CN104039329B - 含去鼠李糖洋丁香酚苷的橄榄提取物 - Google Patents

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Abstract

本发明在于提供在生物体内长时间发挥强抗氧化作用的饮食品、医药保健品(Quasi‑drug)及医药。通过使橄榄提取物含有去鼠李糖洋丁香酚苷(desrhamnosyl acteoside)可赋予强抗氧化活性。另外，通过将含洋丁香酚苷组合物进行糖苷水解酶处理可制备含去鼠李糖洋丁香酚苷组合物。

Description

含去鼠李糖洋丁香酚苷的橄榄提取物
技术领域
本发明涉及含有去鼠李糖洋丁香酚苷(以下，称为“DRA”。)的橄榄提取物、血中抗氧化剂及其制造方法。具体而言，涉及含有DRA且具有血中抗氧化作用的橄榄提取物、含有DRA作为有效成分的血中抗氧化剂及其制造方法。
背景技术
橄榄(Olea europaea)是属于木犀科橄榄属的植物，以地中海地域为首广泛栽培。其果实作为橄榄油提取、食用在全世界广泛利用，食用经验非常丰富。
据报道在橄榄的果实中包含橄榄苦苷、羟基酪醇、洋丁香酚苷等的多酚(非专利文献1、2)，橄榄提取物、上述的多酚成分具有动脉硬化抑制作用(非专利文献3)、高血压抑制作用(专利文献1)、骨重量减少抑制作用(非专利文献4)等。另外，据报道橄榄提取物具有抗氧化、美白、皮肤的抗老化、抗肿瘤效果(专利文献2)。
已知洋丁香酚苷是橄榄中所包含的代表性多酚成分之一，具有抗氧化活性(非专利文献2)。
另一方面，据报道DRA具有从洋丁香酚苷除去了鼠李糖单元的结构，作为木通苯乙醇苷A(calceolarioside A)从玄参科植物(Calceolaria hypericina)中被提纯分离(非专利文献5)外，还在多种植物中存在，但未报道在橄榄中存在。另外，关于抗氧化活性，据报道在体外的抗氧化活性的对比中，与DRA相比洋丁香酚苷的活性强(非专利文献6)。
然而，据报道在研究人摄取了橄榄果实时的多酚类的吸收与排出、血中抗氧化的经时变化时，结果全都在短时间内被清除(非专利文献7)。进而，还报道已知具有抗氧化作用的洋丁香酚苷在经口摄取时其吸收性存在问题(非专利文献8)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1 日本特开2005-334022号公报
专利文献2 日本特开2002-186453号公报
非专利文献
非专利文献1 J.Agric Food Chem，vol.52，pp479-484，2004
非专利文献2 J Agric Food Chem，vol.53，pp8963-8969，2005、
非专利文献3 Atherosclerosis，vol.188，No.1，pp35-42，2006
非专利文献4 Clin Nutr，vol.25，No.5，859-868，2006
非专利文献5 Gazzetta Chimica Italiana，116，P431-433，1986
非专利文献6 Planta Medica，70(1)，50-53，2004
非专利文献7 Phytomedicine，vol.14，pp659-667，2007
非专利文献8 J.Chromatogr.B，844(1)，pp89-95，2006
发明内容
如上所述，在橄榄的果实中包含作为抗氧化多酚的洋丁香酚苷，洋丁香酚苷在体内吸收性上存在问题，经口摄取时的效果并不充分。另外，其抗氧化作用在摄取后为瞬时，作为营养强化剂等利用时，期望效果持续更长时间。
本发明的目的在于提供可在生物体内高效地发挥效能，长时间显示血中抗氧化作用的食品、医药保健品及医药。
本发明者为了解决上述课题进行了深入的研究，结果令人吃惊的是，发现与体外的结果不同，在生物体内DRA显示出了比洋丁香酚苷强的抗氧化作用。另外，发现其抗氧化作用因DRA与洋丁香酚苷的消化性的不同，经过长时间仍显示作用。进而，还表明DRA与洋丁香酚苷相比体内吸收性高，可高效地发挥作为代谢物的羟基酪醇及咖啡酸具有的各种各样的生理活性。另外，发现通过用糖苷水解酶处理洋丁香酚苷可制备DRA，从而完成了本发明。
即，本发明包含下述的发明，但不限定于以下内容。
(1)一种橄榄提取物，其特征在于，包含DRA(以下称为“含DRA橄榄提取物”。)。
