DE69819704T2

DE69819704T2 - Waschmittelzusammensetzung

Info

Publication number: DE69819704T2
Application number: DE69819704T
Authority: DE
Inventors: Yasunao Wada; Miyuki Kasai; Shitsuw Shikata; Atsushi Ichikaimachi SUZUMATSU; Kenzo Sumida-ku KOIKE; Yuji Hatada; Tohru Haga-gun KOBAYASHI; Susumu Ito; Masaki Tsumadori
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1997-04-09
Filing date: 1998-04-08
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2018-04-09
Also published as: CN1254370A; CN1137254C; WO1998045393A2; EP0975725A2; EP0975725B1; ES2210733T5; JP3534607B2; DE69819704D1; EP0975725B2; WO1998045393A3; US6172030B1; DE69819704T3; JPH11140489A; ES2210733T3

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Detergenszusammensetzung, und insbesondere eine Detergenszusammensetzung mit einer ausgezeichneten Waschkraft gegen schlammige Erde.
Stand der Technik
Erde, die an Kleidern haftet, wird allgemein in organische und anorganische Erde klassifiziert. Schlammige Erde ist eine typische anorganische Erde. Schlammige Erde haftet üblicherweise z. B. an Socken und es ist bekannt, dass es sich um eine besonders schwierig zu entfernende Erde handelt. Tenside und Gerüststoffe, die aktive Bestandteile eines Detergens für Kleidungsstücke sind, haben relativ schwache Wirkungen gegen anorganische Erde. Daher wurde eine Vielzahl von Technologien entwickelt, um die Abwaschungswirkung gegen anorganische Erde zu verstärken. Die meisten von diesen sind jedoch angewandte Technologien, die sich konventioneller Detergens-Basismittel bedienen und dementsprechende Nachteile aufweisen. Zum Beispiel sind auf Carbonsäure basierende Polymere, wie z. B. Carboxymethylcellulose oder Polyacrylat mit einer Wirkung einer Dispersion von Schlamm darin schwierig in ausreichender Menge zu inkorporieren und zwar aufgrund ihrer Kosten und Bioabbaubarkeit. Die Verwendung von Reduktionsmitteln wurde ebenfalls vorgeschlagen; es besteht jedoch nach wie vor das Problem ihrer Inkorporation, da Reduktionsmittel manchmal zu einer Entfärbung gefärbter Stoffe führen können.
Neben der Anwendung der oben erwähnten konventionellen Substanzen wurden Versuche unternommen, ein Enzym zur Verstärkung der Waschwirkung gegen anorganische Erde zu verwenden. Da ein Enzym exklusiv auf ein spezifisches Substrat wirkt, übt es seine Wirkungen mit einer geringen Inkorporationsmenge aus. Daher ist ein Enzym eine ausgezeichnete Detergensbasis und es wird angenommen, dass es wichtigere Rollen in Detergenszusammensetzung spielen kann. Die japanische Patentveröffentlichung (Kokai) Nr. 59-49279 offenbart, dass der Einbau von Cellulase in ein Detergens die Waschkraft gegen Schlamm erhöht. Die PCT Kohyo Veröffentlichung Nr. 3-504080 offenbart ebenfalls eine bestimmte Cellulase, die die Härte von baumwollhaltigen Stoffen reduziert und eine Wirkung zur Entfernung von Erde aufweist. Weiterhin veröffentlicht die WO95/25790 und die japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 6-39596 ein Detergens, das eine Pektinase enthält. Insbesondere offenbart die japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 6-39596, dass Pektinase gegen schlammige Erde wirksam ist. Die in diesen Patentveröffentlichungen offenbarte Pektinase übt jedoch eine unzureichende Waschwirkung aus, selbst wenn der Waschvorgang nach einem Voreinweichen bei 40°C für eine Stunde durchgeführt wird.
Im Hinblick auf das Vorstehende ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Detergenszusammensetzung bereitzustellen mit einer ausgezeichneten Waschkraft gegen schlammige Erde.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegenden Erfinder haben festgestellt, dass im Vergleich mit konventionellen Detergentien eine insbesondere ausgezeichnete Waschkraft gegen schlammige Erde durch Einbau von Protopektinase mit einem pH-Optimum für die Reaktion im alkalischen Bereich erhalten werden kann, was zur Vervollständigung der vorliegenden Erfindung führte.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine Detergenszusammensetzung bereit, umfassend Protopektinase mit einem pH-Reaktionsoptimum von 7,0 oder mehr, wenn Protopektin oder Polygalacturonsäure als Substrat verwendet wird, und ein Tensid.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt DNA-Sequenzen vom Primer 1 und Primer 2 zur Klonierung des Gens für die Pektinsäure-Lyase dar.
2 zeigt die DNA-Sequenz und eine abgeleitete Aminosäuresequenz zwischen Primer 1 und Primer 2, wie auch die Stellungen der Primer 3 und Primer 4.
3 zeigt Primer 5 und Primer 6, die zur Amplifikation des Gesamtbereiches der Pektinsäure-Lyase der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese sind Primer für die PCR-Amplifikation, beschrieben in Beispiel IV-1-C und die resultierenden vervielfältigten Fragmente (ungefähr 1 kbp) werden mit Sal I verdaut und darauffolgend mit pHSP64 ligiert, verdaut mit Sal I und Sma I.
4 zeigt die Insertion des Gens für die Pektinsäure-Lyase in einen Vektor (pHSP64), wie auch den erzeugten Vektor für die Expression von Pektinsäure-Lyase pHSP-A156.
Amp: Ampicillin-resistentes Markergen
Tet: Tetracyclin-resistentes Markergen
Beste Ausführungsform der Erfindung
Bei der vorliegenden Erfindung betrifft die Bezeichnung Protopektinase allgemein Enzyme, die auf Protopektin (unlösliches natürliches Pektin) wirken, wobei es sich um eine Pektinsubstanz handelt, die durch gegenseitige Bindung von Pektinmolekülen über Ca²⁺, Mg²⁺ oder intermolekulare Bindungen; Bindung an ein Cellulosemolekül usw. unlöslich gemacht ist.
Gemäß "Iwanami Seibutsugaku Jiten" (3. Auflage, Iwanami Shoten, veröffentlicht am 10. März 1983) und "Oyou Kosogaku (Applied Enzymology)" (herausgegeben von Yoshio Tsujisaka, Seite 50, Kodansha Co., Ltd., veröffentlicht am 01. Juni 1979) wurde die Protopektinase, obwohl ihre Existenz vorhergesagt wurde, bis kürzlich noch nicht als Probe extrahiert. Tatsächlich sind Berichte über tatsächliche Enzymproben der Protopektinase sehr begrenzt (T. Sakai und M. Okushima, Agric. Biol. Chen., 42, 2427 (1978); T. Sakai und M. Okushima, Agric. Biol. Chem., 46, 667, (1982); T. Sakai und T. Sakamoto, Agric. Biol. Chem., 54, 879 (1990); usw.).
Im Hinblick auf die Anwendungen der Protopektinase beschreibt nur die japanische Patentanmeldung Veröffentlichung (Kokai) Nr. 6-220772 und "Sensyoku Kogyo (Dye Industries)" (Band 43, Nr. 4, Seiten 162–173 (1995)) ihre Verwendung für das Säubern von Fasern. Bis jetzt existieren keine veröffentlichten Berichte, die eine Inkorporation von Protopektinase in eine Detergenszusammensetzung darlegen.
Es ist bekannt, dass die Protopektinase in zwei Arten klassifizierbar ist; Typ A und Typ B (Sakai, Sakamoto, "Sen-i Kogaku (Fiber Engineering)," 45, 301 (1992)). Die Typ A Protopektinase baut einen Polygalacturonsäurebestandteil in Protopektin für eine Löslichmachung ab und die Typ B Protopektinase wirkt auch auf die verbleibenden Bestandteile (z. B. Bindungsstelle zwischen einer Pektinsubstanz und einem Cellulosemolekül). Beide Arten der Protopektinase, d. h. die Typen A und B, können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Protopektinase weist ein pH-Optimum für die Reaktion von 7,0 oder mehr in einem Reaktionssystem auf, worin Protopektin oder Polygalacturonsäure als Substrat dienen. Im Hinblick auf die Waschkraft beträgt das pH-Optimum für die Reaktion vorzugsweise 7,5 oder mehr, noch bevorzugter 8,0 oder mehr. Das pH-Optimum für die Reaktion kann in einer Vielzahl von Puffersystemen, die dem Fachmann bekannt sind, gemessen werden und das pH-Optimum für die Reaktion muss 7,0 oder mehr in mindestens einem solchen Puffersystem sein. Wenn Protopektin das Substrat ist, werden Baumwollfasern, enthaltend eine Pektinsubstanz, verwendet und für Messzwecke werden solche mit einem hohen Pektinsubstanzgehalt bevorzugt. Wenn die Protopektinase dem Typ A angehört und eine Pektinase-Aktivität aufweist, kann das pH-Optimum für die Reaktion durch Verwendung von z. B. Pektinsäure als Substrat erhalten werden. Wie hiernach im Beispielteil beschrieben, kann ein System zur Messung eines pH-Optimums für die Reaktion einen Britton-Robinson Universalpuffer beinhalten (Phosphorsäure/Essigsäure/Borsäure/Natriumhydroxid) ("Shin Jikkenkagaku-koza 20," Biochemistry [II], herausgegeben von The Chemical Society of Japan, Seite 1229, Maruzen K. K., veröffentlicht am 20. Oktober 1978) oder einen Glycin-NaOH-Puffer und als Substrat Baumwollstoff oder Polygalacturonsäure.
Die Protopektinase, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, weist vorzugsweise eine hohe Fähigkeit zur Freisetzung von Baumwollpektin bei einem pH von 8,0 auf. In Betrachtung der Waschwirkungen wird eine Fähigkeit zur Freisetzung von Baumwollpektin in einer Menge von 0,2 mg/g Baumwolle bevorzugt. Wie hier verwendet, ist die Fähigkeit zur Freisetzung von Baumwollpektin als eine Menge von Pektin definiert, freigegeben aus Baumwollgarn (1 g), nachdem das Enzym (0,4 mg/ml) eine Stunde bei 30°C mit Baumwollgarn (20 mg/ml) reagieren konnte und dies wird durch ein Verfahren gemessen, wie im Detail in den unten beschriebenen Beispielen dargestellt.
Der Quelle für die Protopektinase der vorliegenden Erfindung ist keine besondere Begrenzung auferlegt und Enzyme, die in einem breiten Bereich von Pflanzen, Bakterien und Pilzen angetroffen werden, können verwendet werden. Beispiele beinhalten ein Bakterium, wie z. B. Bazillus, eine Hefe, wie z. B. Tricosporon, Endomyces, Endomycopsis, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula, Debaryomyces, Hanseniaspora, Torulopsis, Candida oder Kluyveromyces und einen Schimmelpilz, wie z. B. Fusarium, Galactomyces, Aspergillus, Rhizopus oder Trametes. Von diesen wird die von Bazillus abgeleitete Protopektinase besonders bevorzugt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Protopektinase kann auch eine weitere Enzymaktivität ausüben, solange sie die oben beschriebene Protopektinase-Aktivität ausübt. Zum Beispiel kann eine Pektinsäure-Lyase verwendet werden, die eine Protopektinase-Aktivität ausübt.
Beispiele für Enzyme, die eine Protopektinase-Aktivität ausüben, beinhalten die Pektinsäure-Lyase, erzeugt von Bacillus sp. KSM-P15 oder Bacillus sp. KSM-366; eine Typ B Protopektinase, abgeleitet von Bacillus subtilis IFO12113; ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz, bei der eine oder mehr Aminosäuren deletiert, ersetzt oder zugefügt wurden und ein Enzym, das mit einem Antikörper dieser Enzyme immunreaktiv ist.
Ein Enzym, abgeleitet von dem Stamm KSM-P15 wird in der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Die Aminosäuresequenz der Pektinsäure-Lyase, die eine Protopektinase-Aktivität ausübt, erzeugt durch Stamm KSM-P15, ist in Sequenz Nr. 1 dargestellt. Bei der vorliegenden Erfindung kann ein Enzym mit einer Aminosäuresequenz gemäß Sequenz Nr. 1 oder einer Aminosäuresequenz gemäß Sequenz Nr. 1, bei der ein oder mehr Aminosäuren deletiert, ersetzt oder zugefügt wurden, verwendet werden. Der Deletion, dem Ersatz oder der Zugabe (hiernach bezeichnet als Mutation) ist keine besondere Begrenzung auferlegt, solange die Protopektinase und Pektinsäure-Lyase nicht deaktiviert sind und die Mutation vorzugsweise das Lysin an der 107ten Stellung, das Lysin an der 129ten Stellung und das Arginin an der 132ten Stellung in Sequenz Nr. 1 konserviert. Der Grad der Mutation ist auch nicht besonders begrenzt, solange die oben beschriebene 107te Stelle, 129te Stellung und 132te Stellung konserviert sind. Vorzugsweise existiert eine 55,7%ige oder höhere Homologie zwischen den Aminosäuren Nrn. 36 und 132 der Sequenz Nr. 1. Noch bevorzugter ist die Homologie 70% oder höher, insbesondere bevorzugt 80% oder höher.
Das Folgende ist eine detailliertere Beschreibung der enzymologischen Eigenschaften der Pektinsäure-Lyase, die eine Protopektinase-Aktivität ausübt, erzeugt von Bacillus sp. KSM-366. Ihre Messung wird hiernach beschrieben (siehe Beispiel III-1-B).
(1) Wirkung
Die Spaltung einer α-1,4-Bindung von Pektinsäure (Polygalacturonsäure) über β-Eliminierung in endo-Weise zur Bereitstellung einer Doppelbindung an der C4-C5-Stellung des nicht reduzierten Endes zur Bildung eines ungesättigten Digalacturonids oder ungesättigten Oligogalacturonids.
(2) Substratspezifität
Wirkung auf Protopektin, Pektinsäure (Polygalacturonsäure), säurelösliche Pektinsäure und Pektin.
(3) pH-Optimum
pH 8,0 bis 9,0 (Britton-Robinson Universalpuffer).
(4) Temperaturoptimum
Ungefähr 60°C (pH 8, Tris-HCl-Puffer).
(5) Molekulare Masse
Ungefähr 43 kDa (gemessen durch SDS-PAGE).
(6) Isoelektrischer Punkt
Ungefähr pH 10,3 (isoelektrische Fokusierungs-PAGE).
