JPH10506903A - 抗新形成性のココア抽出物の製造および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 開示され、請求されているのはポリフェノールまたはプロシアニジン等のココア抽出物、そのような抽出物の調製方法並びにそれらの使用、特に抗新形成剤および抗酸化剤としての使用である。開示され、請求されているのは、ココアポリフェノールまたはプロシアニジンを含む抗新形成性組成物およびその組成物を用いた患者の治療方法である。付加的に開示され請求されているのは、ココアポリフェノールまたはプロシアニジンを含む抗新形成剤およびココアポリフェノールまたはプロシアニジンを含む凍結乾燥された抗新形成性組成物によって治療の必要のある患者を治療するためのキットである。さらに、開示され、請求されているのは、抗酸化性、保存性およびトポイソメラーゼ阻害性組成物における本発明の使用および方法である。

Description

【発明の詳細な説明】 抗新形成性のココア抽出物の製造および使用方法 発明の分野 本発明は、ポリフェノール、好ましくはプロシアニジンにより質的に向上され たポリフェノール等のココア抽出物に関する。本発明はまた、そのような抽出物 の調製方法、並びにそれらの、例えば抗新形成剤および抗酸化剤等としての使用 に関する。 文献が、クレームの前の、明細書の終りの参考文献の部分に示されている各々 の文献の完全な引用とともに、この開示で引用されている。これらの文献は、本 発明の分野に関係するものであり；そして、ここに引用されている各々の文献は 、ここにおいて参考文献として取り込まれている。発明の背景 ポリフェノールは、多様な植物中で生産される信じられないほど多様化した化 合物の群であり（Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、そのうちのい くつかは食物連鎖に組み込まれている。いくつかの場合において、それらは人間 の制限食のために重要な化合物のクラスを代表している。いくつかのポリフェノ ールは非栄養性であると考えられているが、これらの化合物への関心は、それら の潜在的な健康への有利な効果によるものである。例えば、ケルセチン（フラボ ノイドの１つ）は、実験動物での研究において抗ガン原性活性を有することが示 された（Ｄｅｓｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１、およびＫａｔｏ ｅｔ ａ ｌ．，１９８３）。（＋）−カテキンおよび（−）−エピカテキン（フラバン− ３−オール）は、白血病ウイルス逆転写酵素活性を阻害する（Ｃｈｕ ｅｔ ａ ｌ．，１９９２）。ノボタニン（Ｎｏｂｏｔａｎｉｎ）（加水分解可能なオリゴ マー性タンニン）もまた、抗腫瘍性活性を有することが示されている（Ｏｋｕｄ ａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。日本の茶を生産している地域においては胃ガン の死亡率が顕著に低いということを静力学的な報告が示している。エピガロカテ キン没食子酸は緑茶中の薬理学的活性物質であると報告されている（Ｏｋｕｄａ ｅｔ ａ ｌ．，１９９２）。エラグ酸もまた抗ガン原性活性を多様な動物細胞腫瘍モデル で有することが示された（Ｂｕｋｈａｒｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。最近 、プロアントシアニジンオリゴマーの抗変異剤としての利用がキッコーマンコー ポレーションによって特許にされた。勿論、食品中のフェノール性化合物の範囲 およびその実験動物モデルにおける腫瘍発展の調節は、最近の、２０２ｎｄ Ｎ ａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙで発表された（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕ ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。 しかしながら、これらの報告のうち、ココア抽出物、そのような抽出物の調製 方法、またはココア抽出物の抗新形成剤としての利用を教示または示唆するもの はなかった。 発酵されていないココア豆はかなりのレベルのポリフェノールを含有するので 、本発明者等は、同様な活性および利用が、ココア内の化合物等のココア抽出物 に関してもあり得、そのような化合物をココアから抽出し、抽出物の活性を検索 することにより明らかにすることが可能であると考えた。Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃ ａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、その大型天然生成物選択プログラムの一部 として、多様なＴｈｅｏｂｒｏｍａおよびＨｅｒｒａｎｉａ種を、抗ガン活性に 関して検索した。いくつかのココア組織の抽出物において低レベルの活性が報告 されたが、その研究は追求されなかった。このように、抗新形成または抗ガン分 野において、ココアおよびその抽出物は有用であるとは考えられていなかった； 即ち、抗新形成または抗ガン分野の教示は、当業者をココアおよびその抽出物を ガン治療として用いることから遠ざけていた。数多くのココアポリフェノールの 味覚開発への貢献を研究するための分析的手順が開発されているので（Ｃｌａｐ ｐｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、本発明者等は抗ガン検索のための試 料を調製するために、抗新形成または抗ガン分野の知識とは違う、アナログ法を 応用することを決めた。驚くべきことに、この分野の知識、例えばＮａｔｉｏｎ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの検索、に反して、本発明者等はプロ シアニジンを含むココアポリフェノール抽出物は、抗ガンまたは抗新形成剤とし て重要な用途を有していることを発見した。付加的には、発明者等はプロシアニ ジン を含むココア抽出物が抗酸化剤としての用途を有していることを示した。目的と発明の概要 ココア抽出物を製造するための方法を提供することが本発明の目的である。 ココア抽出物を提供することが本発明の別の目的である。 抗酸化組成物を提供することが本発明の別の目的である。 ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素活性の阻害を示すことが本発明の別の目的で ある。 腫瘍またはガンを治療するための方法を提供することが本発明のまた別の目的 である。 抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成組成物を提供することが提供することが本発 明のさらに別の目的である。 抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成組成物を製造するための方法を提供すること が本発明の更なる目的である。 そして、腫瘍またはガン治療において用いられるキットを提供することが本発 明の目的である。 驚くべきことに、ココア抽出物が抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成活性を有す ること；または、抗酸化組成物であること、またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ 酵素活性を阻害することが発見された。従って、本発明は実質的に純粋なココア 抽出物を提供する。抽出物は好ましくは、ココアプロシアニジン（群）で質的に 向上されたポリフェノール（群）等で、（−）エピカテキン、プロシアニジンＢ −２、２から１２、好ましくは２から５、または４から１２のプロシアニジンオ リゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニジン Ｃ−１から成る群から選択される少なくとも１つのココアプロシアニジンのポリ フェノール群等のポリフェノール（群）を含んでいる。本発明はまた、抗腫瘍、 抗ガン、または抗新形成または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤 組成物であって、実質的に純粋な、プロシアニジン（群）により質的に向上され たポリフェノール（群）等のココア抽出物または合成ポリフェノール（群）、お よび適当な担体から成るものを提供する。抽出物は好ましくはココアプロシアニ ジン（群）を含んでいる。ココア抽出物は好ましくは、ココア豆を粉末に還元し 、 粉末を脱脂し、そして粉末から活性化合物（群）を抽出することから成る工程に よって得られる。 本発明はまた、実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノー ル（群）またはプロシアニジン（群）、および、好適な担体から成る抗新形成性 組成物を患者に有効量投与することから成る、抗腫瘍、抗ガン、または抗新形成 剤または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤で治療の必要のある患 者を治療する方法を包括する。ココア抽出物は、ココアプロシアニジン（群）で あってもよい；そして、好ましくは、ココア豆を粉末に還元し、粉末を脱脂し、 そして粉末から活性化合物を抽出することから成る工程によって得られる。 付加的には、本発明は、実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリ フェノール（群）またはプロシアニジン（群）、および、抽出物または合成ポリ フェノール（群）またはプロシアニジン（群）との混合物に好適な担体から成る 抗新形成性組成物を患者に有効量投与することから成る、抗腫瘍、抗ガン、また は抗新形成剤または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤で治療の必 要のある患者を治療するためのキットを提供する。 これらのおよび他の目的および態様が開示されているか、または以下の詳細な 説明から明白であろう。図面の簡単な説明 以下の詳細な説明は添付した図面を参照することにより、より良く理解される であろうが、そこにおいて： 図１は、粗ココアプロシアニジンの画分からの代表的なゲル濾過クロマトグラ ムを示す； 図２Ａは、発酵されていないココアから抽出されたココアプロシアニジンの分 離（溶出特性）を示している代表的な逆相クロマトグラムを示している； 図２Ｂは、発酵されていないココアから抽出されたココアプロシアニジンの分 離（溶出特性）を示している代表的な順相クロマトグラムを示している； 図３は、いくつかの代表的なプロシアニジンの構造を示している； 図４Ａ−４Ｅは、抗ガンおよび抗新形成活性に関する検索に用いた５つの画分 の、代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示す； 図５および６Ａ−６Ｄは、ココア抽出物とガン細胞ＡＣＨＮ（図５）およびＰ Ｃ−３（図６Ａ−６Ｄ）との間の、投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ 量、μｇ／ｍl）；Ｍ＆Ｍ２ Ｆ４／９２、Ｍ＆ＭＡ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ１、Ｍ＆Ｍ Ｂ＋Ｅ Ｙ１９２Ｐ１、Ｍ＆ＭＣ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ２、Ｍ＆ＭＤ＋Ｅ Ｕ１２Ｐ２ ； 図７Ａから７Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ＋ Ｂ、Ａ＋Ｅ、およびＡ＋ＤとＰＣ−３細胞系統との間の、典型的な投与量−反応 の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ａ ０２１２Ｐ３、 ＭＭ−１Ｂ ０１６２Ｐ１、ＭＭ−１ Ｃ ０１２２Ｐ３、ＭＭ−１ Ｄ ０１ ２２Ｐ３、ＭＭ−１ Ｅ ０２９２Ｐ８、ＭＭ−１ Ａ／Ｂ ０２９２Ｐ６、Ｍ Ｍ−１ Ａ／Ｅ ０２９２Ｐ６、ＭＭ−１ Ａ／Ｄ ０２９２Ｐ６； 図８Ａから８Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ａ＋ Ｂ、Ｂ＋Ｅ、およびＤ＋ＥとＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統との間の、典型的な 