KR100591953B1 - 항신생물코코아추출물과그의제조방법및이용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 폴리페놀 또는 프로시아니딘과 같은 코코아 추출물과 이 추출물의 제조방법 및 그의 용도, 특히 항신생물제와 항산화제로서의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 코코아 폴리페놀 또는 프로시아니딘을 함유하는 항신생물 조성물과 이 조성물을 적용하는 환자 치료방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 코코아 폴리페놀 또는 프로시아니딘을 함유하는 항신생물제, 그리고 코코아 폴리페놀 또는 프로시아니딘을 함유하는 친액화된 항신생물 조성물로 치료가 필요한 환자를 치료하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 항산화제, 방부제, 및 토포아이소머라제-억제 조성물로의 이용 및 그 방법에 관한 것이다.

Description

항신생물 코코아 추출물과 그의 제조방법 및 이용

발명의 분야

본 발명은 폴리페놀, 바람직하게는 프로시아니딘(procyanidins)이 강화된 폴리페놀과 같은 코코아 추출물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 그러한 추출물의 제조방법 및 그의 이용, 예를 들면 항신생물제(antineoplastic agents) 및 항산화제로서의 이용에 관한 것이다.

본 명세서에서는 명세서 말미의 청구범위 앞부분의 참고문헌 란에 전체적인 목록이 기재되어 있는 문헌들이 인용된다. 이들 문헌들은 본 발명의 분야에 속하는 것들이며, 여기서 인용된 문헌들은 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다.

발명의 배경

폴리페놀은 식품에 속하는 종류를 포함한 다양한 식물들에 널리 존재하는 매우 다양한 그룹의 화합물이다(Ferreira et al., 1992). 어떤 경우에는 이들은 사람의 다이어트를 위한 중요한 부류의 화합물로 대표된다. 폴리페놀중 어떤 종류는 영양적이지 못한 것으로 여겨지지만, 이들 화합물이 건강에 미치는 이로운 영향 때문에 관심의 대상이 되기도 한다. 예를 들면, 쿼세틴(일종의 후라보노이드)은 동물실험에서 항암활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Deshner et al,,1991 및 Kato et al., 1983). (+)-카테킨과 (-)-에피카테킨(후라본-3-올)은 백혈병 바이러스 역전사효소 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다(Chu et al., 1992). 노보타닌(가수분해성 올리고머 탄닌의 일종)은 항종양 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Okuda et al., 1992). 또한 통계학적인 보고에 의하면 일본의 차 생산 지역에서는 위암 사망율이 상당히 낮은 것으로 발표되었다. 에피갈로카테킨 갈레이트는 마우스 피부종양을 억제하는 녹차중의 약리학적 활성 물질인 것으로 보고되었다(Okuda et al., 1992). 엘라긴 산(ellagic acid)도 다양한 동물 종양 모델들에 대해 항암 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다(Bukharta et al., 1992). 최근에는 프로안토시아니딘 올리고머가 항돌연변이원으로서의 용도로 키코만 코포레이션에 의해 특허되었다. 실제로 최근에 202회 아메리칸 케미칼 소사이어티 내셔날 미팅에서, 식품내의 페놀성 화합물의 분포와 실험 동물 모델들에서 이들 화합물들에 의한 종양 발달의 조절에 대해 발표되었다(Ho et al., 1992; Huang et al., 1992).

그러나 이러한 보고들중 어느 것도 코코아 추출물과 그의 제조방법 또는 코코아 추출물의 항신생물제로서의 용도에 관해서 개시 또는 제안하고 있지 않다.

미발효된 코코아 열매는 상당량의 폴리페놀을 함유하기 때문에 본 발명자들은 코코아 추출물, 예를 들면 코코아내의 화합물들의 유사한 활성과 그 용도는 코코아로 부터 그러한 화합물들을 추출하고 그 추출물의 활성을 스크린함으로써 밝혀질 수 있을 것으로 생각했다. 내셔날 암 인스티튜트는 대규모의 천연물 조사 프로그램의 일환으로 항암 활성에 대해 다양한 테오브로마(Theobroma)와 헤라니아(Herrania) 종들을 스크린했다.

코코아 조직 추출물의 일부에서 낮은 수준의 활성이 있는 것으로 보고되었으나, 이에 대한 더 이상의 연구는 진행되지 않았다. 따라서 항신생물 또는 항암 분야에서 코코아와 그 추출물은 유용하지 않은 것으로 여겨졌다; 즉, 항신생물 또는 항암 분야에서의 가르침은 당분야 기술자들로 하여금 암치료 용도로서의 코코아와 그 추출물의 적용에 관심을 갖지 않게끔 유도하게 되었다. 코코아 폴리페놀의 향기 발산에 대한 기여도를 연구하기 위한 여러 분석과정들이 개발되었기 때문에(Clapperton et al., 1992), 본 발명자들은 항신생물 또는 항암 분야에서의 통념에 반하여 항암 스크리닝 샘플을 제조하기 위해 유사한 방법들을 적용하기로 결정하였다. 놀랍게도, 그리고 당분야의 지식, 예를 들면 내셔날 암 인스티튜트의 스크리닝 결과와는 반대로, 본 발명자들은 프로시아니딘을 함유하는 코코아 폴리페놀 추출물은 항암 또는 항신생물제로서 매우 유용하다는 것을 밝혀내게 되었다. 또한 본 발명자들은 프로시아니딘을 함유하는 코코아 추출물은 항산화제로서도 유용하다는 것을 밝혀내었다.

발명의 목적 및 요약

본 발명의 목적은 코코아 추물물을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 코코아 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 항산화제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 활성의 억제를 증명하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 종양 또는 암의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암, 항종양 또는 항신생물 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 항암, 항종양 또는 항신생물 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

그리고 본 발명의 목적은 종양 또는 암의 치료에 사용되는 키트(kit)를 제공하는 것이다.

놀랍게도 코코아 추출물은 항종양, 항암 또는 항신생물 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다; 또는 코코아 추출물은 항산화제 조성물이고, 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 활성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 또한 본 발명은 실질적으로 순수한 코코아 추출물을 제공한다. 본 발명의 추출물은 바람직하게는 코코아 프로시아니딘(들)로 강화된 폴리페놀(들); (-)에피카테킨, 프로시아니딘 B-2, 2 내지 12단위 바람직하게는 2 내지 5 또는 4 내지 12 단위로 된 프로시아니딘 올리고머, 프로시아니딘 B-5, 프로시아니딘 A-2, 및 프로시아니딘 C-1으로 부터 선택된 적어도 하나의 코코아 프로시아니딘으로 된 폴리페놀과 같은 폴리페놀(들)을 포함한다. 본 발명은 또한 실질적으로 순수한 코코아 추출물 또는 프로시아니딘(들)로 강화된 폴리페놀(들)과 같은 합성 코코아 폴리페놀(들)과 적당한 담체를 포함하는 항종양, 항암 또는 항신생물 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제 조성물을 제공한다. 바람직하게는 추출물은 코코아 프로시아니딘(들)을 포함한다. 코코아 추출물은 바람직하게는 코코아 열매를 분말화하는 단계, 분말을 탈지하는 단계, 및 분말로 부터 활성 화합물(들)을 추출하는 단계를 포함하는 공정에 의해 얻어진다.

본 발명은 또한 유효량의 실질적으로 순수한 코코아 추출물 또는 합성 코코아 폴리페놀(들) 또는 프로시아니딘(들)과 담체를 포함하는 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 항종양제, 항암제, 또는 항신생물제 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제로 치료가 필요한 환자를 치료하는 방법을 포함한다. 코코아 추출물은 코코아 프로시아니딘(들)일 수 있다; 그리고 바람직하게는 코코아 열매를 분말화하고 분말을 탈지한 후 분말로 부터 활성 화합물(들)을 추출하여 얻어진 것일 수 있다.

또한 본 발명은 실질적으로 순수한 코코아 추출물 또는 합성 코코아 폴리페놀(들) 또는 프로시아니딘(들)과, 추출물 또는 합성 폴리페놀(들) 또는 프로시아니딘(들)과의 혼합을 위한 적당한 담체를 포함하는 항종양제, 항암제 또는 항신생물제 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 억제제로 치료가 필요한 환자를 치료하기 위한 키트를 제공한다.

이러한 목적들과 다른 목적들 및 구체예들은 하기의 상세한 설명에 기재되어 있으며, 이로 부터 자명해질 것이다.

다음의 상세한 설명은 첨부된 도면을 참고하면 더욱 잘 이해될 것이다:

제1도는 조생의(crude) 코코아 프로시아니딘 분획으로 부터 얻어진 대표적인 겔투과 크로마토그램을 나타낸다;

제2A도는 미발효 코코아로 부터 추출된 코코아 프로시아니딘의 분리(용출 프로파일)의 대표적인 역상 HPLC 크로마토그램을 나타낸다;

제2B도는 미발효 코코아로 부터 추출된 코코아 프로시아니딘의 대표적인 정상적 상(normal phase) HPLC 분리를 나타낸다;

제3도는 여러 가지의 대표적인 프로시아니딘 구조들을 나타낸다;

제4A-4E도는 항암 또는 항신생물 활성의 스크리닝에 사용된 다섯 개의 분획들의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

재5도와 제6A-6D도는 코코아 추출물과 암세포 ACHN(제5도)과 암세포 PC-3(제6A-6D도)과의 용량-반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; M＆M2 F4/92, M＆MA + E U12P1, M＆MB + E Y192P1, M＆MC + E U12P2, M＆MD + E U12P2;

제7A도 내지 제7H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, A+B, A+E, 및 A+D와 PC-3 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1A 0212P3, MM-1B 0162P1, MM-1 C 0122P3, MM-1 D 0122P3, MM-1 E 0292P8, MM-1 A/B 0292P6, MM-1 A/E 0292P6, MM-1 A/D 0292P6;

제8A도 내지 제8H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, A+B, B+E, 및 D+E와 KB 비인강/Hela 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1 A 092K3, MM-1 B 0212K5, MM-1 C 0162K3, MM-1 D 0212K5, MM-1 E 0292K5, MM-1 A/B 0292K3, MM-1 B/E 0292K4, MM-1 D/E 0292K5;

제9A도 내지 제9H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, B+D, A+E, 및 D+E와 HCT-116 세포주간의 전형적인 용향 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1 C 0192H5, D 0192H5, E 0192H5, MM-1 B＆D 0262H2, A/E 0262H3, MM-1 D＆E 0262H1;

제10A도 내지 제10H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, B+D, C+D, 및 A+E와 ACHN 신장 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1 A 092A5, MM-1 B 092A5, MM-1 C 0192A7, MM-1 D 0192A7, M＆M1 E 0192A7, MM-1 B＆D 0302A6, MM-1 C＆D 0302A6, MM-1 A＆E 0262A6;

제11A도 내지 제11H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, A+E, B+E, 및 C+E와 A-549 폐 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1 A 019258, MM-1 B 09256, MM-1 C 019259, MM-1 D 019258, MM-1 E 019258, A/E 026254, MM-1 B＆E 030255, MM-1 C＆E N6255;

제12A도 내지 제12H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, B+C, C+D, 및 D+E와 SK-5 멜라노마 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1 A 0212S4, MM-1 B 0212S4, MM-1 C 0212S4, MM-1 D 0212S4, MM-1 E N32S1, MM-1 B＆C N32S3, MM-1 D＆E N32S3;

제13A도 내지 제13H도는 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, C, D, E, B+C, C+E, 및 D+E와 MCF-7 유방 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계(분획생존율 대 용량, ㎍/ml)를 나타낸다; MM-1 A N22M4, MM-1 B N22M4, MM-1 C N22M4, MM-1 D N22M3, MM-1 E 0302M2, MM-1 B/V 0302M4, MM-1 C＆E N22M3, MM-1 D＆E N22M3;

