente incluso más mejorado
con respecto a suciedad por barro.
Este efecto sinérgico atribuible a la utilización
combinada de enzimas se puede obtener también cuando se utilizan
celulasas o proteasas comercialmente disponibles bajo los nombres
comerciales indicados a continuación.
Celulasa: Celluzyme (fabricada por Novo Nordisk
A/S)
Proteasa: Alcalase, Esperase, Savinase, Durazym
(fabricados por Novo Nordisk A/S); Purafect, Maxapem, Properase
(fabricados por Genencor Int. Inc.).
Tal como se ha descrito anteriormente, los
compuestos detergentes de la presente invención tiene un grado de
detergencia muy elevado con respecto a suciedad de barro, y por lo
tanto son especialmente útiles para el lavado de prendas de
ropa.
La presente solicitud tiene prioridad de las
solicitudes de patentes japonesas Nos. 9-091142 y
9-242736, presentadas en 9 de abril de 1997 y 8 de
septiembre de 1997, respectivamente, que se incorporan a la presente
descripción a título de referencia.
Secuencia No. 1
\vskip1.000000\baselineskip
| Longitud: | 591 | |
| Tipo: | ácido nucleico | |
| Hileras: | doble hilera | |
| Topología: | lineal | |
| Tipo molecular: | ADN Genómico | |
| Origen: |
| Microorganismo: | Bacillus sp. | |
| Cepa: | KSM-P15 |
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (7)
1. Compuesto detergente, que comprende
protopectinasa que tiene un pH óptimo para la reacción de 7,0 o
superior cuando se utiliza como substrato una protopectina o ácido
poligalacturónico, y un tensoactivo.
2. Compuesto detergente, según la reivindicación
1, en el que la protopectinasa tiene capacidad de liberar pectina
de algodón, de manera que la capacidad de liberación de pectina de
algodón es de 0,2 mg/g de algodón o superior.
3. Compuesto detergente, según la reivindicación
1 ó 2, en el que la protopectinasa se deriva de un microorganismo
que pertenece al género Bacillus.
4. Compuesto detergente, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la protopectinasa tiene actividad
de liasa de ácido péctico.
5. Compuesto detergente, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una celulasa.
6. Compuesto detergente, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que comprende además una proteasa.
7. Compuesto detergente, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que comprende además un agente
blanqueante.
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