NO971485L - Antineoplastiske kakao-ekstrakter, fremgangsmåter for fremstilling og anvendelse - Google Patents

Description

OPPFINNELSENS FBLT

Foreliggende oppfinnelse angår kakao-ekstrakter slik som polyfenoler, fortrinnsvis polyfenoler anriket med procyanidiner. Foreliggende oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for preparering av slike ekstrakter, såvel som anvendelsen av dem; for eksempel som antineoplastiske midler og antioksidanter .

Dokumenter er sitert i beskrivelsen med full sitering for hver referanse i referanseseksjonen i slutten av beskrivelsen, foran kravene. Disse dokumenter angår oppfinnelsens felt; og hvert sitert dokument er herved innlemmet heri som referanse.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Polyfenoler er en sterkt divers gruppe av forbindelser (Ferreira et al., 1992), som opptrer vidt i forskjellige plan-ter, noen av hvilke går inn i matkjeden. I noen tilfeller representerer de en viktig klasse forbindelser for den humane diett. Selv om noen av polyfenolene er ansett å være ikke-næringsmidler, har interesse i disse forbindelser opp-stått på grunn av deres mulige fordelaktige helse-effekter. For eksempel har quercitin (et flavonoid) blitt vist å ha antikarcinogen aktivitet i eksperimentelle dyrestudier (Deshner et al., 1991, og Kato et al.,1983). (+)-katechin og (-)-epikatechin (flavan-3-oler) har blitt vist å hemme leukemivirus-reverstranskriptaseaktivitet (Chu et al.,1992). Nobotanin (et oligomert hydrolyserbart tannin) er også blitt vist å ha anti-tumoraktivitet (Okuda et al., 1992) . Statistiske rapporter har også vist at magecancer-mortalitet er betydelig lavere i teproduserende distrikter i Japan. Epigallo-katechingallat er blitt rapportert å være det farmakologisk aktive materiale i grønn te som hemmer musehud-tumorer (Okuda et al.,1992). Ellaginsyre har også blitt vist å ha antikarcinogen aktivitet i forskjellige dyretumor-modeller (Bukharta et al., 1992). Til sist har proantocyanidin-oligomerer blitt patentert avKikkoman Corporation for anvendelse som antimutagener. Området feno-liske forbindelser i mat og deres modulasjon av tumorutvik-ling i eksperimentelle dyremodeller har faktisk nylig blitt representert i det 202. National Meeting of The American Chemical Society (Ho et al., 1992; Huang et al., 1992).

Noen av disse rapporter lærer eller foreslår imidlertid kakao-ekstrakter, eventuelle fremgangsmåter for fremstilling av slike ekstrakter, eller eventuelle anvendelser som anti-neoplastiske midler for kakao-ekstrakter.

Da ikke-fermenterte kakaobønner inneholder betydelig nivåer polyfenoler, har foreliggende oppfinnere ansett det mulig at tilsvarende aktivitet av og anvendelse av kakao-ekstrakter, f.eks. forbindelser i kakao, kan bli avslørt ved ekstrahering av slike forbindelser fra kakao og screening av ekstraktene for aktivitet. National Cancer Institute har screenet forskjellige Thoebroma- og Herrania-arter for anti-canceraktivitet som del av deres massive naturprodukt-utvei-gelsesprogram. Lave nivåer av aktivitet ble rapportert for noen ekstrakter kakaovev, og arbeidet har ikke blitt opp-fulgt. I den anti-neoplastiske eller anti-cancerteknikken ble kakao og dets ekstrakter bedømt til ikke å være nyttige; dvs. læren i den anti-neoplastiske teknikk eller anti-cancerteknikken fører fagmannen bort fra anvendelse av kakao og dens ekstrakter som cancer-terapi. Da antallet analytiske prosedyrer ble utviklet for å studere bidraget til kakao-polyfenoler til smakutvikling (Clapperton et al., 1992), avgjorde foreliggende oppfinnere å benytte analoge fremgangsmåter for fremstilling av prøver av for anti-cancer-screening, i motstridning til kunnskapen innen anti-neoplastisk eller anti-cancerteknikk. Overraskende og i motsetning til viten innen teknikken, f.eks. National Cancer Institute' s screening, er det oppdaget at kakao-polyfenolekstrak-ter som inneholder procyanidiner har betydelig anvendelses-område som anti-cancer eller antineoplastiske midler. I til legg er det demonstrert at kakao-ekstrakter inneholder procyanidiner som har anvendelse som antioksidanter.

MAL MBD OG OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Det er et mål med foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av kakao-ekstrakt.

Et annet mål ifølge oppfinnelsen er å fremskaffe en kakao-ekstrakt.

Det er et annet mål ifølge oppfinnelsen å fremskaffe en antioksidant sammensetning.

Der enda et mål med foreliggende oppfinnelse å demonstrere hemming av DNA topoisomerase II enzymaktivitet.

Det er enda et mål med foreliggende oppfinnelse å fremskaffe en fremgangsmåte for behandling av tumorer eller cancer.

Det er enda et mål med foreliggende oppfinnelse å fremskaffe anti-cancer-, anti-tumor- eller anti-neoplastiske sammensetninger .

Det er et ytterligere mål med oppfinnelsen å fremskaffe en fremgangsmåte for fremstilling av anti-cancer-, anti-tumor-eller anti-neoplastiske sammensetninger.

Det er dessuten et mål med oppfinnelsen å fremskaffe et sett for anvendelse i behandling av tumor eller cancer.

Det har overraskende blitt oppdaget at kakao-ekstrakter har anti-cancer-, anti-tumor- eller anti-neoplastiske aktivitet; eller er en anti-oksydant sammensetning, eller hemmer DNA topoisomerase li-enzymaktivitet. Følgelig fremskaffer foreliggende oppfinnelse en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt. Ekstrakten omfatter fortrinnsvis polyfenoler så som polyfenol anriket med kakao-procyanidin slik som polyfenoler av minst én kakao-procyanidin valgt blant (-) epikatechin, procyanidin B-2, procyanidin-oligomerer 2 til12, fortrinnsvis 2 til 5 eller 4 til 12, procyanidin B-5, procyanidin A-2 og procyanidin C-l. Foreliggende oppfinnelse fremskaffer et anti-cancer-, anti-tumor- eller anti-neoplastisk eller antioksidant eller DNA topoisomerase II-hemmende sammensetning omfattende en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetiske kakao-polyfenoler slik som polyfenoler anriket med procyanidiner og en passende bærer. Ekstrakten omfatter fortrinnsvis kakao-procyanidin(er). Kakao-ekstrakten er fortrinnsvis fremstilt ved en prosess omfattende redusering av kakao-bønner til pulver, avfetting av pulveret og ekstrahering av aktive forbindelser fra pulveret.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre fremgangsmåter for behandling av en pasient som trenger slik behandling med et anti-tumor-, anti-cancer- eller anti-neoplastisk middel eller en antioksidant eller en DNA topoisomerase II-inhibitor, omfattende administrering til en pasient av en sammensetning omfattende en effektiv mengde av en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetiske kakao-polyfenoler eller procyanidiner og en bærer. Kakao-ekstrakten kan være kakao-procyanidin; og er fortrinnsvis oppnådd ved redusering av kakao-bønner til pulver, avfetting av pulveret og ekstrahering av aktive forbindelser av pulveret.

I tillegg fremskaffer foreliggende oppfinnelse et sett for

behandling av en pasient som trenger behandling med et anti-tumor-, anti-cancer- eller anti-neoplastisk middel eller en antioksidant eller DNA topoisomerase II-inhibitor omfattende hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetiske kakao-polyfenoler eller procyanidiner og en passende bærer for blanding med ekstrakten eller syntetiske polyfenoler eller procyanidin .

Disse og andre mål og utførelsesformer er beskrevet og vil være opplagte fra den følgende detaljerte beskrivelse.

