JPH11123081A - マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体 - Google Patents
マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
Abstract
(57)【要約】
【課題】 マルトペンタオース生成α−アミラーゼの遺
伝子を改変することにより、マルトペンタオース分解活
性が低下し、実用性の向上した改良酵素を開発するこ
と。 【解決手段】 シュードモナス エスピー ＫＯ−８９
４０由来マルトペンタオース生成アミラーゼのアミノ酸
配列 (Shida, O. ら、Biosci. Biotech. Biochem. 56
巻, 76-80, 1992)において５７番目または１３９番目に
位置するアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有す
る、マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド並びに該プラ
スミドを保有する形質転換大腸菌。
伝子を改変することにより、マルトペンタオース分解活
性が低下し、実用性の向上した改良酵素を開発するこ
と。 【解決手段】 シュードモナス エスピー ＫＯ−８９
４０由来マルトペンタオース生成アミラーゼのアミノ酸
配列 (Shida, O. ら、Biosci. Biotech. Biochem. 56
巻, 76-80, 1992)において５７番目または１３９番目に
位置するアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有す
る、マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼをコー
ドする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミド並びに該プラ
スミドを保有する形質転換大腸菌。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、マルトペンタオー
スの生産に用いるマルトペンタオース生成α−アミラー
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベク
ターおよび形質転換体に関する。マルトペンタオース生
成α−アミラーゼは、グルコースがα−１，４グリコシ
ド結合したデンプンやアミロース等の多糖類のα−１，
４グリコシド結合を加水分解し、グルコースの五炭糖で
あるマルトペンタオースを生成する酵素である。この酵
素を利用することにより、デンプンからマルトペンタオ
ースを生産することができる。この発明は、デンプン等
を材料としたマルトペンタオースの生産に活用できるシ
ュードモナス属微生物由来のマルトペンタオース生成α
−アミラーゼを、遺伝子工学的手法により改良し、実用
性を向上させた当該酵素の遺伝子並びに該遺伝子を含む
プラスミドベクターと形質転換体に関するものである。
スの生産に用いるマルトペンタオース生成α−アミラー
ゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含むプラスミドベク
ターおよび形質転換体に関する。マルトペンタオース生
成α−アミラーゼは、グルコースがα−１，４グリコシ
ド結合したデンプンやアミロース等の多糖類のα−１，
４グリコシド結合を加水分解し、グルコースの五炭糖で
あるマルトペンタオースを生成する酵素である。この酵
素を利用することにより、デンプンからマルトペンタオ
ースを生産することができる。この発明は、デンプン等
を材料としたマルトペンタオースの生産に活用できるシ
ュードモナス属微生物由来のマルトペンタオース生成α
−アミラーゼを、遺伝子工学的手法により改良し、実用
性を向上させた当該酵素の遺伝子並びに該遺伝子を含む
プラスミドベクターと形質転換体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】シュ
ードモナス属微生物に由来するマルトペンタオース生成
α−アミラーゼを用いてデンプン等からマルトペンタオ
ースを酵素的に生産することができる。しかしながら、
当該酵素は、得られるマルトペンタオースを、さらにマ
ルトトリオースとマルトースとにまで分解する活性をも
有する。そのため、時間の経過に伴い、生成したマルト
ペンタオースの分解が平行して進行し、マルトペンタオ
ースの収量が低下すると共に、副生成物であるマルトト
リオースおよびマルトースが発生する。このため、該酵
素を用いてマルトペンタオースを効率よく生産すること
は困難であった。本発明の目的は、当該酵素の遺伝子を
改変することにより、マルトペンタオース分解活性が低
下し、実用性の向上した改良酵素を開発することであ
る。
ードモナス属微生物に由来するマルトペンタオース生成
α−アミラーゼを用いてデンプン等からマルトペンタオ
ースを酵素的に生産することができる。しかしながら、
当該酵素は、得られるマルトペンタオースを、さらにマ
ルトトリオースとマルトースとにまで分解する活性をも
有する。そのため、時間の経過に伴い、生成したマルト
ペンタオースの分解が平行して進行し、マルトペンタオ
ースの収量が低下すると共に、副生成物であるマルトト
リオースおよびマルトースが発生する。このため、該酵
素を用いてマルトペンタオースを効率よく生産すること
は困難であった。本発明の目的は、当該酵素の遺伝子を
改変することにより、マルトペンタオース分解活性が低
下し、実用性の向上した改良酵素を開発することであ
る。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、シュード
モナス属微生物由来のマルトペンタオース生成α−アミ
ラーゼの基質との結合に関与するアミノ酸残基を他のア
ミノ酸に変換する蛋白質工学的研究を計画し、該酵素遺
伝子を改変することにより、実用性に優れた該酵素の生
産に成功することによって本発明を完成させた。
モナス属微生物由来のマルトペンタオース生成α−アミ
ラーゼの基質との結合に関与するアミノ酸残基を他のア
ミノ酸に変換する蛋白質工学的研究を計画し、該酵素遺
伝子を改変することにより、実用性に優れた該酵素の生
産に成功することによって本発明を完成させた。
【０００４】すなわち、請求項１記載の本発明は、シュ
ードモナス エスピー ＫＯ−８９４０由来マルトペン
タオース生成アミラーゼのアミノ酸配列 (Shida, O.
ら、Biosci. Biotech. Biochem. 56 巻, 76-80, 1992)
において５７番目または１３９番目に位置するアミノ酸
残基が置換されたアミノ酸配列を有する、マルトペンタ
オース高生産性α−アミラーゼをコードする遺伝子であ
る。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の遺伝子を
含むプラスミドである。請求項３記載の本発明は、プラ
スミドが、配列表の配列番号３〜８のいずれかに記載の
アミノ酸配列を有するものである請求項２記載のプラス
ミドである。
ードモナス エスピー ＫＯ−８９４０由来マルトペン
タオース生成アミラーゼのアミノ酸配列 (Shida, O.
ら、Biosci. Biotech. Biochem. 56 巻, 76-80, 1992)
において５７番目または１３９番目に位置するアミノ酸
残基が置換されたアミノ酸配列を有する、マルトペンタ
オース高生産性α−アミラーゼをコードする遺伝子であ
る。請求項２記載の本発明は、請求項１記載の遺伝子を
含むプラスミドである。請求項３記載の本発明は、プラ
スミドが、配列表の配列番号３〜８のいずれかに記載の
アミノ酸配列を有するものである請求項２記載のプラス
ミドである。
【０００５】請求項４記載の本発明は、配列表の配列番
号３に記載のアミノ酸配列を有するプラスミドを保有す
る形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１６）であ
る。請求項５記載の本発明は、配列表の配列番号４に記
載のアミノ酸配列を有するプラスミドを保有する形質転
換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１９）である。請求項
６記載の本発明は、配列表の配列番号５に記載のアミノ
酸配列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１５）である。請求項７記載の
本発明は、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を
有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１７）である。請求項８記載の本発明は、
配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するプラ
スミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
１１８）である。請求項９記載の本発明は、配列表の配
列番号８に記載のアミノ酸配列を有するプラスミドを保
有する形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１４）で
ある。
号３に記載のアミノ酸配列を有するプラスミドを保有す
る形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１６）であ
る。請求項５記載の本発明は、配列表の配列番号４に記
載のアミノ酸配列を有するプラスミドを保有する形質転
換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１９）である。請求項
６記載の本発明は、配列表の配列番号５に記載のアミノ
酸配列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌
（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１５）である。請求項７記載の
本発明は、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を
有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１７）である。請求項８記載の本発明は、
配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するプラ
スミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６
１１８）である。請求項９記載の本発明は、配列表の配
列番号８に記載のアミノ酸配列を有するプラスミドを保
有する形質転換大腸菌（ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１４）で
ある。
【０００６】
【発明の実施の形態】本発明者らは、シュードモナス属
細菌由来のマルトペンタオース生成α−アミラーゼの遺
伝子に特定の変異を導入することにより、当該酵素がも
つマルトペンタオース分解活性が低減した一連の変異酵
素を作出した。
細菌由来のマルトペンタオース生成α−アミラーゼの遺
伝子に特定の変異を導入することにより、当該酵素がも
つマルトペンタオース分解活性が低減した一連の変異酵
素を作出した。
【０００７】その方法の概略は以下の通りである。ま
ず、種々のα−アミラーゼで保存されている基質結合に
関与する特定のアミノ酸残基の推定を行った。この特定
のアミノ酸残基のコドンを、部位特異的変異法により変
換し、マルトペンタオースに対する親和性が低下した酵
素を生産する変異遺伝子を造成した。この変異遺伝子を
含むプラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転換体
により、マルトペンタオース分解活性が減少したマルト
ペンタオース生成α−アミラーゼを生産した。
ず、種々のα−アミラーゼで保存されている基質結合に
関与する特定のアミノ酸残基の推定を行った。この特定
のアミノ酸残基のコドンを、部位特異的変異法により変
換し、マルトペンタオースに対する親和性が低下した酵
素を生産する変異遺伝子を造成した。この変異遺伝子を
含むプラスミドを大腸菌に導入して得られた形質転換体
により、マルトペンタオース分解活性が減少したマルト
ペンタオース生成α−アミラーゼを生産した。
【０００８】これらの改良酵素は、マルトペンタオース
分解活性が減少しているため、デンプン等からマルトペ
ンタオースを高収量で生産できる。同時に、副生成物で
あるマルトースとマルトトリオースの収量は、野性型酵
素と比較して非常に少ない。すなわち、当該改良酵素
は、デンプンを材料としたマルトペンタオースの生産能
において、野性型酵素よりも優れているものである。
分解活性が減少しているため、デンプン等からマルトペ
ンタオースを高収量で生産できる。同時に、副生成物で
あるマルトースとマルトトリオースの収量は、野性型酵
素と比較して非常に少ない。すなわち、当該改良酵素
は、デンプンを材料としたマルトペンタオースの生産能
において、野性型酵素よりも優れているものである。
【０００９】以下において、本発明を詳細に説明する。
前記したように、本発明のマルトペンタオース生成α−
アミラーゼ遺伝子は、マルトペンタオース生成α−アミ
ラーゼ生産能を有するシュードモナス属微生物に由来す
るものである。このようなマルトペンタオース生成α−
アミラーゼ生産能を有するシュードモナス属微生物とし
ては、シュードモナス属（Pseudomonas sp.)ＫＯ−８９
４０株がある。
前記したように、本発明のマルトペンタオース生成α−
アミラーゼ遺伝子は、マルトペンタオース生成α−アミ
ラーゼ生産能を有するシュードモナス属微生物に由来す
るものである。このようなマルトペンタオース生成α−
アミラーゼ生産能を有するシュードモナス属微生物とし
ては、シュードモナス属（Pseudomonas sp.)ＫＯ−８９
４０株がある。
【００１０】マルトペンタオース生成α−アミラーゼ
は、上記微生物から得ることができ、具体的には、上記
の菌株を常法に従い栄養培地で培養後、培養物から菌体
を分離する。しかる後、該菌体を常法により破砕、遠心
分離してマルトペンタオース生成α−アミラーゼ画分を
得る。次に、必要に応じてカラムクロマトグラフィー、
ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ等の精製手段を用いることにより、
高度に精製したマルトペンタオース生成α−アミラーゼ
を得ることができる。
は、上記微生物から得ることができ、具体的には、上記
の菌株を常法に従い栄養培地で培養後、培養物から菌体
を分離する。しかる後、該菌体を常法により破砕、遠心
分離してマルトペンタオース生成α−アミラーゼ画分を
得る。次に、必要に応じてカラムクロマトグラフィー、
ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ等の精製手段を用いることにより、
高度に精製したマルトペンタオース生成α−アミラーゼ
を得ることができる。
【００１１】シュードモナス エスピー ＫＯ−８９４
０由来マルトペンタオース生成α−アミラーゼのアミノ
酸配列は、すでに決定されている (Shida, O., Kadowak
i, K. and Kobayashi, S., Biosci. Biotech. Bioche
m., 56巻, 76-80, 1992)。このマルトペンタオース生成
α−アミラーゼのアミノ酸配列のうち、デンプン分子中
のグルコース間のα−１，４結合の加水分解に関与する
部分およびデンプンとの結合に関与する部分の特定を行
った。
０由来マルトペンタオース生成α−アミラーゼのアミノ
酸配列は、すでに決定されている (Shida, O., Kadowak
i, K. and Kobayashi, S., Biosci. Biotech. Bioche
m., 56巻, 76-80, 1992)。このマルトペンタオース生成
α−アミラーゼのアミノ酸配列のうち、デンプン分子中
のグルコース間のα−１，４結合の加水分解に関与する
部分およびデンプンとの結合に関与する部分の特定を行
った。
【００１２】すなわち、マルトペンタオース生成α−ア
ミラーゼのアミノ酸配列を、他のアミラーゼ、具体的に
はタカアミラーゼのアミノ酸配列 (Tsukagoshi, N., Fu
rukawa, M., Nagaba, H., Kirita, N., Tsuboi, A. and
Udaka, S., Gene, 84巻, 1989) およびマルトテトラオ
ース生成α−アミラーゼのアミノ酸配列 (Fujita, M.,