投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ａ ０ ９２Ｋ３、ＭＭ−１ Ｂ ０２１２Ｋ５、ＭＭ−１ Ｃ ０１６Ｋ３、ＭＭ−１ Ｄ ０２１２Ｋ５、ＭＭ−１ Ｅ ０２９２Ｋ５、ＭＭ−１ Ａ／Ｂ ０２９ ２Ｋ３、ＭＭ−１ Ｂ／Ｅ ０２９２Ｋ４、ＭＭ−１ Ｄ／Ｅ ０２９２Ｋ５； 図９Ａから９Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｂ＋ Ｄ、Ａ＋Ｅ、およびＤ＋ＥとＨＣＴ−１１６細胞系統との間の、典型的な投与量 −反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１Ｃ ０１９２ Ｈ５、Ｄ ０１９２Ｈ５、Ｅ ０１９２Ｈ５、ＭＭ−１ Ｂ＆Ｄ ０２６２Ｈ２ 、Ａ／Ｅ ０２６２Ｈ３、ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ ０２６２Ｈ１； 図１０Ａから１０Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、 Ｂ＋Ｄ、Ｃ＋Ｄ、およびＡ＋ＥとＡＣＨＮ腎臓細胞系統との間の、典型的な投与 量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０９ ２Ａ５、ＭＭ−１ Ｂ ０９２Ａ５、ＭＭ−１ Ｃ ０１９２Ａ７、ＭＭ−１Ｄ ０１９２Ａ７、Ｍ＆Ｍ１ Ｅ ０１９２Ａ７、ＭＭ−１ Ｂ＆Ｄ ０３０２Ａ ６、ＭＭ−１ Ｃ＆Ｄ ０３０２Ａ６、ＭＭ−１ Ａ＆Ｅ ０２６２Ａ６； 図１１Ａから１１Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、 Ａ＋Ｅ、Ｂ＋Ｅ、およびＣ＋ＥとＡ−５４９肺細胞系統との間の、典型的な投与 量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０１ ９２５８、ＭＭ−１ Ｂ ０９２５６、ＭＭ−１ Ｃ ０１９２５９、ＭＭ−１ Ｄ ０１９２５８、ＭＭ−１ Ｅ ０１９２５８、Ａ／Ｅ ０２６２５４、Ｍ Ｍ−１ Ｂ＆Ｅ ０３０２５５、ＭＭ−１ Ｃ＆Ｅ Ｎ６２５５； 図１２Ａから１２Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、 Ｂ＋Ｃ、Ｃ＋Ｅ、およびＤ＋ＥとＳＫ−５メラノーマ細胞系統との間の、典型的 な投与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ ０２１２Ｓ４、ＭＭ−１ Ｂ ０２１２Ｓ４、ＭＭ−１ Ｃ ０２１２Ｓ４、 ＭＭ−１ Ｄ ０２１２Ｓ４、ＭＭ−１ Ｅ Ｎ３２Ｓ１、ＭＭ−１ Ｂ＆Ｃ Ｎ３２Ｓ２、ＭＭ−１ Ｃ＆Ｄ Ｎ３２Ｓ３、ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ Ｎ３２Ｓ３； 図１３Ａから１３Ｈまでは、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、 Ｂ＋Ｃ、Ｃ＋Ｅ、およびＤ＋ＥとＭＣＦ−７胸部細胞系統との間の、典型的な投 与量−反応の関係を示す（部分的生存ｖｓ量、μｇ／ｍｌ）；ＭＭ−１ Ａ Ｎ ２２Ｍ４、ＭＭ−１ Ｂ Ｎ２２Ｍ４、ＭＭ−１ Ｃ Ｎ２２Ｍ４、ＭＭ−１ Ｄ Ｎ２２Ｍ３、ＭＭ−１ Ｅ ０３０２Ｍ２、ＭＭ−１ Ｂ／Ｃ ０３０２Ｍ ４、ＭＭ−１ Ｃ＆Ｅ Ｎ２２Ｍ３、ＭＭ−１ Ｄ＆Ｅ Ｎ２２Ｍ３； 図１４は、ココアプロシアニジン（特に画分Ｄ）とＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病細胞系統との間の、典型的な投与量−反応の関係を示す（細胞／ｍｌｖｓ 増殖日数、白丸は対照、黒丸は１２５μｇ画分Ｄ、白逆三角形は２５０μｇ画分 Ｄ、黒逆三角形は５００μｇ画分Ｄ）； 図１５Ａは、画分Ｄ＋Ｅで処理されたＭＣＦ−７ ｐ１６８胸部ガン細胞に対 するＸＴＴおよびクリスタルバイオレット細胞毒性アッセイの比較を示している （白丸はＸＴＴ、黒丸はクリスタルバイオレット）； 図１５Ｂは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフ ェノールで処理されたＭＤＡ ＭＢ２３１胸部細胞系統から得られた典型的な投 与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸 はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白 四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ず しも細胞数をあらわすものではない）； 図１５Ｃは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフ ェノールで処理されたＰＣ−３前立腺ガン細胞系統から得られた典型的な投与量 反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビ ヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四 角は１０μｇ／ｍｌ）； 図１５Ｄは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフ ェノールで処理されたＭＣＦ−７ ｐ１６８胸部ガン細胞系統から得られた典型 的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照 、黒丸はビヒクル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ ｍ１、白四角は１０μｇ／ｍｌ、黒四角は１μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレー トリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）； 図１５Ｅは、ＵＩＴ−１ココア遺伝子型から得られた多様なレベルの粗ポリフ ェノールで処理されたＨｅｌａ子宮ガン細胞系統から得られた典型的な投与量反 応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、黒丸はビヒ クル、白逆三角形は２５０μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は１００μｇ／ｍｌ、白四角 は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプレートリーダーの限界であり、必ずしも細 胞数をあらわすものではない）； 図１５Ｆは、異なったココアポリフェノール画分で処理されたＨｅｌａ子宮ガ ン細胞系統に対する細胞毒性効果を示す（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸 は１００μｇ／ｍｌの画分Ａ−ＥN黒丸は１００μｇ／ｍｌの画分Ａ−Ｃ、白逆 三角形は１００μｇ／ｍｌの画分Ｄ＆Ｅ；吸光度２．０はプレートリーダーの限 界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）； 図１５Ｇは、１００μｌ／ｍｌでの、異なったココアポリフェノール画分で処 理されたＳＫＢＲ−３胸部ガン細胞系統に対する細胞毒性効果を示す（吸収度（ ５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は画分Ａ−Ｅ、黒丸は画分Ａ−Ｃ、白逆三角形は画 分Ｄ＆Ｅ； 図１５Ｈは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＨｅｌａ細胞との間の典型的 な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸は対照、 黒丸は１００μｇ／ｍｌ、白逆三角形は７５μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は５０μｇ ／ｍｌ、白四角は２５μｇ／ｍｌ、黒四角は１０μｇ／ｍｌ；吸光度２．０はプ レートリーダーの限界であり、必ずしも細胞数をあらわすものではない）； 図１５Ｉは、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋ＥとＳＫＢＲ−３細胞系統との間 の典型的な投与量反応曲線を示している（吸収度（５４０ｎｍ）ｖｓ日数；白丸 は対照、黒丸は１００μｇ／ｍｌ、白逆三角形は７５μｇ／ｍｌ、黒逆三角形は ５０μｇ／ｍｌ、白四角は２５μｇ／ｍｌ、黒四角は１０μｇ／ｍｌ）； 図１５Ｊは、軟寒天クローニングアッセイを用いた、ココアプロシアニジン画 分Ｄ＋ＥとＨｅｌａガン細胞との間の典型的な投与量反応関係を示している（棒 グラフ；コロニー数ｖｓ対照、１、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌ）； 図１５Ｋは、異なるココア遺伝子型から得られた粗ポリフェノール抽出物で処 理された場合のＨｅｌａ細胞の増殖阻害を示している（％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍ ｌ；白丸はＣ−１、黒丸はＣ−２、白逆三角形はＣ−３、黒逆三角形はＣ−４、 白四角はＣ−５、黒四角はＣ−６、白三角形はＣ−７、黒三角形はＣ−８；Ｃ− １＝ＵＦ−１２：園芸種＝Ｃｒｉｏｌｌｏおよび記述はＵＦ−１２（ブラジル） ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−２ ＝ＮＡ−３３：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述はＮＡ−３３（ブラジル ）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ− ３＝ＥＥＧ−４８：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述はＥＥＧ−４８（ブ ラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化） ；Ｃ−４＝不明：園芸種＝Ｆｏｒａｓｔｅｒｏおよび記述は不明（Ｗ．アフリカ ）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化）；Ｃ− ５＝ＵＦ−６１３：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＵＦ−６１３（ ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テオブロミン化 ）；Ｃ−６＝ＩＣＳ−１００：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよび記述はＩＣ Ｓ−１００（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェイン化／脱テ オブロミン化）；Ｃ−７＝ＩＣＳ−１３９：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒｉｏおよ び記述はＩＣＳ−１３９（ブラジル）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カフェ イン化／脱テオブロミン化）；Ｃ−８＝ＵＩＴ−１：園芸種＝Ｔｒｉｎｉｔａｒ ｉ ｏおよび記述はＵＩＴ−１（マレーシア）ココアポリフェノール粗抽出物（脱カ フェイン化／脱テオブロミン化）； 図１５Ｌは、発酵されたココア豆および乾燥されたココア豆から得られた粗ポ リフェノール抽出物で処理された場合のＨｅｌａ細胞の増殖の阻害を示す（完全 な発酵段階および太陽での乾燥；％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸は０日画分、 黒丸は１日画分、白逆三角形は２日画分、黒逆三角形は３日画分、白四角は４日 画分、黒四角は９日画分）； 図１５Ｍは、酵素的に酸化されたココアプロシアニジンのＨｅｌａ細胞に対す る影響を示す（ポリフェノールオキシダーゼ処理されたココアポリフェノールに 対する投与量反応；％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；黒四角は粗ＵＩＴ−１（カフェ インおよびテオブロミンとともに）、白丸は粗ＵＩＴ−１（カフェインおよびテ オブロミン無し）および黒丸は粗ＵＩＴ−１（ポリフェノールオキシダーゼ分解 された）； 図１５Ｎは、組み合わされたココアプロシアニジン画分ＤおよびＥの、代表的 な半調製逆相ＨＰＬＣ分離を示す。 