KORT BBSKRIVBLSB AV FIGURBNB

Den følgende detaljerte beskrivelse vil bli bedre forstått med referanse til de vedlagte figurer, hvor: Fig. l viser et representativt gelfiltrerings-kromatogram fra fraksjoneringen av rå kakao-procyanidiner; Fig. 2A viser et representativt reversfase HPLC-kromatogram som viser separering (eluringsprofil) av kakao-procyanidin ekstrahert fra ikke-fermentert kakao; Fig. 2B viser en representativ normalfase HPLC-separasjon av kakao-procyanidiner ekstrahert fra ikke-fermentert kakao; Fig. 3 viser flere representative procyanidin-strukturer: Fig. 4A-4E viser representative HPLC-kromatogrammer av fem fraksjoner benyttet i screening for anti-cancer- eller anti-neoplastisk aktivitet; Fig.5og 6A-6D viser dose-responsforholdet mellom kakao-ekstrakter og cancerceller ACHN (fig. 5) og PC-3 (fig. 6A-6D) (fraksjonoverlevelse versus dose, ug/ ml); M&M2 F4/92 M&MA+E U12P1, M&MB+E Y192P1, M&MC+E U12P2, M&MD+E U12P2; Fig. 7A til 7H viser typisk dose-responsforhold mellom kakao-procyanidin-fraksjoner A, B, C, D, E, A+B, A+E og A+D, og PC-3-cellelinjen (fraksjonoverlevelse versus dose,Mg/ml); MM-IA 0212P3, MM-IB 0162P1, MM-1 C 0122P3, MM-1D 0122P3, MM-1 E 0292P8, MM-1 A/B 0292P6, MM-1 A/E 0292P6, MM-1 A/D 0293P6; Fig. 8A til 8H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidin-fraksjoner A, B, C, D, E, A+B, B+E og D+E og KB Nasopharyngeal/HeLa-cellelinjen (fraksjonoverleving versus dose, /ig/ml) ; MM-1 1A092K3, MM-1 B 0212K5, MM-1 C 0162K3, MM-1 D 0212K5, MM-1 E 0292K5, MM-1 A/B 0292K3, MM-1 B/E 0292K4, MM-1 D/E 0292K5; Fig. 9A til 9H viser typisk dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjoner A, B, C, D, E, B+D, A+E og D+E og HCT-ll6-cellelinjen (fraksjonoverleving versus dose, /xg/ml) ; MM-1 C 0192H5, D 0192H5, E 0192H5, MM-1 B&D 0262H2, A/E 0262H3, MM-1 D&E 0262H1; Fig.10A til 10H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjoner A, B, C, D, E,B+D, C+D og A+E ogACHN-renal-cellelinjen (fraksjonoverleving versus dose, ( ig/ ml) : MM-1 A 092A5, MM-1 B 092A5, MM-1 C 0192A7, MM-1 D 0192A7, M&M1 E 0192A7, MM-1 B&D 0302A6, MM-1C&D 0302A6, MM-1 A&E 0262A6; Fig. HA til UH viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidin-fraksjoner A, B, C, D, E, A+E, B+E, og C+E og A-549-lunge-cellelinjen (fraksjonoverleving versus dose,//g/ml); MM-1 A 019258, MM-1 B 09256, MM-1 C 019259, MM-1 D 019258, MM-1 E 019258, A/E 026254, MM-1 B&E 030255, MM-1 C&E N6255; Fig.12A til 12H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidin-fraksjoner A, B, C, D, E, B+C, C+D og D+E og SK-5-melanoma-cellelinjen (fraksjonoverleving versus dose, /xg/ml) ; MM-1 A 0212S4, MM-1 B 0212S4, MM-1C 0212S4, MM-1 D 0212S4, MM-1 E N32S1, MM-1 B&C N32S2, MM-1 C&D N32S3, MM-1 D&E N32S3; Fig.13A til 13H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidin-fraksjoner A, B, C, D, E, B+C, C+E og D+E og MCF-7-bryst-cellelinjen (fraksjonoverleving versus dose, Mg/ml) ; MM-1 A N22M4, MM-1 B N22M4, MM-1 C N22M4, MM-1 D N22M3, MM-1 E 0302M2, MM-1 B/C 0302M4, MM-1 C&E N22M3, MM-1 D&E N22M3; Fig.14 viser typiske dose-responsforhold for kakao-procyanidin (spesielt fraksjon D) og CCRF-CEM T-celle-leukemi-cellelinje (celler/ml versus dager vekst; åpen sirkel er kontroll, mørk sirkel er 125 ug fraksjon D, åpen invertert trekant er 250 \ xg fraksjon D, mørk invertert trekant er 500 ug fraksjon D) ; Fig. 15 A viser en sammenligning av XTT og krystallfiolett cytotoksisitets-analyse mot MCF-7 pi68 brystcancer-celler behandlet med fraksjon D+E (åpen sirkel erXTTog mørk sirkel er krystallfiolett); Fig. 15 B viser en typisk dose-responskurve oppnådd fra MDA MB231 bryst-cellelinje behandlet med varierende nivåer av rå polyfenoler oppnådd fra UlT-l kakao-genotyper (absorbans 540 nm) versus dager; åpne sirkler er kontroll, mørke sirkler er bærer, åpen invertert trekant er 25 0//m/ml, mørk invertert trekant er 100 /tg/ml, åpent kvadrat er10/tg/ml; absorbans på 2,0 er maksimum for plateleser og er ikke nødvendigvis representativ for celletall); Fig. 15 C viser en typisk dose-responskurve oppnådd fra PC-3 prostatacancer-cellelinje behandlet med varierende nivåer av rå polyfenoler oppnådd fra UIT-l kakao-genotype (absorbans 540 nm) versus dager; åpen sirkel er kontroll, mørk sirkel er bærer, åpen invertert trekant er 250/xm/ml, mørk invertert trekant er 100 ug/ ml og åpent kvadrat er10 /xg/ml) ; Fig. 15 D viser en typisk dose-responskurve oppnådd fra MCF-7 pi68 brystcancer-cellelinje behandlet med varierende nivåer av rå polyfenoler oppnådd fra UIT-l kakao-genotype (absorbans (540 nm) versus dager; åpen sirkel er kontroll, mørk sirkel er bærer, åpen invertert trekant er 250/im/ml, mørk invertert trekant er 100/xg/ml, åpent kvadrat er 10 Hg/ ml, mørkt kvadrat er l//m/ml; absorbans på 2,0 er maksimum for plateleser og er ikke nødvendigvis representativ for celletall); Fig. 15 E viser en typisk dose-responskurve oppnådd fra Hela cervicalcancer-cellelinje behandlet med varierende nivåer av rå polyfenoler oppnådd fra UIT-l kakao-genotype (absorbans (540 nm) versus dager; åpen sirkel er kontroll, mørk sirkel er bærer, åpen invertert trekant er 250/xm/ml, mørk invertert trekant er 100//g/ml, åpent kvadrat er 10//g/ml; absorbans på 2,0 er maksimum for plateleser og er ikke nødvendig-vis representativ for celletall); Fig. 15 F viser cytotoksiske effekter mot Hela cervicalcancer-cellelinje behandlet med forskjellige kakao-polyfenylfraksjoner (absorbans (540 nm) versus dager; åpen sirkel er 100//g/ml fraksjoner A-E, mørk sirkel er 100//g/ml fraksjoner A-C; åpen invertert trekant er 100//g/ml fraksjoner D&E; absorbans på 2,0 er maksimal for plateleser og ikke representativ for celletall); Fig. 15 G viser cytotoksiske effekter ved100//l/ml mot SKBR-3 brystcancer-cellelinje behandlet med forskjellige kakao-polyfenylfraksjoner (absorbans (540 nm) versus dager; åpen sirkel er fraksjoner A-E, mørk sirkel er fraksjoner A-C, åpen invertert triangel er fraksjoner D&E); Fig. 15 H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjon D+E på Hela-celler (absorbans (540 nm) versus dager; åpen sirkel er kontroll, mørk sirkel er 100//g/ml, åpen invertert trekant er 75//g/ml, mørk invertert trekant er 50//g/ml, åpent kvadrat er 25//g/ml; mørkt kvadrat er 10//g/ml; absorbans ved 2,0 er maksimal for plateleser og er ikke representativ for celletall); Fig.15 I viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjon D+E på SKBR-3-celler (absorbans (540 nm) versus dager; åpen sirkel er kontroll, mørk sirkel er 100//g/ml, åpent invertert triangel er 75//g/ml, mørkt invertert triangel er 50//g/ml; åpen firkant er 25//g/ml; mørk firkant er 10 //g/ml) ; Fig. 15 J viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjon D+E på Hela-celler ved anvendelse av Soft Agar Cloning-analyse (søylediagram, antall kolonier versus kontroll, l, 10, 50 og 100//g/ml); Fig. 15 K viser veksthemming av Hela-celler når behandlet med rå polyfenol-ekstrakter oppnådd fra åtte forskjellige kakao-genotyper (% kontroll versus konsentrasjon,//g/ml; åpen sirkel er C-l, mørk sirkel er C-2, åpen invertert trekant er C-3, mørk invertert trekant er C-4, åpen firkant er C-5, mørk firkant er C-6, åpent triangel er C-7, mørkt triangel er C-8; C-l = UF-12; horti race = Criollo og beskrivelsen er rå ekstrakter av UF-12 (Brasil) kakao-polyfenoler (dekoffinert/deteobrominert); C-2 = NA-33; horti race = Forastero og beskrivelse er rå ekstrakter av NA-33 (Brasil) kakao-polyfenoler (dekoffinert/deteobrominert); C-3 = EEG-48; horti race = Forastero og beskrivelse er rå ekstrakter av EEG-48 (Brasil) kakao-polyfenoler (dekoffinert/deteo-brominert) ; C-4 = ukjent: horti race=Forastero og beskrivelse er rå ekstrakter av ukjent (vest-afrikansk) kakao-polyfenoler (dekoffinert/deteobrominert) ; C-5 = UF-613: horti race = Trinitario og beskrivelse er rå ekstrakter av UF-613 (Brasil) kakao-polyfenoler (dekoffinert/deteobromi-nert) ; C-6 = ICS-100; horti race = Trinitario og beskrivelse er rå ekstrakter av ICS-100 (Brasil) kakaopolyfenoler (dekof f inert/deteobrominert) ; C-7 = ICS-139; horti race = Trinitario og beskrivelse er rå ekstrakter av ICS-139 (Brasil) kakaopolyf enoler (dekof f inert/deteobrominert) ; C-8 = UIT-l: horti race = Trinitario og beskrivelse er rå ekstrakter av UIT-l (Malaysia) kakaopolyfenoler (dekoffinert/deteobromi-nert) ; Fig. 15 L viser veksthemming av Hela-celler når behandlet med rå polyfenol-ekstrakter oppnådd fra fermenterte kakao-bønner og behandlede kakaobønner (trinnene gjennom fermentering og soltørking; % kontroll versus kontroll,//g/ml; åpen sirkel er dag null-fraksjon, mørk sirkel er dag l-fraksjon, åpen invertert triangel er dag 2-fraksjon, mørk invertert triangel er dag 3-fraksjon, åpen firkant er dag 4-fraksjon og mørk firkant er dag 9-fraksjon; Fig. 15 M viser effekten av enzymatisk oksiderte kakao-pro-cyadininer mot Hela-celler (doserespons for polyfenoloksy-dase behandlet med rå kakaopolyfenol); % kontroll versus konsentrasjon j/g/ml; mørk firkant er rå UIT-l (med koffein og teobromin), åpen sirkel er rå UIT-l (uten koffein og teobromin) og mørk sirkel er rå UIT-l (polyfenoloksidase-katalysert); Fig. 15 N viser en representativ semi-preparativ reversfase HPLC-separering for kombinert kakaoprocyanidin-fraksjoner D og E; Fig. 15 0 viser en representativ normalfase semi-preparativ HPLC av rå kakaopolyfenol-ekstrakt; Fig.16 viser typiske Rancimat-oksidasjonskurver for kakao-procyanidin-ekstrakt og fraksjoner sammenlignet med de syntetiske antioksidanter BHA og BHT (tilfeldige enheter versus tid; stiplet linje og kryss (+) er BHAog BHT;<+>er D-E; x er rå; åpen firkant er A-C; og åpen diamant er kontroll); Fig.17viser en typisk Agarose-gel som indikerer hemming av topoisomerase II katalysert dekatanisering av kinetoplast DNA ved kakaoprocyanidin-fraksjoner (spor l inneholder 0,5 fig markør (M) monomerlengde kinetoplast DNA-sirkler; spor 2 og 20 inneholder kinetoplast DNA som ble inkubert med topoisomerase II i nærvær av 4% DMSO, men i fravær av eventuelle kakao-procyanidiner. (Kontroll -C); spor 3 og4inneholder kinetoplast DNA som ble inkubert med topoisomerase II i nærvær av 0,5og5,0 ug/ ml kakaoprocyanidin-fraksjon A; spor 5 og 6 inneholder kinetoplast DNA som ble inkubert med topoisomerase II i nærvær av 0,5 og 5,0//g/ml kakaoprocyanidin-fraksjon B; spor 7, 8, 9, 13,14 og 15 er replikater av kinetoplast DNA som ble inkubert med topoisomerase II i nærvær av 0,05, 0,5 og 5,0 i/g/ml kakaoprocyanidin-f raks jon D; spor 10, 11, 12, 16, 17 og 18 kakaoprocyanidin er replikater av kinetoplast DNA som ble inkubert med topoisomerase II i nærvær av 0,05, 0,5 og 5,0 ug/ ml kakaoprocyanidin-fraksjon E; spor 19 er et replikat av kinetoplast DNA som ble inkubert med topoisomerase II i nærvær av 5,0/xg/ml kakaoprocyanidin-f raks jon E; Fig. 18 viser dose-responsforhold av kakaoprocyanidin-fraksjon D mot DNA-reparasjon i kompetente og deficiente cellelinjer (fraksjon overlevelse mot//g/ml; venstre side xrs-6 DNA Deficient Repair Cell Line, MM-1 D D292X1; høyre side BRl BR1 Competent DNA Repair Cell Line, NM-i D D282B1); Fig. 19 viser dose-responskurve for Adriamycin-resistente MCF-7-celler sammenlignet med MCF-7 pl68 parental cellelinje når behandlet med kakaofraksjon D+E (% kontroll versus konsentrasjon,/tg/ml; åpen sirkel er MCF-7 pl68; mørk sirkel er MCF-7ADR); og Fig. 20 viser dose-responseffekt på Hela-celler når behandlet med 100 ug/ ml og 25//g/ml nivåer av tolv fraksjoner fremstilt ved normalfase semi-preparativ HPLC (søylediagram, % kontroll versus kontroll og fraksjoner 1-12) .

DBTALJBRT BBSKRIVELSB

Som diskutert ovenfor, har det overraskende blitt funnet at kakao-ekstrakter viser anti-cancer-, anti-tumor- eller anti-neoplastisk aktivitet, antioksidant-aktivitet og, hemmer DNA topoisomerase Il-enzym. Ekstraktene ble generelt preparert ved redusering av kakaobønner til pulver, avfetting av pulveret og ekstrahering av den/de aktive forbindelse(r) fra det avfettede pulver. Puiveret kan bli preparert ved fryse-tørking av kakaobønnene og fruktkjøttet, fjerning av frukt-kjøtt fra kakaobønnen, fjerning av skall fra den frysetør-kede kakaobønnen og maling av de skallfrie bønner.Ekstrahe- ring av aktive forbindelser kan være ved oppløsningsmiddel-ekstrasjonsteknikker. Ekstrakter kan bli renset, f.eks. ved gelfiltreringskromatografi eller ved preparativ høy-ytelse-væskekromatografi (HPLC) -teknikker eller, ved en kombinasjon av slike teknikker. Ekstraktene som har aktivitet, har, uten ønske å være bundet av noen spesiell teori, blitt identifisert som kakao-polyfenoler slik som procyanidiner. Disse kakao-procyanidiner har signifikant anti-cancer-, anti-tumor- eller anti-neoplastisk aktivitet; antioksidant-aktivitet; og hemmer DNA-topoisomerase II-enzymet.

Anti-cancer-, anti-tumor- eller anti-neoplastisk eller, antioksidant eller DNA topoisomerase II enzymhemmende sammensetninger inneholdende kakao-polyfenolene eller procyanidinene ifølge oppfinnelsen, kan bli preparert ifølge stan-dardteknikker som er velkjent for fagmannen innen farmasi. Slike sammensetninger kan bli administrert til en pasient som trenger slik administrasjon i doseringer og med teknikker som er velkjent for fagmannen innen medisin, og som tar i betraktning slike faktorer som alder, kjønn, vekt og tilstanden til den bestemte pasient, og administrasjonsvei. Sammensetningene kan bli administrert sammen med eller sek-vensielt administrert med andre anti-neoplastiske, anti-tumor- eller anti-cancermidler eller antioksidanter eller DNA topoisomerase II enzymhemmende midler og/eller med midler som reduserer eller letter tykktarms-effekter av anti-neoplastiska, anti-tumor- eller anti-cancermidler eller antioksidanter eller DNA topoisomerase II enzymhemmende midler; igjen under hensyntagen til slike faktorer som alder, kjønn, vekt og tilstanden til den bestemte pasient, og admi-nistrasj onsveien.