Das Folgende ist eine detailliertere Beschreibung der enzymologischen Eigenschaften der Pektinsäure-Lyase, die eine Protopektinase-Aktivität ausübt, erzeugt durch den Bacillus sp. KSM-P15-Stamm. Ihre Messung wird unten beschrieben (siehe Beispiel III-2-B).
(1) Wirkung
Die Spaltung einer α-1,4-Bindung von Pektinsäure (Polygalacturonsäure) über β-Eliminierung in endo-Weise zur Bereitstellung einer Doppelbindung an der C4-C5-Stellung des nicht reduzierten Endes zur Bildung eines ungesättigten Digalacturonids oder ungesättigten Oligogalacturonids.
(2) Substratspezifität
Wirkung auf Protopektin, Pektinsäure (Polygalacturonsäure), säurelösliche Pektinsäure und Pektin.
(3) pH-Optimum
pH 10,3 bis 10,7 (Glycin-NaOH-Puffer).
(4) Temperaturoptimum
50 bis 55°C (pH 10,5, Glycin-NaOH-Puffer).
(5) Molekulare Masse
Ungefähr 20 bis 21 kDa (gemessen durch Sedimentations-Equilibrium; ungefähr 26 kDa, gemessen durch SDS-PAGE).
(6) Isoelektrischer Punkt
Ungefähr pH 10,3 (isoelektrische Fokusierungs-PAGE).
(7) N-terminale Aminosäuresequenz einschließlich APTVVHETIRVPAGQTFDGK.
Beispiele für den Mikroorganismus, der das oben beschriebene Enzym erzeugt, das eine Protopektinase-Aktivität ausübt, beinhalten die oben beschriebenen Mikroorganismen, Varianten davon und Wirtszellen, transformiert mit rekombinanter DNA, die eine DNA-Sequenz aufweist, kodierend für diese Enzyme und Mutanten davon.
Um einen rekombinanten Vektor zu erzeugen, wird das Gen in einen willkürlichen Vektor insertiert, der für die Expression des Gens in einer Wirtszelle von Interesse geeignet ist. Beispiele für den Vektor beinhalten pBR322, pUC18 und pUC19 für Fälle, in denen Escherichia coli als Wirt verwendet wird und pUB110 in Fällen, in denen Bacillus subtilis als Wirt verwendet wird.
Um das Enzym, das die Protopektinase-Aktivität ausübt, durch Verwendung des vorstehenden Mikroorganismus, der ein Enzym erzeugt, das eine Protopektinase-Aktivität ausübt, eine Variante davon oder Wirtszellen, transformiert mit rekombinanter DNA mit einer DNA-Sequenz, die für diese Enzyme oder Mutanten kodiert, zu erzeugen, kann der Mikroorganismus in ein Kulturmedium inokuliert werden, enthaltend eine assimilatorische Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle und andere essentielle Nährstoffe und kann dann durch ein allgemeines Verfahren kultiviert werden.
Die Zielsubstanz, d. h. ein Enzym, das eine Protopektinase-Aktivität ausübt, kann von der so erhaltenen Kulturbrühe gesammelt und durch allgemeine Verfahren für die Sammlung und Reinigung von Enzymen gereinigt werden. Die so erhaltene Enzymlösung kann ohne weitere Behandlung verwendet werden oder kann weiter durch die bekannten Verfahren gereinigt, kristallisiert oder granuliert werden. Wenn die Enzymlösung in einer Detergenszusammensetzung verwendet wird, kann die Kulturbrühe konzentriert, dialysiert und dann sprühgetrocknet werden, um Körner zu erhalten und zwar durch die bekannten Verfahren.
Der Menge der in die Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung eingebauten Protopektinase ist keine besondere Begrenzung auferlegt, solange die Enzymaktivität in ausreichender Weise ausgedrückt wird und die oben erwähnte Freisetzbarkeit für Baumwollpektin kann als Index der bevorzugten Einbaumenge dienen. Zum Beispiel wird die Protopektinase in eine Waschlösung in einer Menge von 0,001 bis 500 mg/l, noch bevorzugter 0,05 bis 50 mg/l reduziert als Menge der Enzymprobe eingebaut, so dass die oben erwähnte Freisetzbarkeit für Baumwollpektin 0,2 mg/g Baumwolle oder mehr annehmen kann. Wenn die Protopektinase der vorliegenden Erfindung zum A-Typ gehört und eine Pektinase-Aktivität ausübt, kann das Enzym in einer Menge von 1 bis 10.000 U/l, noch bevorzugter 5 bis 5.000 U/l, besonders bevorzugt 10 bis 2.000 U/l eingebaut werden, als Konzentration des Waschens, bestimmt durch das unten beschriebene Messverfahren für die Protopektinase-Aktivität.
Um eine hohe Waschwirkung gegen schlammige Schmierflecke zu erhalten ist es wichtig, ein Enzym zu verwenden, das eine Protopektinase-Aktivität in einem alkalischen Bereich ausübt, bei dem der tatsächliche Waschvorgang durchgeführt wird. Spezifisch wird es bevorzugt, dass die Protopektinase ein Reaktions-pH-Optimum von 7,0 oder mehr aufweist oder dass die Protopektinase eine Freisetzbarkeit für Baumwollpektin von 0,2 mg/g Baumwolle oder mehr bei dem pH von 8,0 ausübt und eingebaut wird. Anders ausgedrückt ist es für die Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wichtig, dass die Protopektinase zur Freisetzung von Baumwollpektin in einer alkalischen Lösung, enthaltend das Detergens, wirkt.
Die Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung enthält außerdem einen bekannten Detergensbestandteil, für den Beispiele die Folgenden beinhalten.
(1) Tensid:
Beispiele für Tenside beinhalten anionische Tenside, wie z. B. lineare Alkylbenzolsulfonate mit einer C10-C18 (durchschnittlich) Alkylgruppe, Alkylethersulfonate, zu denen Ethylenoxid zugefügt wurde (durchschnittlich 0,5 bis 8 mol/Molekül), mit einer C10-C20 (durchschnittlich) linearen oder verzweigten Alkylgruppe, Alkylsulfate mit einer C10-C20 (durchschnittlich) Alkylgruppe, Olefinsulfonate mit 10 bis 20 (durchschnittlich) Kohlenstoffatomen im Molekül, Alkansulfonate mit 10 bis 20 (durchschnittlich) Kohlenstoffatomen im Molekül, α-Sulfofettsäuremethyl- oder -ethylester mit 10 bis 20 (durchschnittlich) Kohlenstoffatomen im Molekül, C8-C20 (durchschnittlich) höhere Fettsäuresalze, Alkylethercarbonsäuren, denen Ethylenoxid zugefügt wurde (durchschnittlich 0,5 bis 8 mol/Molekül), mit einer C10-C20 (durchschnittlich) linearen oder verzweigten Alkylgruppe; nichtionische Tenside, wie z. B. Alkoholethoxylate mit einer C10-C20 (durchschnittlich) Alkylgruppe und einer Kette von Ethylenoxideinheiten (durchschnittlich 1 bis 20 mol), Fettsäurealkanolamide oder ihre Alkylenoxidaddukte oder Ethylenoxidaddukte von Propylenoxid-Propylenglycol-Kondensat mit einer Marke "Pluronic"; betainartige ampholytische Tenside; sulfonatartige ampholytische Tenside; phosphatesterartige Tenside; aminosäureartige Tenside und kationische Tenside.
Von diesen werden die anionischen und nichtionischen Tenside vorzugsweise als aktive Tenside im Hinblick auf die Verstärkung der Detergenskraft verwendet. Besonders bevorzugte Beispiele für anionische Tenside beinhalten lineare Alkylbenzolsulfonate mit einer C10-C18 (durchschnittlich) Alkylgruppe, Alkylsulfonatester, Polyoxyalkylenalkylethersulfate und α-Sulfofettsäuremethylester. Ein Talgöl- oder ein Palmölfettsäuresalz kann in einer geringen Menge zugefügt werden. Bevorzugte Beispiele für nichtionische Tenside beinhalten Polyoxyalkylen (vorzugsweise Oxyethylen und/oder Oxypropylen) Alkylether.
Diese Tenside werden vorzugsweise in der Detergenszusammensetzung in einer Menge von 0,5 bis 60 Gew.-% (hiernach einfach bezeichnet als %), insbesondere 10 bis 45% für die pulverförmige Detergenszusammensetzung und 20 bis 50% für die Flüssig-Detergenszusammensetzung eingebaut. Wenn die Detergenszusammensetzung ein Bleichmittel in einer Menge von 40% (effektiver Sauerstoffgehalt 10% wie reduziert) oder mehr enthält, wird das Tensid vorzugsweise in einer Menge von 1 bis 10%, noch bevorzugter 1 bis 5% eingebaut.
(2) Andere Enzymbestandteile
Die Detergenszusammensetzung kann weiterhin ein anderes Enzym als eine Protopektinase enthalten. Beispiele für das Enzym beinhalten Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Lyasen, Transferasen und Isomerasen, wie klassifiziert im Hinblick auf ihre Reaktivität. Von diesen werden Cellulase, Protease, Lipase, Amylase, Pullulanase, Esterase, Hemicellulase, Peroxidase, Phenoloxidase und Pektinase, als Ersatz für Protopektinase, besonders bevorzugt. Kommerzielle Enzyme können in bekannter Menge eingebaut werden. Beispiele für die bevorzugten Enzyme beinhalten Protease, wie z. B. die Protease, die in der japanischen Patentanmeldung Veröffentlichung (Kokai) Nr. 5-25492 beschrieben wird, Alkalase, Esperase, Savinase, Durazym (Novo Nordisk A/S), Purafect, Maxapem oder Properase (Genencor Int. Inc.); Cellulase, wie z. B. die Cellulase, die in der japanischen Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 4-43119 beschrieben wird und Celluzyme (Novo Nordisk A/S); Lipase, wie z. B. Lipolase (Novo Nordisk A/S) oder Lipomax (Genencor Int. Inc.) und Amylase, wie z. B. verflüssigte α-Amylase, beschrieben in WO94/26881, Pullulanase, beschrieben in der japanischen Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7-8993 und 7-49594, alkalische Pullulanase mit einer α-Amylase-Aktivität, beschrieben in der japanischen Patentanmeldung Veröffentlichung (Kokai) Nr. 6-264094, Termamyl, Duramyl (Novo Nordisk A/S), Maxamyl, Purafect OXAm (Genencor Int. Inc.).
Von diesen verstärkt die Cellulase oder Protease, verwendet zusammen mit der oben beschriebenen Protopektinase, die Detergenskraft gegen schlammige Schmierflecke. Weiterhin verstärkt die Verwendung von Cellulase und Protease, zusammen mit der oben beschriebenen Protopektinase, die Detergenskraft weiter.
(3) Bleichmittel
Die Zugabe eines Bleichmittels zu der Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung führt zu einer weiteren Verstärkung der Detergenskraft gegen schlammige Schmierflecken. Beispiele für das Bleichmittel beinhalten Natriumpercarbonat und Natriumperborat.
(4) Metallionen Maskierungsmittel
Beispiele für Maskierungsmittel beinhalten kondensierte Phosphate, wie z. B. Tripolyphosphat, Pyrophosphat oder Orthophosphat; Aluminosilikate, wie z. B. Zeolit, synthetische beschichtete kristalline Silikate; Nitrilotriacetate; Ethylendiamintetraacetate; Citrate; Isocitrate und Polyacetalcarboxylate.
Von diesen werden kristalline Aluminosilikate (synthetisches Zeolit) besonders bevorzugt. Unter dem A-Typ, X-Typ und P-Typ-Zeolit wird der A-Typ bevorzugt. Das besonders bevorzugte synthetische Zeolit weist eine durchschnittliche primäre Korngröße von 0,1 bis 10 μm, insbesondere 0,1 bis 5 μm auf.
Das Metallion-Maskierungsmittel kann in einer Menge von 0 bis 50%, vorzugsweise 5 bis 40% zugefügt werden und phosphorfreie Metallionen-Maskierungsmittel werden bevorzugt verwendet.
Ebenfalls bevorzugt werden kristalline Silikate mit einer hohen Metallionen-Maskierungsfähigkeit, wie beschrieben in den japanischen Patentveröffentlichungen (Kokai) Nrn. 7-89712 und 60-227895; Phys. Chem. Glasses. 7, 127–138 (1966); Z. Kristallogr., 129, 396–404 (1969) usw. Beispiele hierfür beinhalten "SKS-6" (δ-Na₂Si₂O₅), kommerziell erhältlich von Clariant Japan Co.
(5) Anti-Wiederablagerungsmittel
Beispiele für Anti-Wiederablagerungsmittel beinhalten Polyethylenglycol, Carbonsäurepolymer, Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Von diesen weist das Carbonsäurepolymer eine Metallionenmaskierungsfähigkeit und eine Fähigkeit zur Dispersion fester körniger Schmierflecken von Kleidungsstücken an ein Waschbad auf, wie auch eine Anti- Wiederablagerungswirkung. Das Carbonsäurepolymer beinhaltet ein Homopolymer oder ein Copolymer von Acrylsäure, Methacrylsäure, Itaconsäure usw. und ein Copolymer von Maleinsäure und die oben beschriebenen Monomere werden bevorzugt. Das Molekulargewicht des Copolymers ist vorzugsweise einige tausend bis 100.000. Ebenfalls wird ein Polymer bevorzugt, wie z. B. Polyglycidsäuresalz, ein Cellulosederivat, wie z. B. Carboxymethylcellulose oder ein Aminocarbonsäurepolymer, wie z. B. Polyasparaginsäuresalz, und zwar, weil diese Substanzen auch eine Fähigkeit für ein Metallionenmaskieren, eine Dispersion und eine Verhinderung einer neuerlichen Schmierfleckenbildung aufweisen.
Das Anti-Wiederablagerungsmittel wird in einer Menge von 0 bis 20%, vorzugsweise 0 bis 10%, noch bevorzugter 1 bis 5 eingebaut.
(6) Alkalisches Mittel
Konventionelle alkalische Mittel werden vorzugsweise in die Detergenszusammensetzung eingebaut. Beispiele für die alkalischen Mittel, die in einem pulverförmigen Detergens verwendet werden, beinhalten Alkalimetallcarbonate, wie z. B. Natriumcarbonat, die allgemein als dichte oder leichte Asche bezeichnet werden und amorphe Alkalimetallsilikate, wie z. B. JIS Nr. 1, 2 oder 3. Diese anorganischen alkalischen Mittel sind wirksam zur Bildung von Kornkernen beim Trocknen eines Detergens um in der Lage zu sein, ein relativ hartes Detergens mit ausgezeichneter Fluidität bereitzustellen. Anstelle dieser alkalischen Mittel können Natriumsesquicarbonat und Natriumhydrogencarbonat verwendet werden und Phosphate, wie z. B. Tripolyphosphate, wirken ebenfalls als alkalische Mittel. Beispiele für die alkalischen Mittel, die in einem flüssigen Detergens verwendet werden können und die als Gegenionen für ein Tensid dienen, beinhalten Natriumhydroxid und Mono-, Di- und Triethanolamin, wie auch die oben beschriebenen alkalischen Mittel. Das alkalische Mittel wird vorzugsweise in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung in einer Menge von 0,01 bis 60%, noch bevorzugter 1 bis 50% und besonders bevorzugt 1 bis 20% eingebaut.