Torigoe, K., Nakada, U., Tsuzuki, K., Kubota, M. a
nd Tsujikawa, Y. J.Bacteriol., 171巻, 1333-1339,
1989) との比較を行った。
ミラーゼのアミノ酸配列を、他のアミラーゼ、具体的に
はタカアミラーゼのアミノ酸配列 (Tsukagoshi, N., Fu
rukawa, M., Nagaba, H., Kirita, N., Tsuboi, A. and
Udaka, S., Gene, 84巻, 1989) およびマルトテトラオ
ース生成α−アミラーゼのアミノ酸配列 (Fujita, M.,
Torigoe, K., Nakada, U., Tsuzuki, K., Kubota, M. a
nd Tsujikawa, Y. J.Bacteriol., 171巻, 1333-1339,
1989) との比較を行った。
【００１３】当該酵素、タカアミラーゼおよびマルトテ
トラオース生成α−アミラーゼの各アミノ酸配列を、ホ
モロジー解析プログラム Clustal W でアライメントし
た。Ｘ線結晶解析の結果、加水分解と基質との結合に関
与することがすでに明らかなタカアミラーゼ（Matsuur
a, Y. et al., J. Biodhem. 95 巻, 697-702, 1984)お
よびマルトテトラオース生成α−アミラーゼ（Morisit
a, Y. et al., J. Mol. Biol. 267巻, 661-672, 1997)
のアミノ酸残基は、これら３つの酵素の各アミノ酸配列
のほぼ同じ位置に共通して存在していることがわかっ
た。その結果、当該酵素のアミノ酸配列のうち、酵素活
性に影響を与えず、マルトペンタオースとの結合力を低
下させることが可能な変換候補アミノ酸残基は、加水分
解に直接関わる活性中心から離れて位置する５７番目の
トリプトファン残基と１３９番目のチロシン残基である
と特定した。すなわち、これらアミノ酸残基がデンプン
分子のグルコースとの結合に関与するアミノ酸残基であ
る。
トラオース生成α−アミラーゼの各アミノ酸配列を、ホ
モロジー解析プログラム Clustal W でアライメントし
た。Ｘ線結晶解析の結果、加水分解と基質との結合に関
与することがすでに明らかなタカアミラーゼ（Matsuur
a, Y. et al., J. Biodhem. 95 巻, 697-702, 1984)お
よびマルトテトラオース生成α−アミラーゼ（Morisit
a, Y. et al., J. Mol. Biol. 267巻, 661-672, 1997)
のアミノ酸残基は、これら３つの酵素の各アミノ酸配列
のほぼ同じ位置に共通して存在していることがわかっ
た。その結果、当該酵素のアミノ酸配列のうち、酵素活
性に影響を与えず、マルトペンタオースとの結合力を低
下させることが可能な変換候補アミノ酸残基は、加水分
解に直接関わる活性中心から離れて位置する５７番目の
トリプトファン残基と１３９番目のチロシン残基である
と特定した。すなわち、これらアミノ酸残基がデンプン
分子のグルコースとの結合に関与するアミノ酸残基であ
る。
【００１４】次に、この両アミノ酸残基を他のアミノ酸
残基に変換する方法について検討した。アミノ酸残基の
変換は、例えば以下のような方法により行うことができ
る。まず、両アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変換す
るためのオリゴヌクレオチド２本を、ホスホアミダイド
試薬を用いてＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステ
ムズ社製）で合成した。２本のうち、５７番目のトリプ
トファン残基を変換するためのオリゴヌクレオチドをオ
リゴヌクレオチドＡ、１３９番目のチロシン残基を変換
するためのオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドＢ
と称する。オリゴヌクレオチドＡおよびＢの塩基配列
は、それぞれ配列表の配列番号１および２に示す通りで
ある。
残基に変換する方法について検討した。アミノ酸残基の
変換は、例えば以下のような方法により行うことができ
る。まず、両アミノ酸残基を他のアミノ酸残基に変換す
るためのオリゴヌクレオチド２本を、ホスホアミダイド
試薬を用いてＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシステ
ムズ社製）で合成した。２本のうち、５７番目のトリプ
トファン残基を変換するためのオリゴヌクレオチドをオ
リゴヌクレオチドＡ、１３９番目のチロシン残基を変換
するためのオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドＢ
と称する。オリゴヌクレオチドＡおよびＢの塩基配列
は、それぞれ配列表の配列番号１および２に示す通りで
ある。
【００１５】一方、塩基置換を導入するＤＮＡ領域を含
む５３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＯＳ３４
１０より調製した。これを、ファージベクターＭ１３ｔ
ｖ１８のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することによ
って、Ｍ１３ｔｖ１８−Ａ１を作成した。
む５３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片をｐＯＳ３４
１０より調製した。これを、ファージベクターＭ１３ｔ
ｖ１８のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することによ
って、Ｍ１３ｔｖ１８−Ａ１を作成した。
【００１６】部位特異的変異の導入は、例えばアマーシ
ャム社製のSculptor（登録商標）invitro mutagenesis
Kitを使用して行うことができる。このSculptor in vit
ro mutagenesis Kit を使用する場合、アマーシャム社
の実験書に従って、部位特異的変異の導入を行う。すな
わち、Ｍ１３ｔｖ１８−Ａ１の一本鎖ＤＮＡの鋳型にオ
リゴヌクレオチドＡおよびＢをアニーリングし、ｄＣＴ
ＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＡＴＰの
存在下で、Ｔ７ポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼによ
って伸長反応と連結反応とを行う。次に、Ｔ５エキソヌ
クレアーゼ処理により、一本鎖部分を持つ未反応分子を
切断した後、制限酵素ＮｃｉＩで鋳型のＤＮＡ鎖を切断
する。さらに、エキソヌクレアーゼIII で鋳型のＤＮＡ
鎖を完全に分解する。
ャム社製のSculptor（登録商標）invitro mutagenesis
Kitを使用して行うことができる。このSculptor in vit
ro mutagenesis Kit を使用する場合、アマーシャム社
の実験書に従って、部位特異的変異の導入を行う。すな
わち、Ｍ１３ｔｖ１８−Ａ１の一本鎖ＤＮＡの鋳型にオ
リゴヌクレオチドＡおよびＢをアニーリングし、ｄＣＴ
ＰαＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＡＴＰの
存在下で、Ｔ７ポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼによ
って伸長反応と連結反応とを行う。次に、Ｔ５エキソヌ
クレアーゼ処理により、一本鎖部分を持つ未反応分子を
切断した後、制限酵素ＮｃｉＩで鋳型のＤＮＡ鎖を切断
する。さらに、エキソヌクレアーゼIII で鋳型のＤＮＡ
鎖を完全に分解する。
【００１７】こうして合成された一本鎖ＤＮＡを大腸菌
に形質転換する。この一本鎖ＤＮＡが塩基置換がもつか
どうかは、形質転換体から一本鎖ＤＮＡを調製し、その
塩基配列を解析することにより確認することができる。
上記の方法により、該酵素のアミノ酸配列のうち、５７
番目のトリプトファン残基と１３９番目のチロシン残基
を変換することができるが、ＰＣＲ法（藤永薫 編集、
遺伝子増幅（ＰＣＲ）法、蛋白質核酸酵素，35巻, 17
号, 1990, 共立出版) によって行うことも可能である。
すなわち、配列番号１に示す塩基置換を含むオリゴヌク
レオチドＡおよび配列番号２に示す塩基置換を含むオリ
ゴヌクレオチドＢ、さらにはこれらの相補オリゴヌクレ
オチドを用いて、二段階のＰＣＲを行うことにより、２
つのアミノ酸残基を変換することができる。
に形質転換する。この一本鎖ＤＮＡが塩基置換がもつか
どうかは、形質転換体から一本鎖ＤＮＡを調製し、その
塩基配列を解析することにより確認することができる。
上記の方法により、該酵素のアミノ酸配列のうち、５７
番目のトリプトファン残基と１３９番目のチロシン残基
を変換することができるが、ＰＣＲ法（藤永薫 編集、
遺伝子増幅（ＰＣＲ）法、蛋白質核酸酵素，35巻, 17
号, 1990, 共立出版) によって行うことも可能である。
すなわち、配列番号１に示す塩基置換を含むオリゴヌク
レオチドＡおよび配列番号２に示す塩基置換を含むオリ
ゴヌクレオチドＢ、さらにはこれらの相補オリゴヌクレ
オチドを用いて、二段階のＰＣＲを行うことにより、２
つのアミノ酸残基を変換することができる。
【００１８】このようにして変異が導入された組換えＤ
ＮＡより、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を回収する。この
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社製）を用いて、ｐＯＳ３４１０の
該ＤＮＡ断片と入れ換える。その結果、アミノ酸配列が
変化した変異マルトペンタオース生成α−アミラーゼを
生産するプラスミド６種類を作出することができる。
ＮＡより、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を回収する。この
ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を、ＤＮＡライゲーションキ
ット（宝酒造株式会社製）を用いて、ｐＯＳ３４１０の
該ＤＮＡ断片と入れ換える。その結果、アミノ酸配列が
変化した変異マルトペンタオース生成α−アミラーゼを
生産するプラスミド６種類を作出することができる。
【００１９】６種類のプラスミドは、それぞれｐＯＳ３
４１０Ｆ５７、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７、ｐＯＳ３４１０
Ｌ５７、ｐＯＳ３４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３４１０Ｈ１
３９およびｐＯＳ３４１０Ｌ１３９と命名されており、
それぞれの塩基配列および該塩基配列によりコードされ
る酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、４、
５、６、７および８に記載の通りである。
４１０Ｆ５７、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７、ｐＯＳ３４１０
Ｌ５７、ｐＯＳ３４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３４１０Ｈ１
３９およびｐＯＳ３４１０Ｌ１３９と命名されており、
それぞれの塩基配列および該塩基配列によりコードされ
る酵素のアミノ酸配列は、配列表の配列番号３、４、
５、６、７および８に記載の通りである。
【００２０】これら６種類のプラスミドのうち、ｐＯＳ
３４１０Ｆ５７、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７およびｐＯＳ３
４１０Ｌ５７は、野性型のマルトペンタオース生産性α
−アミラーゼのアミノ酸配列の５７番目のトリプトファ
ンが、それぞれフェニルアラニン、ヒスチジンおよびロ
イシンに変換されたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼのアミノ酸配列を生産することができる。
３４１０Ｆ５７、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７およびｐＯＳ３
４１０Ｌ５７は、野性型のマルトペンタオース生産性α
−アミラーゼのアミノ酸配列の５７番目のトリプトファ
ンが、それぞれフェニルアラニン、ヒスチジンおよびロ
イシンに変換されたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼのアミノ酸配列を生産することができる。
【００２１】また、ｐＯＳ３４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３
４１０Ｈ１３９およびｐＯＳ３４１０Ｌ１３９は、野性
型のマルトペンタオース生産性α−アミラーゼのアミノ
酸配列の１３９番目のトリプトファンが、それぞれフェ
ニルアラニン、ヒスチジンおよびロイシンに変換された
マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼのアミノ酸
配列を生産することができる。
４１０Ｈ１３９およびｐＯＳ３４１０Ｌ１３９は、野性
型のマルトペンタオース生産性α−アミラーゼのアミノ
酸配列の１３９番目のトリプトファンが、それぞれフェ
ニルアラニン、ヒスチジンおよびロイシンに変換された
マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼのアミノ酸
配列を生産することができる。
【００２２】これらのプラスミドＤＮＡを大腸菌に形質
転換するには、例えば Cohenらの塩化カルシウム法 (Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 69 巻, 2110-2114, 1972)
に従って行うことができる。すなわち、大腸菌を５０ｍ
ｌのＬＢ培地で培養し、対数増殖初期に遠心で集菌す
る。菌体を培養液の２５ｍｌの氷冷０．１Ｍ塩化マグネ
シウムに懸濁し、遠心で集菌する。集めた菌体を、培養
液の１２．５ｍｌの氷冷０．１Ｍ塩化カルシウムに懸濁
し、氷中に３０分間保持する。遠心による集菌後、２ｍ
ｌの同溶液に懸濁する。菌液２００μｌに１０ｎｇのプ
ラスミドＤＮＡを含むＴＥ緩衝液１０μｌを加え、氷中
に４５分間保持する。４２℃で１分間加熱した後、１ｍ
ｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間穏やかに振とうす
る。培養液の一部を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一夜培養して形質転
換体を選抜する。なお、プラスミドＤＮＡの大腸菌への
形質転換は、エレクトロポレーション法（三浦 謹一郎
ら 編、新基礎生化学実験法７、遺伝子工学，1988, 丸
善株式会社) によって行うことも可能である。
転換するには、例えば Cohenらの塩化カルシウム法 (Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA., 69 巻, 2110-2114, 1972)
に従って行うことができる。すなわち、大腸菌を５０ｍ
ｌのＬＢ培地で培養し、対数増殖初期に遠心で集菌す
る。菌体を培養液の２５ｍｌの氷冷０．１Ｍ塩化マグネ
シウムに懸濁し、遠心で集菌する。集めた菌体を、培養
液の１２．５ｍｌの氷冷０．１Ｍ塩化カルシウムに懸濁
し、氷中に３０分間保持する。遠心による集菌後、２ｍ
ｌの同溶液に懸濁する。菌液２００μｌに１０ｎｇのプ
ラスミドＤＮＡを含むＴＥ緩衝液１０μｌを加え、氷中
に４５分間保持する。４２℃で１分間加熱した後、１ｍ
ｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間穏やかに振とうす
る。培養液の一部を１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含
むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で一夜培養して形質転
換体を選抜する。なお、プラスミドＤＮＡの大腸菌への
形質転換は、エレクトロポレーション法（三浦 謹一郎
ら 編、新基礎生化学実験法７、遺伝子工学，1988, 丸
善株式会社) によって行うことも可能である。
【００２３】こうして形質転換された大腸菌は、工業技
術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、それら
の受託番号は、導入されたプラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ
５７、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７、ｐＯＳ３４１０Ｌ５７、
ｐＯＳ３４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９およ
びｐＯＳ３４１０Ｌ１３９の順に、それぞれＦＥＲＭＢ
Ｐ−６１１６、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１９、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１５、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１８およびＦＥＲＭ ＢＰ−６１１４であ
る。
術院生命工学工業技術研究所に寄託されており、それら
の受託番号は、導入されたプラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ
５７、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７、ｐＯＳ３４１０Ｌ５７、
ｐＯＳ３４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９およ
びｐＯＳ３４１０Ｌ１３９の順に、それぞれＦＥＲＭＢ
Ｐ−６１１６、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１９、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１５、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１７、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１８およびＦＥＲＭ ＢＰ−６１１４であ
る。
【００２４】これらの形質転換体から生産されるマルト
ペンタオース高生産性α−アミラーゼは、デンプンのグ
ルコース間のα−１，４結合は分解するが、生成するマ
ルトペンタオースのα−１，４結合分解活性が低いた
め、マルトペンタオースを効率よく生産することができ
る。
ペンタオース高生産性α−アミラーゼは、デンプンのグ
ルコース間のα−１，４結合は分解するが、生成するマ
ルトペンタオースのα−１，４結合分解活性が低いた
め、マルトペンタオースを効率よく生産することができ
る。
【００２５】
【実施例】次に、本発明を実施例により詳しく説明する
が、本発明はこれらにより制限されるものではない。 実施例１ シュードモナス エスピー ＫＯ−８９４０株のマルト
ペンタオース生成α−アミラーゼのアミノ酸配列 (Shid
a, O., Kadowaki, K. and Kobayashi, S., Biosci. Bio
tech. Biochem., 56巻, 76-80, 1992)をタカアミラーゼ
(Tsukagoshi,N., Furukawa, M., Nagaba, H., Kirita,
N., Tsuboi, A. and Udaka, S., Gene84 巻, 1989) お
よびマルトテトラオース生成α−アミラーゼ (Fujita,
M., Torigoe, K., Nakada, U., Tsuzuki, K., Kubota,
M. and Tsujikawa, Y. J. Bacteriol., 171 巻, 1333-1
339, 1989)のアミノ酸配列との比較から、該酵素の５７
番目のトリプトファン残基と１３９番目のチロシン残基
が基質であるデンプン分子のグルコースとの結合に関与
するアミノ酸残基であると推定した。
が、本発明はこれらにより制限されるものではない。 実施例１ シュードモナス エスピー ＫＯ−８９４０株のマルト
ペンタオース生成α−アミラーゼのアミノ酸配列 (Shid
a, O., Kadowaki, K. and Kobayashi, S., Biosci. Bio
tech. Biochem., 56巻, 76-80, 1992)をタカアミラーゼ
(Tsukagoshi,N., Furukawa, M., Nagaba, H., Kirita,
N., Tsuboi, A. and Udaka, S., Gene84 巻, 1989) お
よびマルトテトラオース生成α−アミラーゼ (Fujita,
M., Torigoe, K., Nakada, U., Tsuzuki, K., Kubota,
M. and Tsujikawa, Y. J. Bacteriol., 171 巻, 1333-1
339, 1989)のアミノ酸配列との比較から、該酵素の５７
番目のトリプトファン残基と１３９番目のチロシン残基
が基質であるデンプン分子のグルコースとの結合に関与
するアミノ酸残基であると推定した。
【００２６】両アミノ酸残基を、他のアミノ酸残基に変
換するためのオリゴヌクレオチドＡ（配列表の配列番号
１）およびＢ（配列表の配列番号２）をホスホアミダイ
ド試薬を用いてＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社製）で合成した。一方、塩基置換を導入するＤ
ＮＡ領域を含む５３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片
をｐＯＳ３４１０より調製し、ファージベクターＭ１３
ｔｖ１８のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することに
よってＭ１３ｔｖ１８−Ａ１を作成した。
換するためのオリゴヌクレオチドＡ（配列表の配列番号
１）およびＢ（配列表の配列番号２）をホスホアミダイ
ド試薬を用いてＤＮＡ合成装置（アプライドバイオシス
テムズ社製）で合成した。一方、塩基置換を導入するＤ
ＮＡ領域を含む５３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片
をｐＯＳ３４１０より調製し、ファージベクターＭ１３
ｔｖ１８のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入することに
よってＭ１３ｔｖ１８−Ａ１を作成した。
【００２７】部位特異的変異の導入は、アマーシャム社
製のSculptor in vitro mutagenesis Kit を使用して行
い、方法はアマーシャム社の実験書に従った。すなわ
ち、Ｍ１３ｔｖ１８−Ａ１の一本鎖ＤＮＡの鋳型にオリ
ゴヌクレオチドＡおよびＢをアニーリングし、ｄＣＴＰ
αＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＡＴＰの存
在下でＴ７ポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼによって
伸長反応と連結反応とを行った。
製のSculptor in vitro mutagenesis Kit を使用して行
い、方法はアマーシャム社の実験書に従った。すなわ
ち、Ｍ１３ｔｖ１８−Ａ１の一本鎖ＤＮＡの鋳型にオリ
ゴヌクレオチドＡおよびＢをアニーリングし、ｄＣＴＰ
αＳ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびＡＴＰの存
在下でＴ７ポリメラーゼとＴ４ＤＮＡリガーゼによって
伸長反応と連結反応とを行った。
【００２８】Ｔ５エキソヌクレアーゼ処理により、一本
鎖部分を持つ未反応分子を切断した後、制限酵素Ｎｃｉ
Ｉで鋳型のＤＮＡ鎖を切断した。さらに、エキソヌクレ
アーゼIII で鋳型のＤＮＡ鎖を完全に分解し、合成され
た塩基置換をもつ一本鎖ＤＮＡを大腸菌に形質転換し
た。得られた形質転換体から、一本鎖ＤＮＡを調製し、
アプライドバイオシステムズ社のDye Primer cycle seq
uencing kit を用いて、シーケンス反応を行い、ＤＮＡ
配列をＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム
ズ社製、モデル３７３）で解析した。
鎖部分を持つ未反応分子を切断した後、制限酵素Ｎｃｉ
Ｉで鋳型のＤＮＡ鎖を切断した。さらに、エキソヌクレ
アーゼIII で鋳型のＤＮＡ鎖を完全に分解し、合成され
た塩基置換をもつ一本鎖ＤＮＡを大腸菌に形質転換し
た。得られた形質転換体から、一本鎖ＤＮＡを調製し、
アプライドバイオシステムズ社のDye Primer cycle seq
uencing kit を用いて、シーケンス反応を行い、ＤＮＡ
配列をＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム
ズ社製、モデル３７３）で解析した。
【００２９】その結果、変異の導入が確認された組換え
ＤＮＡより、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を回収し、ＤＮ
Ａライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用い
て、ｐＯＳ３４１０の該ＤＮＡ断片と入れ換えてアミノ
酸配列が変化したマルトペンタオース高生産性α−アミ
ラーゼを生産するプラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ５７、ｐ
ＯＳ３４１０Ｈ５７、ｐＯＳ３４１０Ｌ５７、ｐＯＳ３
４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９およびｐＯＳ
３４１０Ｌ１３９（配列表の配列番号３、４、５、６、
７および８参照）を作出した。
ＤＮＡより、ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ断片を回収し、ＤＮ
Ａライゲーションキット（宝酒造株式会社製）を用い
て、ｐＯＳ３４１０の該ＤＮＡ断片と入れ換えてアミノ
酸配列が変化したマルトペンタオース高生産性α−アミ
ラーゼを生産するプラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ５７、ｐ
ＯＳ３４１０Ｈ５７、ｐＯＳ３４１０Ｌ５７、ｐＯＳ３
４１０Ｆ１３９、ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９およびｐＯＳ
３４１０Ｌ１３９（配列表の配列番号３、４、５、６、
７および８参照）を作出した。
【００３０】さらに、これらのプラスミドＤＮＡを Coh
enらの塩化カルシウム法 (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 69 巻, 2110-2114, 1972)に従って、大腸菌に形質
転換した。形質転換した大腸菌は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されており、それらの受託番号は
順に、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６１１６、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１９、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１５、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１８およびＦ
ＥＲＭ ＢＰ−６１１４である。
enらの塩化カルシウム法 (Proc. Natl. Acad. Sci. US
A., 69 巻, 2110-2114, 1972)に従って、大腸菌に形質
転換した。形質転換した大腸菌は、工業技術院生命工学
工業技術研究所に寄託されており、それらの受託番号は
順に、それぞれＦＥＲＭ ＢＰ−６１１６、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１９、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１５、ＦＥＲＭ
ＢＰ−６１１７、ＦＥＲＭ ＢＰ−６１１８およびＦ
ＥＲＭ ＢＰ−６１１４である。
【００３１】一方、通常のシュードモナス・エスピー
（ｐＯＳ３４１０）から得られる野性型酵素と変異酵素
であるマルトペンタオース高生産性α−アミラーゼをSh
ida らの方法 (Biosci. Biotech. Biochem., 56 巻, 76
-80, 1992)に従って調製した。すなわち、野性型および
変異酵素の遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌を
ＬＢ培地（Sambrook, J. et al., Molecular cloning,
第２版，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
を用いて、３０℃で培養した。６６０ｎｍの吸光度が
０．５になった時点で、イソプロピル−β−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度が０．１ｍＭとなる
ように添加し、さらに４０時間培養を続けた。培養後、
遠心で集菌し、オスモティクショック法でペリプラズム
画分を調製して、酵素標品とした。なお、オスモティク
ショック法とは、０．５Ｍの蔗糖を含む高張液に細胞を
懸濁し、原形質分離を行った後、蔗糖を含まない低張液
に懸濁することにより、細胞を急激に膨潤させ、細胞壁
と細胞質膜との間（ペリプラズム）に存在する蛋白質を
特異的に細胞外に放出させる方法である。
（ｐＯＳ３４１０）から得られる野性型酵素と変異酵素
であるマルトペンタオース高生産性α−アミラーゼをSh
ida らの方法 (Biosci. Biotech. Biochem., 56 巻, 76
-80, 1992)に従って調製した。すなわち、野性型および
変異酵素の遺伝子を含むプラスミドを保有する大腸菌を
ＬＢ培地（Sambrook, J. et al., Molecular cloning,
第２版，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)
を用いて、３０℃で培養した。６６０ｎｍの吸光度が
０．５になった時点で、イソプロピル−β−チオガラク
トピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度が０．１ｍＭとなる
ように添加し、さらに４０時間培養を続けた。培養後、
遠心で集菌し、オスモティクショック法でペリプラズム
画分を調製して、酵素標品とした。なお、オスモティク
ショック法とは、０．５Ｍの蔗糖を含む高張液に細胞を
懸濁し、原形質分離を行った後、蔗糖を含まない低張液
に懸濁することにより、細胞を急激に膨潤させ、細胞壁
と細胞質膜との間（ペリプラズム）に存在する蛋白質を
特異的に細胞外に放出させる方法である。
【００３２】次に、これらの酵素について、可溶性デン
プンを基質として酵素活性を測定した。すなわち、0.２
５単位（Ｕ）の各酵素で可溶性デンプンを処理して経時
的に反応液を採取した。反応液を水で１０倍に希釈した
後、１０μｌをＭＣＩ−ＧＥＬＣＫ０４５カラム（１０
×２００ｎｍ；三菱化学株式会社製）を装着した高速液
体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）に
供した。溶出には蒸留水を用い、温度８５℃、加圧０．
３ｋｇ／cm2 、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎの条件で行っ
た。反応物は、ＵＶ検出器（島津製作所製、ＳＰＤ−６
Ａ）を用いて２１０ｎｍの吸光度を測定して検出した。
生成物は、マルトペンタオース、マルトトリオースおよ
びマルトースの標準品の保持時間をもとに同定した。そ
れぞれの酵素について、反応時間３０分後および１８０
分後の酵素活性の検出結果（２１０ｎｍにおける吸光
度）を図１〜図１４に示す。
プンを基質として酵素活性を測定した。すなわち、0.２
５単位（Ｕ）の各酵素で可溶性デンプンを処理して経時
的に反応液を採取した。反応液を水で１０倍に希釈した
後、１０μｌをＭＣＩ−ＧＥＬＣＫ０４５カラム（１０
×２００ｎｍ；三菱化学株式会社製）を装着した高速液
体クロマトグラフィー（島津製作所製、ＬＣ−６Ａ）に
供した。溶出には蒸留水を用い、温度８５℃、加圧０．
３ｋｇ／cm2 、流速０．４ｍｌ／ｍｉｎの条件で行っ
た。反応物は、ＵＶ検出器（島津製作所製、ＳＰＤ−６
Ａ）を用いて２１０ｎｍの吸光度を測定して検出した。
生成物は、マルトペンタオース、マルトトリオースおよ
びマルトースの標準品の保持時間をもとに同定した。そ
れぞれの酵素について、反応時間３０分後および１８０
分後の酵素活性の検出結果（２１０ｎｍにおける吸光
度）を図１〜図１４に示す。
【００３３】図１〜図１４を比較することにより、以下
のことが明らかである。まず、野性型の酵素の場合は、