Eksempler på sammensetninger ifølge oppfinnelsen omfatter faste preparater for oral administrasjon slik som kapsler,

tabletter, piller eller lignende, så vel som tyggbare faste formuleringer til hvilke foreliggende oppfinnelse kan være veltilpasset ettersom den er fra en spiselig kilde (f.eks.

faste sammensetninger med kakao- eller sjokoladesmak); væskepreparater for åpninger, f.eks. oralt, nasalt, analt, vaginalt osv., administrasjon så som suspensjoner, siruper eller eliksirer; og preparater av parental, subkutant, intradermal, intramuskulær eller intravenøs administrasjon (f.eks. injiserbare administrasjon) slik som sterile suspensjoner eller emulsjoner. Den aktive ingrediens i sammensetningen kan imidlertid være kompleks med proteiner slik at når de blir administrert i blodstrømmen, kan klumpdannelse skje på grunn av utfelling av blodproteiner; og, fagmannen bør ta dette i betraktning. I slike sammensetninger kan den aktive kakao-ekstrakt være blandet sammen med en passende bærer, fortynner eller eksipient slik som sterilt vann, fysiologisk saltvann, glukose eller lignende. Den aktive kakao-ekstrakt ifølge oppfinnelsen kan bli fremskaffet i lyofilisert form for rekonstituering, f.eks. i isoton, vandig saltvannsbuffer.

Videre omfatter oppfinnelsen også et sett hvori den aktive kakao-ekstrakt er anbrakt. Settet kan inkludere en separat beholder inneholdende en passende bærer, fortynner eller eksipient. Settet kan også omfatte et ytterligere anti-cancer-, anti-tumor- eller antineoplastisk middel eller antioksidant eller DNA topoisomerase II enzymhemmende middel og/eller et middel som reduserer eller letter sykdomseffek-ter av antineoplastiske, anti-tumor- eller anti-cancermidler eller antioksidant eller DNA topoisomerase II enzymhemmende midler for samtidig eller sekvensiell administrering. De ytterligere midler kan bli gitt i separate beholdere eller i samblanding med den aktive kakao-ekstrakt. I tillegg kan settet omfatte instruksjoner for blanding eller kombinering av ingredienser og/eller administrasjon.

Videre, mens oppfinnelsen er beskrevet med hensyn til kakao-ekstrakter som fortrinnsvis omfatter kakao-procyanidiner, vil den organiske kjemiker fra denne beskrivelse forstå og kunne forutsi syntetiske veier for å oppnå de aktive for bindelser. Følgelig omfatter foreliggende oppfinnelse syntetiske kakao-polyfenoler eller -procyanidiner eller deres derivater som omfatter, men som ikke er begrenset til, gly-kosider, gallatere, estere, osv., og lignende.

De følgende ikke-begrensende eksempler er gitt utelukkende som illustrasjon og er ikke ment å begrense oppfinnelsen, mange tydelige variasjoner av hvilke er mulig uten å forlate ånden eller rammen derav.

EKSEMPLER

Eksempel 1: Kakaokil der og metode for pre parering

Flere Theobroma cacao-genotyper, som representerer tre aner-kjente hortikulturelle raser av kakao (Erigues, 1967; Engels, 1981), ble oppnådd fra tre viktige kakaoproduserende opprinnelser i verden. En liste over disse genotyper benyttet i denne studie er vist i tabell1.Høstede kakaobelger ble åpnet og bønnene med fruktkjøtt ble fjernet fra fryse-tørking. Massen ble manuelt fjernet fra den frysetørkede masse og bønnene ble utsatt for analyse som følger. De ikke-fermenterte, frysetørkede kakaobønner ble først manuelt fri-gitt for skall og malt til en fin, pulverformig masse med TEKMARmølle. Den resulterende masse ble så avfettet over-natten ved Soxhlet-ekstrahering ved anvendelse av redestil-lert heksan som oppløsningsmiddel. Gjenværende oppløsnings-middel ble fjernet fra den avfettede masse ved vakuum ved omgivelsestemperatur.

Eksempel 2: Procyanidin- ekstraherinasprosedyrer

A. Metode 1

Procyanidiner ble ekstrahert fra de avfettede, ikke-fermenterte, frysetørkede kakaobønner fra eksempel1ved anvendelse av modifikasjoner ved fremgangsmåten beskrevet av Jalal og Collin (1977) . Procyanidiner ble ekstrahert fra 50 grams porsjoner avfettet kakaomasse med 2 x 400 ml 70% aceton/deionisert vann, fulgt av 400 ml 70% metanol/deionisert vann. Ekstraktene ble oppsamlet og oppløsningsmidlene fjernet ved avdamping ved 45°C med rotasjonsfordamper holdt under delvis vakuum. Den resulterende fase ble fortynnet til l liter med deionisert vann og ekstrahert to ganger med 400 ml CHC13. Oppløsningsmiddelfasen ble kastet. Den vandige fase ble ekstrahert fire ganger med 500 ml etylacetat. Eventuelle resulterende emulsjoner ble brutt ved sentrifugering på en Sor-vall RC 28S-sentrifuge drevet ved 2.000 x g i 30 minutter ved10°C. Til de kombinerte etylacetat-ekstrakter ble det tilsatt 100-200 ml deionisert vann. Oppløsningmidlet ble fjernet ved avdamping ved 45°C med en rotasjonsfordamper holdt under delvis vakuum. Den resulterende vandige fase ble frosset i flytende N2, fulgt av frysetørking på et LABCONCO Freeze Dry System. Utbyttene av rå procyanidiner som ble oppnådd fra forskjellige kakao-genotyper er opplistet i tabell2.

B. Metode 2

Alternativt ble procyanidiner ekstrahert fra avfettede, ikke-fermenterte, frysetørkede kakaobønner fra eksempel l med 7 0% vandig aceton. Ti gram avfettet materiale ble opp-slemmet med 100 ml oppløsningsmiddel i 5-10 minutter. Oppslemmingen ble sentrifugert i 15 minutter ved 4°C ved 3 00 x g og supernatanten passert gjennom glassull. Filtratet ble utsatt for destillering under delvis vakuum og den resulterende vandige fase frosset i flytende N2, fulgt av frysetør-king på et LABCONCO Freeze Dry System. Utbyttet av rå procyanidiner var i området fra 15 til 20%.

Uten ønske om å være bundet av noen spesiell teori, er det antatt at forskjellen i råutbytter reflekterer variasjoner som blir møtt med forskjellige genotyper, geografisk opprinnelse, hortikurturell rase og prepareringsmetode.

Eksempel 3: Partiell rensin<g>av kakao- procyanidiner A. Gelf iltreringskromatografi

Procyanidiner oppnådd i eksempel 2 ble delvis renset ved væskekromatografi på Sephadex LH-20 (28 x 2,5 cm). Separering ble utført ved en trinngradient fra deionisert vann til metanol. Den initielle gradientsammensetning startet med 15% metanol i deionisert vann som ble fulgt med trinn hvert 30. minutter med 25% metanol i deionisert vann, 35% metanol i deionisert vann, 70% metanol i deionisert vann og endelig 100% metanol. Utslippet fra elueringen av xantin-alkaloidene (koffein og teobromin) ble oppsamlet som en enkelt fraksjon. Fraksjonen gav en xantin-alkaloidfri subtraksjon som ble utsatt for ytterligere subfraksjonering for å gi fem subtrak-sjoner angitt MM2A til MM2E. Oppløsningsmidlene ble fjernet fra hver subtraksjon ved avdamping ved45°C på en rotasjonsfordamper holdt under delvis vakuum. Den resulterende vandige fase ble frosset i flytendeN2og frysetørket over natten på et LABCONCO Freeze Dry System. Reprensentative gelfiltreringskromatogrammer som angir fraksjonering er vist i fig. l. Omkring 100 mg materiale ble subfraksjonert på denne måte.

Fig. l. Gelfiltreringskromatogram på rå procyanidiner på

. Sephadex LH-20

Kromatografiske betingelser: Kolonne: 28 x 2,5 cm Sephadex LH-20, mobil fase: metanol/vann-trinngradient, 15:85, 25:75, 35:65, 70:30, 100:0, trinn med 1/2 times intervaller, strøm-ningshastighet: 1,5 ml/min., detektor: UV @ A1=254nm og A. 2=365 nm, skriverhastighet: 0,5 mm/min., kolonnelast: 120 mg.

B. Semi- preparativ hgY- ytelBeB- vaeskekromatoaraf i ( HPLC) Metode Tl-, Rever Bf ase - separering

Procyanidiner oppnådd fra eksempel 2 og/eller 3A ble delvis renset ved semi-preparativ HPLC. Et Hewlett Packard 1050-system utstyrt med en variabel bølgelengde-detektor, Rheo-dyne 7010 injeksjonsventil med l ml injeksjonssløyfe ble satt sammen med en Pharmacia FRAC-lOO Fraction Collector. Separeringer ble utført på en Phenomenex Ultracarb 10 n ODS kolonne (250 x 22,5 mm) forbundet med en Phenomenex 10 ODS Ultracarb (60 x 10 mm) guardkolonne. Den mobile fasesammensetning var A = vann; B = metanol benyttet under de følgende lineære gradientbetingelser: [Tid, %A]; (0,85), (60,50,), (90,0) og (110,0) ved en strømningshastighet på 5 ml/min.

Et representativt semi-preparativt HPLC-diagram er vist i fig. 15N for separering av procyanidiner til stede i fraksjon D+E. individuelle topper eller valgte kromatografiske regioner ble oppsamlet på tidtatte intervaller eller manuelt ved fraksjonoppsamling for ytterligere rensing og påfølgende evaluering, injeksjonslaster varierer fra 25 til 100 mg

materiale.

Metode 2: Normal f ase- separering

Procyanidin-ekstrakter oppnådd fra eksempel 2 og/eller 3A ble delvis renset ved semi-preparativ HPLC. Et Hewlett Packard 1050 HPLC-system, Millipore-Waters modell 480 LC detektorsett ved 254 nm ble satt sammen med en Pharmacia Frac-100 Fraction Collector Set satt i toppmodus. Separering ble utført på en Supelco 5 \ i Supelcosil LC-Si-kolonne (250 x10 mm) forbundet med en Supelco 5 \ x Supelguard LC-Si guardkolonne (20 x 4,6 mm). Procyanidiner ble eluert med en lineær gradient under de følgende betingelser: (Tid, %A, %B); (0,82,14), (30, 67,5, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86) , fulgt av en 10 minutters re-ekvilibrering. Mobilfase-sammensetning var A = diklormetan; B = metanol; og C = eddiksyre:vann (1:1). En strømningshastighet på 3 ml/ min. ble benyttet. Komponenter ble detektert ved UV ved 254 nm og målt på en Kipp & Zonan BD4i-recorder. Injeksjonsvolu-mer varierte fra 100 til 250 \ i\ av 10 mg procyanidin-ekstrakt oppløst i 0,25 ml 70% vandig aceton. Et representativt semi-preparativt HPLC-diagram vist i fig. 15 0. Individuelle topper eller utvalgte kromatografiske regioner ble oppsamlet etter tidsintervaller eller manuelt ved fraksjons-oppsamling for ytterligere rensing og påfølgende evaluering.

HPLC-betingelser: 250 x 10 mm Supelco Supelcosil LC-Si (5

/im) . Semi-preparativ kolonne 2 0 x 4,6 mm Supelco Supelcosil LC-Si (5/an) guardkolonne.

Detektor: Waters LC

Spektrofotometer, modell 480 @ 254 nm

Strømingshastighet: 3 ml/min., Kolonnetemperatur: omgivelse. injeksjon: 250/zl 70% vandig aceton-ekstrakt.

De oppnådde fraksjoner var som følger:

Eksempel4: Analytisk HPLC- analyse av procyanidin-ekstrakter

Metode l: Reversfase- separering

Procyanidin-ekstrakter oppnådd fra eksempel 3 ble filtrert gjennom 0,45 \ i filter og analysert ved et Hewlett Packard 1090 ternært HPLC-system, utstyrt med en Diode Array detektor og en HP-modell 1046A programmerbar fluorescensdektek-tor. Separering ble utført ved 45°C på en Hewlett-Packard 5 \ x Hypersil ODS kolonne (200 x 2,1 mm) . Flavanolene og procyanidinene ble eluert med en lineær gradient på 60% B i A, fulgt av en kolonnevask med B ved en strømningshastighet på 0,3 ml/min. Den mobile fasesammensetning var B = 0,5% eddiksyre i metanol og A = 0,5% eddiksyre i deionisert vann. Eddiksyre-nivåer i A og B mobile faser kan bli øket til 2%.Komponenter ble detektert ved fluorescens., hvor A,ex=276nm og A.em= 316 nm. Konsentrasjoner av ( + )-katechin og (-)-epikatechin ble bestemt relativt til referanse-standardopp-løsninger. Procyanidin-nivåer ble estimert ved anvendelse av responsfaktor for (-)-epikatechin. Et representativt HPLC-kromatogram som viser separasjon av de forskjellige komponenter, er vist i fig. 2A for én kakao - genotype. Tilsvarende HPLC-profiler ble oppnådd fra de andre kakao-genotyper.