제14도는 코코아 프로시아니딘 (특히 분획 D)와 CCRF-CEM T-세포 백혈병 세포주간의 전형적인 용량 - 반응 상관관계를 나타낸다(세포수/ml 대 성장일수; 개방환은 대조군, 검은 환은 125㎍ 분획 D, 개방 역삼각은 250㎍ 분획 D, 검은 역삼각은 500㎍ 분획 D);

제15도는 분획 D+E로 처리된 MCF-7 p168 유방암 세포에 대한 XTT와 결정 바이올렛 세포독성 분석의 대비를 나타낸다(개방환은 XTT이고, 검은 환은 결정 바이올렛이다);

제15B도는 UIT-1 코코아 유전자형으로 부터 얻어진 다양한 농도의 조생의(crude) 폴리페놀로 처리된 MDA MB231 유방 세포주로 부터 얻어진 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 대조군, 검은 환은 비히클, 개방 역삼각은 250㎍/ml, 검은 역삼각은 100㎍/ml, 개방 사각은 10 ㎍/ml; 2.0의 흡광도는 플레이트 판독기의 최대 흡광도이고, 이는 반드시 세포수를 표시하는 것이 아닐 수 있다);

제15C도는 UIT-1 코코아 유전자형으로 부터 얻어진 다양한 농도의 조생의 폴리페놀로 처리된 PC-3 전립선암 세포주로 부터 얻어진 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 대조군, 검은 환은 비히클, 개방 역삼각은 250㎍/ml, 검은 역삼각은 100㎍/ml, 개방 사각은 10 ㎍/ml);

제15D도는 UIT-1 코코아 유전자형으로 부터 얻어진 다양한 농도의 조생의 폴리페놀로 처리된 MCF-7 p168 유방암 세포주로 부터 얻어진 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 대조군, 검은 환은 비히클, 개방 역삼각은 250㎍/ml, 검은 역삼각은 100㎍/ml, 개방 사각은 10 ㎍/ml, 검은 사각은 1 ㎍/ml; 2.0의 흡광도는 플레이트 판독기의 최대 흡광도이고, 이는 반드시 세포수를 표시하는 것이 아닐 수 있다);

제15E도는 UIT-1 코코아 유전자형으로 부터 얻어진 다양한 농도의 조생의 폴리페놀로 처리된 Hela 경부암 세포주로 부터 얻어진 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 대조군, 검은 환은 비히클, 개방 역삼각은 250㎍/ml, 검은 역삼각은 100㎍/ml, 개방 사각은 10 ㎍/ml; 2.0의 흡광도는 플레이트 판독기의 최대 흡광도이고, 이는 반드시 세포수를 표시하는 것이 아닐 수 있다);

제15F도는 다른 코코아 폴리페놀 분획으로 처리된 Hela 경부암 세포주에 대한 세포독성 효과를 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 100㎍/ml 분획 A-E, 검은 환은 100㎍/ml 분획 A-C, 개방 역삼각은 100㎍/ml 분획 D와 E; 2.0의 흡광도는 플레이트 판독기의 최대 흡광도이고, 이는 반드시 세포수를 표시하는 것이 아닐 수 있다);

제15G도는 다른 코코아 폴리페놀 분획으로 처리된 SKBR-3 유방암 세포주에 대한 100μl/ml에서의 세포독성 효과를 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 분획 A-E, 검은 환은 분획 A-C, 개방 역삼각은 분획 D와 E;

제15H도는 Hela 세포주들에 대한 코코아 프로시아니딘 분획 D+E 사이의 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 대조군, 검은 환은 100㎍/ml, 개방 역삼각은 75㎍/ml, 검은 역삼각은 50㎍/ml, 개방 사각은 25㎍/ml, 검은 사각은 10㎍/ml; 2.0의 흡광도는 플레이트 판독기의 최대 흡광도이고, 이는 반드시 세포수를 표시하는 것이 아닐 수 있다);

제15I도는 SKBR-3 세포주들에 대한 코코아 프로시아니딘 분획 D+E 사이의 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(흡광도(540 ㎚) 대 일수(Days); 개방환은 대조군, 검은 환은 100㎍/ml, 개방 역삼각은 75㎍/ml, 검은 역삼각은 50㎍/ml, 개방 사각은 25㎍/ml, 검은 사각은 10㎍/ml);

제15J도는 소프트 한천 클로닝 분석을 이용한 Hela 세포주들에 대한 코코아 프로시아니딘 분획 D+E 사이의 전형적인 용량 - 반응 곡선을 나타낸다(바 차트(bar chart); 콜로니수 대 대조군, 1, 10, 50, 및 100㎍/ml);

제15K도는 8개의 다른 코코아 유전자형으로 부터 얻어진 폴리페놀 조추출물로 처리되었을 때 Hela 세포들의 성장 억제를 나타낸다(% 대조군 대 농도, ㎍/ml; 개방환은 C-1, 검은 환은 C-2, 개방 역삼각은 C-3, 검은 역삼각은 C-4, 개방 사각은 C-5, 검은 사각은 C-6, 개방 삼각은 C-7, 검은 삼각은 C-8 ; C-1=UF-12: 원예품종=크리올로, 종류는 UF-12(브라질) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-2=NA-33: 원예품종=포라스테로, 종류는 NA-33(브라질) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-3=EEG-48: 원예품종=포라스테로, 종류는 EEG-48(브라질) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-4=미상(unknown): 원예품종=포라스테로, 종류는 미상의(서아프리카) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-5=UF-613: 원예품종=트리니타리오, 종류는 UF-613(브라질) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-6=ICS-100: 원예품종=트리니타리오, 종류는 ICS-100(브라질) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-7=ICS-139: 원예품종=트리니타리오, 종류는 ICS-139(브라질) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임); C-8=UIT-1: 원예품종=트리니타리오, 종류는 UIT-1(말레이시아) 코코아 폴리페놀의 조추출물이다(탈카페인/탈테오브로민 된 것임);

제15L도는 발효된 코코아 열매와 건조된 코코아 열매로 부터 얻어진 폴리페놀 조추출물로 처리될 때 Hela 세포들의 성장 억제를 나타낸다(발효와 자연건조 동안의 단계들; %대조군 대 농도, ㎍/ml; 개방환은 일수(days)가 제로인 분획, 검은 환은 1일째인 분획, 개방 역삼각은 2일째인 분획, 검은 역삼각은 3일째인 분획, 개방 사각은 4일째인 분획, 검은 사각은 9일째인 분획);

제15M도는 Hela 세포들에 대한 효소적으로 산화된 코코아 프로시아니딘의 효과를 나타낸다(폴리페놀 옥시다제로 처리된 코코아 조생의 폴리페놀에 대한 용량-반응; %대조군 대 농도, ㎍/ml; 검은 사각은 조생의 UIT-1(카페인과 테오브로민 함유), 개방환은 조생의 UIT-1(카페인과 테오브로민 없음), 검은 환은 조생의 UIT-1(폴리페놀 옥시다제로 촉매된 것));

제15N도는 조합된 코코아 프로시아니딘 분획 D 와 E에 대한 대표적인 반-정제(semi-preparative) 역상 HPLC 분리를 나타낸다;

제15O도는 코코아 폴리페놀 조추출물의 대표적인 정상적 상 반-정제 HPLC 분리를 나타낸다;

제16도는 합성 항산화제인 BHA 와 BHT와 비교되는 코코아 프로시아니딘 추출물과 분획들 대한 전형적인 란시매트(Rancimat) 산화 곡선을 나타낸다(임의의 단위 대 시간; 점선과 크로스(+)는 BHA 와 BHT이다; *는 D-E이다; x 는 정제되지 않은 것(crude)이다; 개방환은 A-C이다; 개방 다이아몬드는 대조군이다);

제17도는 코코아 프로시아니딘 분획들에 의한, 토포아이소머라제 Ⅱ에 의해 촉매된 운동핵질 DNA의 사슬붕괴의 억제를 보여주는 전형적인 아가로스 겔을 나타낸다(래인 1은 0.5㎍의 마커(M) 모노머-길이의 운동핵질 DNA 환을 포함한다; 래인 2 와 20은 4% DMSO의 존재 및 코코아 프로시아니딘의 부재하에서 토포아이소머라제 Ⅱ로 배양된 운동핵질 DNA를 포함한다(대조군-C); 래인 3과 4는 0.5㎍/ml와 5.0㎍/ml의 코코아 프로시아니딘 분획 A의 존재하에 토포아이소머라제 Ⅱ로 배양된 운동핵질 DNA를 포함한다; 래인 5와 6을 0.5㎍/ml와 5.0㎍/ml의 코코아 프로시아니딘 분획 B의 존재하에 토포아이소머라제 Ⅱ로 배양된 운동핵질 DNA를 포함한다; 래인 7, 8, 9, 13, 14 및 15는 0.05㎍/ml, 0.5㎍/ml 와 5.0㎍/ml의 코코아 프로시아니딘 분획 D의 존재하에 토포아이소머라제 Ⅱ로 배양된 운동핵질 DNA의 복사체(replicates)이다; 래인 10, 11, 12, 16, 17 및 18은 0.05 ㎍/ml, 0.5㎍/ml와 5.0㎍/ml의 코코아 프로시아니딘 분획 E의 존재하에 토포아이소머라제 Ⅱ로 배양된 운동핵질 DNA의 복사체이다; 래인 19는 5.0㎍/ml의 코코아 프로시아니딘 분획 E의 존재하에 토포아이소머라제 Ⅱ로 배양된 운동핵질 DNA의 복사체이다;

제18도는 DNA 복구 적응 및 결핍(DNA repair competent and deficient) 세포주들에 대한 코코아 프로시아니딘 분획 D의 용량-반응 상관관계를 나타낸다(분획생존율 대 ㎍/ml; 왼쪽 사이드 xrs-6 DNA 결핍 복구 세포주, MM-1 D D282X1; 오른쪽 사이드 BR1 적응 DNA 복구 세포주, MM-1 D D282B1);

제19도는 코코아 분획 D+E로 처리될 때 MCF-7 p168 모세포주와 비교되는 아드리아마이신 내성 MCF-7 세포에 대한 용량-반응 곡선을 나타낸다(%대조군 대 농도, ㎍/ml; 개방환은 MCF-7 p168이다; 검은 환은 MCF-7 ADR이다);

제20도는 정상적 상 반-정제 HPLC에 의해 제조된 100㎍/ml와 25㎍/ml수준의 12개 분획들로 처리될 때 Hela 세포들에 대한 용량-반응 효과를 나타낸다(바 차트, %대조군 대 대조군과 분획 1-12).

상술한 바와 같이, 놀랍게도 코코아 추출물은 항암, 항종양 또는 항신생물 활성, 항산화제 활성을 나타내며, DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 추출물은 일반적으로 코코아 열매를 분말화하고, 분말을 탈지한 후, 탈지된 분말로 부터 활성 화합물(들)을 추출함으로써 제조된다. 분말은 코코아 열매와 펄프를 동결건조하고, 코코아 열매와 펄프를 탈펄프한 후, 동결건조된 코코아 열매를 탈피(dehulling)하고, 탈피된 열매를 분쇄함으로써 제조될 수 있다. 활성 화합물(들)의 추출은 용매 추출기술에 의해 수행될 수 있다. 추출물은 정제될 수 있는데; 예를 들면 겔 투과 크로마토그래피 또는 예비적인 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)기술 또는 이러한 기술들을 조합하여 정제될 수 있다. 어떠한 특정의 이론에 반드시 한정되고자 하는 의도없이, 본 발명의 추출물은 프로시아니딘과 같은 코코아 폴리페놀(들)로 동정되었다. 이러한 코코아 프로시아니딘들은 상당한 항암, 항종양, 항신생물 활성을 가지며, 항산화제 활성을 가지고; DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소를 억제한다.