３０分後（図１）と比較して、１８０分後（図２）には
生成物であるマルトペンタオースを約５０％も分解す
る。これに対し、プラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ５７（図
３、図４、若い番号が３０分後の結果を示す。以下、同
じ）、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７（図５、図６）およびｐＯ
Ｓ３４１０Ｌ５７（図７、図８）から得られる酵素は、
１８０分経過後でも、マルトペンタオースの分解率は１
０％以内であった。また、野性型酵素がマルトペンタオ
ースをほぼ１００％分解する３６０分後でも、変異酵素
では５０％のマルトペンタオースが分解されなかった。
同様の結果は、プラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ１３９（図
９，図１０）、ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９（図１１，図１
２）およびｐＯＳ３４１０Ｌ１３９（図１３，図１４）
から得られる変異酵素でも得られた。このことから、本
発明のプラスミドから得られる変異酵素、すなわちマル
トペンタオース高生産性α−アミラーゼは、マルトペン
タオース分解活性が、野性型酵素の２０％以下に低下し
ており、酵素の反応時間を長くしても、マルトペンタオ
ースは減少しないことが明らかとなった。
のことが明らかである。まず、野性型の酵素の場合は、
３０分後（図１）と比較して、１８０分後（図２）には
生成物であるマルトペンタオースを約５０％も分解す
る。これに対し、プラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ５７（図
３、図４、若い番号が３０分後の結果を示す。以下、同
じ）、ｐＯＳ３４１０Ｈ５７（図５、図６）およびｐＯ
Ｓ３４１０Ｌ５７（図７、図８）から得られる酵素は、
１８０分経過後でも、マルトペンタオースの分解率は１
０％以内であった。また、野性型酵素がマルトペンタオ
ースをほぼ１００％分解する３６０分後でも、変異酵素
では５０％のマルトペンタオースが分解されなかった。
同様の結果は、プラスミドｐＯＳ３４１０Ｆ１３９（図
９，図１０）、ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９（図１１，図１
２）およびｐＯＳ３４１０Ｌ１３９（図１３，図１４）
から得られる変異酵素でも得られた。このことから、本
発明のプラスミドから得られる変異酵素、すなわちマル
トペンタオース高生産性α−アミラーゼは、マルトペン
タオース分解活性が、野性型酵素の２０％以下に低下し
ており、酵素の反応時間を長くしても、マルトペンタオ
ースは減少しないことが明らかとなった。
【００３４】
【発明の効果】本発明のマルトペンタオース高生産性α
−アミラーゼ遺伝子から得られる酵素を用いると、デン
プン等に作用させて生成したマルトペンタオースの分解
が低減するため、マルトペンタオースを高収量で得るこ
とができる。
−アミラーゼ遺伝子から得られる酵素を用いると、デン
プン等に作用させて生成したマルトペンタオースの分解
が低減するため、マルトペンタオースを高収量で得るこ
とができる。
【００３５】
【００３６】配列番号：１ 配列の長さ：２３ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成混合オリゴヌクレオチド 起源 直接の起源：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１..２３ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGTAGCGCAT SHRCCACGGG ACG ２３
【００３７】配列番号：２ 配列の長さ：２５ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成混合オリゴヌクレオチド 起源 直接の起源：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 配列の特徴 特徴を示す記号：mutation 存在位置：１..２５ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GTTCGCGTCA CCGWRGTTGG TGATG ２５
【００３８】配列番号：３ 配列の長さ：１９８１ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異導入染色体ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳ３４１０Ｆ５７ 配列の特徴：mat peptide 存在の位置：６..１８４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTC ATG TCG CGC AGG CTG GCG CTG GCC CTG GCC GCC AGT GCC GTC 48 Met Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val -25 -20 -15 CTG GCC GGG CCC TGG GCG GTC GGC GCG GTG CAG GCG CAG TCC GCG CCG 96 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Val Gly Ala Val Gln Ala Gln Ser Ala Pro -10 -5 1 CGC ACG GCC TTC GTG CAG CTT TTC GAG TGG AAG TGG ACC GAC GTC GCC 144 Arg Thr Ala Phe Val Gln Leu Phe Glu Trp Lys Trp Thr Asp Val Ala 5 10 15 20 CGG GAG TGC GAG ACC TAC CTC GGC CCC AAG GGT TTC GCG GCC GTG CAG 192 Arg Glu Cys Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Phe Ala Ala Val Gln 25 30 35 ATC TCG CCG CCC AAC GAG CAC AAC TGG GTC AGC AGC GGC GAC GGC GCG 240 Ile Ser Pro Pro Asn Glu His Asn Trp Val Ser Ser Gly Asp Gly Ala 40 45 50 CCC TAC CCG TGG TTC ATG CGC TAC CAG CCG GTC AGC TAC AGC CTG GAC 288 Pro Tyr Pro Trp Phe Met Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Ser Leu Asp 55 60 65 CGC AGC CGC AGC GGC ACT CGC GCC GAG TTC CAG GAC ATG GTC AAC CGC 336 Arg Ser Arg Ser Gly Thr Arg Ala Glu Phe Gln Asp Met Val Asn Arg 70 75 80 TGC AAC GCA GCA GGC GTG GGC ATC TAC GTC GAC GCG GTG ATC AAC CAC 384 Cys Asn Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile Asn His 85 90 95 100 ATG TCG GGT GGC AAC GGC GGC ACC TCG AGC GCA GGG CGC AGC TGG AGC 432 Met Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Ser Ser Ala Gly Arg Ser Trp Ser 105 110 115 CAC CAC AAC TAT CCG GGC CTG TAC GGC TCG CAG GAC TTC CAT CAC CCG 480 His His Asn Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Phe His His Pro 120 125 130 GTG TGC GCC ATC ACC AAC TAC GGT GAC GCG AAC AAC GTG CAG AAC TGC 528 Val Cys Ala Ile Thr Asn Tyr Gly Asp Ala Asn Asn Val Gln Asn Cys 135 140 145 GAG CTC TCG GGC CTG CAG GAC CTG AAC ACC GGC AGC AGC TAC GTG CGC 576 Glu Leu Ser Gly Leu Gln Asp Leu Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Arg 150 155 160 GGC AAG ATC TCC GAC TAC CTG GTC GAC CTG GTC CAG ATG GGC GTC AAG 624 Gly Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Val Asp Leu Val Gln Met Gly Val Lys 165 170 175 180 GGC TTG CGC GTC GAT GCG GCC AAG CAC ATC AGC CCG ACG GAC CTG GGT 672 Gly Leu Arg Val Asp Ala Ala Lys His Ile Ser Pro Thr Asp Leu Gly 185 190 195 GCC ATC ATC GAC AGC GTC AAC GCG CGC ACC GGT GCC GCA CGG CCA TTC 720 Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Ala Arg Thr Gly Ala Ala Arg Pro Phe 200 205 210 TGG TTC CTG GAG GTG ATC GGC GCG CCG GGC GAG GCG GTG CAG CCC AGC 768 Trp Phe Leu Glu Val Ile Gly Ala Pro Gly Glu Ala Val Gln Pro Ser 215 220 225 CAG TAC TTC GGG CTC GGC GGC GGG CAG GTC ACG GTG ACC GAG TTC GCC 816 Gln Tyr Phe Gly Leu Gly Gly Gly Gln Val Thr Val Thr Glu Phe Ala 230 235 240 TAC GGC AAG GAG CTC TAC GGC AAG TTC GCC GGC GGC GGC AAG CTG GCC 864 Tyr Gly Lys Glu Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Gly Gly Gly Lys Leu Ala 245 250 255 260 GAC CTG CAG ACC TTC GGC CCC AGC TGG AAC CTG ATG CCC AGC AGC AAG 912 Asp Leu Gln Thr Phe Gly Pro Ser Trp Asn Leu Met Pro Ser Ser Lys 265 270 275 GCC ATC GCT TTC GTC GAC AAC CAC GAC AAG CAG CGC GGC CAC GGC GGC 960 Ala Ile Ala Phe Val Asp Asn His Asp Lys Gln Arg Gly His Gly Gly 280 285 290 GGG GGC GGC TAC GTC ACC TAT CAC CAC GGC AGC ACC TAC GAC CTG GCG 1008 Gly Gly Gly Tyr Val Thr Tyr His His Gly Ser Thr Tyr Asp Leu Ala 295 300 305 AAC ATC TTC ATG CTG GCC TGG CCC TAT GGC TAC CCG GCG CTG ATG TCA 1056 Asn Ile Phe Met Leu Ala Trp Pro Tyr Gly Tyr Pro Ala Leu Met Ser 310 315 320 GCT ACG GCT TCA ACC AGG GCA GCA GCT ACG ACA CCA GCT ACG GCC CGC 1104 Ala Thr Ala Ser Thr Arg Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ala Thr Ala Arg 325 330 335 340 CGC ACT ACA GCG ACG GCT CGA CCC GGG GGC CGT GGG ACC GGA ACC CCG 1152 Arg Thr Thr Ala Thr Ala Arg Pro Gly Gly Arg Gly Thr Gly Thr Pro 345 350 355 CCA GCC CGG GTG CTT CAA CCA GAC CGT GGG TGG CTG GGT CTG CGA GCA 1200 Pro Ala Arg Val Leu Gln Pro Asp Arg Gly Trp Leu Gly Leu Arg Ala 360 365 370 CCG CTG GCG CGG CAT CGG CAA CAT GGT GGC CTT CCG CAA CGC CAC CGT 1248 Pro Leu Ala Arg His Arg Gln His Gly Gly Leu Pro Gln Arg His Arg 375 380 385 GGA CAA CTG GTT CGT CAG CGA CTG GTG GAG CAA CGG CAA CAA CCA GAT 1296 Gly Gln Leu Val Arg Gln Arg Leu Val Glu Gln Arg Gln Gln Pro Asp 390 395 400 CGC CTT CGG CCG CGG CGA CAA GGG CTT CGT CGT CAT CAA CAA GGA AGG 1344 Arg Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gly Leu Arg Arg His Gln Gln Gly Arg 405 410 415 420 TAC GGC GCT GAC GCA GCT TCC AGA CCA GCC TGC CGG CCG GGC GTA TTG 1392 Tyr Gly Ala Asp Ala Ala Ser Arg Pro Ala Cys Arg Pro Gly Val Leu 425 430 435 CGA CGT GAT CTC CGG CGA CTT CGC CAA CGG CAG CTG CAC CGG CAC GGT 1440 Arg Arg Asp Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Gln Leu His Arg His Gly 440 445 450 GGT GAC CGT GGA TGC AGG CGG CCA CGC GAT GCT GTC CGC ACC CGC TTA 1488 Gly Asp Arg Gly Cys Arg Arg Pro Arg Asp Ala Val Arg Thr Arg Leu 455 460 465 TGG CGC GGC GGC GAT CCA CGT CGG TGC GCG CAT CGG CGA CAC GCA GCA 1536 Trp Arg Gly Gly Asp Pro Arg Arg Cys Ala His Arg Arg His Ala Ala 470 475 480 GGT GCA GCA GTG CTC AGC TTG ACC TTC AAC GAG ACG GCC GAC ACC GTG 1584 Gly Ala Ala Val Leu Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Thr Val 485 490 495 500 TGG GGC CAG AAC CTC TTC GTC GTC GGC AAC GTC GGC GCG CTC GGC AAC 1632 Trp Gly Gln Asn Leu Phe Val Val Gly Asn Val Gly Ala Leu Gly Asn 505 510 515 TGG GCG CCC GCG GCC GGG GCG GCG ATG ACC TGG ATC TCC GGC AGC GGC 1680 Trp Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Met Thr Trp Ile Ser Gly Ser Gly 520 525 530 AGC ACC GGC CAG TGG CGT GCG ACG GTG CAG CTG CCC GCC GAC ACG CCG 1728 Ser Thr Gly Gln Trp Arg Ala Thr Val Gln Leu Pro Ala Asp Thr Pro 535 540 545 GTG CAG TAC AAG TAC GTG AAG AAG GAC GGC GCC GGC AAC GTG GTG TGG 1776 Val Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Lys Asp Gly Ala Gly Asn Val Val Trp 550 555 560 GAA AGC GGC GGC AAC CGC GTG GTG ACG ACG CCC GCG CCC GGG GCG ACG 1824 Glu Ser Gly Gly Asn Arg Val Val Thr Thr Pro Ala Pro Gly Ala Thr 565 570 575 580 ATC GCC GTC AAC GAC AGC TGG AAG TGACGGCCGG GGGCGCCAGG ACGACAAGGC 1878 Ile Ala Val Asn Asp Ser Trp Lys 585 CCTGAGCGCC TCGTACACCG TGCCCAGCGT GGTGGTAGTC CAACTGGCCC GACTGGCTCT 1938 TCTGGTTGCT GAGCTTGCGG TTGTCGCGCG TCACTGTGGT ACC 1981