(2)根据(1)所述的橄榄提取物，其特征在于，包含0.1重量％以上的DRA。
(3)根据(2)所述的橄榄提取物，其特征在于，包含1重量％以上的DRA。
(4)一种组合物，其特征在于，配合了(1)～(3)中的任一种。
(5)根据(4)所述的组合物，其特征在于，组合物为饮食品。
(6)一种饮食品，其特征在于，包含0.1重量％以上的DRA。
(7)根据(6)所述的饮食品，其特征在于，包含橄榄提取物。
(8)一种血中抗氧化剂，其特征在于，包含DRA。
(9)根据(8)所述的血中抗氧化剂，其特征在于，包含0.1重量％以上的DRA。
(10)一种组合物，其特征在于，配合了(8)或(9)的血中抗氧化剂。
(11)根据(10)所述的组合物，其特征在于，组合物为饮食品。
(12)一种制造方法，其为含DRA组合物的制造方法，其特征在于，包含将含洋丁香酚苷组合物用具有去鼠李糖活性的糖苷水解酶处理的工序。
(13)根据(12)所述的制造方法，其特征在于，含洋丁香酚苷组合物为橄榄提取物。
(14)根据(12)或(13)所述的制造方法，其特征在于，糖苷水解酶为柚苷酶。
本发明的含DRA橄榄提取物及血中抗氧化剂在生物体内长时间发挥强的抗氧化作用。因此，作为饮食品、医药保健品及医药有用。
附图说明
图1为表示将通过酶反应生成的DRA量的HPLC峰面积作为指标的经时变化的图。
图2为表示将由酶反应引起的洋丁香酚苷减少的HPLC峰面积作为指标的经时变化的图。
图3表示将DRA或洋丁香酚苷作为CMC混悬液给予时的血中FRAP(Ferric ReducingAbility of Plasma)活性的经时变化。
图4表示将DRA作为橄榄油溶液给予时的血中FRAP活性的经时变化。
图5表示将DRA或洋丁香酚苷作为CMC混悬液给予时的血中ORAC(Oxygen RadicalAbsorbance Capacity)活性的经时变化。
图6表示将DRA作为橄榄油溶液给予时的血中ORAC活性的经时变化。
图7为表示给予0.5％CMC悬浊液时的大鼠血中的洋丁香酚苷、DRA、羟基酪醇、咖啡酸浓度的经时变化的图。
图8为表示给予洋丁香酚苷500mg/0.5％CMC悬浊液时的大鼠血中的洋丁香酚苷、DRA、羟基酪醇、咖啡酸浓度的经时变化的图。
图9为表示给予DRA423mg/0.5％CMC悬浊液时的大鼠血中的羟基酪醇、咖啡酸浓度的经时变化的图。
图10为表示与洋丁香酚苷相比，DRA的体内吸收量(AUC)多的图。
图11表示将含DRA提取物作为橄榄油溶解液单次给予时的血中FRAP活性的经时变化。
图12表示将含DRA橄榄提取物或酶未处理的橄榄提取物作为橄榄油混悬液单次给予时的血中FRAP活性的经时变化。
图13表示将含DRA橄榄提取物或酶未处理的橄榄提取物作为橄榄油混悬液连续给予时的末次给予9小时后的血中FRAP活性。
具体实施方式
本发明涉及含有DRA且在生物体内长时间具有强抗氧化作用的橄榄提取物、含有DRA的饮食品、血中抗氧化剂及其制造方法。
以下，关于本发明的实施方式进行进一步详细说明。
<含DRA橄榄提取物>
本发明的含DRA橄榄提取物含有DRA。
以下示出DRA的结构式。
Figure BDA0000535246020000051
如前所述，据报道DRA是最初在1986年作为木通苯乙醇苷A(calceolarioside A)从玄参科植物(Calceolaria hypericina)中被提纯分离的，其后报道了在多种植物中存在，但未报道在橄榄中存在。相对于此，本发明的含DRA橄榄提取物中的DRA含量可以为极微量，包含0.1重量％以上、优选1重量％以上、进一步优选5重量％以上。
DRA可以通过将下述的洋丁香酚苷用酶处理得到，也可以通过其他方法得到。例如，相对于含洋丁香酚苷的橄榄提取物，通过使用可除去洋丁香酚苷的鼠李糖部分的酶在适合的条件下反应，可得到含有DRA的橄榄提取物。另外，也可通过从包含DRA的植物原料等提取DRA并添加在橄榄提取物中得到。
以下示出洋丁香酚苷的结构式。
Figure BDA0000535246020000052
本发明的含DRA橄榄提取物中只要包含DRA即可，其他的含有成分没有特别限制。作为其他的含有成分，可列举例如作为来自橄榄成分的洋丁香酚苷、羟基酪醇。其他成分的含量、DRA与其他含有成分的量比可任意设定。