図１５Ｏは、粗ココアポリフェノール抽出物の、代表的な半調製順相ＨＰＬＣ 分離を示す。 図１６は、ココアプロシアニジン抽出物および画分のランシマット（Ｒａｎｃ ｉｍａｔ）酸化曲線を、合成抗酸化剤ＢＨＡおよびＢＨＴと比較して示している （任意の単位ｖｓ時間；破線およびクロス（＋）はＢＨＡおよびＢＨＴ；＊はＤ −Ｅ；ｘは粗試料；白四角はＡ−Ｃ；および白ひし形は対照）； 図１７は、キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩ触媒鎖分解の、ココ アプロシアニジン画分による阻害を示している典型的なアガロースゲルである。 （レーン１は、０．５μｇのマーカー（Ｍ）モノマー長キネトプラストＤＮＡ環 を含む；レーン２および２０は、トポイソメラーゼＩＩとともに４％ＤＭＳＯ存 在下であって、何れのココアプロシアニジンの不在下で保温されたキネトプラス トＤＮＡを含む。（対照−Ｃ）；レーン３および４は、０．５および５．０μｇ ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ａの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに 保温されたキネトプラストＤＮＡを含む；レーン５および６は、０．５および５ ． ０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｂの存在下でトポイソメラーゼＩＩと ともに保温されたキネトプラストＤＮＡを含む；レーン７、８、９、１３、１４ 、および１５は、０．０５、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニ ジン画分Ｄの存在下でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラスト ＤＮＡの複製である；レーン１０、１１、１２、１６、１７、および１８は、０ ．０５、０．５および５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｅの存在下 でトポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である ；レーン１９は、５．０μｇ／ｍｌのココアプロシアニジン画分Ｅの存在下でト ポイソメラーゼＩＩとともに保温されたキネトプラストＤＮＡの複製である； 図１８はココアプロシアニジン画分Ｄの、ＤＮＡ修復能を有する、およびそれ を欠失している細胞系統に対する投与量反応関係を示している（部分的生存ｖｓ μｇ／ｍｌ；左側はｘｒｓ−６ＤＮＡ欠損修復細胞系統、ＭＭ−１ Ｄ Ｄ２８ ２Ｘ１；右側はＢＲ１ＤＮＡ修復可能細胞系統ＭＭ−１ Ｄ Ｄ２８２Ｂ１）； 図１９は、ココアプロシアニジン画分Ｄ＋Ｅで処理された場合の、アドリアマ イシン耐性ＭＣＦ−７細胞に対する投与量反応曲線を、ＭＣＦ−７ ｐ１６８親 細胞系統と比較して示している（％対照ｖｓ濃度μｇ／ｍｌ；白丸はＭＣＦ−７ ｐ１６８；黒丸はＭＣＦ−７ ＡＤＲ）；および、 図２０は、順相半調製ＨＰＬＣにより調製された１２の画分の、１００μｇ／ ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌのレベルで処理された場合の、Ｈｅｌａ細胞に対する 投与量反応効果を示している（棒グラフ、％対照ｖｓ対照および画分１−１２） 。詳細な説明 上で議論したとおり、今、驚くべきことに、ココア抽出物が抗ガン、抗腫瘍、 または抗新形成活性、抗酸化活性を示し、そしてＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵 素を阻害することが発見された。抽出物は、一般的に、ココア豆を粉末に還元し 、粉末を脱脂し、活性な化合物（群）を脱脂された粉末から抽出することにより 調製される。粉末はココア豆およびパルプを凍結乾燥し、ココア豆およびパルプ を脱パルプ化し、凍結乾燥されたココア豆を脱穀し、脱穀された豆を粉砕するこ とによって調製されてもよい。活性な化合物（群）の抽出は溶媒抽出技術で可能 である。抽出物は精製できる；例えば、ゲル濾過クロマトグラフィーによるかま た は調製的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術によるか、またはこれ らの技術の組合せによる。活性を有する抽出物は、何れかの特定の理論に必ず拘 束されることを望まないが、プロシアニジン等のココアポリフェノール（群）で あると同定された。これらのココアプロシアニジンは、重要な抗ガン、抗腫瘍、 または抗新形成活性；抗酸化活性；を有し、そしてＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ 酵素を阻害する。 本発明のココアポリフェノールまたはプロシアニジンを含む抗ガン、抗腫瘍ま たは抗新形成、または抗酸化またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害組成物 は、薬学的分野の当業者によく知られた標準的な技術に従って調製可能である。 そのような組成物は、そのような投与を要する患者に対して、医学分野の当業者 に良く知られた技術により、年齢、性別、体重および特定の患者の状態、および 投与経路等を考慮して、投与することができる。この組成物は、他の抗新形成、 抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ阻害剤 および／または、抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤またはＤＮＡ トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の副作用を減少または軽減する薬剤とともに、また はそれと連続的に、再び年齢、性別、体重および特定の患者の状態、および投与 経路等を考慮して、投与することができる。 本発明の組成物の例には、カプセル、錠剤、丸薬、およびその様なもの、並び に咀嚼可能な固体配合物であって、本発明が食用給源なのでそれにふさわしいも の（ココアまたはチョコレート味の固体組成物等）；経口、経鼻孔、経肛門、経 膣等の開口部用の液体調製物、懸濁物、シロップまたは内用液等の投与；および 、非経口、皮下、皮内、筋内または滅菌懸濁物またはエマルジョン等の静脈内投 与（注入可能投与等）が含まれる。しかしながら、組成物中の活性な成分は、血 液流中に投与された場合に、血液タンパク質の沈殿により凝集を生じ得るような タンパク質複合体であるかも知れない；そして、当業者はこのことを考慮すべき である。このような組成物においては、活性ココア抽出物は、好適な担体、希釈 液または滅菌水、生理食塩水、グルコースまたはその様なもの等の賦形剤との混 合物であってもよい。本発明の活性ココア抽出物は、例えば等圧水性食塩水バッ ファー中等の再配合のための、凍結乾燥の形状で提供されることもできる。 さらに、本発明は、活性ココア抽出物が提供されているキットを包括する。キ ットは、適当な担体、希釈液または賦形剤を含む独立したコンテナを有していて もよい。キットはまた、付加的な抗ガン、抗腫瘍または抗新形成剤、または抗酸 化剤、またはＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害剤および／または、共にまた は続けて投与するための、抗新形成、抗腫瘍または抗ガン剤または抗酸化剤また はＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ酵素阻害剤の副作用を減少または軽減する薬剤を 含んでいてもよい。付加的な薬剤（群）は別個のコンテナ（群）中、または活性 ココア抽出物との混合物として提供されてもよい。付加的には、キットは、内容 物の混合または混合および／または投与のための指示書を含んでもよい。 さらには、本発明は、好ましくはココアプロシアニジンを含むココア抽出物に 関して記載されているが、この開示から熟練した有機化学者は、活性化合物を得 るための合成経路を理解し想像するであろう。従って、本発明は、合成ココアポ リフェノールまたはプロシアニジンまたはその派生体であって、グリコシド、没 食子酸、エステル等およびその様なものを腹部がこれに限定されないものをも包 括する。 以下の限定的ではない例は説明のみのために提供されており、本発明の限定と 考えられるべきではなく、本発明の精神またはその範囲から離れることなく、多 くの明白な変化が可能である。実施例 実施例１： ココア給源および調製方法 ３種類の認識されたココアの園芸種を代表するいくつかのＴｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ遺伝子型（Ｅｎｒｉｑｕｅｚ、１９６７；Ｅｎｇｅｌ、１９８１） を、世界の３つの主要なココア生産起源より得た。この研究に用いられたこれら の遺伝子型のリストを表１に示す。収穫されたココアさやを開き、パルプを有す る豆を凍結乾燥用に取り除いた。パルプを凍結乾燥された塊から手作業で除去し 、豆を以下のように分析した。発酵されていない、凍結乾燥されたココア豆を最 初に手作業で脱穀し、ＴＥＫＭＡＲ Ｍｉｌｌで細かい粉末塊へと粉砕した。そ の結果生じた塊を、続いて、再蒸留ヘキサンを溶媒として用いたＳｏｘｈｌｅｔ 抽出で一晩脱脂した。残存溶媒を脱脂された塊から常温で真空により取り除いた 。 実施例２： プロシアニジン柚出の手順 Ａ．方法１ プロシアニジンは、脱脂され、発酵されていない、凍結乾燥された実施例１の ココア豆から、ＪａｌａｌおよびＣｏｌｌｉｎ（１９７７）によって記述された 方法の改変型を用いて抽出した。プロシアニジンは、５０ｇの脱脂されたココア 塊のバッチから、４００ｍｌの７０％アセトン／脱塩水で２回、続いて４００ｍ ｌの７０％メタノール／脱塩水により抽出した。抽出物を貯蔵し、溶媒を４５℃ で部分的に真空に保たれたロータリーエバポレーターにより蒸留して除去した。 その結果生じた水相を、脱塩水で１ｌに希釈し、４００ｍｌ ＣＨＣｌ₃で２回 抽出した。この溶媒相は廃棄した。水相を続いて、５００ｍｌ酢酸エチルで４回 抽出した。生じたエマルジョンの何れをも、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＣ２８Ｓ遠心機 での、２０００ｇ、３０分間の１０℃での遠心により破壊した。統合された酢酸 エチル抽出物に、１００−２００ｍｌの脱塩水を添加した。溶媒を４５℃で部分 的に真空に保たれたロータリーエバポレーターにより蒸留して除去した。その結 果生じた水相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム 上で凍結乾燥した。異なったココア遺伝子型より得られた粗プロシアニジンの収 量を表２にリストした。 Ｂ．方法２ 別の選択としては、プロシアニジンは、脱脂された、発酵されていない、実施 例１の凍結乾燥ココア豆から７０％水性アセトンにより抽出される。１０ｇの脱 脂原料を１００ｍｌの溶媒で５−１０分間スラリー化した。スラリーを４℃で３ ０００ｇで１５分間遠心し、上清をグラスウールに通した。濾過したものを部分 的な真空の下で蒸留し、その結果生じた水相を液体窒素中で凍結し、続いてＬＡ ＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システム上で凍結乾燥した。粗プロシアニジンの収量は１ ５−２０％の範囲にあつた。 何れかの特定の理論に拘束されることを望むものではないが、粗収量における 違いは、異なった遺伝子型、地理的起源、園芸的種および調製方法によって生じ た変化を反映していると信じられている。実施例３： ココアプロシアニジンの部分精製 Ａ．ゲル濾過クロマトグラフィー 実施例２により得られたプロシアニジンをセファデックスＬＨ−２０（２８ｘ ２．５ｃｍ）での液体クロマトグラフィーにより部分的に精製した。分離を、 脱塩水からメタノールへの段階グラジエントにより支援した。初期グラジエント 組成物は脱塩水中の１５％メタノールで開始され、３０分毎に脱塩水中の２５％ メタノール、脱塩水中の３５％メタノール、脱塩水中の７０％メタノール、そし て最終的には１００％メタノールと段階的に続いて行った。キサンチンアルカロ イド（カフェインおよびテオブロミン）の溶出に続く溶出物は単一の画分として 集められた。この画分は、キサンチンアルカロイドを含有していない副画分であ って、ＭＭ２ＡからＭＭ２Ｅと命名された５つの副画分を得るために提出された ものを得た。