【００３９】配列番号：４ 配列の長さ：１９８１ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異導入染色体ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳ３４１０Ｈ５７ 配列の特徴：mat peptide 存在の位置：６..１８４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTC ATG TCG CGC AGG CTG GCG CTG GCC CTG GCC GCC AGT GCC GTC 48 Met Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val -25 -20 -15 CTG GCC GGG CCC TGG GCG GTC GGC GCG GTG CAG GCG CAG TCC GCG CCG 96 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Val Gly Ala Val Gln Ala Gln Ser Ala Pro -10 -5 1 CGC ACG GCC TTC GTG CAG CTT TTC GAG TGG AAG TGG ACC GAC GTC GCC 144 Arg Thr Ala Phe Val Gln Leu Phe Glu Trp Lys Trp Thr Asp Val Ala 5 10 15 20 CGG GAG TGC GAG ACC TAC CTC GGC CCC AAG GGT TTC GCG GCC GTG CAG 192 Arg Glu Cys Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Phe Ala Ala Val Gln 25 30 35 ATC TCG CCG CCC AAC GAG CAC AAC TGG GTC AGC AGC GGC GAC GGC GCG 240 Ile Ser Pro Pro Asn Glu His Asn Trp Val Ser Ser Gly Asp Gly Ala 40 45 50 CCC TAC CCG TGG CAC ATG CGC TAC CAG CCG GTC AGC TAC AGC CTG GAC 288 Pro Tyr Pro Trp His Met Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Ser Leu Asp 55 60 65 CGC AGC CGC AGC GGC ACT CGC GCC GAG TTC CAG GAC ATG GTC AAC CGC 336 Arg Ser Arg Ser Gly Thr Arg Ala Glu Phe Gln Asp Met Val Asn Arg 70 75 80 TGC AAC GCA GCA GGC GTG GGC ATC TAC GTC GAC GCG GTG ATC AAC CAC 384 Cys Asn Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile Asn His 85 90 95 100 ATG TCG GGT GGC AAC GGC GGC ACC TCG AGC GCA GGG CGC AGC TGG AGC 432 Met Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Ser Ser Ala Gly Arg Ser Trp Ser 105 110 115 CAC CAC AAC TAT CCG GGC CTG TAC GGC TCG CAG GAC TTC CAT CAC CCG 480 His His Asn Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Phe His His Pro 120 125 130 GTG TGC GCC ATC ACC AAC TAC GGT GAC GCG AAC AAC GTG CAG AAC TGC 528 Val Cys Ala Ile Thr Asn Tyr Gly Asp Ala Asn Asn Val Gln Asn Cys 135 140 145 GAG CTC TCG GGC CTG CAG GAC CTG AAC ACC GGC AGC AGC TAC GTG CGC 576 Glu Leu Ser Gly Leu Gln Asp Leu Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Arg 150 155 160 GGC AAG ATC TCC GAC TAC CTG GTC GAC CTG GTC CAG ATG GGC GTC AAG 624 Gly Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Val Asp Leu Val Gln Met Gly Val Lys 165 170 175 180 GGC TTG CGC GTC GAT GCG GCC AAG CAC ATC AGC CCG ACG GAC CTG GGT 672 Gly Leu Arg Val Asp Ala Ala Lys His Ile Ser Pro Thr Asp Leu Gly 185 190 195 GCC ATC ATC GAC AGC GTC AAC GCG CGC ACC GGT GCC GCA CGG CCA TTC 720 Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Ala Arg Thr Gly Ala Ala Arg Pro Phe 200 205 210 TGG TTC CTG GAG GTG ATC GGC GCG CCG GGC GAG GCG GTG CAG CCC AGC 768 Trp Phe Leu Glu Val Ile Gly Ala Pro Gly Glu Ala Val Gln Pro Ser 215 220 225 CAG TAC TTC GGG CTC GGC GGC GGG CAG GTC ACG GTG ACC GAG TTC GCC 816 Gln Tyr Phe Gly Leu Gly Gly Gly Gln Val Thr Val Thr Glu Phe Ala 230 235 240 TAC GGC AAG GAG CTC TAC GGC AAG TTC GCC GGC GGC GGC AAG CTG GCC 864 Tyr Gly Lys Glu Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Gly Gly Gly Lys Leu Ala 245 250 255 260 GAC CTG CAG ACC TTC GGC CCC AGC TGG AAC CTG ATG CCC AGC AGC AAG 912 Asp Leu Gln Thr Phe Gly Pro Ser Trp Asn Leu Met Pro Ser Ser Lys 265 270 275 GCC ATC GCT TTC GTC GAC AAC CAC GAC AAG CAG CGC GGC CAC GGC GGC 960 Ala Ile Ala Phe Val Asp Asn His Asp Lys Gln Arg Gly 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【００４０】配列番号：５ 配列の長さ：１９８１ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異導入染色体ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳ３４１０Ｌ５７ 配列の特徴：mat peptide 存在の位置：６..１８４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTC ATG TCG CGC AGG CTG GCG CTG GCC CTG GCC GCC AGT GCC GTC 48 Met Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val -25 -20 -15 CTG GCC GGG CCC TGG GCG GTC GGC GCG GTG CAG GCG CAG TCC GCG CCG 96 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Val Gly Ala Val Gln Ala Gln Ser Ala Pro -10 -5 1 CGC ACG GCC TTC GTG CAG CTT TTC GAG TGG AAG TGG ACC GAC GTC GCC 144 Arg Thr Ala Phe Val Gln Leu Phe Glu Trp Lys Trp Thr Asp Val Ala 5 10 15 20 CGG GAG TGC GAG ACC TAC CTC GGC CCC AAG GGT TTC GCG GCC GTG CAG 192 Arg Glu Cys Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Phe Ala Ala Val Gln 25 30 35 ATC TCG CCG CCC AAC GAG CAC AAC TGG GTC AGC AGC GGC GAC GGC GCG 240 Ile Ser Pro Pro Asn Glu His Asn Trp Val Ser Ser Gly Asp Gly Ala 40 45 50 CCC TAC CCG TGG CTC ATG CGC TAC CAG CCG GTC AGC TAC AGC CTG GAC 288 Pro Tyr Pro Trp Leu Met Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Ser Leu Asp 55 60 65 CGC AGC CGC AGC GGC ACT CGC GCC GAG TTC CAG GAC ATG GTC AAC CGC 336 Arg Ser Arg Ser Gly Thr Arg Ala Glu Phe Gln Asp Met Val Asn Arg 70 75 80 TGC AAC GCA GCA GGC GTG GGC ATC TAC GTC GAC GCG GTG ATC AAC CAC 384 Cys Asn Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile Asn His 85 90 95 100 ATG TCG GGT GGC AAC GGC GGC ACC TCG AGC GCA GGG CGC AGC TGG AGC 432 Met Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Ser Ser Ala Gly Arg Ser Trp Ser 105 110 115 CAC CAC AAC TAT CCG GGC CTG TAC GGC TCG CAG GAC TTC CAT CAC CCG 480 His His Asn Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Phe His His Pro 120 125 130 GTG TGC GCC ATC ACC AAC TAC GGT GAC GCG AAC AAC GTG CAG AAC TGC 528 Val Cys Ala Ile Thr Asn Tyr Gly Asp Ala Asn Asn Val Gln Asn Cys 135 140 145 GAG CTC TCG GGC CTG CAG GAC CTG AAC ACC GGC AGC AGC TAC GTG CGC 576 Glu Leu Ser Gly Leu Gln Asp Leu Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Arg 150 155 160 GGC AAG ATC TCC GAC TAC CTG GTC GAC CTG GTC CAG ATG GGC GTC AAG 624 Gly Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Val Asp Leu Val Gln Met Gly Val Lys 165 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Gln Asn Leu Phe Val Val Gly Asn Val Gly Ala Leu Gly Asn 505 510 515 TGG GCG CCC GCG GCC GGG GCG GCG ATG ACC TGG ATC TCC GGC AGC GGC 1680 Trp Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Met Thr Trp Ile Ser Gly Ser Gly 520 525 530 AGC ACC GGC CAG TGG CGT GCG ACG GTG CAG CTG CCC GCC GAC ACG CCG 1728 Ser Thr Gly Gln Trp Arg Ala Thr Val Gln Leu Pro Ala Asp Thr Pro 535 540 545 GTG CAG TAC AAG TAC GTG AAG AAG GAC GGC GCC GGC AAC GTG GTG TGG 1776 Val Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Lys Asp Gly Ala Gly Asn Val Val Trp 550 555 560 GAA AGC GGC GGC AAC CGC GTG GTG ACG ACG CCC GCG CCC GGG GCG ACG 1824 Glu Ser Gly Gly Asn Arg Val Val Thr Thr Pro Ala Pro Gly Ala Thr 565 570 575 580 ATC GCC GTC AAC GAC AGC TGG AAG TGACGGCCGG GGGCGCCAGG ACGACAAGGC 1878 Ile Ala Val Asn Asp Ser Trp Lys 585 CCTGAGCGCC TCGTACACCG TGCCCAGCGT GGTGGTAGTC CAACTGGCCC GACTGGCTCT 1938 TCTGGTTGCT GAGCTTGCGG TTGTCGCGCG TCACTGTGGT ACC 1981