橄榄是属于木犀科橄榄属的植物，任一个品种均可作为提取物制备的原料使用。若例示，则可适合地使用曼萨尼约(Manzanillo)、卢卡(Lucca)、Nevadillo Blanco、Mission、皮夸尔(Picual)、阿尔贝基纳(Arbequina)、欧西布兰卡(Hojiblanca)、山羊角(Cornicabra)、戈达尔(Gordal)、莫拉约罗(Moraiolo)、佛奥(Frantoio)、科拉蒂(Coratina)、莱星(Leccino)等的品种。
在橄榄提取物的制备中，可使用橄榄的果实、种子、叶、茎等中的任一个部位，但优选使用洋丁香酚苷含量多的部分，例如果实。橄榄果实可以直接使用生的果实，也可以使用通过冷冻干燥等干燥的果实。另外，也可以直接或者以干燥的状态使用从橄榄果实压榨油后的残渣。橄榄提取物的制备为将上述任一种作为原料进行溶剂提取来得到提取物。溶剂提取所使用的溶剂可以为极性溶剂也可以为非极性溶剂。可例示水、甲醇或乙醇等的醇类，乙二醇或丙二醇等的多元醇类，酮类等。优选60℃～90℃的热水。
由于本发明的含DRA橄榄提取物含有DRA因而具有各种效能。例如，与洋丁香酚苷相比DRA的体内吸收量高，可更高效发挥作为代谢物的羟基酪醇及咖啡酸具有的各种各样的生理活性。另外，摄取后经过长时间仍显示血中抗氧化活性。
DRA等的体内吸收量例如可通过将试验溶液给予实验动物，并在一定时间后采集血液测定浓度来进行评价。示出一个例子，使用导管将DRA的橄榄油混悬液(0.8mM)以5ml/kg的用量经口给予禁食过夜的大鼠。然后，在给予后以一定间隔由尾静脉采集血液到肝素采血管中，通过离心分离操作得到血浆样品进行浓度分析来评价。
作为DRA代谢物的羟基酪醇与咖啡酸的结构式如下所示。
Figure BDA0000535246020000061
已知羟基酪醇在具有非常强的抗氧化作用的同时，还具有防止从作为不良胆固醇的LDL成为进一步恶化的氧化LDL的功能。
咖啡酸是咖啡中所包含的多酚的一种，作为香气成分而已知。据报道该咖啡酸具有抑制癌细胞的转移、增殖的效果。
橄榄提取物作为食用在全世界广泛利用，食用经验非常丰富。因此，本发明的含DRA橄榄提取物可以直接作为饮食品等使用，也可以配合到饮食品、医药品等中。
直接作为饮食品等使用时，只要不损坏DRA的效果，即只要不产生与DRA不优选的相互作用，则可以根据需要混合其他的生理活性成分，例如，矿物质；维生素E、维生素C、维生素A等的维生素类；营养成分；香料；色素等其他的添加物。上述添加物中的任一种均可使用饮食品中通常使用的添加物。
另外，配合含DRA橄榄提取物，可制成功能性食品(包含健康辅助食品、营养功能食品、特别用途食品、特定保健用食品等的健康食品、动物用营养强化剂)、动物用饲料等。
<饮食品>
本发明涉及包含0.1重量％以上DRA的饮食品。优选包含橄榄提取物。
DRA可以通过将洋丁香酚苷用酶处理得到，也可以通过其他方法得到。例如，相对于洋丁香酚苷含有物，通过使用可除去洋丁香酚苷的鼠李糖部分的酶在适合的条件下反应，可得到DRA含有物。另外，也可从包含DRA的植物原料等提取DRA来得到。
可将饮食品的形态制成片剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、保健饮料剂(healthdrink)(包含溶液剂及混悬液剂)等的健康食品的形态，也可以制成清凉饮料、茶饮料、酸奶或乳酸菌饮料等的乳制品、调味料、加工食品、甜点类、糕点糖果(例如，口香糖、糖果、果冻)等的形态。本发明的饮食品中也可以包含作为食品允许的赋形剂、结合剂、包覆剂、崩解剂、添加剂等。
本发明的饮食品通过具有抗氧化活性，对与活性氧有关的损伤/疾病等的预防或改善有效。
<血中抗氧化剂>
本发明还涉及包含DRA的血中抗氧化剂。
如前所述，表明与迄今为止的报道不同，给予洋丁香酚苷时几乎没有看到血中抗氧化活性的升高，相对于此，给予DRA时在给予后血中抗氧化活性显著升高。进而，由于其效果可达到长时间，所以本发明的含DRA血中抗氧化剂为缓释性血中抗氧化剂。通过具有抗氧化活性，对与活性氧有关的损伤/疾病等的预防、改善或治療有效。