HPLC-betingelser: Kolonne: 200 x 2,1 mm Hewlett PackardHypersil ODS (5 fjt)

Guardkolonne: 20 x 2,1mm Hewlett Packard Hypersil ODS (5/x)

Detektorer: Diode array@280 nm Fluorescens A.ex= 276 nm;

A.em = 316 nm.

Strømningshastighet: 0,3 ml/min. Kolonnetemperatur: 45°C.

Metode 2: Nor malfaae- Beparering

Procyanidin-ekstrakter oppnådd fra eksempel 2 og/eller 3 ble filtrert gjennom et 0,45 \ i filter og analysert ved en Hewlett Packard 1090 serie II HPLC-system, utstyrt med en HP modell 1046A programmerbar fluorescens-detektor og diode-arraydetektor. Separasjoner ble utført ved 37°C på en 5 \ i Phenomanex Lichrosphere Silica100 kolonne (250 x 3,2 mm) forbundet til en Supelco Supelguard LC-Si 5 \ l guardkolonne (20 x4,6 mm). Procyanidiner ble eluert ved lineær gradient under følgende betingelser: (Tid: %A, %B) ; (0, 82, 14), (30, 67,6, 28,4), (60, 46, 50), (65, 10, 86), (70, 10, 86), fulgt av en 8-minutter re-ekvilibrering. Mobilfase-sammensetning var A = diklormetan, B = metanol, og C = eddiksyre. vann ved et volumforhold på 1:1. En strømningshastighet på 0,5 ml/ min. ble benyttet. Komponenter ble detektert ved fluore scens, hvor A,ex= 276 nm og Xem= 316 nm eller ved UV ved 280 nm. Et representativt HPLC-kromatogram som viser separering av forskjellige procyanidiner, er vist i fig. 2B for én genotype. Tilsvarende HPLC-profiler ble oppnådd fra andre kakao-genotyper.

HPLC-betingelser:

250 x 3,2 mm Phenomenex Lichrosphere Silica 100-kolonne (5 n) 20 x 4,6 mm Supelco SupelguardLC-Si (5/x) guardkolonne

Detektorer: Fotodiode-array@280 nm Fluorescens Aex= 276 nm;

^■ern = 316 nm-

Strømningshastighet: 0,5 ml/min.

Kolonnetemperatur: 37°C.

Eksempel 5: Identifikasjon av procyanidiner Procyanidiner ble renset ved væskekromatografi på Sephadex LH-20 (28 x 2,5 cm) kolonner, fulgt av semi-preparativ HPLC ved bruk av 10/i/xBondapak C18 (100 x 8 mm) kolonne eller ved semi-preparativ HPLC ved anvendelse av en 5 /i Supelcosil LC-Si (250 x 10 mm) kolonne.

Delvis rensede isolater ble analysert ved Fast Atom Bombardment - massespektrometri (FAB-MS) på et VG ZAB-T høy oppløsnings MS-system ved anvendelse av en Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry (LSIMS) teknikk i positiv og negativ ionmodi. En cesium ionkanon ble benyttet som deioniserings-kilde ved 30 kV og en "Magic Bullet Matrix" (i:i ditiotreitol/ditioerytritol) ble benyttet som protondonor. Analytisk undersøkelse av disse fraksjoner ved LSIMS avslør-te nærværet av et antall flavan-3-ol-oligomerer som vist i tabell 3.

Hovedmassefragmentionene var i samsvar med arbeid tidligere rapportert for både positiv og negativ ion-FAB-MS-analyse av procyanidiner (Seif et al.,1986, og Porter et al., 1991) . Ionet tilsvarende til m/z 577 (m+H)<+>og dets natriumaddukt ved m/z 599 (M+Na)<+>antydet nærværet av dobbelt bundede procyanidin-dimerer i isolatet. Det var interessant å notere at de høyere oligomerer var mer sannsynlig til å danne natrium-addukter (M+Na)<+>enn deres protonerte molekylære ioner

(M+H)<+>. Procyanidin-isomerene B-2, B-5 og C-l ble tentativt identifisert basert på arbeidet rapportert av Revilla et al.

(1991), Seif et al. (1986) og Porter et al. (1991). Procy^ nidiner opp til både oktamer og dekamer ble verifisert ved FAB-MS i del rensede fraksjoner. I tillegg ble tegn for procyanidiner opptil dodekamer observert fra normalfase HPLC-analyse (se fig. 2B) . Uten å ønske å være bundet av noen bestemt teori er det antatt at dodekamer er begrensende for oppløselighet i oppløsningsmidlet benyttet for ekstraksjon og rensingstrinnene. Tabell 4 opplister relative konsentrasjoner av procyanidinene funnet i xantinalkaloid-fri isolater basert på reversfase HPLC-analyse. Tabell 5 opplister relative konsentrasjoner av procyanidinene basert på normalfase-HPLC-analyse. Fig. 3 viser forskjellige procyanidin-strukturer og figurene 4A-4E viser representative HPLC-kromatogrammer av fem fraksjoner benyttet i de følgende screeninger for anti-cancer-eller antineoplastisk aktivitet.HPLC-betingelser for figurene 4A-4E var som følger: HPLC-betingelser: Hewlett Packard1090 ternært HPLC-system utstyrt med HP-modell 1046A programmerbar fluo-rescensedetektor.

Kolonne: Hewlett Packard 5 \ i Hypersil ODS (200 x 2,1 mm) lineær gradient fra 60% B til A ved.en strømnings-hastighet på 0,3 ml/min. B = 0,5% eddiksyre i metanol; A = 0,5% eddiksyre i deionisert vann. A.ex= 280 nm; Aem= 316 nm.

Fig. 15 0 viser et representativt semi-preparativt HPLC-kromatogram i ytterligere 12 fraksjoner benyttet i screening for anti-cancer eller antineoplastisk aktivitet (HPLC-betingelser angitt ovenfor).

Eksempel 6: Anti-cancer-. anti-tumor- eller a ntineopla-atiflk aktivitet av kakao- ekstrakter

(procyanidiner)

MTT(3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazolium-bromid) - mikrotiterplate-tetrazoliumcytotoksisitet-analyse opprinnelig utviklet av Mosmann (1983) ble benyttet for å screene testprøver fra eksempel 5. Testprøver, stardard (cisplatin og klorambucil) og MTT-reagens ble oppløst i 100% DMSO (dimetylsulfoksid) ved 10 mg/ml konsentrasjon. Serielle fortynninger ble preparert fra stamoppløsninger. For test-prøvene ble fortynninger i området fra 0,01til 100/ig/ml preparert i 0,5% DMSO.

Alle humane tumor-cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Celler ble dyrket som monolag i alfa-MEM inneholdende 10% føtalt bovinserum, 100 enheter/ml penicil-lin, 100/tg/ml streptomycin og 240 enheter/ml nystatin. Cellene ble holdt i en fuktig, 5% C02-atmosfære ved 37°c.

Etter trypsinisering ble cellene talt og justert til en konsentrasjon på 50 x 10<5>celler/ml (variert ifølge cancer-cellelinjen) . 200/il cellesuspensjon ble utsådd på brønner i fire rekker på 96-brønners mikrotiterplater. Etter at cellene fikk feste seg i fire timer, ble 2/il DMSO inneholdende testprøve-oppløsning tilsatt til kvadruplikate brønner. Initielle doserespons-funneksperimenter ved anvendelse av stør-relsesorden- testprøvefortynning ble benyttet for å bestemme området av doser for undersøkelse. Brønn-absorbans ved 540 nm ble målt på en.BIO RAD MP450 plateleser. Den gjennom-snittlige absorbans for kvadruplikat-testprøvebehandlede brønner ble sammenlignet med kontroll, og resultatene ut-trykt som prosent av kontroll absorbans pluss/minus stadard-awik. Reduksjon av MTT til et purpur formazanprodukt korre- lerte på lineær måte med antallet levende celler i brønnen. Ved måling av absorbansen av reduksjonsproduktet kan således kvantifiseringen av prosenten av celleoverlevelse ved en gitt dose av testprøve bli oppnådd. Kontrollbrønner inneholdt en endelig konsentrasjon av1% DMSO.

To av prøvene ble først testet med denne protokoll. Prøve MMI representerer meget rått isolat fra kakao-procyanidiner og inneholdt sannsynlige mengder koffein og teobromin. Prøve MM2 representerer et kakao-procyanidinisolat delvis renset ved gelfiltreringskromatografi. Koffein og teobromin var fraværende i MM2. Begge prøver ble screenet for aktivitet mot de følgende cancer-cellelinjer ved anvendelse av prosedyrene beskrevet ovenfor:

HCT116 colon-cancer

ACHN renal adenocarcinoma

SK-5 melanoma

A498 renal adenocarcinoma

MCF-7 brystcancer

PC-3 prostatacancer

CAPAN-2 pankreatisk cancer

Liten eller ingen aktivitet ble observert med MMI på noen av cancercellelinjene. MM2 ble funnet å ha aktivitet mot HCT-116, PC-3 og ACHN-cancer-cellelinjer. Både MMI og MM2 ble imidlertid funnet å interferere medMTTslik at det dekket reduksjonen i absorbans som ville ha reflektert en reduksjon i levedyktig celletall. Denne interferens bidrar også til store feilsøyler, på grunn av at den kjemiske reaksjon synes å gå hurtigere i brønner sammen med perimeteren av platen. Et typisk eksempel på disse effekter er vist i fig. 5. Ved høye konsentrasjoner av testmateriale vil man forvente å observere en stor reduksjon i overlevere heller enn de høye overlevelsesnivåene vist. Likevel avslørte, mikroskopiske undersøkelser at cytotoksiske effekter opptrådte trass MMT-interferenseffekter. For eksempel ble en IC50-verdi på 0,5//g/ml for effektene av MM2 påACHN-cellelinjene oppnådd på denne måte.

Disse preliminære resultater krever ifølge oppfinnernes syn forbedring i analyseprosedyrene for å unngå interferens med MTT. Dette ble oppnådd som følger. Etter inkubering av platene ved 37°C i en fuktet, 5% C02-atmosfære i 18 timer ble mediet forsiktig tatt av og erstattet med ferskt alfa-MEM-medium. Dette medium ble igjen trukket ut fra cellene på den tredje dagen av analysen og erstattet med 100/il friskt pre-parerte McCoy's medium, il/il av en 5 mg/ml stamoppløsning av MTT i PBS (fosfatbufret saltvann) ble så tilsatt til brønnene i hver plate. Etter inkubering i 4 timer i fuktet, 5% C02-atmosfære ved 37°C, ble 100/il 0,04 N HC1 i isopro-panol tilsatt til alle brønner i platen, fulgt av grundig blanding for å oppløse formazanen produsert ved eventuelle levedyktige celler. Videre ble det bestemt å subfraksjonere procyanidinet for å bestemme den spesifikke komponent som er ansvarlig for aktiviteten.

Subfraksjoneringsprosedyren på forhånd beskrevet ble benyttet for å preparere prøver for ytterligere screening. Fem fraksjoner som representerer arealene vist i fig. l og kom-ponentdistribusjonen vist i figurene 4A-4E ble preparert. Prøvene ble kodet MM2A til MM2E for å reflektere disse analytiske karakteristikkene og for å angi fraværet av koffein og teobromin.

Hver fraksjon ble individuelt screenet mot HCT-116, PC-3 og ACHN-cancercellelinjer. Resultatene indikerte at aktiviteten ikke var konsentrert til noen spesifikk fraksjon. Denne type

resultat ble ikke ansett uvanlig, da komponentene i "aktive" naturlige produktisolater kan oppføre seg synergistisk. For kakao-procyanidinisolatet (MM2) utgjorde over 2 0 detekter-bare komponenter isolatet. Det ble ansett mulig at aktiviteten var relatert til en kombinasjon av komponenter til stede

i forskjellige fraksjoner, heller enn at aktiviteten var relatert til en individuell komponent.