본 발명의 코코아 폴리페놀들 또는 프로시아니딘들을 함유하는 항암, 항종양 또는 항신생물 조성물 또는 항산화제 조성물 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 억제 조성물들은 약제학 분야에서 통상의 기술자들에게 잘 알려져 있는 표준의 기술들에 의해 제조될 수 있다. 이러한 조성물들은 나이, 성별, 체중 및 특정 환자의 상태와 투여경로와 같은 요소들을 고려하는 의학 분야에서의 통상의 기술자들에게 잘 알려진 기술에 의해 적정 복용량으로, 그러한 투여가 필요한 환자에게 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은, 나이, 성별, 체중, 및 특정 환자의 상태와 투여경로와 같은 요소들을 고려하여, 다른 항신생물제, 항종양제 또는 항암제 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 억제제 및/또는 항신생물제, 항종양제 또는 항암제 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 억제제에 의한 부작용을 감소 또는 완화시키는 제제들과 함께 공동-투여되거나, 상기 제제들과 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물의 예는 캡슐, 정제, 환 등과 같은 경구 투여용 고체 조성물뿐 아니라 씹을 수 있는 고체 제제-본 발명의 조성물은 식용원으로 부터 유래된 것이므로 상기한 제형들에 매우 적합하다(예, 코코아 또는 쵸콜렛 향의 고체 조성물); 구멍, 예로서 경구, 비강, 항문, 질 등을 통한 투여를 위한 현탁액, 시럽 또는 엘릭스(elixirs)와 같은 액체 제제; 비경구, 피하, 피내(intradermal), 근육내, 또는 정맥내 투여(예, 주사투여)를 위한 멸균 현탁액 또는 유화액과 같은 제제를 포함한다.

그러나 조성물내의 활성 성분은 단백질과 복합체를 형성할 수 있으므로, 혈관내로 투여될 때 혈액 단백질과의 침전에 기인하여 응고될 수 있다; 당분야 기술자는 이점을 고려하여야만 한다. 그러한 조성물에 있어서, 활성 코코아 추출물은 적당한 담체, 희석제, 또는 멸균수, 생리 식염수, 글루코즈 등과 같은 부형제와 혼합될 수 있다. 본 발명의 활성 코코아 추출물은 재제제화(reconstituting)을 위한 친액화된 형태(lyophilized form), 예를 들면 수성 등장액, 염 완충액의 형태로 제공될 수 있다.

또한, 본 발명은 활성 코코아 추출물의 제공을 위한 키트를 포함한다. 본 발명의 키트는 적당한 담체, 희석제 또는 부형제를 함유하는 독립된 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 공동-투여 또는 순차적 투여를 위하여 부가적인 항암제, 항종양제, 또는 항신생물제 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 억제제 및/또는 항암제, 항종양제, 또는 항신생물제 또는 항산화제 또는 DNA 토포아이소머라제 Ⅱ 효소 억제제에 의한 부작용을 감소 또는 완화시키는 제제를 포함할 수 있다. 부가적인 제제(들)은 독립된 용기(들)로 제공될 수도 있고, 활성 코코아 추출물과 혼합되어 제공될 수도 있다. 또한 본 발명의 키트는 성분들의 혼합과 조합 및/또는 투여를 위한 지시를 포함할 수 있다.

본 발명이 바람직하게는 코코아 프로시아니딘을 포함하는 코코아 추출물에 관한 것으로 설명되어 있으나, 숙련된 유기 화학자라면, 본 명세서에서의 설명내용으로 부터 활성 화합물을 얻기위한 합성 경로를 예측하여 계획할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명은 합성 코코아 폴리페놀 또는 합성 프로시아니딘 또는, 제한되지는 않지만, 글리코사이드, 갈레이트, 에스테르 등과 같은 그들의 유도체들을 포함한다.

이하에 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니라 단지 예시하기 위한 실시예들이 설명되며, 본 발명의 기술사상 또는 범위를 벗어나지 않고 이들 실시예들의 자명한 변형들이 가능하다.

실시예 1 : 코코아 소스(Source)와 제조방법

3곳의 주요 코코아 원산지로 부터 3가지의 알려진 코코아 원예품종을 대표하는 수개의 테오브로마 카카오(Theobroma cacao) 유전자형들을 얻었다. 본 발명에 사용된 이들 유전자형들은 표1에 나타내었다. 수확된 코코아 꼬투리를 까서 펄프와 함께 열매를 회수하여 동결건조시켰다. 동결건조된 덩어리로 부터 손으로 펄프를 제거하고 열매는 분석을 위하여 다음과 같은 처리를 하였다. 먼저 미발효된 동결건조 열매를 탈피하고 TEKMAR 밀을 이용하여 미세한 분말로 분쇄하였다. 얻어진 분말을 재증류된 헥산을 용매로 이용하여 Soxhlet 추출법에 의해 밤새 탈지하였다. 잔여 용매는 주위 온도에서 진공에 의해 탈지된 분말로 부터 제거되었다.

표 1 : 테오브로마 카카오 소스 물질에 대한 설명

실시에 2 : 프로시아니딘 추출공정

A. 방법 1

제랄과 콜린(1977)에 개시된 방법의 변형된 방법을 이용하여 실시예1에서 제조된 탈지된 미발효 동결건조된 코코아 열매로 부터 프로시아니딘을 추출하였다. 50g 뱃치(batches)의 탈지된 코코아를 400 mL의 70% 아세톤/탈이온수로 2회 처리한 후 400 mL의 70％ 아세톤/탈이온수로 처리하여 프로시아니딘을 추출하였다. 추출물을 모으고, 45℃에서 부분적인 진공하의 회전 증발기를 이용하여 증발에 의해 용매를 제거하였다. 얻어진 수상을 탈이온수로 1L가 되도록 희석하고, 400mL의 CHCl₃로 2회 추출하였다. 용매상은 버렸다. 그런 다음 수상을 500mL 에틸아세테이트로 4회 추출하였다. 얻어진 유화액을 2,000 xg로 작동되는 Sorvall RC 28S 원심분리기를 이용하여 10℃에서 30분간 원심분리하였다. 합해진 에틸아세테이트 추출물에 100-200mL 탈이온수를 참가하였다. 용매는 부분적인 진공하의 회전 증발기를 이용하여 45℃에서 증발에 의해 제거하였다. 얻어진 수상을 액체 N₂에서 동결한 다음 LABCONCO 동결건조 시스템에서 동결건조하였다. 다양한 코코아 유전자형으로 부터 얻어진 조생의 프로시아니딘의 수율은 표2에 나타내었다.

표 2 : 조생의 프로시아니딘 수율

B. 방법 2

선택적으로, 실시예1에서 얻은 탈지된 미발효 동결건조된 코코아 열매로 부터 70% 수성 아세톤으로 프로시아니딘을 추출한다. 10g의 탈지물을 100mL 용매로 5-10분간 슬러리화 하였다. 슬러리를 3000xg, 4℃에서 15분간 원심분리하고, 상등액을 그라스울에 통과시켰다. 여과액을 부분적인 진공하에서 증류하고, 얻어진 수상을 액체 N₂로 동결한 다음 LABCONCO 동결건조 시스템으로 동결건조하였다. 조생의 프로시아니딘의 수율은 15-20%의 범위였다.

어떠한 특정의 이론에 한정됨이 없이, 수율의 차이는 다른 유전자형, 지역적 출처, 원예품종, 및 제조방법의 차이가 반영된 것으로 믿어진다.

실시예 3 : 코코아 프로시아니딘의 부분적 정제

A. 겔 투과 크로마토그래피

실시예2로 부터 얻은 프로시아니딘을 세파덱스 LH-20(28 x 2.5 ㎝)상에서 액체 크로마토그래피에 의해 부분적으로 정제하였다. 분리는 탈이온수로 부터 메탄올 내로의 단계 경사(step gradient)에 의해 촉진되었다. 초기 경사 조성물은 탈이온수중의 15％ 메탄올로 시작하여, 매 30분 마다 탈이온수중의 25％ 메탄올, 탈이온수중의 35％ 메탄올, 탈이온수중의 70％ 메탄올, 최종적으로 100％ 메탄올의 순서로 적용되었다. 크산틴 알칼로이드(카페인과 테오브로민)의 용출후의 유출액을 단일 분획으로 회수하였다. 상기 분획으로 부터 크산틴 알칼로이드가 없는 서브(sub)분획을 얻었고, 이 서브 분획을 더 분별하여 MM2A 내지 MM2E 로 지칭되는 5개의 서브 분획을 얻었다. 부분적인 진공하의 회전식 증발기를 이용하여 45℃ 에서 각각의 서브 분획으로 부터 용매를 증발시켜 제거하였다. 얻어진 수상을 액체 N₂에서 동결하고, LABCONCO 동결건조 시스템에서 밤새 동결건조하였다. 분획화를 보여주는 대표적인 겔 투과 크로마토그램을 제1도에 나타내었다. 대략 설명하면, 100㎎의 물질을 다음의 방식으로 세부 분획화하였다.

제1도 : 세파덱스 LH-20상에서의 조생의 프로시아니딘의 겔 투과 크로마토그램

크로마토그래피 조건 : 칼럼; 28×2.5㎝ 세파덱스 LH-20, 이동상: 메탄올/물 단계적 경사, 1/2시간 간격으로 15:85, 25:75, 35:65, 70:30, 100:0로 단계적으로 경사, 이동상; 1.5ml/분, 검출기; UV ＠ λ₁=254 ㎚ 및 λ₂=365 ㎚, 차트 속도: 0.5 ㎜/분, 칼럼 적하량(Load); 120㎎.

B. 반-정제(semi-preparative) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)

방법 1: 역상 분리

실시예 2 및/또는 3A에서 얻어진 프로시아니딘을 반-정제 HPLC로 부분적으로 정제하였다. 다양한 파장 검출기와 1mL주입 루프를 갖는 Rheodyne 7010 주입 밸브가 장착된 Hewlett Packard 1050 HPLC 시스템을 파마시아 FRAC-100 분획 회수기와 함께 조립하였다. 분리는 페놈에넥스(Phenomenex) 10μ ODS 울트라카브(Ultracarb)(60 × 10㎜) 가드 칼럼에 연결된 페놈에넥스 울트라카브 10μ ODS 칼럼(250 × 22.5㎜)상에서 이루어졌다. 이동상 조성물은 A=물, B=메탄올이었으며, 다음과 같은 선형 경사(linear gradient) 조건하에서 사용되었다: [시간, %A]; (0, 85), (60, 50), (90, 0), (110, 0), 유속 5 mL/분.

분획 D+E에 존재하는 프로시아니딘의 분리에 대한 대표적인 반-정제 HPLC 기록을 제15N도에 나타내었다. 더 이상의 정제와 그에 이은 평가를 위해 개개의 피크들 또는 선택된 크로마토그래픽 영역들을 분획 회수에 의해 일정 시간 간격으로, 또는 수작업으로 회수하였다. 주입된 물질량은 25-100㎎의 범위였다.

방법 2. 정상적 상 분리

실시예 2 및/또는 3A에서 얻어진 프로시아니딘 추출물을 반-정제 HPLC에 의해 부분적으로 정제하였다. 밀리포어-워터스 모델 480 LC 검출기가 254㎚에 셋팅된 Hewlett Packard 1050 HPLC 시스템을 피크 모드로 셋팅된 파마시아 Frac-100 분획 회수기와 함께 조립하였다. 분리는 수펠코 5μ 수펠가드 LC-Si 가드 칼럼(20 × 4.6㎜)에 연결된 수펠코 5μ 수펠코실 LC-Si 칼럼(250 × 10㎜)상에서 이루어졌다. 프로시아니딘은 다음의 조건에서 선형 경사에 의해 용출된 후 10분간 재-평형화(re-equilibration)되었다: (시간, %A, ％B); (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), 65, 10, 86), (70, 10, 86). 이동상 조성물은 A=디클로로메탄; B=메탄올; C=아세트산:물(1:1)이었다. 유속은 3mL/분이었다. 성분들은 254㎚에서 UV에 의해 검출되었고, Kipp ＆ Zonan BD41 기록기에 기록되었다. 주입부피는 0.25mL 70％ 수성 아세톤중의 10㎎ 프로시아니딘 추출물 100-250μL이었다. 대표적인 반-정제 HPLC 기록은 제15O도에 나타내었다. 더 이상의 정제와 그에 이은 평가를 위해 분획 회수에 의해 개개의 피크들과 선택된 크로마토그래픽 영역을 시간 간격으로, 또는 수작업으로 회수하였다.