【００４１】配列番号：６ 配列の長さ：１９８１ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異導入染色体ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳ３４１０Ｆ１３９ 配列の特徴：mat peptide 存在の位置：６..１８４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTC ATG TCG CGC AGG CTG GCG CTG GCC CTG GCC GCC AGT GCC GTC 48 Met Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val -25 -20 -15 CTG GCC GGG CCC TGG GCG GTC GGC GCG GTG CAG GCG CAG TCC GCG CCG 96 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Val Gly Ala Val Gln Ala Gln Ser Ala Pro -10 -5 1 CGC ACG GCC TTC GTG CAG CTT TTC GAG TGG AAG TGG ACC GAC GTC GCC 144 Arg Thr Ala Phe Val Gln Leu Phe Glu Trp Lys Trp Thr Asp Val Ala 5 10 15 20 CGG GAG TGC GAG ACC TAC CTC GGC CCC AAG GGT TTC GCG GCC GTG CAG 192 Arg Glu Cys Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Phe Ala Ala Val Gln 25 30 35 ATC TCG CCG CCC AAC GAG CAC AAC TGG GTC AGC AGC GGC GAC GGC GCG 240 Ile Ser Pro Pro Asn Glu His Asn Trp Val Ser Ser Gly Asp Gly Ala 40 45 50 CCC TAC CCG TGG TGG ATG CGC TAC CAG CCG GTC AGC TAC AGC CTG GAC 288 Pro Tyr Pro Trp Trp Met Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Ser Leu Asp 55 60 65 CGC AGC CGC AGC GGC ACT CGC GCC GAG TTC CAG GAC ATG GTC AAC CGC 336 Arg Ser Arg Ser Gly Thr Arg Ala Glu Phe Gln Asp Met Val Asn Arg 70 75 80 TGC AAC GCA GCA GGC GTG GGC ATC TAC GTC GAC GCG GTG ATC AAC CAC 384 Cys Asn Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile Asn His 85 90 95 100 ATG TCG GGT GGC AAC GGC GGC ACC TCG AGC GCA GGG CGC AGC TGG AGC 432 Met Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Ser Ser Ala Gly Arg Ser Trp Ser 105 110 115 CAC CAC AAC TAT CCG GGC CTG TAC GGC TCG CAG GAC TTC CAT CAC CCG 480 His His Asn Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Phe His His Pro 120 125 130 GTG TGC GCC ATC ACC AAC TTC GGT GAC GCG AAC AAC GTG CAG AAC TGC 528 Val Cys Ala Ile Thr Asn Phe Gly Asp Ala Asn Asn Val Gln Asn Cys 135 140 145 GAG CTC TCG GGC CTG CAG GAC CTG AAC ACC GGC AGC AGC TAC GTG CGC 576 Glu Leu Ser Gly Leu Gln Asp Leu Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Arg 150 155 160 GGC AAG ATC TCC GAC TAC CTG GTC GAC CTG GTC CAG ATG GGC GTC AAG 624 Gly Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Val Asp Leu Val Gln Met Gly Val Lys 165 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His Gly Gly 280 285 290 GGG GGC GGC TAC GTC ACC TAT CAC CAC GGC AGC ACC TAC GAC CTG GCG 1008 Gly Gly Gly Tyr Val Thr Tyr His His Gly Ser Thr Tyr Asp Leu Ala 295 300 305 AAC ATC TTC ATG CTG GCC TGG CCC TAT GGC TAC CCG GCG CTG ATG TCA 1056 Asn Ile Phe Met Leu Ala Trp Pro Tyr Gly Tyr Pro Ala Leu Met Ser 310 315 320 GCT ACG GCT TCA ACC AGG GCA GCA GCT ACG ACA CCA GCT ACG GCC CGC 1104 Ala Thr Ala Ser Thr Arg Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ala Thr Ala Arg 325 330 335 340 CGC ACT ACA GCG ACG GCT CGA CCC GGG GGC CGT GGG ACC GGA ACC CCG 1152 Arg Thr Thr Ala Thr Ala Arg Pro Gly Gly Arg Gly Thr Gly Thr Pro 345 350 355 CCA GCC CGG GTG CTT CAA CCA GAC CGT GGG TGG CTG GGT CTG CGA GCA 1200 Pro Ala Arg Val Leu Gln Pro Asp Arg Gly Trp Leu Gly Leu Arg Ala 360 365 370 CCG CTG GCG CGG CAT CGG CAA CAT GGT GGC CTT CCG CAA CGC CAC CGT 1248 Pro Leu Ala Arg His Arg Gln His Gly Gly Leu Pro Gln Arg His Arg 375 380 385 GGA CAA CTG GTT CGT CAG CGA CTG GTG GAG CAA CGG CAA CAA CCA GAT 1296 Gly Gln Leu Val Arg Gln Arg Leu 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Gln Asn Leu Phe Val Val Gly Asn Val Gly Ala Leu Gly Asn 505 510 515 TGG GCG CCC GCG GCC GGG GCG GCG ATG ACC TGG ATC TCC GGC AGC GGC 1680 Trp Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Met Thr Trp Ile Ser Gly Ser Gly 520 525 530 AGC ACC GGC CAG TGG CGT GCG ACG GTG CAG CTG CCC GCC GAC ACG CCG 1728 Ser Thr Gly Gln Trp Arg Ala Thr Val Gln Leu Pro Ala Asp Thr Pro 535 540 545 GTG CAG TAC AAG TAC GTG AAG AAG GAC GGC GCC GGC AAC GTG GTG TGG 1776 Val Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Lys Asp Gly Ala Gly Asn Val Val Trp 550 555 560 GAA AGC GGC GGC AAC CGC GTG GTG ACG ACG CCC GCG CCC GGG GCG ACG 1824 Glu Ser Gly Gly Asn Arg Val Val Thr Thr Pro Ala Pro Gly Ala Thr 565 570 575 580 ATC GCC GTC AAC GAC AGC TGG AAG TGACGGCCGG GGGCGCCAGG ACGACAAGGC 1878 Ile Ala Val Asn Asp Ser Trp Lys 585 CCTGAGCGCC TCGTACACCG TGCCCAGCGT GGTGGTAGTC CAACTGGCCC GACTGGCTCT 1938 TCTGGTTGCT GAGCTTGCGG TTGTCGCGCG TCACTGTGGT ACC 1981
【００４２】配列番号：７ 配列の長さ：１９８１ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異導入染色体ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳ３４１０Ｈ１３９ 配列の特徴：mat peptide 存在の位置：６..１８４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTC ATG TCG CGC AGG CTG GCG CTG GCC CTG GCC GCC AGT GCC GTC 48 Met Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val -25 -20 -15 CTG GCC GGG CCC TGG GCG GTC GGC GCG GTG CAG GCG CAG TCC GCG CCG 96 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Val Gly Ala Val Gln Ala Gln Ser Ala Pro -10 -5 1 CGC ACG GCC TTC GTG CAG CTT TTC GAG TGG AAG TGG ACC GAC GTC GCC 144 Arg Thr Ala Phe Val Gln Leu Phe Glu Trp Lys Trp Thr Asp Val Ala 5 10 15 20 CGG GAG TGC GAG ACC TAC CTC GGC CCC AAG GGT TTC GCG GCC GTG CAG 192 Arg Glu Cys Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Phe Ala Ala Val Gln 25 30 35 ATC TCG CCG CCC AAC GAG CAC AAC TGG GTC AGC AGC GGC GAC GGC GCG 240 Ile Ser Pro Pro Asn Glu His Asn Trp Val Ser Ser Gly Asp Gly Ala 40 45 50 CCC TAC CCG TGG TGG ATG CGC TAC CAG CCG GTC AGC TAC AGC CTG GAC 288 Pro Tyr Pro Trp Trp Met Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Ser Leu Asp 55 60 65 CGC AGC CGC AGC GGC ACT CGC GCC GAG TTC CAG GAC ATG GTC AAC CGC 336 Arg Ser Arg Ser Gly Thr Arg Ala Glu Phe Gln Asp Met Val Asn Arg 70 75 80 TGC AAC GCA GCA GGC GTG GGC ATC TAC GTC GAC GCG GTG ATC AAC CAC 384 Cys Asn Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile Asn His 85 90 95 100 ATG TCG GGT GGC AAC GGC GGC ACC TCG AGC GCA GGG CGC AGC TGG AGC 432 Met Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Ser Ser Ala Gly Arg Ser Trp Ser 105 110 115 CAC CAC AAC TAT CCG GGC CTG TAC GGC TCG CAG GAC TTC CAT CAC CCG 480 His His Asn Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Phe His His Pro 120 125 130 GTG TGC GCC ATC ACC AAC CAC GGT GAC GCG AAC AAC GTG CAG AAC TGC 528 Val Cys Ala Ile Thr Asn His Gly Asp Ala Asn Asn Val Gln Asn Cys 135 140 145 GAG CTC TCG GGC CTG CAG GAC CTG AAC ACC GGC AGC AGC TAC GTG CGC 576 Glu Leu Ser Gly Leu Gln Asp Leu Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Arg 150 155 160 GGC AAG ATC TCC GAC TAC CTG GTC GAC CTG GTC CAG ATG GGC GTC AAG 624 Gly Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Val Asp Leu Val Gln Met Gly Val Lys 165 170 175 180 GGC TTG CGC GTC GAT GCG GCC AAG CAC ATC AGC CCG ACG GAC CTG GGT 672 Gly Leu Arg Val Asp Ala Ala Lys His Ile Ser Pro Thr Asp Leu Gly 185 190 195 GCC ATC ATC GAC AGC GTC AAC GCG CGC ACC GGT GCC GCA CGG CCA TTC 720 Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Ala Arg Thr Gly Ala Ala Arg Pro Phe 200 205 210 TGG TTC CTG GAG GTG ATC GGC GCG CCG GGC GAG GCG GTG CAG CCC AGC 768 Trp Phe Leu Glu Val Ile Gly Ala Pro Gly Glu Ala Val Gln Pro Ser 215 220 225 CAG TAC TTC GGG CTC GGC GGC GGG CAG GTC ACG GTG ACC GAG TTC GCC 816 Gln Tyr Phe Gly Leu Gly Gly Gly Gln Val Thr Val Thr Glu Phe Ala 230 235 240 TAC GGC AAG GAG CTC TAC GGC AAG TTC GCC GGC GGC GGC AAG CTG GCC 864 Tyr Gly Lys Glu Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Gly Gly Gly Lys Leu Ala 245 250 255 260 GAC CTG CAG ACC TTC GGC CCC AGC TGG AAC CTG ATG CCC AGC AGC AAG 912 Asp Leu Gln Thr Phe Gly Pro Ser Trp Asn Leu Met Pro Ser Ser Lys 265 270 275 GCC ATC GCT TTC GTC GAC AAC CAC