(7) Im Hinblick auf andere Bestandteile können konventionell bekannte Bestandteile eingebaut werden; ein Extender, wie z. B. Natriumsulfat; ein Bleichaktivator, beschrieben in der japanischen Patentanmeldungs-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 6-316700 oder Tetraacetylethylendiamin (TAED); ein Enzymstabilisator, wie z. B. eine Borverbindung oder Natriumsulfit; ein Öl absorbierendes Substrat, wie z. B. amorphes Aluminosilikat; ein Entschäumungsmittel, wie z. B. Silikon/Silikasystem; ein Antioxidans; ein fluoreszierender Farbstoff; ein Bläuungsmittel und ein Parfüm in bekannter Menge. Spezifisch können die in der japanischen Patentanmeldungs-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 8-218093 (Seite 4, Zeile Zeile 18+ und Seite 7, Zeile 17) als die oben beschriebenen Bestandteile verwendet werden.
Die Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch ein allgemeines Verfahren hergestellt werden unter Verwendung einer Kombination der oben beschriebenen Protopektinase und der bekannten Bestandteile. Je nach Verwendung kann die Form des Detergens aus Flüssigkeiten, Pulvern oder Körnern gewählt werden. Außerdem kann die Detergenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung als Detergens für Kleidungsstücke und als Bleichdetergens verwendet werden, vorzugsweise als Detergens für Kleidungsstücke. In dem Fall einer Herstellung eines granulären Detergens für Kleidungsstücke werden eine getrennt hergestellte Detergensbasis und getrennt hergestellte Enzymkörner vorzugsweise trocken vermischt, um dadurch das Detergens zu erhalten. Natürlich sollte die Protopektinase nicht deaktiviert werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail durch die Beispiele beschrieben, die nicht als die Erfindung begrenzend angesehen werden sollten.
I. Verschiedene Messverfahren
I-1 Messung des pH-Optimums für die Reaktion
1) Protopektin als Substrat:
Zu einer Enzymlösung (0,1 ml) mit einer geeigneten Konzentration wurde eine Substratlösung (1,9 ml) zugefügt, enthaltend 0,2 M Britten-Robinson-Universalpuffer (pH 3 bis 12) und Baumwollfasern (2,2 5 (G/V). Man ließ die Mischung eine Stunde bei 30°C inkubieren und unterzog sie dann einer Zentrifugation (3000 Upm, 5 Minuten, 4°C). Dem resultierenden Überstand (0,25 ml) wurde gekühlte, konzentrierte Schwefelsäure (96%, 3 ml) zugefügt und es wurde gemischt. Eine Carbazollösung (0,25 ml; 0,2% Carbazol/100% Ethanol) wurden weiter zugefügt und es wurde gemischt. Man ließ die resultierende Mischung 20 Minuten in einem 80°C Wasserbad Farbe entwickeln und sie wurde dann mit Wasser für 20 Minuten gekühlt. Darauffolgend wurde die Absorption bei 525 nm gemessen. Die Menge des freigesetzten Pektins wurde basierend auf einer Kalibrierungskurve von D-Galacturonsäure, die gleichzeitig hergestellt wurde, berechnet. Da Baumwollpektin ein Protopektin ist, ist das Enzym, das Baumwollpektin freisetzt und löslich macht, Protopektinase. Der pH, bei dem die größte Menge Baumwollpektin freigesetzt wurde, wurde als pH-Optimum für die Reaktion definiert. Verschiedene Baumwollstoffe und Baumwollgarne können als Baumwollfasern verwendet werden, die als Substrat bei dieser Messung dienen, jedoch werden diejenigen, die eine größere Menge an Pektinsubstanzen enthalten, zum Zwecke der Messung bevorzugt und diejenigen, die mindestens 5 mg Pektinsubstanzen pro g Baumwolle enthalten, wie bestimmt durch das Ammoniumoxalat-Extraktionsverfahren, das später beschrieben werden wird, werden besonders bevorzugt. Andere Puffer als der Britton-Robinson-Universalpuffer können bei dieser Messung verwendet werden. Da bestimmte Puffer einige Enzyme in ihrer enzymatischen Aktivität beeinflussen können, können Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, je nach Zweck und Umständen willkürlich gewählt werden.
2) Polygalacturonsäure als Substrat:
Eine Enzymlösung (0,1 ml) mit einer geeigneten Konzentration wurde einer Substratlösung (0,9 ml) zugefügt, enthaltend enthaltend 0,2 M Britton-Robinson-Universalpuffer (pH 3 bis 12), Polygalacturonsäure (PG; ICN Biomedicals, Ohio; 0,56%) und Calciumchlorid (0,56 mM). Man ließ die Mischung 20 Minuten bei 30°C inkubieren. Zu der resultierenden Mischung wurde 1 ml einer DNS-Lösung (0,5%, 3,5-Dinitrosalicylsäure; 1,6% Natriumhydroxid; 30% Kaliumnatriumtartrat) zugefügt. Die Mischung wurde 5 Minuten gekocht, um die Farbe von reduzierendem Zucker zu entwickeln. Direkt nach der Farbentwicklung wurde die Mischung mit Eis für ungefähr 15 Minuten abgekühlt, mit 4 ml deionisiertem Wasser gemischt und dann einer Zentrifugation unterzogen (3.000 Upm, 10 Minuten). Die Absorption des resultierenden Überstandes wurde bei 535 nm gemessen. Die Menge des produzierten reduzierenden Zuckers wurde berechnet, basierend auf einer Kalibrierungskurve von D-Galacturonsäure, die gleichzeitig hergestellt wurde. Der pH, bei dem die Aktivität die höchste war, wurde als pH-Optimum für die Reaktion definiert. Andere Puffer als der Britton-Robinson-Universalpuffer können für diese Messung verwendet werden. Da bestimmte Puffer einige Enzyme in ihrer enzymatischen Aktivität beeinflussen können, können Puffer, die dem Fachmann bekannt sind, je nach Zweck und Umständen, willkürlich gewählt werden.
I-2 Messung der Baumwoll-Pektin-Freisetzungs-Aktivität (pH 8,0)
Eine Enzymlösung (0,1 ml) wurde einer Substratlösung (1,9 ml) zugefügt, enthaltend Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 55,6 mM) und Baumwollfasern (2,2% (G/V)). Die Endkonzentration des Enzyms in der Reaktionsmischung betrug 0,4 mg/ml. Die Mischung wurde eine Stunde bei 30°C umgesetzt und einer Zentrifugation (3.000 Upm, 5 Minuten, 4°C) unterzogen. Dem resultierenden Überstand (0,25 ml) wurde gekühlte und konzentrierte Schwefelsäure (3 ml, 96%) zugefügt und es wurde gemischt. Eine Carbazollösung (0,25 ml; 0,2% Carbazol/100% Ethanol) wurde ebenfalls zugefügt und es wurde gemischt. Man ließ die resultierende Mischung 20 Minuten in einem 80°C Wasserbad Farbe entwickeln und sie wurde dann mit Wasser 20 Minuten gekühlt. Darauffolgend wurde die Absorption bei 525 nm gemessen. Die Menge des freigesetzten Pektins wurde basierend auf einer Kalibrierungskurve von D-Galacturonsäure, die gleichzeitig hergestellt wurde, berechnet. Daraus wurde die Pektinmenge, die aus 1 g Baumwolle freigesetzt wurde, berechnet und als Baumwollpektin freisetzende Aktivität bei pH 8,0 definiert. Da Baumwollpektin ein Protopektin ist, weisen Enzyme mit einer Baumwollpektin freisetzenden Aktivität eine Protopektinase-Aktivität in einem alkalischen Bereich auf. Baumwollgarne, die als Substrat bei dieser Messung dienen, sind diejenigen, die 1,5 bis 2,5 mg Pektinsubstanzen pro g Baumwolle enthalten, wie bestimmt durch das Ammoniumoxalat-Extraktiosverfahren, das später beschrieben werden wird. Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Baumwollgarne beinhalten Nähbaumwolle mit einer Garnzahl von 30 oder 40 und hergestellt von Kanebo Co.
I-3 Extraktion von Baumwollpektin durch Verwendung von Ammoniumoxalat und quantitative Bestimmung von Baumwollpektin:
Pektinsubstanzen wurden extrahiert und quantitativ durch das Ammoniumoxalat-Extraktionsverfahren bestimmt. Die Extraktionsoperation wurde durch Zugabe von fein geschnittener Baumwolle zu einer Lösung aus 0,5% Ammoniumoxalat durchgeführt, um eine Baumwollkonzentration von 1% (G/V) zu erhalten. Die Menge der extrahierten Pektinsubstanzen wurde durch das Carbazolsulfatverfahren bestimmt. Das Verfahren zur Extraktion und quantitativen Analyse wurde gemäß dem Verfahren durchgeführt, wie beschrieben in "The Research Reports von Hamamatsu Technology Center, Shizuoka" (Nr. 4, Seiten 17 bis 22, 1994).
I-4 Bestimmung der Pektinase-Aktivität in Enzympulvern
Eine Enzymlösung (0,1 ml) mit einer geeigneten Konzentration wurde einer Substratlösung (0,9 ml) zugefügt, enthaltend einen Puffer, Polygalacturonsäure (PG; ICN Biomedicals, Ohio; 0,56%) und Calciumchlorid (0,56 mM). Man ließ die Mischung 20 Minuten bei 30°C inkubieren. Als Puffer für eine Substratlösung wurde Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0, Endkonzentration: 50 mM) zur Bestimmung eines alkalischen Enzyms verwendet, während Zitronensäurepuffer (pH 5,0; Endkonzentration: 10 mM) für die Bestimmung eines sauren Enzyms verwendet wurde. Zu der resultierenden Mischung wurde 1 ml DNS-Lösung (0,5% 3,5-Dinitrosalicylsäure; 1,6% Natriumhydroxid; 30% Kaliumnatriumtartrat) zugefügt. Die Mischung wurde 5 Minuten gekocht um die Farbe des reduzierenden Zuckers zu entwickeln. Direkt nach der Farbentwicklung wurde die Mischung mit Eis ungefähr 15 Minuten gekühlt, mit 4 ml deionisiertem Wasser gemischt und dann einer Zentrifugation (3.000 Upm, 10 Minuten) unterzogen. Die Absorption des resultierenden Überstandes wurde bei 535 nm gemessen. Die Menge des erzeugten reduzierenden Zuckers wurde basierend auf der Kalibrierungskurve von D-Galacturonsäure berechnet, die gleichzeitig hergestellt wurde, um dadurch die enzymatische Aktivität zu erhalten. Im Hinblick auf die enzymatische Aktivität wurde die Menge des Enzyms, das reduzierenden Zucker äquivalent zu 1 μmol Galacturonsäure, in einer Minute erzeugte, als 1 U definiert.
I-5 Messung der Cellulase-Aktivität
Eine Enzymlösung (0,1 ml) mit einer geeigneten Konzentration wurde einer Substratlösung (0,9 ml) zugefügt, enthaltend Carboxymethylcellulose (CMC: Sunrose AO1MC, DS = 0,65 bis 0,75, DP = 250, Nihon Seishi Co.; 1,1%) und Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,0, 111 mM). Man ließ die Mischung 20 Minuten bei 40°C inkubieren. Zu der resultierenden Mischung wurde 1 ml DNS-Lösung (0,5% 3,5-Dinitrosalicylsäure; 1,6% Natriumhydroxid; 30% Kaliumnatriumtartrat) zugefügt. Die Mischung wurde 5 Minuten gekocht, um die Farbe des reduzierenden Zuckers zu entwickeln. Direkt nach der Farbentwicklung wurde die Mischung mit Eis ungefähr 15 Minuten gekühlt und dann mit 4 ml deionisiertem Wasser vermischt. Die Absorption des resultierenden Überstands wurde bei 535 nm gemessen. Die Menge des produzierten reduzierenden Zuckers wurde kalkuliert, basierend auf einer Kalibrierungskurve von D-Glucose, die gleichzeitig hergestellt wurde, um dadurch die enzymatische Aktivität zu erhalten. Im Hinblick auf die enzymatische Aktivität wurde die Menge des Enzyms, die reduzierenden Zucker äquivalent zu 1 μmol Glukose in einer Minute erzeugte, als 1 U definiert.
I-6 Messung der Protease-Aktivität
Die Abbauaktivität gegenüber Harnstoff-denaturiertem Hämoglobin wurde wie folgt durch das modifizierte Anson-Hämoglobin-Verfahren bestimmt (M. L. Anson, J. Gen. Physiol., 22, 79, 1938). Eine Enzymlösung (0,1 ml) mit einer geeigneten Konzentration wurde einer Substratlösung (0,65 ml), enthaltend Harnstoff-denaturiertes Hämoglobin (1,70%) und Calciumchlorid (0,46 mM) in der Reaktionsmischung zugefügt. Man ließ die Mischung 20 Minuten bei pH 10,5 und 25°C inkubieren. Der resultierenden Mischung wurde 1 ml Trichloressigsäure (TCA: 5% G/V Lösung) zur Beendigung der Reaktion zugefügt. Die Mischung wurde einer Zentrifugation (3.000 Upm, 10 Minuten) unterzogen. Das in dem resultierenden Überstand vorliegende Protein ließ man durch ein Phenolreagenz Farbe entwickeln. Die Menge des TCA-löslichen Proteins wurde basierend auf einer Kalibrierungskurve von Tyrosin berechnet, die gleichzeitig hergestellt wurde, um dadurch die enzymatische Aktivität zu erhalten. Im Hinblick auf die enzymatische Aktivität wurde die Menge des Enzyms, die TCA-lösliches Protein, äquivalent zu 1 mmol Tyrosin in einer Minute erzeugte, als 1 U definiert.
II. Isolierung von alkalischer Protopektinase erzeugenden
Mikroorganismen
II-1 Isolierung des Bacillus sp. KSM-366-Stammes
Erden von verschiedenen Stellen in Japan, suspendiert in sterilisiertem Wasser oder Stämme, gelagert in Mikroorganismen-Sammlungen der Kao Corporation, wurden auf ein Agarplatten-Kulturmedium aufgebracht, enthaltend Polygalacturonsäure und dann bei 30°C 3 bis 5 Tage kultiviert. Wenn Bakterien gewachsen waren, wurde 1% (G/V) CTAB- (Cetyltrimethylammoniumbromid) Lösung auf das Kulturmedium gegossen und das resultierende Medium ließ man 10 Minuten stehen. Bakterien, die um die Kolonien aufgrund eines Zerfalls von Polygalacturonsäure klare Zonen bildeten, wurden selektiert und als Pektinsäure-Lyase produzierendes Bakterium konserviert, um dadurch ein Rohenzym herzustellen, das verschiedenen Tests unterzogen wurde. Auf diese Weise wurde der Bacillus sp. KSM-366-Stamm als Bakterium selektiert, das ein Enzym erzeugte, das eine alkalische Protopektinase-Aktivität aufwies.