血中抗氧化活性例如可使用FRAP(Ferric Reducing Ability of Plasma)、ORAC(Oxygen Radical Absorbance Capaeity)进行评价。
本发明的血中抗氧化剂中DRA的含量没有特别限制，从效果方面看为0.1重量％以上、优选1重量％以上、更优选2重量％以上、进一步优选5重量％以上。DRA可通过将洋丁香酚苷进行酶处理得到，也可以通过其他方法得到。例如，相对于洋丁香酚苷含有物，通过使用可除去洋丁香酚苷的鼠李糖部分的酶在适合的条件下反应，可得到DRA含有物。另外，也可从包含DRA的植物原料等提取DRA来得到。
本发明的血中抗氧化剂可以为例如由片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂等进行的经口给予剂或者也可以为注射剂等的非经口给予剂的形态。其次，在本发明的血中抗氧化剂中可添加制剂上允许的赋形剂、结合剂、增量剂、分散剂或保存剂等。
本发明的血中抗氧化剂可以直接使用，另外也可以配合到饮食品、医药品等中。
直接作为饮食品等使用时，只要不损坏DRA的效果，即只要不产生与DRA不优选的相互作用，则可根据需要混合其他的生理活性成分，例如矿物质；维生素E、维生素C、维生素A等的维生素类；营养成分；香料；色素等其他的添加物。上述添加物中的任一种均可使用饮食品中通常使用的添加物。
<含DRA组合物的制造方法>
在本发明的制造方法中，从含洋丁香酚苷组合物来制备含DRA组合物。具体而言，通过糖苷水解酶处理来除去洋丁香酚苷的鼠李糖部分，可简便地制备包含DRA的组合物。
作为原料所使用的含洋丁香酚苷组合物只要是含有洋丁香酚苷的组合物即可，也可为经纯化的洋丁香酚苷，也可为洋丁香酚苷与橄榄苦苷、与羟基酪醇等其他多酚化合物等的混合物。另外，也可使用含有洋丁香酚苷的植物提取物。原料中的洋丁香酚苷的浓度可以考虑成为目标的生成物中的DRA含量来适当决定。如前所述，由于在橄榄中包含相对较多的洋丁香酚苷，适当使用公知的方法能够以所期望的比例得到含有洋丁香酚苷的橄榄提取物，所以在本发明的制造方法中为优选的原料。从该方面看，优选橄榄果实，也可使用市售橄榄果实的提取物粉末的溶解液。
所使用的糖苷水解酶只要具有从洋丁香酚苷除去鼠李糖的鼠李糖苷酶活性则可没有限制地使用。作为具有鼠李糖苷酶活性的酶，例如，可列举柚苷酶、橙皮苷酶(Hesperidinase)。酶处理条件可以考虑所使用的酶的最适反应温度、pH等来适当决定。例如，使用柚苷酶时，使用适合的试剂类将pH调节到3.5～5的范围内，在30～60℃、优选35～45℃范围的温度下进行反应。酶处理后使用例如将溶液的pH调节到3且在80℃以上加热10分钟等公知的适合的方法使酶失活。
所生成的含DRA组合物中的DRA浓度通过适当设定原料中的洋丁香酚苷浓度、酶添加量、反应时间等，可得到所期望的浓度。
通过酶反应所得到的含DRA组合物中的DRA的浓度及残留洋丁香酚苷的浓度可通过本领域技术人员已知的方法，例如通过HPLC分析进行测定。
也可从所得到的含DRA组合物将DRA分离纯化来利用。DRA的分离纯化方法可通过溶剂提取·色谱分离等本领域技术人员已知的方法来适当实施。
实施例
以下，根据实施例来说明本发明，但本发明不限定于这些实施例。
制备例1.橄榄提取物的制备
将8kg橄榄果实的油压榨残渣用32L80℃的热水提取2次每次30分钟。用尼龙网(日本理化学器械株式会社制、商品名：NRS-500)过滤后，通过使用了2张#131(φ330mm)滤纸+200g硅藻土(hy-flo-super cell)(Nacalai Tesque株式会社)的抽吸过滤来除去压榨残渣得到提取液。在用50％丙酮洗净并用水平衡化的5L Amberlite XAD7-HP树脂(Rohm andHaas Japan株式会社)(柱尺寸φ14×32cm)中总量负荷该提取液。用5L的水洗净后，依次用20L的水、35L的15％乙醇水溶液、20L的60％乙醇水溶液洗脱。将15％洗脱组分与60％洗脱组分各自减压浓缩后进行冷冻干燥，分别得到了37.2g与66.0g的分馏物。其中，将从60％洗脱组分所得到的分馏物作为橄榄提取物(洋丁香酚苷含量9.1％)用于后面的动物实验。
制备例2.洋丁香酚苷的制备