各々の副画分から、溶媒を４５℃でロータリーエバポレーターを部 分真空下で用いて除去した。その結果生じた水相を液体窒素中で凍結させ、ＬＡ ＢＣＯＮＣＯ凍結乾燥システムで一晩凍結乾燥した。画分をしめす代表的なゲル 濾過クロマトグラフィーを図１に示す。この方法により、およそ１００ｍｇの材 料が副画分化された。 図１：粗プロシアニジンのセファデックスＬＨ−２０上でのゲル濾過クロマトグ ラフ クロマトグラフ条件： カラム；２８ ｘ ２．５ｃｍ セファデックスＬＨ− ２０、移動相：メタノール／水段階グラジエント、１５：８５、２５：７５、３ ５：６５、７０：３０、１００：０、１／２時間間隔で段階化した、流速；１． ５ｍｌ／分、検出器；ＵＶ＠λ１＝２５４ｎｍおよびλ２＝３６５ｎｍ、チャー ト速度０．５ｍｍ／分、カラム充填；１２０ｍｇ。 Ｂ．半調製的高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ） 方法１：逆相分離 実施例２および／または３Ａのプロシアニジンは半調製的ＨＰＬＣによって部 分精製された。多様な波長の検出器を備えたヒューレットパッカード１０５０Ｈ ＰＬＣ、１ｍｌ注入ループを有するＲｈｅｏｄｙｎｅ７０１０注入バルブを、フ ァルマシアＦＲＡＣ−１００フラクションコレクターと共に組み立てた。分離は 、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ １０μ ＯＤＳ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ（６０ ｘ １ ０ｍｍ）ガードカラムと連結されたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｕｌｔｒａｃａｒｂ １０μ ＯＤＳカラム（２５０ ｘ ２２．５ｍｍ）上でもたらされた。移動 相組成物は、Ａ＝水；Ｂ＝以下の直線的グラジエント条件で用いられたメタノー ル；［時間、％Ａ］；（０、８５）、（６０、５０）、（９０、０）、および（ １１０、０）、流速５ｍｌ／分。 画分Ｄ＋Ｅ中に存在するプロシアニジンの分離のための代表的な半調製的ＨＰ ＬＣトレースを図１５Ｎに示す。個々のピークおよび選択クロマトグラフ領域を 、時間を決めた間隔または手作業でフラクションコレクターによって、更なる精 製およびそれに続く評価のために収集した。注入充填量は、物質２５−１００ｍ ｇ の範囲にあった。 方法２．順相分離 実施例２および／または３Ａで得られたプロシアニジン抽出物を、半調製的Ｈ ＰＬＣにより部分精製した。ヒューレットパッカード１０５０ＨＰＬＣシステム 、２５４ｎｍでのミリポアウォーターモデル４８０ＬＣ検出器セットを、ピーク モードにセットしたファルマシアＦｒａｃ−１００フラクションコレクターとと もに組み立てた。分離は、Ｓｕｐｅｌｃｏ ５μ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ −Ｓｉ ガードカラム（２０ ｘ ４．６ｍｍ）と連結されたＳｕｐｅｌｃｏ ５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉカラム（２５０ ｘ １０ｍｍ）上で もたらされた。プロシアニジンは以下の条件下での直線的グラジエントで溶出し た：（時間、％Ａ、％Ｂ）；（０、８２、１４）、（３０、６７．６、２８．４ ）、（６０、４６、５０）、（６５、１０、８６）、（７０、１０、８６）続い て１０分間再び平衡化した。移動相組成物はＡ＝ジクロロメタン；Ｂ＝メタノー ル；およびＣ＝酢酸：水（１：１）。流速３ｍｌ／分を用いた。成分を２５４ｎ ｍのＵＶで検出し、Ｋｉｐｐ ＆ Ｚｏｎａｎ ＢＤ４１記録器で記録した。注 入量は、０．２５ｍｌの７０％水性アセトン中に溶解された１０ｍｇのプロシア ニジンの、１００−２５０μｌの範囲であった。代表的な半調製的ＨＰＬＣトレ ースを図１５ Ｏに示す。個々のピークまたは選択されたクロマトグラフ領域を 、時間を決めた間隔で、または手作業でフラクションコレクターにより、更なる 精製およびそれに続く評価のために収集した。 ＨＰＬＣ条件： ２５０ ｘ １０ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉ ｌ ＬＣ−Ｓｉ（５μｍ）半調製的カラム ２０ ｘ ４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（ ５μｍ）ガードカラム 検出器： Ｗａｔｅｒｓ ＬＣ 分光光度計 モデル４８０＠２５４ｎｍ 流速： ３ｍｌ／分 カラム温度： 室温 注入： ２５０μｌの７０％水性アセトン抽出物。 得られた画分は以下のとおり： 実施例４： プロシアニジン抽出物の分析的ＨＰＬＣ分析 方法１： 逆相分離 実施例３により得られたプロシアニジン抽出物を、０．４５μフィルターで濾 過し、ダイオード配列検出器をおよびＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光 検出器備えたヒューレットパッカード１０９０３次ＨＰＬＣシステムにより分析 した。分離は、４５℃で、ヒューレットパッカード ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（２００ ｘ ２．１ｍｍ）上でもたらされた。フラバノールおよ びプロシアニジンを、６０％のＢからＡへの直線的グラジエントにより溶出し、 続いてカラムをＢで流速０．３ｍｌ／分で洗浄した。移動相組成物は、Ｂ＝メタ ノール中の０．５％酢酸で、Ａ＝脱塩水中の０．５％酢酸である。ＡおよびＢ移 動相の酢酸レベルは２％まで増加してもよい。化合物は蛍光によって検出され、 λｅｘ＝２７６ｎｍ、でλｅｍ＝３１６ｎｍであった。（＋）−カテキンおよび （−）−エピカテキンの濃度は標準参照溶液と関連して決定された。プロシアニ ジンレベルを（−）−エピカテキンに対する反応因子を用いて評価した。多様な 成分の分離を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１つのココア遺伝子型に ついて図２Ａに示した。同様のＨＰＬＣ特性が他のココア遺伝子型についても見 られた。 ＨＰＬＣ条件： カラム： ２００ ｘ ２．１ｍｍ ヒューレットパッカード Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳ（５μ） ガードカラム：２０ ｘ ２．１ｍｍヒューレットパッカード Ｈｙｐｅｒｓｉ ｌ ＯＤＳ（５μ） 検出器： ダイオード配列＠２８０ｎｍ 蛍光λｅｘ＝２７６ｎｍ；λｅｍ＝３ １６ｎｍ 流速： ０．３ｍｌ／分 カラム温度： ４５℃ 方法２： 順相分離 実施例２および／または３により得られたプロシアニジン抽出物を、０．４５ μフィルターで濾過し、ダイオード配列検出器をおよびＨＰモデル１０４６Ａプ ログラム可能蛍光検出器備えたヒューレットパッカード１０９０シリーズＩＩＨ ＰＬＣシステムにより分析した。分離は、３７℃で、Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅ ｒｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ ５μ ガードカラム（２０ ｘ ４．６ｍｍ）と連 結された５μ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｓｉｌｉｃａ １００カラム（２５０ ｘ ３．２ｍｍ）によりもたらされた。プロシアニ ジンは以下の条件での直線状グラジエントにより溶出した：（時間、Ａ％、Ｂ％ ）；（０、８２、１４）、（３０、６７．６、２８．４）、（６０、４６、５０ ）、（６５、１０、８６）、（７０、１０、８６）、続いて８分間再び平衡化し た。移動相組成物は、Ａ＝ジクロロメタン、Ｂ＝メタノール、およびＣ＝容量比 で１：１の酢酸：水であった。流速は０．５ｍｌであった。成分を、蛍光により λｅｘ＝２７６ｎｍおよびλｅｍ＝３１６ｎｍで、または２８０ｎｍのＵＶによ り検出した。多様な成分の分離を示す代表的なＨＰＬＣクロマトグラムは、１つ のココア遺伝子型について図２Ｂに示した。同様のＨＰＬＣ特性が他のココア遺 伝子型についても見られた。 ＨＰＬＣ条件： ２５０ ｘ ３．２ｍｍ Ｐｈｅｎｏｍeｎｅｘ Ｌｉｃｈｒ ｏｓｐｈｅｒ Ｓｉｌｉｃａ １００カラム（５μ） ２０ ｘ ４．６ｍｍ Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ ＬＣ−Ｓｉ（５μ） ガードカラム 検出器： フォトダイオード配列＠２８０ｎｍ 蛍光λｅｘ＝２７６ｎｍ；λｅｍ＝３１６ｎｍ 流速： ０．５ｍｌ／分 カラム温度： ３７℃ 実施例５： プロシアニジンの同定 プロシアニジンを、セファデックスＬＨ−２０（２８ ｘ ２．５ｃｍ）カラ ム上での液体クロマトグラフィーで精製し、続いて、１０μ μＢｏｎｄａｐａ ｋ Ｃ１８（１００ ｘ ８ｍｍ）カラムを用いた半調製的ＨＰＬＣまたは５μ Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ ＬＣ−Ｓｉ（２５０ ｘ １０ｍｍ）カラムを用いた 半調製的ＨＰＬＣを行った。 特に精製された単離物は、高速原子衝撃質量分析器（ＦＡＢ−ＭＳ）により、 ＶＧ ＺＡＢ−Ｔ高解像度ＭＳシステム上で、液体２次イオン質量分析器（ＬＳ ＩＭＳ）技術を陽および陰イオンモードで用いて分析した。セシウムイオン銃を イオン化源として３０ｋＶで用い、「Ｍａｇｉｃ Ｂｕｌｌｅｔ Ｍａｔｒｉｘ 」（１：１ ジチオスレイトール／ジチオエリスリトール）をプロトンドナーと して用いた。 これらの画分のＬＳＩＭＳによる分析的調査により、表３に示されている多く のフラバン−３−オールオリゴマーの存在が明らかとなった。 主要な質量断片イオンは、陽および陰イオンの両方のプロシアニジンのＦＡＢ −ＭＳ分析について以前に報告された結果と一致していた（Ｓｅｌｆ ｅｔ ａ ｌ．，１９８６およびＰｏｒｔｅｒ ｅｔａｌ．，１９９１）。ｍ／ｚ ５７７ （Ｍ＋Ｈ）＋に相当するイオンおよびそのｍ／ｚ ５９９（Ｍ＋Ｎａ）＋でのナ トリウム内転は、単離物中に二重結合したプロシアニジンダイマーが存在するこ とを示唆していた。より高度なオリゴマーは、それらのプロトン化分子イオン（ Ｍ＋Ｎａ）＋よりも、より多くのナトリウム内転（Ｍ＋Ｎａ）＋を形成しがちで あることに注意すると興味深い。プロシアニジン異性体Ｂ−２、Ｂ−５およびＣ −１は、 試験的にＲｅｖｉｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）、Ｓｅｌｆ ｅｔ ａｌ． （１９８６）およびＰｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）によって報告され た結果に基づいて同定した。オクタマーおよびデカマーの両方までのプロシアニ ジンを、部分精製画分中にＦＡＢ−ＭＳによって確認した。付加的に、ドデカマ ーまでのプロシアニジンの証拠が、順相ＨＰＬＣ分析から観察された（図２Ｂを 参照）。何れの特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ド デカマーは抽出および精製計画に用いられた溶媒中での溶解性の限界であると信 じられている。表４は、キサンチンアルカロイドを含まない単離物中に見られた プロシアニジンの、逆相ＨＰＬＣ分析に基づいた相対濃度を列挙している。表５ は、順相ＨＰＬＣ分析に基づいたプロシアニジンの相対濃度を列挙している。 図３は、いくつかのプロシアニジン構造を示し、図４Ａ−４Ｅは、以下の抗ガ ンまたは抗新形成活性のスクリーニングで用いられた５つの画分の、代表的なＨ ＰＬＣクロマトグラムを示している。図４Ａ−４ＥのためのＨＰＬＣ条件は以下 のとおりである： ＨＰＬＣ条件： ＨＰモデル１０４６Ａプログラム可能蛍光検出器を備えたヒュ ーレットパッカード１０９０３次ＨＰＬＣシステム。 カラム： ヒューレットパッカード ５μ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＯＤＳカラム（ ２００ ｘ ２．１ｍｍ） ６０％のＢからＡへの直線的グラジエント、流速０ ．３ｍｌ／分 Ｂ＝メタノール中の０．５％酢酸、Ａ＝脱塩水中の０．５％酢酸 、λｅｘ＝２８０ｎｍ，λｅｍ=３１６ｎｍ。 図１５ Ｏは、抗ガンまたは抗新形成活性のスクリーニングで用いられた付加 的な１２の画分の、代表的な半調製的ＨＰＬＣクロマトグラムを示している（Ｈ ＰＬＣ条件は上記と同じ）。