JPH10506902A - 抗原を発現する組み換えウイルスと免疫刺激分子を発現する組み換えウイルスとを含む組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、病因物質に対する抗原をコードする遺伝子をゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルスと、病因物質に対する免疫応答を刺激する目的のための免疫分子をコードする遺伝子をゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルスとの組成物である。癌または病原性微生物によって引き起こる疾患などの疾患の治療方法が、上記組成物を使用することによって提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 抗原を発現する組み換えウイルスと 免疫刺激分子を発現する組み換えウイルスとを含む組成物 発明の分野 本発明は病原性疾患及び癌の予防と治療のための組換えウイルスベクターワク チンの組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は抗原（単数又は複数）をコー ドする遺伝子を含む組換えウイルスベクターと、免疫刺激性分子（単数又は複数 ）をコードする遺伝子（単数又は複数）を含む組換えウイルスベクターとの組成 物に関する。これらの遺伝子は１つの組換えベクターに又は別々のウイルスベク ターに挿入されることができる。本発明の他の態様は、免疫刺激性遺伝子（単数 又は複数）を含有する組換えウイルスによるｉｎ ｓｉｔｕ若しくはインビトロ における疾患細胞の感染及び感染した細胞の宿主中への再導入によって、哺乳動 物における疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する免疫応答を強化することであ る。 発明の背景 癌患者における活性免疫反応を刺激する現在までの試みは“非特異的”（即ち 、ＢＣＧの使用）又は“特異的”（即ち、腫瘍細胞、腫瘍細胞抽出物、細胞培養 上澄み液からの抗原混合物又は腫瘍細胞の溶解産物（oncolysate）の使用）とし て分類することができる。これらの努力の殆どが転移性黒色腫を有する患者にお いて続けられている。組換えワクチンの開発は、免疫原又は免疫刺激性分子の特 異的な、規定された遺伝子産物又はエピトープの使用を含む。後者のアプローチ が特定の患者からの細胞を用いて、これらの細胞に例えばＢ７．１、Ｂ７．２、 ＩＬ−２又はＧＭ−ＣＳＦのような免疫刺激性分子の遺伝子を現場で挿入するか 又は培養した細胞を患者に再び投与することを必要とするという点で、組換えワ クチンは“遺伝子療法”にも用いることができる。 組換えワクチンは多くの形態をとることができる。例えばバキュロウイルス（ 昆虫ベクター）のようなベクターによって又は真核細胞におけるように、組換 えタンパク質を合成することができる。合成ペプチドが免疫原として役立つこと ができる。９〜数ダースのアミノ酸から成るペプチドワクチンは２種類の形態を とることができる。これらはアジュバントと混合するか又は患者に再注入するた めの抗原提示細胞(antigen presenting cell)（ＡＰＣ）として末梢血管細胞を パルスする(pulse)ために用いることができる。特定腫瘍関連抗原をコードする 遺伝子をベクターに挿入することによっても、組換えワクチンを構築することが できる。用いられる共通ベクター（common vector）の一部はワクシニアウイル ス、例えば鶏痘又はカナリヤ痘（ポックス）のようなトリポックス（avian pox ）ウイルス、ＢＣＧ、アデノウイルス及びサルモネラ(Salmonella)である。これ らのベクターは、各々がそれらの利点と欠点を有するが、それらの構成タンパク 質の免疫原性のために通常用いられ、挿入された遺伝子のタンパク質又はエピト ープをより大きく免疫原性にする。組換えワクチンは、特定腫瘍関連抗原に対し て産生されるモノクローナル抗体に向けられる抗イディオタイプ抗体の形態をと ることもできる。最も最近では、プロモーター遺伝子を含有するプラスミド中の 腫瘍関連遺伝子のネーキッド(naked)ＤＮＡから成るポリヌクレオチドワクチン が製造されている。上記の全ては動物モデルにおいて分析されているが、１つの アプローチの他のアプローチに対する相対的効率を調べた研究は殆どない。臨床 試験は現在これらのアプローチの幾つかを胸部癌及び他の癌患者に用い始めてお り、他の臨床試験も近い将来開始する見込みが大きい。 現在、癌治療用の組換えワクチンに用いられうると見なされている幾つかの抗 原が存在する。これらの最初の抗原は、胸部腫瘍の約２０〜３０％に過度に発現 することが判明しているｃ−ｅｒｂＢ／２癌遺伝子である（Ｐｉｅｔｒａｓ Ｒ Ｊ等，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：１８２９〜１８３８，１９９４）。ラットにおけ る点突然変異したｃ−ｅｒｂＢ／２癌遺伝子が、ワクシニアウイルスに挿入され たときに、免疫原性になり、抗腫瘍効果を生じることができることが判明してい る（Ｂｅｒｎａｒｄｓ Ｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：６８５４〜６８５８，１９８７）。しかし、ヒトｃ−ｅｒｂＢ／２は突 然変異させられない。この遺伝子が、インビトロでヒトＴ細胞反応を生じるよう に思われる幾つかのエピトープを含有することが最近判明している（Ｄｉｓｉｓ ＭＬ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：１０７１〜１０７６，１９９４）。や はり多くのヒト胸部腫瘍中に見い出される点突然変異したｐ５３癌遺伝子は細胞 毒性Ｔ細胞の可能な標的であることが判明している（Ｙａｎｕｃｋ，Ｍ等，Ｃａ ｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５３：３２５７〜３２６１，１９９３）。特異的な点突然変 異を示すペプチドがヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）によってパルスされて、患者 に再投与される臨床研究も現在開始されている。胸部癌ムチン，ＭＵＣ−１又は ＤＦ３は胸部の分化抗原(differentiation antigen)を表す（Ａｂｅ Ｍ．とＫ ｕｆｅ Ｄ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８２ 〜２８６，１９９３）。ＭＵＣ−１はある種類の正常上皮組織中に発現されるが 、これは胸部癌組織中では特有にグリコシル化されるように思われる。ＭＵＣ− １ムチンのコアタンパク質のタンデム反復（tandem repeat）は、胸部癌患者の リンパ節が非ＭＨＣ制限的にＭＵＣ−１ペプチドによって活性化されうるＴ細胞 を含有すると言う点で、ヒトにおいて免疫原性であると報告されている（Ｂａｒ ｎｄ ＤＬ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７１５ ９〜７１６３，１９８９）。卵巣癌患者がこの領域に対して抗体反応を示すこと ができることも判明している（Ｒｕｇｈｅｔｔｉ Ａ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ．５３：２４５７〜２４５９，１９９３）。ＭＵＣ−１遺伝子がワクシニアウイ ルスに挿入されている動物モデルが報告されている（Ｈａｒｅｕｖｅｎｉ Ｍ等 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９４９８〜９５０２ ，１９９０；Ｈａｒｅｕｖｅｎｉ等，Ｖａｃｃｉｎｅ，９：６１８〜６２６，１ ９９１）。ＭＵＣ−１ペプチドがヒトＰＢＬによってパルスされる臨床試験は現 在、胸部癌患者において行われている。癌療法の可能な標的を表す他のムチンは 、ヒト胸部癌患者の約７０〜８０％に見い出されるＴＡＧ−７２である（Ｔｈｏ ｒ Ａ等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４６：３１１８〜３１２４，１９８６）。 癌抗原に対する有効な免疫感作の大抵の試みは全腫瘍細胞又は腫瘍細胞フラグ メントを含んでいるが、悪性細胞を正常細胞から区別する特有の腫瘍抗原に対し て特異的に免疫感作することが最も望ましい。Ｔリンパ球によって認識される腫 瘍関連抗原の分子性質は充分に理解されていない。エピトープ又は完全(intact) タンパク質を認識する抗体とは対照的に、Ｔ細胞は細胞表面のクラスＩ又はＩＩ 主要組織適合（ＭＨＣ）分子上に存在する短鎖ペプチドフラグメント（８〜１８ アミノ酸）を認識し、このようにして腫瘍関連抗原は提示され、Ｔ細胞によって 認識されると思われる。 ＨＬＡ−Ａ２クラスＩ分子に関連してＴＩＬによって認識される黒色腫の腫瘍 抗原をコードする幾つかの遺伝子が同定されている（Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．等 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５〜３５１９ ，１９９４；Ｋａｗａｋａｍｉ，Ｙ．等，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２ ４〜３１２６，１９９４）。 ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）も、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、胸部癌及び非ス モール(non-small)細胞癌を包含する、ある範囲のヒト癌の免疫療法の可能な標 的分子を表す（Ｒｏｂｂｉｎｓ ＰＦ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５３：８ ９２〜８９７，１９９３；Ｅｓｔｅｂａｎ ＪＭ等，Ｃａｎｃｅｒ ７４：１５ ７５〜１５８３，１９９４）。実験研究は、抗−ＣＥＡモノクローナル抗体に対 する抗イディオタイプ抗体がマウスにおいて免疫応答を誘出することができるこ とを実証している（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ−Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｍ．等 ，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏ．７：２８９〜３０２，１９９１）。この抗イ ディオタイプ抗体を用いる臨床研究は現在進行中である。ＣＥＡ遺伝子がワクシ ニアウイルス中に挿入されている組換えワクチンも開発されている（Ｋａｎｔｏ ｒ Ｊ．等，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８４：１０８４〜１０９ １，１９９２）。このワクチンを含むフェイズＩ臨床試験は丁度完成されたとこ ろである。 特有の腫瘍抗原を表す免疫優生ペプチドの同定は癌に対する免疫感作の新しい 可能性を開示している。免疫優生ウイルスペプチドによる免疫感作がウイルス感 染に対する保護を与えることができるウイルス特異的ＣＴＬを誘導することがで きることの実質的な証拠が動物モデルに存在する。純粋なペプチドのみではＴ細 胞応答を刺激するのに効果がないが、アジュバント中に乳化した又は脂質と複合 体化した(complexed)ペプチドが新しいウイルスによるチャレンジに対してマウ スをプライミングする(priming)ことが実証されており、このようなペプチドが 、致死的なウイルス接種物からマウスを保護するウイルス特異的ＣＴＬを誘導す る ことができる（Ｋａｓｔ，Ｗ．Ｍ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．ＵＳＡ ，８８：２２８３〜２２８７，１９９１；Ｄｅｒｅｓ，Ｋ等，Ｎａｔｕ ｒｅ ，３４２：５６１〜５６４，１９８９；Ｇａｏ，Ｘ．Ｍ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕ ｎｏｌ ．１４７：３２６８〜３２７３，１９９１；Ａｉｃｈｅｌｅ，．Ｐ．Ｊ． Ｅｘｐ．Ｍｅｄ ．１７１：１８１５〜１８２０，１９９０；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｄ ．Ｓ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３３３６〜３３４１，１９９２）。Ｌ ｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ペプチドエピトープによって被覆 された脾臓細胞に対するマウスの免疫感作も、培養中にエキスパンドされ(expan ded)うるＬｉｓｔｅｒｉａ特異的ＣＴＬの形成を生じる。これらのＣＴＬの養子 移入もマウスを致死的細胞チャレンジから保護することができる（Ｈａｒｔｙ， Ｊ．Ｔ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１５３１〜１５３８，１９９２）。 完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント中で乳化されたＨＩＶｇｐ１２０とｇｐ１６０の 抗原エピトープを表すペプチドも特異的ＣＴＬ応答をプライミングすることがで きる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ，８５：３１０５〜３１０９，１９８８；Ｈａｒｔ，Ｍ．Ｋ．等，Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ，８８：９４４８〜９４５２，１９９ １）。 アジュバント中の又は脂質と複合体化したペプチドによる免疫感作はマウスに おけるＴ細胞応答を生じるが、この反応は一次脾臓細胞にＴ反応性細胞を誘導す るほど強力であることは稀である。感作リンパ球の検出は殆ど常に二次インビト ロ刺激を必要とする。 Ｂ７遺伝子ファミリーの発現はマウスとヒトの両方における抗腫瘍応答の重要 な機構であることが実証されている。少なくとも２種類のシグナルが抗原担持標 的細胞による未使用（naive）Ｔ細胞の活性化のために必要であることが現在明 らかになりつつある：Ｔ細胞受容体から供給される抗原特異的シグナルと、リン ホカイン産物を生じる抗原独立性又は同時刺激性シグナル（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ，Ｋ．Ｅ．等，Ａｎｎａｌｓ ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２２５〜２３ ０，１９９３）。２種類の重要な同時刺激性分子は、Ｔ細胞表面抗原ＣＤ２８と ＣＴＬＡ４のリガンドであるＢ７−１（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｈ．Ｃｅｌｌ， ７１：１０６５〜１０６８，１９９２；Ｃｈｅｎ，Ｌ．等，Ｃｅｌｌ，７１：１ ０９ ３〜１１０２，１９９２；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４３：２７１４〜２７２２，１９８９；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｅ ｘｐ．Ｍｅｄ ．１７４：６２５〜６３１，１９９１）と、ＣＴＬＡ４の代替リガ ンドであるＢ７−２（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２： ８１３〜９６０，１９９３）とである。現在までに、ネズミＢ７−１とＢ７−２ （Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５〜６３１ ，１９９１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：８１３〜 ９６０，１９９５）とヒトＢ７−１とＢ７−２の両方が述べられている（Ｆｒｅ ｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４〜２７２２，１ ９８９；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６２：９０９〜９１ １，１９９３）。Ｂ７−１とＢ７−２によって与えられる同時刺激性シグナルが Ｔ細胞活性化の機能的に異質の機構であるか又は余分な(redundant)機構である のかはこの時点では不明である（Ｈａｔｈｃｏｃｋ，Ｋ．Ｓ．等，Ｊ．Ｅｘｐ． Ｍｅｄ ．１８０：６３１〜６４０，１９９４）。ネズミとヒトの大抵の腫瘍はＢ ７−１又はＢ７−２を発現せず、このことは、腫瘍が可能な拒絶抗原(rejection antigen)を発現する場合にも、抗腫瘍Ｔ細胞応答を活性化する見込みがないこ とを意味する。（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．等，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ ．６９０：２２５〜２３０，１９９３；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ ．等，Ａｎｎａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６９０：２４〜３１，１９９ ３）。実際に、１種類のみのシグナルがＴ細胞によって受容されることに起因し てアネルギーが生じる可能性がある（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｋ．Ｅ．等，Ａｎｎ ａｌｓ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ．６９０：２２５〜２３０，１９９３）。黒 色腫細胞中へのＢ７のトランスフェクションはインビボにおいてネズミ黒色腫の 拒絶を誘導することが判明した（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．Ｅ．等，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ ，２５９：３６８〜３７０，１９９３）。 ワクシニアウイルスはヒトに広範囲に用いられており、天然痘に対するワクチ ンに基づくワクシナ（vaccina）の使用はこの疾患の世界的な規模の根絶を生じ ている（参考文献のＭｏｓｓ，Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６６２〜１６６ ７，１９９１において調査）。