På basis av disse resultater ble det bestemt å kombinere fraksjonene og gjenta analysene mot de samme cancer-cellelinjer. Flere fraksjonskombinasjoner produserte cytotoksiske effekter mot PC-3-cancercellelinjer. Spesifikt ble IC50-verdier på 40/xg/ml hver for MM2A- og MM2E-kombinasjonen og en på 20/xg/ml av hver av MM2C og MM2E-kombi nasjonen oppnådd. Aktivitet kan også bli rapportert mot HCT-116 og ACHN-cellelinjer, men som før, og forhindret interferens med MTT-indi-katoren presise observasjoner. Replikate eksperimenter ble gjentatt utført på HCT-116 og ACHN-linjer for å forbedre disse data. Disse resultatene var imidlertid inkonklusive på grunn av bakteriell kontaminasjon og utarming av testprøve-materialet. Figurer 6A-6D viser dose-responsforhold mellom kombinasjoner av kakao-ekstrakter og PC-3-cancerceller.

Fra disse data er det likevel klart at kakao-ekstrakter, spesielt kakao-polyfenoler eller -procyanidiner har signifikante anti-tumor, anti-cancer eller antineoplastisk aktivitet, spesielt med hensyn på human PC-3 (prostata), HCT-116 (colon) og ACHN (renal) cancer-cellelinjer. I tillegg antyder resultatene at spesifikke procyanidinfraksjoner kan være ansvarlig for aktiviteten mot PC-3-cellelinjen.

Eksempel 7: Anti-cancer-, anti- tumor- eller antineoplastisk aktivitet i kakao- ekstrakter

( procyanidiner)

For å bekrefte funnene ovenfor og ytterligere studere fraksjonskombinasjoner ble en annen omfattende screening utført.

Alt preparert materiale og prosedyrer er identisk med de rapportert ovenfor, bortsett fra at standard 4-replikater pr. testdose ble øket til 8- eller 12-replikater pr. testdose. For denne studie ble individuelle og kombinasjoner av fem kakao-procyanidinfraksjoner screenet mot de følgende cancercellelinj er.

PC-3 Prostata

KB Nasopharyngeal/HeLa

HCT-116 Colon

ACHN Renal

MCF-7 Bryst

SK-5 Melanoma

A-549 Lunge

CCRF-CEM T-celle-leukemi

Individuelle screeninger bestod av analysering av forskjellige dosenivåer (0,01-100 jig/ml) av fraksjoner A, B, C, D og E (se figurer 4A-4E og diskusjonen derav, ovenfor) mot hver cellelinje. Kombinasjonsscreeninger bestod av kombinasjon av like dosenivåer av fraksjoner A+B, A+C, A+D, A+E, B+C, B+D, B+E, C+D, C+E og D+E mot hver cellelinje. Resultatene fra disse analyser er individuelt diskutert, fulgt av en total oppsummering.

A. PC- 3- prostata- cellelinj e

Figurer 7A-7H viser det typiske dose-responsforholdet mellom kakao-procyanidinfraksjoner og PC-3-cellelinjen. Figurer 7D og 7E demonsterer at fraksjonene D og E var aktive ved en I<C>5Q-verdi på75ug/ ml. I<C>50-verdiene som ble oppnådd fra dose-responskurvene fra de andre procyanidin-fraksjonskombi-nas joner var i området fra 60 til 80 txg/ ml når fraksjonene D eller E var til stede. De individuellelC50-verdier er opplistet i tabell 6.

B. KB Nasopharynoeal/HeLa-ce llelinje

Figurer 8A-8H viser typisk dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinf raks joner og KB-Nasopharyngeal/HeLa-cellelinjen. Figurer 8D og 8E demonstrerer at fraksjonene D og E var aktive ved en IC50-verdi på 75/xg/ml. Figurer 8F-8H angir representative resultater oppnådd fra fraksjonskombinasjons-studien. I dette tilfelle hadde procyanidin-fraksjonskombi- nasjon A+B ingen effekt, mens fraksjonskombinasjoner B+E og D+E var effektive ved en IC50-verdi på 60 ug/ ml. IC50-verdi-en som ble oppnådd fra de andre dose-responskurvene fra andre f raks jonskombinas joner var i området 60 til 80 ug/ ml når fraksjonene D og E var til stede. De individuelle IC50-verdier er opplistet i tabell 6. Disse resultater er hovedsakelig de samme som de som ble oppnådd mot PC-3-cellelinjen.

C.HCT-116-colon-cellelinje

Figurer 9A til 9H viser typiske dose-responsf orhold mellom kakao-procyanidinf raks joner og HCT-116-colon-cellelinj en. Figurene 9D og 9E demonstrerer at fraksjon E var aktiv ved en ic50-verdi på omkring 400//g/ml. Denne verdi ble oppnådd ved ekstrapolering av den eksisterende kurve. Notér at helningsvinkelen til dose-responskurven for fraksjon D også indikerer aktivitet. Ingen IC5Q-verdi ble imidlertid bestemt fra dette plott, da helningsvinkelen til kurven var for liten til å oppnå en pålitelig verdi. Figurene 9F-9H angir representative resultater oppnådd fra fraksjonskombinasjons-studien. I dette tilfelle viste procyanidin-fraksjonskombi-nas jon B+D ingen spesiell aktivitet, mens fraksjonskombinasjoner A+E og D+E var aktive IC50-verdier på henholdsvis 500 iig/ml og 85 ug/ ml. IC50-verdiene som ble oppnådd fra dose-responskurvene til andre fraksjonskombinasjoner var gjennom-snittlig omkring 250 jzg/ml når fraksjon E var til stede. De ekstrapolerte lC50-verdier er opplistet i tabell 6.

D. ACHN- renal- cellelinje

Figurer 10A-10H viser de typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinf raks joner og ACHN-renal-cellelinj en. Figurer 10A-10E indikerer at ingen fraksjon var aktiv mot denne cellelinje. Figurer 10F-10H angir representative resultater oppnådd fra f raks jonskombinas jon-studien. I dette tilfelle var procyanidin-f raks jonskombinas jon B+C inaktiv, mens f raks jonskombinas j onenA+E resulterte i en ekstrapolert lC50-verdi på omkring 500//g/ml. Dose-responskurvene tilsva rende til en C+D-kombinasjon ble ansett inaktive, da deres helningsvinkel var for liten. Ekstrapolerte IC50-verdier for de andre fraksjonskombinasjoner er opplistet i tabell 6.

B. A- 549- lunge-cellelinje

Figurer HA-llH viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjoner og A-549-lunge-cellelinje. Ingen aktivitet kunne bli detektert fra noen individuelle fraksjoner eller kombinasjoner av fraksjoner ved dosene benyttet i analysen. Imidlertid kan procyanidinfraksjonene likevel ha anvendelse med hensyn på denne cellelinje.

F- SK- 5- melanoma-ce llelinj e

Figurer 12A-12H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjoner og SK-5-melanoma-cellelinjen. Ingen aktivitet kunne bli detektert fra noen individuelle fraksjoner eller kombinasjoner av fraksjoner ved dosene benyttet i analysen. Imidlertid kan procyanidinfraksjonene likevel ha anvendelse med hensyn på denne cellelinje.

G. MCF-7-bryst-cellelinje

Figurer 13A-13H viser typiske dose-responsforhold mellom kakao-procyanidinfraksjoner og MCF-7-bryst-cellelinje. Ingen aktivitet kunne bli detektert fra noen individuelle fraksjoner eller kombinasjoner av fraksjoner ved dosene benyttet i analysen. Imidlertid kan procyanidinfraksjonene likevel ha anvendelse med hensyn på denne cellelinje.

H. CCRF-CEM-T-celle-leukemilinje

Atypiske dose-responskurver ble opprinnelig oppnådd mot CCRF-CEM-T-celle-leukemilinje. Imidlertid indikerte mikroskopiske tellinger celletall versus tid ved forskjellige f.raksjonskonsent ras joner at 500/ig av fraksjoner A, B og D gav en 80% vekstreduksjon over en 4-dagers periode. Et representativt dose-responsforhold er vist i fig.14.

I. O ppsummering

IC5Q-verdiene oppnådd i disse analyser er kollektivt oppsamlet i tabell 6 for alle cellelinjer bortsett fra CCRF-CEM-T-celle-leukemi. T-celle-leukemi-data ble utelatt med hensikt fra tabellen, da en forskjellig analyseprosedyre ble benyttet. En generell oppsummering av disse resultater indikerer at det meste av aktiviteten var forbundet med fraksjonene D og E. Disse fraksjoner var de mest aktive mot PC-3 (prostata) og KB (nasopharyngeal/HeLa) cellelinjer. Disse fraksjoner viste også aktivitet mot HCT-116 (colon) og ACHN (renal) cellelinjer, men kun ved mye høyere doser. Ingen aktivitet ble detektert mot MCF-7 (bryst) , SK-5 (melanoma) og A-549 (lunge) cellelinjer. Procyanidinfraksjoner kan imidlertid likevel ha anvendelse med hensyn på disse cellelinjer. Aktivitet kan også vises mot CCRF-CEM (T-celle-leukemi) cellelinje. Det må noteres at fraksjon D og E er de mest komplek-se sammensetninger. Fra disse data er det likevel klart at kakao-ekstrakter, spesielt kakao-procyanidin, har signifikant anti-tumor-, anti-cancer- eller antineoplastisk aktivitet.

Verdier over 100//g/ml ble ekstrapolert fra dose-responskurver

Eksempel 8: Anti-cancer-, anti-tumor- eller antineoplastisk aktivitet av kakao-ekstrakter

(procyanidiner)

Forskjellige ytterligere in vitro-analyseprosedyrer ble benyttet for å komplettere og utvide resultatene presentert i eksemplene 6 og 7.

Metode A: Kryetallviolett- farveanalyse

Alle humane tumor-cellelinjer ble oppnådd fra American Type Culture Collection. Celler ble dyrket som monolag i IMEM inneholdende 10% føtalt bovinserum uten antibiotika. Cellene ble holdt i fuktet, 5% C02-atmosfære ved 37°C.

Etter trypsinering ble cellene talt og justert til en konsentrasjon på 1.000-2.000 celler pr. 100/il. Celle-proli-ferasjon ble bestemt ved utsåing av celler (1.000-2.000 celler/brønn) i en 96-brønners mikrotiter-plate. Etter tilsetning av 100/il celler pr. brønn, ble cellene tillatt å feste seg i 24 timer. Ved slutten av 24-timers perioden ble forskjellige kakao-fraksjoner tilsatt ved forskjellige konsentrasjoner for å oppnå dose-responsresultater. Kakao-fraksjonene ble oppløst i media ved 2-gangers konsentrasjon, og 100/il av hver oppløsning ble tilsatt i triplikate brønner. På

påfølgende dager ble plater farvet med 50/il krystallf iolett (2,5 g krystallfiolett oppløst i 125 metanol, 375 ml vann) i15 minutter. Farvingen ble fjernet og platen ble forsiktig neddykket i kaldt vann for å fjerne overskudd av farve. Vas-kingene ble gjentatt ytterligere to ganger og platene ble tørket. Den gjenværende farve ble oppløst ved tilsetting av 100/il 0,1 M natriumcitrat/50% etanol til hver brønn. Etter oppløsning ble antallet celler kvantifisert på en ELISA-plateleser ved 540 nm (referansefilter ved 410 nm). Resultater fra ELISA-leseren ble oppsatt i kurve med absorbans på y-aksen og dager vekst på x-aksen.

Metode B: Myk agar- kloningsanalyse

Celler ble klonet i myk agar ifølge metoden beskrevet av Navata et al. (1981). Enkeltcelle-suspensjoner ble fremstilt i media inneholdende 0,8% agar med forskjellige konsentrasjoner av kakaofraksjoner. Suspensjonene ble alikvotert i 35 mm skåler belagt med media inneholdende 1,0% agar. Etter10 dagers inkubering ble antallet kolonier med større diameter enn 60/im bestemt på en Ominicron 3600 Image Analysis Sys tem. Resultatene ble plottet med antall kolonier på y-aksen og konsentrasjon av en kakaofraksjon på x-aksen.