HPLC 조건 : 250 × 10㎜ 수펠코 수펠코실 LC-Si(5μm) 반정제 칼럼

20 × 4.6㎜ 수펠코 수펠코실 LC-Si(5μm)가드 칼럼

검출기: 워터스 LC

스펙트로 포토미터 모델 480 ＠ 254㎚

유속: 3mL/분,

칼럼온도: 주위온도,

주입: 70% 수성 아세톤 추출물 250μL.

얻어진 분획들은 다음과 같다:

실시예 4 : 프로시아니딘 추출물의 HPLC 분석

방법 1 : 역상분리

실시예 3으로 부터 얻은 프로시아니딘 추출물을 0.45μ필터를 통해 여과하고 다이오드어레이(Diode array) 검출기와 HP 모델 1046A 프로그램 가능한 형광검출기가 장치된 Hewlett Packard, 090 HPLC 시스템으로 분석했다. 분리는 45℃에서 Hewlett-Packard 5μ Hypersil ODS 칼럼(200×2.1㎜)상에서 이루어졌다. 후라베놀(flavanols)과 프로시아니딘을 선형경사로 B로 부터 A로 경사용리하고, 이어서 유속 0.3ml/분으로 B내용물을 칼럼세척했다. 이동상 조성물은 B=메탄올중의 0.5% 아세트산이고 A=탈이온수중의 0.5% 아세트산이었다. A와 B 이동상내의 아세트산 수준은 2%로 증가될 수 있다. 성분들은 형광에 의해 검출되며, 여기에서 λ_ex=276㎚ 이고 λ_em=316㎚이다. (+)-카테킨과 (-)-에피카테킨의 농도는 참고표준용액에 따라 결정되었다.

프로시아니딘 수준(level)은 (-)-에피카테킨에 대한 응답계수를 사용하여 평가했다. 여러 가지 성분들의 분리를 보여주는 대표적인 HPLC 크로마토그램은 한가지 코코아 유전자형에 대해 제2A도에 나타낸다. 유사한 HPLC 프로파일이 다른 코코아 유전자형으로 부터 얻어졌다.

HPLC 조건 : 칼럼 : 200×2.1㎜ Hewlett Packard Hypersil ODS(5μ)

가드칼럼 : 20×2.1㎜ Hewlett Packard Hypersil ODS(5μ)

검출기 : 다이오드 어레이 ＠ 28O㎚

형광 λ_ex = 276㎚ ;

λ_em = 316㎚

유속 : 0.3mL/min

칼럼온도 : 45℃

방법 2 : 정상적 상 분리

실시예 2 및/또는 3으로 부터 얻은 프로시아니딘 추출물물 0.45μ 필터를 통해 여과하고, HP 모델 1046A 프로그램 가능한 형광검출기와 다이오드어레이 검출기가 장치된 Hewlett Packard 1090 시리이즈Ⅱ HPLC 시스템을 사용하여 분석했다. 분리는 37℃에서 슈펠코 슈펠가드 LC-Si 5μ 가드칼럼(20×4.6㎜)에 연결된 5μ 페노메넥스 리크로스피어 실리카 100 칼럼(250×3.2㎜)상에서 이루어졌다. 프로시아니딘을 다음의 조건에 따라서 선형경사에 의해 경사용리한 후 8분간 재평형시켰다 : (시간, ％A, ％B) ; (0, 82, 14), (30, 67.6, 28.4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), 이동상 조성물은 A=디클로로메탄, B=메탄올, C=체적비 1:1의 아세트산 : 물 이었다. 유속은 0.5ml/분이었다. 성분들은 λ_ex=276㎚, λ_em=316㎚인 형광 또는 280㎚에서의 UV에 의해 검출되었다.

여러 가지 프로시아니딘의 분리를 보여주는 대표적인 HPLC 크로마토그램은 한가지 유전자형에 대해 제2B도에 나타낸다. 유사한 HPLC 프로파일을 다른 코코아 유전자형으로 부터 얻었다.

HPLC조건 : 250×3.2㎜ 페노에넥스 리크로스피어 실리카 100칼럼(5μ)

20×4.6㎜ 슈펠코 슈펠가드 LC-Si(5μ) 가드컬럼.

검출기 : 포토다이오드 어레이 ＠ 280㎚

형광 λ_ex = 276㎚ ;

λ_em = 316㎚

유속 : 0.5ml/분

칼럼온도 : 37℃

실시예 5 : 프로시아니딘의 동정

프로시아니딘을 세파덱스 LH-20(28×2.5㎝) 칼럼상에서 액체크로마토그래피로 정제하고, 이어서 10μ 본다팩 C18(100×8㎜) 칼럼을 사용하는 반-정제 HPLC 또는 5μ 슈펠코실 LC-Si(250×10㎜) 칼럼을 사용하는 반-정제 HPLC로 처리했다.

부분적으로 정제된 분리물들을 양이온과 음이온 방식으로 액체 이차 이온 질량 분석법(LSIMS) 기술을 사용하는 VG ZAB-T 고해상도 MS시스템상에서 Fast Atom Bombardment-질량 분석법(FAB-MS)에 의해 분석했다. 세슘이온층이 30㎸에서 이온화원(ionzing source)으로 사용되었으며, “Magic Bullet Matrix”(1:1 디티오트레이톨/디티오에리트리톨)은 양자 공여체로 사용되었다.

LSIMS에 의한 이들 분획의 분석조사는 다수의 후라벤-3-올 올리고머가 존재함을 보여주며, 이는 표3에서 알 수 있다.

표 3 : 코코아 프로시아니딘 분획으로 부터 얻은 LSIMS(양이온) 데이터

주요한 질량 단편이온(mass fragment ions)은 프로시아니딘의 양이온 및 음이온 FAB-MS 분석 결과로 이미 보고된 바 있는 연구결과와 일치되었다(셀프등, 1986 및 포터 등, 1991). m/z 577(M+H)⁺에 해당하는 이온과 m/z 599(M+Na)⁺에서의 그의 소듐 부가물은 분리물중에 이중으로 결합된 프로시아니딘 이량체가 존재하고 있음을 암시해준다. 높은 단위수의 올리고머들이 이들의 양자화된 분자이온(M+H)⁺들 보다는 소듐 부가물(M+Na)⁺을 만들려고 한다는 사실은 흥미로운 일이다. 프로시아니딘 이성체들 B-2, B-5와 C-1은 레빌라등(1991), 셀프등(186)과 포터등(1991)에 의해 보고된 연구결과를 기초로 시험적으로 확인되었다.

팔량체와 십량체에 이르는 프로시아니딘은 부분적으로 정제된 분획중에서 FAB-MS에 의하여 검정되었다. 또한, 십이량체에 이르는 프로시아니딘에 대한 증거는 정상적인 상 HPLC 분석법으로 부터 관찰되었다(제2B도 참조).

어떤 특별한 이론에 속박됨이 없이, 십이량체는 추출 및 정제 체계에 사용된 용매내에서 용해도의 한계인 것으로 믿어진다.

표4는 역상 HPLC 분석결과에 기초를 둔 키산틴 알카로이드가 없는 분리물중에서 발견된 프로시아니딘의 상대적 농도를 목록화한 것이다. 표5는 정상적 상 HPLC 분석결과에 기초를 둔 프로시아니딘의 상대적 농도를 목록화한 것이다.

표 4 ; 키산틴 알카로이드가 없는 분리물중의 프로시아니딘의 상대농도

표 5 ; 수용성아세톤 추출물중의 프로시아니딘의 상대농도

제3도는 몇개의 프로시아니딘 구조를 보여주며, 제4A-4E도는 후술하는 항암 또는 항신생물제 활성에 대한 스크리닝시 사용된 5가지 분획의 대표적인 HPLC 크로마토그램을 보여준다.

제4A-4E도에 대한 HPLC조건들은 다음과 같다 ;

HPLC 조건 : HP모델 1046A 프로그램 가능한 형광 검출기가 장치된 Hewlett

Packard 1090 터너리 HPLC 시스템.

칼럼 : Hewlett Packard 5μ Hypersil ODS(200×2.1㎜)

60% B를 유속 0.3ml/분으로 A내로 선형 경사 용리.

B=메탄올중의 0.5% 아세트산 ;

A=탈이온수중의 0.5% 아세트산,

λ_ex=280㎚ ; λ_em=316㎚.

제15 O도는 항암 또는 항신생물제 활성에 대한 스크리닝시에 사용된 부가적인 12가지 분획의 대표적인 반-정제 HPLC 크로마토그램을 보여준다(HPLC 조건은 상술한 바와 같음).

실시예 6 : 코코아 추출물의 항암, 항종양 또는 항신생물 활성도(프로시아니딘)

모스만(1983)에 의해 최초로 개발된 MTT(3-[4,5-디메틸 티아졸-2일]-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드)-마이크로 타이터 플레이트 테트라졸리움 세포독성 분석법은 실시예 5로 부터 얻은 테스트용 시료를 스크리닝하는데 사용되었다.

테스트용 시료, 표준액(시스플라틴과 클로람부씰)과 MTT 시약을 10㎎/ml 농도로 100% DMSO(디메틸설폭사이드)에 용해했다. 저장용액으로 부터 순차적으로 희석액을 조제했다. 테스트용 시료의 경우에는, 0.5% DMSO 중의 0.01∼100㎍/ml 농도범위의 희석액을 조제했다.

모든 인간 종양 세포주들은 ATCC(American Type Culture Collection)으로 부터 구입했다. 세포들은 10% 소태아 혈청, 100유니트/ml 페니실린, 100㎍/ml 스트렙토마이신과 240 유니트/ml 나이스타틴을 포함하는 알파-MEM 중에서 단층으로 성장시켰다.

세포들을 37℃에서 가습상태의 5% CO₂ 대기하로 유지했다.

트립신화 반응(trypsinization)후에, 세포들을 계수하고, 농도가 50×10⁵ 세포/ml가 되게 조절했다(암세포주에 따라 변화). 세포현탁액 200μl를 96-웰 마이크론 타이터 플레이트의 4열로 된 웰(well)에 넣었다. 세포들이 4시간동안 부착되도록 방치한 후에, 테스트용 시료를 포함하는 DMSO 2μl를 사중의(quadruplicate) 웰에 첨가했다. 초기의 용량-반응 확인 실험에서는, 농도순서에 따라 테스트용 시료 희석액을 이용하여 시험할 용량의 범위를 결정하였다. 540㎚에서 웰(well) 흡광도는 바이오 래드 MP450 플레이트 판독기(plate reader)로 측정했다. 테스트용 시료로 처리된 사중의 웰(Well)의 평균 흡광도를 대조군의 값과 비교했으며, 결과는 대조군 흡광도 플러스/마이너스 표준편차의 %로서 나타내었다.

자줏빛 포름아잔(formazan) 생성물로의 MTT의 환원은 웰내의 살아 있는 세포들의 수와 정비례의 상관관계가 있다. 따라서, 환원 생성물의 흡광도를 측정하므로써, 테스트용 시료의 일정 용량중에 잔존하는 세포의 %량을 알 수 있다. 대조군 웰(wells)은 최종농도 1% DMSO를 포함했다.