ワクシニアウイルスは低コスト、熱安定性及び簡 単な投与方法と言う利点を有する。他の疾患の予防のためにワクシニアウイルス ベクターを開発しようと試みられている。 ワクシニアウイルスは細胞質ＤＮＡウイルスのポックス（pox）ウイルスファ ミリーの要素である。ＤＮＡ組換えはポックスウイルスの複製中に生じ、ＤＮＡ をウイルスゲノムに挿入するために用いられている。組換えワクシニアウイルス 発現ベクターは広範囲で述べられている。これらのベクターは多様な外来遺伝子 産物に対して細胞免疫性を与えることができ、幾つかの動物モデルにおいて感染 性疾患を予防することができる。組換えワクシニアウイルスは発現ベクターはヒ トの臨床試験にも同様に用いられている。Ｃｏｏｎｅｙ等は３５人の健康なＨＩ Ｖ血清陰性男性にＨＩＶのｇｐ１６０エンベロープ遺伝子を発現する組換えワク シニアウイルスによって免疫感作した（Ｃｏｏｎｅｙ，Ｅ．，Ｔｈｅ Ｌａｎｃ ｅｔ ３３７：５６７〜５７２，１９９１）。Ｇｒａｈａｍ等はｇｐ１６０ＨＩ Ｖエンブロープタンパク質を含有する組換えワクシニアウイルス又は対照ワクシ ニアウイルスのいずれかを受容するように３６人の被験者を無作為に選別した（ Ｇｒａｈａｍ，Ｂ．Ｓ．等，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１６６：２４４〜２５ ２，１９９２）。組換えワクシニアウイルスを用いたフェイズＩ研究が転移性黒 色腫を有する患者においてｐ９７黒色腫抗原を発現する組換えウイルスを用いて 開始されていて（Ｅｓｔｉｎ，Ｃ．Ｄ．等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ ｃｉ． ８５：１０５２〜１０５６，１９８８）、進行した胸部癌、肺癌又は結腸 直腸癌を有する患者におけるヒト癌胎児性抗原を発現する組換えワクシニアウイ ルスを用いるフェイズＩ試験は丁度完了したところである。これらの試験におい て、ワクシニアウイルスは皮内乱刺法によって投与され、局所皮膚刺激状態、リ ンパ節症及び一過性インフルエンザ様症状を含めた副作用は最小であった。 鶏痘及びカナリヤ痘（ポックス）はポックスウイルスファミリー（トリポック スウイルス遺伝子）の要素である。これらのウイルスはトリ細胞においてのみ複 製することができ、ヒト細胞では複製することができない。これらは、宿主ゲノ ムに結合しない細胞質ウイルスであるが、真核細胞において多数の組換え遺伝子 を発現することができる。 狂犬病糖タンパク質を発現する組換えトリポックスウイルスはマウス、ネコ及 びイヌを生狂犬病ウイルスチャレンジから保護するのに用いられている。鶏と七 面鳥のインフルエンザＨＡ抗原を発現する組換えトリポックスによる免疫感作は 、インフルエンザウイルスによる致死的なチャレンジから保護した（Ｔａｙｌｏ ｒ等，Ｖａｃｃｉｎｅ，６：５０４〜５０８，１９８８）。カナリヤポックス被 験者は１０^5.5感染単位までの用量を受容した（Ｃａｄｏｚ Ｍ．，Ｔｈｅ Ｌ ａｎｃｅｔ，３３９：１４２９〜１４３２，１９９２）。ＮＩＡＩＤによって支 持された最近の試験（プロトコール０１２Ａ：ＨＩＶ−１非感染成人における生 組換えカナリヤポックス−ｇｐ１６０ＭＮ（ＡＬＶＡＣ ＶＣＰ１２５ ＨＩＶ −１ｇｐ１６０ＭＮＯ）のフェイズＩ安全性及び免疫原性試験）では、患者はＨ ＩＶｇｐ１６０遺伝子を含有する組換えカナリヤポックスウイルスを筋肉内注射 によって１０^5・5ｐｆｕまでの用量で受容して、殆ど又は全く中毒を示さなかっ た（個人的な通信，Ｐ．Ｆａｓｔ．ＮＩＡＩＤ）。。 このように、トリポックスウイルスは体液免疫と細胞免疫の両方を刺激するこ とができ、高い抗体価（１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ）で経済的に製造されることができ 、しかもヒト細胞を生産的に感染させることができず、それらの使用の安全性を かなり高めるので、トリポックスウイルスは免疫感作のために魅力的なビヒクル である。 トリポックスウイルスの他のかなりの利点は、ワクシニアウイルスとの交差反 応性が殆ど又は全くなく、したがって、予めワクチン接種されたヒトが鶏痘ウイ ルスタンパク質に対して既存の免疫反応性を有さないことである。 発明の概要 本発明は病原性疾患及び癌の予防と治療のための組換えウイルスベクターワク チンの組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は抗原（単数又は複数）をコー ドする遺伝子を含む組換えウイルスベクターと、免疫刺激性分子（単数又は複数 ）をコードする遺伝子（単数又は複数）を含む組換えウイルスベクターとの組成 物に関する。これらの遺伝子は１つの組換えベクターに又は別々のウイルスベク ターに挿入されることができる。本発明の他の態様は、免疫刺激性遺伝子（単数 又は複数）を含有する組換えウイルスによるin situ若しくはインビトロにおけ る 疾患細胞の感染及び感染した細胞の宿主中への再導入によって、哺乳動物におけ る疾患細胞（例えば、腫瘍細胞）に対する免疫応答を強化することである。 図面の簡単な説明 本発明の上記その他の目的、特徴及び幾つかの付随的な利点は、発明の詳細な 説明を読んで、検討するならばさらに良好に理解されるであろう。 図１Ａ−ＩＤはｒＶ−Ｂ７タンパク質を発現するＢＳＣ−１細胞の蛍光分析を 示す。ＢＳＣ−１細胞は、Ｂ７−１又はＢ７−２表面タンパク質に関して、感染 前に（図１Ａ）、１０ＭＯＩ Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（図１Ｂ）、ｒＶ−Ｂ７−１（図 １Ｃ）又はｒＶ−Ｂ７−２（図１Ｄ）による感染後に染色した。図１Ａと１Ｂは 正常ＢＳＣ−１細胞又はｒＶ−Ｂ７−１とｒＶ−Ｂ７−２との構築に用いた親ワ クシニア菌株によって感染させた細胞のＢ７染色を典型的に示すが、図１Ｃと１ ＤはｒＶ−Ｂ７−１とｒＶ−Ｂ７−２による感染後の組換えＢ７タンパク質の強 い発現を、これらの分子に特異的なモノクローナル抗体をそれぞれ用いて説明す る。 図２Ａ−２ＤはｒＶ−Ｂ７タンパク質を発現する移植されたマウス腺癌の成長 を示す。１群あたり５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに、感染させない（図２Ａ）、 ０．２５ＭＯＩ Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（図２Ｂ）、ｒＶ−Ｂ７−１（図２Ｃ）又はｒ Ｖ−Ｂ７−２（図２Ｄ）によって感染させた３×１０⁵ＭＣ３８細胞を注入した 。図２Ａと２ＢはＭＣ３８細胞の正常な成長速度を示し、図２Ｃと２Ｄは組換え Ｂ７タンパク質を発現するＭＣ３８細胞の成長速度を示す。腫瘍は２種類のサイ ズで測定された。これらの実験をさらに３回繰り返して、同様な結果を得た。* 動物は腹腔内腫瘍を増殖させたが、これは測定することができなかった。 図３Ａ−３Ｄ。図３Ａは未使用Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける非感染ＭＣ３８ 腫瘍の成長を示す。図３ＢはｒＶ−Ｂ７−１で予め感染させたＭＣ３８細胞を予 め投与され（４０日目）、３ｘ１０⁵ＭＣ３８細胞によってチャレンジされたＭ Ｃ３８腫瘍の成長を示す。図３ＣはｒＶ−Ｂ７−２で感染させたＭＣ３８細胞を 予め投与され（４０日目）、３ｘ１０⁵ＭＣ３８細胞によってチャレンジされた ＭＣ３８腫瘍の成長を示す。 図４は、ヒト癌胎児性抗原遺伝子（ｒＶ−ＣＥＡ）、ネズミＢ７−２（ｒＶ− Ｂ７）、又はワクシニアウイルスの野生型菌株（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ）の遺伝子をコ ードする組換えワクシニアウイルスで免疫感作された５ Ｃ５７ＢＬ／６マウス の各処置群を示す。各マウスには、下記比：１：１ｒＶ−ＣＥＡ／ｒＶ−Ｂ７（ ５ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋５ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；１：１Ｖ−Ｗｙ ｅｔｈ／ｒＶ−Ｂ７（５ｘ１０⁶ＰＦＵＶ-Ｗｙｅｔｈ＋５ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ− Ｂ７）；又は１：１ｒＶ−ＣＥＡ／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（５ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ−Ｃ ＥＡ＋５ｘ１０⁶ＰＦＵＶ−Ｗｙｅｔｈ）での尾乱刺法によって１ｘ１０⁷プラー ク形成単位を投与した。免疫感作後１４日目に各処置群から３個を脾臓摘出し、 プールし、標準５日リンパ球増殖分析(standard 5 day lymphoproliferative as say)を既述されたように実施した（Ｋａｎｔｏｒ等，ＪＮＣＩ，８４：１０８４ ，１９９２）。精製Ｔ細胞をそれらの増殖能力に関して１００μｇ／ｍｌのバキ ュロウイルス産生組換えＣＥＡに対して試験した。培地に対する細胞反応性（バ ックグランド）に関連して刺激指数を算出した。 図５は、ヒト癌胎児性抗原遺伝子（ｒＶ−ＣＥＡ）、ネズミＢ７−２（ｒＶ− Ｂ７）、又はワクシニアウイルスの野生型菌株（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ）の遺伝子をコ ードする組換えワクシニアウイルスで免疫感作された５ Ｃ５７ＢＬ／６マウス の各処置群を示す。各マウスには、下記比：１：３ｒＶ−ＣＥＡ／ｒＶ−Ｂ７（ ２．５ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋７．５ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；１：３ Ｖ−Ｗｙｅｔｈ／ｒＶ−Ｂ７（２．５ｘ１０⁶ＰＦＵＶ−Ｗｙｅｔｈ＋７．５ｘ １０⁶ＰＦＵｒＶ−Ｂ７）；又は１：３ｒＶ−ＣＥＡ／Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（２．５ ｘ１０⁶ＰＦＵｒＶ−ＣＥＡ＋７．５ｘ１０⁶ＰＦＵＶ-Ｗｙｅｔｈ）での尾乱刺 法によって１ｘ１０⁷プラーク形成単位を投与した。免疫感作後１４日目に３個 の脾臓を摘出し、プールし、標準５日リンパ球増殖分析を既述されたように実施 した（Ｋａｎｔｏｒ等，ＪＮＣＩ，８４：１０８４，１９９２）。精製Ｔ細胞を それらの増殖能力に関して１００μｇ／ｍｌのバキュロウイルス産生組換えＣＥ Ａに対して試験した。培地に対する細胞反応性（バックグランド）に関連して刺 激指数を算出した。 図６Ａ−６Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７とによって同時感染されたＢＳＣ −１の蛍光分析を示す。ＢＳＣ−１細胞に下記：（６Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（６ Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（６Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ ７（３：１）；又は（６Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの 比で５のＭＯＩにおいてウイルスによって同時感染させ、ＭＡｂｓ ＰＥ−Ｂ７ −１とＦＴＴＣ−ＣＯＬ−１によって染色した。ＸおよびＹ軸は、各々ＣＥＡお よびＢ７−１蛍光を示し、Ｚ軸は細胞数を示す。各座標における陽性細胞の％を 挿入パネルに示す。図６Ａは親ワクシニア菌株で感染された正常ＢＳＣ−１細胞 の染色を示す。図６Ｂと図６Ｃは単独感染中のＣＥＡ又はＢ７−１の発現を示し 、図６ＤはｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７の両方による感染後に両方の組換え分子の 同時発現を示す。 図７は、ｒＶ−ＣＥＡ及び／又はｒＶ−Ｂ７による免疫感作後の一次ＣＴＬ活 性の増強を示す。ＣＥＡに特異的な細胞毒性活性を全体で１ｘ１０⁷ＰＦＵのｒ Ｖ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１；三角形）又はｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７ （３：１；円形）による感作後１０日目に分析した。各群からの脾臓Ｔ細胞を１ ６時間細胞毒性分析においてＭＣ３８細胞（ＣＥＡ陰性；閉鎖記号）又はＭＣ３ ８−ＣＥＡ２細胞（ＣＥＡ陽性；開放記号）と共にインキュベートした。抗Ｖ− ＷｙｅｔｈＣＴＬ活性は全てのサンプルにおいて＞５０％であった。 図８Ａ−８Ｄは、ｒＶ−ＣＥＡ及びｒＶ−Ｂ７によって免疫感作されたマウス における移植されたＣＥＡ発現マウス腺癌細胞の成長を示す。１群にあたり１０ Ｃ５７ＢＬ／６マウスを（８Ａ）Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；（８Ｂ）ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ− Ｗｙｅｔｈ（３：１）；（８Ｃ）Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；又は（８ Ｄ）ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のいずれかの全体で１０⁷ＰＦＵで一 回に免疫感作し、１４日間後に３ｘ１０⁶ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２−細胞を皮下 に注射した。 図９Ａ−９Ｂは、ｒＶ−Ｂ７とｒＶ−ＣＥＡとの混合物を予め投与されたマウ スにおける抗腫瘍免疫性を示す。図９Ａは未使用Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける ＭＣ−３８−ＣＥＡ−２−腫瘍の成長を示し、予め腫瘍チャレンジを受けて生残 したマウスにおける腫瘍成長を示す（図９Ｂ）。マウスをｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ− Ｂ７（３：１）によって免疫感作し、１４日後に腫瘍によるチャレンジを 受けさせた。６０日間後に無腫瘍で留まるマウス（図８Ｄ）を反対側フランクで 再チャレンジさせた（図９Ｂ）。 図１０は、ｒＶ−ＰＳＡ及びｒＶ−Ｂ７−１による免疫感作後の一次ＣＴＬ活 性の増強を示す。ＰＳＡに特異的な細胞毒性活性を全体で１ｘ１０⁷ＰＦＵのｒ Ｖ−ＰＳＡ，ｒＶ−ＰＳＡ：ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−ＣＥＡ：ｒ−Ｂ７−１に よる感作後１０日目に分析した。各群からの脾臓Ｔ細胞を１６時間細胞毒性分析 においてＭＣ３８細胞又はＭＣ３８−ＰＳＡ細胞と共にインキュベートした。 発明の詳細な説明 本発明は、疾患原因（病因）物質（disease causing agent）又は疾患状態か らの抗原（単数又は複数）を発現する新規な組換えウイルスと、免疫刺激性分子 （単数又は複数）を発現する組換えウイルスとの組成物であり、又は同じベクタ ー組成物中に挿入された両分子をコードする遺伝子は、疾患を予防又は治療する ためにＴ依存性抗原又は抗体に対する哺乳動物における免疫応答を誘出する及び ／又はアップレギュレーティング（upregulating）することができる。本発明の 組成物は細胞仲介免疫性並びに抗体のアップレギュレーティングに特に重要であ る。 細胞仲介免疫性は癌及び病原性微生物、特に、ウイルスその他の細胞内微生物 によって惹起される疾患に耐えるために非常に重要である。本発明の組成物は疾 患状態の細胞からの抗原をコードする遺伝子をそのゲノムに又はその一部に組み 入れた第１の組換えウイルスと、１以上の免疫刺激分子をコードする１以上の遺 伝子または同じベクター中に挿入された両分子をコードする遺伝子を有する第２ の組換えウイルスとを有する。両方の組換えウイルスによって感染された宿主細 胞は、疾患原因物質からの両抗原（単数または複数）を発現し、免疫刺激性分子 （単数又は複数）を発現する。この抗原は感染宿主細胞の細胞表面に発現される ことができる。免疫刺激性分子は細胞表面に発現されるか又は宿主細胞によって 実際に分泌されることができる。 抗原と免疫刺激性分子の両方の発現は、特異的Ｔ細胞に対して必要なＭＨＣ制 限ペプチドを与え、Ｔ細胞に適当なシグナルを与えて、抗原特異性Ｔ細胞の抗原 認識、増殖又はクローンエキスパンジョン(clonal expansion)を助成する。総合 的な結果は免疫系のアップレギュレーション(upregulation)である。好ましい実 施態様では、免疫応答のアップレギュレーションは、疾患原因物質又は疾患原因 物質によって感染した細胞を殺すか又はその成長を抑制することができる抗原特 異性Ｔヘルパーリンパ球及び／又は細胞毒性リンパ球の増加である。 １実施態様では、この組成物はウイルスゲノム又はその一部及び病原性微生物 からの抗原をコードする核酸配列を含む組換えウイルスと、１種以上の免疫刺激 性分子をコードする１種以上の核酸配列をコードする組換えウイルスとを含む。 別の実施態様では、この組成物はウイルスゲノム又はその一部及び腫瘍関連抗 原をコードする核酸配列を含む組換えウイルスと、１種以上の免疫刺激性分子を コードする１種以上の核酸配列をコードする組換えウイルスとを含む。 １実施態様では、これらの組換えウイルスはサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ −６、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２）と同時刺激性及び補助的分子（Ｂ７−１、Ｂ ７−２）とを単独で又は多様な組合せで発現するように構築されている。免疫刺 激性分子とモデルＴＡＡとをウイルス複製／感染の部位（いずれにせよ、ＴＡＡ 産生部位）で同時に産生することは特異的エフェクターの発生を増強する。これ らの特異的免疫刺激性分子に依存して、種々な機構が免疫原性強化：ヘルプシグ ナル（ＩＬ−２）の増強、プロフェッショナルＡＰＣ（ＧＭ−ＣＳＦ）の補充、 ＣＴＬ頻度（ＩＬ−２）の増加、抗原プロセッシング(processing)経路及びＭＨ Ｃ発現（ＩＦＮγ及びＴＮＦα）への影響等の原因になると考えられる。少なく とも１種の免疫刺激性分子と一緒のモデル抗原の同時発現は動物モデルにおいて 抗腫瘍効果を実証するために有効である。 場合によっては、多価ワクチンを得るために問題の抗原を１種類より多く含む 組換えウイルスを形成することが有利である。例えば、組換えウイルスはウイル スゲノム又はその一部と、ＧＰ１２０（ＨＩＶから）をコードする核酸配列と、 Ｈｅｐ Ｂ表面抗原をコードする核酸配列とを含むことができる。 １実施態様では、この組成物はワクシニアウイルスゲノム又はその一部と、Ｃ ＥＡをコードする核酸配列とを含む組換えウイルスと、免疫刺激性分子、Ｂ７． １をコードする核酸配列を単独で又は免疫刺激性分子、Ｂ７．２をコードする核 酸配列と組合せて含む組換えウイルス、又は腫瘍抗原の遺伝子と免疫刺激性分子 の両方を含有する組換えウイルスとを含む。 本発明はまた、ウイルスゲノム又はその一部と、１種以上のＢ７分子をコード する１種以上の核酸配列とを含む組換えウイルス、好ましくはＢ７−１及び／又 はＢ７−２を発現する組換えワクシニアウイルスをも含む。これらの組換えウイ ルスによる腫瘍細胞の迅速な感染は、ワクシニアがこれらのタンパク質を確実に 発現することができ、機能的な分子であることを実証する。これらの組換え分子 を発現する弱免疫原性シンゲニック(syngeneic)腫瘍は免疫適格性宿主によって 拒絶される。 特定の実施態様では、組換えウイルスはＢ７．１を含有する組換えワクシニア ウイルスと、Ｂ７．２を含有する組換えワクシニアウイルスである（それぞれ、 ｒＶ−Ｂ７−１とｒＶ−Ｂ７−２と名付けられる）。 １実施態様では、この組成物はｒＶ−Ｂ７−１および／またはｒＶ−Ｂ７−２ とをｒＶ−ＣＥＡと組み合わせて含む。Ｂ８７分子は、非限定的に、Ｂ７−１、 Ｂ７−２等と、これらの類似体を包含する。Ｂ７遺伝子は非限定的に、好ましく はネズミ又はヒト供給源から、哺乳動物組織、ゲノムライブラリー又はｃＤＮＡ ライブラリーを含めた、哺乳動物供給源からクローン化されることができる。 ウイルスベクター 本発明に使用可能であるウイルスは、ゲノムの一部が欠失して、ウイルスの伝 染力を損なわずに、新しい遺伝子を導入することができるようなウイルスである 。本発明のウイルスベクターは非病原性ウイルスである。１実施態様では、ウイ ルスベクターは哺乳動物の特定の細胞タイプに対する向性を有する。他の実施態 様では、本発明のウイルスベクターは例えば樹枝状細胞及びマクロファージのよ うなプロフェッショナル抗原提示細胞を感染させることができる。本発明のさら に他の実施態様では、ウイルスベクターは哺乳動物の任意の細胞を感染させるこ とができる。ウイルスベクターは腫瘍細胞をも感染させることができる。 本発明のウイルスは非限定的に例えばワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、非 常に弱められたワクシニアウイルス（ＭＶＡ）、アデノウイルス、バキュロウイ ルス等を包含する。 ワクシニアウイルスゲノムは技術上周知である。これはＨＩＮＤ Ｆ１３Ｌ領 域と、ＴＫ領域と、ＨＡ領域とから成る。組換えワクシニアウイルスは外因性遺 伝子産物の発現のために外因性遺伝子を組み込むために当該技術分野で用いられ ている（Ｐｅｒｋｕｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：９８１〜９８４，１９８５ ；Ｋａｕｆｍａｎ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４８：９００〜９０７，１９ ９１；Ｍｏｓｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６６２，１９９１）。 疾患状態又は疾患原因物質の抗原をコードする遺伝子をＨＩＮＤ Ｆ１３Ｌ領 域に組み入れるか、又はこの代わりに、組換えワクシニアウイルスベクターのＴ Ｋ領域又はワクシニアウイルスゲノムの非本質的領域に組み入れることができる 。同様に、免疫刺激性分子をコードする遺伝子をＨＩＮＤ Ｆ１３Ｌ領域に又は 組換えワクシニアウイルスベクターのＴＫ領域に組み入れることができる。 ＳｕｔｔｅｒとＭｏｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ． Ａ． ，８９：１０８４７〜１０８５１，１９９２）とＳｕｔｔｅｒ等（Ｖｉｒｏ ｌｏｇｙ ，１９９４）とは、本発明にウイルスベクターとして使用可能である、 非複製組換えＡｎｋａｒａウイルス（ＭＶＡ、修飾ワクシニアＡｎｋａｒａ）の 構成とベクターとしての使用とを開示している。 ＢａｘｙとＰａｏｌｅｔｔｉ（Ｖａｃｃｉｎｅ，１０：８〜９，１９９２）は 本発明にウイルスベクターとして使用可能である、カナリヤポックスウイルス、 鶏痘ウイルス及び他のトリ種を包含する非複製ポックスウイルスの構成とベクタ ーとしての使用とを開示している。 本発明における使用に適切な発現ベクターは、機能的に核酸配列に連結した少 なくとも１種の発現制御要素を含む。この発現制御要素は核酸配列の発現を制御 し、調節するためにベクターに挿入される。発現制御要素の例は、非限定的に、 ｌａｃ系、ファージラムダのオペレーター領域とプロモーター領域、酵母プロモ ーター及びポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス又はＳＶ４０に由来す るプロモーターを包含する。付加的な好ましい又は必要とされる機能的要素の例 は、非限定的に、リーダー配列、停止コドン、ポリアデニル化シグナル、及び宿 主系の核酸配列の適当な転写とその後の翻訳のために必要な又は好ましい他の配 列を包含する。必要な又は好ましい発現制御要素の適切な組合せが選択された宿 主系に依存することは理解されるであろう。さらに、発現ベクターが宿主系の核 酸配列含有発現ベクターの転移とその後の複製のために必要な付加的要素を含有 すべきであることは当業者により理解されるであろう。このような要素の例は、 非限定的に、複製起点と選択可能なマーカーを包含する。このようなベクターが 慣用的な方法［“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ“（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，ニューヨ ーク州，ニューヨーク）におけるＡｕｓｕｂｅｌ等（１９８７）］を用いて容易 に構築されるか又は商業的に入手可能であることは、当業者によって理解される であろう。 疾患原因物質 本発明の組み換えウイルスは、疾患原因物質によって惹起される疾患の治療と 予防に有用である。各疾患原因物質又は疾患状態は、それと共に抗原又は抗原上 の免疫優生エピトープを付随しており、これらは免疫認識と、宿主における疾患 誘発因子又は疾患状態の究極的な除去と制御とに非常に重要であり、時には当該 技術分野で保護抗原と呼ばれる。宿主免疫系は、関連する疾患原因物質に対する 体液及び／又は細胞の免疫応答を開始させるために、抗原又は抗原上の免疫優生 エピトープと接触しなければならない。 本発明の組成物は、１種以上の単離抗原又は免疫優生エピトープをコードする １種以上の核酸配列を含む本発明の組換えウイルスと、１種以上の免疫刺激性分 子を含む第２の組換えウイルスとを含む。 このような疾患誘発因子は、非限定的に、癌及び病原性微生物を包含する。本 発明の組換えウイルスを用いて治療することができる癌は、非限定的に、原発性 又は転移性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホドキンス（Ho dgkins）リンパ腫、ホドキンス（Hodgkins）リンパ腫、白血病、子宮癌、例えば 胸部癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等のような腺癌を包含する。 上記癌は本出願に述べた方法によって評価し、又は治療することができる。癌 の場合には、癌に関連した抗原をコードする遺伝子を組換えウイルスゲノム又は その一部に、１種以上の免疫刺激性分子をコードする遺伝子と共に組み入れる。 或いは、癌に関連した抗原をコードする遺伝子と、１種以上の免疫刺激性分子を コードする遺伝子とを別々の組換えウイルス中に組み入れる。癌に関連した抗原 は癌細胞の表面に発現されるか又は内部抗原であることもできる。１実施態様で は、癌に関連した抗原は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）又はその一部である。本発明に 使用可能であるＴＡＡの例は、非限定的に、黒色腫ＴＡＡを包含し、これは非限 定的にＭＡＲＴ−１（Ｋａｗａｋａｍｉ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４ ７〜３５２，１９９４）、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＰ−１００（Ｋａｗ ａｋａｍｉ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：６４５ ８〜６４６２，１９９４）、ＣＥＡ及びチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ等，Ｊ ．Ｅｘｄ．Ｍｅｄ ．１７８：４８９，１９９３）を包含する。 他の実施態様では、ＴＡＡはＭＵＣ−１、ＭＵＣ−２、点突然変異ｒａｓ癌遺 伝子、点突然変異ｐ５３癌遺伝子（膵臓癌）、ＣＡ−１２５（卵巣癌）、ＰＳＡ （前立腺癌）、ｃ−ｅｒｂ／Ｂ２（胸部癌）等（Ｂｏｏｎ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：３３７，１９９４）である。 本発明は、上でリストされたＴＡＡをコードする遺伝子に決して限定されない 。例えば米国特許第４，５１４，５０６号に記載される公知の方法により、他の ＴＡＡを同定、単離、およびクローン化してよい。 病原性微生物である疾患原因（病因）物質の抗原をコードする遺伝子は、ウイ ルス、例えばＨＩＶ（ＧＰ−１２０，ｐ１７，ＧＰ−１６０抗原）、インフルエ ンザ（ＮＰ，ＨＡ抗原）、単純ヘルペス（ＨＳＶｄＤ抗原）、ヒトパピローマウ イルス、ウマ脳炎ウイルス、肝炎（Ｈｅｐ Ｂ表面抗原）等を含む。病原性細菌 は、クラミジア（Chlamydia）、ミコバクテリア（Mycobacteria）、レジュネラ （Legioniella）等を含むが限定されない。病原性原生動物（protozoans）は、 マラリア、バベシア、住血吸虫（Schistosomiasis）等を含むが限定されない。 病原性酵母はアスペルギルス（Aspergillus）、侵入性カンジダ（Candida）等を 含むが限定されない。好ましい態様において、病原性微生物は細胞内生物である 。 免疫刺激分子：共同刺激／アクセサリー分子およびサイトカイン 共同刺激／アクセサリー分子からの遺伝子および／またはサイトカインをコー ドする遺伝子を組換え体ウイルスのゲノムに挿入する。共同刺激分子の例は、Ｂ ７−１，Ｂ７−２，ＩＣＡＭ−１，ＬＦＡ−３，ＣＤ７２等を含むが限定されな い。本発明により包含されるサイトカインの例は、ＩＬ−２，ＧＭ−ＣＳＦ，Ｔ ＮＦα，ＩＦＮγ，ＩＬ−１２，ＲＡＮＴＥＳ等を含むが限定されない。 ＩＬ−２コンストラクト 本発明のＩＬ−２遺伝子は、タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら（Ｎａｔｕｒ ｅ ３０２：３０５，１９８３）により開示されるとおりにして作成した。 Ｂ７コンストラクト Ｂ７ファミリー（例えばＢ７．１，Ｂ７．２およびたぶんＢ７．３）の共同刺 激性分子は、より最近に発見された重要なグループの分子を意味する。Ｂ７．１ およびＢ７．２は共にＩｇ遺伝子スーパーファミリーの一員である。これらの分 子は、マクロファージ、樹状細胞、単球、即ち抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在 する。白血球が抗原のみと遭遇して、Ｂ７．１による共同刺激を伴えば、アネル ギーまたはアポトーシス（プログラムされた細胞死）のいずれかを伴い応答し； 共同刺激シグナルが提供されたなら、標的抗原に対するクローンの増殖と共に応 答する。与えられた抗原に対する免疫応答の顕著な増大は共同刺激なしでは生じ ない（ジュン（Ｊｕｎｅ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １５：３２ １−３３１，１９９４；チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄ ａｙ １４：４８３−４８６；タウンゼンド（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）ら、Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５９：３６８−３７０）。フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら（Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ ．１４３：２７１４−２７２２，１９８９）は、Ｂ７．１遺伝子の クローニングおよび配列決定を報告する。アズマ（Ａｚｕｍａ）ら（Ｎａｔｕｒ ｅ ３６６：７６−７９，１９９３）は、Ｂ７．２遺伝子のクローニングおよび 配列決定を報告する。 ひとつの態様において、Ｂ７．１遺伝子またはＢ７．２遺伝子をワクシニアウ イルスに挿入した。もうひとつの態様において、ＣＥＡ遺伝子およびＩＬ−２遺 伝子を共に単一のワクシニアウイルスに挿入した。ｒＶ−ＣＥＡ／_nＩＬ−２（ ＡＴＣＣ名称ＶＲ ２４８０），ｒＶ−ＣＥＡ−Ｔ１０８（ＡＴＣＣ名称Ｎｏ． ＶＲ２４８１），ｒＶ−_mＢ７−２（ＡＴＣＣ名称ＶＲ２４８２）；およびｒＶ −_mＢ７−１（ＡＴＣＣ名称ＶＲ２４８３）は、アメリカンタイプカルチャーコ レクション（ＡＴＣＣ），１２３０１ パークロウンドライブ、ロックビル、メ リーランドに１９９４年１０月３日ブダペスト条約の条件下で寄託した。 本発明は、本明細書に開示された疾患原因（病因）物質により引き起こされた 疾患または疾患状態を治療または予防するための方法も包含する。 治療法において、本発明の組換えウイルスまたは組換えウイルスの組成物の投 与は、「予防」または「治療」目的のいずれかでありうる。予防を提供する場合 、本発明の組換えウイルスまたは本発明の組換えウイルスの組成物は、あらゆる 兆候に先立って提供される。組換えウイルスまたは組換えウイルス組成物の予防 投与は続いて起こるあらゆる感染または疾患を予防または改良するように作用す る。治療を提供する場合、組換えウイルスまたは１より多くの組換えウイルスの 組成物を感染または疾患の兆候の開始時（または直後）に提供する。即ち、本発 明は疾患原因因子への予想される暴露または疾患状態前、または感染または疾患 の開始後のいずれかに提供されうる。 腫瘍特異的抗原の遺伝的定義は癌治療のための標的抗原特異的ワクチンの開発 につながる。免疫刺激性分子を含む組換えウイルスと組み合わせてウイルスゲノ ム中に腫瘍抗原遺伝子を挿入することは、癌の進行の危険が増大した患者におけ る予防（予防免疫）、最初の外科手術後の疾患再発の予防（抗−転移予防接種） に関して、またはインビボにおいてＣＴＬの数を増やして、即ち拡散性腫瘍の根 絶に関する効果を改良するための（確立された疾患の治療）道具として、特定の 免疫応答を引き出すための強力なシステムである。最終的に、本発明の組換えウ イルスまたは組成物は、腫瘍運搬物に戻される前にエクスビボにおいて高められ た患者の免疫応答を引き出すことができる（養子免疫治療）。 接種物に関する単語「ユニット投薬量」は、哺乳動物のための単位投薬量とし て適切な物理的に別個のユニットを意味し、各ユニットは必要な希釈剤との関連 において所望の免疫効果を生ずるように計算された予め決定された量の組換えウ イルスを含む。本発明の接種物の新規なユニット投薬量に関する詳細は、組換え ウイルスの独特な特徴および達成される特定の免疫効果により指令され、そして それに依存する。 接種物は、典型的には許容される（受容可能な）希釈剤、例えば、塩水、リン 酸緩衝食塩水または他の生理学上許容される希釈剤等中の溶液として調製されて 、水性薬剤組成物を形成する。 接種のルートは、静脈（Ｉ．Ｖ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、皮下（Ｓ．Ｃ．） 、内皮（Ｉ．Ｄ．）等でありえ、疾患原因物質に対する保守的免疫応答を引き出 す。投薬量は少なくとも一回投与される。次の投薬量は示唆されたとおりに投与 される。 本発明の組換えウイルスの哺乳動物、好ましくはヒトへの提供において、投与 された組換えウイルスの投薬量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、通常の 医学的条件、以前の病歴、疾患の進行、腫瘍の重さ等の因子に依存して変更され る。 通常、約１０⁵から約１０¹⁰プラーク形成ユニット／ｍｇ哺乳動物の範囲の投 薬量で組成物中の各組換えウイルスを受容者に提供するのが望ましいが、より低 いかまたは高い投薬量を投与してよい。 組換えウイルスベクターの組成物は、癌例えば黒色腫（メラノーマ）のあらゆ る兆候に先立つか、または癌例えば黒色腫（メラノーマ）に悩まされる哺乳動物 における疾患の間接（mediate）退向に先立って、哺乳動物に導入されうる。哺 乳動物に組成物を投与するための方法の例は、エクスビボにおける組換えウイル スへの細胞の暴露、または影響された組織への組成物の注射またはウイルスの皮 下、Ｓ．Ｃ．，Ｉ．Ｄ．またはＩ．Ｍ．投与を含むが限定されない。別法として 、組換えウイルスベクターまたは組換えウイルスベクターの組み合わせは、癌様 病巣への直接の注射かまたは薬学上受容可能なキャリアー中での局所適用により 局在投与してよい。投与されるひとつまたはそれ以上のＴＡＡの核酸配列を運ぶ 組換えウイルスベクターの量はウイルス粒子の力価に基づく。投与される免疫原 の好ましい範囲は哺乳動物、好ましくはヒトあたり１０⁵から１０¹⁰ウイルス粒 子である。 ひとつまたはそれ以上のＴＡＡの核酸配列を運ぶ第１の組換えウイルスベクタ ーとひとつまたはそれ以上の免疫刺激性分子の核酸配列を運ぶ第２の組換えウイ ルスベクターの組み合わせを用いる場合、哺乳動物は異なる比の第１および第２ 組換えウイルスベクターで免疫されてよい。一つの態様において、第１ベクター の第２ベクターに対する比は、約１：１、または約１：３、または約１：５であ る。第２ベクターに対する第１ベクターの最適な比は本明細書に記載される方法 を用いて力価測定される。 免疫後、ワクチンの効果は特異的溶解活性または特異的サイトカイン生成によ るかまたは腫瘍退向により評価されるとおり、抗原を認識する抗体または免疫細 胞の生成により評価されうる。当業者であれば、上記パラメーターを評価するた めの慣用的方法を知るはずである。免疫される哺乳動物が既に癌または転移性癌 に罹患しているなら、他の治療処置と共にワクチンを投与することができる。 一つの処置法において、自己の細胞毒性白血球または腫瘍浸潤白血球を癌患者 から得てよい。