Metode C:XTT-mjtokultu<y>-tetrasolAum-a<q>aJ,yae XTT-analyseprosedyren beskrevet av Scudiero et al. (1988) ble benyttet for å screene forskjellige kakaofraksjoner. XTT-analysen var hovedsakelig den samme som den beskrevet ved anvendelse av MTT-prosedyren (eksempel 6), bortsett fra de følgende modifikasjoner. XTT [ (2,3-bis(2-metoksy-4-nitro-5-sulfofenyl) -5- [ (fenylamino)karbonyl] -2H-tetrazoliumhydrok-sid) ble preparert ved l mg/ml medium uten serum, forhånds-varmet til 37°C. PMS ble preparert ved 5 mm PBS. XTT og PMS ble blandet sammen; 10/il PMS pr. ml XTT og 50 /il PMS-XTT ble tilsatt til hver brønn. Etter en inkubering ved 37°C i4timer ble platene blandet i 30 minutter på en mekanisk ris-ter og absorbansen målt ved 450-600 nm. Resultatene ble plottet med absorbans på y-aksen og dager vekst eller konsentrasjon på x-aksen.

For metoder A og C ble resultatene også plottet som prosent-kontroll som y-akse og dager vekst eller konsentrasjon på y-aksen.

En sammenligning av XTT- og krystallfiolett-analyseprosedyrene ble gjort med kakaofraksjon D&E (eksempel 3B) mot brystcancer-cellelinje MCF-7 pi68 for å bestemme hvilken analyse som var mest sensitiv. Som vist i fig. 15A, viste begge analyser de samme dose-responseffekter for konsentrasjoner >75 ug/ ml. Ved konsentrasjoner under denne verdi viste krystallfiolett-analysen høyere standardavvik enn XTT-analyseresultatene. Ettersom krystall-fiolett-analysen var enklere å benytte, ble imidlertid alle etterfølgende analyser, hvis ikke annet er spesifisert, utført ved denne prose-dyre .

Krystallfiolett-analyseresultater er presentert (figurer15B-15E) for å demonstrere effekten av rå polyfenol-ekstrakt

(eksempel 2) på henholdsvis brystcancer-cellelinje MDA MB231, prostatacancer-cellelinje PC-3, brystcancer-cellelinje MCF-7 pl63 og cervicalcancer-cellelinje Hela. I alle tilfeller hemmes en dose på 250 fig/ ml fullstendig all can-cercellevekst over en periode på 5 til 7 dager. Hela-cellelinjen syntes å være mer sensitiv for ekstrakt da en 100//g/ml dose også hemmet vekst. Kakaof raks joner fra eksempel 3B ble også analysert mot Hela og en annen brystcancer-cellelinje SKBR-3. Resultatene (figurer 15F og 15G) viste at fraksjon D&E hadde den høyeste aktivitet. Som vist i figurer 15H og 151 ble IC50-verdier på omkring 40 ug/ ml D&E oppnådd fra begge cancercellelinjer.

Kakaofraksjon D&E ble også testet i softagar-kloningsana-lysen, som bestemte evnen til testforbindelsen i å hemme forankringsuavhengig vekst. Som vist i fig. 15J hemmet en konsentrasjon på 100 ug/ ml fullstendig kolonidannelsen av Hela-celler.

Rå polyfenol-ekstrakter oppnådd for åtte forskjellige kakao-genotyper, som representerer tre hortikulturelle raser kakao, ble også analysert mot Hela-cellelinjen. Som vist i fig. 15K, viste alle kakao-variantene tilsvarende dose-responseffekter. UIT-l-variasjonen viste den sterkeste aktivitet mot hele Hela-cellelinjen. Disse resultater demonstrerer at alle kakao-genotypene har en polyfenolfraksjon som viser aktivitet mot minst én human cancercellelinje som er uavhengig av geografisk opprinnelse, hortikulturell rase og genotype.

En annen serie av analyser ble utført på rå polyfenol-ekstrakter preparert på en daglig basis fra ett tonn skala

tradisjonell 5-dags fermentering på brasilianske kakåkobøn-ner, fulgt av et 4-dagefs soltørkingstrinn. Resultatene vist i fig. 15L, viste ingen naturlige effekter av disse tidlige prosesseringstrinn, noe som antyder liten forandring i sammensetningen av polyfenolene. Imidlertid er det kjent

(Lahrian og Petterson, 1983) at polyfenol-oksidase (PPO) vil oksidere polyfenoler under fermeteringstrinnet. For å bestemme hvilken effekt enzymatisk oksiderte polyfenoler vil ha på aktiviteten, ble et annet eksperiment utført. Rå PPO ble preparert ved ekstrahering av fint malt, ikke-fermentert, frysetørkert, avfettet brasilianske kakaobønner med aceton ved et forhold på l g pulver til 10 ml aceton. Oppslemmingen ble sentrifugert ved 3.000 omdr./min. i 15 minutter. Dette ble gjentatt tre ganger, kasting av supernatanten hver gang, hvor den fjerde ekstrahering ble helt gjennom en Buchner-filtreringstrakt. Acetonpulveret ble tillatt å luft-tørke, fulgt av analyse ifølge prosedyren beskrevet av McLord og Kilara (1983) . Til en oppløsning av rå polyfenoler (100 mg/10 ml citratfosfat-buffer, 0,02M, pH 5,5) ble 100 mg acetonpulver (4.000 ix/mg protein) tilsatt og omrørt i 30 minutter med en strøm luft boblet gjennom oppslemmingen. Prøven ble sentrifugert ved 5.000 x g i 15 minutter og supernatanten ekstrahert tre ganger med 2 0 ml etylacetat. Etylacetat-ekstraktene ble slått sammen, tatt til tørrhet ved destillering under delvis vakuum og 5 ml vann tilsatt, fulgt av lyofilisering. Materialet ble så analysert mot Hela-celler og doserespons sammenlignet med rå polyfenol-ekstrakter som ikke var enzymatisk behandlet. Resultatene (fig.15M) viser et signifikant skift i dose-responskurven for den enzymatisk oksiderte ekstrakt, noe som viser at det oksiderte produkt var mer inhibitorisk enn deres native former.

Eksempel 9: Antioksidant- aktivitet av kakao-ekstrakter

inneholdende procyanidiner

Bevis i litteraturen antyder et forhold mellom forbruk av naturlig forekommende antioksidanter (vitaminer C, E og B-karoten) og en senket opptreden av sykdom, inkluder cancer (Designing Foods; Caragay, 1992). Det er generelt antatt at disse antioksidanter påvirker visse oksydative og friradi-kale prosesser involvert i noen typer tumorpromosjon. I tillegg har noen plante-polyfenoliske forbindelser, som er blitt vist å være anticarciogene, også hatt betydelig antioksidant aktivitet (Ho et al., 1992; Huang et al., 1992).

For å bestemme om kakao-ekstrakter inneholdende procyanidiner har antioksidant-egenskaper, ble en standard Rancimat-metode benyttet. Prosedyrene benyttet i eksempler l, 2 og 3 ble benyttet for å fremstille kakao-ekstrakter, som ble manipulert videre for å produsere to fraksjoner fra gelfiltreringskromatografi. Disse to fraksjoner er faktisk kombinerte fraksjoner A til C, og D og E (se fig. l) hvis antioksidant-egenskaper ble sammenlignet mot syntetiske antioksidanter BHA og BHT.

Peanøtt-olje ble presset fra ikke-røstede peanøtter etter at skallet var fjernet. Hver testforbindelse ble hatt i oljen ved to nivåer, 100 ppm og 20 ppm, med de aktuelle nivåer angitt i tabell 7. 50 \ il metanol oppløst antioksidant ble tilsatt til hver prøve for å hjelpe med dispersjonen av antioksidanten. En kontrollprøve ble preparert med 50 fil metanol inneholdende ingen antioksidanter.

Prøvene ble evaluert i duplikat for oksidativ stabilitet ved anvendelse av Rancimat-stabilitetstesten ved 100°C og 20 cm<3>/min. luft.Eksperimentparametere ble valgt for å tilpas-se de benyttet med aktiv-oksygenmetoden (AOM) eller skift - stabilitetstesten (Van Oosten et al., 1981) . En typisk Raneimat-kurve er vist i fig. 16. Resultater er rapport i tabell 8 som timer nødvendig for å nå et peroksidnivå på 100 mekv.

Disse resultater demonstrerer øket oksidativ stabilitet for peanøttolje med alle de testede tilsetningsstoffer. Den høyeste økning i oksidativ stabilitet ble realisert med prø-ven tilsatt rå etylacetat-ekstrakt av kakao. Disse resultater demonstrerer at kakao-ekstrakter inneholdende procyanidiner og antoksidant-potensiale som er likt eller større enn like mengder BHA og BHT. Følgelig kan oppfinnelsen bli benyttet i stedet for BHT eller BHA i kjente anvendelser av BHA og BHT, slik som f.eks. som en antioksidant og/eller mat-tilsetningsstoff. Hva dette angår, ble det også notert at oppfinnelsen er av en spiselig kilde. Gitt disse resultater kan fagmannen også lett bestemme en passende mengde ifølge oppfinnelsen å benytte i slik"BHAeller BHT"-anvendelser, f.eks. mengden for tilsetning til mat, uten unødven-dig eksperimentering.

Eksempel 10: TopolBomerase II- hemmelseBstudler DNA topoisomerase I og II er enzymer som katalyserer brudd og gjenforening av DNA-strenger for derved å kontrollere topologitilstanden til DNA (Wang, 1985) . I tillegg til studien av intracellulær funksjon av topoisomerase, har én av de mest signifikante funn vært identifiseringen av topoisomerase II som det primære cellulære mål for et antall klinisk viktige antitumor-forbindelser (Yamashita et al., 199 0), som omfatter interkalerende midler (m-AMSA, Adriamycin<®>og ellipticin) så vel som ikke-interkalerende epipodo-fyllotoksin. Flere bevislinjer indikerer at noen antitumor-medikamenter har felles egenskaper ved stabilisering av DNA - topoisomerase II-komplekset ("spaltbart kompleks"), som etter eksponering for denaturerende midler resulterer i induksjon av DNA-spalting (Muller et al., 1990). Det har blitt foreslått at spaltingskompleksdannelsen ved antitumor-medikamenter produserer klumpete DNA-addukter som kan føre til celledød.

Ifølge denne attraktive modell er en spesifikk ny inducer for DNA-topisomerase II spaltbart kompleks anvendelig som anti-cancer-, anti-tumor- eller antineoplastisk middel. I et forsøk på å identifisere cytotoksiske forbindelser med akti-viteter som målsøker DNA, ble kakao-procyanidiner screenet for øket cytotoksisk aktivitet mot flere DNA - skadesensitive cellelinjer og enzymanalyse med human-topoisomerase II oppnådd fra lymfoma.

A. Dekatenerina av kinetopl ast- DNA ved topoiBomeraae II In vitro-hemming av topoisomerase II-dekatenering av kinetoplast-DNA, som beskrevet av Muller et al. (1989), ble utført som følger. Nukleære ekstrakter inneholdende topoisomerase II-aktivitet ble preparert fra humane lymfoma ved modifika sjoner av metoden ifølge Miller et al. (1981) og Danks et al. (1988). Én enhet renset enzym var nok til å dekatenere 0,25 /tg kinetoplast DNA i 30 min. ved 34 °C. Kinetoplast DNA ble oppnådd fra trypanosomet Crithidia fasciculata. Hver reaksjon ble utført i et 0,5 ml mikrosentrifugerør inneholdende 19,5/il H20,2,5/xl10x buffer (1x buffer inneholder 50 mM tris-HCl, pH 8,0, 120 mM KC1, 10 mM MgCl2, 0,5 mM ATP, 0,5 mM ditiotreitol og 30/tg BSA/ml) , l/xl kinetoplast DNA (0,2 ug), og l/xl DMSO inneholdende kakao-procyanidin-test-fraksjon med forskjellige konsentrasjoner. Denne kombinasjon ble blandet grundig og holdt på is. Én enhet topoisomerase ble tilsatt umiddelbart før inkuberingen i et vannband ved 34°C i 30 minutter.

Etter inkubering ble dekateneringsanalysen stoppet ved tilsetning av 5/xl stoppbuffer (5% sarkosyl, 0,0025% bromofenol blue, 25% glycerol) og plassert på is. DNA ble elektrofore-sert på en 1% agarosegel i TAE-buffer inneholdende etidium-bromid (0,5 /ig/ml) . Ultrafiolett bestråling ved 310 nm bølgelengde tillot visualisering av DNA. Gelene ble foto-grafert ved anvendelse av et Polaroid Land kamera.