将100g橄榄果肉的提取物粉末(Indena公司制的OLEASELECT(商标)(批号10219))溶解于1200ml甲基乙基酮与600ml蒸馏水中，用3L容量的分液漏斗充分振荡回收有机层。在水层中加入1200ml甲基乙基酮充分振荡回收有机层，进一步重复同样的操作。合并总计3次的有机层并进行浓缩、冷冻干燥，得到52.5g的干燥物。
将该干燥物总量溶解于200ml的70％乙醇水溶液中，进一步用水稀释到10倍后负荷于用水平衡化了的1L的MCI GEL CHP-20P(三菱化学株式会社制、75-150μm)中。流过10L的10％乙醇水溶液后，分别用各1L的12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％、25％、27.5％、30％、35％的乙醇水溶液，进而用2L的40％乙醇水溶液依次进行洗脱(乙醇浓度全部为V/V％)。从12.5％到27.5％为止的洗脱液分离回收为4个馏分每个馏分各250ml，其中将从20％洗脱液的第4馏分到25％洗脱液的第3馏分为止进行合并、浓缩从而得到5.98g纯化洋丁香酚苷。
实施例1.DRA的制造-1
将0.37mg柚苷酶(来自Penicillium decumbens、300单位/g、Sigma公司制)混悬于1.68ml0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)中来制备0.22mg/ml的酶液(简称：1/10)。将该1/10酶液用0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)稀释，并制备3倍、10倍、30倍稀释的酶液(各自的简称：1/30、1/100、1/300)。采集0.9ml各自的酶液到螺口玻璃试管中，并添加0.1ml制备例2所得到的纯化洋丁香酚苷的50％乙醇水溶液(20mg/ml)，在40℃下振荡(100-130次/分钟、Water BathShaker MM-10型、大洋科学工业株式会社(现为TIETECH株式会社)制)。反应开始1、2、3、4、5、24小时后采集0.1ml，以除蛋白为目的，添加等量冰藏的乙腈进行搅拌，并在冰藏下静置10分钟后，进行离心分离(10000转、10分钟、5℃、微量高速冷却离心分离机MX-100型、株式会社Tomy精工制)。将4μl所得到的离心分离上清供于下述分析条件下的HPLC分析。同样地处理酶无添加组的第5、24小时，并测定洋丁香酚苷的稳定性(简称：Ez(-))。此外，通过LC/MS分析确认了反应生成物为DRA。
<HPLC分析条件>
系统：Waters 2690/2695分离模块、996光电二极管阵列检测器
色谱柱：Develosil(商标)RPAQUEOUS-AR-5(3*150mm)
流动相：A：0.1％甲酸-15％乙腈/蒸馏水、B：0.1％甲酸-50％乙腈/蒸馏水
程序：0分钟(0％B)、30分钟(100％B)
流速：0.43ml/分钟
进样量：4μl
检测波长：280nm
在上述分析条件下，DRA在8.958±0.008分钟(n＝24)洗脱，洋丁香酚苷在9.348±0.009分钟(n＝18)洗脱。以HPLC的峰面积为指标的经时变化的结果如图1及图2所示。可确认伴随着洋丁香酚苷的减少DRA生成。
实施例2.DRA的制造-2
将4g制备例2所得到的纯化洋丁香酚苷溶解到100ml50％乙醇水溶液中。将该溶解液总量添加到2L的0.1M醋酸缓冲液(pH4.0)中保持在40℃，添加400mg柚苷酶(来自Penicillium decumbens、300单位/g、Sigma公司制)。在40℃搅拌3小时后，立即将反应液总量负荷到用水平衡化了的700ml的MCIGEL CHP-20P(三菱化学株式会社制、75-150um)中。用2L的水洗净后，流过2L的15％乙醇水溶液、1200ml的20％乙醇水溶液。接着，用各750ml的22.5％、25％、27.5％的乙醇水溶液进行洗脱，分别分离为3个组分每个组分各250ml。进而，用1250ml的30％乙醇水溶液进行洗脱，分为5个组分每个组分各250ml。其中，分别浓缩27.5％洗脱液的第1及第2组分的合并组分、从27.5％洗脱液的第3组分到30％洗脱液的第3组分为止的合并组分，分别得到438mg与1.562g的干燥物。使用从27.5％洗脱液的第3组分到30％洗脱液的第3组分的干燥物进行MS及NMR解析，确认为DRA。
