KR20170138996A - 고형 종양을 위한 단일면역요법으로서 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합된 불활성화 비복제성 변형 백시니아 바이러스 안카라의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감염가능하지만 비복제성인 불활성화 변형 백시니아 안카라(MVA) 및 악성 고형 종양의 치료를 위한 단독 또는 면역 체크포인트 차단제와의 조합의 면역요법으로서의 그 용도에 관한 것이다. 구체적 실시형태는 고형 악성 종양으로 진단된 개체에서 면역 반응을 유도하는 것에 관련된다.

Description

고형 종양을 위한 단일면역요법으로서 또는 면역 체크포인트 차단제와 조합된 불활성화 비복제성 변형 백시니아 바이러스 안카라의 용도

본 출원은 2015년 2월 25일에 출원된 미국 가출원 62/120,862호에 대한 우선권을 주장한다. 상기 가출원의 전체 내용은 그 전체가 참고로 본원에 포함된다.

본 명세서에 개시된 연구는 국립보건원에 의해 수여된 교부금 No. K08AI073736 및 No. R56 AI095692에 의해 지원되었을 수 있다. 미국 정부는 본 발명에서 권리를 가질 수 있다.

본 발명은 일반적으로 종양학, 바이러스학 및 면역요법에 관련된다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폭스바이러스(Poxvirus), 구체적으로는 감염가능(infection-competent)하지만 비복제성이며 예를 들어 열 또는 자외선(UV) 조사에 의해 추가 변형된 불활성화 변형 백시니아 안카라 바이러스(vaccinia Ankara virus)("불활성화-MVA")의 용도에 관한 것이다. 이 불활성화 MVA는 단일요법으로서 또는 면역 체크포인트(immune checkpoint) 차단 치료법과 조합된 병용 요법으로서 암의 치료를 위한 면역치료제로서 사용될 수 있다.

면역계 및 암

악성 종양은 본래 종래의 치료법에 저항성이며 상당한 치료적 어려움을 제공한다. 면역요법은 발전하는 연구 분야가 되었으며 소정의 암 유형의 치료를 위한 추가적인 선택이 되었다. 면역요법 접근법은 면역계가 종양 세포를 식별하고 종양 세포를 파괴하기 위해 표적화하도록 자극될 수 있다는 논리에 의존한다.

많은 연구들은 암 진행에서 면역계 성분의 차등적 존재의 중요성을 지지한다[1]. 임상 데이터는 고밀도의 종양-침윤성 림프구가 개선된 임상 결과에 연관됨을 제안한다[2]. 강한 림프구 침윤과 환자 생존 사이의 상관성은 흑색종, 난소, 두경부, 유방, 요로상피, 대장, 폐, 간세포, 담낭 및 식도 암을 비롯한 다양한 유형의 암에서 보고되었다[3]. 종양 면역 침윤물은 대식세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, 천연 킬러(NK) 세포, 미감작 및 기억 림프구, B 세포 및 종양 세포에 의해 발현된 항원의 인식 및 T 세포에 의한 종양 세포의 후속 파괴를 주로 책임지는 이펙터(effector) T 세포(T 림프구)를 포함한다.

암세포에 의한 항원의 제시 및 잠재적으로 종양 세포에 대해 반응할 수 있는 면역 세포의 존재에도 불구하고, 많은 경우에, 면역계는 활성화되지 않는다. 이 현상의 핵심은 종양이 면역계의 다른 세포를 억제하기 위하여 면역계의 세포들을 강제하여 그 자신을 면역 반응으로부터 보호하는 능력이다. 예를 들어, CD4⁺ T 세포는 T 조절(Treg) 세포로 분화하는 능력을 보유하며, 이들은 활성화된 T 세포를 억제하는 능력을 가진다. 부가적으로, 암세포는 CD8⁺ T 세포 이펙터 기능을 손상시켜, 항종양 면역 반응의 회피를 유도할 수 있다. 마지막으로, 면역 교정(immune editing)과 함께, 종양 미세환경의 국소적인 면역억제 특성은 표적 항원을 발현하지 않는 암세포 하위집단의 탈출을 유도할 수 있다. 면역계의 항종양 활성의 보존 및/또는 회복을 가능하게 하는 방법을 찾는 것은 매우 중요하다.

타입 I IFN은 숙주 항종양 면역에서 중요한 역할을 하는 것으로 확립되었다[4]. IFNAR1-결핍 마우스는 종양 세포의 이식 후 종양 발생에 더 민감하다. 자발적인 종양-특이적 T 세포 프라이밍(priming) 또한 IFNAR1-결핍 마우스에서 결함이 있다[5, 6]. 보다 최근의 연구는 세포기질 DNA-센싱(sensing) 경로가 선천적 면역계에 의한 종양-유래 DNA의 인식에서 중요함을 보여주었다. 결과적으로, 이것은 항종양 CD8⁺ T 세포 면역의 발달을 유도한다[7]. 이 경로는 또한 방사선-유도 항종양 면역에서 중요한 역할을 한다[8].

흑색종

치명적인 암 중 하나인 흑색종은 미국과 전세계에서 가장 빨리 성장하는 암이다. 그 발생률은 1980년 이후 젊은 백인 여성 사이에서 50% 증가하였으며, 주로 과다한 햇빛 노출과 일광욕용 베드의 사용으로 인해서이다. 미국 암협회에 따르면, 미국에서 2016년에 대략 76,380명의 사람들이 흑색종으로 진단받고 10,130명의 사람들(또는 시간 당 한 사람)이 흑색종으로 사망할 것으로 예상된다. 대부분의 경우에, 진행된 흑색종은 화학요법과 방사선을 비롯한 종래의 치료법에 저항성이다. 그 결과, 전이성 흑색종을 가진 사람들은 예후가 매우 좋지 못하며, 기대 수명이 단지 6 내지 10개월이다. 흑색종의 약 50%가 BRAF(핵심 종양-촉진 유전자)에서 돌연변이를 가진다는 발견은 이 질병에서 표적화 치료법을 위한 기회를 제공하였다. BRAF 억제제를 이용한 초기 임상 시험은 BRAF 돌연변이를 가진 흑색종 환자에서 주목할만하지만, 불행히도 지속적이지 못한 반응을 보여주었다. 따라서, 이들 환자 및 BRAF 돌연변이가 없는 흑색종 환자를 위한 대안적인 치료 전략이 절실하게 필요하다.

인간 병리학 데이터는 흑색종 병변 내의 T 세포 침윤물의 존재가 더 긴 환자 생존과 긍정적으로 상관됨을 나타낸다[9]. 흑색종으로부터의 보호에서 면역계의 중요성은 개별적으로 또는 조합되어 사용된 항-CTLA-4 및 항-PD-1/PD-L1을 비롯한 면역 체크포인트 차단 치료법에 대한 전이성 흑색종을 가진 환자의 전례없는 임상 반응뿐만 아니라[11-17] 면역 활성자 IFN-α2b 및 IL-2와 같은 면역요법의 부분적 성공[10]에 의해 추가로 지지된다. 하지만, 많은 환자는 면역 체크포인트 차단 치료법 단독에 대해 반응하지 않는다. 바이러스요법(virotherapy)의 추가가 면역 체크포인트 차단에 대한 저항성을 극복할 수도 있으며, 이는 동물 종양 모델에 의해 지지된다[18].