白血球を培養により成長させて、特異的抗原およびサイトカイン の存在下で培養することにより抗原特異的白血球を増やす。次に、抗原特異的白 血球を自己輸血により患者に戻す。 本発明は、組換えウイルス中の免疫刺激性分子例えばＢ７と共に、組換えウイ ルス中の効果的な量の抗原を哺乳動物に投与することにより、抗原特異的Ｔ−細 胞応答を高めるための方法を包含する。この免疫アプローチは、Ｂ７共同刺激性 分子により共同刺激と共に抗原により生じた免疫応答を増加させるかまたは増大 する。抗原を含有する組換えウイルスおよびＢ７を含有する組換えウイルスの投 与法は、増加した抗原特異的白血球増殖、高められた細胞溶解活性およびいずれ かの組み換えウイルス単独のみの使用との比較の上での抗原に対する免疫性の延 長をもたらす。抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させる方法のひとつの態様におい て、哺乳動物、好ましくはヒトをｒＶ−ＴＡＡおよびｒＶ−Ｂ７で免疫する。ｒ Ｖ−Ｂ７に対するｒＶ−ＴＡＡの比は、抗原特異的Ｔ−細胞応答を最大にするた めに変更されうる。ｒＶ−ＴＡＡのｒＶ−Ｂ７に対する比は１：１、２：１、３ ：１、４：１等を含むが限定されない。治療の効果はインビトロおよび／または インビボにおいて抗原特異的白血球増殖、抗原特異的細胞溶解活性、腫瘍退向等 により監視されうる。 任意の量のｒＶ−Ｂ７の抗原への添加は比にかかわらず改良された細胞免疫を もたらす。しかしながら、ｒＶ−Ｂ７に対する抗原の最適な比は興味のある抗原 各々に関して決定される。ひとつの態様において、ｒＶ−Ｂ７にｒＶ−ＣＥＡを 用いた場合、抗原特異的白血球増殖性、細胞溶解性かつ腫瘍退向性のＣＥＡ特異 的応答において最大の増加をもたらす比は３：１であった。 抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させる方法はあらゆる抗原に関して使用される 。特に興味があるのは、腫瘍関連抗原および感染性因子の抗原である。抗原特異 的Ｔ−細胞応答を増大させるためのひとつの方法において、ｒＶ−ＣＥＡおよび ｒＶ−ヒトＢ７−１を最適比でＣＥＡ陽性癌腫（カルシノーマ）を有する患者に 投与して、ＣＥＡ陽性癌腫（カルシノーマ）の軽減または排除をもたらすＣＥＡ 特異的Ｔ−細胞応答を刺激する。抗原特異的Ｔ−細胞応答を増大させるためのも うひとつの方法において、ｒＶ−ｇｐ１２０またはその一部およびｒＶ−ヒトＢ ７−１を、ｇｐ１２０陽性細胞の減少または排除をもたらすｇｐ１２０特異的Ｔ −細胞応答を刺激する比で、ｇｐ１２０陽性細胞を有する患者に投与する。 本発明は、組み合わせ治療も包含する。組み合わせ治療によりとは、ひとつま たはそれ以上の疾患因子に関連したひとつまたはそれ以上の抗原をコードするひ とつまたはそれ以上の遺伝子を含む組換えウイルスおよびひとつまたはそれ以上 の免疫刺激性分子をコードするひとつまたはそれ以上の遺伝子を含む組換えウイ ルスまたは同じベクターに挿入された両タイプの遺伝子の組成物を、他の外因性 免疫変調剤または免疫刺激性分子、化学療法薬剤、抗生物質、抗真菌薬、抗ウイ ルス薬等の単独またはその組み合わせと共に患者に投与することを意味する。他 の外因的に付加される因子の例は、外因性ＩＬ−２、ＩＬ−６、インターフェロ ン、腫瘍壊死因子、シクロホスファミドおよびシスプラチナム、ガンシクロビア 、アンフォテリシンＢ等を含む。 本発明の他の側面は、in situまたはインビトロにおいて癌細胞が組換えウイ ルスまたは組換えウイルスの組み合わせに感染した場合の癌の治療法である。免 疫刺激性分子と共に腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を、癌罹患哺乳動物におい て腫瘍の減少または除去をもたらすのに効果的な量で哺乳動物に投与する。 本発明は、さらに、本発明の組換えウイルスを用いた免疫により引き出された ひとつまたは複数の抗体を含む。抗体は、興味のある抗原に特異性を有し、そし て反応または結合する。本発明のこの態様において、抗体はモノクローナルまた はポリクローナル起源である。 例示される抗体分子は、完全なイムノグロブリン分子、実質的に完全なイムノ グロブリン分子、またはＦ（ａｂ），Ｆ（ａｂ’）；Ｆ（ａｂ’）₂およびＦ（ ｖ）として当業界において知られているイムノグロブリン分子の部分を含む、抗 原結合部位を含むイムノグロブリン分子の部分である。ポリクローナルまたはモ ノクローナル抗体は、当業界において公知の方法により生成される（コーラーと ミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）（１９７５）Ｎａｔ ｕｒｅ ２５６，４９５−４９７；キャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）「モノクロ ーナル抗体技術、げっ歯類およびヒトのハイブリドーマの生成および特徴」、バ ードン（Ｂｕｒｄｏｎ）ら編（１９８５）「生化学および分子生物学における実 験室技術」、１３巻、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｓ，アムステルダム）。抗体または抗原結合断片は遺伝子工学により生成しても よい。大腸菌における重鎖および軽鎖両者の発現技術はＰＣＴ特許出願：国際公 開番号ＷＯ９０１４４３、ＷＯ９０１４４３およびＷＯ９０１４４２４およびヒ ューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８ １の主題である。 一つの態様において、本発明の抗体はイムノアッセイに使用することにより生 物学上のサンプル中の興味ある新規抗原を検出する。 一つの態様において、ＣＥＡ発現組換えワクシニアウイルスおよびＢ７．１発 現組換えワクシニアウイルスを含む組成物を用いた免疫により生じた本発明のＣ ＥＡ抗体を使用することにより、免疫細胞化学を用いてＣＥＡ発現癌に罹患した 哺乳動物の組織検体からのＣＥＡ抗原の存在を評価する。疾患組織中のＣＥＡ抗 原の描写のそのような評価を用いることにより、疾患に罹患した哺乳動物におけ る疾患の進行または免疫治療の効果を予測することができる。免疫組織化学に関 する慣用的方法は、ハローとレーン（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ）（編） （１９８８）「抗体実験室マニュアル」中、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；ア ウスベル（Ａｕｓｂｅｌ）ら（編）（１９８７）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏ ｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（ニューヨーク、ニューヨーク）に記載されている。 他の態様において、本発明の抗体は免疫治療に用いられる。本発明の抗体は受 動免疫治療に用いられる。 抗体または抗原結合断片を受容哺乳動物好ましくはヒトに提供する際、投与さ れた抗体または抗原結合断片の投薬量は、哺乳動物の年齢、体重、身長、性別、 通常の医学的条件、以前の医学的条件等の因子に依存して変更される。 本発明の抗体または抗原結合断片は、疾患または感染の重度、範囲または期間 を予防し、減らし、または弱めるのに十分な量で受容者に提供されることを意図 する。 抗イディオタイプ抗体は、通常は免疫応答の途中にでき、そしてその抗イディ オタイプ抗体の一部分は、元の免疫応答を誘発したエピトープに似ている。本発 明においては、その結合部位が疾患状態の抗原を反映している抗体のイムノグロ ブリン遺伝子又はその一部分が、ウイルスゲノムのゲノム又はその一部分の中に 、単独で又は免疫刺激性分子の遺伝子若しくはその一部分と組み合わさって組み 込まれているので、その結果できた組換えウイルスは、その抗原への細胞性及び 体液性免疫応答を引き出すことができる。 実施例１ ｒＶ−Ｂ７−１及びｒＶ−Ｂ７−２の 構築及び構築体の特性決定 材料及び方法 組換えワクシニアウイルス マウスＢ７−１の全縁オープンリーディングフレームをコードする１，１２５ ｂｐＤＮＡ断片及びマウスＢ７−２の全縁オープンリーディングフレームをコー ドする９４２ｂｐＤＮＡ断片を、逆転写酵素ＰＣＲ（Geneamp RNA PCR Kit，Per kin Elmer，Norwalk，CT）により、マウスＢ細胞系，Ａ２０（TIB 208，ATCC，R ockville，MD）から抽出した全ＲＮＡから増幅した。それらＢ７挿入物の配列は 、公表された配列と同一であることが分かった（Freeman，G.J．ら，J ．Exp．Me d. 174:625-631，1991；Freeman，G.J．ら，Science 262:813-960，1993）。そ れらＤＮＡ断片を、組換えウイルスの選択のための大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含有 する、Theion Biologics（Cambridge，MA）により提供されたワクシニアウイル ス運搬ベクターＰＴ１１６のＫｐｎ−１／Ｘｈｏ−１制限酵素部位に別々に連結 した。組換えウイルスを先に記載された通りに誘導した（Kaufman，H．ら，Int ．J. of Cancer 48:900-907，1991）。組換えクローンを５−ブロモ−４−クロ ロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ（X-Gal）の存在下でのＢＳＣ −１細胞（CC126，ATCC）での増殖により選択した。適切な青色の組換えクロー ンを５ラウンドのプラーク精製により精製してより高い力価の溶解産物の中に増 殖させた。接種用のウイルスをＨｅＬａ細胞の攪拌培養液中で増殖させ、遠心分 離により直接沈澱させ、そして２０％〜４０％ショ糖勾配で精製した（Moss，B ．Current Protocols in Molecular Biology 2.16.15.1-16.18.9，1993）。 組換えウイルスの特性決定 ＤＮＡ組換えのサザーン分析 組換えワクシニアゲノムを、ウイルスＤＮＡ抽出、ＨｉｎｄIIIでの制限エン ドヌクレアーゼ消化、及びサザーンブロッティングにより、先に記載された通り に分析した（Kaufman，H．ら，Int ．J．Cancer 48:900-907，1991）。 タンパク質発現のウェスタン分析 集密ＢＳＣ−１細胞に野生型ワクシニアウイルス又はマウスＢ７−１若しくは Ｂ７−２遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ− Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２と命名した）のいずれかを１０のＭＯＩで４時間感 染させた。タンパク質を抽出して先に記載された通りに分析した（Kantor，J.ら ，J ．Nat'l Cancer Inst. 84:1084-1091，1992）。ウェスタンブロットを抗Ｂ７ −１（精製ラット抗マウスＢ７／ＢＢ１）又は抗Ｂ７−２（ラット抗マウスＢ７ −２（ＧＬ−１））モノクローナル抗体（Pharmingen，San Diego，CA）と共に インキュベートしてから、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP，Kirkega ard & Perry Laboratories，Gaithersburg，MD）と結合したヤギ抗ラットと共に インキュベートし、そしてメーカーの使用説明書に従って発色させることにより 、組換えＢ７−１又はＢ７−２タンパク質を検出した。 タンパク質発現の蛍光分析 集密ＢＳＣ−１細胞にＶ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２の いずれかを１０ＭＯＩで２時間感染させた。感染後３〜６時間で細胞を採取して 精製ラット抗マウスＢ７／ＢＢ１−ＦＩＴＣ又はラット抗マウスＢ７−２（ＧＬ −１）−ＦＩＴＣモノクローナル抗体で免疫染色した。細胞をフローサイトメト リ（FACSCAN，Becton Dickinson，San Jose，CA）により分析した。 in vitro実験 ＭＣ３８マウス間代性（clonic）アデノカルチノーマ細胞系（Fox，B.A．ら， J．Biol．Response Modifiers 9:499-511，1990）をDr．Steve Rosenberg（Nati onal Cancer Institute，Bethesda，MD）の研究室により供与された。ＭＣ３８ 細胞にＶ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２のいずれかを０.２ ５ＭＯＩで１時間感染させ、洗浄し、そしてＨＢＳＳ中に３×１０⁶細胞／ｍｌ の濃度で懸濁させた。メスＣ５７ＢＬ／６マウスをTaconic Farms（Germantown, NY）から得た。６〜８週齢のマウスに１００μｌ（３×１０⁵感染細胞）の皮 下注射を右側腹部に行った。対照マウスには、未感染ＭＣ３８細胞を注射した。 少なくとも４０日間腫瘍ができなかったマウスに３×１０⁵未感染細胞で反対の 側腹部を誘発した。平行実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをγ線照射（５００ｒ ａｄ）して、２４時間後に未感染ＭＣ３８細胞、又は０.２５ＭＯＩ Ｖ−Ｗｙｅ ｔｈ、ｒＶ−Ｂ７−１若しくはｒＶ−Ｂ７−２のいずれかを感染させた細胞を注 射した。腫瘍をハサミ尺により２次元で測定して、先に記載された通りにその体 積を計算した（Kantor，J.ら，J ．Nat'lCancer Instit．84:1084-1091，1992） 。 実施例２ 組換えウイルスの発生及び特性決定 マウスＢ７−１及びＢ７−２のオープンリーディングフレームをコードするｃ ＤＮＡ断片を、Ｂ７−１特異性オリゴヌクレオチドプライマー５'ＧＧＴＡＣＣ ＡＴＧＧＣＴＴＧＣＡＡＴＴＧＴＣＡＧＴＴＧ３'（配列番号：１）、５'ＣＴＣ ＧＡＧＣＴＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＧＧＴＣＴＧ３'（配列番号：２）、及びＢ７ −２特異性プライマー５'ＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＡＣＣＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣ ３'（配列番号：３）、５'ＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＣＴＧＣＡＴＴＴＧＧＴＴＴ ＴＧＣ３'（配列番号：４）を用いる逆転写酵素ＰＣＲにより得て、ワクシニア ウイルス運搬ベクターＰＴ１１６内に連結した。このベクターは、挿入した遺伝 子産物の合成を誘発するために多クローニング部位の上流に強力なワクシニアウ イルス即時初期プロモーター（Ｐ４０と命名した）を含有する。Ｂ７ＤＮＡ断片 の連結及び方向、並びにプロモーター位置をＰＣＲ及び配列決定法により確かめ た。このキメラベクター構築体をワクシニアゲノミックＨｉｎｄIIIＭ部位内に 先に報告された通りの相同組換えにより挿入し（Kaufman，H．ら，Int ．J．Canc er 48:900-907，1991）、そしてプローブとしての³²Ｐ放射標識Ｂ７−１又はＢ ７−２ＤＮＡでのサザーン分析により確認した（データは示していない）。ワク シニアウイルスクローン内のＢ７−１及びＢ７−２の全縁ｃＤＮＡ配列は、公表 された配列と同一であることが分かった（Freeman，G.J．ら，J ．Exp．Med．174 :625-631，1991；Freeman，G.J．ら，Science 262:813-960，1993）。 組換えタンパク質の発現をｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２感染ＢＳＣ−１ 細胞からのタンパク質抽出物のウェスタン分析により確認した。これら細胞は、 組換えワクシニア産物の評価用に定型的に用いられる（Moss，B．Current Proto cols in Molecular Biology 2.16.15.1-16.18.9，1993）。ラット抗マウスモノ クローナル抗体Ｂ７−ＢＢ１とのｒＶ−Ｂ７−１感染細胞からのタンパク質抽出 物ブロットのインキュベーションで、幅広い５０〜９０ｋＤバンドが現れた。同 じく、ラット抗マウスモノクローナル抗体Ｂ７−２（ＧＬ−１）とのｒＶ−Ｂ７ −２感染細胞からのタンパク質抽出物ブロットのインキュベーションで、６５〜 １００ｋＤの範囲のバンドが現れた（データは示していない）。これは、Ｎ−結 合グリコシル化の結果としての雑多な糖タンパク質として現れるこれら分子の見 掛けの分子量を示す報告と一致している（Schwartz，R.H．Cell 71:1065-1068,1 992;Freeman，G.J．ら，J ．Exp．Med．174:625-631，1991；Freeman，G.J．ら，Science 262:813-960，1993）。未感染又はＶ−Ｗｙｅｔｈ感染細胞は、Ｂ７− １及びＢ７−２の両方の発現について陰性であった。 Ｂ７−１又はＢ７−２組換えタンパク質の細胞表面発現をフローサイトメトリ により検査した。図１Ａは、未感染ＢＳＣ−１細胞（図１Ａ）がＢ−７（ＢＢ１ ）又はＢ７−２（ＧＬ−１）抗体のいずれとも反応しないことを示している（９ ８．５％の細胞が５.２２の平均蛍光で陰性である）。同じく、野生型ワクシニ アを感染させた細胞（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、図１Ｂ）も、これら２種の抗体のいずれ とも反応しなかった（９７．７％の細胞が５．４３の平均蛍光で陰性である）。 ｒＶ−Ｂ７−１を感染させたＢＳＣ−１細胞（図１Ｃ）は、Ｂ７／ＢＢ１抗体と 強く反応する（９７．５％の細胞が２５１３．６８の平均蛍光で陽性である）。 ｒＶ−Ｂ７−２を感染させた細胞（図１Ｄ）は、Ｂ７−２（ＧＬ−１）抗体と強 く反応する（９８．８％の細胞が１８０２．３０の平均蛍光で陽性である）。抗 体Ｂ７／ＢＢ１とｒＶ−Ｂ７−２を感染させた細胞との間には反応性がなく、抗 体ＧＬ−１とｒＶ−Ｂ７−１を感染させた細胞との反応性もなかった。かくして 、これら検討は、組換えワクシニアウイルスが感染後３〜６時間で細胞表面上で Ｂ７−１及びＢ７−２分子を発現できることを証明している。感染細胞の溶解は 、通常は２４〜４８時間の間は起こらない（Moss，B．Current Protocols in Mo lecular Bi ology 2.16.15.1-16.18.9，1993）。 