먼저 시료 두가지를 이 프로토콜에 의해 테스트했다. 시료 MM1은 코코아 프로시아니딘의 매우 조잡한 분리물이었으며, 감지할 수 있는 정도의 양으로 카페인과 테오브로민을 포함하고 있었다. 시료 MM2는 겔 투과 크로마토그래피에 의하여 부분적으로 정제된 코코아 프로시아니딘 분리물이었으며, 카페인과 테오브로민은 MM2중에는 없었다. 두가지 시료들을 위에서 설명한 방법들을 사용하여 다음의 암세포주들에 대한 활성에 관해 스크리닝 했다.

HCT-116 결장암

ACHN 신장선암

SK-5 흑색종

A-498 신장선암

MCF-7 유방암

PC-3 전립선암

CAPAN-2 췌장암

조사한 암세포주들중의 어느것에 관해서도 시료 MM1은 아무런 활성도 관찰되지 않았다. MM2는 HCT-116, PC-3과 ACHN 암세포주에 대하여 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나, MM1과 MM2 모두는 MTT를 방해하는 것으로 확인되었으며, 따라서 생존력이 있는 세포수의 감소를 반영하는 흡광도의 감소를 불명료하게 하였다. 또한 이러한 방해는 마이크로 타이터 플레이트의 둘레를 따라서 웰(Well)내에서 화학반응이 더 빠르게 진행되는 것으로 보이기 때문에 커다란 에러의 원인이 될 수도 있다. 이러한 효과들의 전형적인 예는 제5도에 표현되었다. 테스트용 물질이 고농도인 경우에는 도면에서 보여준 높은 생존 수준 보다 생존 세포수가 크게 감소됨을 일반적으로 예측할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 현미경검사는 MTT 방해효과에도 불구하고 세포특성 효과가 발생됨을 보여준다. 예를들면, 이 방법에서 ACHN 세포주에 대한 MM2의 효과에 대하여 0.5㎍/ml의 IC₅₀ 값이 얻어졌다.

본 발명자들의 견해로는 이와같은 예비적 결과들에 따라 MTT 방해를 미리 배제하기 위하여 분석방법의 수정이 필요케 되었다. 이는 다음과 같이 이루어졌다. 플레이트를 가습된 5% CO₂ 대기하에서 18시간동안 37℃로 항온처리한 후에 배지를 주의하여 통풍시키고, 새로운 알파-MEM 배지로 대체했다. 이 배지를 분석 3일째에 다시 웰로부터 통풍시키고, 새로 제조한 멕코이 배지 100μl로 대체했다. PBS(포스페이트로 완충처리된 식염수)중의 5㎎/ml MTT 저장용액 11μl를 각 플레이트의 웰(well)에 첨가했다. 가습상태의, 5％ CO₂ 대기하에서 4시간 동안 37℃로 항온처리한 후에, 이소프로판올 중의 0.04N HC1 100μl를 플레이트의 모든 웰에 첨가하고, 어떠한 생존력이 있는 세포들에 의해 생성된 포름아잔(formazan)을 가용화 시키기 위해 완전 혼합하였다. 부가적으로, 활성에 관여하는 특정의 성분들을 결정하기 위하여 프로시아니딘을 세부적으로 분별증류 하기로 결정했다.

이미 설명한 세부적 분별증류법(subfractionation)은 더 스크리닝하기 위한 시료를 만드는데 사용되었다. 제1도에서의 면적과 제4A-4E도에의 성분(들) 분포를 나타내는 5가지 분획을 제조하였다. 이러한 분석적 특성들을 반영하고 카페인과 테오브로민의 부재를 나타내기 위하여 시료들을 MM2A 내지 MM2E로 코드화했다.

각각의 분획을 HCT-116, PC-3와 ACHN 암세포주들에 대하여 개별적으로 스크리닝 했다. 이 결과는 활성이 어느 하나의 특이적 분획에 집중되지 않았음을 보여준다. 천연적 분리생성물중의 “활성적인” 성분들은 함께 상승작용을 할 수 있기 때문에, 이러한 유형의 결과는 예외적인 것으로는 여겨지지 않는다. 코코아 프로시아니딘 분리물(MM2)의 경우에는, 20가지가 넘는 검출가능한 성분들이 이 분리물에 포함되어 있었다. 활성은 각개의 성분(들)에 관련됐다고 생각되기 보다는, 오히려 여러 분획들중에 존재하는 성분들의 조합에 관련됐다고 생각할 수 있다.

이러한 결과들을 바탕으로 분획들을 조합하고, 동일한 암세포주들에 대하여 시험분석을 반복하기로 결정했다. 몇가지의 분획의 조합은 PC-3 암세포주들에 대하여 세포독성 효과를 나타냈다.

특별히, MM2A와 MM2E의 조합에 대하여 40㎍/ml의 IC₅₀값과 MM2C와 MM2E의 조합에 대하여 20㎍/ml의 IC₅₀ 값을 각각 얻었다. 또한 HCT-116과 ACHN 세포주에 대한 활성도 관찰됐으나, 전술한 바와 같이, MTT 지시약의 방해는 정밀한 관찰을 방해했다. 데이터를 개선하기 위하여 HCT-116과 ACHN 세포주에 관한 재현실험을 반복해 실시했다. 그러나, 이 결과들은 박테리아 오염과 테스트용 시료물길의 부족때문에 확정적이지 못하였다. 제6A-6D도는 코코아 추출물과 PC-3 암세포들의 조합들간의 용량-반응 관계를 보여준다.

그럼에도 불구하고, 이 데이타로 부터 코코아추출물, 특히 코코아 폴리페놀 또는 프로시아니딘은 항종양, 항암 또는 항신생물 활성, 특히 인간의 PC-3(전립선), HCT-116(결장)과 ACHN(신장선) 암세포주에 대해서는 활성을 갖는 것이 분명하다. 더욱이, 이 결과들은 특이적인 프로시아니딘 분획이 PC-3 세포주에 대한 활성을 갖는다는 것을 보여준다.

실시예 7 ; 코코아추출물(프로시아니딘)의 항암, 항종양 또는 항신생물 활성

상기 실시예들에서의 발견을 확실히 하고, 분획의 조합에 대해 더 연구하기 위하여, 또다른 포괄적 스크리닝을 실시했다.

모든 제조물질과 방법들은 테스트 용량당 4회 반복이었던 것을 8회 또는 12회 반복으로 증가한 것을 제외하고는 상기에서 설명한 바와 동일하다.

이 연구를 위하여, 다섯가지의 코코아 프로시아니딘 분획 각각과 그들의 조합을 다음의 암세포주들에 대해 스크리닝 하였다.

PC-3 전립선암

KB 비인강/Hela세포

HCT-116 결장암

ACHN 신장선암

MCF-7 유방암

SK-5 흑색종

A-549 폐암

CCRF-CEM T-세포 백혈병

각각의 스크리닝은 각 세포주에 대하여 분획 A, B, C, D와 E의 상이한 용량수준(0.01∼100㎍/ml)을 분석하도록 구성했다(제4A-4E도 참조). 조합 스크리닝은 각각의 세포주에 대하여 분획 A+B, A+C, A+D, A+E, B+C, B+D, B+E, C+D, C+E와 D+E의 동일한 용량 수준을 조합하는 것으로 이루어졌다. 이하 이 분석평가로 부터의 결과를 개별적으로 논의한 다음 전체적으로 요약했다.

A. PC-3 전립선암 세포주

제7A-7H도는 코코아 프로시아니딘 분획과 PC-3 세포주 사이의 전형적인 용량-반응 관계를 보여준다. 제7D와 7E도는 분획 D와 E가 75㎍/ml의 IC₅₀값에서 활성적임을 보여준다. 다른 프로시아니딘 분획 조합의 용량-반응 곡선으로 부터 얻어진 IC₅₀값은 분획 D 또는 E가 존재시에 60∼80㎍/ml의 범위이었다. 각각의 IC₅₀값은 표6에 설명되었다.

B. KB 비인강 암/Hela 세포주

제8A-8H도는 코코아 프로시아니딘 분획과 KB 비인강암/Hela 세포주 사이의 전형적인 용량-반응관계를 보여준다. 제8D와 8E도는 분적 D와 E가 75㎍/ml의 IC₅₀값에서 활성적임을 보여준다. 제8F-8H도는 분획의 조합 연구로 부터 얻은 대표적인 결과들을 설명한다. 이 경우에, 프로시아니딘 분획 조합 A+B는 별 효과가 없는 반면에, B+E와 D+E 조합은 60㎍/ml의 IC₅₀값에서 활성적이었다. 다른 프로시아니딘 분획 조합으로 부터의 다른 용량-반응곡선으로 얻은 IC₅₀값은 분획 D 또는 E가 존재시에 60∼80㎍/ml의 범위였다. 각각의 IC₅₀ 값은 표6에 설명되었다. 이결과들은 PC-3 세포주에 대하여 얻은 결과와 기본적으로 동일했다.

C. HCT-116 결장암 세포주

제9A-9H도는 코코아 프로시아니딘 분획과 HCT-116 결장암 세포주 사이의 전형적인 용량-반응 관계를 보여준다. 제9D와 9E도는 약 400㎍/ml의 IC₅₀ 값에서 분획 E가 활성적임을 보여준다. 이 값은 존재하는 곡선의 외삽법에 의해 얻었다. 분획 D에 대한 용량-반응 곡선의 기울기가 활성도를 나타낸다. 그러나, 이 도표로 부터는 IC₅₀ 값이 결정되지 않았으며, 이는 곡선의 기울기가 너무나 작기 때문에 믿을 만한 값을 얻을 수 없기 때문이다. 제9F-9H도는 분획 조합 연구로 부터 얻은 대표적인 결과들을 설명한다. 이 경우에 프로시아니딘 분획 조합 B+D는 감지할 수 있는 정도의 활성을 보여주지 않지만, 반면에 분획 조합 A+E와 D+E는 500㎍/ml와 85㎍/ml IC₅₀의 값에서 각각 활성적이었다. 다른 분획 조합의 용량-반응 곡선으로 부터 얻은 IC₅₀값은 분획 E가 존재시에 평균 약 250㎍/ml이었다. 외삽법으로 얻은 IC₅₀ 값은 표6에 목록되어 있다.

D. ACHN 신장선암 세포주

제10A-10H도는 코코아 프로시아니딘 분획과 ACHN 신장선암 세포주 사이의 전형적인 용량-반응 관계를 보여준다. 제10A-10E도는 각각의 분획이 이 세포주에 대하여 활성적이지 않음을 보여준다. 제10F-10H도는 분획 조합 연구로 부터 얻은 대표적 결과를 설명한다. 이 경우에서, 프로시아니딘 분획 조합 B+C는 비활성적인 반면에, 분획조합 A+E는 약 500㎍/ml의 외삽된 IC₅₀값을 나타내었다. C+D 조합에 유사한 용량-반응 곡선은 비활성적인 것으로 고려할 수 있으며, 이는 이들의 기울기가 너무나 작기 때문이다. 다른 분획 조합에 대해 외삽법으로 얻은 IC₅₀값은 표6에 목록되어 있다.

E. A-549 폐암 세포주

제11A-11H도는 코코아 프로시아니딘 분획과 A-549 폐암 세포주 사이의 전형적인 용량-반응관계를 보여준다. 평가분석에 사용된 용량으로는 어떤 개별적 분획 또는 분획 조합으로 부터도 활성은 검출되지 않았다. 그러나, 프로시아니딘 분획은 그럼에도 불구하고 이 세포주에 대하여 효용성을 갖는다.

F. SK-5 흑색종 세포주

제12A-12H는 프로시아니딘 분획과 SK-5 흑색종 세포주 사이의 전형적인 용량-반응관계를 보여준다. 평가분석에 사용된 용량으로는 어떠한 개별적 분획 또는 분획 조합으로 부터도 활성은 검출되지 않았다. 그러나, 프로시아니딘 분획은 그럼에도 불구하고 이 세포주에 대하여 효용성을 갖는다.