GAC AAG CAG CGC GGC CAC GGC GGC 960 Ala Ile Ala Phe Val Asp Asn His Asp Lys Gln Arg Gly His Gly Gly 280 285 290 GGG GGC GGC TAC GTC ACC TAT CAC CAC GGC AGC ACC TAC GAC CTG GCG 1008 Gly Gly Gly Tyr Val Thr Tyr His His Gly Ser Thr Tyr Asp Leu Ala 295 300 305 AAC ATC TTC ATG CTG GCC TGG CCC TAT GGC TAC CCG GCG CTG ATG TCA 1056 Asn Ile Phe Met Leu Ala Trp Pro Tyr Gly Tyr Pro Ala Leu Met Ser 310 315 320 GCT ACG GCT TCA ACC AGG GCA GCA GCT ACG ACA CCA GCT ACG GCC CGC 1104 Ala Thr Ala Ser Thr Arg Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ala Thr Ala Arg 325 330 335 340 CGC ACT ACA GCG ACG GCT CGA CCC GGG GGC CGT GGG ACC GGA ACC CCG 1152 Arg Thr Thr Ala Thr Ala Arg Pro Gly Gly Arg Gly Thr Gly Thr Pro 345 350 355 CCA GCC CGG GTG CTT CAA CCA GAC CGT GGG TGG CTG GGT CTG CGA GCA 1200 Pro Ala Arg Val Leu Gln Pro Asp Arg Gly Trp Leu Gly Leu Arg Ala 360 365 370 CCG CTG GCG CGG CAT CGG CAA CAT GGT GGC CTT CCG CAA CGC CAC CGT 1248 Pro Leu Ala Arg His Arg Gln His Gly Gly Leu Pro Gln Arg His Arg 375 380 385 GGA CAA CTG GTT CGT CAG CGA CTG GTG GAG CAA CGG CAA CAA CCA GAT 1296 Gly Gln Leu Val Arg Gln Arg Leu Val Glu Gln Arg Gln Gln Pro Asp 390 395 400 CGC CTT CGG CCG CGG CGA CAA GGG CTT CGT CGT CAT CAA CAA GGA AGG 1344 Arg Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gly Leu Arg Arg His Gln Gln Gly Arg 405 410 415 420 TAC GGC GCT GAC GCA GCT TCC AGA CCA GCC TGC CGG CCG GGC GTA TTG 1392 Tyr Gly Ala Asp Ala Ala Ser Arg Pro Ala Cys Arg Pro Gly Val Leu 425 430 435 CGA CGT GAT CTC CGG CGA CTT CGC CAA CGG CAG CTG CAC CGG CAC GGT 1440 Arg Arg Asp Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Gln Leu His Arg His Gly 440 445 450 GGT GAC CGT GGA TGC AGG CGG CCA CGC GAT GCT GTC CGC ACC CGC TTA 1488 Gly Asp Arg Gly Cys Arg Arg Pro Arg Asp Ala Val Arg Thr Arg Leu 455 460 465 TGG CGC GGC GGC GAT CCA CGT CGG TGC GCG CAT CGG CGA CAC GCA GCA 1536 Trp Arg Gly Gly Asp Pro Arg Arg Cys Ala His Arg Arg His Ala Ala 470 475 480 GGT GCA GCA GTG CTC AGC TTG ACC TTC AAC GAG ACG GCC GAC ACC GTG 1584 Gly Ala Ala Val Leu Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Thr Val 485 490 495 500 TGG GGC CAG AAC CTC TTC GTC GTC GGC AAC GTC GGC GCG CTC GGC AAC 1632 Trp Gly Gln Asn Leu Phe Val Val Gly Asn Val Gly Ala Leu Gly Asn 505 510 515 TGG GCG CCC GCG GCC GGG GCG GCG ATG ACC TGG ATC TCC GGC AGC GGC 1680 Trp Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Met Thr Trp Ile Ser Gly Ser Gly 520 525 530 AGC ACC GGC CAG TGG CGT GCG ACG GTG CAG CTG CCC GCC GAC ACG CCG 1728 Ser Thr Gly Gln Trp Arg Ala Thr Val Gln Leu Pro Ala Asp Thr Pro 535 540 545 GTG CAG TAC AAG TAC GTG AAG AAG GAC GGC GCC GGC AAC GTG GTG TGG 1776 Val Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Lys Asp Gly Ala Gly Asn Val Val Trp 550 555 560 GAA AGC GGC GGC AAC CGC GTG GTG ACG ACG CCC GCG CCC GGG GCG ACG 1824 Glu Ser Gly Gly Asn Arg Val Val Thr Thr Pro Ala Pro Gly Ala Thr 565 570 575 580 ATC GCC GTC AAC GAC AGC TGG AAG TGACGGCCGG GGGCGCCAGG ACGACAAGGC 1878 Ile Ala Val Asn Asp Ser Trp Lys 585 CCTGAGCGCC TCGTACACCG TGCCCAGCGT GGTGGTAGTC CAACTGGCCC GACTGGCTCT 1938 TCTGGTTGCT GAGCTTGCGG TTGTCGCGCG TCACTGTGGT ACC 1981
【００４３】配列番号：８ 配列の長さ：１９８１ 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異導入染色体ＤＮＡ 起源 生物名：シュードモナス エスピー 株名：ＫＯ−８９４０ 直接の起源 プラスミド名：ｐＯＳ３４１０Ｌ１３９ 配列の特徴：mat peptide 存在の位置：６..１８４７ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 GAATTC ATG TCG CGC AGG CTG GCG CTG GCC CTG GCC GCC AGT GCC GTC 48 Met Ser Arg Arg Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ala Ser Ala Val -25 -20 -15 CTG GCC GGG CCC TGG GCG GTC GGC GCG GTG CAG GCG CAG TCC GCG CCG 96 Leu Ala Gly Pro Trp Ala Val Gly Ala Val Gln Ala Gln Ser Ala Pro -10 -5 1 CGC ACG GCC TTC GTG CAG CTT TTC GAG TGG AAG TGG ACC GAC GTC GCC 144 Arg Thr Ala Phe Val Gln Leu Phe Glu Trp Lys Trp Thr Asp Val Ala 5 10 15 20 CGG GAG TGC GAG ACC TAC CTC GGC CCC AAG GGT TTC GCG GCC GTG CAG 192 Arg Glu Cys Glu Thr Tyr Leu Gly Pro Lys Gly Phe Ala Ala Val Gln 25 30 35 ATC TCG CCG CCC AAC GAG CAC AAC TGG GTC AGC AGC GGC GAC GGC GCG 240 Ile Ser Pro Pro Asn Glu His Asn Trp Val Ser Ser Gly Asp Gly Ala 40 45 50 CCC TAC CCG TGG TGG ATG CGC TAC CAG CCG GTC AGC TAC AGC CTG GAC 288 Pro Tyr Pro Trp Trp Met Arg Tyr Gln Pro Val Ser Tyr Ser Leu Asp 55 60 65 CGC AGC CGC AGC GGC ACT CGC GCC GAG TTC CAG GAC ATG GTC AAC CGC 336 Arg Ser Arg Ser Gly Thr Arg Ala Glu Phe Gln Asp Met Val Asn Arg 70 75 80 TGC AAC GCA GCA GGC GTG GGC ATC TAC GTC GAC GCG GTG ATC AAC CAC 384 Cys Asn Ala Ala Gly Val Gly Ile Tyr Val Asp Ala Val Ile Asn His 85 90 95 100 ATG TCG GGT GGC AAC GGC GGC ACC TCG AGC GCA GGG CGC AGC TGG AGC 432 Met Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Ser Ser Ala Gly Arg Ser Trp Ser 105 110 115 CAC CAC AAC TAT CCG GGC CTG TAC GGC TCG CAG GAC TTC CAT CAC CCG 480 His His Asn Tyr Pro Gly Leu Tyr Gly Ser Gln Asp Phe His His Pro 120 125 130 GTG TGC GCC ATC ACC AAC CTC GGT GAC GCG AAC AAC GTG CAG AAC TGC 528 Val Cys Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asp Ala Asn Asn Val Gln Asn Cys 135 140 145 GAG CTC TCG GGC CTG CAG GAC CTG AAC ACC GGC AGC AGC TAC GTG CGC 576 Glu Leu Ser Gly Leu Gln Asp Leu Asn Thr Gly Ser Ser Tyr Val Arg 150 155 160 GGC AAG ATC TCC GAC TAC CTG GTC GAC CTG GTC CAG ATG GGC GTC AAG 624 Gly Lys Ile Ser Asp Tyr Leu Val Asp Leu Val Gln Met Gly Val Lys 165 170 175 180 GGC TTG CGC GTC GAT GCG GCC AAG CAC ATC AGC CCG ACG GAC CTG GGT 672 Gly Leu Arg Val Asp Ala Ala Lys His Ile Ser Pro Thr Asp Leu Gly 185 190 195 GCC ATC ATC GAC AGC GTC AAC GCG CGC ACC GGT GCC GCA CGG CCA TTC 720 Ala Ile Ile Asp Ser Val Asn Ala Arg Thr Gly Ala Ala Arg Pro Phe 200 205 210 TGG TTC CTG GAG GTG ATC GGC GCG CCG GGC GAG GCG GTG CAG CCC AGC 768 Trp Phe Leu Glu Val Ile Gly Ala Pro Gly Glu Ala Val Gln Pro Ser 215 220 225 CAG TAC TTC GGG CTC GGC GGC GGG CAG GTC ACG GTG ACC GAG TTC GCC 816 Gln Tyr Phe Gly Leu Gly Gly Gly Gln Val Thr Val Thr Glu Phe Ala 230 235 240 TAC GGC AAG GAG CTC TAC GGC AAG TTC GCC GGC GGC GGC AAG CTG GCC 864 Tyr Gly Lys Glu Leu Tyr Gly Lys Phe Ala Gly Gly Gly Lys Leu Ala 245 250 255 260 GAC CTG CAG ACC TTC GGC CCC AGC TGG AAC CTG ATG CCC AGC AGC AAG 912 Asp Leu Gln Thr Phe Gly Pro Ser Trp Asn Leu Met Pro Ser Ser Lys 265 270 275 GCC ATC GCT TTC GTC GAC AAC CAC GAC AAG CAG CGC GGC CAC GGC GGC 960 Ala Ile Ala Phe Val Asp Asn His Asp Lys Gln Arg Gly His Gly Gly 280 285 290 GGG GGC GGC TAC GTC ACC TAT CAC CAC GGC AGC ACC TAC GAC CTG GCG 1008 Gly Gly Gly Tyr Val Thr Tyr His His Gly Ser Thr Tyr Asp Leu Ala 295 300 305 AAC ATC TTC ATG CTG GCC TGG CCC TAT GGC TAC CCG GCG CTG ATG TCA 1056 Asn Ile Phe Met Leu Ala Trp Pro Tyr Gly Tyr Pro Ala Leu Met Ser 310 315 320 GCT ACG GCT TCA ACC AGG GCA GCA GCT ACG ACA CCA GCT ACG GCC CGC 1104 Ala Thr Ala Ser Thr Arg Ala Ala Ala Thr Thr Pro Ala Thr Ala Arg 325 330 335 340 CGC ACT ACA GCG ACG GCT CGA CCC GGG GGC CGT GGG ACC GGA ACC CCG 1152 Arg Thr Thr Ala Thr Ala Arg Pro Gly Gly Arg Gly Thr Gly Thr Pro 345 350 355 CCA GCC CGG GTG CTT CAA CCA GAC CGT GGG TGG CTG GGT CTG CGA GCA 1200 Pro Ala Arg Val Leu Gln Pro Asp Arg Gly Trp Leu Gly Leu Arg Ala 360 365 370 CCG CTG GCG CGG CAT CGG CAA CAT GGT GGC CTT CCG CAA CGC CAC CGT 1248 Pro Leu Ala Arg His Arg Gln His Gly Gly Leu Pro Gln Arg His Arg 375 380 385 GGA CAA CTG GTT CGT CAG CGA CTG GTG GAG CAA CGG CAA CAA CCA GAT 1296 Gly Gln Leu Val Arg Gln Arg Leu Val Glu Gln Arg Gln Gln Pro Asp 390 395 400 CGC CTT CGG CCG CGG CGA CAA GGG CTT CGT CGT CAT CAA CAA GGA AGG 1344 Arg Leu Arg Pro Arg Arg Gln Gly Leu Arg Arg His Gln Gln Gly Arg 405 410 415 420 TAC