同系のＣ５７ＢＬ／６マウス内に３×１０⁵ＭＣ３８マウスアデノカルチノー マ細胞を皮下注射すると、定型的には、７〜１４日以内に触知可能な腫瘍が生じ た後、急速に増殖してついには致命的となることが以前に示されている（Kantor ,J.ら，J．Nat'l Cancer Inst．84:1084-1091，1992）。これら腫瘍細胞も、Ｂ ７の発現について陰性であることが分かっている（Chen，L．ら，J ．Exp．Med． 179:523-532，1992）。Ｂ７の機能的発現についてこれら組換えワクシニア構築 体を試験するために、ＭＣ３８腫瘍細胞の増殖を、ｒＶ−Ｂ７−１、ｒＶ−Ｂ７ −２、及び野生型Ｖ−Ｗｙｅｔｈを感染させたＭＣ３８の増殖と比較した（図２ Ａ〜２Ｄ）。未感染ＭＣ３８細胞の注射で（図２Ａ）、全てのマウスに７日以内 に触知可能な腫瘍が生じた。腫瘍増殖は、この実験の全期間を通して進行性であ った。あらゆる腫瘍の測定値（長さ又は幅）が２０ｍｍを超えたときに、全実験 において動物を殺した。０.２５ＭＯＩＶ−Ｗｙｅｔｈを１時間感染させたＭＣ ３８細胞の注射（図２Ｂ）で、触知可能な腫瘍の発生に僅かな遅れがあり、そし て全ての動物は、ついには腫瘍について陽性となった（図２Ｂにおける一匹の動 物で腹腔内腫瘍が増殖したが測定できなかった）。全てのグループについて０. ２５のＭＯＩを選んだ。というのは、それよりも大きな量で感染させると、より 高いレベルの非特異的細胞死が起こって腫瘍の増殖が遅くなるからである。０. ２５ＭＯＩのｒＶ−Ｂ７−１（図２Ｃ）又はｒＶ−Ｂ７−２（図２Ｄ）を感染さ せたＭＣ３８細胞の注射では、どのマウスにも腫瘍が誘発されず、この実験のあ いだ腫瘍がないままであった。 このＭＯＩを感染させた細胞の組換えタンパク質発現をフローサイトメトリに より確認した。０．２５ＭＯＩ組換えウイルスを感染させた後は、約３５％のＭ Ｃ３８細胞が、組換えＢ７−１又はＢ７−２のいずれかについて平均蛍光が４１ ７〜５８５の陽性であった。未感染であるか又は０.２５ＭＯＩ Ｗｙｅｔｈを感 染させたＭＣ３８細胞は、Ｂ７−１又はＢ７−２の発現について陰性のままであ った。これらＭＣ３８細胞は、感染前及び感染後の両方でＩ型ＭＨＣ抗原の発現 について陽性であった。これらいずれの動物においても４０日間の観察パネルの あいだ目立った毒作用は認められなかった。動物の体重は、正常な相応週齢マウ ス の標準偏差の範囲内であった。これら実験を更に３回繰り返したが同様な結果で あった。 腫瘍拒絶が無傷免疫系に依存性であるか否かを確認するために検討を行った。 これら検討において、マウスを照射により免疫抑制（実施例１の材料及び方法を 参照のこと）して感染ＭＣ３８腫瘍細胞を投与した（表１）。Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ −Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２を感染させた照射マウスにおける腫瘍は、腫瘍移 植後１４日で測定可能となり、腫瘍体積の差は認められなかった。これは、組換 えＢ７分子に応答するには無傷免疫系が必要であることを示すものである。 Ｂ７遺伝子の導入のためにレトロウイルスベクターを用いる系においては、マ ウスの一方の側腹部へのＢ７発現性腫瘍細胞の投与及び反対の側腹部へのＢ７陰 性腫瘍細胞の同時投与は、両方の腫瘍集団の増殖を阻止するであろうということ が分かっている（Chen，L.ら，Cell 71:1093-1102，1992）。他の検討では、Ｂ ７陰性細胞への抗腫瘍活性は、Ｂ７陰性一次腫瘍の皮下投与後１０日のＢ７発現 性腫瘍細胞の多数回腹腔内注射により確認された（Li，Y.ら，J ．Immunol．153: 421-428，1994）。ここに記載した検討は、腫瘍細胞への長期持続性免疫がｒＶ −Ｂ７感染腫瘍細胞での感作によって誘発されるか否かを確認するためにデザイ ンされたものである。ｒＶ−Ｂ７−１又はｒＶ−Ｂ７−２を感染させたＭＣ３８ 細胞を投与されたマウスは、少なくとも４０日間は腫瘍がないままであった（図 ２Ｃ及び２Ｄ）ので、次にその反対の側腹部を３×１０⁵未感染（Ｂ７陰性）Ｍ Ｃ３８細胞で誘発した（図３Ｂ及び３Ｃ）。未感作マウスにこれらＭＣ３８細胞 を注射すると（図３Ａ）、全ての動物に７日以内に触知可能な腫瘍形成があり、 この実験の全期間を通して進行性の腫瘍増殖があった。腫瘍移植後２１日におけ るこの対照グループの平均腫瘍体積は、２４３６±８５８ｍｍ³であった。ｒＶ −Ｂ７−１を感染させた腫瘍を４０日前に投与しておいたマウスも、未感染ＭＣ ３８細胞で誘発した（図３Ｂ）。これら腫瘍の形成は遅れたため、増殖速度は平 均腫瘍体積が２１日目で３７２±１０６ｍｍ³と実質的に低下した。同じく、ｒ Ｖ−Ｂ７−２感染腫瘍を投与しておいたマウスは、ＭＣ３８細胞で誘発すると、 腫瘍細胞の増殖の実質的な低下を示した。このグループにおける平均腫瘍体積は 、２１日目で１９７±１６１ｍｍ³であった。かくして、腫瘍発現性Ｂ７−１又 はＢ７−２を予め投与された動物においては、組換えワクシニアウイルス感染に より腫瘍増殖が＞９０％低下した。これは、腫瘍誘発の４０日前に一回感作した だけであるという事実、及びマウスを比較的大きな腫瘍量で誘発したという事実 からみて興味深かった。これは、ＭＣ３８腫瘍細胞上の拒絶抗原に対する記憶免 疫応答がｒＶ−Ｂ７感染腫瘍細胞の注射によって誘発されていることを暗に示す 。上記処理方法に手を加えて、Ｂ７発現性腫瘍細胞での多数回接種、及びＩＬ− ２のようなサイトカインを含む免疫刺激性分子でのＴ細胞活性化の増大を含めて もよい。 これまでの研究では、ＰＬＮＳＸ、ＰＬＮＣＸ又はＰＬＸＳＮのようなレトロ ウイルスベクターでの形質導入による腫瘍細胞内へのＢ７の導入で、それら腫瘍 に免疫原性を付与できることが証明されている（Chen，L.ら，J ．Exp．Med．179 :523-532，1992；Dohring，C．ら，Int ．J．Cancer 57:754-759，1994）。これ らＢ７導入の方法は、レトロウイルスベクターの比較的低い感染効率並びに薬剤 選択及びＢ７陽性腫瘍細胞の拡大に要求される必然的な長い時間のために、臨床 的応用に潜在的な限界を有している。代わりとして、ここに報告した検討は、同 時刺激性分子Ｂ７−１及びＢ７−２の遺伝子を発現する組換えワクシニアウイル スの発生を証明した。これら組換えワクシニア構築体は、腫瘍細胞を速やかに感 染し（１〜４時間）そして高い効率で組換えタンパク質を発現する（９７％を超 える細胞、それぞれ図１Ｃ及び１Ｄ）。感染された細胞は、確実に組換えタンパ ク質を合成し、抗腫瘍作用をもたらすことが分かった。かくして、これら検討は 、ワクシニアウイルスベクター内へのＢ７遺伝子の挿入のための実験系にデータ を提示するものであり、潜在的な免疫療法的応用についての暗示を有している。 実施例３ 腫瘍関連抗原を発現する組換えワクシニアウイルスとＢ７共刺激分子を 発現する組換えワクシニアウイルスを混合することによる、 ヒト腫瘍関連抗原に対するＴ細胞免疫応答の増強の誘導 本発明は、ｒＶ−Ｂ７をヒト腫瘍関連抗原を発現する組換えワクシニアウイル スとともに含む組成物を含む。本発明の組成物は、宿主に共接種されると、ヒト 腫瘍関連抗原に対する全身性Ｔ細胞免疫応答を増強する。 今や、数種のヒト腫瘍関連抗原が同定されている。そのうちの一つはヒト癌胚 抗原（ＣＥＡ）であり、これは結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、および非小細 胞肺癌を含む広範囲のヒトの癌に発現するものである。ｒＶ−ＣＥＡと呼ばれる 組換えワクシニアＣＥＡ構築物をマウスおよびアカゲザルの双方に投与して、双 方のモデル系においてＣＥＡに特異的なＴ細胞反応を誘導することができる、と いうことが最近示された（Kantor J.,et al.，J.Natl.Cancer Ins.84:1084-1091 , 1992;Kantor J．et al.,Cancer Res.52: 6917-6925，1992）。さらに、どちら の系においても全く毒性は観察されなかった。最近、転移性の胃腸癌、乳癌また は肺癌を伴う患者にｒＶ−ＣＥＡを投与する臨床実験が終了した。段階Ｉ研究で は、天然痘ワクチンを投与した場合に観察されるような状態以外は、全く毒性は 観察されなかった。 一つの態様は、Ｂ７およびＣＥＡの遺伝子を同一の組換えワクシニア構築物に 挿入することである。なぜなら、双方の分子が同じ細胞上に同じ時に発現する必 要があるからである。別の態様は、ｒＶ−ＣＥＡをｒＶ−Ｂ７と混合してＣＥＡ に対するＴ細胞免疫反応を特異的に高めることである。この後者の手段の利点は いくつもある：（ａ）最大免疫反応のための割合を決定するために、ｒＶ−ＣＥ ＡとｒＶ−Ｂ７の異なる割合を調べることができる（ｂ）ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ− Ｂ７の投与時期を変化させることができる（ｃ）ｒＶ−Ｂ７構築物は１種類のみ 製造すればよい、即ち、ｒＶ−ＣＥＡと共に使用されるｒＶ−Ｂ７は、別の腫瘍 関連抗原に対するｒＶ構築物と使用することもでき、実際、免疫反応強化のため の薬剤に関連する他のいかなる抗原とも使用することができる。 一つの態様において、単にｒＶ−ＣＥＡをｒＶ−Ｂ７と混合して宿主に共投与 するだけで、ＣＥＡに特異的なＴ細胞免疫応答の強化が誘導されることが示され た。さらに、ｒＶ−Ｂ７に対するｒＶ−ＣＥＡの割合が免疫応答の強度における 重要な因子であった。 第一の研究において、ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７は１対１の割合で混合された 。即ち、５×１０⁶ｐｆｕのＢ７と５×１０⁶ｐｆｕのｒＶ−ＣＥＡとを混合し、 尾乱切によって３匹のマウスのグループに共投与した。免疫から１４日後に脾臓 を切除して、リンパ球の供給源とした。対照としてマウスの他の３つのグループ を使用した：（ａ）非ワクチン接種マウス（ｂ）５×１０⁶ｐｆｕのｒＶ−ＣＥ Ａと５×１０⁶ｐｆｕの野生型ワクシニア（「Ｖ−Ｗｙｅｔｈ」と呼ぶ）を受け るマウス、および（ｃ）５×１０⁶ｐｆｕのＶ−Ｗｙｅｔｈと５×１０⁶ｐｆｕの ｒＶ−Ｂ７受けるマウス。従って、全てのワクチン接種マウスは合計１０⁷ｐｆ ｕのワクシニアウイルスを与えられ、３つのグループ全てにおいて、ワクシニア ウイルスの割合は１：１であった。図４に見られるように、ｒＶ−ＣＥＡ＋Ｖ− Ｗｙｅｔｈを１回投与した後、マウスはＣＥＡに特異的な免疫反応が、低レベル ではあるとしても、確かに高まった。使用された免疫分析は、以前から記載され ているリンパ球増殖分析であり（Kantor et al.，J ．Natl.Cancer Inst.,84:108 4-1092，1992）、使用された標的抗原は、バキュロウイルスに由来する組換えＣ ＥＡであった。図４に示されるように、ｒＶ−Ｂ７のｒＶ−ＣＥＡへの追加は、 特異的免疫反応を数倍増強させた。対照的に、ｒＶ−Ｂ７の対照Ｖ−Ｗｙｅｔｈ への追加は、ＣＥＡ特異的免疫反応の増強に何ら影響しなかった。 次の実験において、ｒＶ−ＣＥＡのｒＶ−Ｂ７に対する割合を、１：３に修飾 した。図５に示されるように、１：３の割合のｒＶ−ＣＥＡ＋ｒＶ−Ｂ７の投与 は、ｒＶ−ＣＥＡ＋Ｖ−Ｗｙｅｔｈと比較してＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応を増強さ せ、しかも、その程度は二つの構築物（ｒＶ−Ｂ７＋ｒＶ−ＣＥＡ）を１：１の 割合で混合させた場合よりも大きかった。前回と同様に、２つの対照群、即ち、 非ワクチン接種の群およびｒＶ−Ｂ７をＶ−Ｗｙｅｔｈと混合させた群は、ＣＥ Ａにたいして免疫反応を示さなかった。 これらの結果は、ヒト腫瘍関連抗原に関する特異的なＴ細胞反応を増強させる ために、ｒＶ−含有ヒト関連遺伝子をｒＶ−Ｂ７と単に混合させるだけで、抗原 提示細胞上に共感染および共発現を誘導させることができることを示唆している 。さらに、使用されたｒＶ−Ｂ７およびｒＶ−含有ヒト関連遺伝子の割合は、ヒ ト腫瘍関連遺伝子産物、あるいは実際、誘導させたい若しくは免疫性を高めたい と望むその他の全ての遺伝子産物に対するＴ細胞活性化を最適化させるために重 要な因子であるかもしれない。 実施例４ ｒＶ−ＣＥＡ＋ｒＶ−Ｂ７による免疫化後の ＣＥＡに対するマウスＴ細胞のリンパ球増殖反応 リンパ球増殖反応 Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、以下のものを様々の割合で含む総計１×１０⁷ＰＦ Ｕのウイルスで免疫化した：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ；ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ； Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７；またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７。そして、上述した ようにＣＥＡ特異的リンパ球増殖を分析した（Kantor，J et al.，J ．Nat'l．Ca ncer Inst. ,84:1084-1091，1992）。簡単には、脾臓を免疫化から１４日後に切 除し、７０μｍ細胞濾過器（Falcon，Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ） を通して機械的に分散させ、単細胞の懸濁液を得た。赤血球および死んだ細胞を Ficoll-Hypaque勾配（密度＝１．１１９ｇ／ｍｌ）（Sigma Chemical Co.,St.Lo uis，MO）上で遠心することによって除去した。脾臓の単核細胞をナイロンウー ルカラム（Robbins Scientific Corp.Sunnyvale,CA）上を通すことによって約９ ５％のＴ細胞からなる集団を得た。ＣＥＡ特異的リンパ球増殖を評価するために 、Ｔ細胞を１０⁵／ウェルの濃度で９６ウェル平底プレート（Costar,Cambridge ，MA）中に加えた。抗原提示細胞は、５×１０⁵／ウェルの濃度で加えられた被 放射（２０００ｒａｄ）の未処理（ｎａｉｖｅ）同系脾臓細胞から構成された。 刺激されたウェルは以下のものを与えられた：精製ヒトＣＥＡ（１００−１２. ５μ ｇ／ｍｌ）（Vitro Diagnostics，Denver，CO）；陰性コントロールとしてオバ ルブミン（１００μｇ／ｍｌ）；再現抗原としてＵＶ−不活性化Ｖ−Ｗｙｅｔｈ （２×１０⁷ＰＦＵ／ｍｌ）またはＴ細胞陽性コントロールとしてＣｏｎ−Ａ（ ２μｇ／ｍｌ）。コントロールは、Ｔ細胞、ＡＰＣおよび培地のみを与えられた 。全てのウェルの細胞は、全容量２００μｌの完全培地（ＣＭ）［ウシ胎児血清 （１０％）；グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、Ｈｅｐ ｅｓ（７ｍＭ）、ゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、２−メルカプトエタノー ル（５０μＭ）および非必須アミノ酸（０．１ｍＭ）を含むＲＰＭＩ １６４０ （Biofluids,Rockville,MD）］中で５日間培養された。細胞を１μＣｉ／ウェル ［³Ｈ］−チミジン（New England Nuclear，Wilmington，DE）と共に総計１２− １８時間インキュベーションすることにより標識し、ＰＨＤ細胞回収器（Cambri dge Technology，Cambridge，MA）を用いて回収した。取り込まれた放射活性を 液体シンチレーションカウンター（LS 6000IC;Beckman,Duarte，CA）によって測 定した。三重のウェルからの結果を平均化して、以下のように計算された刺激指 数（ＳＩ）： ＳＩ＝［ＣＰＭ（刺激されたウェル）］／［ＣＰＭ（コントロールウェル）］ として報告した。 リンパ球増殖分析 ｒＶ−ＣＥＡとｒＶ−Ｂ７との混合物による免疫化が、増強されたＣＥＡ特異 的リンパ球増殖反応を引き起こし得るか否かを調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マ ウスを、総計１０⁷ＰＦＵのｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ： ｒＶ−Ｂ７またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７を１：１、１：３また３：１の割合 （表２を御覧いただきたい）で使用して同時に免疫化し、１４日後にリンパ球増 殖反応を分析した。表２は、全く免疫化を受けなかったマウスからのＴ細胞は精 製ＣＥＡに対して反応しないのに対し、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈで免疫化 されたマウスからのＴ細胞は弱く反応した（１．９−２．５の刺激指数［ＳＩ］ ）ことを示す。ＣＥＡに対する反応は、免疫化の際に与えられたｒＶ−ＣＥＡの 用量に関連するようであった。Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７はどの割合でも免疫 化し たマウスからのＴ細胞はＣＥＡに対して反応しなかった。対照的に、ｒＶ−ＣＥ Ａ：ｒＶ−Ｂ７はどの割合の場合で免疫した場合でもそのマウスからのＴ細胞は 、免疫化としてｒＶ−Ｂ７を与えられなかった群と比較して、ＣＥＡに対する増 強された反応を有するようであった（表２）。ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３： １）の免疫化は、本実験において最大のリンパ球増殖の誘導を示した（ＳＩ １ ２．３）。ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７の割合を変えた（３:１、１:１、１:３） 実験を４回行ったが、各場合において３：１の割合がＣＥＡ特異的Ｔ細胞反応を 最も増強させた。ＣＥＡ特異的細胞免疫応答の程度をさらに調べるために、マウ スをｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（ ３：１）またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）で１回免疫化し、そして前 述ようにリンパ球増殖反応を分析した。 表３は、免疫化を受けていないマウスからのＴ細胞は、いかなる濃度の精製Ｃ ＥＡにも、ＵＶ−不活性化Ｖ−Ｗｙｅｔｈにも反応しないことを示す。Ｖ−Ｗｙ ｅｔｈで免疫化したマウスからのＴ細胞は強い刺激指数（３１．７）でＵＶ−Ｖ −Ｗｙｅｔｈに反応するが、ＣＥＡに応答して増殖することはなかった。対照的 に、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）で免疫化したマウスからのＴ細胞 は、ＣＥＡと共に増殖させた場合用量依存的に増殖した（刺激指数４．