G. MCF-7 유방암 세포주

제13A-13H도는 코코아 프로시아니딘 분획과 MCF-7 유방암 세포주 사이의 전형적인 용량-반응 관계를 보여준다. 평가분석에 사용된 용량으로는 어떠한 개별적 분획 또는 분획 조합으로 부터도 활성은 검출되지 않았다. 그러나, 프로시아니딘 분획은 그럼에도 불구하고 이 세포주에 대하여 효용성을 갖는다.

H. CCRF-CEM T-세포 백혈병 세포주

전형적인 용량-반응 곡선이 CCRF-CEM T-세포 백혈병 세포주에 대하여 얻어졌다. 그러나, 다양한 분획 농도에서 시간에 대한 세포수의 현미경 계수는 분획 A, B와 D 500㎍이 4일의 기간에 걸쳐서 80％의 성장 감소를 초래하였음을 보여주었다. 대표적인 용량-반응 관계는 제14도에 나타낸다.

I. 요약

이 평가분석으로 부터 얻은 IC₅₀값은 CCRF-CEM T-세포 백혈병 세포주에 대한 것을 제외하고는 세포주들 모두에 대한 값이 표6에 목록되어 있다. T-세포 백혈병 세포주에 대한 데이터는 상이한 평가분석법이 사용됐기 때문에, 표6으로부터 의도적으로 삭제했다. 이 결과들의 일반적인 요약은 대부분의 활성이 분획 D 및 E와 연관이 있음을 보여준다. 이 분획들(D, E)은 PC-3(전립선암)과 KB(비인강암/Hela) 세포주에 대하여 가장 활성적이었다. 또한 이 분획들은 HCT-116(결장암)과 ACHN(신장선암) 세포주에 대해서도 활성도를 나타내지만, 너무 많은 용량이 문제였다. MCF-7(유방암), SK-5(흑색종)과 A-549(폐암) 세포주에 대해서는 뚜렷한 활성이 감지되지 않았다. 그러나, 프로시아니딘 분획은 그럼에도 불구하고 이 세포주들에 대하여 효용성을 갖는다. 또한 CCRF-CEM(T-세포 백혈병) 세포주에 대해서 활성이 있다. 분획 D와 E는 가장 복잡한 조성물임에 주목해야만 한다. 그럼에도 불구하고, 이 데이터로부터, 코코아추출물, 특히, 코코아 프로시아니딘은 상당한 항종양, 항암 또는 항신생물 활성을 갖고 있음을 분명히 알 수 있다.

표 6: 여러 가지의 세포주들에 대한 코코아 프로시아니딘 분획 IC₅₀값

(IC₅₀값 ㎍/ml)

100㎍/ml 이상의 값은 용량-반응곡선으로부터 외삽법으로 처리한 것임.

실시예 8. 코코아 추출물(프로시아니딘)의 항암, 항종양 또는 항신생물 활성

몇가지의 부가적인 생체외 분석방법들이 실시예 6과 실시예 7에 나타난 결과들을 보충하고 확대하기 위하여 사용되었다.

방법 A. 결정 바이오렛 염색분석법

모든 인간 종양 세포주들은 ATCC로 부터 구입했다. 세포들을 항생물질 없이 10% 소태아혈청을 포함하는 IMEM내에서 단층배양으로 성장시켰다. 세포들을 가습하고, 37℃, 5% CO₂ 대기하에서 유지되게 했다.

트립신화 반응후에, 세포수를 계수하고 100μl당 1,000∼2,000 세포정도의 농도가 되게 조절하였다. 세포증식은 세포들을(1,000∼2,000세포/웰) 96웰 마이크로 타이터 플레이트에 넣으므로써 수행되었다. 웰(well)당 100μl 세포를 첨가한 후에 세포들을 24시간동안 접촉하게 방치했다. 24시간 주기의 끝무렵에 용량-반응결과를 얻기 위하여 여러 가지의 코코아 분획들을 상이한 농도로 첨가했다. 코코아 분획을 2배 농도로 배지내에 용해하고, 각 용액 100μl를 삼중으로 된 웰에 첨가했다. 매일 계속하여, 플레이트를 50μl 결정 바이오렛으로(125ml 메탄올과 375ml 물 중에 결정 바이오렛 2.5g을 용해시켜 만듬) 15분동안 염색했다. 염색액을 제거하고 플레이트를 찬물에 살짝 담궈서 여분의 염색액을 제거했다. 세척을 두차례 더 반복하고, 플레이트를 말렸다. 남아있는 염색액을 각각의 웰에 0.1M 소듐시트레이트/50% 에탄올로 된 용액 100μl를 첨가하여 가용화시컸다. 가용화후에, 엘리자(ELISA) 플레이트 판독기(reader)상의 540㎚(참고 필터는 410㎜에서)에서 세포들의 수를 정량했다. 엘리자 판독기로 부터 얻은 결과들은 Y-축에는 흡광도, X-축에는 성장일수로 표시해 그래프로 만들었다.

방법 B. 소프트 한천 클로닝 분석법

세포들을 나와타(Nawata) 등에 의해 설명된 방법(1981)에 따라서 소프트 한천내에서 클로닝했다. 여러 가지 농도의 코코아 분획과 0.8% 한천을 포함하는 배지로 단일 세포 현탁액을 만들었다. 현탁액을 1.0％ 한천을 포함하는 배지로 코팅된 35㎜ 접시에 분획으로 나눠 처리했다. 10일간 배양한 후에, 직경이 60μm 보다 더 큰 콜로니(colonies)의 수를 오미니크론 3600 이미지 분석 시스템상에서 측정했다. 결과를 Y-축에는 콜로니의 수, X-축에는 코코아 분획의 농도로 표시해 도표로 만들었다.

방법 C. XTT-마이크로배양 테트라졸리움 분석법

스쿠디에로등(1988)에 의해 설명된 XTT 분석법이 여러 가지의 코코아 분획을 스크리닝하는데 사용되었다.

XTT 분석법은 다음의 변경사항을 제외하고는 MTT법(실시예 6)을 사용하여 설명된 방법과 본질적으로 동일하다. XTT((2,3-비스(2-메톡시-4-니트로-5-설포페닐)-5-((페닐아미노)카보닐)-2H-테트라졸리움 하이드록사이드)는 37℃로 예열된 혈청없는 1㎎/ml 배지로 제조되었다. PMS는 5mM PBS로 제조되었다.

XTT와 PMS를 함께 혼합하고 ; XTT ml당 PMS 10μl와 PMS-XTT 50μl를 각각의 웰에 첨가했다. 37℃에서 4시간 동안 배양을 한 후에, 플레이트를 기계적 진탕기상에서 30분동안 혼합하고, 450∼600㎚에서 흡광도를 측정했다. 결과를 Y-축에는 흡광도, X-축에는 성장일수 또는 농도로 하여 도표로 작성했다.

방법 A와 C를 위하여, 결과들을 Y-축에는 % 대조군, X-축에는 성장일수 또는 농도로 하여 도표로 만들었다.

XTT와 결정 바이오렛 분석법과의 비교는 어느 분석법이 가장 민감한지를 결정하기 위하여 유방암세포주 MCF-7 p168에 대하여 분획 D와 E(실시예 3B)로써 행하였다. 제15A도에서 알 수 있듯이, 두가지 분석법은 >75㎍/ml 농도에 대해서는 동일한 용량-반응 효과를 보여줬다. 이값 이하의 농도에서는, 결정 바이오렛 분석법이 XTT 분석법의 결과 보다 더 큰 표준 편차를 보여줬다. 그러나, 결정 바이오렛 분석법은 사용하기가 더 쉽기 때문에, 다르게 특정을 하지 않은 한, 이후의 모든 분석법은 이 방법을 이용해서 실행했다.

결정 바이오렛 분석결과들은 유방암 세포주 MDA MB231, 전립선 암세포주 PC-3, 유방암 세포주 MCF-7 p163과 자궁경암 세포주 Hela, 각각에 대하여 조생의 폴리페놀 추출물(실시예 2)의 효과를 예시하도록(제15B-15E) 나타내었다. 모든 경우에 용량 250㎍/ml은 5∼7일간에 걸쳐서 모든 암세포의 성장을 완전히 저지시켰다. Hela 세포주는 100㎍/ml 용량으로도 성장이 저지되기 때문에, 이 추출물에 대해 보다 민감한 것으로 보여진다. 실시예 3B로 부터의 코코아 분획들도 Hela 세포주와 다른 유방암 세포주 SKBR-3에 대해 분석되었다. 결과들은(제15F와 15G도) 분획 D와 E가 가장 높은 활성을 갖는 것을 보여준다. 제15H도와 제15I도에서 알 수 있듯이, 약 40㎍/ml의 D와 E의 IC₅₀값은 두가지의 암세포주들로 부터 얻은 것이다.

코코아 분획 D와 E에 대해서도 테스트용 화합물들이 정착 독립성장(anchorage independent growth)을 저지시키는지를 결정하기 위해 소프트 한천 클로닝 분석법으로 테스트했다. 제15J도에서 알 수 있듯이, 100㎍/ml 정도의 농도이면 Hela 세포들의 콜로니 생성이 완전히 저지되었다.

코코아의 3가지 원예 품종을 나타내는 8가지의 서로 다른 코코아 유전자형으로 부터 얻은 조생의 폴리페놀 추출물들도 Hela 세포주에 대하여 분석되었다. 제15K도에서 알 수 있듯이, 모든 코코아 품종들은 유사한 용량-반응 효과를 보여준다. UIT-1 품종이 Hela 세포주에 대하여 가장 좋은 활성을 보여주었다. 이 결과는 모든 코코아 유전자형이 지리학적 기원, 원예품종과 유전자형 등에 관계없이 적어도 하나의 인간 암세포주에 대하여 활성을 나타내는 폴리페놀 분획을 포함하고 있음을 예시해준다.

브라질과 코코아 열매의 일톤규모의 전통적인 5일간의 발효와 그후의 4일간의 자연건조 단계 동안에 일일기준으로 제조된 조생의 폴리페놀 추출물에 관하여 또다른 일련의 분석방법들이 실시되었다. 이 결과들은 제15L도에 설명되는데, 여기에서는 초기의 발효공정 단계에서는 분명한 효과가 없음을 보여주었으며, 폴리페놀의 조성물에 어떠한 변화도 없음을 암시해준다. 그러나, 폴리페놀옥시다제(PPO)는 발효단계 동안에 폴리페놀을 산화시키는 것으로 알려져 있다(레리안과 패턴슨, 1983). 촉매적으로 산화된 폴리페놀이 활성에 어떠한 효과를 미치는가를 결정하기 위해, 다른 실험을 실시했다.

미세하게 분쇄되고, 미발효, 냉동건조되고, 탈지된 브라질 코코아 열매를 아세톤 10ml 대 코코아가루 1g의 비율로 아세톤으로 추출하여 조생의 폴리페놀 옥시다제(P.P.O)를 제조했다. 슬러리를 3,000rpm으로 15분동안 원심분리했다. 이를 3회 반복하여, 매회에 상등액을 버리고, 4회 추출액을 뷔후너 여과깔대기를 통해 부었다. 아세톤 분말을 공기건조시키고, 이어서 맥로드와 킬라라에 의해 설명된 방법(1983)에 따라서 분석했다. 조생의 폴리페놀용액에(100㎎/10mL 시트레이트-포스페이트 완충액, 0.02M, pH 5.5), 아세톤분말(4,000μ/㎎ 단백질) 100㎎을 첨가하고 30분동안 교반시켜서, 슬러리내에 기포가 발생되게 했다. 시료를 5,000xg으로 15분간 원심분리하고, 상등액을 20ml에 에틸아세테이트로서 3회 추출했다. 에틸아세테이트 추출물을 모으고, 부분 진공하에서 증류에 의하여 건조하고, 물 5ml를 첨가하고, 이어서 동결건조했다.