実施例６ ココア柚出物の抗ガン、抗腫痛、または抗新形成活性 元々はＭｏｓｍａｎｎ（１９８３）により開発された、ＭＴＴ（３−［４、５ −ジメチルチアゾール−２−イル］−２、５−ジフェニルテトラゾリウムブロミ ド）−マイクロタイタープレートテトラゾリウム細胞毒性アッセイを、実施例５ の試験試料の探索に用いた。試験試料、標準試料（ｃｉｓｐｌａｔｉｎおよびｃ ｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ）およびＭＴＴ試薬を１００％ＤＭＳＯ（ジメチルスル ホキシド）に濃度１０ｍｇ／ｍｌで溶解させた。連続的希釈物をストック溶液か ら調製した。試験試料の場合、希釈は０．０１から１００ｐｇの範囲で０．５％ ＤＭＳＯ中に調製された。 全てのヒト腫瘍細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクションから入手 した。細胞を、１０％胎児ウシ血清、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μ ｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび２４０単位／ｍｌのナイスタチンを含むア ルファＭＥＭ中で単層として増殖させた。細胞は加湿、５％ＣＯ₂雰囲気中で３ ７℃で培養した。 トリプシン化の後で、細胞を計数し５０ ｘ １０⁵細胞／ｍｌの濃度に調製 した（ガン細胞系統によって異なっていた）。２００μｌの細胞懸濁液をウェル に４列の９６ウェルマイクロタイタープレートに注入した。細胞が４時間取付可 能にされた後、２μｌのＤＭＳＯ含有試験試料溶液を、四重に用意したウェルに 添加した。初期投与量反応を見つける実験で、試験試料希釈の規模の桁を用いた ものを、試験する投与量の範囲を決定するために行った。ウェルの５４０ｎｍで の吸光を続いてＢＩＯ ＲＡＤ ＭＰ４５０プレートリーダー上で測定した。四 重に用意された、試験試料で処理されたウェルの吸光度の平均を対照と比較し、 その結果を対照の吸光度のパーセンテージ±標準偏差で表した。ＭＴＴの紫のホ ルマザン生成物への還元は、ウェル中で生きている細胞数と直線的に関連してい る。このように、還元生成物の吸光度を測定することにより、所定の試験試料投 与量における細胞生存のパーセントの定量を行うことができる。対照ウェルは終 濃度で１％のＤＭＳＯを含んでいた。 試料の内の２つは、最初にこの手順により試験した。試料ＭＭ１はココアプロ シアニジンの非常に粗な単離物を代表し、かなりの量のカフェインとテオブロミ ンを含有していた。試料ＭＭ２はゲル濾過クロマトグラフィーによって部分精製 されたココアプロシアニジン単離物を代表していた。ＭＭ２中にはカフェインと テオブロミンは存在しなかった。両方の試料は、以下のガン細胞系統について前 述の手順を用いて活性を検索した。 ＨＣＴ１１６結腸ガン ＡＣＨＮ腎臓アデノカルシノーマ ＳＫ−５メラノーマ Ａ４９８腎臓アデノカルシノーマ ＭＣＦ−７胸部ガン ＰＣ−３前立腺ガン ＣＡＰＡＮ−２膵臓ガン 調べられたガン細胞系統の何れにおいても、ＭＭ１に関しては活性は僅かに見 られるかまたは全く見られなかった。ＭＭ２は、ＨＣＴ−１１６、ＰＣ−３、お よびＡＣＨＮガン細胞系統に対して活性を有することが判明した。しかしながら 、ＭＭ１およびＭＭ２の両方は、ＭＭＴと、生存細胞数の減少を反映する吸光度 の減少を弱めるように干渉することが判明した。この干渉はまた大きな誤差の障 害にも貢献しているが、それは、プレートの周辺にそったウェルの内部で化学反 応がより迅速に進行するように見えるためである。これらの効果の典型例を、図 ５に示した。試験材料の高い濃度において、示された高い生存レベルと比較して 生存の大きな減少を見ることが期待できる。しかしながら、顕微鏡観察によって 、ＭＭＴ干渉効果にもかかわらず、細胞毒性効果が生じていることが判明した。 例えば、ＭＭ２のＡＣＨＮ細胞系統に対する効果の、０．５μｌ／ｍｌのＩＣ５ ０値が、この方式において得られた。 これらの予備的な結果から、本発明者等の見解では、ＭＴＴの干渉を排除する ためにアッセイ手法の補正が必要であった。これは以下のようにして実現した。 加湿、５％ＣＯ₂雰囲気において３７℃で１８時間プレートを保温した後、培地 を注意深く吸引し、新鮮アルファ−ＭＥＭ培地で置換した。この培地をアッセイ の３日目にウェルから再び吸引し、新たに調製した１００μｌのＭｃＣｏｙ培地 で置換した。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中の５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴストック溶 液を１１μｌ、続いて各々のプレートのウェルに添加した。加湿、５％ＣＯ₂雰 囲気において３７℃で４時間保温した後、イソプロパノール中の０．０４Ｎ Ｈ Ｃｌを１００μｌ、プレートの全てのウェルに添加し、続いて混合し、何れかの 生存細胞により生成されたホルマザンを可溶化させた。付加的には、活性を有し ている特定の成分を決定するために、プロシアニジンを副画分化することが決定 された 前述の副画分化の手順を更なる検索のための試料調製のために用いた。図１に 示した範囲および図４Ａ−４Ｅの成分（群）の配分を代表する５つの画分を調製 した。試料は、これらの分析的特徴およびカフェインおよびテオブロミンの不在 を表示するため、ＭＭ２ＡからＭＭ２Ｅとコード化した。 各々の画分を、独立にＨＣＴ−１１６、ＰＣ−３およびＡＣＨＮガン細胞系統 について検索した。その結果は、活性は何れかの特定の画分に集中してはいない ことを示していた。この型の結果は異常ではないと考えられたが、それは「活性 な」天然生産物単離物中の成分は相乗効果的に振る舞うことがありえるからであ る。ココアプロシアニジン単離物（ＭＭ２）の場合は、２０以上の検出可能な成 分が単離物に含まれている。独立した成分（群）に活性が関連しているというよ りは、異なった画分中に存在する成分の組合せに活性が関連している可能性があ ることが考えられた。 これらの結果に基づき、画分を組み合わせて同じガン細胞系統についてアッセ イを繰り返すことを決定した。いくつかの画分の組合せがＰＣ−３ガン細胞系統 に対して細胞毒性を生じさせた。特に、ＭＭ２ＡおよびＭＭ２Ｅの組合せに対す るそれぞれ４０μｇ／ｍｌの、およびＭＭ２ＣおよびＭＭ２Ｅの組合せに対する それぞれ２０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値が得られた。活性はＨＣＴ−１１６および ＡＣＨＮ細胞系統に対しても報告されたが、前回のように、ＭＴＴ指示薬の干渉 により精密な観察は不可能だった。複数回の実験をくり返しＨＣＴ−１１６およ びＡＣＨＮ系統上で行い、データを改善した。しかしながら、これらの結果は細 菌汚染および試験試料材料の疲弊により明確なものではない。図６Ａ−６Ｄはコ コア抽出物とＰＣ−３ガン細胞との間の投与量反応関係を示すものである。 しかしながら、このデータから、ココア抽出物、特にココアポリフェノールま たはプロシアニジン、は、重要な抗腫瘍、抗ガン、抗新形成活性を、特にヒトＰ Ｃ−３（前立腺）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、およびＡＣＨＮ（腎臓）ガン細胞 系統に関して有することは明白である。加えて、これらの結果は特定のプロシア ニジン画分がＰＣ−３細胞系統に対して関与していることを示唆している。実施例７： ココア抽出物（プロシアニジン）の抗ガン、抗腫瘍または抗新形成 活性 上記の発見を確認し、さらに組合せ画分を研究するために、別の包括的なスク リーニングを行った。 全ての調製された材料および手順は、試験投与量毎に四重であった標準を、試 験投与量毎に八重または十二重に増加させた点を除いて、上記の報告と同一であ つた。この研究のために、個々の５個のココアプロシアニジン画分、およびその 組合せを、以下のガン細胞系統について検索した。 ＰＣ−３前立腺 ＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ ＨＣＴ−１１６結腸 ＡＣＨＮ腎臓 ＭＣＦ−７胸部 ＳＫ−５メラノーマ Ａ−５４９肺 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血病 個々のスクリーニングは、異なった投与量レベル（０．０１−１００μｇ／ｍ ｌ）の画分Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ（図４Ａ−４Ｅおよびその検討、前出を参 照されたい）を各々の細胞系統についてアッセイすることから成る。組合せのス クリーニングは、同じ投与量レベルの画分Ａ＋Ｂ、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｄ、Ａ＋Ｅ、Ｂ ＋Ｃ、Ｂ＋Ｄ、Ｂ＋Ｅ、Ｃ＋Ｄ、Ｃ＋Ｅ、およびＤ＋Ｅを、各々の細胞系統につ いて組み合わせることから成る。これらのアッセイからの結果は、独立して検討 し、続いて全体をまとめた。 Ａ．ＰＣ−３前立腺細胞系統 図７Ａ−７Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＰＣ−３細胞系統との間の、典 型的な投与量反応関係を示している。図７Ｄおよび７Ｅは、画分ＤおよびＥが、 ７５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。他のプロシ アニジン画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画分Ｄまた はＥが存在する場合には、６０−８０μｇ／ｍｌの範囲にあった。個々のＩＣ５ ０値は表６に列挙した。 Ｂ．ＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統 図８Ａ−８Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＫＢ鼻咽頭／Ｈｅｌａ細胞系統 との間の、典型的な投与量反応関係を示している。図８Ｄおよび８Ｅは、画分Ｄ およびＥが、７５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している 。図８Ｆ−８Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している 。この場合は、プロシアニジン画分の組合せＡ＋Ｂは効果を有していなかったが 、一方で画分の組合せＢ＋ＥおよびＤ＋Ｅは、６０μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活 性であった。他のプロシアニジン画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩ Ｃ５０値は、画分ＤまたはＥが存在する場合には、６０−８０μｇ／ｍｌの範囲 にあった。個々のＩＣ５０値は表６に列挙した。これらの結果は、ＰＣ−３細胞 系統について得られたものと本質的に同じである。 Ｃ．ＨＣＴ−１１６結腸細胞系統 図９Ａ−９Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＨＣＴ−１１６結腸細胞系統と の間の、典型的な投与量反応関係を示している。図９Ｄおよび９Ｅは、画分Ｅが 、約４００μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性を有していたことを示している。この 値は実在の曲線を外挿して得た。画分Ｄについての投与量反応曲線の勾配もまた 活性を示していることに注意されたい。しかしながら、ＩＤ５０値はこのプロッ トからは得られなかったが、それは曲線の勾配が、信頼できる値を得るためには あまりにも浅いものであったためである。図９Ｆ−９Ｈは、画分の組合せの研究 から得られた代表的な結果を示している。この場合は、プロシアニジン画分の組 合せＢ＋Ｄは認識できる効果を有していなかったが、一方で画分の組合せＡ＋Ｅ およびＤ＋Ｅは、それぞれ５００μｇ／ｍｌ、８５μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活 性であった。他の画分の組合せの投与量反応曲線から得られたＩＣ５０値は、画 分Ｅが存在する場合には平均で約２５０μｇ／ｍｌであった。外挿されたＩＣ５ ０値を表６に列挙した。 Ｄ．ＡＣＨＮ腎臓細胞系統 図１０Ａ−１０Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＡＣＨＮ腎臓細胞系統との 間の、典型的な投与量反応関係を示している。