５−１． ６）。ｒＶ−Ｂ７のみで免疫化した（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７）マウスから のＴ細胞は、ＣＥＡに反応しなかった。最後に、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３ ：１）の組み合わせで免疫化したマウスからのＴ細胞は、ＣＥＡ抗原に反応して 用量依存的に増殖した（ＳＩ＝１８．６−３．０）。この刺激指数は、ｒＶ−Ｂ ７の追加によってＣＥＡ特異的増殖反応が４倍以上増加することを示す。全ての 群からのＴ細胞はコントロールリンパ球マイトゲンＣｏｎＡに反応し、陰性コン トロール抗原オバルブミンとは反応しなかった。 実施例５ｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７で感染させた細胞におけるＣＥＡおよびＢ７−１ の二重発現 フローサイトメトリー法 ２色フローサイトメトリー法を、in vitroにおいてｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ− Ｂ７で細胞が二重に感染していることを示すために使用した。集密のＢＳＣ−１ 細胞（ＣＣＩ２６，ＡＴＣＣ，ロックバイル、メリーランド州）を、全ＭＯＩが ５となるように、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ， Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７の３：１の混合物，またはＶ−Ｗｙｅｔｈのみで２ 時間にわたって感染させた。細胞は、感染後、１８時間目に回収し、ＰＥ結合ラ ット抗マウスＢ７−１モロクローナル抗体（ファルミンゲン、サンディエゴ、カ リフォルニア州）およびＦＩＴＣ結合抗ＣＥＡモロクローナル抗体ＣＯＬ−１（ ３６）またはＦＩＴＣおよびＰＥ結合アイソタイプのコントロールモロクローナ ル抗体（ファルミンゲン）を組み合わせて染色した。ＣＯＬ−１モロクローナル 抗体は、標準的な手法を用いてＦＩＴＣに結合した（３７）。細胞の蛍光は、Ｌ ｙｓｉｓＩＩソフトを用いたＦＡＣＳＣＡＮ（ベクトンディキンソン、マウンテ ンビュー、カリフォルニア州）を使用して解析した。 フローサイトメトリーによる解析：組換えＣＥＡおよびＢ７の二重発現 抗原およびＢ７−１の両方が、Ｔ細胞とＣＤ２８受容体を正しく結合させるた めに、互いに極めて隣接した位置に発現されなければならないとこれまで考えら れていたために（ジェンキンズ、Ｍ．Ｋ.ら、Current Opinion in Immunol．５ ：３６１−３６７，１９９３；ハスコック、Ｋ．Ｓ.ら、J.Exp.Med．１８０：６ ３１−６４０，１９９４；ヘルストローム、Ｋ．Ｅ.ら、Ann.NY Acad.Sci.６９ ０：２２５−２３０，１９９３：ハーヂング，Ｆ．Ａ.ら、J.Exp.Med．１７７： １７９１−１７９６，１９９３）、ｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７の混合物を細 胞に感染させると、細胞表面にＣＥＡおよびＢ７−１の両方の二重発現が起こる かどうかについて決定した。二重発現について決定するために、ＢＳＣ−１細胞 をｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ，Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７，またはｒＶ− ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７の３：１の混合物、またはＶ−Ｗｙｅｔｈのみで感染させ、 二色フローサイトメトリーによって解析した。Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ で感染させた細胞は、バックグランド程度の染色のみ示したが（図６Ａ）；ｒＶ −ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈで感染させた細胞は、主としてＣＥＡに対して陽性を 示した（図６Ｂ）。同様に、Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７の混合物で感染させた 細胞は、主としてＢ７−１に陽性を示した（図６Ｃ）。しかし、ｒＶ−ＣＥＡ： ｒＶ−Ｂ７で共感染させた細胞は、ＣＥＡおよびＢ７の両方に陽性を示した（図 ６Ｄ）。 実施例６ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫した後のＣＥＡ特異的な細胞傷害性の上昇 細胞溶解反応の方法： マウスを実施例４に記載したように免疫し、ＣＥＡ特異的細胞溶解活性を上記 に記載したように解析した（カンター．Ｊ.ら、J.Nat'l Cancer Inst.８４：１ ０８４−１０９１，１９９２）。簡単にいえば、脾臓を免疫後１４日目に除去し 、これを細胞１つ１つの懸濁液にして、フィコールーハイパク（Ficoll-Hypaque ）勾配にかけた。ＭＣ３８マウスコロニー形成能がある腺癌細胞系列（フォック ス，Ｂ．Ａ．ら、J ．Bio．Resp．Modifiers９：４９９−５１１，１９９０）を 、スティーブローゼンバーグ博士の研究室より（国立癌研究所、ベセスダ、メリ ーランド州）入手した。ヒトＣＥＡ、ＭＣ３８−ＣＥＡ−２を発現する誘導細胞 系列については、すでに記載されている（ロビンス、Ｐ．Ｆ．ら、Cancer Res． ５１：３６５７−３６６２，１９９１）。これらの腫瘍細胞は、¹¹¹Ｉｎを使用 した標準的な細胞溶解測定（ウンダーリッヒ、Ｊ．ら、Current Protocols in I mmunology、コリガンＪ．Ｅ．ら（編集）３．１１．１−３．１１．１４，１９ ９４）における標的として使用するために調製した。簡単に言えば、腫瘍細胞（ １−２×１０⁶）を、５０μＣｉの¹¹¹Ｉｎオキシキノリン溶液（アマシャム、ア リングトンハイツ、イリノイ州）で３７℃にて２０分間放射性標識し、それから 取り込まれなかった放射性標識されている核酸を除くために洗浄した。脾臓のリ ンパ細胞および標的細胞（５×１０³細胞／ウエル）を、ＣＴＬ培地に懸濁し（ ＲＰＭ Ｉ−１６４０のかわりに、ＲＰＭＩ−１６４０：ＥＨＡＡ ５０：５０を含む完 全培地、バイオウィッタカー、ウオーカースバイル、メリーランド州）、および Ｕ底９６穴プレート（コスター）中にてエフェクター対標的の比率が１００：１ から１２．５：１にて結合させて、１６時間３７℃にて５％ＣＯ₂とともにイン キュベートした。インキュベーションの後、上清回収システム（Ｓｋａｎｔｒｏ ｎ，スターリング、バージニア州）を使用して上清を回収し、放射活性をガンマ カウンターを使用して定量化した（コブラオートガンマ、パッカード、ダウナー ズグルーブ、イリノイ州）。¹¹¹Ｉｎの特異的な放出の比率は、標準式によって 決定した：特異的な溶解％＝［（実験において自然に起こる数）／（自然に起こ る最大数）］ｘ１００。 細胞傷害性Ｔ細胞の解析：ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫した後のＣＥＡ特異 的な細胞傷害性の増加 ｒＶ−ＣＥＡにｒＶ−Ｂ７を添加した場合のＣＥＡ特異的細胞傷害活性に対す る効果を解析するために、ｒＶ−Ｂ７およびｒＶ−ＣＥＡの混合物で免疫したマ ウス由来の脾臓リンパ細胞を、ＣＥＡに陰性なマウス腺癌細胞（ＭＣ３８）また は、ヒトＣＥＡを発現するレトロウイルスベクターを使用してＣＥＡで形質転換 した同一細胞（ＭＣ３８−ＣＥＡ−２）に対する溶解活性について試験した。図 ７は、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１）で一度免疫したマウス由来のＴ 細胞は、ＣＥＡ陰性ＭＣ３８標的細胞（黒三角）を溶解しないが、ＣＥＡ陽性Ｍ Ｃ３８−ＣＥＡ−２標的細胞（白三角）は低レベルにもかかわらず、溶解した。 このＣＥＡ特異的な溶解は、Ｅ：Ｔ比に依存しており、Ｅ：Ｔ比が１２．５：１ では１０％まで溶解は減少した。免疫源であるｒＶ−ＣＥＡにｒＶ−Ｂ７を添加 すると（ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７；３：１）、ＭＣ３８細胞の溶解には何の影 響も与えないが（黒丸）、ＭＣ３８−ＣＥＡ−２標的細胞のＣＥＡ特異的な溶解 には実質的な影響を及ぼした。溶解単位についてのデータの変換に基づくと、ｒ Ｖ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）で免疫したマウスのＣＴＬ活性は、ｒＶ−Ｃ ＥＡのみで免疫したマウスに比較して２．８倍増加していた。 実施例７ｒＶ−ＣＥＡと混合したｒＶ−Ｂ７の抗癌効果 方法 １０匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを、全部で１×１０⁷ＰＦＵのウイルスで免疫 した。免疫した後１４日後に、マウスを３×１０⁵個のＭＣ３８−ＣＥＡ−２細 胞を右わきばらに皮下注射した。少なくとも６０日のあいだ腫瘍がみられなかっ たｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）のグループのマウスを、３×１０⁵個の ＭＣ３８−ＣＲＡ−２細胞を反対側のわきばらに接種した。腫瘍は、二方向カリ パスで測定し、以前に記載したように、体積を計算した（カンター，Ｊ.ら、J ． Nat'l Cancer Inst ．８４：１０８４−１０９１，１９９２）。腫瘍が２０ｍｍ を越えたら（長さまたは幅）、すべての実験において、動物を殺した。 ｒＶ−ＣＥＡと混合したｒＶ−Ｂ７の抗癌効果 先天的なＣ５７ＢＬ／６マウスに３×１０⁵個のＭＣ３８−ＣＥＡ−２マウス の腺癌細胞を皮下注射によって投与すると、７−１４日の間に明らかな腫瘍が生 じてきて、それから急速に腫瘍が発達して最終的に致命的となるということが以 前に示されていた（カンター，Ｊ.ら、J ．Nat'l Cancer Inst．８４：１０８４ −１０９１，１９９２）。１×１０⁷ＰＦＵのｒＶ−ＣＥＡを３回免疫すること が、マウスをこの腫瘍の接種から１００％保護するために必要であることもまた 、示されていた（カンター，Ｊ.ら、J ．Nat'l Cancer Inst．８４：１０８４− １０９１，１９９２）。３：１の比率のｒＶ−ＣＥＡおよびｒＶ−Ｂ７で免疫し て、動物を腫瘍の接種から保護することが可能であるかについて決定するために 、我々は全部で１０⁷ＰＦＵのＶ−Ｗｙｅｔｈ、ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ （３：１）；Ｖ−Ｗｙｅｔｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）；またはｒＶ−ＣＥＡ：ｒ Ｖ−Ｂ７（３：１）のいずれかで一度だけ免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけ るＭＣ３８−ＣＥＡ−２腫瘍細胞の増殖を比較した。ＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞 を接種すると（図８Ａ）、１４日以内に、１０匹のＶ−Ｗｙｅｔｈで免疫した動 物すべてにおいて明らかな腫瘍が生じた。腫瘍の増殖は、この実験を行っている 間じゅう、発育し続けた。ｒＶ−ＣＥＡ：Ｖ−Ｗｙｅｔｈ（３：１；図８Ｂ）で 免疫し た動物にＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を接種すると、明らかな腫瘍がみられはじめ る時期が少し遅れて、結果的に、動物の７０％が腫瘍に陽性になった。Ｗｙｅｔ ｈ：ｒＶ−Ｂ７（３：１；図８Ｃ）で免疫した動物にＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞 を接種すると、Ｖ−Ｗｙｅｔｈで免疫したコントロールの集団の腫瘍増殖と同じ ように、明らかな腫瘍が１４日以内に生じた（図８Ａ）。反対に、ｒＶ−ＣＥＡ ：ｒＶ−Ｂ７（３：１；図８Ｄ）で一度免疫したマウスの８０％は、腫瘍を形成 しなかった。腫瘍陰性マウス（ｎ＝８）は、この実験の間じゅう、腫瘍をつくら なかった（６０日）。著しい毒性効果は、観察期間のあいだはこれらの動物に観 察されなかった。動物の体重は、年齢に相当する正常なマウスの標準偏差の中に おさまった。これらの実験はさらに３回繰り返し行って、同じ結果を得た。 腫瘍細胞に対する長い期間の継続的な免疫は、ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３ ：１）の組み合わせで免疫することによって誘導されるかどうかを決定するため に、組換えウイルスをこの比率で免疫し、少なくとも６０日間は腫瘍が形成され ない（図８Ｄ）マウスに、３×１０⁵個のＭＣ３８−ＣＥＡ−２細胞を反対のわ きばらに接種した（図９Ｂ）。コントロールの正常なマウスにＭＣ３８−ＣＥＡ −２細胞を接種すると（図９Ａ）、１４日以内にすべての動物において明らかな 腫瘍が形成され、この実験を行っている間、腫瘍の増殖が進行する一方で、先に ｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７（３：１）を投与したマウスは、さらに４９日間観察 しても、腫瘍はみられなかった（図９Ｂ）。 実施例８ｒＶ−ＰＳＡの構築および特性 組換えワクシニアウイルス ヒト前立腺特異的抗原の全オープンリーディングフレームをコードする７８６ ｂｐのＤＮＡ断片を、ヒト転移性前立腺腺癌細胞系列、ＬＮＣａＰＦＧＣ（ＣＲ Ｌ１７４０，アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ），ロックバ イル、メリーランド州）から抽出した全ＲＮＡより、逆転写ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡ ｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ノルウォーク、コ ネチカット州）によって増幅した。ＰＳＡコード配列から予測されるアミノ酸配 列は、２２０番目の残基がアスパラギンからチロシンに置換していたことだけが 異なるが、既に報告された配列と同一であることが示された（ルンドウエルら、FEBS Letters ２１４：３１７−３２２，１９８７）。ＰＳＡの全コード配列、 ５’非翻訳領域の４１ヌクレオチド、および３’非翻訳領域の５２０ヌクレオチ ドを含むＰＳＡのＤＮＡ断片を、ワクシニアウイルストランスファーベクターｐ Ｔ１１６のＸｂａＩ制限酵素部位にライゲーションした。生じたプラスミドは、 ｐＴ１００１と命名され、ワクシニアウイルス４０Ｋプロモーターの制御下にあ るＰＳＡ遺伝子（グリッツら、J.Virology、６４：５９４８−５９５７，１９９ ０）および鶏痘ウイルスＣ１プロモーターの制御下にある大腸菌ＬａｃＺ遺伝子 （ジェンキンズら、AIDS Research and Human Retroviruses、７：９９１−９９ ８，１９９１）を含む。外来遺伝子は、ワクシニアゲノムのＨｉｎｄＩＩＩＭ領 域由来のＤＮＡ配列に結合させた。ワクシニアのＷｙｅｔｈ（ニューヨーク衛生 局）株からプラーク精製した単離物を、組換えワクシニアウイルスの構築におい て親ウイルスとして使用した。組換えウイルスの作製は、Ｗｙｅｔｈワクシニア ゲノムのワクシニア配列と、ｐＴ１００１で形質転換したワクシニアに感染した ＲＫ₁₃細胞（ＣＣＬ３７，ＡＴＣＣ）中のｐＴ１００１のこれに相当する配列の あいだでの相同組換えによって生じた。組換えクローンは、以前に記載したよう に（パニカリら、Gene ４７：１９３−１９９，１９８６；カウフマンら、Int ． J．Cancer 、４８：９００−９０７，１９９１）、５−ブロモ−４−クロロ−３ −インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）の存在下においてＲ Ｋ₁₃細胞（ＣＣＬ３７，ＡＴＣＣ）の増殖によって同定し、選別した。適切な青 い組換えをおこしたコロニーを、４回プラーク精製することによって精製した。 ウイルスのストックは、感染したＲＫ₁₃細胞抽出液を、３６％ショ糖クッション によって遠心して精製することによって調製した。 ＤＮＡ組換えのサザン解析 組み換えワクシニアゲノムを、ウイルスＤＮＡの抽出、ＨｉｎｄＩＩＩおよび ＣｌａＩでの制限酵素消化、および以前に記載したようなサザンブロット（カウ フマンら、Int ．J．Cancer、４８：９００−９０７，１９９１）によって解析し た。 ＰＳＡタンパク質発現のウエスタン解析 集密のＢＳＣ−４０細胞を、野生型親株ワクシニアウイルス（Ｖ−Ｗｙｅｔｈ と呼ばれている）または組み換えワクシニアＰＳＡ（ｒＶ−ＰＳＡと呼ばれてい る）のいずれかをＭＯＩが１として２％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イー ゲル培地中で感染させた。一晩感染させた後、細胞から培地を除去し、アリコー トをメタノール沈澱して分泌されたＰＳＡの存在を測定した。感染した細胞は、 低張の溶解緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ ＥＤＴＡ，１０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ＰＭＳＦ）中に溶解し、それから超音波処理をした。細胞抽出 物と培養用培地を、ＳＤＳ１０％アクリルアミドゲルで電気泳動した。タンパク 質を、ニトロセルロース上にトランスブロットし、ブロットしたものを室温で４ 時間、ＰＳＡに特異的なウサギ抗体（ＰＯ７９８，Sigma Chemical Co.，セント ルイス、ミズーリ州）とインキュベーションし、洗浄し、それからヤギ抗ウサギ ホスファターゼ標識二次抗体（ＡＰ，Kirkegaad＆Perry Laboratories，ガイザ ースバーグ、メリーランド州）と共にインキュベートし、製造業者の手法に従っ て現像した。 組換えウイルス（ｒＶ−ＰＳＡ）の特性 ヒトＰＳＡのオープンリーディングフレームをコードしているｃＤＮＡ断片を 、ＰＳＡ特異的オリゴヌクレオチドプライマー５’ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＣＣＣＡ ＡＧＣＴＴＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡ３’（配列番号：５），５’ＴＣＴＡＧＡＴＣ ＡＧＧＧＧＴＴＧＧＣＣＡＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＴＧＡＴＣＣＡＣＴ３’（ 配列番号：６）を使用して逆転写ＰＣＲによって得て、ワクシニアウイルストラ ンスファーベクターｐＴ１１６中にラーゲーションした。