Die mycologischen Eigenschaften des Stamms KSM-366 sind die folgenden: A Morphologische Eigenschaften

(a) Form und Größe der Zelle	Stäbchen (0,6 bis 0,8) × (3 bis 5) μm
(b) Polymorphismus	nein
(c) Motilität	ja (peritriche Flagellen)
(d) Sporen (Größe, Form, Lokalisierung, geschwollen)	(0,6 bis 1,0) × (1,05 bis 5) μm, zentral bis subterminal, nicht geschwollen
(e) Gramfärbung	positiv
(f) Säurefestigkeit	negativ
(g) Wachstum auf Fleischbrühen-Agarplatte	opal, glatt oder blattförmige Kolonienbildung
(h) Litmusmilch	Alkalisierung, Verflüssigung

B Physiologische Eigenschaften

(a) Reduktion von Nitrat	positiv
(b) Denitrifikation	negativ
(c) MR-Test	nagativ (pH 5,8)
(d) VP-Test	positiv
(e) Indolbildung	negativ
(f) Hydrogensulfid-Bildung	negativ
(g) Stärkehydrolyse	positiv
(h) Verwertung von Zitronensäure	positiv (Christensen, Simmons-Kulturmedium)
(i) Verwertung von anorganischen Stickstoffen	Verwertung von Nitrat und Ammoniumsalz
(j) Pigmentbildung	nein
(k) Urease	negativ

(l) Oxidase	positiv
(m) Katalase	positiv
(n) Wachstumstemperaturbereich	10°C bis 45°C (optimale Temperatur: 30°C bis 40°C)
(o) Wachstums-pH-Bereich	pH 5 bis 11 (optimaler Wachstums-pH: pH 6 bis 9)
(p) Sauerstoffwirkung auf das Wachstum	Wachstum unter anaeroben Bedingungen
(q) OF-Test	- (Wachstum ohne Farbveränderung)
(r) Natriumchlorid-Beständigkeit	Wachstum auf einem Medium, das 10% Natriumchlorid enthielt
(s) Säurebildung aus Zucker	Säurebildung aus Galactose, Xylose, Arabinose, Saccharose, Glucose, Mannitol, Mannit, Inosit, Sorbit, Trehalose, Glycerin, Maltose, Fructose, Raffinose, Melibiose und löslicher Stärke; keine Säurebildung aus Lactose
(t) Gasbildung aus Glucose	nein

Ein Studium der oben beschriebenen mycologischen Eigenschaften, basierend auf der Beschreibung in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984) legte deutlich genug nah, dass dieser Stamm zu Bacillus licheniformis gehört.
Der vorliegende Stamm ist jedoch nicht fähig zu einem Überleben bei einer Temperatur oberhalb von 45°C und ist fähig zu einem Überleben bei einem maximalen pH von 11. Da bekannte Stämme von Bacillus licheniformis diese Eigenschaften nicht aufweisen, handelt es sich bei diesem Stamm um einen neuen Mikroorganismus. Dementsprechend hinterlegten wir diesen Stamm, einen neuen Mikroorganismus bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology als Bacillus sp. KSM-356 (FERM BP-6252).
II-2 Isolierung von Bacillus sp. KSM-P15-Stamm
Auf dieselbe Weise wie beschrieben in II-1 wurde der Bacillus sp. KSM-15-Stamm als Bakterium isoliert, das ein Enzym produziert, das eine alkalische Protopektinase-Aktivität ausübt.