　

폭스바이러스

조작된 백시니아 바이러스와 같은 폭스바이러스는 전이암을 위한 암용해 요법(oncolytic therapy)로서 선두에 있다[19]. 백시니아 바이러스는 대형 DNA 바이러스이며, 빠른 생애 주기를 가진다[20]. 폭스바이러스는 암세포에서 다수의 트랜스유전자를 발현하고 따라서 치료 효능을 향상시키기 위한 벡터로서 매우 적합하다[21]. 전임상 연구 및 임상 시험은 암용해 백시니아 바이러스 및 다른 폭스바이러스를 종래의 치료법에 저항성인 진행된 암의 치료를 위해 사용하는 것의 효능을 입증하였다[22-24]. 폭스바이러스계 암용해 치료법은 세포 용해, 어팝토시스(apoptosis) 및 괴사의 조합을 통해 암세포를 사멸시키는 효과를 가진다. 이는 또한 종양으로의 면역 세포의 모집 및 항종양 획득 면역 반응의 발달을 촉진하는 선천적 면역 센싱 경로를 유발한다. 임상 시험에서 현재의 암용해 백시니아 균주(예를 들어, JX-594)는 종양 선택성을 향상시키기 위하여 티미딘 키나아제가 결실되고, 면역 반응을 자극하기 위하여 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)와 같은 트랜스유전자의 발현을 가진 야생형 백시니아를 이용한다[21]. 하지만, 많은 연구는 야생형 백시니아는 항원 제시 세포(APC)에 대해 면역 억제 효과를 가지며[25-28] 따라서 종양 자체의 면역억제 및 면역회피 효과에 부가됨을 보여주었다.

폭스바이러스는 다수의 선천적 면역 시그널링 경로의 세포외 및 세포내 성분을 금지하는 단백질을 인코딩함으로써 다수의 선천적 면역 시그널링 경로를 회피하고 길항하는데 특히 능숙하다[29]. 변형 백시니아 바이러스 안카라(MVA)는 닭 배아 섬유아세포에서의 연속 계대를 통해 개발된 약독화 백시니아 바이러스이다. MVA는 모 백시니아 게놈의 31-kb 결실을 가지며 WHO-지원 천연두 박멸 캠페인 동안 백신으로서 성공적으로 사용되었다[30-32]. MVA는 암뿐만 아니라 HIV, 결핵, 말라리아, 인플루엔자 및 코로나바이러스에 대한 백신 벡터로서 방대하게 조사되었다[33-38].

MVA는 선천적 면역 반응을 조절하는데 관여하는 K1L, N1L, 및 A52R를 비롯한 여러 세포내 면역조절 유전자가 결실되거나 절단되어 있다[39-46]. 다른 한편으로는, MVA는 핵심 백시니아 발병력 인자인 이기능성 Z-DNA/dsRNA 결합 단백질을 인코딩하는 E3L 유전자를 보유한다[47-55]. 인간 단핵구-유래 수지상 세포의 MVA 감염이 DC 활성화를 야기하는 것으로 나타났다[56]. Waibler 등[57]은 쥐 Flt3L-DC의 MVA 감염이 TLR-독립적 타입 I IFN 반응을 유발하였음을 보고하였다. 또한, 인간 대식세포의 MVA 감염은 TLR2/TLR6/MyD88 및 MDA5/MAVS-의존성 경로를 통해 타입 I IFN 및 프로-염증성 사이토카인 및 케모카인을 유발한다[58].

세포기질에서 DNA의 센싱은 세포 스트레스 반응 뿐만 아니라 타입 I IFN 및 사이토카인의 생산을 유도하는 사건들의 캐스캐이드를 유발한다. STING (IFN 유전자의 자극인자)는 세포기질 DNA-센싱 경로를 위해 중요한 어댑터(adaptor)로 확인되었다[59-61]. DNA 센서의 특성은 중요한 DNA 센서로서 사이클릭 GMP-AMP 신타제(cGAS) 및 GpA 단계에서 예상치못한 2',5' 연결 및 ApG 단계에서 표준 3',5' 연결을 함유하는 그 생성물 사이클릭 GMP-AMP를 발견할 때까지는 규정되지 못했다[62-68]. 후속 연구는 cGAMP에 의해 활성화되어, 인터페론 반응을 유도하는 키나제 및 전사 인자에 관련된 다운스트림 사건들의 캐스캐이드를 매개하는 핵심 어댑터로서 STING을 확인하였다[66, 68, 69]. 본 발명자들은 쥐의 통상적인 수지상 세포의 MVA 감염이 세포기질 DNA 센서 cGAS, 그의 어댑터 STING, 및 전사 인자 IRF3 및 IRF7에 의해 매개된 세포기질 DNA-센싱 경로를 통해 타입 I IFN을 유도함을 보고하였다. 대조적으로, 야생형 백시니아 바이러스는 이 경로를 활성화시키지 못한다. 꼬리 정맥 주사를 통한 MVA의 정맥내 접종은 WT 마우스에서 타입 I IFN 분비를 유도하였으며, 이는 STING 또는 IRF3-결핍 마우스에서는 감소되었다[70]. 또한, 본 발명자들은 백시니아 발병력 인자 E3 및 N1이 세포기질 DNA-센싱 경로에서 억제 역할을 함을 보여주었다[70].

일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 고형 악성 종양을 가진 개체의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 불활성화 변형 백시니아 안카라(불활성화 MVA)를 종양의 세포에 전달하여 종양을 치료하는 것을 포함한다.

다른 양태에서, 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하기에 효과적인 양의 불활성화-MVA를 개체의 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는, 개체에서 고형 악성 종양을 치료하기 위한 방법이 제공된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에서 악성 종양을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하기에 효과적인 양의 불활성화-MVA를 개체의 종양 세포에 전달하고, 이와 함께 종양에 의해 발현된 면역 체크포인트를 차단하기에 효과적인 면역 체크포인트 차단제의 제2 양을 개체에게 투여하는 것을 조합하여, 종양을 치료하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용될 때, "전달"은 "투여"를 의미하며, 전자는 대부분 불활성화 MVA와 관련하여 사용되며, 후자는 면역 체크포인트 차단제와 관련하여 사용된다.

반대로 명시되지 않으면, 이하에서 개시되는 실시형태가 전술한 양태의 각각에 관련되며 추가의 또는 보다 구체적인 실시형태의 특징이 특정 양태 내에서 개별적으로 제시될 수 있거나 그들 중 하나 이상이 조합될 수 있음이 이해될 것이다.

일부 실시형태에서, 불활성화 MVA의 양은 하기 중 하나 이상을 이루는데 효과적이다:

a. 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도;

b. 종양의 크기 감소;

c. 종양의 박멸;

d. 종양의 성장 억제;

e. 종양의 전이 억제; 및

f. 전이성 종양의 감소 또는 박멸.

일부 실시형태에서, 치료된 종양은 불활성화 MVA 전달 부위에 위치한 종양, 또는 상기 부위 및 개체 신체 내의 그 밖의 곳 둘 모두에 위치한 종양을 포함한다. 즉, 불활성화 MVA가 개체의 고형 종양 중 단지 하나 또는 단지 다수에만 전달될 수 있다 하더라도, MVA 전달의 효과는 전신적이다.