このベクターは、挿入 された遺伝子産物の合成を引き起こすように、マルチクローニング部位の上流に 強力なワクシニアウイルス初期／後期プロモーター（４０Ｋと呼ばれている）を 含む。プロモーターの部位と同様に、ＰＳＡのＤＮＡ断片のライゲーションおよ び方向は、ＰＣＲおよび塩基配列決定によって確認された。キメラのベクター構 築 物を、以前に報告されたように、相同組換えによってワクシニアウイルスゲノム のＨｉｎｄＩＩＩＭ部位中に挿入し（カウフマンら、Int ．J．Cancer、４８：９ ００−９０７，１９９１）、ＰＳＡ配列およびＨｉｎｄＩＩＩＭ領域中のワクシ ニア配列に相当する³²Ｐで放射性標識したＤＮＡをプローブにしたサザン解析に よって確認した（データは示さない）。 組換えＰＳＡタンパク質の発現は、上清およびｒＶ−ＰＳＡを感染させたＢＳ Ｃ４０細胞から抽出したタンパク質のウエスタンブロット解析によって確認した 。これらの細胞は、組換えワクシニア産物を確認するのに日常的に使用している （エールら、Current Protocols in Molecular Biol.,２．１６．１５．１−１ ６．１８．９，１９９３）。ｒＶ−ＰＳＡを感染させた細胞由来の細胞上清をブ ロットしたものをウサギ抗ＰＳＡ抗体と共にインキュベーションすると、およそ ３３，０００ダルトンの一本の免疫反応するペプチドが現れた（データは示さな い）。同様に、ｒＶ−ＰＳΛを感染させた細胞由来のタンパク質抽出物をブロッ トしたものをインキュベーションすると、同じ分子量の一本のバンドが現れた（ データは示さない）。これは、ＰＳＡ分子の予測される大きさと一致する（アル ムブラスターら、Clin.Chem.３９：１８１−１９５，１９９３；ワングら、Meth ods in Cancer Research、１９：１７９−１９７，１９８２）。親株Ｖ−Ｗｙｅ ｔｈを感染させた細胞由来の上清のブロットおよびタンパク質ブロットは、ＰＳ Ａの発現は陰性であった。したがって、これらの結果は、組換えワクシニアウイ ルスは、ヒトＰＳＡ遺伝子産物を忠実に発現することが可能であることを示して いる。 実施例９ｒＶ−ＰＳＡ：ｒＶ−Ｂ７での免疫によるＰＳＡ特異的細胞傷害性の増加 細胞系列 コロニー形成能のあるマウス腺癌細胞系列であるＭＣ−３８（フォックス、Ｂ ．Ａ．ら、J ．Biol．Response Mod．９：４９９−５１１，１９９０）を、バー ナードフォクス博士より入手した（国立癌研究所、国立衛生研究所、ベネスダ、 メリーランド州）。ＬＮＣａＰヒト前立腺腺癌細胞系列（ヘルスコビッツ、Ｊ． Ｓ． ら、マーフィー，Ｇ．Ｐ．（編集）前立腺癌のモデル、ｐｐ．１１５−１３２， ニューヨーク：A.R.Liss，１９８０）を、アメリカンカルチャータイプコレクシ ョン（ロックバイル、メリーランド州）より入手した。モロニーマウス肉腫ウイ ルスレトロウイルスベクターｐＬＮＳＣ（ミラー、Ａ．Ｄ．ら、Biotechniques ７：９８０−９９０，１９８９）を、Ａ．ダスティーミラー博士より入手した（ フレッドハッチンソン癌研究所、シアトル、ワシントン州）。マウスのエコトロ ピック（ecotropic）ウイルスを保持している細胞系列ＧＰ＋Ｅ−８６（ヘスド ルファー、C．Hematol Oncol ．Clin．North Am.，５（３）：４２３−４３２， １９９１）、ＭＣ−３８，ＰＳＡ／ＭＣ−３８およびｐＬＮＳＸ／ＭＣ−３８を 、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むダルベッコ改変 イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，ガイザーバーグ、メリーラン ド州）にて維持した。ＰＳＡ／ＭＣ−３８およびｐＬＮＳＸ／ＭＣ−３８細胞系 列は、１ｍｌあたり１ｍｇのＧ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の選択圧を 常に与えている状況下において維持した。ＬＮＣａＰは、１０％ＦＢＳを含むＲ ＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で維持した。 ＰＳＡｃＤＮＡのクローニング 相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ヒト前立腺癌細胞系列であるＬＮＣａＰ由来 の全ＲＮＡよりＧｅｎｅＡｍｐＲＮＡポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）キット（Pe rkin Elmer Corp．，ノルウォーク、コネチカット州）を使用して合成した。ヒ トＰＳＡに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ４ ．１．４．コンピュータープログラム（Kodak Co．，ロチェスター，ニューヨー ク州）を使用してヒトｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０７７３０）に 基ずいて選択した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素部位を含む５’（５’ＡＧＡ ＧＡ Ｇ ＡＧＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＣＣＣ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ Ｃ ＣＡＣ ＣＴＧ ＣＡ３’）（配列番号：７）および３’（５’ＡＧＡ Ｇ ＡＧ ＡＧＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＡＧＴ ＣＣＣ ＴＣＴ ＣＣＴ ＴＡＣ Ｔ ＴＣ ＡＴ３’）（配列番号：８）を、ＰＣＲによって全長のＰＳＡｃＤＮＡを 合成するのに使用した。１．５ｋｂのＰＳＡ遺伝子を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ で 消化したｐＬＮＳＸ ＤＮＡとラーゲーションし、コンピテントＣＨα大腸菌細 胞（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を形質転換するのに使用した。アンピシリン耐性なコ ロニーについて、ベクター特異的な５’オリゴヌクレオチドプライマー（５’Ｔ ＴＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＣＴＡ ＧＧＣ ＴＴＴ ＴＧＣ ＡＡＡ３’）（配列 番号：９）および上述したＰＳＡに特異的な３’プライマーを使用してＰＣＲに よってｃＤＮＡインサートの方向を調べた。ＰＳＡｃＤＮＡがセンス方向を向い ている形質転換体を選択し、制限酵素消化によって同定し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ （United States Biochemical Corp．，クリーブランド、オハイオ州）を使用し たジデオキシ法によって塩基配列を決定した。ＰＣＲによって回収された遺伝子 の塩基配列の解析により、この遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋにあるヒトＰＳＡ遺伝 子配列と同一であることが確証された。 ＭＣ−３８標的細胞へのＤＮＡの形質転換および形質導入 ＰＳＡ／ｐＬＮＳＸプラスミド（５μｇ）を、形質転換試薬（ＤＯＴＡＰ）（ Boehringer Mannheim Biochemica，インディアナポリス、イリノイ州）を使用し て製造業者の手法に従ってＭＣ−３８細胞に形質転換した。２４時間後に、Ｇ４ １８を１００μｇ／ｍｌ（重量／体積）含む選択培地を細胞に添加した。選択圧 は、１０％ＦＢＳおよび濃度勾配のＧ４１８を（１ｍｇ／ｍｌまで）含むＤＭＥ Ｍ中において継続的に培養することによって維持した。薬剤耐性の細胞を制限希 釈によりクローニングした。クローニング壁から得た馴化培地を、固相の二重決 定タンデムＲＰＳＡ免疫放射分析（Hybritech Inc．，サンディエゴ、カリフォ ルニア州）を使用して試験した。ＰＳＡを最も効率良く分泌するクローンを、制 限希釈によって２回クローン化した。ＰＳＡ／ＭＣ−３８と命名された１つのク ローンは、およそ１０ｎｇＰＳＡ／ｍｌを生産した。 ベクターを形質導入したＰＳＡ陰性なＭＣ−３８細胞は、以下のようにして作 製した。マウスのエコトロピック（ecotropic）ウイルスを保持している細胞系 列ＧＰ＋Ｅ＋８６を、上記に記載したように、ＤＯＴＡＰ形質導入試薬を使用し て２μｇのｐＬＮＳＸベクターＤＮＡで形質導入した。２４時間後に、形質導入 した細胞を植えかえて選択培地上で増殖した（１ｍｌあたり１．０ｍｇのＧ４１ ８）。Ｇ４１８による選択を生き延びて、ｐＬＮＳＸを持っている細胞は、Ｇ４ １８が存在しない培地中でも増殖し、この培地を８μｇ／ｍｌのポリブレン（Si gma Chemical Co.,セントルイス、ミズーリ州）存在下にてＭＣ−３８細胞に添 加した。形質導入したＭＣ−３８細胞は、Ｇ４１８存在下において３週間成育し た。個々の薬剤耐性コロニーを無菌的なクローニングリングによって単離し、ｐ ＬＮＳＸの存在をＰＣＲによって同定した。１つのクローンがｐＬＮＳＸ／ＭＣ −３８であり、これをさらなる実験に使用した。 細胞傷害反応の方法 マウスを、実施例６に記載した基本的な手法を使用してｒＶ−ＰＳＡで免疫し た。実施例８に記載したように作製したｒＶ−ＰＳＡは、Therion Biologics Co rporation，ケンブリッジ、マサチューセッツ州から入手した。上記およびカー ル，Ｊ．Ｆ．ら（Cancer Reserch，印刷中）に記載されているのヒトＰＳＡを発 現するコロニー形成能のあるＭＣ３８マウス腺癌細胞系列（ＭＣ３８−ＰＳＡ） を、抗原特異的な標的として使用した。 細胞傷害性Ｔ細胞の解析：ｒＶ−ＰＳＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫したことによるＰＳ Ａ特異的な細胞傷害性の増加 ｒＶ−ＰＳＡにｒＶ−Ｂ７を添加した場合のＰＳＡ特異的細胞傷害性活性に対 する効果を解析するために、ｒＶ−Ｂ７およびｒＶ−ＰＳＡの混合物で免疫した マウス由来脾臓リンパ細胞を、ＰＳＡに陰性なマウス腺癌細胞（ＭＣ３８）また はＰＳＡで形質導入した同じ細胞（ＭＣ３８−ＰＳＡ）について溶解活性を試験 した。図１０は、ｒＶ−ＰＳＡで一度免疫したマウス由来のＴ細胞は、ＰＳＡ陰 性なＭＣ３８標的細胞を溶解しないが、ＰＳＡ陽性なＭＣ３８−ＰＳＡ標的細胞 は溶解することを示している。免疫源であるｒＶ−ＰＳＡにｒＶ−Ｂ７を添加し ても、ＭＣ３８細胞の溶解には影響を及ぼさないが、ＭＣ３８−ＰＳＡ標的細胞 のＰＳＡ特異的な溶解に対しては実際に影響を及ぼす（図１０）。溶解の特異性 は、異なる抗原であるｒＶ−ＣＥＡ：ｒＶ−Ｂ７で免疫したマウスのＴ細胞は、 ＭＣ３８−ＰＳＡ標的細胞を溶解しないということからもさらに示された。 実施例１０癌にかかっている哺乳動物を治療するためのＣＥＡ抗原に由来する免疫原性ペプ チドに感作したリンパ細胞の使用 前もってＣＥＡ抗原に感作させたＴリンパ細胞は、癌にかかっている哺乳動物 を治療するのに効果的である場合がある。Ｔリンパ細胞は、末梢血液または腫瘍 懸濁液由来で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した（カワカミ、Ｙ，ら（１９８８）J. Exp ．Med． １６８：２１８３−２１９１）。Ｔリンパ細胞は、濃度が１−１０ ＭＯＩでおよそ１−１６時間のあいだ、ＣＥＡ関連抗原を発現する組換えウイル スおよび／またはＢ７．１および／またはＢ７．２を発現する組換えウイルスを 感染させた細胞にさらす。抗原にさらされたＴリンパ細胞を、哺乳動物、好適に はヒトにおよそ１０⁷−１０¹²個のリンパ細胞を投与する。リンパ細胞は、静脈 内、腹膜内、または病気の部分に投与される。この処置は、Ｔリンパ細胞治療と 組み合わせて、サイトカイン、放射治療、腫瘍部分の外科的除去および化学治療 薬剤のような他の治療的処置と同時に投与できる。 本発明はある特定の態様に関連して上記に記載したが、さまざまに改変するこ とが可能で、別の材料および試薬を本発明から逸脱しないように使用することが 可能である。ある場合には、このような改変および代用は、いくらか実験を必要 とするかも知れないが、日常的な実験のみ含むと考えられる。 特定の態様の詳細な記載は、本発明の一般的な特性を十分に明らかにしており 、最新の知識を適応することによって研究者は遺伝学的な概念から逸脱すること なくこのような特定の態様を容易に改変および／またはさまざまな応用に適応さ せることが可能であり、それゆえ、このような適応および改変は、記載した態様 に相当する内容および範囲内において理解されると考えられる。 参照したすべての参考文献および特許は、本明細書中に参考文献として取り入 れている。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項 【提出日】１９９６年５月２８日 【補正内容】 １５． 細胞が腫瘍細胞、遺伝的に欠陥のある細胞、または病原性微生物に感 染した細胞である、請求項１４に記載の方法。 １６． インビボで病的状態の細胞を請求項１に記載の組成物の有効量で直接 感染させることを含む、哺乳動物の病的状態の細胞に対する免疫応答を強化する 方法。 １７． Ｂ７−１をコードする遺伝子またはその一部とＢ７−２をコードする 遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組 み換えワクシニアウイルスを含む組み換えワクシニアウイルス。 １８． 病的状態の抗原に特異的な抗体またはその抗原結合片を含み、請求項 １に記載の組成物にとる免疫感によって引き出される抗体またはその抗原結作合 断片。 １９． 病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、Ｂ７ ．１、Ｂ７．２、あるいはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子またはその一 部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルス。 ２０． 抗原が腫瘍関連抗原である請求項１９に記載の組み換えウイルス。 ２１． 腫瘍関連抗原が、胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍ ａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒ ｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝 子、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項２０に記載の組み換 えウイルス。 ２２． ＩＬ−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔ ＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびそれらの組み合わせから成る群 から選択される免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部をさら に含む、請求項１９〜２１に記載の組み換えウイルス。 ２３． 抗原がＣＥＡである、請求項２０に記載の組み換えウイルス。 ２４． 胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ １００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ− ２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、ＴＡＧ−７２、ＨＩＶ抗原 、肝炎ウイルス抗原、ヒトパピローマウイルス抗原、ウマ脳炎ウイルス抗原、単 純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、非ホドキンリンパ腫抗 原、白血病抗原、ホドキンリンパ腫抗原、肺癌抗原、肝臓癌抗原、黒色腫抗原、 腺癌抗原、胸腺腫抗原および肉腫抗原から成る群から選択される病的状態の抗原 をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、ＩＬ−２、Ｂ７．１、Ｂ７．２ 、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２およ びそれらの組み合わせから成る群から選択される免疫刺激分子をコードする１以 上の遺伝子またはその一部とを、ウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んで いる組み換えウイルス。 ２５． 単独のあるいは外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイ ルス薬または抗菌薬と組み合わせた請求項１９〜２３または２４に記載の組み換 えウイルスと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。 ２６ 病的状態の抗原を反映する結合部位を有する抗体をコードする１以上 の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第 １の組み換えウイルスと、免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその 一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第２の組み換えウイル スとを単独で、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス 薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物。 ２７． 病的状態の抗原を反映する結合部位を有する抗体をコードする１以上 の遺伝子またはその一部と、免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはそ の一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルス 。 ２８． 単独のあるいは外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイ ルス薬または抗菌薬と組み合わせた請求項２７に記載の組み換えウイルスと、薬 学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。 