实施例3.含DRA橄榄提取物的制造-1
将160ml蒸馏水在40℃孵育，添加4g橄榄果肉提取物粉末(Indena公司制OLEASELECT(商标)(批号10219))的20ml的50％乙醇水溶液并搅拌(此时pH为4.7)，使用冰醋酸将pH调节为4.0。接着，加入40mg柚苷酶(来自Penicillium decumbens、300单位/g、Sigma公司制)的20ml蒸馏水混悬液开始反应。在0.5分钟、从2分钟到30分钟为止以2分钟间隔、从60分钟到210分钟为止以30分钟间隔采集100μl，以除蛋白为目的，添加100μl等量冰藏(storage in ice)的乙腈并搅拌后，进行离心分离(10000转、10分钟、5℃、微量高速冷却离心分离机MX-100型、株式会社Tomy精工制)。加温210分钟后的反应液的pH为4.1。另外，将添加蒸馏水来代替酶液并进行同样处理的试样作为对照。将所得到的4μl离心分离上清供于HPLC分析，求得DRA与洋丁香酚苷的峰面积。另外，使用DRA与洋丁香酚苷来制备由50％乙腈进行的阶梯稀释液，在相同条件下进行分析并制作标准曲线(DRA标准曲线的R2＝0.9999、洋丁香酚苷标准曲线的R2＝1)。用于标准曲线制作的DRA及洋丁香酚苷的标准品分别使用实施例2、制备例2所得到的DRA及洋丁香酚苷。从峰面积值与标准曲线计算浓度，根据下述的计算式求得原来试样中(分析时相当于10mg/ml)的DRA及洋丁香酚苷含量。结果如表1所示。
<HPLC分析条件>
系统：Waters 2690/2695分离模块、996光电二极管阵列检测器
色谱柱：Develosil(商标)RPAQUEOUS-AR-5(3*150mm)
流动相：A：0.1％甲酸-15％乙腈/蒸馏水、B：0.1％甲酸-60％乙腈/蒸馏水
程序：0分钟(0％B)、30分钟(100％B)
流速：0.43ml/分钟
进样量：4μl
检测波长：280nm
<计算式>
由于反应时的试样浓度为20mg/ml，进一步用乙腈稀释2倍，所以试样浓度在分析时为10mg/ml相当量，因而含量(％)＝100*浓度(μg/ml)/10000(μg/ml)
表1表示DRA及洋丁香酚苷含量的经时变化。可确认伴随洋丁香酚苷的减少，DRA生成。
表1
Figure BDA0000535246020000131
实施例4.含DRA橄榄提取物的制造-2
<提取>
将2kg橄榄果实的油压榨残渣用16L80℃的热水提取2小时。用尼龙网(日本理化学器械株式会社制、商品名：NRS-500)过滤后，通过使用了2张#131(φ330mm)滤纸+400g硅藻土(Nacalai株式会社)的抽吸过滤来除去压榨残渣得到提取液。
<去鼠李糖反应>
将提取液冷却至40℃，添加32ml醋酸并将pH降低至3.93。一边在水浴中保持为40℃，一边添加130mg柚苷酶(来自Penicillium decumben、540单位/g、Sigma公司制)并反应3.5小时。为了使反应终止，通过添加35ml的6N硫酸将pH调节为3.0，并在80℃下加热10分钟使酶失活。其后用水浴冷却到40℃以下，添加52.5ml当量的4N NaOH水溶液。
<纯化>
在用50％丙酮洗净并用水平衡化的1L Amberlite XAD7-HP树脂(Rohm and HaasJapan株式会社)(柱尺寸φ8×20cm)中总量负荷上述的反应液。用2L的水洗净后，依次用6L的15％乙醇水溶液、4L的60％乙醇水溶液进行洗脱。将该15％洗脱组分与60％洗脱组分各自减压浓缩后进行冷冻干燥，分别得到了8.73g与16.8g的分馏物。其中，将从60％洗脱组分所得到的分馏物作为含DRA橄榄提取物(DRA含量8.9％)用于后面的动物实验。
实施例5.DRA的血中抗氧化活性
<测定方法>
使用大鼠评价DRA对血中抗氧化活性所带来的影响。血中抗氧化活性的评价使用FRAP、ORAC。另外，DRA及洋丁香酚苷分别使用与实施例2及制备例2同样的方法制备的DRA及洋丁香酚苷。