보다 구체적인 실시형태에서, 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 포함한다:

a. 종양 내 및/또는 종양-배수(tumor-draining) 림프절 내의 세포독성 CD8⁺ T 세포의 증가;

b. 타입 I IFN의 유도를 통해 상기 종양을 침윤하는 수지상 세포의 성숙 유도;

c. 종양 내에서 또는 전신적으로 종양 세포를 인식하는 개체 내 활성화 CD4⁺ 이펙터 T 세포의 유도;

d. 종양 내의 면역 억제(조절) CD4⁺ T 세포의 감소; 및

e. 종양 세포가 그들의 표면 상에 MHC 클래스 I을 발현하고 타입 I IFN 및 다른 염증성 사이토카인 및 케모카인 중 하나 이상을 생산하도록 유도.

일부 실시형태에서, 종양은 원발성 또는 전이성 흑색종 또는 원발성 또는 전이성 결장 암종이다.

일부 실시형태에서, 개체는 인간이다.

일부 실시형태에서, 불활성화 MVA의 전달은 떨어진 시간 간격으로 반복되며; 보다 구체적인 실시형태에서, 효과가 지속되는 한 또는 최대 내약 용량이 도달될 때까지 반복 전달은 수 주, 수 개월 또는 수년 동안 또는 무기한으로 계속되며; 추가 실시형태에서, 불활성화 MVA의 전달은 한달에 한번 내지 1주에 2회 범위 내의 빈도로 반복되며; 일부 보다 구체적 실시형태에서, 전달은 매주 한번 반복된다.

일부 실시형태에서, 불활성화 MVA의 전달은 비경구 경로에 의해서이며; 보다 구체적인 실시형태에서는 종양내 주사 또는 정맥내 주사에 의해서이다.

일부 실시형태에서, 불활성화-MVA는 약 10⁵ - 10¹⁰ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되며; 보다 구체적인 실시형태에서, 약 10⁶ 내지 약 10⁹ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달된다.

일부 실시형태에서, 불활성화 MVA는 UV-불활성화 MVA이며; 다른 실시형태에서는, 열-불활성화 MVA이며; 또 다른 실시형태에서는, 열- 및 UV-불활성화 MVA의 조합이다.

일부 실시형태에서, 이펙터 T 세포의 유도 및 활성화는 상기 종양에서 조절 CD4⁺ 세포의 감소를 수반하며; 일부 실시형태에서, 불활성화-MVA는 타입 I IFN의 유도를 통해 상기 종양을 침윤하는 수지상 세포의 성숙을 유도하며; 일부 실시형태에서, 불활성화 MVA는 감염된 종양 세포에서 MHC 클래스 I의 발현 및 타입 I 인터페론 및 다른 염증성 사이토카인과 케모카인 중 하나 이상의 유도를 유도한다.

일부 실시형태에서, 유도된 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 일으키거나 기여한다: 종양 크기 감소, 종양 박멸, 종양 또는 전이성 성장 억제. 다시, 종양은 불활성화 MVA로 감염된 종양에 국한되지 않는다.

상기에 언급된 세 번째 양태 내의 구체적 실시형태는 전술한 것과 하기와 같은 추가의 것들을 포함한다:

일부 실시형태에서, 불활성화 MVA의 전달은 종양내 주사에 의해서이며 면역 체크포인트 차단제의 투여는 정맥내 경로에 의해서이며; 다른 실시형태에서, 전달 및 투여는 둘 모두 정맥내 경로에 의해서이며; 또 다른 실시형태에서, 전달 및 투여는 둘 모두 종양내 주사에 의해서이다. 일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 차단제는 항-PD-1 억제제, PD-L1 억제제 및 CTLA4 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 이는 구체적 실시형태에서 항체이다.

일부 실시형태에서, 각각 간격을 두고 떨어진 그 자신의 투여 스케쥴에 따라 불활성화 MVA는 전달되고 면역 체크포인트 차단제는 투여된다. 일부 실시형태에서, 전달 및 투여는 동일한 전체 기간 동안 평행하게 발생한다.

일부 실시형태에서, 불활성화 MVA의 제1 투여량이 먼저 전달되고, 시간 경과 후, 예를 들어, 1주일 후, 면역 체크포인트 차단제의 제1 투여량이 투여된다. 일부 실시형태에서, 불활성화 MVA와 면역 체크포인트 차단제 중 하나 또는 둘 모두는 효과가 지속되고 최대 내약 용량이 도달되지 않는 한 수 주, 수 개월 또는 수년동안 또는 무기한 각각 전달되고 투여된다.

일부 실시형태에서, 면역 체크포인트 차단제와 불활성화 MVA는 동시에 투여되며; 일부 실시형태에서, 그들은 동일한 조성물로 투여되며; 일부 실시형태에서, 그들은 둘 모두 종양내로 전달된다. 일부 실시형태에서, 동시 전달은 더 낮은 투여량의 면역 체크포인트 차단제가 이용되도록 하며 두 가지 활성 제제의 조합된 효과가 상승적일 수 있다.

개시되는 다수의 실시형태 중에서 임의의 실시형태 또는 선택된 실시형태의 임의의 특징 또는 특징들의 조합이 배제될 수 있다.