그후에, 이 물질을 Hela 세포에 대하여 분석하고 용량-반응을 효소로 처리하지 않은 조생의 폴리페놀 추출액과 비교했다. 결과는(제15M도) 효소로 산화된 추출물에 대한 용량-반응 곡선상에 상당한 이동이 있음을 보여주며, 산화된 생성물들은 이들이 천연적 형태일 때 보다도 더 억제성이 있음을 보여준다.

실시예 9 : 프로시아니딘을 포함하는 코코아 추출물의 산화방지 활성

문헌상에 나타난 증거는 천연물 유래의 산화방지제(비타민 C, E와 B-카로텐) 소비와 암을 포함하는 질병의 저하된 발생율 사이의 관계를 암시해준다(디자이닝후드, 1993, Caragay, 1992). 이 산화방지제들은 여러 가지 유형의 종양촉진에 포함된 어떠한 산화 및 자유라디컬 공정에 영향을 미치는 것으로 생각된다. 또한, 항발암 물질인 것으로 알려진 몇몇의 식물성 폴리페놀성 화합물들은 실질적으로 산화방지 활성을 갖는다(호 등, 1992 ; 후암 등, 1992).

프로시아니딘을 포함하는 코코아 추출물들이 산화방지특성을 갖고 있는지를 확인하기 위해, 표준 랜시매트(Rancimat) 방법이 사용되었다. 실시예 1, 2와 3에 설명된 방법들을 이용하여 코코아 추출물을 제조하였고, 이들을 겔투과 크로마토그래피하여 두가지의 분획을 얻었다. 이들 두가지 분획들은 분획 A∼C 및 D와 E(제1도 참고)를 실질적으로 조합한 것으로서, 이들의 산화방지특성을 합성 산화방지제인 BHA와 BHT의 특성과 비교했다.

땅콩 껍질을 제거한 후에, 볶지 않은 땅콩을 압출시켜서 땅콩기름을 얻었다. 각각의 테스트용 화합물을 ∼100ppm과 ∼20ppm의 두가지 농도로(실제 농도는 표 7애 설명) 오일에 첨가했다. 메탄올에 가용화된 산화방지제 50μl를 산화방지제의 분산을 돕기 위하여 각각의 시료에 첨가했다. 대조군 시료는 산화방지제를 포함하지 않는 메탄올 50μl로 제조했다.

산화안정도 테스트를 위해 100℃에서, 공기 20cc/분으로 랜시매트 안정도 테스트법을 사용하여 시료를 2차례 평가했다. 실험매개변수들은 활성산소법(Active Oxygen Method, AOM) 또는 신속한 안정도테스트(반 우스텐 등, 1981)에 사용된 것들과 조화를 이루도록 선택했다. 전형적인 랜시매트 기록은 제16도에서 알 수 있다. 결과들은 표8에 보고되며, 시간은 100meq의 과산화물 수준에 도달하는 데 필요한 시간이다.

표 7 : 산화방지제들의 농도

표 8 : 여러 가지 산화방지제에 따른 땅콩기름의 산화안정도

이 결과들은 테스트한 첨가제들 모두 콩기름의 산화안정도를 증가시킴을 보여준다. 산화안정도에서 가장 높은 증가는 코코아의 조생의 에틸아세테이트 추출물을 첨가한 시료에서 나타났다. 이 결과들은 프로시아니딘을 포함하는 코코아 추출물들이 인공으로 합성한 BHA와 BHT 동일량 보다도 더 크거나 또는 동등한 산화 방지 잠재력을 갖고 있음을 보여준다.

따라서, 본 발명은 공지된 BHA 또는 BHT의 용도, 예를들면 산화방지제 및/또는 식품첨가제와 같은 용도로 BHT 또는 BHA 대신에 사용될 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명은 식용원으로 부터 유래됨을 주목해야 한다. 이러한 결과들로 부터, 숙달된 당업자들은 실험을 행하지 않고도, “BHA 또는 BHT”의 용도에 본 발명이 사용될 적당한 양, 즉 식품에 첨가할 양을 쉽게 결정할 수 있다.

실시예 10 ; 토포아이소머라제 Ⅱ 억제연구

DNA 토포 아이소머라제 Ⅰ과 Ⅱ는 DNA 사슬의 파괴와 재결합을 촉매화하는 효소들이며, 이에 의하여 DNA의 위상상태가 조절된다(왕, 1985). 토포아이소머라제의 세포내 기능에 관한 연구이외에도, 가장 중요한 발견들중의 하나는 혼입되지 않는(nonintercalating) 에피포도필로톡신 뿐 아니라 혼입되는(intercalating) 제제(m-AMSA, 아드리아마이신^®, 엘립타이신)를 포함하는, 임상적으로 중요한 수많은 항종양 화합물들의 일차적 세포 표적으로서의 토포아이소머라제 Ⅱ를 동정했다는 것이다(야마시타 등, 1990). 몇몇의 항종양 약제들이, 변성제에 노출시에 DNA 절단을 일으키는 DNA-토포아이소머라제 Ⅱ 콤플렉스(“절단가능한 콤플렉스”)를 안정화시키는 통상적인 성질을 갖는 것으로 알려졌다(뮬러등, 1989). 항종양 약제들에 의한 절단가능한 콤플렉스 생성은 세포의 죽음을 초래할 수 있는 부피가 큰 DNA 첨가물을 만든다는 것을 암시한다.

이러한 매력적인 모델에 따라서, DNA-토포아이소머라제Ⅱ 절단 가능한 콤플렉스를 위한 특이하고, 신규한 유발물질을 항암, 항종양 또는 항신생물체로서 유용하다. DNA를 표적으로 하는 활성을 갖는 세포독성 화합물들을 동정하기 위한 시도로서, 몇개의 DNA-손상에 민감한 세포주에 대한 증가된 세포독성 활성분석과 림프종으로 부터 얻은 인간의 토포아이소머라제Ⅱ를 이용한 효소분석을 위해 코코아 프로시아니딘을 스크리닝 했다.

A. 토포아이소머라제Ⅱ에 의한 운동핵질 DNA의 사슬붕괴

뮬러등(1989)에 의하여 설명된, 운동핵질 DNA의 토포아이소머라제Ⅱ에 의한 사슬붕괴의 생체외 억제는 다음과 같이 실시했다. 토포아이소머라제Ⅱ 활성을 포함하는 핵 추출물들은 밀러등(1981)과 댕크스 등(1988)의 방법의 개량법에 의하여 인간 림프종으로 부터 제조했다. 정제한 효소의 한 유니트는 34℃에서 30분내에 운동핵질 DNA 0.25/㎍을 사슬붕괴하는데 충분하다. 운동핵질 DNA는 트리파노솜 크리티디아 파시컬라타(trypanosome Crithidia fasciculata)로 부터 얻었다. 각 반응은 H₂O 19.5μL, 10X 완충액 2.5μl(1X 완충액은 50mM 트러스-HCl, pH 8.0, KCl 120mM, MgCl₂ 10mM, 0.5mM ATP, 0.5mM 디티오트레이톨과 30㎍ BSA/ml를 포함), 운동핵질 DNA 1μl(0.2㎍) 및 DMSO를 포함하는 여러 가지 농도의 코코아 프로시아니딘 테스트용 분획 1㎕ 등을 포함하는 0.5ml 마이크로원심관내에서 실시했다. 이 조합물을 완전히 혼합시키고, 얼음상에 보관했다. 34℃에서 30분동안 수조(워터배드)에서 항온처리하기 직전에 토포아이소머라제 1 유니트를 첨가했다. 항온처리를 한 다음에, 5μl 스톱 완충액(5％ 사르코실, 0.0025％ 브로모페놀 블루, 25％ 글리세롤)을 첨가하여 사슬붕괴 분석을 멈추고, 얼음 위에 놓았다. DNA를 에티디움브로마이드(0.5㎍/ml)를 포함하는 TAE 완충액중의 1％ 아가로스 겔상에서 전기영동 처리했다. 310㎚ 파장에서 UV 조명은 DNA의 가시화를 가능케 했다. 폴라로이드 랜드 카메라를 사용해 겔의 사진을 찍었다. 제17도는 이 실험의 결과를 보여준다. 완전히 연결된 운동핵질 DNA는 1% 아가로스 겔내로 이동하지 않는다. 토포아이소머라제Ⅱ에 의한 운동핵질 DNA의 사슬붕괴는 겔내로 이동하는 단량체 DNA(단량체 써클, 형상 I과 Ⅱ)의 밴드를 생성시킨다. 코코아 프로시아니딘의 첨가에 의한 효소의 억제는 농도의 증가에 따른 단량체 밴드의 점진적인 소실에 의해 분명히 확인된다. 이 결과들을 기초로 하여, 코코아 프로시아니딘 분획 A, B, D와 E는 0.5∼5.0㎍/ml의 농도범위에서 토포아이소머라제Ⅱ를 억제한다. 이 억제제 농도는 미토키산트론과 m-AMSA[4'- (9-아크리디닐아미노)메탄설폰-m-아니시다이드]에 대해 얻은 것과 매우 유사했다.

B. 약제에 민감한 세포주들

코코아 프로시아니딘을 몇가지의 DNA-손상에 민감한 세포주에 대한 세포독성을 위해 스크리닝했다. 세포주들중의 하나는 P. Jeggo(Kemp 등, 1984)에 의해 개발된 xrs-6 DNA 이중사슬 파단부위 복구 돌연변이체였다. xrs-6 세포주의 DNA 복구결핍은 이들을 특히 X-조사에 예민하게 했고, 볼레오마이신과 같은 DNA 이중사슬 파단을 일으키는 화합물 및 토포아이소머라제Ⅱ를 억제하는 화합물에 예민하게 했으며, 따라서 워터스(waters)등 (1991)에 의해 암시된 바와 같이 이중사슬 파단을 간접적으로 유도하였다. 복구결핍 세포주애 대한 세포독성과 DNA 복구에 능숙한 CHO 세포주인 BR1에 대한 세포독성을 비교했다. 복구결핍(xrs-6) 세포주에 대한 향상된 세포독성은 DNA 절단가능한 이중사슬 파단부위 형성에 대한 증거로 해석된다.

DNA 복구가능한 CHO 세포주, BR1은 배로우(Barrows) 등에 의해 개발되었으며(1987), 정상적인 CHO DNA 복구효소이외에 O⁶-알킬구아닌-DNA-알킬전이효소를 발현한다. CHO 이중사슬 파단 복구 결핍된 세포주(xrs-6)는 P. Jeggo박사와 그의 공동연구자에 의해 개발되었다(Jeggo 등, 1989). 이들 두가지 세포주들은 실시예 6에서 설명한 바와 같은 혈청과 항생물질을 포함하는 알파-MEM 배지내에서 단층으로 성장했다. 세포들을 가습상태의 5% CO₂ 대기하에서 37℃로 유지했다. 코코아 프로시아니딘으로 처리 하기전에, 단층으로 성장한 세포들을 트립신으로 처리하여 분리했다. 분석은 실시예 6에 설명된 MTT 분석방법을 사용해 실시했다. 결과는(제18도) xrs-6 세포들에 대한 세포독성이 향상되지 않았음을 보여주며, 이는 코코아 프로시아니딘이 절단가능한 이중사슬 파단부위 형성이외의 다른 방법으로는 토포아이소머라제Ⅱ를 억제하지 못함을 나타낸다. 즉, 코코아 프로시아니딘은 토포아이소머라제Ⅱ가 절단할 수 없는 콤플렉스를 만들기 위하여 DNA와 서로 반응을 하기전에 토포아이소머라제Ⅱ와 서로 반응한다는 것이다.