SD(IGS)系雄性大鼠(6周龄)从日本Charles River公司购买，在试验环境下适应1周后，将显示出顺利发育的动物供于试验。将禁食过夜的大鼠分为5组，各组3只。1组为0.5％CMC溶液、2组为DRA的0.5％CMC混悬液(0.8mM)、3组为纯化洋丁香酚苷的0.5％CMC混悬液(0.8mM)、4组为橄榄油溶液(Nacalai Tesque code.073-26)、5组为DRA的橄榄油混悬液(0.8mM)，各组分别以5ml/kg的用量使用导管经口给予。1-3组在给予前、给予后0.5、1、3、6、9、24小时后由尾静脉采集血液至肝素采血管，4-5组在给予前、给予后1、3、6、9、24小时后由尾静脉采集血液至肝素采血管，通过离心分离操作(8,000rpm、10min)得到血浆样品。日后测定血浆FRAP活性及用丙酮除蛋白处理后上清的ORAC活性。
结果如图3～图6所示。洋丁香酚苷给予组几乎没有看到血中的抗氧化活性的升高，而DRA给予组在给予后看到了血中抗氧化活性的明显升高。特别是以FRAP活性来看时，由于在给予初期(1-3小时后)与第9小时看到了2相性的抗氧化活性的峰，所以可确认DRA具有缓释作用。
实施例6.体内吸收
在实施例5中在用于血中抗氧化活性的测定所采集的血浆样品中，使用1组(0.5％CMC溶液给予组)、2组(DRA的0.5％CMC混悬液给予组)、3组(洋丁香酚苷的0.5％CMC混悬液给予组)的血浆的一部分，进行各样品给予时的血中浓度的测定。
<测定方法>
将各组3只的血浆等量混合均匀后，在90μl血浆中添加90μl来自蜗牛的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶/醋酸缓冲液(pH5.0)，在37℃下进行1小时的孵育。添加900μl乙腈终止反应，接着添加10μl的1％抗坏血酸水溶液、10μl内标溶液并混合，回收离心分离操作(15,000rpm、10min)后的上清。减压浓缩回收的上清后，再溶解于50％甲醇中并用过滤器过滤，交与LC-MS/MS进行洋丁香酚苷、DRA及羟基酪醇、咖啡酸的定量。洋丁香酚苷、DRA、羟基酪醇、咖啡酸的量通过峰面积与作为内标使用的橙皮苷(Wako)的峰面积之比来决定。LC-MS/MS分析条件如下所示。
<HPLC分析条件>
色谱柱：ACQUITY BEH18(1.7μm、2.1Φ×100mm、日本Waters)
流动相：A；0.1％甲酸水溶液、B；乙腈
流速：0.30ml/min
梯度：B液5％维持5分钟、其后5分钟B液从5％增至10％、B液10％维持2分钟、其后7分钟B液从10％增至24％、接下来4分钟B液从24％增至80％的线性梯度
<MS/MS分析条件>
测定模式：选择性反应监测
检测
：洋丁香酚苷(保留时间约17.4分钟)；前体离子m/z＝623([M-H]-)、生成离子m/z＝161
：DRA(保留时间约17.0分钟)；前体离子m/z＝477([M-H]-)、生成离子m/z＝161
：羟基酪醇(保留时间约3.1分钟)；前体离子m/z＝153([M-H]-)、生成离子m/z＝123
：咖啡酸(保留时间约8.1分钟)；前体离子m/z＝179([M-H]-)、生成离子m/z＝135
：橙皮苷(保留时间约18.7分钟)；前体离子m/z＝609([M-H]-)、生成离子m/z＝301
离子化法：ESI法
结果如图7、图8、图9所示。给予洋丁香酚苷时的洋丁香酚苷的最大血中浓度(Cmax)不满1μM，检测到了作为代谢物的羟基酪醇及咖啡酸。羟基酪醇的最大血中浓度(Cmax)为11.7μM、咖啡酸的最大血中浓度(Cmax)为0.7μM。相对于此，给予DRA时的DRA的最大血中浓度(Cmax)也仍然不满1μM，高浓度检测到了作为代谢物的羟基酪醇及咖啡酸。羟基酪醇的最大血中浓度(Cmax)为32.8μM、咖啡酸的最大血中浓度(Cmax)为7.3μM。
由于洋丁香酚苷、DRA中的任一种均不以其原来的形式吸收，不向血中移动，作为代谢物的羟基酪醇、咖啡酸在体内存在，所以使用羟基酪醇及咖啡酸的AUC对比体内吸收量，将结果示于图10。DRA的体内吸收量用羟基酪醇的AUC进行对比时，升高了洋丁香酚苷的约3倍，用咖啡酸的AUC进行对比时升高了约13倍。
以上的结果提示，DRA与洋丁香酚苷相比，体内吸收量增加，且作为代谢物的羟基酪醇及咖啡酸所具有的各种各样的生理活性均高。
实施例7.血中抗氧化作用的含量依存性评价
对比以各种各样的浓度含有DRA的橄榄提取物的血中抗氧化作用。
<测定方法>