図１０Ａから１０Ｅは、独立の画 分はこの細胞系統については活性を有していないことを示している。図１０Ｆ− １０Ｈは、画分の組合せの研究から得られた代表的な結果を示している。この場 合は、プロシアニジン画分の組合せＢ＋Ｃは活性ではなかったが、一方で画分の 組合せＡ＋Ｅは、５００μｇ／ｍｌのＩＣ５０値で活性であるという結果であっ た。Ｃ＋Ｄの組合せと同様の投与量反応曲線は不活性と考えられたが、それはそ れらの勾配があまりに浅かったからである。その他の画分についての外挿された ＩＣ５０値を表６に列挙した Ｅ．Ａ−５４９肺細胞系統 図１１Ａ−１１Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＡ−５４９肺細胞系統との 間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せか らは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら、 プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない。 Ｆ．ＳＫ−５メラノーマ細胞系統 図１２Ａ−１２Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＳＫ−５メラノーマ細胞系 統との間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組 合せからは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしな がら、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れ ない。 Ｇ．ＭＣＦ−７胸部細胞系統 図１３Ａ−１３Ｈは、ココアプロシアニジン画分とＭＣＦ−７胸部細胞系統と の間の、典型的な投与量反応関係を示している。独立の画分または画分の組合せ からは、アッセイした投与量においては活性は検出されなかった。しかしながら 、プロシアニジン画分はなおもこの細胞系統に関して用途を有するかも知れない 。 Ｈ．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病系統 ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞 白血病系統に対する、本来の典型的な投与量反応 曲線を得た。しかしながら、顕微鏡での細胞数の計数ｖｓ異なった画分濃度での 時間は、５００μｇの画分Ａ、ＢおよびＤが４日間の期間にわたる８０％の増殖 の減少をもたらしたことを示している。代表的な投与量反応関係を図１４に示す 。 Ｉ．まとめ これらのアッセイから得られたＩＣ５０値は、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ Ｔ細胞白血 病を除く全ての細胞系統について、表６に集められて列挙されている。ＣＣＲＦ −ＣＥＭ Ｔ細胞白血病は意図的に表からはずされたが、それは異なったアッセ イの手順を用いたためである。これらの結果の全体的なまとめは、最も高い活性 は画分ＤおよびＥに関連するものであることを示している。これらの画分はＰＣ −３（前立腺）およびＫＢ（鼻咽頭／Ｈｅｌａ）細胞系統に対してもっとも活性 であった。これらの画分はまた、ＨＣＴ−１１６（結腸）およびＡＣＨＮ（腎臓 ）細胞系統に対しても活性であったが、しかし、非常に高い投与量においてのみ であった。ＭＣＦ−７（胸部）、ＳＫ−５（メラノーマ）、およびＡ−５４９（ 肺）細胞系統に対しては活性は検出されなかった。しかしながら、プロシアニジ ン画分はそれでもこれらの細胞系統に関して用途を有しているかもしれない。Ｃ ＣＲＦ−ＣＥＭ（Ｔ細胞白血病）細胞系統に対しても活性が見られた。画分Ｄお よびＥは組成物として最も複雑であることに注意すべきである。しかしながら、 このデータから、ココア抽出物、特にココアプロシアニジン、は、重要な抗腫瘍 、抗ガンまたは抗新形成活性を有していることは明白である。 実施例８ ココア抽出物（プロシアニジン）の抗ガン、抗腫瘍、または抗新形成 活性 いくつかの付加的な生体外アッセイの手順を、実施例６および７で示された結 果を補完し、拡張するために用いた。 方法Ａ．クリスタルバイオレット染色アッセイ 全てのヒト腫瘍細胞系統をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た 。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含む抗生物質を含まないＩＭＥＭ中で単層とし て増殖させた。細胞を加湿、５％ＣＯ₂雰囲気中で３７℃で維持した。 トリプシン化の後、細胞を計数し、濃度を１００μｌあたり１０００−２００ ０細胞に調節した。細胞拡散を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に細胞 をプレートする（ウェルあたり１０００−２０００細胞）ことにより決定した。 ウェルあたり１００μｌの細胞を添加した後、細胞を２４時間取付可能とした。 ２４時間の期間の終りには、多様なココア画分を異なった濃度で、投与量反応結 果を得るために添加した。ココア画分を２倍の濃度で培地中に溶解させ、各々の 溶液の１００μｇを、三重に用意したウェルに添加した。連続した日に、プレー トを５０μｌのクリスタルバイオレット（１２５ｍｌのメタノール、３７５ｍｌ の水に溶解された２．５ｇのクリスタルバイオレット）で１５分間染色した。染 色液を除き、プレートを穏やかに冷水に浸し、過剰の染色を除去した。洗浄をさ らに２回くり返し、プレートを乾燥させた。残存している染色は１００μｌの０ ．１Ｍクエン酸ナトリウム／５０％エタノールを各々のウェルに添加することに より可溶化した。可溶化の後、細胞の数をＥＬＩＳＡプレートリーダー上で５４ ０ｎｍで定量化した（参照フィルターは４１０ｎｍ）。ＥＬＩＳＡリーダーから の結果は、ｙ軸に吸光度、ｘに日数としてグラフ化した。 方法Ｂ．軟寒天クローニングアッセイ Ｎａｗａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８１）によって記述された方法に従って、 細胞を軟寒天中にクローン化した。単一の細胞懸濁液を、０．８％寒天を含む培 地中に様々な濃度のココア抽出物と共に生成した。懸濁液は１．０％寒天を含有 する培地でコートされた３５ｍｍのディッシュ分配した。１０日間の保温の後、 直径６０μｍ以上のコロニーの数を、Ｏｍｉｃｒｏｎ ３６００イメージ分析シ ステム上で計数した。この結果は、ｙ軸上にコロニーの数、そしてココア画分の 濃度をｘ上にプロットした。 方法Ｃ．ＸＴＴマイクロカルチャー テトラゾリウムアッセイ Ｓｃｕｄｉｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（１９８８）によって記載されたＸＴＴアッ セイの手順を、多様なココア画分の検索のために用いた。ＸＴＴアッセイは、以 下の変更を除いては、実質的には記載されたＭＴＴを用いた手順（実施例６）と 同じである。ＸＴＴ（（２、３−ビス（２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホ フェニル）−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウムヒ ドロキシド）を、１ｍｇ／ｍｌで血清を含まない培地で調製し、３７℃で前加熱 した。ＰＭＳを５ｍＭ ＰＢＳで調製した。ＸＴＴおよびＰＭＳは共に混合した ；１０μｌのＰＭＳを１ｍｌあたりのＸＴＴ、および５０μｌのＰＭＳ−ＸＴＴ を各々のウェルに添加した。３７℃で４時間の保温の後、プレートを３０分間、 機械式振とう機で混合し、４５０−６００ｎｍの吸光度を測定した。結果を、吸 光度をｙ軸に、増殖日数または濃度をｘにプロットした。 方法ＡおよびＣについては、結果はまた、パーセント対照をｙ軸に、増殖日数 または濃度をｘにしてプロットした。 ＸＴＴおよびクリスタルバイオレットアッセイ手順比較を、ココア画分Ｄ＆Ｅ （実施例３Ｂ）を胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７ ｐ１６８に対して行い、どのア ッセイが最も敏感であるか決定した。図１５Ａに示されたとおり、両方のアッセ イは、濃度＞７５μｇ／ｍｌでは同じ投与量反応効果をしめした。この値より小 さい濃度では、クリスタルバイオレットはＸＴＴアッセイの結果よりも高い標準 偏差を示した。しかしながら、クリスタルバイオレットアッセイはより容易に用 いることが出来るので、全てのこの後のアッセイは、特に断らないかぎり、この 手順により行った。 クリスタルバイオレットアッセイの結果は示されているが（図１５Ｂ−１５Ｅ ）、粗ポリフェノール抽出物（実施例２）の、胸部ガン細胞系統ＭＤＡ ＭＢ２ ３１、前立腺ガン細胞系統ＰＣ−３、胸部ガン細胞系統ＭＣＦ−７ ｐ１６３、 および子宮ガン細胞系統Ｈｅｌａそれぞれに対する効果を表している。全ての場 合において、２５０μｇ／ｍｌの投与量は完全に全てのガン細胞の増殖を、５− ７日の期間にわたって阻害した。Ｈｅｌａ細胞系統はこの抽出物に対して最も感 受性であるように見えたが、それは１００μｇ／ｍｌの投与量でもまた生育を阻 害したからである。実施例３Ｂ由来のココア抽出物はまた、Ｈｅｌａおよび他の 胸部ガン細胞系統ＳＫＢＲ−３に対してアッセイした。結果（図１５Ｆおよび図 １５Ｇ）は、画分Ｄ＆Ｅが最も高い活性を有していることを示している。図１５ Ｈおよび１５Ｉに示されているとおり、約４０μｇ／ｍｌのＤ＆ＥのＩＣ５０値 が両方のガン細胞系統に対して得られた。 ココア画分Ｄ＆Ｅはまた、試験化合物（群）の固定独立増殖を阻害する能力を 決定するための軟寒天クローングアッセイにおいてもまた試験された。図１５Ｊ に示されているとおり、１００μｇ／ｍｌの濃度でＨｅｌａ細胞のコロニー形成 を完全に阻害した。 ３種類のココア園芸種を代表している、８種類の異なったココア遺伝子型から 得られた粗フェノール抽出物についてもまた、Ｈｅｌａ細胞に対してアッセイし た。図１５Ｋに示されているように、全ての多様なココアは同様の投与量反応効 果を示した。ＵＩＴ−１種はＨｅｌａ細胞に関して最も高い活性を示した。これ らの結果は、全てのココア造伝子型が、地理的起源、園芸種および遺伝子型とは 独立に、少なくとも１つのヒトガン細胞系統に対して活性を誘導するポリフェノ ール画分を有していることを示している。 別の一連のアッセイを、１トンスケールの、ブラジルココア豆の伝統的な５日 間の発酵で、その後４日間の太陽乾燥段階を行ったものから、毎日の基本として 調製された粗ポリフェノール抽出物について行った。図１５Ｌに示された結果は 、これらの初期処理工程の明白な影響を示しておらず、ポリフェノールの成分の わずかな変化を示唆していた。しかしながら、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐ ＰＯ）が発酵工程の間にポリフェノールを酸化することが知られている（Ｌｅｈ ｒｉａｎ ａｎｄ Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、１９８３）。酵素的に酸化されたポリ フェノールが活性にどのような効果を有するかを決定するために、別の実験を行 った。粗ＰＰＯを、細かく粉砕された、発酵されていない、凍結乾燥され、脱脂 されたブラジルココア豆を、１ｇの粉末に対して１０ｍｌのアセトンで抽出する ことにより調製した。スラリーを３０００ｒｐｍで１５分間遠心した。これを３ 回くり返し、上清をその度に廃棄し、ブフナー漏斗を通して注いだ４回目の抽出 を行った。アセトン粉末は空気乾燥され、続いてＭｃＬｏｒｄ ａｎｄ Ｋｉｌ ａｒａ（１９８３）によって記述された手順に従ってアッセイした。粗ポリフェ ノール溶液（１００ｍｇ／１０ｍｌクエン酸−リン酸バッファー、０．０２Ｍ、 ｐＨ５．５）に、１００ｍｇのアセトン粉末（４０００μ／ｍｇタンパク質）を 添加し、スラリー中を泡立たせた空気流とともに３０分間撹拌した。この試料を 、５０００ｇで１５分間遠心し、上清を３回２０ｍｌ酢酸エチルで抽出した。酢 酸エチル抽出物を統合し、部分的真空下で蒸留し乾燥させ、５ｍｌの水を添加し 、続いて凍結乾燥を行った。物質を続いてＨｅｌａ細胞に対してアッセイし、投 与量反応を酵素的に処理されていない粗ポリフェノール抽出物と比較した。結果 （図１５Ｍ）は、酵素的に酸化された抽出物の投与量反応曲線は顕著に変化して いることを示し、酸化された生成物はそれらの天然型よりも阻害的であることを 示した。