Die mycologischen Eigenschaften des Stamms KSM-P15 sind die folgenden: A Morghologische Eigenschaften

(a) Form und Größe der Zelle	Stäbchen (0,3 bis 0,5) × (1,6 bis 2,1) μm
(b) Polymorphismus	nein
(c) Motilität	ja
(d) Sporen (Größe, Form, Lokalisierung, geschwollen)	(0,6 bis 0,7) × (1,2 bis 1,4) μm, zentral bis subterminal, geschwollen
(e) Gramfärbung	positiv
(f) Säurefestigkeit	negativ
(g) Wachstum auf Fleischbrühen-Agarplatte	gelblich-weiß, punktförmig, angehoben, Gesamt-Koloniebildung
(h) Litmusmilch	leicht rot, ohne Koagulation

B Physiologische Eigenschaften

(a) Reduktion von Nitrat	positiv
(b) Denitrifikation	negativ
(c) MR-Test	positiv (pH 5,5)
(d) VP-Test	positiv
(e) Indolbildung	negativ
(f) Hydrogensulfid-Bildung	negativ
(g) Stärkehydrolyse	positiv
(h) Verwertung von Zitronensäure	positiv
(i) Verwertung von anorganischen Stickstoffen	Keine Verwertung von Nitrat oder Ammoniumsalz
(j) Pigmentbildung	nein
(k) Urease	negativ
(l) Oxidase	positiv
(m) Wachstumstemperaturbereich	20°C bis 45°C
(n) Wachstums-pH-Bereich	pH 7 bis 10
(o) Sauerstoffwirkung auf das Wachstum	Wachstum unter anaeroben Bedingungen
(p) OF-Test	Wachstum, keine Farbveränderung
(q) Gasbildung aus Glucose	nein
(r) Natriumchlorid-Beständigkeit	Kein Wachstum auf einem Medium, enthaltend 3% Natriumchlorid
(s) Säurebildung aus Zucker	Säurebildung aus Galactose, Xylose, Arabinose, Saccharose, Glucose, Mannit, Mannose, Trehalose, Lactose, Glycerin, Maltose, Fructose, Raffinose, Melibiose und löslicher Stärke; keine Säurebildung aus Inosit oder Sorbit

Ein Studium der oben beschriebenen mycologischen Eigenschaften, basierend auf der Beschreibung in "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984) legt deutlich genug nahe, dass dieser Stamm zu Bacillus circulans gehört, wobei es sich um einen Stamm mit vielen Varianten handelt. Der vorliegende Stamm hat jedoch Eigenschaften, die mit denen der bekannten Stämme von Bacillus circulans nicht vollständig übereinstimmen und es ist daher ein neuer Mikroorganismus. Dementsprechend wurde dieser Stamm, ein neuer Mikroorganismus, bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology als Bacillus sp. KSM-P15 (FERM BP-6241) hinterlegt.
III. Herstellung von Pektinsäure-Lyase mit alkalischer Protopektinase-Aktivität und enzymologische Eigenschaften
III-1 Pektinsäure-Lyase, erzeugt von Bacillus sp. KSM-366
A Herstellung des Enzyms
Der Bacillus sp. KSM-366 Stamm wurde in einer Nährbrühe (0,8%), enthaltend Pektinsubstanzen (0,5%) und Natriumcarbonat (0,5%) insgesamt 72 Stunden kultiviert. Darauffolgend wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Der so erhaltene Überstand wurde durch Ultrafiltration (6.000 Mr cutoff) konzentriert. Die resultierende konzentrierte Lösung wurde lyophilisiert, um dadurch Enzympulver zu erhalten. Die so erhaltenen Enzympulver zeigten eine Protopektinase-Aktivität und werden hiernach als Protopektinase A bezeichnet.
Darauffolgend wurde Protopektinase A in 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst und auf eine Säule (5 × 20 cm) Super Q Toyopearl 650C (Produkt von Toso Co.), äquilibriert mit demselben Puffer, aufgebracht. Die mit dem Äquilibrierungspuffer eluierten Proteine (Proteine, die nicht an der Säule adsorbiert waren) wurden gesammelt und dann auf eine Säule (2,5 × 20 cm) SP Toyopearl 550C (Produkt von Toso Co.) geladen, äquilibriert mit 20 mM Phosphorsäure-Puffer (pH 6,0). Die Säule wurde mit dem Äquilibrierungspuffer gewaschen und Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M Natriumchlorid in dem Äquilibrierungspuffer eluiert, um dadurch Proteine mit einer Pektinase-Aktivität zu sammeln. Die so erhaltenen Fraktionen wurden durch Ultrafiltration (PM10 Diaflomembran, Produkt von Amicon; 10.000-Mr cutoff) konzentriert, darauffolgend auf eine Säule (2,6 × 60 cm) Sephacryl S-200 (Produkt von Pharmacia), äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 100 mM Natriumchlorid und 1 mM Calciumchlorid, aufgebracht und dann mit dem Puffer eluiert. Die Pektinase-Aktivitäts-Fraktionen, umfassend fast ein einzelnes Protein, wurden gesammelt und dialysiert und dann lyophilisiert, um dadurch gereinigtes Enzympulver zu erhalten. Das so erhaltene Enzym zeigt eine Protopektinase-Aktivität und wird als Protopektinase PA bezeichnet.
B Enzymologische Eigenschaften
(a) Standard enzymatische Aktivität
Die Substratlösung (3 ml), enthaltend 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8), 0,5 mM Calciumchlorid und 0,2% Polygalacturonsäure (hergestellt von Sigma) wurde 5 Minuten bei 30°C inkubiert. Eine in geeigneter Weise verdünnte Enzymlösung [0,1 ml, verdünnt mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 1 mM Calciumchlorid (pH 7,5)] wurde zur Initiation der Reaktion zugefügt. Die Mischung wurde 20 Minuten bei 30°C inkubiert und man ließ sie dann 5 Minuten in kochendem Wasser stehen, um die enzymatische Reaktion zu beenden. Die Menge der in der Reaktion gebildeten ungesättigten Oligo-Galacturonsäure wurde durch Messung der Absorption bei 235 nm bestimmt und durch Berechnung mit dem molaren Extinktionskoeffizienten von ungesättigtem Digalacturonid (4.600 M^–1 cm^–1, Hasegawa & Nagel, J. Food Sci., 31, 838–845, 1966). Es wurde eine Testleerprobe verwendet, die man 5 Minuten in kochendem Wasser stehen ließ, direkt nach Zugabe der Enzymlösung. Eine Einheit des Enzyms (1 U) wurde als Menge des Enzyms definiert, die ungesättigte Oligo-Galacturonsäure äquivalent zu 1 μmol ungesättigtem Digalacturonid pro Minute unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen erzeugt. Bei dem Experiment zur Bestimmung des pH-Optimums für die Reaktion wurde das Zeit-Scan-Verfahren verwendet, um direkt den Anstieg der Absorption bei 235 nm zu bestimmen.
(b) pH-Optimum
Das pH-Optimum für die Reaktion wurde durch das Standardenzymatische-Aktivitäts-Meßverfahren unter Verwendung von 0,2 M Britton-Robinson-Universalpuffer (pH 6,5 bis 12,0) untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass das pH-Optimum für die Reaktion 8,0 bis 9,0 beträgt.
(c) Temperatur-Optimum
Das Temperatur-Optimum für die Reaktion wurde durch Verwendung eines 0,1 M Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) bei Temperaturen zwischen 5 und 70°C einschließlich untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Enzym in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 70°C wirkt, wobei 60°C ungefähr das Optimum ist.
(d) Molekulare Masse
Die molekulare Masse des Enzyms wurde durch SDS-PAGE (12,5 Gel) als bei ungefähr 43 kDa liegend geschätzt.
(e) Isoelektrischer Punkt
Der isoelektrische Punkt des Enzyms wurde durch isoelektrische Fokusierungs-PAGE durch Verwendung von 5% Polyacrylamidgel, enthaltend einen Ampholyten mit einem pH von 8 bis 10,5 oder pH 3 bis 10 (Pharmalyte, Produkt von Pharmacia) als bei ungefähr pH 10,3 liegend bestimmt.
III-2. Pektinsäure-Lyase, erzeugt von Bacillus sp. KSM-P15
A Herstellung des Enzyms
Auf dieselbe Weise wie beschrieben in III-1 A wurde der Bacillus sp. KSM-P15-Stamm kultiviert und die Enzympulver wurden hergestellt. Die erhaltenen Enzympulver zeigten eine Protopektinase-Aktivität und werden hiernach als Protopektinase B bezeichnet.
Darauffolgend wurde die Protopektinase B in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) gelöst und auf eine Säule (5 × 20 cm) von Super Q Toyopearl 650C (Produkt von Toso Co.), äquilibriert mit demselben Puffer, aufgebracht. Die Proteine, die mit dem Äquilibrierungspuffer eluierten (Proteine, die nicht an der Säule adsorbiert waren) wurden gesammelt und dann auf einem Bio Cad60 HPLC-System (Produkt von Nihon Perceptive Co.), ausgerüstet mit einer HS-Säule (Sulfopropylgruppe; 1 × 10 cm) injiziert, äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 0,2 mM Calciumchlorid (pH 7,0). Protein, das an die Säule adsorbiert war, wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,2 M Natriumchlorid in dem Äquilibrierungspuffer eluiert, um dadurch Fraktionen zu sammeln, die eine Pectinase-Aktivität zeigten und umfassend fast ein einzelnes Protein. Die so erhaltenen Fraktionen wurden dialysiert und lyophilisiert um dadurch ein gereinigtes Enzympulver zu erhalten. Das resultierende Enzym zeigt eine Protopektinase-Aktivität und wird als Protopektinas PB bezeichnet.
B Enzymologische Eigenschaften
(a) Standard enzymatische Aktivität
Ein 0,5 M Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,5) (0,3 ml), 6 mM Calciumchlorid (0,3 ml) und deionisiertes Wasser (1,7 ml) wurden in ein Teströhrchen gegeben, das dann bei 30°C 5 Minuten inkubiert wurde. Eine in geeigneter Weise verdünnte Enzymlösung [0,1 ml, verdünnt mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 1 mM Calciumchlorid (pH 7,5)] wurde dem Teströhrchen zugefügt, das weiter bei konstanter Temperatur 5 Minuten inkubiert wurde. Eine wässrige Lösung aus Polygalacturonsäure (0,6 ml, 1% (G/V), Produkt von ICN Biochemicals Co.) wurde der Enzymlösung zugefügt, um die Reaktion auszulösen und die Mischung wurde 10 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 ml 50 mM HCl beendet. Die Menge der in der Reaktion gebildeten ungesättigten Oligo-Galacturonsäure wurde durch Messung der Absorption bei 235 nm bestimmt und durch Berechnung mit dem molaren Extinktions-Koeffizienten des ungesättigten Digalacturonids (4.600 M^–1 cm^–1, S. Hasegawa und C. W. Nagel, J. Food Sci., 31, 838–845, 1966). Eine Testprobe wurde wie folgt hergestellt: 50 mM Salzsäure (3 ml) wurden einer Reaktionsmischung zugefügt, behandelt ohne mit der Enzymlösung versetzt zu sein, und darauffolgend wurde eine Enzymlösung (0,1 ml) zugefügt. Eine Einheit des Enzyms (1 U) wurde als die Menge des Enzyms definiert, die ungesättigtes Oligogalacturonid äquivalent zu 1 μmol ungesättigtem Digalacturonid pro Minute unter den oben beschriebenen Reaktionsbedingungen erzeugt.
(b) pH-Optimum
Das pH-Optimum für die Reaktion wurde durch das Standardenzymatische-Aktivitäts-Meßverfahren unter Verwendung von 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9) oder 50 mM Glycin-NaOH-Puffer (pH 8,5 bis 11,0) untersucht. Das Enzym zeigt die höchste Rate einer Reaktion in Glycin-NaOH-Puffer (pH 10,5). Bei einem pH von 10,3 bis 10,7 beträgt die Aktivität 90 oder mehr der maximalen Aktivität und die Aktivität beträgt 70% oder mehr der maximalen Aktivität zwischen pH 10 und 11.
(c) Temperatur-Optimum
Das Temperatur-Optimum für die Reaktion wurde durch Verwendung eines 50 mM Glycin-NaOH-Puffers (pH 10,5) bei Temperaturen zwischen 10°C und 70°C einschließlich untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass das Enzym in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 65°C wirkt, wobei das Optimum zwischen 50 und 55°C liegt.
(d) Molekulare Masse

(d-1) Die molekulare Masse des Enzyms, erhalten durch Sedimentations-Gleichgewichts-Experimente beträgt 20,3 ± 1,0 kDa.
(d-2) Die molekulare Masse des Enzyms wurde durch SDS-PAGE (15% Gel) als bei ungefähr 26 kDa liegend bestimmt. Ein Molekulargewichtsmarker (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, niedriger Bereich, Produkt von Bio-Rad) wurde als Standardprotein verwendet.