SD(IGS)系雄性大鼠(6周龄)从日本Charles River公司购买，在试验环境下适应1周后，使显示出顺利发育的动物禁食过夜，分为5组，各组4只。使用与实施例2同样的方法制造的DRA与制备例1所得到的橄榄提取物，制备含DRA橄榄提取物。将该含DRA橄榄提取物溶解于橄榄油，制作含有0、0.5、1、2、5％DRA的给予液，以5ml/kg的用量使用导管经口给予。给予前、给予后1、3、6、9、24小时后由尾静脉采集血液至肝素采血管，通过离心分离操作(8,000rpm、10min)得到血浆样品。日后测定血浆FRAP活性。
结果如图11所示。DRA含量依存性地升高血中抗氧化活性，在2％以上的浓度下可看到明显的血中抗氧化活性的升高作用。
实施例8.血中抗氧化活性
根据FRAP活性对比橄榄提取物的去鼠李糖反应有无的血中抗氧化活性。
<测定方法>
样品使用实施例4制备的含DRA橄榄提取物(DRA含量8.9％)与实施例4的工序中仅不进行去鼠李糖反应而其他工序同样处理的酶未处理的橄榄提取物(洋丁香酚苷含量9.1％)。
SD(IGS)系雄性大鼠(6周龄)从日本Charles River公司购买，在试验环境下适应1周后，将显示出顺利发育的动物供于试验。将禁食过夜的大鼠分为3组，各组4只。1组为橄榄油溶液、2组为含DRA橄榄提取物的橄榄油混悬液、3组为酶未处理橄榄提取物的橄榄油混悬液，各组分别以500mg/5ml/kg的用量使用导管经口给予。在给予前、给予后1、3、6、9、24小时后由尾静脉采集血液至肝素采血管，通过离心分离操作(8,000rpm、10min)得到血浆样品。日后测定血浆FRAP活性。
结果如图12所示。通过由酶处理来提高DRA含量可确认抗氧化活性升高。
实施例9.DRA的缓释性
试验动物及给予液用与实施例8同样的方法准备。给予为以500mg/5ml/kg的用量以24小时间隔连续给予5天，并在末次给予9小时后采集血液至肝素采血管，通过离心分离操作(8,000rpm、10min)得到血浆样品。日后测定血浆FRAP活性。
结果如图13所示。可看到含DRA橄榄提取物给予组与没有进行酶处理的橄榄提取物给予组进行对比，末次给予9小时后的血中抗氧化活性显著升高，可确认DRA的缓释性。
制剂例1.片剂
Figure BDA0000535246020000181
将上述各成分均匀混合，并用单冲式压片机压片，制造直径10mm、1粒300mg的片剂。将每天4粒作为推荐摄取量。
制剂例2.颗粒剂
Figure BDA0000535246020000182
将上述各成分均匀混合后加入100ml的10％羟丙基纤维素·乙醇溶液，按照常规方法混合、挤出、干燥得到颗粒剂。每天摄取1根该1.5g/根的棒状颗粒。
制剂例3.软胶囊剂
每一粒的配合量 将1天2粒作为推荐摄取量。
Figure BDA0000535246020000183
在由上述成分构成的软胶囊剂皮中，将以下所示的组合物通过常规方法进行填充，得到1粒300mg的软胶囊。将该软胶囊1天2粒作为推荐摄取量。
Figure BDA0000535246020000191
制剂例4.保健饮料剂
Figure BDA0000535246020000192
配合上述成分并加水制成10L。该保健饮料剂每次饮用约100ml。
产业上的可利用性
根据本发明可提供在生物体内长时间发挥强抗氧化作用的饮食品、医药保健品及医药。

Claims (5)

1.一种具有抗氧化作用的橄榄提取物，其特征在于，包含5重量％以上的去鼠李糖洋丁香酚苷,所述橄榄提取物通过用具有去鼠李糖活性的糖苷水解酶处理含洋丁香酚苷的橄榄提取物而获得。
2.一种组合物，其特征在于，配合了权利要求1所述的橄榄提取物。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，组合物为饮食品。
4.一种制造方法，其为含5重量％以上的去鼠李糖洋丁香酚苷组合物的制造方法，其特征在于，
包含将含有洋丁香酚苷的橄榄提取物用具有去鼠李糖活性的糖苷水解酶处理的工序。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其特征在于，糖苷水解酶为柚苷酶。
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