도 1은 열-MVA가 MVA 보다 쥐 cDC에서 더 높은 수준의 타입 I IFN 생산을 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 1a는 10의 MOI의 MVA로 또는 등가량의 열-MVA로 감염된 cDC(GM-CSF-배양된 골수 유래 DC)에서 무 바이러스 대조군에 비교한 상대적인 IFNA4 및 IFNB mRNA 발현 수준의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 2회 반복된다. 도 1b는 cDC의 MVA 또는 열-MVA 감염 후 시간에 따른 배지 내의 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도의 그래프이다(***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 2회 반복된다. 도 1c는 백시니아 E3의 p25, p-IRF-3, 및 (로딩 대조군으로서)β-액틴의 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 스캔된 이미지이다. "hpi"는 감염 후 시간이며, "M"은 가짜 감염 대조군이다.
도 2는 열-MVA 유도된 타입 I IFN 생산이 cGAS 및 STING에 의해 매개된 세포기질 DNA-센싱 경로에 의존함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 2a는 무 바이러스 대조군에 비교한, cGAS^+/+ 및 cGAS^-/- 마우스로부터 생성되고 열-MVA로 감염된 cDC에서 IFNA4 및 IFNB 상대적 mRNA 발현의 막대 그래프이다(***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 2b는 cGAS^+/+ 및 cGAS^-/- 마우스로부터 생성되고 열-MVA로 감염된 cDC의 배지에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도의 막대 그래프이다(***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 2c는 무 바이러스 대조군에 비교한, STING^+/+ 및 STING^{Gt / Gt} 마우스로부터 생성되고 열-MVA로 감염된 cDC에서 IFNA4 및 IFNB 상대적 mRNA 발현의 막대 그래프이다(***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 2회 반복된다. 도 2d는 STING^+/+ 및 STING^{Gt / Gt} 마우스로부터 생성되고 열-MVA로 감염된 cDC의 배지에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도의 막대 그래프이다(***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 2회 반복된다. 도 2e는 열-MVA 감염 후 cGAS^+/+ 및 cGAS^-/- cDC에서 p-IRF3 및 β-액틴의 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 스캔된 이미지이다. "hpi"는 감염 후 시간이다. "M"는 가짜 감염 대조군이다. 도 2f는 열-MVA 감염 후 STING^+/+ 및 STING^{Gt / Gt} cDC에서 p-IRF3 및 β-액틴의 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 스캔된 이미지이다. "hpi"는 감염 후 시간이다. "M"는 가짜 감염 대조군이다. 도 2g는 STING^GtGt 및 WT 마우스로부터 생성된 열-MVA 감염 cDC에서 표면 마커 MHCI(MHC 클래스 I), CD40, CD86, 및 CD80의 발현을 보여주는 일련의 그래프이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 2회 반복된다.
도 3은 열-MVA 유도된 타입 I IFN 생산이 전사 인자 IRF3, IRF7, 및 IFNAR1에 의존함을 보여주는 일련의 그래프이다. 도 3a는 WT, IRF3^-/-, IRF5^-/-, 및 IRF7^-/- 마우스로부터 생성된 cDC의 열-MVA 감염 후 IFNA4 및 IFNB mRNA 발현의 유도 배수를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 3b는 WT, IRF3^-/-, IRF5^-/-, 및 IRF7^-/- 마우스로부터 생성된 열-MVA-감염 cDC의 배지에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도를 도시하는 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 3c는 IFNAR^+/+ 및 IFNR^-/- 마우스로부터 생성된 cDC의 열-MVA 감염 후 IFNA4 및 IFNB mRNA 발현의 유도 배수를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 3d는 IFNAR^+/+ 및 IFNR^-/- 마우스로부터 생성된 열-MVA-감염 cDC의 배지에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도를 보여주는 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 4는 열-MVA가 인 비보에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도하며 STING/IRF3/IRF7 -의존 방식으로 그러함을 보여주는 일련의 산점도이다. 도 4a는 꼬리 정맥 주사를 통해 MVA(2 x 10⁷ pfu) 또는 등가량의 열-MVA로 접종된 WT 마우스로부터의 혈청에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도의 산점도이다. 혈청을 접종 후 6 시간에 수집하였다(***, p < 0.001; n=5). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 4b는 열-MVA로 접종된 IFNAR^+/+ 또는 IFNR ^-/- 마우스로부터의 혈청에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도의 산점도이다(**, p < 0.01; ***, p < 0.001; n=5). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 4c는 열-MVA로 접종된 WT, IRF3^-/-, IRF7^-/-, 또는 STING^{Gt / Gt} 마우스로부터의 혈청에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도의 산점도이다(n=5). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 5는 B16-F10 흑색종 세포의 열-MVA 감염이 타입 I IFN 및 프로염증성 사이토카인 및 케모카인의 생산을 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 5a는 B16-F10 흑색종 세포의 열-MVA 또는 MVA 감염 후 IFNA4, IFNB, CCL5, 및 IL6의 mRNA 수준의 유도 배수를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 5b는 열-MVA 또는 MVA 감염 후 B16-F10 흑색종 세포의 배지에서 분비된 IFN-α 및 IFN-β, CCL5 및 IL-6의 농도를 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 5c는 열-MVA 또는 MVA로 감염된 B16-F10 세포에서 p-IRF, IRF, 및 (로딩 대조군으로서) GAPDH 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 스캔된 이미지이다. "hpi"는 감염 후 시간이다. 도 5d는 무 바이러스 대조군, MVA 또는 열-MVA로 감염된 B16-F10 세포에서 MHCI 발현의 그래프이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 6은 1시간 동안 55℃에서 열-불활성화 처리된 MVA가 cDC로부터 최고 수준의 IFN 분비를 유도하였음을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 6a 및 6b는 1시간 동안 상이한 온도에서 열-처리된 MVA로 감염된 cDC의 배지에서 분비된 IFN-α(a) 및 IFN-β(b) 각각의 농도의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 7은 열-MVA 주사가 종양 박멸 및 전신성 항-종양 면역을 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 7a는 PBS(백색 원; n=5) 또는 열-MVA(흑색 원; n=10) 주사 후 시간(일)에 대한 종양 부피의 플롯이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 5회 반복된다. 도 7b는 PBS(백색 원; n=5) 또는 열-MVA(흑색 원; n=10)로 주사된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르(Kaplan-Meier) 생존 곡선이다(****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 5회 반복된다. 도 7c는 치사량의 B16-F10 흑색종 세포(1 x 10⁶ 세포)로 대측(contralateral side)에서 재공격된 천연 마우스(백색 원; n=5) 및 열-MVA-처리 마우스(흑색 원; n=10)의 카프란-메이에르 생존 곡선이다. 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 5회 반복된다. 도 7d는 1 x 10⁶ 세포의 정맥내 전달 후 천연 마우스(백색 원; n=9) 또는 열-MVA-처리 마우스(흑색 원; n=10)으로부터 3주에 수집된 폐의 표면 상의 종양 병소의 수의 산점도이다(****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 적어도 2회 반복된다.