(e) Isoelektrischer Punkt
Der isoelektrische Punkt des Enzyms wurde durch elektrisches Fokusierungs-PAGE durch Verwendung von 5% Polyacrylamidgel, enthaltend einen Ampholyten des pHs 8 bis 10,5 (Pharmalyte, Produkt von Pharmacia) als bei ungefähr pH 10,3 liegend bestimmt.
(f) N-terminale Aminosäuresequenz
Das Enzym wurde auf ein ProSorb-Filter (Perkin-Elmer Co.) geblottet und durch Verwendung eines Protein-Sequenzierers (Modell 674, Applied Biosystem Co.) analysiert, um die Aminosäuresequenz bis zur 20. Aminosäure zu bestimmen, d. h. APTVVHETIRVPAGQTDGK.
(g) Innere Aminosäuresequenz
Das Enzym wurde mit Lysyl-Endopeptidase behandelt. Die internen Peptide wurde von der behandelten Lösung durch Verwendung eines automatisierten C-terminalen Fragment-Fraktionators (CTFF-1: Shimadzu Co.) fraktioniert. Die Probe wurde auf einen ProSorb-Filter geblottet und die N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch Verwendung eines Proteinsequenzierers bestimmt, um dadurch die Sequenz von VVIGAPAADGVH zu erhalten.
(h) Wirkungen chemischer Reagenzien
Verschiedene chemische Reagenzien wurden zu 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) zugefügt. Eine Enzymlösung wurde zugefügt. Nachdem die Mischung für eine Stunde bei 30°C inkubiert worden war, wurde die Restaktivität durch die Standardbedingungen des Assays gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Enzym durch Tenside (0,01 bis 0,1%), Chelatbildner (0,15 bis 0,20%) oder andere Verbindungen nicht inhibiert wird.
IV. Klonierung des Gens für Pektinsäure-Lyase, abgeleitet von Bacillus sp. KSM-P15 und Herstellung des korrespondierenden Enzyms aus Transformanten.
IV-1 Klonierung des Gens
A Herstellung von genomischer DNA
Bacillus sp. KSM-P15 wurde aerob in einem flüssigen Kulturmedium unter Schütteln kultiviert und die Kulturbrühe wurde zum Sammeln von Zellen zentrifugiert. Die genomische DNA wurde aus den erhaltenen Zellen gemäß Saito und Miura (Biochim. Biophys. Acta, 72, 619–629, 1963) hergestellt.
B Herstellung von Primern
Primer 1 und Primer 2 wurden basierend auf den Ergebnissen der Beispiele B-f und B-g in (III-2) (1) synthetisiert.
C Klonieren
Eine PCR wurde durch Verwendung von Primer 1 und Primer 2 und genomischer DNA (0,5 μg) von Bacillus sp. KSM-P15 als Matrize durchgeführt. Das erhaltene amplifizierte Fragment wurde mit einem PCR-Fragment-Reinigungskit (Boehronger Mannheim) gereinigt und durch Insertion des Fragments an die Sma I-Stelle eines Plasmidvektors pUC19 kloniert. Ein Teil-Gensequenz der gewünschten Pektinsäure-Lyase wurde in der bestimmten Nukleotidsequenz von mehreren erhaltenen Klonen nachgewiesen und die Aminosäuresequenz wurde ebenfalls abgeleitet (siehe 2).
Darauffolgend wurde eine inverse PCR durchgeführt, um einen Bereich stromabwärts und einen Bereich stromaufwärts von dem oben beschriebenen PCR-vervielfältigten Fragment zu vervielfältigen. Die in 2 beobachteten Nukleotidsequenzen, Primer 3 und Primer 4 wurden verwendet. Eine genomische DNA (1 μg) vom Stamm KSM-P15 wurde mit Pst I vorverdaut, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit T4-DNA-Ligase behandelt, um eine intramolekulare Bindung (zirkularisierte DNA-Bindung) zur Bereitstellung einer Matrize zu bilden. Eine PCR wurde durch Verwendung eines Long Template System PCR-Kits (TaKaRa Co.) durchgeführt. Ein vervielfältigtes Fragment von ungefähr 2,0 kbp wurde nachgewiesen und das DNA-Fragment wurde direkt sequenziert. Auf diese Weise ergab sich die Aminosäuresequenz und Nukleotidsequenz (Sequenz Nr. 1) der Pektinsäure-Lyase, umfassend 197 Aminosäuren von der N-terminalen Aminosäuresequenz zu der Aminosäure vor dem Terminationscodon (TAA). Aus den Sequenzen kann die Molekularmasse der Pektinsäure-Lyase (Enzym der Sekretionstyp-Reifung), erzeugt durch Stamm KSM-P15, als bei 20924 Da (ungefähr 21 kDa) liegend abgeleitet werden.
Primer 5 (3) wurde so aufgebaut, dass er die abgeleitete Signalpeptidase erkennende Sequenz von Ala-Glu-Ala, lokalisiert direkt stromaufwärts der N-terminalen Aminosäure Ala der Pektinsäure-Lyase, erzeugt vom Stamm KSM-P15 und die Signalsequenz, abgeleitet von dem verwendeten Vektor verband. Primer 6 (3) war so aufgebaut, dass er eine Sequenz von 26 bp aufwies, lokalisiert in einem stromabwärts gelegenen Bereich (um 372 bp) von dem Terminationscodon (TAA) des Gens für die Pektinsäure-Lyase.
Die PCR wurde durch Verwendung von Primer 5 und Primer 6 und genomischer DNA des Stamms KSM-P15 als Matrize durchgeführt, um dadurch das DNA-Fragment zu ungefähr 1 kbp zu amplifizieren. Das DNA-Fragment wurde mit Sal I verdaut und an pHSP64 (Sumitomo et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56, 872, 1992) durch Verwendung einer Ligase ligiert, das mit Sal I und Sma I geschnitten wurde (siehe 4).
Das resultierende rekombinante Plasmid wurde in E. coli HB101-Zellen transformiert und die Transformanten wurden auf dem Agar-Plattenmedium zur Bildung klarer Zonen um die Kolonien (siehe II-1 und II-2) angezüchtet. Das erhaltene rekombinante Plasmid der vorliegenden Erfindung, das das Gen der vorliegenden Erfindung kodiert, wurde als pHSP-A15b bezeichnet.
IV-2 Herstellung des Enzyms aus Transformanten
pHSP-A156 wurde in Bacillus subtilis ISW1214-Zellen eingeführt und die Transformanten wurden in einem Flüssigmedium 3 Tage bei 30°C kultiviert, um dadurch extrazellulär eine Pektinsäure-Lyase in ziemlich großen Mengen zu erzeugen.

Die so erhaltene Rohpektinsäure-Lyaselösung wurde gemäß dem oben beschriebenen Verfahren III-2-A gereinigt. Dieses Enzym zeigte die Protopektinase-Aktivität und daher wird dieses Enzym hiernach als Protopektinase RB bezeichnet. Der pH gegenüber der Aktivitätskurve der Protopektinase RB stimmte fast vollständig mit der der Protopektinase PB überein. V. Detergenstest V-1 Herstellung von Enzymen, die in dem Detergenstest verwendet werden

(a) Protopektinase A:	hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren, wie beschrieben in III-1-A oben.
(b) Protopektinase PA:	hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren, wie beschrieben in III-1-A oben.
(c) Protopektinase B:	hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren III-2-A oben.
(d) Protopektinase PB:	hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren, wie beschrieben in III-1-A oben.
(e) Protopektinase RB:	hergestellt in Übereinstimmung mit dem Verfahren, wie beschrieben in IV-2 oben.

(f) Protopektinase C:
Die Protopektinase C wurde wie folgt hergestellt. Bacillus subtilis IFO 12113 wurde gemäß dem von Sakai et al. (Agric. Biol. Chem. 53, 1213, (1989)) beschriebenen Verfahren kultiviert. Darauffolgend wurde die Kulturbrühe zur Entfernung von Zellen zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde durch Ultrafiltration (6.000-Mr cutoff) konzentriert. Die resultierende konzentrierte Lösung wurde lyophilisiert, um dadurch ein Enzympulver zu erhalten. Das so erhaltene Enzympulver hat die Fähigkeit, Baumvaollpektin freizusetzen und daher wird dieses Enzym hiernach als Protopektinase C bezeichnet.
Protopektinase C wurde als zu Typ B Protopektinase gehörend klassifiziert, das es keine Pektinase-Aktivität zeigt.
(g) Pektinase D:
Pektinase D wurde wie folgt hergestellt. Bacillus sp. KSM-5272 (National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Hinterlegungsnummer FERM P-16065) wurde kultiviert und die Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die Zellen zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde durch Ultrafiltration (6.000-Mr cutoff) konzentriert. Die resultierende konzentrierte Lösung wurde lyophilisiert, um dadurch ein Enzympulver mit einer Pektinase-Aktivität zu erhalten. Dieses Enzym wird hiernach als Pektinase D bezeichnet. Die Pektinase D zeigte eine alkalische Pektinsäure-Lyase-Aktivität, zeigte jedoch keine Protopektinase-Aktivität.
(h) Pektinase PD:
Darauffolgend wurde Pektinase D in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5), enthaltend 1 mM Calciumchlorid, gelöst. Die Lösung wurde auf eine Säule (2,5 × 10 cm) Super Q Toyopearl 650M (Produkt von Tosoh Co.), äquilibriert mit demselben Puffer, aufgetragen. Die mit dem Äquilibrierungspuffer eluierten Proteine (Proteine, die nicht an der Säule adsorbiert waren) wurden gesammelt und auf ein Bio Cad 60 HPLC-System (Produkt von Nihon Perceptive Co.) injiziert, ausgerüstet mit einer HS-Säule (Sulfopropylgruppe; 1 × 10 cm), äquilibriert mit 20 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 0,2 mM Calciumchlorid (pH 7,0). Das an die Säule adsorbierte Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,2 M Natriumchlorid in dem Äquilibrierungspuffer eluiert, um dadurch Fraktionen zu sammeln; die eine Pektinase-Aktivität zeigten und umfassend fast ein einzelnes Protein. Die so erhaltenen Fraktionen wurden dialysiert und dann lyophilisiert, um dadurch ein gereinigtes Enzympulver zu erhalten. Dieses Enzym wird Pektinase PD genannt. ähnlich der Protopektinase PA und PB zeigt die Pektinase PD eine alkalische Pektinsäure-Lyase-Aktivität, zeigt jedoch keine Protopektinase-Aktivität.
(i) Kommerziell erhältliche Pektinasen
Die folgenden Pektinasen wurden verwendet.
Sucrase N (Sankyo Co.)
Pektinase Tanabe (Tanabe Seiyaku Co.)
Pectolyase (Kikkoman Co.)
Pektinase SS (Yakult Honsha Co.)
Pektinase HL (Yakult Honsha Co.)
V-2 Aktivität der im Detergens-Test verwendeten Enzyme

1) Die Messung wurde durch Verwendung eines 0,2 M Britton-Robinson-Universalpuffers durchgeführt. Die Daten, die durch Sternchen angegeben sind, wurden durch Verwendung eines Glycin-NaOH-Puffers erhalten, da die Messung mit dem Britton-Robinson-Universalpuffer nicht möglich war.
2) Die Messung wurde durch Verwendung eines Tris-HCl-Puffers (pH 8,0) durchgeführt.
3) Für die Protopektinase A, PA, B, PB, RB und Pektinase D wurde die Aktivität durch Verwendung eines Glycin-NaOH-Puffers (pH 10,0) gemessen und für andere Enzyme wurde die Messung in Citrat-Puffer (pH 5,0) durchgeführt.
4) Typ B Protopektinase; zeigt keine Zerfallsaktivität gegen Polygalacturonsäure.
5) Nicht in der Lage, die Aktivität zu messen (d. h. keine Aktivität).