GGC GCT GAC GCA GCT TCC AGA CCA GCC TGC CGG CCG GGC GTA TTG 1392 Tyr Gly Ala Asp Ala Ala Ser Arg Pro Ala Cys Arg Pro Gly Val Leu 425 430 435 CGA CGT GAT CTC CGG CGA CTT CGC CAA CGG CAG CTG CAC CGG CAC GGT 1440 Arg Arg Asp Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Gln Leu His Arg His Gly 440 445 450 GGT GAC CGT GGA TGC AGG CGG CCA CGC GAT GCT GTC CGC ACC CGC TTA 1488 Gly Asp Arg Gly Cys Arg Arg Pro Arg Asp Ala Val Arg Thr Arg Leu 455 460 465 TGG CGC GGC GGC GAT CCA CGT CGG TGC GCG CAT CGG CGA CAC GCA GCA 1536 Trp Arg Gly Gly Asp Pro Arg Arg Cys Ala His Arg Arg His Ala Ala 470 475 480 GGT GCA GCA GTG CTC AGC TTG ACC TTC AAC GAG ACG GCC GAC ACC GTG 1584 Gly Ala Ala Val Leu Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Ala Asp Thr Val 485 490 495 500 TGG GGC CAG AAC CTC TTC GTC GTC GGC AAC GTC GGC GCG CTC GGC AAC 1632 Trp Gly Gln Asn Leu Phe Val Val Gly Asn Val Gly Ala Leu Gly Asn 505 510 515 TGG GCG CCC GCG GCC GGG GCG GCG ATG ACC TGG ATC TCC GGC AGC GGC 1680 Trp Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Met Thr Trp Ile Ser Gly Ser Gly 520 525 530 AGC ACC GGC CAG TGG CGT GCG ACG GTG CAG CTG CCC GCC GAC ACG CCG 1728 Ser Thr Gly Gln Trp Arg Ala Thr Val Gln Leu Pro Ala Asp Thr Pro 535 540 545 GTG CAG TAC AAG TAC GTG AAG AAG GAC GGC GCC GGC AAC GTG GTG TGG 1776 Val Gln Tyr Lys Tyr Val Lys Lys Asp Gly Ala Gly Asn Val Val Trp 550 555 560 GAA AGC GGC GGC AAC CGC GTG GTG ACG ACG CCC GCG CCC GGG GCG ACG 1824 Glu Ser Gly Gly Asn Arg Val Val Thr Thr Pro Ala Pro Gly Ala Thr 565 570 575 580 ATC GCC GTC AAC GAC AGC TGG AAG TGACGGCCGG GGGCGCCAGG ACGACAAGGC 1878 Ile Ala Val Asn Asp Ser Trp Lys 585 CCTGAGCGCC TCGTACACCG TGCCCAGCGT GGTGGTAGTC CAACTGGCCC GACTGGCTCT 1938 TCTGGTTGCT GAGCTTGCGG TTGTCGCGCG TCACTGTGGT ACC 1981
【図１】 野性型のシュードモナス・エスピー（ｐＯＳ
３４１０）から得られた野性型酵素の、処理開始３０分
後における可溶性デンプン分解活性を示したものであ
る。
３４１０）から得られた野性型酵素の、処理開始３０分
後における可溶性デンプン分解活性を示したものであ
る。
【図２】 野性型のシュードモナス・エスピー（ｐＯＳ
３４１０）から得られた野性型酵素の、処理開始１８０
分後における可溶性デンプン分解活性を示したものであ
る。
３４１０）から得られた野性型酵素の、処理開始１８０
分後における可溶性デンプン分解活性を示したものであ
る。
【図３】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｆ５
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分解
活性を示したものである。
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分解
活性を示したものである。
【図４】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｆ５
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
【図５】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｈ５
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分解
活性を示したものである。
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分解
活性を示したものである。
【図６】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｈ５
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
【図７】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｌ５
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分解
活性を示したものである。
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分解
活性を示したものである。
【図８】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｌ５
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
７から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミラ
ーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
【図９】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｆ１
３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミ
ラーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−アミ
ラーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン分
解活性を示したものである。
【図１０】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｆ
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプ
ン分解活性を示したものである。
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプ
ン分解活性を示したものである。
【図１１】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｈ
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン
分解活性を示したものである。
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン
分解活性を示したものである。
【図１２】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｈ
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプ
ン分解活性を示したものである。
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプ
ン分解活性を示したものである。
【図１３】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｌ
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン
分解活性を示したものである。
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始３０分後における可溶性デンプン
分解活性を示したものである。
【図１４】 本発明の形質転換大腸菌ｐＯＳ３４１０Ｌ
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプ
ン分解活性を示したものである。
１３９から得られたマルトペンタオース高生産性α−ア
ミラーゼの、処理開始１８０分後における可溶性デンプ
ン分解活性を示したものである。
図中のＧ５は、マルトペンタオースの検出量を、Ｇ３は
マルトトリオースの検出量を、Ｇ２はマルトースの検出
量をそれぞれ示す。
マルトトリオースの検出量を、Ｇ２はマルトースの検出
量をそれぞれ示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (9)
- 【請求項１】 シュードモナス エスピー ＫＯ−８９
４０由来マルトペンタオース生成アミラーゼのアミノ酸
配列 (Shida, O. ら、Biosci. Biotech. Biochem. 56
巻, 76-80, 1992)において５７番目または１３９番目に
位置するアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列を有す
る、マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼをコー
ドする遺伝子。 - 【請求項２】 請求項１記載の遺伝子を含むプラスミ
ド。 - 【請求項３】 プラスミドが、配列表の配列番号３〜８
のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するものである請
求項２記載のプラスミド。 - 【請求項４】 配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配
列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１１６）。 - 【請求項５】 配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配
列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１１９）。 - 【請求項６】 配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配
列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１１５）。 - 【請求項７】 配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配
列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１１７）。 - 【請求項８】 配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配
列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１１８）。 - 【請求項９】 配列表の配列番号８に記載のアミノ酸配
列を有するプラスミドを保有する形質転換大腸菌（ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６１１４）。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9305071A JP3062595B2 (ja) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体 |
| US09/017,706 US6087147A (en) | 1997-10-21 | 1998-02-05 | α-amylase gene having ability for highly producing maltopentaose, vector containing said gene and transformant |
| DK199800255A DK25598A (da) | 1997-10-21 | 1998-02-25 | alfa-amylase-gen med evne til høj produktion af maltopentose, vektor indeholdende dette gen og transformant indeholdende ve |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9305071A JP3062595B2 (ja) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11123081A true JPH11123081A (ja) | 1999-05-11 |
| JP3062595B2 JP3062595B2 (ja) | 2000-07-10 |
Family
ID=17940772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9305071A Expired - Lifetime JP3062595B2 (ja) | 1997-10-21 | 1997-10-21 | マルトペンタオース高生産性α−アミラーゼ遺伝子、該遺伝子を含むベクターおよび形質転換体 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6087147A (ja) |
| JP (1) | JP3062595B2 (ja) |
| DK (1) | DK25598A (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8194781B2 (en) * | 2006-12-29 | 2012-06-05 | Samsung Electronics Co., Ltd | Method and apparatus for transmitting and receiving control channel message in a MIMO mobile communication system |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4017595A1 (de) * | 1990-05-31 | 1991-12-05 | Consortium Elektrochem Ind | Maltopentaose produzierende amylasen |
-
1997
- 1997-10-21 JP JP9305071A patent/JP3062595B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-02-05 US US09/017,706 patent/US6087147A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-25 DK DK199800255A patent/DK25598A/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK25598A (da) | 1999-04-22 |
| JP3062595B2 (ja) | 2000-07-10 |
| US6087147A (en) | 2000-07-11 |
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