도 8은 열-MVA의 종양내 주사가 종양 미세환경에서 면역학적 변화를 야기함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 8a는 CD3⁺CD45⁺ T 세포의 유세포 분석이다. 도 8b-c는 그랜자임(Granzyme) B⁺ (8b) 또는 Ki-67(8c)를 발현하는 CD8⁺ 세포의 유세포 분석의 산점도이다. 도 8d-f는 FoxP3(8d), 그랜자임 B(8e), 또는 Ki-67(8f)를 발현하는 CD4⁺ 세포의 유세포 분석의 산점도이다. 도 8g-l은 PBS(n=5) 또는 열-MVA(n=5; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001)로 처리된 마우스의 종양 내에서 CD45⁺CD3⁺(8g), CD8⁺그랜자임 B⁺(8h), CD8⁺Ki-67⁺(8i), CD4⁺Foxp3⁺(8j), CD4⁺그랜자임 B⁺(8k), 및 CD4⁺Ki67⁺(8l) 세포의 백분율의 산점도이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 9는 열-MVA가 종양 배수 림프절(TDLN)에서 면역학적 변화를 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 9a-d는 PBS(n=5) 또는 열-MVA(n=5) 처리 마우스의 TDLN으로부터 분리된 그랜자임 B⁺CD8⁺(9a), 그랜자임 B⁺CD4⁺(9b), Ki-67⁺CD8⁺(9c), 및 Ki67⁺CD4⁺(9d) 세포의 유세포 분석의 산점도이다. 도 9e-h는 TDLN에서 그랜자임 B⁺CD8⁺(9e), Ki67⁺CD8⁺(9f), 그랜자임 B⁺CD4⁺(9g), 및 Ki67⁺CD4⁺(9h) 세포의 백분율을 도시하는 그래프이다(n=5; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 10은 열-MVA가 야생형 대조군에 비하여 STING-결핍 마우스 또는 Batf3-결핍 마우스에서 B16-F10 흑색종의 박멸에서 덜 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 10a는 종양-보유 WT, STING^{Gt / Gt}, 및 Batf3^-/- 마우스에서 PBS 또는 열-MVA 주사 후 종양 부피 v. 시간(일)의 그래프이다. 도 10b는 PBS 또는 열-MVA로 처리된 종양-보유 WT, STING^{Gt / Gt}, 및 Batf3^-/- 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(n은 상이한 그룹에 대해 5-8 범위임; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 11은 열-MVA-유도된 항종양 효과는 대부분 CD8⁺ T 세포에 의해 매개되며 CD4⁺ T 세포는 종양 재-공격에 대한 전신성 면역의 발달에 기여함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 11a는 일측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 CD4⁺, CD8⁺, 및 NK 세포에 대한 고갈 항체의 존재 또는 부재하에서 열-MVA의 종양내 주사의 도식 다이아그램이다. 도 11b는 아이소타입 대조군, CD4⁺, CD8⁺, 및 NK 세포-고갈 항체의 존재하에서 PBS 또는 열-MVA로 처리된 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(n=10; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001). 도 11c-g는 PBS(11c), 열-MVA + 아이소타입 대조군(11d), 열-MVA + 항-CD8(11e), 열-MVA + 항-CD4(11f), 및 열-MVA + 항-NK(11g)를 비롯한 다양한 처리 요법 후 일수에 대해 그려진 종양 부피의 그래프이다. 도 11h는 CD4⁺ 및 NK 세포 고갈의 존재 또는 부재하에서 우측 옆구리에 이식된 원래 종양에 대해 열-MVA로 처리된 생존 마우스 및 천연 마우스에서 좌측 옆구리에 1 x 10⁶ B16-F10 세포의 치사량의 피내 이식을 이용한 종양 재-공격의 도식적 다이아그램이다. 도 11i는 B16-F10 흑색종 세포 치사량 재-공격으로 대측에서 재-공격된, 천연 마우스(백색 원, n=6), 열-MVA-처리 마우스(흑색 원, n=10), NK 고갈을 가진 열-MVA-처리 마우스(흑색 사각형, n=6), 및 CD4⁺ T 세포 고갈을 가진 열-MVA-처리 마우스(흑색 삼각형, n=6)의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 12는 STING 및 Batf3에 의존하는 열-MVA의 종양내 주사에 의해 유도된 항-흑색종 항체 반응을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 12a는 열-MVA 또는 PBS(NT, 무 혈청 처리 대조군)로 처리된 STING^{Gt / Gt}, Batf3^-/-, 및 연령-매치 WT 마우스의 혈청에서 항-흑색종 항체 농도(ELISA에 의해 결정됨)의 산점도이다. 도 12b는 열-MVA 또는 PBS(NT, 무 혈청 처리 대조군)로 처리된 STING^{Gt / Gt}, Batf3^-/-, 및 연령-매치 WT 마우스의 혈청에서 항-백시니아 바이러스 항체 농도(ELISA에 의해 결정됨)의 산점도이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 13a-d는 PBS의 종양내 주사 + 아이소타입 항체 대조군의 복강내 전달(13a, n=5), PBS의 종양내 주사 + 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달(13b, n=5), 열-MVA의 종양내 주사 + 아이소타입 대조군(13c, n=10), 및 열-MVA의 종양내 주사 + 항-CTLA-4의 복강내 전달(13d, n=9)를 비롯한 다양한 처리 요법 후 시간(일)에 대해 그려진 종양 부피의 그래프이다. 도 13e는 PBS + 아이소타입, 열-MVA + 아이소타입, PBS + 항-CTLA-4, 및 열-MVA + 항-CTLA4 항체로 처리된 마우스에서 바이러스 주사의 개시에서 종양 부피의 산점도이다. 도 13f는 PBS + 아이소타입, 열-MVA + 아이소타입, PBS + 항-CTLA-4, 및 열-MVA + 항-CTLA4 항체로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(*, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 14는 열-MVA의 종양내 주사가 주사되지 않은 종양의 성장 제어에서뿐만 아니라 주사된 종양의 박멸에서 MVA 보다 더욱 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 14a는 양측 피내 종양 이식 모델에서 B16-F10 흑색종에 MVA 또는 열-MVA가 종양내로 처리된 처리 계획의 도식이다. 도 14b는 MOI가 5(백색 원) 또는 0.05(흑색 원)일 때 B16-F10 세포에서 MVA의 복제 곡선의 그래프이다. 도 14c는 PBS(백색 원, n=7), MVA(흑색 사각형, n=9), 또는 열-MVA(흑색 원, n=9)로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(**, p < 0.01; ***, p < 0.001). 도 14d-e는 PBS 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(injected)(d) 및 비주사(non-injected)(e) 종양 부피의 그래프이다. 도 14f-g는 MVA 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(f) 및 비주사(g) 종양 부피의 그래프이다. 도 14h-i는 열-MVA 주사 후 일수에 대한 주사(h) 및 비주사(i) 종양 부피의 그래프이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 15는 양측 B16-F10 흑색종 모델에서 비주사 종양에서 면역 세포를 모집하고 활성화함에 있어서 열-MVA의 종양내 주사가 MVA 또는 PBS보다 더욱 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 종양-보유 마우스를 도 14a에 대해 개시된 대로 PBS, MVA 또는 열-MVA의 종양내 주사로 처리하였다. 총 2회 처리 후, 비주사 종양을 첫번째 처리 후 7일에 수집하였다. 종양 침윤 면역 세포를 FACS에 의해 분석하였다. 도 15a는 대측 종양에의 PBS, MVA 또는 열-MVA의 종양내 주사 후 비주사 종양 그램 당 종양 침윤 CD45⁺, CD103⁺CD11c⁺, CD3⁺ 및 CD8⁺ 의 절대 수의 그래프이다. 도 15b는 대측 종양에의 PBS(n=5), MVA(n=5) 또는 열-MVA(n=5)의 종양내 주사 후 비주사 종양 그램 당 종양 침윤 그랜자임 B⁺CD8⁺, Ki67⁺CD8⁺, 그랜자임 B⁺CD4⁺, 및 Ki67⁺CD4⁺ 세포의 절대 수의 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=5)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 16은 양측 종양 이식 모델에서 야생형 대조군에 비교할 때 STING-결핍 마우스 또는 Batf3-결핍 마우스에서 B16-F10 흑색종을 박멸함에 있어서 열-MVA가 덜 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 16a-b는 PBS 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(a) 및 비주사(b) 종양 부피의 그래프이다(n=6). 도 16c-d는 WT 마우스(n=10)에서 열-MVA 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(c) 및 비주사(d) 종양 부피의 그래프이다. 도 16e-f는 STING^{Gt / Gt} 마우스(n=8)에서 열-MVA 주사 후 일수에 따른 주사(e) 및 비주사(f) 종양 부피의 그래프이다. 도 16g-h는 Batf3^-/- 마우스(n=6)에서 열-MVA 주사 후 일수에 따른 주사(g) 및 비주사(h) 종양 부피의 그래프이다. 도 16i는 PBS 또는 열-MVA로 처리된 종양-보유 WT, STING^{Gt / Gt}, 및 Batf3^-/- 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다(**, p < 0.01; ****, p < 0.0001). 대표적인 실험이 나타나며, 1회 반복된다.