実施例９： プロシアニジンを含むココア抽出物の抗酸化剤活性 文献中の証拠は、天然に生成される抗酸化剤（ビタミンＣ、Ｅ、およびＢ−カ ロテン）の消費と、ガンを含む病気の低減された発生率との関係を示唆している （Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｆｏｏｄｓ、１９９３；Ｃａｒａｇａｙ、１９９２）。 これらの抗酸化剤は、いくつかの腫瘍成長の型に関与している、特定の酸化的で フリーラジカル工程に影響すると一般に考えられている。付加的には、抗ガン原 性であることが示されているいくつかの植物ポリフェノール性化合物は、実質的 な抗酸化剤活性もまた有している（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。 プロシアニジンを含むココア抽出物が抗酸化剤活性を有するか否かを決定する ために、標準的なＲａｎｃｉｍａｔ法を用いた。実施例１、２および３に記載さ れた手順を、ココア抽出物を調製するために用い、抽出物をさらに２つのゲル濾 過由来の画分を生成させるために操作した。これらの２つの画分は実際には画分 ＡからＣを統合したもの、およびＤとＥ（図１を参照）であり、それらの抗酸化 剤特性を、合成抗酸化剤ＢＨＡおよびＢＨＴと比較した。 ローストされていないピーナツから、皮を除去してピーナツ油をプレスした。 各々の試験化合物は、各々試験化合物を、１００ｐｐｍ程度と２０ｐｐｍ程度の ２つのレベルで（実際のレベルは表７中に示されている）油中に添加した。５０ μｌのメタノール可溶化抗酸化剤を、各々の試料に抗酸化剤の分散を補助するた めに添加した。抗酸化剤を含まない５０μｌのメタノールを有する対照試料を調 製した。 試料を、酸化安定性に関して、１００℃で２０ｃｃ／分の空気でのＲａｎｃｉ ｍａｔ安定性試験を用いて二重に評価した。実験的変数は活性酸素法（ＡＯＭ） またはＳｗｉｆｔ安定性試験（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１ ）について用いられたものと対応させて選択した。典型的なＲａｎｃｉｍａｔト レースは図１６に示されている。結果を表８に、１００ｍｅｇの過酸化物レベル に達するために必要な時間として報告する。 これらの結果は、試験された全ての添加物について、ピーナツ油の増加した酸 化安定性を示した。酸化安定性の最も高い増加は、ココアの酢酸エチル粗抽出物 を添加した試料によって実現された。これらの結果は、プロシアニジンを含むコ コア抽出物は、同じ量の合成ＢＨＡまたはＢＨＴと同等かまたはそれ以上の抗酸 化的潜在性を有することを示している。従って、本発明は、例えば抗酸化剤およ び／または食品添加物等の公知のＢＨＡまたはＢＨＴの用途においてＢＨＡまた はＢＨＴに代わって用いられ得る。そして、この点に関して、本発明は食品の給 源由来であることにも注意すべきである。これらの得られた結果から、当業者は 、そのような「ＢＨＡまたはＢＨＴ」の用途における本発明の好適な量、例えば 食品への添加量を、実験によらずに容易に決定できる。実施例１０： トポイソメラーゼＩＩ阻害の研究 ＤＮＡトポイソメラーゼＩおよびＩＩは、ＤＮＡ鎖の開裂および再結合を触媒 し、それによりＤＮＡの位相的状態を制御している酵素である（Ｗａｎｇ，１９ ８５）。細胞内のトポイソメラーゼの機能の研究に加え、最も重要な発見の１つ は、トポイソメラーゼＩＩが、介在物質（ｍ−ＡＭＳＡ、Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ （登録商標）およびエリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）並びに非介在エピ ポドフィロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）を含む数多く の診療において重要な抗腫瘍化合物に対する主要な細胞内標的として同定された ことである（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。いくつかの証拠 の系統が、いくつかの抗腫瘍薬が、変性剤へさらすとＤＮＡの分解という結果と なるＤＮＡ−トポイソメラーゼＩＩ複合体（分解複合体）を安定化するという共 通の特性を有することを示している（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８９） 。抗腫瘍薬による分解複合体形成は、細胞死につながりうる巨大ＤＮＡ反転をも たらすことが提唱されている。 この魅力的なモデルに従えば、特定のＤＮＡトポイソメラーゼＩＩ分解複合体 の新規な誘導剤が、抗ガン、抗腫瘍、抗新形成剤として有用である。細胞毒性化 合物を、標的ＤＮＡの活性により同定する試みにおいて、ココアプロシアニジン を、いくつかのＤＮＡ損傷感受性細胞系統に対する促進された細胞毒性活性およ びリンパ腫から得られたヒトトポイソメラーゼＩＩでの酵素アッセイに関して検 索した。 Ａ．キネトプラストＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩによる鎖分解（ｄｅｃａｔ ｅｎａｔｉｏｎ Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）に記載されている、キネトプラスト ＤＮＡのトポイソメラーゼＩＩの鎖分解の生体外での阻害を以下のように行った 。トポイソメラーゼＩＩ活性を含む核抽出物を、ヒトリンパ腫からＭｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８１）およびＤａｎｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）の方法 を変更して抽出した。精製酵素の１単位は０．２５μｍｏｌのキネトプラストＤ ＮＡを３４℃で３０分間に鎖分解する（ｄｅｃａｔｅｎａｔｅ）ために十分なも のである。キネトプラストＤＮＡは、トリパノソーマ類Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ ｆ ａｓｃｉｃｕｌａｔａから得た。各々の反応は、１９．５μｌＨ₂Ｏ、２．５μ ｌ １０ｘバッファー（１ｘバッファーは、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ ８．０、１２０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭ ＡＴＰ、０ ．５ｍＭジチオスレイトールおよび３０μｇ ＢＳＡ／ｍｌを含む）、１μｌキ ネトプラストＤＮＡ（０．２μｇ）、および、１μｌの、様々な濃度での、ＤＭ ＳＯ 含有ココアプロシアニジン試験画分を含む０．５ｍｌマイクロ遠心チューブ中で 行った。この組合せを、完全に混合し氷上に保存した。１単位のトポイソメラー ゼを、３４℃で３０分間ウォーターバス中で保温する直前に添加した。 保温に続いて、鎖分解アッセイは５μl停止バッファー（５％サルコシル、０ ．００２５％ブロモフェニルブルー、２５％グリセロール）の添加により停止さ せ、氷上に静置した。ＤＮＡを、エチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）を含 むＴＡＥバッファー中の１％アガロースゲル上で電気泳動させた。波長３１０ｎ ｍでの紫外線発光により、ＤＮＡを可視化した。ポラロイドランドカメラを用い てゲルを撮影した。 図１７は、これらの実験の結果を示している。完全に鎖形成されたキネトプラ ストＤＮＡは１％アガロースゲル中で移動しない。キネトプラストＤＮＡのトポ イソメラーゼＩＩによる鎖分解は、ゲル中で移動するモノマ−ＤＮＡ（モノマー サークル、Ｉ型およびＩＩ型）を生じさせる。ココアプロシアニジンの添加によ る酵素の阻害は、増加する濃度の関数としてのモノマーバンドの増加的な消失か ら明らかである。これらの結果に基づいて、ココアプロシアニジン画分Ａ、Ｂ、 Ｄ、およびＥは、０．５から５．０μｇ／ｍｌの範囲にある濃度でトポイソメラ ーゼＩＩの阻害を示した。これらの阻害剤濃度は、ミトキサントロン（ｍｉｔｏ ｘａｎｔｈｒｏｎｅ）およびｍ−ＡＭＳＡ（４’−（９−アクリジニルアミノ） メタンスルホン−ｍ−アニシジド）について得られたものと非常に類似したもの であった。 Ｂ．薬剤感受性細胞系統 ココアプロシアニジンを、いくつかのＤＮＡ損傷感受性細胞系統に対して検索 した。これらの細胞系統の１つは、Ｐ．Ｊｅｇｇｏによって開発されたｘｒｓ− ６ＤＮＡ二本鎖修復変異体である（Ｋｅｍｐ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ｘｒ ｓ−６細胞系統のＤＮＡ修復欠損は、それら自身を、Ｘ照射、ＤＮＡ二本鎖形成 を直接破壊するブレオマイシン等の化合物、およびトポイソメラーゼＩＩを阻害 し、それにより間接的に二本鎖を破壊するＷａｒｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９ ９１）によって提唱された化合物に対して特に感受性であるものとする。修復欠 損系統に対しての細胞毒性を、ＤＮＡ修復能力の高いＣＨＯ系統、ＢＲ１に対す る細胞 毒性と比較した。修復欠損（ｘｒｓ−６）系統に対しての促進された細胞毒性を 、ＤＮＡ分解二本鎖破壊の形成に対する証拠として解した。 ＤＮＡ修復可能ＣＨＯ系統、ＢＲ１は、Ｂａｒｒｏｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９ ８７）によって開発され、Ｏ⁶−アルキルグアニン−ＤＮＡ−アルキルトランス フェラーゼを、通常のＣＨＯ ＤＮＡ修復酵素に加えて発現する。ＣＨＯ二本鎖 破壊修復欠損系統は、Ｐ．Ｊｅｇｇｏ博士およびその共同研究者（Ｊｅｇｇｏ ｅｔ ａｌ．，１９８９）からの寛大なる贈り物である。これらの両方の系統を アルファ−ＭＥＭ含有血清および抗生物質中で実施例６に記載のとおりに単層と して増殖させた。細胞は加湿５％ＣＯ₂雰囲気下で維持した。ココアプロシアニ ジン処理の前に、単層として増殖させた細胞をトリプシン処理により引き離した 。実施例６に記載されているＭＴＴアッセイの手順を用いたアッセイを行った。 その結果は（図１８）、ｘｒｓ−６に対する促進された細胞毒性はみられない ことを示し、ココアプロシアニジンは分解二本鎖破壊形成とは異なった方式でト ポイソメラーゼＩＩを阻害したことを示唆していた。即ち、ココアプロシアニジ ンは、トポイソメラーゼＩＩと、それがＤＮＡと相互作用し非分解型複合体を形 成する前に相互作用する。 非分解型複合体形成化合物は比較的新しい発見である。アントラサイクリン（ ａｎｔｈｒａｃｙｃｌｉｎｅ）、ポドフィリンアルカロイド（ｐｏｄｏｐｈｙｌ ｌｉｎ ａｌｋａｌｏｉｄ）、アントラセネジオン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅｄｉ ｏｎ）、アクリジンおよびエリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）の同類は、 全て臨床用の抗ガン、抗腫瘍または抗新形成のための使用が是認されており、そ れらは分解型複合体を形成する（Ｌｉｕ、１９８９）。いくつかの新しいクラス の、分解型複合体を形成するようには見えないトポイソメラーゼＩＩ阻害剤が近 年同定されてきた。これらには、アモナフィド（ａｍｏｎａｆｉｄｅ）（Ｈｓｉ ａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、ディスタマイシン（ｄｉｓｔａｍｙｃｉｎ ）（Ｆｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、フラバノイド（ｆｌａｖａｎｏｉ ｄ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９０）、サイントピン（ｓａｉ ｎｔｏｐｉｎ）（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、メンブラノ ン（ｍｅｍｂｒａｎｏｎｅ）（Ｄｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、テルペ ノイド（ｔ ｅｒｐｅｎｏｉｄ）（Ｋａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９１）、アントラピラ ゾール（ａｎｔｈｒａｐｙｒａｚｏｌｅ）（Ｆｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５） 、ジオキソピペラジン（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９９１）およびマリン アクリジン−デルシチン（ｍａｒｉｎｅ ａｃｒｉｄｉｎｅ−ｄｅｒｃｉｔｉｎ ）（Ｂｕｒｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９）が含まれる。 