【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年９月１３日 【補正内容】 請求の範囲 １． 病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその１部をウイルス ゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第１の組み換えウイルスと、Ｂ７．１ 、Ｂ７．２、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする１以上の遺伝子またはその 一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第２の組み換えウイル スとを単独で含むか、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウ イルス薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物であって、当該組成物が宿主細 胞に同時感染して、病的状態の抗原をコードする遺伝子と、Ｂ７．１、Ｂ７．２ 、またはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子との同時発現を生じることがで きる上記の組成物。 ２． 第１の組み換えウイルス、第２の組み換えウイルス、または第１および 第２のウイルスがレトロウイルス、鶏痘、カナリア痘、豚痘、アデノウイルス、 ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスから成る群から選択される、請求項１ に記載の組成物。 ３． 病的状態が癌または病原性微生物である、請求項１に記載の組成物。 ４． 癌が原発性または転移性である、請求項３に記載の組成物。 ５． 癌が非ホドキンリンパ腫、白血病、ホドキンリンパ腫、肺癌、肝臓癌、 黒色腫、腺癌、胸腺腫および肉腫から成る群から選択される、請求項４に記載の 組成物。 ６．病原性微生物がウイルス、バクテリウム、原生動物、または酵母である、 請求項３に記載の組成物。 ７． 病原性ウイルスが、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、 ウマ脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスである 、請求項６に記載の組成物。 ８． 抗原が腫瘍関連抗原である、請求項４に記載の組成物。 ９． 腫瘍関連抗原が、胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍａ ｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ −２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子 、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項８に記載の組成物。 １０． 第２の組み換えウイルスが、免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝 子またはその一部をさらに含み、該免疫刺激分子が、ＩＬ−２、ＩＣＡＭ−１、 ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ −６およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の組 成物。 １１． 抗原がＣＥＡである、請求項１０に記載の組成物。 １２． 請求項１に記載の組成物の有効量を単独で、または外因の免疫刺激分 子と組合わせて哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の病気を防止する方法で あって上記量が上記病的状態を防止または改善するのに有効である上記の方法に おいて使用するための請求項１に記載の組成物。 １３． 請求項１に記載の組成物および薬学的に許容できる担体を含む医薬組 成物。 １４． 請求項１に記載の組成物によってインビトロで病的状態の細胞を感染 させ、上記感染した細胞を病的状態の細胞に罹患した哺乳動物に投与することを 含む、哺乳動物の病的状態の細胞に対する免疫応答を強化する方法において使用 するための請求項１に記載の組成物。 １５． 細胞が腫瘍細胞、遺伝的に欠陥のある細胞、または病原性微生物に感 染した細胞である、請求項１４に記載の方法。 １６． インビボで病的状態の細胞を請求項１に記載の組成物の有効量で直接 感染させることを含む、哺乳動物の病的状態の細胞に対する免疫応答を強化する 方法において使用するための請求項１に記載の組成物。 １７． Ｂ７−１をコードする遺伝子またはその一部とＢ７−２をコードする 遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組 み換えワクシニアウイルスを含む組み換えワクシニアウイルス。 １８． 病的状態の抗原と類似する結合部位を有する抗体またはその結合部位 を含み、請求項１に記載の組成物による免疫感作によって引き出される抗体また はその結合部位。 １９． 病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、Ｂ７ ．１、Ｂ７．２、あるいはＢ７．１とＢ７．２をコードする遺伝子またはその一 部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルス。 ２０． 抗原が腫瘍関連抗原である請求項１９に記載の組み換えウイルス。 ２１． 腫瘍関連抗原が、胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍ ａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒ ｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝 子、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項２０に記載の組み換 えウイルス。 ２２． ＩＬ−２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｔ ＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ−６およびそれらの組み合わせから成る群 から選択される免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部をさら に含む、請求項１９〜２１に記載の組み換えウイルス。 ２３． 抗原がＣＥＡである、請求項２０に記載の組み換えウイルス。 ２４． 胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍａｇｅ−３、ｇｐ １００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ−２、Ｍｕｃ− ２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子、ＴＡＧ−７２、ＨＩＶ抗原 、肝炎ウイルス抗原、ヒトパピローマウイルス抗原、ウマ脳炎ウイルス抗原、単 純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザウイルス抗原、非ホドキンリンパ腫抗 原、白血病抗原、ホドキンリンパ腫抗原、肺癌抗原、肝臓癌抗原、黒色腫抗原、 腺癌抗原、胸腺腫抗原および肉腫抗原から成る群から選択される病的状態の抗原 をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、Ｂ７．１、Ｂ７．２、またはＢ ７．１とＢ７．２をコードする１以上の遺伝子またはその一部とを単独、あるい はＩＬ−２、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ −１２、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−６およびそれらの組み合わせから成る群から選択 される免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部と組み合わせて 、ウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルス。 ２５． 単独のあるいは外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイ ルス薬または抗菌薬と組み合わせた請求項１９〜２３または２４に記載の組み換 えウイルスと、薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。 ２６ 病的状態の抗原に類似する結合部位を有する抗体をコードする１以上 の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第 １の組み換えウイルスと、Ｂ７．１、Ｂ７．２またはＢ７．１とＢ７．２をコー ドする１以上の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り 込んでいる第２の組み換えウイルスとを単独で、または外因の免疫刺激分子、化 学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物。 ２７． 病的状態の抗原に類似する結合部位を有する抗体をコードする１以上 の遺伝子またはその一部と、Ｂ７．１、Ｂ７．２またはＢ７．１とＢ７．２をコ ードする１以上の遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に 取り込んでいる組み換えウイルス。 ２８． 単独のあるいは外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイ ルス薬または抗菌薬と組み合わせた請求項２７に記載の組み換えウイルスと、薬 学的に許容できる担体とを含む医薬組成物。 ２９． 宿主細胞が抗原提示細胞である、請求項１に記載の組成物。 ３０． 病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイル スゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第１の組み換えウイルスと、Ｂ７． １、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα 、ＩＮＦγおよびＩＬ−１２から成る群から選択される免疫刺激分子をコードす る１以上の遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込 んでいる第２の組み換えウイルスとを、単独であるいは外因の免疫刺激分子、化 学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物であ って、当該組成物が宿主細胞に同時感染して、病的状態の抗原をコードする遺伝 子と、免疫刺激分子をコードする遺伝子との同時発現を生じることができる上記 の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＹ Ａ６１Ｋ 45/00 ＡＤＹ 48/00 ＡＤＸ 48/00 ＡＤＸ Ｃ１２Ｎ 7/01 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 カンター，ジュディス アメリカ合衆国メリーランド州20850，ロ ックヴィル，ラークスパー・テラス 1096

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイルス ゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第１の組み換えウイルスと、免疫刺激 分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一 部中に取り込んでいる第２の組み換えウイルスとを単独で含むか、または外因の 免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせ て含む組成物。 ２． ウイルスがレトロウイルス、鶏痘、カナリア痘、豚痘、アデノウイルス 、ワクシニアウイルスおよびポリオウイルスから成る群から選択される、請求項 １に記載の組成物。 ３． 病的状態が癌または病原性微生物である、請求項１に記載の組成物。 ４． 癌が原発性または転移性である、請求項３に記載の組成物。 ５． 癌が非ホドキンリンパ腫、白血病、ホドキンリンパ腫、肺癌、肝臓癌、 黒色腫、腺癌、胸腺腫および肉腫から成る群から選択される、請求項４に記載の 組成物。 ６． 病原性微生物がウイルス、バクテリウム、原生動物、または酵母である 、請求項３に記載の組成物。 ７． 病原性ウイルスが、ＨＩＶ、肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、 ウマ脳炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスである 、請求項６に記載の組成物。 ８． 抗原が腫瘍関連抗原である、請求項４に記載の組成物。 ９． 腫瘍関連抗原が、胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍａ ｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒｂ −２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝子 、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項８に記載の組成物。 １０． 免疫刺激分子が、ＩＬ−２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、Ｌ ＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ− ６およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１に記載の組成 物。 １１． 抗原がＣＥＡであり、免疫刺激分子がＢ７．１、Ｂ７．２あるいはＢ ７．１とＢ７．２である、請求項１０に記載の組成物。 １２． 請求項１に記載の組成物の有効量を単独で、または外因の免疫刺激分 子と組み合わせて哺乳動物に投与することを含む哺乳動物の病気を防止する方法 であって、上記量が上記病的状態を防止または改善するのに有効である上記の方 法。 １３． 請求項１に記載の組成物および薬学的に許容できる担体を含む医薬組 成物。 １４． 請求項１に記載の組成物によってインビトロで病的状態の細胞を感染 させ、上記感染した細胞を病的状態の細胞に罹患した哺乳動物に投与することを 含む、哺乳動物の病的状態の細胞に対する免疫応答を強化する方法。 １５． 細胞が腫瘍細胞、遺伝的に欠陥のある細胞、または病原性微生物に感 染した細胞である、請求項１４に記載の方法。 １６． インビボで病的状態の細胞を請求項１に記載の組成物の有効量で直接 感染させることを含む、哺乳動物の病的状態の細胞に対する免疫応答を強化する 方法。 １７． Ｂ７−１をコードする遺伝子またはその一部、Ｂ７−２をコードする 遺伝子またはその一部、またはＢ７−１とＢ７−２とをコードする遺伝子または その一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えワクシニ アウイルスを含む組み換えワクシニアウイルス。 １８． 病的状態の抗原に特異的な抗体またはその抗原結合断片を含み、請求 項１に記載の組成物による免疫感作によって引き出された抗体またはその抗原結 合断片。 １９． 病的状態の抗原をコードする１以上の遺伝子またはその一部と、免疫 刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその一部とをウイルスゲノムまたは その一部中に取り込んでいる単独、またはまたは外因の免疫刺激分子、化学療法 薬、抗生物質、抗ウイルス薬または抗菌薬と組み合わせた組み換えウイルス。 ２０． 抗原が腫瘍関連抗原である請求項１９に記載の組み換えウイルス。 ２１． 腫瘍関連抗原が、胎児腫瘍性抗原、ＭＡＲＴ−１、Ｍａｇｅ−１、Ｍ ａｇｅ−３、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＣＡ−１２５、ｅｒ ｂ−２、Ｍｕｃ−１、Ｍｕｃ−２、点変異ｒａｓ癌遺伝子、点変異ｐ５３癌遺伝 子、およびＴＡＧ−７２から成る群から選択される、請求項２０に記載の組み換 えウイルス。 ２２． 免疫刺激分子が、ＩＬ−２、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＣＡＭ−１、Ｌ ＦＡ−３、ＣＤ７２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、ＩＮＦγ、ＩＬ−１２、ＩＬ− ６およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項１９に記載の組 み換えウイルス。 ２３． 抗原がＣＥＡであり、免疫刺激分子がＢ７．１、Ｂ７．２あるいはＢ ７．１とＢ７．２である、請求項２０に記載の組み換えウイルス。 ２４． 請求項１９に記載の組み換えウイルスと薬学的に許容できる担体とを 含む医薬組成物。 ２５． 病的状態の抗原を反映する結合部位を有する抗体をコードする１以上 の遺伝子またはその一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第 １の組み換えウイルスと、免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはその 一部をウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる第２の組み換えウイル スとを単独で、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス 薬または抗菌薬と組み合わせて含む組成物。 ２６． 病的状態の抗原を反映する結合部位を有する抗体をコードする１以上 の遺伝子またはその一部と、免疫刺激分子をコードする１以上の遺伝子またはそ の一部とをウイルスゲノムまたはその一部中に取り込んでいる組み換えウイルス 単独、または外因の免疫刺激分子、化学療法薬、抗生物質、抗ウイルス薬または 抗菌薬と組み合わせた上記組み換えウイルス。