도 17은 양측 B16-F10 흑색종 모델에서 주사 및 비주사 종양에서 면역 세포를 모집하고 활성화함에 있어서 열-MVA의 종양내 주사가 Batf3-/- 마우스에서 보다 WT 마우스에서 더욱 효과적임을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 종양-보유 마우스를 도 14a에 대해 개시된 대로 PBS 또는 열-MVA의 종양내 주사로 처리하였다. 총 2회 처리 후, 비주사 종양을 첫번째 처리 후 7일에 수집하였다. 종양 침윤 면역 세포를 FACS에 의해 분석하였다. 도 17a-b는 WT 및 Batf3^-/- 마우스 상의 우측 옆구리 종양에의 PBS 또는 열-MVA의 종양내 주사 후 주사(a) 및 비주사(b) 종양 그램 당 종양 침윤 CD3⁺ 및 CD8⁺ 의 절대 수의 그래프이다. 도 17c-d는 WT 및 Batf3^-/- 마우스 상의 우측 옆구리 종양에의 PBS 또는 열-MVA의 종양내 주사 후 주사(c) 및 비주사(d) 종양 그램 당 종양 침윤 Ki67⁺CD8⁺ 및 Ki67⁺CD4⁺ 세포의 절대 수의 그래프이다(**, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001). 데이터는 평균 ± SEM(n=4)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 18은 열-MVA의 종양내 주사와 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체의 전신 전달의 조합이 종양-보유 동물에서 전체 반응 및 치유율을 유의하게 증가시킴을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 18a는 양측 피내 종양 이식 모델에서 면역 체크포인트 차단 항체의 전신 전달이 있거나 없이 PBS 또는 열-MVA의 종양내 전달로 B16-F10 흑색종을 처리하는 처리 계획의 도식이다. 도 18b는 PBS(n=5), 열-MVA + 아이소타입 대조군(n=10), 열-MVA + 항-CTLA4 항체(n=10), 열-MVA + 항-PD1 항체(n=10), 또는 열-MVA + 항-PD-L1 항체(n=10; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001)로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다. 도 18c-d는 PBS 주사 후 일수에 따른 주사(c) 및 비주사(d) 종양 부피의 그래프이다. 도 18e-f는 열-MVA의 종양내 주사 및 아이소타입 대조군의 복강내 전달 후 일수에 따른 주사(e) 및 비주사(f) 종양 부피의 그래프이다. 도 18g-h는 열-MVA의 종양내 주사 및 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달 후 일수에 따른 주사(g) 및 비주사(h) 종양 부피의 그래프이다. 도 18i-j는 열-MVA의 종양내 주사 및 항-PD-1 항체의 복강내 전달 후 일수에 따른 주사(i) 및 비주사(j) 종양 부피의 그래프이다. 도 18k-l은 열-MVA의 종양내 주사 및 항-PD-L1 항체의 복강내 전달 후 일수에 따른 주사(k) 및 비주사(l) 종양 부피의 그래프이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다.
도 19는 UV-불활성화 MVA(UV-MVA)가 STING/IRF3-의존성 세포기질 DNA-센싱 경로를 통해 cDC에서 타입 I IFN을 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 19a-b는 cDC의 MVA(흑색 원), 열-MVA(백색 사각형), 또는 UV-MVA(흑색 사각형) 감염 후 시간에 따른 배지내의 분비된 IFN-α(a) 및 IFN-β(b)의 농도의 그래프이다(***, p < 0.001). 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 19c-d는 STING^{Gt / Gt}, IRF3^-/-, 및 WT 대조군 마우스로부터 생성되고 UV-MVA로 감염된 cDC의 배지 내의 분비된 IFN-α(c) 및 IFN-β(d)의 농도의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 19f는 UV-MVA 감염 후 STING^+/+ 및 STING^GtGt cDC에서 p-IRF3, IRF3, STING, 및 β-액틴의 단백질 수준을 보여주는 웨스턴 블롯의 스캔된 이미지이다(hpi, 감염 후 시간; NT, 무처리).
도 20은 UV-불활성화 MVA(UV-MVA)가 MC38 결장 선암 세포주로부터 염증성 사이토카인 및 케모카인을 유도하며 UV-MVA의 종양내 주사가 열-MVA와 유사한 효율로 종양 박멸 및 전신성 항종양 면역의 발달을 유도함을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 20a-c는 MVA, 열-MVA, UV-MVA, 또는 가짜 대조군으로 감염된 MC38 세포의 배지내의 분비된 IL-6(a), CCL4(b), 및 CCL5(c)의 농도의 막대 그래프이다. 데이터는 평균 ± SEM(n=3)이다. 대표적인 실험이 나타나며, 2회 반복된다. 도 20d-f는 PBS(d), 열-MVA(e), 또는 UV-MVA(f)의 종양내 주사 후 종양 부피 v. 시간(일수)의 그래프이다. 도 20g는 PBS(흑색 원, n=5), 또는 열-MVA(흑색 사각형, n=10), 또는 UV-MVA(흑색 삼각형, n=7)로 주사된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다. 도 20h는 치사량의 MC38 결장 선암 세포로 대측에서 재공격된 천연 마우스(흑색 원, n=5), 열-MVA-처리 마우스(흑색 사각형, n=7), 및 UV-MVA-처리 마우스(흑색 삼각형, n=5)의 카프란-메이에르 생존 곡선이다. 대표적인 실험이 나타나며, 1회 반복된다.
도 21은 열-MVA의 종양내 주사와 항-CTLA-4 또는 항-PD-L1 항체의 전신 전달의 조합이 종양-보유 동물에서 전체 반응 및 치유율을 유의하게 증가시킴을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 21a-b는 PBS 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(a) 및 비주사(b) 종양 부피의 그래프이다. 도 21c-d는 PBS의 종양내 주사 및 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(c) 및 비주사(d) 종양 부피의 그래프이다. 도 21e-f는 PBS의 종양내 주사 및 항-항-PD-L1 항체의 복강내 전달 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(e) 및 비주사(f) 종양 부피의 그래프이다. 도 21g-h는 열-MVA의 종양내 주사 및 아이소타입 항체 대조군의 복강내 전달 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(g) 및 비주사(h) 종양 부피의 그래프이다. 도 21i-j는 열-MVA의 종양내 주사 및 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(i) 및 비주사(j) 종양 부피의 그래프이다. 도 21k-l은 열-MVA의 종양내 주사 및 항-PD-L1 항체의 복강내 전달 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(k) 및 비주사(l) 종양 부피의 그래프이다. 도 21m은 PBS(n=6), 항-CTLA4 항체 (n=7), 또는 항-PD-L1 항체(n=7; ***, p < 0.001)로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다. 도 21n은 PBS(n=6), 열-MVA + 아이소타입 대조군(n=10), 열-MVA + 항-CTLA4 항체(n=10), 또는 열-MVA + 항-PD-L1 항체(n=10; *, p < 0.05; **, p < 0.01; ****, p < 0.0001)로 처리된 종양-보유 마우스의 카프란-메이에르 생존 곡선이다. 대표적인 실험이 나타나며, 1회 반복된다.
도 22는 양측 B16-F10 종양 이식 모델에서 열-MVA 및 항-CTLA-4의 종양내 공동투여가 전체 반응 및 치유율을 유의하게 증가시킴을 보여주는 데이터의 일련의 그래프 도시이다. 도 22a-b는 PBS 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(a) 및 비주사(b) 종양 부피의 그래프이다(n=10). 도 22c-d는 열-MVA 및 아이소타입 대조군 항체의 종양내 주사 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(c) 및 비주사(d) 종양 부피의 그래프이다(n=10). 도 21e-f는 복강내 전달을 위해 사용된 투여량의 1/10로 열-MVA 및 항-CTLA-4 항체를 종양내 공동투여 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(e) 및 비주사(f) 종양 부피의 그래프이다(n=10). 도 22g-h는 열-MVA의 종양내 주사 및 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달 후 시간(일)에 대해 그려진 주사(g) 및 비주사(h) 종양 부피의 그래프이다(n=10).