Fig. 17 viser resultatene av disse eksperimenter. Fullt katenatert kinetoplast-DNA migrerer ikke inn i en 1% agarosegel. Dekatenering av kinetoplast-DNA ved topoisomerase II genererer bånd av monomer DNA (monomersirkel, former I og II) som migrerer inn i gelen. Hemming av enzymet ved tilsetning av kakao-procyanidiner er tydelig ved progressiv for-svinning av monmerbåndene som en funksjon av økende konsentrasjon. Basert på disse resultatene ble kakao-procyanidin-fraksjoner A, B, D og E vist å hemme topoisomerase II ved konsentrasjoner i området fra 0,5 til 5,0/xg/ml. Disse inhi-bitoriske konsentrasjoner var meget tilsvarende til de oppnådd for mitoksantrbn og m-AMSA [4'-(9-akridinylamino)-metansulfon-m-anisidid].

B. Medikament- sensitive cell elinjer

Kakao-procyanidiner ble screenet for cytotoksisitet mot forskjellige DNA-skadesensitive cellelinjer. Én av disse cellelinjer var xrs-6 DNA dobbelstreng-reparasjonsmutanten utviklet av P. Jeggo (Kemp et al., 1984). DNA reparasjons-svikten i xrs-6 cellelinjen gjør dem spesielt sensitive for røntgenbestråling, for forbindelser som produserer DNA-dob-bel st reng-brudd direkte, så som bleomycin, og til forbindelser som hemmer topoisomerase II, og kan således indirekte indusere dobbelstreng-brudd som foreslått av Warter et al.

(1991). Cytotoksisiteten mot reparasjonssvikt-linjen ble

sammenlignet med cytotoksisiteten mot en DNA-reparasjonspro-fisient-CHO-cellelinje, BR1. Øket cytotoksisitet mot reparasjonssvikt (xrs-6) linjen ble tolket som et bevis på dannel-se av DNA-spaltbare dobbelstrengs-brudd.

Den DNA-reparasjonskompetente CHO-linje, BRi, ble utviklet av Barrows et al. (1987) og uttrykker 0<6->alkylguanin - DNA - alkyltransferase i tillegg til normal CHO DNA reparasjons-enzymer . CHO-dobbelstrengs-brudd-reparasjonssviktlinjen (xrs-6) var en generøs gave fra dr. P.Jeggo og samarbeidere (Jeggo et al.,1989). Begge disse linjer ble dyrket som monolag i alfa-MEM inneholdende serum og antibiotika som beskrevet i eksempel 6. Celler ble holdt ved 37°C i en fuktet 5% C02-atmosfære. Før behandling med kakao-procyanidiner ble celler dyrket som monolag løsnet med trypsinbehandling. Analyser ble utført ved anvendelse av MTT-analyseprosedyren beskrevet i eksempel 6.

Resultatene (fig. 18) indikerte ingen økning i cytotoksisitet mot xrs-6-celler, noe som antyder at kakao-procyanidiner hemmer topoisomerase II på en måte som er forskjellig fra Ikke-spaltbare kompleksdannende forbindelser er relativt nye oppdagelser. Medlemmer av antracykliner, podofyllinalkaloi-der, antracendioner, akridiner og ellipticiner er alle god-kjent for klinisk anti-cancer-, anti-tumor- eller antineoplastisk anvendelse, og de produserer spaltbare komplekser (Liu, 1989). Flere nye klasser topoisomerase II-inhibitorer er også nylig blitt identifisert, som ikke synes å produsere spaltbare komplekser. Disse omfatter amonafid (Hsiang et al., 1989), distamycin (Fesen et al., 1989), flavanoider (Yamashita et al., 1990), saintopin (Yamashita et al., 1991), membranon (Drake et al., 1989), terpanoider (Kawada et al., 1991), antrapyrazoler (Fry et al., 1985), dioksopi-peraziner (Tanabe et al.,1991) og det marine akridin - dercitin (Burres et al., 1989).

Da kakao-procyanidiner inaktiverer topoisomerase II før spaltbare komplekser blir dannet, har de kjemoterapeutisk verdi alene eller i kombinasjon med andre kjente mekanisk definerte topoisomerase Il-inhibitorer. I tillegg synes kakao-procyanidiner også å være en ny klasse topoisomerase II-inhibitorer (Kashiwada et al.,1993), og kan således være mindre toksiske for celler enn andre kjente inhibitorer for derved å fremme deres anvendelse i kjemoterapi.

Den humane brystcancer-cellelinje MCF-7 (ADR), som uttrykker et membranbundet glykoprotein (gpl70) for å gi multimedika-ment-resistens (Leonessa et al., 1994) og dens parentale cellelinje MCF-7 pi68 ble benyttet for å analysere effekten av kakaofraksjoner D&E. Som vist i fig.19, ble den parentale cellelinje hemmet ved økende dosenivå av fraksjon D&E, mens den Adriamycin (ADR) -resistente linje ble mindre påvirket ved høyere doser. Disse resultater viser at kakao-fraksjonen D&E har en effekt på multimedia-resistente cellelinjer.

Eksempel li: Syntese av procy anidi ner

Syntesen av procyanidiner ble utført ifølge prosedyren utviklet av Delcour et al., (1983), med modifikasjoner. I tillegg til kondensering av (+)-katechin med dihydroquertin under reduserende betingelser, ble (-)-epikatechin også benyttet for å reflektere de høyere konsentrasjoner av (-)-epikatechin som naturlig opptrer i ikke-fermenterte kakaobønner. De syntetiske produkter ble isolert, renset, analysert, og identifisert ved prosedyrene beskrevet i eksempler 3, 4 og 5. På denne måte ble det fremstilt bifla-vanoider, triflavanoider og tetraflavanoider og anvendt som analytiske standarder og på samme måte som beskrevet ovenfor med hensyn på kakao-ekstrakter.

Eksempel 12: Analyse av normalfase semi- pre parative frak-sjoneringer

Da polyfenolekstraktene er av kompleks sammensetning, var det nødvendig å bestemme hvilke komponenter som var aktive mot cancer-cellelinjer for ytterligere rensing, dose-responsanalyse og omfattende strukturelle identifikasjoner. En normalfase semi-preparativ HPLC-separering (eksempel 3B) ble benyttet for å separere kakao-procyanidiner på basis av oligomer størrelse. I tillegg til den opprinnelige ekstrakt, ble 12 fraksjoner preparert (figurer 2B og 15 0) og analysert ved100 ug/ ml og 25//g/ml doser mot Hela for å bestemme hvilken oligomer som hadde den største aktivitet. Som vist i fig. 20, demonstrerte fraksjoner 4-11 (pentamer-dodekamer) IC50-verdier på omkring 25/ig/ml. Disse resultatene indikerer at disse spesifikke oligomerer hadde den største aktivitet mot Hela-celler. I tillegg indikerer normalfase HPLC-analyse av kakao-fraksjoner D&E at disse fraksjoner var anriket på disse oligomerer.

Fra det foregående er det klart at ekstrakten og kakao-polyfenolene, så vel som sammensetningene, metoden og settet ifølge oppfinnelsen, har anvendelse. Hva dette angår, kan det nevnes at oppfinnelsen er av en spiselig kilde og at aktiviteten in vitro kan demonstrere minst noe aktivitet in vivo, spesielt hva angår dosene diskutert ovenfor.

I tillegg viser diskusjonen ovenfor at ekstrakten og kakaopolyf enolene, såvel som sammensetningene, fremgangsmåten og settene, har antioksidant aktivitet lik den til BHT og BHA, så vel som oksidativ stabilitet. Således kan oppfinnelsen bli benyttet i stedet for BHT eller BHA i kjente anvendelser for BHA og BHT, slik som en antioksidant, f.eks. et antioksidant-mat-tilsetningsstoff. Oppfinnelsen kan også bli benyttet i stedet for topoisomerase-inhibitorer i de tidligere kjente anvendelser for disse. Følgelig er det mange sammensetninger og metoder som er omfattet av oppfinnelsen, f.eks. antioksydant- eller konserveringssammensetninger, topoisomerasehemmende sammensetninger, fremgangsmåter for konservering av mat eller et hvilket som helst emne fra slik som fra oksidering, og fremgangsmåter for hemming av topoisomerase som omfatter enten ekstrakten og/eller kakaopolyf enol (er) eller som omfatter å bringe i kontakt mat, et emne eller topoisomerase med respektive sammensetninger eller med ekstrakten og/eller kakaopolyfenolene.

Etter på denne måte i detalj å ha beskrevet foretrukne ut-førelsesformer av oppfinnelsen, må det forstås at oppfinnelsen definert ved de vedlagte krav, ikke er begrenset i spesiell detalj av det satt ovenfor da mange variasjoner derav er mulig uten å forlate ånden og rammen av foreliggende oppfinnelse.

REFERANSER

1. Barrows, L.R., Borchers, A.N., og Paxton, M.B., Trans-fectant CHO Cells Expressing 0<6>- alkylquanine - DNA-alkyltransferase Display Increased Resistance to DNA Damage Other than 0<6->guanine Alkylation, Caroinoge-nesis, 8:1853 (1987) . 2. Boukharta, M.. Jalbert, G. og Castonguay, A., Efficacy of Ellagitannins and Ellagic Acid as Cancer Chemopre-ventive Agents - Presented at the xvi<th>international Conference of the Groupe Polyphenols, Lisboa, Portugal, 13.-16. juli 1992. 3. Burres, N.S., Sazesh, J., Gunawardana, G.P. , og ele-ment, J.J., Antitumor Activity and Nucleic Acid Binding Properties of Dercitin, a New Acridine Alkaloid Isola-ted from a Marine Dercitus species Sponge, Cancer Research, 49, 5267-5274 (1989) . 4. Caragay, A.B., Cancer Preventive Foods and Ingredients, Food Technology, 46:4, 65-79 (1992) 5. Chu, S.-C, Hsieh, Y.-S. og Lim. J.-Y., inhibitory Effects of Flavonoids on Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase Activity. J. of Natural Products, 55:2, 179-183 (1992) . 6. Clapperton, J., Hammerstone, J.F. Jr , Romanczyk, L.J. Jr., Chan, J., Yow, S., Lim, D. og Lockwood, R., Polyphenols and Cocoa Flavor - Presented at the XVI^h International Conference of the Groupe Polyphenols, Lisboa, Portugal, 13.-16. juli, 1992. 7. Danke, M.K., Schmidt, CA , Cirtain, M.C., Suttle, D.P., og Beck, W.T., Altered Catalytic Activity of and DNA Cleavage by DNA Topoisomerase II from Human Leuke-mic Cells Selected for Resistance to VM-26, Biochem., 27 -.8861 (1988) . 8. Delcour, J.A., Ferreira, D. og Roux D.G., Synthesis of Condensed Tannins, Part 9, The Condensation Sequence of Leucocyanidin with (+)-Catechin and with the Resultant Procyanidins, J. Chem. Soc. Perkin Trans, i, 1711-1717

(1983) . 9. Deschner, E.E., Ruperto, J., Wong, G. og Newmark, H.L., Quercetin and Rutin as Inhibitors ofAzoxymethanol - Induced Colonic Neoplasia, Carcinogenesis, 7, 1193-1196 (.1991) . 10. Designing Foods, Manipulating Foods to Promote Health, inform,4:4, 344-369 (1993) . 11. Drake, F.H., Hofmann. G.A., Mong., S.-M., Bartus, J.O., Hertzberg, R.P., Johnson,R.K., Mattern, M.R, og Mira- belli, C.K., ln vitro and intercellular Inhibition of Topoisomerase II by the Antitumor Agent Membranone, Cancer Resarch, 49, 2578-2583 (1989).12. Engels j.m.m. , Genetic Resources of Cacao: A Catalogue of the CATIE Collection, Tech. Bull. 7, Turrialba, Costa Rica (1981). 13. Enriquez G.A. og Soria J.V., Cocoa Cultivars Register IICA, Turrialba, Costa Rica (1967). 14. Ferreira, D., Steynberg, J.P., Roux, D.G. og Brandt, E.V., Diversity of Structure and Function in Oligomeric Flavanoids, Tetrahedron, 48:10, 1743-1803 (1992). 15. Fasen, M. og Pommier, Y., Mammalian Topoisomerase II Activity is Modulated by the DNA Minor Groove Binder -Distainycin in Simian Virus 40 DNA, Biol. Chem., z64, 11354-11359 (1989) .16. Fry, D.W., Boritzki, T.J., Besserer, J.A., og Jackson,R.C., In vitro Strand Scission and inhibition of Nucleic Acid Synthesis on L1210 Leukemia Cells by a New Class of DNA Complexes, the anthra [l, 9-CD]pyrazol-6-(2H)-ones (anthrapyrazoles), Biochem. Pharmacol., 34, 3499-3508 (1985). 17.Heiang, Y.-H., Jiang, J.B., og Liu, L.F., Topoisomerase II Mediated DNA Cleavage by Amonafide and Its Structu-ral Analogs, Mol. Pharmacol., 36, 371-376 (1989). 16. Jalal, M.A.F. og Collin, H.A., Polyphenols of Mature Plant, Seedling and Tissue Cultures of Theobroma Cacoa, Phytochemistry, 6, 1377-1380 (1978). 19. Jeggo, P.A., Caldecott, K., Pidsley, S., og Banks, G.R., Sensitivity of Chinese Hamster Ovary Mutants Defective in DNA Double Strand Break Repair to Topoisomerase II Inhibitors, Cancer Res., 49:7057 (1989). 20. Kashiwada, Y., Nonaka, G.-I., Nishioka, I., Lee,K.J.-H., Bori, I., Fukushima, Y., Bastow, K.F., og Lee, K.-H., Tannin as Potent Inhibitors of DNA Topoisomerase II in vitro, J. Pharm. Sei., 82:5, 487-492 (1993). 21. Kato, R., Nakadate, T., Yamamoto, S. og Sugimura, T., inhibition of i2-o-tetradecanoylphorbol-l3-acetate Induced Tumor Promotion and Ornithine Decarboxylase Activity by Quercitin: Possible Involvement of Lipoxy-genase Inhibition, Carcinogenesis, 4, 1301-1305 (1983) . 22. Kawada, S.-Z., Yamashita, Y., Fujii, N. og Nakano, H., lnduction of Heat Stable Topoisomerase II-DNA Cleavable Complex by Nonintercalative Terpentecin and Clerocidin, Cancer Research, 51, 2922-2929 (1981). 23. Kemp, L.M., Sedgwick, S.G. og Jeggo, P.A., X-ray Sensitive Mutants of Chinese Hamster Ovary Cells Defective in Double Strand Break Rejoining, Mutat. Res., 13Z:189