V-3 Verfahren für einen Test der Detergenskraft
1. Waschtest für Stoff, beschmutzt mit schlammiger Erde:
Stücke von Baumwoll-Strickstoff (Strumpfwaren) wurden mit Kanuma-Akadama-Erde (Erde aus der Kanuma-Region, Japan) befleckt, um dadurch künstlich mit Erde befleckte Stücke Stoff herzustellen.
Jede der hiernach beschriebenen Detergenszusammensetzungen wurde in 4° DH harten Wasser (71,2 mg; CaCO₃/l) gelöst, um eine bestimmte Detergenskonzentration zu erhalten, um dadurch 1 l einer Detergenslösung herzustellen. Die Detergenslösung wurde in ein Becherglas aus rostfreiem Stahl für ein Terg-O-Tometer übertragen. Fünf Stücke der künstlich verschmutzten Stoffe wurden der Detergenslösung zugefügt und bei 100 Upm und 30°C 10 Minuten gewaschen. Die Teststücke wurden mit laufendem Wasser gespült, gebügelt und dann einer Messung des Reflektionsvermögens unterzogen.
Das Reflektionsvermögen des Originalstoffes vor der Verfleckung und das des Stoffes vor und nach dem Waschen wurden durch ein autoaufzeichnendes Colorimeter (Shimadzu Co.) bestimmt. Die Detergenskraft (%) wurde durch Verwendung der folgenden Gleichung berechnet: Detergenskraft (%) = {(Reflektionsvermögen nach dem Waschen) – (Reflektionsvermögen vor dem Waschen)}/{(Reflektionsvermögen des ursprünglichen Stoffs) – (Reflektionsvermögen vor dem Waschen)} × 100
2. Waschtest für schlammige Socken
Die Testteilnehmer trugen Sportsocken (Mischfasergewebe aus Baumwolle und Acrylgarnen; hergestellt von Gunze Co.). Schlamm derselben Art wie derjenige, der für die Verfleckung des oben beschriebenen Stoffs verwendet wurde, wurde den rechten und linken Socken in gleichen Mengen aufgetragen. 10 Socken jeder Gruppe (fünf linke und fünf rechte Socken) wurden mit einer Vergleichs-Detergenszusammensetzung gewaschen und die verbleibenden 10 Socken (fünf rechte und fünf linke Socken) wurden mit den Proben-Detergenszusammensetzungen gewaschen.
Die Waschweise war die Folgende. Jede Detergenszusammensetzung wurde in 30 l 30° Wasser (4° DH) gelöst, um eine bestimmte Konzentration zu haben. Die Socken wurden in einer Haushalts-Waschmaschine vom elektrischen Zwei-Gefäß-Typ 10 Minuten gewaschen, mit laufendem Wasser 5 Minuten gespült, entwässert und dann getrocknet.
Für die Bestimmung der Detergenskraft wurde ein Paar Socken mit den anderen verglichen; während eine Socke mit einem Referenz-Detergens gewaschen wurde (Detergens, das kein Enzym enthielt), wobei dies als Kontrolle diente, wurde die andere Socke mit einem Test-Detergens (Detergenszusammensetzung, die ein Enzym enthielt) gewaschen und im Hinblick auf die Kontrolle bewertet. 10 Socken wurden subjektiv durch drei Richter bewertet und die Summe der Bewertungen wurde als Einteilung einer Bewertung für die Detergenskraft angesehen.
Die Bewertungsstandards waren die Folgenden.
+2: Definitiv besser als Referenz-Detergens
+1: Etwas besser als Referenz-Detergens
0: Vergleichbar mit dem Referenz-Detergens
–1: Etwas schlechter als das Referenz-Detergens
–2: Deutlich schlechter als das Referenz-Detergens.
V-4: Ergebnisse des Waschkrafttests
A Wirkungen, wenn die Enzyme in Detergentien für Stoffe eingebaut sind
(a) Zusammensetzungen der Detergentien, die in dem Test verwendet wurden:
Tabelle 2

LAS

Natrium-lineares Alkyl(C12-C14)benzolsulfonat (für flüssige Detergentien wird LAS vom sauren Typ formuliert).

AS

Alkylsulfate

AE-1

Polyoxyethylenlaurylether (durchschnittliche Molzahl der zugefügten E. O. = 4)

AE-2

Polyoxyethylenalkyl(C12-C14)ether (durchschnittliche Molzahl der zugefügten E. O. = 6)

AEP

Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Laurylether (durchschnittliche Molzahl der zugefügten E. O. = 8; durchschnittliche Molzahl der zugefügten P. O. = 3)

AES

Alkylethersulfat (durchschnittliche Molzahl der zugefügten E. O. = 2,5)

Fettsäure

Palmsäure abgeleitete Fettsäure-Na

Zeolit

Typ 4A-Zeolit, durchschnittliche Korngröße 3 μm

Amorphes Aluminosilikat

siehe Synthesebeispiel 1

Natriumcarbonat

dichte Asche

Amorphes Silikat

JIS Nr. 2 Natriumsilikat

Kristallines Silikat

SKS-6 (Clariant Japan Co.), pulverisiert, durchschnittliche Teilchengröße: 15 μm

AA-MA

Sokalan CP5, Acrylsäure – Maleinsäure-Copolymer (BASF)

PEG

Polyethylenglykol, durchschnittliches Molekulargewicht 8.000.

Synthesebeispiel 1 (Verfahren zur Herstellung von amorphem Aluminosilikat)
Eine wässrige Lösung Natriumaluminat (1.010 g; Na₂O 1,55 Gew.-%, Al₂O₃ 2,30 Gew.-%, Na₂O/Al₂O₃ = 1,11 (molares Verhältnis)) wurde auf 40°C erwärmt. Während die Lösung bei 1.500 Upm gerührt wurde, wurden eine wässrige Natriumsilikatlösung (700 g; Na2O 2,75 Gew.-%, SiO₂ 7,88 Gew.-%, SiO₂/Na₂O = 2,96 (molares Verhältnis) und Calciumchlorid 2H₂O (1,2 g) tröpfchenweise über 20 Minuten zur Auslösung einer Reaktion zugeführt. Nach Abschluß der Addition wurde die Mischung zusätzlich für weitere 15 Minuten erwärmt. Darauffolgend wurden Feststoffe durch Filtration gesammelt und gewaschen. Der so erhaltene Feuchtkuchen wurde bei 105° bei 300 Torr für 10 Stunden zur Trockene gebracht. Der Trockenkuchen wurde pulverisiert, um dadurch ein fein verteiltes Aluminosilikatpulver zu erhalten, das durch Röntgenüberprüfung als amorph bestätigt wurde.
Die Atomabsorptions-Analyse und die Plasma-Emissions-Analyse ergaben, dass das so erhaltene amorphe Aluminosilikat die folgende Zusammensetzung aufwies:
Al₂O₃ 21,1 Gew.-%, SiO₂ 57,2 Gew.-%, Na₂O 20,8 Gew.-% und CaO 0,9 Gew.-% (1,65 Na₂O·0,08 CaO·Al₂O₃·4,75 SiO₂). Die Öl-Absorptionsfähigkeit betrug 210 ml/100 g.
(b) Testergebnisse
Die Ergebnisse der Tests, worin das Waschen durch Verwendung der Detergentien (a) bis (d) mit den in Tabelle 2 dargestellten Zusammensetzungen durchgeführt wurden, zu denen jeweils eine Vielzahl von Enzymen zugefügt wurden, sind in (b-1) bis (b-5) unten dargestellt.
Wie sich aus den Ergebnissen ablesen lässt, üben die Protopektinase-haltigen Detergenszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung Waschkraftwirkungen auf, die deutlich stärker sind als diejenigen, die durch Detergenszusammensetzungen erhalten werden, die vergleichbare Pektinase enthalten. Weiterhin, wenn alkalische Enzyme, wie z. B. Protopektinase A und B eingebaut sind, können ausgezeichnete Wirkungen in Detergenslösungen mit einem hohen pH erreicht werden. Insbesondere können solche exzellenten Wirkungen erhalten werden, wenn ein Voreinweichschritt ausgelassen wird. Es wird auch bemerkt, dass unter den Pektinasen, die ein pH-Optimum für die Reaktion im alkalischen Bereich aufweisen, Protopektinase A und B, die in der Lage sind, Baumwollpektin freizusetzen, eine ausgezeichnete Waschkraft aufweisen, während Pektinase D, die kein Baumwollpektin freisetzen kann, keine Waschkraft ausübt. Hieraus wird geschlossen, dass die alkalische Protopektinase als Detergensbestandteil effektiv ist.
(b-1) Ergebnisse aus dem Waschtest mit Detergens (a) (pH der Waschflüssigkeit: 10,7)
Waschbedingungen: Terg-O-Tometer 100 Upm, 10 Minuten, 30°C.
Wie aus Tabelle 3 deutlich wird, stellen die Protopektinasen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Waschkraft selbst dann bereit, wenn sie in ein Detergens für schwere Anwendungen eingebaut werden und bei einer Waschflüssigkeit mit hohem pH verwendet werden. Demgegenüber zeigen die Vergleichsdetergens-Zusammensetzungen, die kommerziell erhältliche Pektinasen enthalten, praktisch keine Wirkung. Der Unterschied in der Waschkraft zwischen der vorliegenden Erfindung und Vergleichsprodukten wird bei der Bewertung der Waschkraft gegenüber schlammigen Socken noch deutlicher. Weiterhin wird festgehalten, dass, obwohl die Waschkraft für Rohnzym-Präparationen anerkannt ist, gereinigte Enzyme eine Verstärkte Waschkraft selbst bei geringen Verwendungsmengen bereitstellen.
(b-2) Ergebnisse eines Waschtests mit Detergens (b) (pH der Waschflüssigkeit: 10,6)
Waschenbindungen: Terg-O-Tometer 100 Upm, 10 Minuten, 30°C.
Tabelle 4
Wie aus Tabelle 4 deutlich wird, stellen die Protopektinansen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Waschkraft selbst dann bereit, wenn sie in ein Detergens für schwierige Anwendungen eingebaut sind, enthaltend ein nichtionisches Tensid als Hauptbestandteil und mit einem hohen pH der Waschflüssigkeit. Demgegenüber zeigen die Vergleichs-Detergenszusammensetzungen, die kommerziell erhältliche Pektinansen enthalten, im wesentlichen keine Wirkung. Es ist festgehalten, dass obwohl die Waschkraft mit Rohenzym-Präparationen anerkannt ist, gereinigte Protopektinasen eine verstärkte Waschkraft mit geringen Verwendungsmengen bereitstellen.
(b-3) Ergebnisse eines Waschtests mit Detergens (c) (pH der Waschflüssigkeit: 9,2)
Waschbedingungen: Treg-O-Tometer 100 Upm, 10 Minuten, 30°C
Tabelle 5
Wie aus Tabelle 5 deutlich wird, ist klar, dass die Protopektinasen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Waschkraft selbst dann bereitstellen, wenn sie in eine flüssige Detergenszusammensetzung eingebaut sind. Demgegenüber zeigen Vergleich-Detergenszusammensetzungen, die kommerziell erhältliche Pektinasen enthalten, praktisch keine Wirkung. Weiterhin wird festgehalten, dass obwohl die Waschkraft für Rohenzym-Präparationen anerkannt ist, gereinigte Protopektinasen eine verstärkte Waschkraft bei nur geringen Verwendungsmengen bereitstellen.
(b-4) Ergebnisse eines Waschtests mit Detergens (d) (pH der Waschflüssigkeit: 8,0)
Waschbedingungen: Die zu waschenden Materialien wurden in einer 40°C Detergenslösung mit einer 6fachen Konzentration der Konzentration für die aktuelle Verwendung voreingewweicht. Darauffolgerd wurde die Konzentration auf diejenige für die aktuelle Verwendung reduziert und die Materialien wurden in einem Terg-O-Tometer bei 100 Upm und 30°C 10 Minuten gewaschen.
Tabelle 6
Wie aus Tabelle 6 deutlich wird ist klar, dass die Protopektinasen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Waschkraft bereitstellen. Wenn ein Voreinweichen in einer 40°C Detergenslösung durchgeführt wird, die eine 6fache Konzentration aufweist, zeigten die Vergleichs-Detergenszusammensetzungen, die kommerziell erhältliche Pektinasen enthielten, etwas Wirkung. Die Wirkung lag jedoch deutlich unterhalb der Wirkung, die durch die erfinderischen Produkte erhalten wird. Es wird festgehalten, dass obwohl die Waschkraft für Rohenzym-Präparationen anerkannt ist, gereinigte Protopektinasen eine verstärkte Waschkraft bei nur geringen Verwendungsmengen bereitstellen.
(b-5) Ergebnisse eines Waschtests mit Detergens (d) (pH der Waschflüssigkeit: 8,0)
Waschbedingungen: Terg-O-Tometer 100 Upm, 10 Minuten, 30°C.
Tabelle 7
Wie aus Tabelle 7 deutlich wird ist klar, dass in Abwesenheit eines Voreinweichschritts die Protopektinasen der vorliegenden Erfindung eine verbesserte Waschkraft bereitstellen. Demgegenüber zeigen Vergleichs-Detergenszusammensetzungen, die kommerziell erhältliche Pektinasen enthalten, praktisch keine Wirkung. Obwohl die Waschkraft für Rohenzym-Präparationen anerkannt ist, stellen gereinigte Enzyme eine verstärkte Waschkraft bei nur geringen Verwendungsmengen bereit.
Weiterhin wurden Detergenszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung durch Einbau von 0,1 Gew.-Teilen der Protopektinase A, B, PA, PB oder RB in 100 Gew.-Teile der in Tabellen 8 und 9 dargestellten Detergenszusammensetzungen hergestellt. Wenn körnige Detergenszusammensetzungen gebildet wurden, wurden andere Bestandteile als das Enzym, PC, AC-1 und AC-2 zunächst granuliert, um eine Detergensbasis herzustellen und darauffolgend wurden jeweils das Enzym, PC, AC-1 und AC-2 granuliert und mit den Detergensbasis-Körnern vermischt. Die so erhaltenen Detergenszusammensetzungen weisen eine ausgezeichnete Waschkraft auf und sind für das Waschen von Stoff geeignet.
Tabelle 8-1
Tabelle 8-2 (Fortsetzung von Tabelle 8-1)
Tabelle 9-1
Tabelle 9-2 (Fortsetzung von Tabelle 9-1)