ココアプロシアニジンは、分解性複合体が形成される前にトポイソメラーゼＩ Ｉを不活性化するので、それらは単独で、または公知で機構的に決定されている トポイソメラーゼＩＩインヒビターと組み合わせて、化学治療法的価値を有する 。付加的には、ココアプロシアニジンはまた、新規クラスのトポイソメラーゼＩ Ｉインヒビターであるように見え（Ｋａｓｈｉｗａｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９ ３）、そしてそれ故に他の公知のインヒビターよりも細胞に対して毒性が少なく 、それによりそれらの化学治療法における用途を拡大している。 膜結合糖タンパク質（ｇｐ１７０）を発現し複数の薬剤耐性を付与するヒト胸 部ガン細胞系統ＭＣＦ−７（ＡＤＲ）、およびその親系統ＭＣＦ−７ ｐ１６８ を、ココア画分ＤおよびＥの効果をアッセイするために用いた。図１９に示され るように、親系統は増加されたレベルでの画分ＤおよびＥで阻害されたが、一方 でアドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；ＡＤＲ）耐性の系統は高い投与量 では影響は少なかった。これらの結果は、ココア画分ＤおよびＥは複数の薬物耐 性細胞系統に効果を有することを示している。実施例１１： プロシアニジンの合成 プロシアニジンの合成を、Ｄｅｌｃｏｕｒ ｅｔ ａｌ．（１９８３）によっ て開発された手順に従って、変更を加えて行った。（＋）−カテキンをジヒドロ ケルセチンとともに還元的条件下で濃縮することに加え、（−）−エピカテキン もまた、発酵されていないココア豆中に天然にもたらされる（−）−エピカテキ ンの高濃度を反映させるために用いた。合成生成物を単離し、精製し、分析し、 実施例３、４および５に記載されている手順により同定した。このやり方により 、ビフラバノイド、トリフラバノイドおよびテトラフラバノイドを調製し、分析 用標準試料として、上記の方式でココア抽出物に関して用いた。実施例１２： 順相半調製画分のアッセイ ポリフェノール抽出物は組成物として複雑であるので、更なる精製、投与量反 応アッセイ、および包括的な構造の同定のために、どの成分がガン細胞に対して 活性であるのかを決定する必要があった。順相半調製ＨＰＬＣ分離（実施例３Ｂ ）をココアプロシアニジンをオリゴマーの大きさに基づいて分離するために用い た。元々の抽出物に加え、１２の画分を調整し（図２Ｂおよび１５ Ｏ）、１０ ０μｇ／ｍｌおよび２５μｇ／ｍｌの投与量でＨｅｌａ細胞に対して、どのオリ ゴマーが最大の活性を有しているかを決定するためにアッセイした。図２０に示 されているように、画分４−１１は（ペンタマーからドデカマー）は、約２５μ ｇ／ｍｌのＩＣ５０値を示した。これらの結果は、これらの特定のオリゴマーが 、Ｈｅｌａ細胞に対する最大の活性を有していることを示した。付加的には、コ コア画分ＤおよびＥの順相ＨＰＬＣ分析により、この画分がこれらのオリゴマー を豊富に有することが示された。 上記から、本発明の、抽出物およびココアポリフェノール、並びに組成物、方 法およびキットは用途を有していることは明らかである。この見地から、本発明 は、食料品由来であり、生体外で示された活性は、少なくともいくつかの活性は 生体内で、特に上記の投与量を考慮して示され得るといえる。 付加的には、これまでの記述は、抽出物およびココアポリフェノール、ならび に組成物、方法およびキットは、ＢＨＴおよびＢＨＡに類似した抗酸化剤活性を 、酸化安定性と同様に有していることを示している。このように、本発明は、例 えば抗酸化食品添加物等の抗酸化剤等の公知のＢＨＡ、ＢＨＴの用途においてＢ ＨＴまたはＢＨＡに代わって用いられることができる。本発明はまた、トポイソ メラーゼ阻害剤として、現在そのために知られている用途において用いられるこ とができる。従って、本発明によって想像できる組成物および方法が数多く存在 する：例えば、抗酸化剤または保存用組成物、トポイソメラーゼ阻害組成物、食 品または何れかの所望の品の、酸化等からの保存方法、およびトポイソメラーゼ 阻害のための方法であって、抽出物および／またはココアポリフェノールを含有 するもの、または、食品、品物またはトポイソメラーゼをそれぞれの組成物即ち 抽出物および／またはココアポリフェノール（群）と接触させることから成るも のの何れか、等である。 このように詳細に、好ましい本発明の態様を記述してきたが、添付の請求の範 囲により定義された本発明は、上記の記述中に示された特定の詳細に限定される ものではなく、本発明の範囲および精神から離れるものではない数多くのその変 化体があり得ることは理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 バック，マーガレット エム アメリカ合衆国 ニュージャージー州 07960 モリスタウン レイク ヴァレイ ロード 126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ココアポリフェノール（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物。 ２．ココア豆を粉末に還元すること、 粉末を脱脂すること、および 粉末からココアポリフェノール（群）を抽出および精製すること、 から成る工程により調製される請求の範囲第１項記載の抽出物。 ３．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、 豆およびパルプを凍結乾燥すること、 凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、 凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および 脱穀された豆を粉砕すること、 から成ることを特徴とする請求の範囲第２項記載の抽出物。 ４．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体 クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むこと を特徴とする請求の範囲第２または３項記載の抽出物。 ５．（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジ ンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニ ジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンの ポリフェノール（群）を含有することを特徴とする請求の範囲第４項記載の抽出 物。 ６．実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）およ び好適な担体から成る抗新形成性組成物。 ７．ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココア抽出物を含むこと を特徴とする請求の範囲第６項記載の抗新形成性組成物。 ８．前記ココアプロシアニジン（群）が、 ココア豆を粉末に還元すること、 粉末を脱脂すること、および 粉末からココアポリフェノール（群）を抽出すること、 から成る工程により調製される請求の範囲第７項記載の抗新形成性組成物。 ９．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、 豆およびパルプを凍結乾燥すること、 凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、 凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および 脱穀された豆を粉砕すること、 から成ることを特徴とする請求の範囲第８項記載の抗新形成性組成物。 10．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体 クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むこと を特徴とする請求の範囲第８または９項記載の抗新形成性組成物。 11．（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２のプロシアニジ ンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２およびプロシアニ ジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプロシアニジンの ポリフェノール群を含有することを特徴とする請求の範囲第１０項記載の抗新形 成性組成物。 12．有効量の実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（ 群）および好適な担体から成る抗新形成性組成物を患者に投与することから成る 、抗新形成剤で治療の必要のある患者を治療する方法。 13．前記抗新形成剤が、ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココ ア抽出物を含むことを特徴とする請求の範囲第１２項記載の方法。 14．前記ココアポリシアニジン（群）が、 ココア豆を粉末に還元すること、 粉末を脱脂すること、および 粉末からココアポリフェノール（群）を抽出すること、 から成る工程により調製されることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の 方法。 15．前記ココア豆を粉末に還元する工程が、 豆およびパルプを凍結乾燥すること、 凍結乾燥された塊を脱パルプ化すること、 凍結乾燥されたココア豆を脱穀すること、および 脱穀された豆を粉砕すること、 から成ることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の方法。 16．前記工程が、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび／または調製用高性能液体 クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により抽出物を精製することをさらに含むこと を特徴とする請求の範囲第１４または１５項記載の抗新形成性組成物。 17．前記抽出物が、（−）−エピカテキン、プロシアニジンＢ−２、４から１２ のプロシアニジンオリゴマー、プロシアニジンＢ−５、プロシアニジンＡ−２お よびプロシアニジンＣ−１から成る群から選択された少なくとも１つのココアプ ロシアニジンのポリフェノール（群）を含有することを特徴とする請求の範囲第 １６項記載の抗新形成性組成物。 18．実質的に純粋なココア抽出物もしくは合成ココアポリフェノール（群）およ び好適な担体から成る、抗新形成剤で治療の必要のある患者を治療するためのキ ット。 19．前記抗新形成剤が、ココアプロシアニジン（群）を含む実質的に純粋なココ ア抽出物を含み；前記キットが原料の混合および／または患者への投与のための 指示書を含むことを特徴とする請求の範囲第１８項記載のキット。 20．実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリフェノール（群）を含む ことを特徴とする凍結乾燥された抗新形成性組成物。 21．前記組成物が実質的に純粋なココア抽出物を含むことを特徴とする請求の範 囲第２０項記載の凍結乾燥された抗新形成性組成物。 22．請求の範囲第１項記載の実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリ フェノール（群）を含む抗酸化性または保存性組成物。 23．請求の範囲第１項記載の実質的に純粋なココア抽出物または合成ココアポリ フェノール（群）を含むトポイソメラーゼ阻害性組成物。 24．品物を請求の範囲第２２項記載の組成物と接触させることから成る、所望の 品物を保存または酸化から防護するための方法。 25．前記品物が食品であることを特徴とする請求の範囲第２４項記載の方法。 26．請求の範囲第２３項記載の組成物とトポイソメラーゼを接触させることから 成るトポイソメラーゼを阻害するための方法。