절단할 수 없는 콤플렉스를 만드는 화합물들은 대체적으로 신규의 발견물이다. 안트라사이클린, 포도필린알카로이드, 안트라센디온, 아크리딘 및 엘립티씬류들은 모두가 항암, 항종양 또는 항신생물 치료 용도로 인정을 받았으며, 이들은 절단가능한 콤플렉스(Liu, 1989)를 만든다. 최근에 몇가지의 새로운 부류의 토포아이소머라제Ⅱ 억제제들은 절단가능한 콤플렉스를 만들지 않는 것으로 확인되었다. 이들은 아몬아파이드(Hsiang 등, 1989), 디스타마이신(Fesen등, 1989), 후라벤노이드(야마시타 등, 1990), 새인토핀(야마시타 등, 1991), 멤브라논(드레이크 등, 1989), 테르페노이드(가와다 등, 1991), 안트라피라졸(프라이 등, 1985), 디옥소피페라진(다나베 등, 1991)과 마린 아크리딘-데르씨틴(뷰레스등, 1989)을 포함한다. 절단가능한 콤플렉스가 생성되기전에 코코아 프로시아니딘은 토포아이소러라제Ⅱ를 비활성화하기 때문에, 이들은 단독으로 또는 다른 공지의 기계작용학적으로 정의된 토포아이소머라제Ⅱ 억제제와 조합되어 화학요법제로서의 가치를 갖는다. 코코아 프로시아니딘은 또한 새로운 부류의 토포아이소머라제Ⅱ 억제제일 것으로 보여지며(가시와타 등, 1993), 따라서 다른 공지의 억제제들 보다는 독성이 적으며, 이에 따라서 화학요법에서 이들의 효용성이 높다. 다양한-약제내성을 갖도록 막에 결합된 글리코 프로테인(gp170)을 발현하는 인간의 유방암 세포주 MCF-7(ADR)와 (레오네사 등, 1994), 이의 모세포주 MCF-7 p168은 코코아 분획 D와 E의 효과를 검정하는데 사용되었다. 제19도에서 알 수 있듯이, 모세포주는 분획 D와 E의 용량 수준을 증가시킴에 따라 억제되는 반면에 아드리아마이신(ADR) 내성주는 더 많은 용량으로도 억제되지 않았다. 이 결과는 코코아 분획 D와 E가 다양한-약제 내성 세포주에 관하여 효과가 있음을 보여준다.

실시예 11 : 프로시아니딘의 합성

델쿠어 등(1983)에 의해 개발된 방법을 변형시켜서 프로시아니딘을 합성하였다. 환원조건하에서, 디하이드로쿼세틴과 (+)-카테킨을 축합시키는 것 이외에, 미발효된 코코아 열매에서 천연적으로 생성되는 (-)-에피카테킨의 농도를 높히기 위해 (-)-에피카테킨을 사용했다. 합성된 생성물을 분리, 정제하고, 분석하여 실시예 3, 4, 5에 설명된 방법에 따라 동정했다. 이 방법으로, 비후라베노이드, 트리후라베노이드와 테트라후라베노이드가 제조되었으며, 코코아 추출물에 관해 위에서 설명한 방법에서 분석용 표준물질로 사용되었다.

실시예 12 : 정상적 상 반-정제 분획의 분석

폴리페놀 추출물들은 조성적으로 복잡하므로 더 이상의 정제와 용량-반응분석 및 포괄적 구조 확인을 위하여, 어떤 성분들이 암세포주들에 대해 활성이 있는가를 결정할 필요가 있다. 정상적 상 반-정제 HPLC 분리법(실시예 3B)이 올리고머 크기를 바탕으로 한 코코아 프로시아니딘을 분리하는데 사용되었다. 원래의 추출물 이외에, 12개의 분획이 제조되었으며(제2B와 15O도) 어떤 올리고머가 가장 큰 활성을 갖는가를 결정하기 위하여 Hela 세포에 대하여 100㎍/ml와 25㎍/ml 용량에서 분석했다. 제20도중에서 알 수 있듯이, 분획 4-11(오량체-십이량체)은 IC₅₀값이 약 25㎍/ml 임을 보여준다. 이결과는 이같은 특정의 올리고머들이 Hela 세포에 대해 가장 큰 활성을 갖고 있음을 보여준다.

또한, 코코아 분획 D와 E의 정상적 상 HPLC 분석은 이 분획이 상기 올리고머들로 강화된 것임을 보여준다.

전술한 내용들로 부터, 본 발명의 추출물과 코코아 폴리페놀들, 본 발명의 조성물과 방법 및 키트(kit)는 효용성이 있음이 분명하다. 이에 관하여, 본 발명은 식용원으로 부터 유래되었으며, 시험관내 활성은 상술한 용량을 특히 고려한다면, 생체내에서도 최소한 활성을 나타낼 수 있다.

부가적으로, 상술한 내용들은, 본 발명의 추출물, 코코아 폴리페놀, 조성물, 본 발명의 방법과 키트는 BHT와 BHA와 마찬가지로 항산화제 활성과 산화안정성을 갖고 있음을 보여준다. 따라서, 본 발명은 공지의 BHT와 BHA의 용도, 예를들면 산화방지제 또는 산화방지용 식용첨가제로서 BHT 또는 BHA 대신에 사용될 수 있다.

또한 본 발명은 최근에 그 효용성이 알려진 토포아이소머라제-억제제 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 계획된 많은 조성물들과 방법들이 있다. 예를들면, 산화방지제 또는 방부제 조성물, 토포아이소머라제-억제용 조성물, 식품 또는 어떤 소기의 대상물을 산화로부터 보존하기 위한 방법, 본 발명의 추출물 및 또는 코코아 폴리페놀(들)을 포함하는 토포아이소머라제를 억제하는 방법, 또는 식품, 어떤 대상물 또는 토포아이소머라제를 각각의 조성물 또는 본 발명의 추출물 및/또는 코코아 폴리페놀(들)과 접촉시키는 것을 포함하는 토포아이소머라제를 억제하는 방법등이다.

본 발명의 바람직한 실시예에서 상세하게 설명되었으나, 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 본 발명은 위에서 설명한 특별한 상세내용에 의하여 제한을 받지 않으며, 본 발명의 정신과 범위를 빗어나지 않고도 많은 변경과 변형이 이루어질 수 있음을 이해해야할 것이다.

Claims (27)

1. 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 코코아 폴리페놀을 포함하는 코코아 추출물:

   미발효된 또는 부분적으로 발효된 코코아 열매들을 분말화하는 단계;

   상기 분말을 탈지하는 단계;

   상기 분말로부터 용매 추출기술로 코코아 폴리페놀을 추출하는 단계; 및,

   상기에서 얻은 코코아 추출물을 정제하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 추출물을 겔 투과 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 또는 겔 투과 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 정제하는 것을 더 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 코코아 추출물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, (-)-에피카테킨, 프로시아니딘B-2, 사량체 내지 십이량체의 프로시아니딘 올리고머, 프로시아니딘B-5, 프로시아니딘A-2 및 프로시아니딘C-1으로부터 선택되는 적어도 하나의 코코아 프로시아니딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 코코아 추출물.
4. 코코아 프로시아니딘 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체, 육량체, 칠량체, 팔량체, 구량체, 십량체, 십일량체 및 십이량체의 각각을 적어도 하나씩 포함하는, 코코아폴리페놀을 포함하는 코코아 추출물.
5. 키산틴 알카로이드를 포함하지 않고, 다음 단계들을 포함하는 방법에 의해 얻어지는, 코코아 폴리페놀을 포함하는 코코아 추출물:

   코코아 열매들을 분말화하는 단계;

   상기 분말을 탈지하는 단계;

   상기 분말로부터 용매 추출기술로 코코아 폴리페놀을 추출하는 단계; 및,

   상기 추출물에서 키산틴 알카로이드를 제거하여, 키산틴 알카로이드가 없는 분획을 얻는 단계.
6. 제1항에 있어서, 상기 코코아 열매를 분말화하는 과정은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 코코아 추출물:

   열매와 펄프를 동결건조하는 단계;

   동결건조된 재료를 탈펄프화하는 단계;

   동결건조된 코코아 열매를 탈피하는 단계; 및,

   탈피된 열매를 분쇄하는 단계.
7. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 친액화된 형태인 것을 특징으로 하는 코코아 추출물.
8. 적합한 담체, 및 적어도 하나의 사량체 내지 십이량체의 코코아 프로시아니딘 올리고머를 포함하는 코코아 추출물을 포함하는 경구투여에 적합한 고체 조성물.
9. 적합한 담체, 및 에피카테킨, 프로시아니딘B-2, 이량체 내지 십이량체의 프로시아니딘 올리고머, 프로시아니딘B-5, 프로시아니딘A-2 및 프로시아니딘C-1으로부터 선택되는 적어도 하나의 코코아 프로시아니딘을 포함하는 미발효된 또는 부분적으로 발효된 코코아 열매의 추출물을 포함하는 경구투여에 적합한 고체 조성물.
10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 추출물이 효소적으로 산화된 것을 특징으로 하는 고체 조성물.
11. 적합한 담체 및 합성 코코아 프로시아니딘 올리고머 이량체 내지 십이량체 또는 그의 글리코사이드 또는 에스테르를 포함하는 경구투여에 적합한 고체 조성물.
12. 제11항에 있어서, 상기 에스테르는 갈레이트 에스테르인 것을 특징으로 하는 고체 조성물.
13. 제8항, 제9항 및 제11항중 어느 한 항에 있어서, 씹을 수 있는 고체 조성물인 것을 특징으로 하는 고체 조성물.
14. 제8항, 제9항 및 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 코코아 향 또는 초콜렛 향의 고체 조성물인 것을 특징으로 하는 고체 조성물.
15. 제8항, 제9항 및 제11항중 어느 한 항에 있어서, 정제, 캡슐 또는 환인 것을 특징으로 하는 고체 조성물.
16. 적합한 담체, 및 적어도 하나의 사량체 내지 십이량체의 프로시아니딘 올리고머를 포함하는 코코아 추출물을 포함하는 경구투여에 적합한 액상 제제.
17. 적합한 담체, 및 에피카테킨, 프로시아니딘B-2, 이량체 내지 십이량체의 프로시아니딘 올리고머, 프로시아니딘B-5, 프로시아니딘A-2 및 프로시아니딘C-1으로부터 선택되는 적어도 하나의 코코아 프로시아니딘을 포함하는 미발효된 또는 부분적으로 발효된 코코아 열매의 추출물을 포함하는 경구투여에 적합한 액상 제제.
18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 추출물이 효소적으로 산회된 것을 특징으로 하는 액상 제제.
19. 적합한 담체, 및 합성 코코아 프로시아니딘 올리고머 이량체 내지 십이량체 또는 그의 글리코사이드 또는 에스테르를 포함하는 경구투여에 적합한 액상 제제.
20. 제19항에 있어서, 합성 코코아 프로시아니딘 올리고머 이량체 내지 오량체 또는 그의 글리코사이드 또는 에스테르를 포함하는 액상 제제.
21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 에스테르는 갈레이트 에스테르인 것을 특징으로 하는 액상 제제.
22. 제16항, 제17항 및 제19항중 어느 한 항에 있어서, 현탁액, 시럽 또는 엘릭스인 것을 특징으로 하는 액상 제제.
23. 적어도 하나의 코코아 프로시아니딘 올리고머 오량체 내지 십이량체를 포함하는 코코아 추출물을 포함하는 항신생물 조성물.
24. 합성 코코아 프로시아니딘 올리고머 또는 그의 글리코사이드 또는 에스테르 유도체를 포함하는 항신생물 조성물.
25. 제23항 또는 제24항에 있어서, 유방암, 비인강암, 신장암, T-세포 백혈병, 전립선암 또는 경부암의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 항신생물 조성물.
26. 적어도 하나의 코코아 프로시아니딘 올리고머 오량체 내지 십이량체를 포함하는 코코아 추출물을 포함하고 토포아이소머라제 억제활성을 나타내는 항암 또는 항종양제 조성물.
27. 합성 프로시아니딘 올리고머 오량체 내지 십이량체를 포함하고 토포아이소머라제 억제활성을 나타내는 항암 또는 항종양제 조성물.

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