(1984) . 24. Kikkoman Corporation, Antimutagenic Agent Containing Proanthocyanidin Oligomer Preferably Håving Flavan-3-Ol-Diol Structure, JP 04190774-A, 7. juli, 1992. 25. Lehrian, D.W.; Patterson, G.R. In Biotechnology; Reed, G., Ed.; Verlag Chemie: Weinheim, 1983, bd. 5, kap. 12. 26. Leonessa, F., Jacobson, M., Boyle, B., Lippman. J., McGarvey, M.; and Clarke, R. Effect of Tamoxifen on the Multidrug-Resistant Phenotype in Human Breast Cencer Cells: Isobolograms, Drug Accumulation, and M5170,000 Glycoprotein (gp 170) Binding Studies, Cancer Research, 54, 441-447 (1994) . 27. Liu, L.F., DNA Topoisomerase Poisons as Antitumor Drugs, Ann. Rev. Biochem., 58, 351-375 (1989). 28. McCord, J.D. og Kilara A. Control of Enzymatic Browning in Processed Mushrooms (Agaricus bisporus). J. Food Sei., 4B:1479 (1983) . 29. Miller, K.G., Liu, L.F. og Englund, P.A., Homogenous Type II DNA Topoisomerase from Hela Cell Nuclei, J. Biol. Chem., 256:9334 (1981). 30. Mosmann, T., Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytoxicity Assays, J. Immunol. Methods, 65, 55 (1983). 31. Muller, M.T., Helal, K., Soisson, S. og Spitzer, J.R., A Rapid and Quantitative Microtiter Assay for Eukaryo-tic Topoisomerase li, Nuc. Acid Res.,17:9499 (1989). 32. Nawata, H., Chong, M.T., Bronzert, D. og Lippman, M.E. Estradiol-Independent growth of a Subline of MCF-7 Human Breast Cancer Cells in Culture, J. Biol. Chem., 256:13, 6895-6902 (1981) . 33. Okuda, T., Yoshida, T. og Hatano, T., Molecular Struc-tures and Pharmacological Activities of Polyphenols - Oligomeric Hydrolyzable Tannins and Others - Presented at theXVI<th>International Conference of the Groups Polyphenols, Lisboa, Portugal, 13.-16. juli, 1992. 34. Phenolic Compounds in Foods and Their Effeets on Health II. Antioxidants & Cancer Prevention, Huang, M.-T., Ho, C-T., og Lea, CY. editors, ACS Symposium Series 507, American Chemical Society, Washington, D.C (1992). 35. Phenolic Compounds in Foods and TheirEffeets on Health I, Analysis, Occurrence&Chemistry, Ho, C-T., Lee, C.Y, og Huang, M.-T, editors, ACS Symposium Series 506, American Chemical Society, Washington, D.C. (1992) . 36. Porter, L.J., Ma, Z. og Chan, B.G., Cocoa Procyanidins: Major Flavanoids and Identification of Some Minor Meta-bolites, Phytochemistry, 30, 1657-1663 (1991). 37. Revilla, E., Bourzeix, M. og Alonso, E., Analysis o£ Catechine and Procyanidins in Grape Seeds by HPLC with Photodiode Array Detection, Chromatographia, 31, 465-468 (1991) . 38. Scudiero, D.A., Shoemaker, R.H , Pauli, K.D., Monks, A. Tierney, S., Nofziger, T.H., Currens, M.J., Seniff, D., og Boyd, M.R. Evaluation of a Soluble Tetrazolium/For-mazan Assay for Cell Growth and Drug Sensitivity in Culture Using Human and Other Tumor Cell Lines, Canur Research, 48, 4827-4833 (1988). 39. Seif, R., Eaglas, J., Galletti, G.C., Mueller-Harvey, I., Hartley, R.D., Lee, A.G.H., Magnolato, D., Richli, U., Gujur, R. og Haslam, E., Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry of Polyphenols (syn. Vegetable Tannins), Biomed. Environ. Mass Spee. 13, 449-468 (1986). 40. Tanabe, K., Ikegami, Y., Ishda, R. og Andoh, T , Inhibition of Topoisomerase II by Antitumor Agents bis-(2,6-dioxopiperazine) Derivatives, Cancer Research, 51, 4903-4908 (1991) .41. Van Oosten, C.W., Poot, C. og A.C. Hensen, The Preci-sion of the Swift Stability Test, Fette, Seifen, An-strichmittel, 83:4, 133-135 (1981).42. Wang, J.C., DNA Topoisomerases, Ann. Rev. Biochem., 54, 665-697 (1985). 43. Warters, R.L., Lyons, B.W., Li, T.M. og Chen. D.J., Topoisomerase II Activity in a DNA Double-Strand Break Repair Deficient Chinese Hamster Ovary Cell Line, Mu-tant. Res., 254:167 (1991).44. Yamashita, Y., Kawada, S.-Z. og Nakano, H., Induction of Mammalian Topoisomerase II Dependent DNA cleavage byNonintercalative Flavanoids, Genistein and Orbol., Biochem. Pharm., 39:4, 737-744(1990) 45. Yamashita, Y., Kawakada, S.-Z., Fujii, N. og Nakano, H., Induction of Mammalian DNA Topoisomerase I and II Mediated DNA Cleavage by Saintopin, a New Antitumor Agent from Fungus, Bioc, 30, 5838-5845 (1991).

Claims (26)

1. Hovedsakelig ren kakao-ekstrakt, karakterisert ved at den omfatter kakao-polyfenol(er).

2. Ekstrakten ifølge krav l, karakterisert ved at den er fremstilt ved en prosess omfattende: reduksjon av kakaobønner til pulver, avfetting av pulveret, og ekstrahering og rensing av kakao-polyfenolene fra pulveret.

3. Ekstrakt ifølge krav 2, karakterisert ved at prosessen for redusering av kakaobønnene til pulver omfatter: frysetørking av bønner og fruktkjøtt, fjerning av fruktkjøtt fra den frysetørkede masse, skallfjerning fra de frysetørkede kakaobønnene, og maling av de skallfrie bønnene.

4 . E kstrakt ifølge hvilket som helst av kravene2 eller 3, karakterisert ved at prosessen ytterligere omfatter rensing av ekstrakten ved gelfiltreringskromatografi og/eller ved preparativ høy-ytelse vaeskekromatografi (HPLC).

5. Ekstrakt ifølge krav 4, karakterisert ved at den inneholder polyfenoler fra minst ett kakao-procyanidin valgt fra gruppen omfattende: (-)-epikatechin, procyanidin B-2, procyanidin-oligomerer 4 til 12, procyanidin B-5, procyanidin A-2 og procyanidin C-l.

6 . Antineoplastisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetisk(e) kakao-polyfenol(er) og en passende bærer.

7. Antineoplastisk sammensetning ifølge krav 6, karakterisert ved at den omfatter hovedsakelig ren kakao-ekstrakt inneholdende kakao-procyanidin(er).

8. Antineoplastisk sammensetning ifølge krav 7, karakterisert ved at kakao-procyanidin(ene) blir fremstilt ved en prosess omfattende: redusering av kakaobønner til pulver, avfetting av pulveret, og ekstrahering av kakao-procyanidin(er) fra pulveret.

9 . Antineoplastisk sammensetning ifølge krav 8, karakterisert ved at prosessen ved redusering av kakaobønner til pulver omfatter: frysetørking av bønner og fruktkjøtt, fjerning av fruktkjøtt fra den frysetørkede masse, skallfjerning fra de frysetørkede kakaobønner, og maling av de skallfrie bønner.

10. Antineoplastisk sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 8 eller 9, karakterisert ved at prosessen ytterligere omfatter rensing av ekstrakten ved gelfiltreringskromatografi og/eller preparativ høy-ytelses-væskekromatografi (HPLC).

Antineoplastisk sammensetning ifølge krav 10, k a r a k- terisert ved at den inneholder polyfenoler av minst ett kakao-procyanidin valgt fra gruppen omfattende: (-)-epikatechin, procyanidin B-2, procyanidin-oligomerer 4 til1 2, procyanidin B-5, procyanidin A-2 og procyanidin C-l.

12. Fremgangsmåte for behandling av en pasient som trenger behandling med et antineoplastisk middel, karakterisert ved at den omfatter administrering til pasienten av en antineoplastisk sammensetning omfattende en effektiv mengde av hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetiske kakao-polyfenoler, og en passende bærer.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at det antineoplastiske middel er omfattet av hovedsakelig ren kakao-ekstrakt inneholdende kakao-procyanidiner.

14 . Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at kakao-procyanidinene blir fremstilt ved en fremgangsmåte som omfatter: reduksjon av kakaobønner til pulver, avfetting av pulveret, og ekstrahering av kakao-procyanidiner fra pulveret.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at prosessen for redusering av kakao-belger til pulver omfatter: frysetørking av bønner og fruktkjøtt, fjerning av fruktkjøtt fra den frysetørkede masse, skallfjeming fra de frysetørkede kakaobønner, og maling av de skallfrie bønner.

16 . Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene14 eller 15, karakterisert ved at prosessen ytterligere omfatter rensing av ekstrakten ved gelfiltreringskromatografi og/eller ved preparativ høy-ytelsesvæske-kromatografi (HPLC).

17. F remgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at ekstrakten inneholder polyfenoler av minst ett kakao-procyanidin valgt fra gruppen omfattende: (-)-epikatechin, procyanidin B-2, procyanidin-oligomerer 4 til 12, procyanidin B-5, procyanidin A-2 og procyanidin C-l.

18. Sett for behandling av en pasient som trenger behandling med et antineoplastisk middel, karakterisert ved at det omfatter en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetisk kakao-polyfenoler og en passende bærer.

19 . Sett ifølge krav 18, karakterisert ved at det antineoplastiske midlet er omfattet av en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt inneholdende procyanidiner; og at settet omfatter instruksjoner for blanding av ingrediensene og/ eller administrasjon til pasienten.

20. Lyofilisert antineoplastisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt eller syntetiske kakao-polyfenoler. .

21. Lyofilisert antineoplastisk sammensetning ifølge krav 20, karakterisert ved at sammensetningen er omfattet av en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt inneholdende kakao-procyanidin(er).

22 . Antioksydant eller konserverende sammensetning, karakterisert ved at den omfatter hovedsakelig ren kakao-ekstrakt ifølge krav l eller syntetiske kakao-polyfenoler.

23. Topoisomerase-hemmende sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en hovedsakelig ren kakao-ekstrakt ifølge krav l eller syntetiske kakao-polyfenoler

24. Fremgangsmåte for konservering eller beskyttelse fra oksyde-ring av et ønsket emne, karakterisert ved at det omfatter å bringe i kontakt emnet med en sammensetning ifølge krav 22.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at emnet er et næringsmiddel.

26 . Fremgangsmåte for hemming av topoisomerase, karakterisert ved at den omfatter å bringe i kontakt topoisomerase med en sammensetning ifølge krav 23.