정의:

본 명세서에서 사용될 때 하기 용어는 문맥이 명백하게 다르게 나타내지 않으면 하기에서 그들에게 부여된 의미를 가질 것이다:

"암"은 제어되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 인간 및 동물의 질병 부류를 말한다. 달리 명시되지 않으면, 용어 "암"은 본 명세서에서 용어 "종양"(원발성 및 전이성 종양 둘 모두를 포함함), "악성 종양", "과증식" 및 "신생물(들)"과 상호교환되어 사용될 수 있으며; 용어 "암 세포(들)"는 용어 "종양 세포(들)", "악성종양 세포(들)", "과증식 세포(들)" 및 "신생물 세포(들)"과 상호교환가능하다.

"흑색종"은 멜라닌을 생산할 수 있는 세포로부터 기원하는 악성 신생물을 말한다. 용어 흑색종은 "악성 흑색종"과 동의어이다. 흑색종은 환자의 림프절, 피부, 간, 폐 및 뇌 조직을 비롯하여 넓게 전이된다.

"고형 종양"은 림프종, 백혈병 및 다발성 골수종과 같은 혈액암을 제외한, 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 원발성 또는 전이성, 및 모든 전암 및 암 세포 및 조직을 말한다. 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종(endotheliosarcoma), 림프관육종, 림프안지오엔도테리오살코마(lymphangioendotheliosarcoma), 활막종, 중피종, 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평세포 암종, 기저 세포 암종, 선암, 한선암종, 피지선암종, 유두암종, 유두 선암(papillary adenocarcinomas), 낭선암종, 수질암종, 기관지원성 암종, 신장세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 태생성 암종, 윌름 종양(Wilm's tumor), 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체부종양, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 및 망막아세포종을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법이 유용할 가장 일반적인 고형 종양 중 일부는 두경부암, 직장 선암, 신경교종, 수모세포종, 요로상피세포암종, 췌장 선암, 자궁내막암, 난소암, 전립선 선암, 비소세포폐암(편평 및 선암), 소세포폐암, 흑색종, 유방 암종, 신장세포 암종 및 간세포 암종을 포함한다.

"전이"는 그 원발 부위로부터 신체 내 이웃 조직 또는 말단 위치로의 암의 확산을 말한다. 암세포는 원발 종양으로부터 빠져 나와, 림프관 및 혈관 내로 침투하고, 혈류를 통해 순환하고, 신체 내 다른 곳의 정상 조직에서 성장한다. 전이는 원발 종양으로부터 빠져 나와, 혈류 또는 림프관을 통해 이동하고, 먼 부위에서 멈추는 종양 세포(또는 암 줄기 세포)에 달린 순차적 과정이다. 일단 다른 부위에 가면, 암세포는 혈관 또는 림프벽을 통해 재침투하고, 계속 증식하고, 결국에는 새로운 종양(전이성 종양)을 형성한다. 일부 실시형태에서, 이 새로운 종양은 전이성(또는 이차) 종양으로 불린다.

"면역 반응"은 인간 신체로부터 암세포, 전이성 종양 세포 등의 선택적 손상, 파괴 또는 제거를 야기하는, 림프구, 항원 제시 세포, 포식세포, 과립구 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체 포함) 중 하나 이상의 작용을 말한다. 면역 반응은 세포 기능, 즉, T 세포 기능의 변경(조절, 예를 들어, 유의한 향상, 자극, 활성화, 손상 또는 억제)인 T 세포 반응과 같은 세포 반응을 포함할 수 있다. T 세포 반응은 특정 타입의 T 세포 또는 T 세포의 서브세트, 예를 들어, 이펙터 CD4⁺, 세포독성 CD8⁺, 또는 천연 킬러(NK) 세포의 생성, 증식 또는 확장 또는 자극을 포함할 수 있다. 그러한 T 세포 서브세트는 하나 이상의 세포 수용체 또는 세포 표면 분자(예를 들어, CD 또는 분화 분자 집단)을 검출하여 확인될 수 있다. T 세포 반응은 또한 다른 세포의 분화 또는 증식에 영향을 주는 가용성 매개인자(예를 들어, 사이토카인, 림포카인, 사이토카인 결합 단백질 또는 인터루킨)과 같은 세포 인자의 변경된 발현(통계적으로 유의한 증가 또는 감소)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 타입 I 인터페론(IFN-α/β)은 선천적 면역의 중요한 조절자이다[71]. 동물 및 인간 연구는 항원 인식 항-종양 면역 반응의 초기 단계 동안 CD4⁺ 및 CD8⁺T 세포 둘 모두의 운명에 직접적으로 영향을 주는 데 있어서 IFN-α/β의 역할을 보여주었다. 타입 I IFN은 수지상 세포의 활성화 및 그에 따른 선천적 면역계의 감시에 대한 반응에서 유도된다.

"종양 면역"은 종양이 면역계에 의한 인식과 소거(clearance)를 회피하는 과정을 말한다. 따라서, 치료 개념으로서, 종양 면역은 그러한 회피가 약화되거나 제거되고 종양이 면역계에 의해 인식되고 공격될 때 "치료"된다. 종양 인식의 예는 종양 결합이며, 종양 공격의 예는 종양 (수, 크기 또는 둘 모두에서)감소 및 종양 소거이다.

"T 세포"는 다양한 세포-매개 획득 면역 반응에 참여하는 흉선 유래 림프구를 말한다.

"헬퍼(Helper) T 세포"는 CD4⁺ T 세포를 말하며; 헬퍼 T 세포는 MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원을 인식한다. Th1과 Th2의 적어도 두 가지 타입의 헬퍼 T 세포가 있으며, 이들은 상이한 사이토카인을 생산한다.

"세포독성 T 세포"는 보통 그 표면 상에 CD8 분자 마커를 보유하며(CD8+) 그 표면 상에 특정 항원 분자를 가진 표적 세포를 파괴함으로써 세포-매개 면역에서 기능하는 T 세포를 말한다. 세포독성 T 세포는 또한 퍼포린(perforin)-형성된 기공을 통해 표적 세포에 들어가고 어팝토시스(세포 사멸)을 유도할 수 있는 세린 프로테아제인 그랜자임을 방출한다. 그랜자임은 세포독성 표현형의 마커로서 작용한다. 세포독성 T 세포를 위한 다른 명칭은 CTL, 세포용해 T 세포, 세포용해 T 림프구, 킬러 T 세포, 또는 킬러 T 림프구를 포함한다. 세포독성 T 세포의 표적은 바이러스-감염된 세포, 세균 또는 원충으로 감염된 세포 또는 암 세포를 포함할 수 있다. 대부분의 세포독성 T 세포는 그들의 세포 표면 상에 존재하는 단백질 CD8을 가진다. CD8은 클래스 I MHC 분자의 일부분에 이끌린다. 전형적으로, 세포독성 T 세포는 CD8+ 세포이다.

"종양-침윤 림프구"는 순환계(혈액 또는 림프액)에 체류하거나 다르게는 순환계를 떠나서 종양 내로 이동한, (흑색종과 같은) 암에 걸린 개체의 백혈구를 말한다.