LAS-2

Ein Produkt, erhalten durch Neutralisieren von Alkylbenzolsulfonsäure "Alkene L" (Kohlenstoffzahl der Alkylkette: 10 bis 14; Produkt von Nisseki Senzai Co.) mit 48% NaOH.

LAS-3

Ein Produkt, erhalten durch Neutralisieren von Alkylbenzolsulfonsäure "Alkene L" (Kohlenstoffzahl der Alkylkette: 10 bis 14; Produkt von Nisseki Senzai Co.) mit 50% KOH.

AS2

Ein Natriumsalz von Dovanol 25 Sulfat (C12-C15 Schwefelsäure) (Produkt von Mitsubishi Kagaku Co.).

SAS

Hostapur SAS93, (C13-C18 Natriumalkansulfonat) (Produkt von Clariant Japan Co.).

AOS

Natrium-α-Olefinsulfonat

SFE

Abgeleitet von Palmöl. Natrium-α-Sulfo-Fettsäure-Methylester.

Fettsäuresalz

Natriumpalmitat

AES-2

Polyoxyethylenalkyl (C12-C15) Ethernatriumsulfat (durchschnittliche Molzahl der zugefügten E. O. = 2).

AE-3

Nonidet S-3 (ein Produkt, erhalten durch Zugabe zu einem C12- oder C13-Alkohol, E. O. in einer Menge von 3 mol Durchschnitt) (hergestellt von Mitsubishi Kagaku Co.).

AE-4

Nonidet R-7 (ein Produkt, erhalten durch Zugabe von C12- oder C15-Alkohol, E. O. in einer Menge von 7,2 mol Durchschnitt) (hergestellt von Mitsubishi Kagaku Co.).

AE-5

Softanol 70 (ein Produkt, erhalten durch Zugabe zu einem C12-C15 sekundären Alkohol, E. O. in einer Menge von 7 mol im Durchschnitt) (hergestellt von Nippon Shokubai Co.).

AG

Alkyl(palmöl-abgeleitetes)glucosid (durchschnittlicher Polymerisationsgrad: 1,5).

Öl-absorbierender

Träger: Tixolex 25 (amorphes Natriumaluminosilikat; hergestellt von Kofran Chemical; Öl-Absorptions-Fähigkeit: 235 ml/100 g).

Kristallines Silikat

SKS-6; δ-Na₂Si₂O₅; kristallines laminiertes Silikat; durchschnittliche Korngröße: 20 μm; hergestellt von Clariant Japan Co.

Amorphes Silikat

JIS Nr. 1 Natriumsilikat

STPP

Natriumtripolyphosphat

NTA

Natriumnitrilotriacetat

PAA

Natriumpolyacrylat; durchschnittliches Molekulargewicht: 12.000.

AA-MA

Sokalan CP5 von BASF; Acrylsäure-Maleinsäure-Copolymer (hergestellt von BASF).

CMC

Sunrose B1B; Carboxymethylcellulose-Na; hergestellt von Nihon Seishi Co.).

PEG

Polyethylenglykol; durchschnittliches Molekulargewicht 6.000.

PVP

Polyvinylpyrrolidon; durchschnittliches Molekulargewicht: 40.000; K-Zahl: 26–35.

Fluoreszierender Farbstoff

Eine 1 : 1-Mischung aus Tinopal CBS (hergestellt von Ciba Geigy) und Whitex SA (hergestellt von Sumitomo Chemical Co.). (Bemerkung: im Fall von flüssigen Detergentien wurde Tinopal CBS allein eingebaut).

Parfüm

Formuliert gemäß der Parfüm-Zusammensetzung, beschrieben im Beispielsteil der japanischen Patentanmeldungs-Veröffentlichung (Kokai) Nr. 8-239700.

Enzyme

Eine 2 : 1 : 1 : 1-Mischung von Savinase 12.0 TW (Protease), Lipolase 100T (Lipase), Termamyl 60T (Amylase) – alle hergestellt von Novo Nordisk A/S- und KAC 500 (Cellulase, hergestellt von Kao Co.). (Bemerkung: im Fall von flüssigen Detergentien wurde Savinase 16.0L (Protease, hergestellt von Novo Nordisk A/S) allein eingebaut).

PC

Natriumpercarbonat; durchschnittliche Teilchengröße 400 μm; beschichtet mit Natriummetaborat.

AC-1

TAED, Tetraacetylethylendiamin; hergestellt von Clariant Co., Ltd..

AC-2

Natriumlauroyloxybenzolsulfonat.

B Wirkungen, wenn die Enzyme in Bleichdetergentien eingebaut werden:
Bleichdetergentien mit den in Tabelle 10 dargestellten Zusammensetzungen wurden hergestellt. Stücke von künstlich schlammverschmutzem Stoff wurden in einer 0,5 eigen wässrigen Lösung von jedem Detergens (20°C, 30 Minuten) eingeweicht und darauffolgend durch Verwendung eines Terg-O-Tometers bei 100 Upm und 20°C 10 Minuten gewaschen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 dargestellt.
Aus Tabelle 10 wird klar, dass die Protopektinase-haltigen Bleich-Detergenszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine bemerkenswerte Waschkraft gegen schlammige Erde ausüben.
C Wirkungen, die sich auf der kombinierten Verwendung von Protopektinase und Cellulase und/oder Protease ergeben:
Eine Vielzahl von Enzymen, wie dargestellt in Tabelle 11, wurden in das vorstehende Detergens (a) in den in Tabelle 11 angegebenen Mengen eingebaut und Stücke von künstlich verschmutzten Stoffe wurden durch Verwendung der resultierenden Detergenszusammensetzungen gewaschen (pH der Waschflüssigkeiten: 10,7; Waschbedingungen: Terg-O-Tometer 100 Upm, 10 Minuten, 30°C).
Aus den obigen Ergebnissen wird deutlich, dass wenn die Protopektinasen der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Cellulase oder Protease verwendet werden, eine verstärkte Waschkraftwirkung erhalten werden kann. Wenn die Protopektinasen der vorliegenden Erfindung weiterhin in Kombination mit Cellulase und Protease zur Herstellung eines Drei-Komponenten-Systems verwendet werden, kann sogar eine noch verbessertere Waschkraftwirkung gegen schlammige Erde erhalten werden.
Diese synergistische Wirkung, die der kombinierten Verwendung der Enzyme zuzuschreiben ist, kann auch erhalten werden, wenn andere Cellulasen oder Proteasen verwendet werden, die kommerziell unter den unten angegebenen Marken erhältlich sind.
Cellulase: Celluzyme (hergestellt von Novo Nordisk A/S) Protease: Alkalase, Esperase, Savinase, Durazym (hergestellt von Novo Nordisk A/S); Purafect, Maxapem, Properase (hergestellt von Genencor Int. Inc.).
Gewerbliche Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben, weisen die Detergenszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eine sehr hohe Waschkraft gegenüber schlammiger Erde auf und sind daher besonders geeignet zum Waschen von Kleidung.
Diese Anmeldung beansprucht die Prioritäten, basierend auf der japanischen Patentanmeldung Nr. 9-091142 und 9-242736, eingereicht am 09. April 1997 bzw. 08. September 1997, die hier durch Inbezugnahme inkorporiert sind.
Sequenzprotokoll

Claims

Detergenszusammensetzung, umfassend Protopektinase mit einem pH-Optimum bei der Reaktion von 7,0 oder höher, wenn Protopektin oder Polygalacturonsäure als Substrat verwendet wird, und ein Tensid.
Detergenszusammensetzung gemäss Anspruch 1, wobei die Protopektinase die Fähigkeit aufweist, Baumwollpektin freizusetzen, wobei die Freisetzbarkeit für Baumwollpektin 0,2 mg/g Baumwolle oder mehr beträgt.
Detergenszusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei die Protopektinase von einem Mikroorganismus der Gattung Bacillus stammt.
Detergenszusammensetzung gemäss einem der vorherigen Ansprüche 1 bis 3, wobei die Protopektinase eine Pektinsäure-Lyase-Aktivität aufweist.
Detergenszusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4, die weiterhin eine Cellulase umfasst.
Detergenszusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 5, die weiterhin eine Protease umfasst.
Detergenszusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, die weiterhin ein Bleichmittel umfasst.