"면역 체크포인트 억제제(들)" 또는 "면역 체크포인트 차단제"는 하나 이상의 체크포인트 단백질의 활성을 완전히 또는 부분적으로 감소, 억제, 간섭 또는 조절하는 분자를 말한다. 체크포인트 단백질은 T-세포 활성화 또는 기능을 조절한다. 체크포인트 단백질은 CTLA-4 및 그 리간드 CD80 및 CD86; PD-1 및 그 리간드 PDL1 및 PDL2; LAG3, B7-H3, B7-H4, TIM3, ICOS, 및 BTLA를 포함하지만 이에 제한되지 않는다[72].

치료 물질의 투여 맥락에서 사용될 때 "비경구"는 소화관을 통한 투여 외의 다른 임의의 투여 경로를 포함한다. 특히 본 발명의 방법에 관련되는 것은 정맥내(예를 들어, 간문맥을 통한 것을 포함), 종양내 또는 척추강내 투여이다.

"항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자 또는 그러한 분자의 항원-결합 단편을 말한다. 따라서, 항체는 천연 공급원으로부터 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 본래의 면역글로불린일 수 있으며 본래의 면역글로불린의 면역반응성(항원-결합) 단편 또는 일부분일 수 있다. 항체는 예를 들어, 다클론 항체, 단클론 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2, 및 단일쇄 항체(scFv) 인간화 항체, 키메라 항체, 인간 재조합 항체 및 이(bi)- 및 삼(tri)-특이적 항체를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다.

"암용해 바이러스(Oncolytic virus)"는 암세포를 우선적으로 감염시키고, 그러한 세포에서 복제하고, 그 복제 과정을 통해 암세포의 용해를 유도하는 바이러스를 말한다. 자연 발생 암용해 바이러스의 비제한적인 예는 수포성 구내염 바이러스, 레오바이러스, 및 아데노바이러스, 뉴캐슬병 바이러스 및 단순포진 바이러스와 같은 암선택적이도록 조작된 바이러스를 포함한다[19, 73-75]. 백시니아 바이러스는 많은 타입의 세포를 감염시키지만, 종양 세포가 복제에 유리한 대사를 가지며, 또한 복제에 유리한 소정의 경로의 활성화를 나타내며 또한 바이러스 복제에 유리한, 선천적 면역계를 회피하는 환경을 생성한다는 사실로 인해, 종양 세포에서 우선적으로 복제된다. 열-불활성화 MVA는 암용해 바이러스의 정의에 맞지 않는다.

"MVA"는 "변형 백시니아 안카라"를 의미하며 안카라 균주로부터 유래되고 백신 및 백신 아쥬반트로서의 사용을 위해 개발된 고도로 약독화된 백시니아 균주를 말한다. 원래의 MVA는 닭 배아 세포를 통한 연속 계대에 의해 야생형 안카라 균주로부터 분리되었다. 그렇게 처리되어, 원래의 MVA는 영장류(인간 포함) 세포에서 효율적으로 복제하는 능력을 비롯하여 야생형 백시니아의 게놈의 약 15%를 소실하였다[76]. 천연두 예방접종 균주 MVA: 마커, 유전자 구조, 비경구 예방접종에서 수득한 경험 및 약화된 방어 기전을 가진 유기체에서의 거동. MVA는 감염성 질병 또는 종양에 대한 유전자 또는 예방접종 전달을 위한 재조합 벡터로서의 개발을 위한 적절한 후보로 간주된다[77]. MVA는 178 kb 길이의 게놈과 Antoine, G et al[78]에서 처음 개시된 서열을 가진다. 서열은 또한 Genbank U94848.1에 개시된다. 임상 등급 MVA는 덴마크 크비스트가드의 바바리안 노르딕 에이/에스(Bavarian Nordic A/S)로부터 구매가능하다. 부가적으로, MVA는 메릴랜드주 락빌의 ATCC 및 프랑스 파리의 CMCN(Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes)으로부터 입수가능하다. 돌연변이 MVA E3L 넉아웃(ΔE3L-MVA) 및 그 제조는 예를 들어, 미국 특허 7,049,145호에 개시되었다.

"열-불활성화 MVA" 또는 "열 MVA"는 그 면역원성 또는 표적 세포(종양 세포)에 들어가는 그 능력을 파괴하지 않으나 숙주의 면역 반응을 억제하는 인자(예를 들어, 감염된 세포에서 IFN 타입 I의 유도를 억제하는 인자) 및 바이러스의 잔여 복제 능력을 제거하는 조건하에서 열에 노출시켜 추가로 처리된 MVA를 의미한다. 그러한 조건의 예는 약 1시간의 기간 동안 약 50 내지 약 60℃ 범위 내의 온도에 노출하는 것이다. 다른 시간과 온도가 일상적인 실험으로 결정될 수 있으며 감염된 cDC에서의 IFN 타입 I 유도는 본 명세서에 개시된 실험에서 사용된 열-MVA에 비교될 수 있으며 MVA의 IFN 타입 I 유도보다 높아야 한다. 본 발명자가 수행한 한 가지 실험에서, 65℃ 및 1-시간 노출의 조합으로 처리된 MVA에 의한 cDC의 감염은 IFN 타입 I을 유도하지 못했다. 안전성과 강한 면역원성의 이 조합은 WT 백시니아 및 심지어 MVA에 비하여 열-MVA를 특히 매력적으로 만든다.

"UV-불활성화 MVA" 또는 "UV-MVA"는 그 면역원성 또는 표적 세포(종양 세포)에 들어가는 그 능력을 파괴하지 않으나 바이러스의 잔여 복제 능력을 제거하는 조건하에서 UV에 노출시켜 불활성화된 MVA를 의미한다. 본 발명에서 유용할 수 있는 그러한 조건의 예는 예를 들어, 약 30분 내지 약 1시간의 기간 동안 365 nm UV 전구를 이용하여 UV에 노출하는 것이다[56, 79]. 다시, 상기 열-MVA에 대해 설명된 대로, UV 파장과 노출의 이들 조건의 한계는 주어진 노출에 처리된 UV-MVA에 의해 유도된 타입 I IFN을 결정하고 이를 하기의 실험에서 사용된 UV-MVA에 의해 유도된 타입 I IFN에 그리고 미처리 MVA에 비교함으로써 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다. UV-MVA는 유사하게 열-MVA처럼 안전하며 또한 유의한 타입 I IFN을 유도한다.

따라서, "불활성화 MVA"는 감염성이고, 비복제성이며 감염된 DC 세포에서 IFN 타입 I 생산을 억제하지 않는 열-불활성화 MVA 및 UV-불활성화 MVA를 포함하는 포괄적 용어로서 사용된다. 열과 UV 조사의 조합에 의해 불활성화된 MVA는 또한 본 발명의 범위 이내이다.

"개체"는 암에 걸릴수 있는 임의의 동물(포유동물, 인간 또는 기타) 환자를 의미한다.

"치료적 유효량" 또는 "유효량"은 질병의 완화, 치유 또는 경감에서 원하는 생물학적 결과를 제공하기에 충분한 기간 동안 하나 이상의 투여량으로 투여될 경우 제제의 충분한 양을 말한다. 본 발명에서, 불활성화-MVA의 유효량은 암세포의 수를 감소시키거나; 또는 종양 크기를 감소시키거나 종양을 박멸하거나; 또는 말초 기관 내로의 암세포 침윤을 억제(즉, 지연 또는 중단)하거나; 전이성 성장을 억제(즉, 지연 또는 중단)하거나; 종양 성장을 억제(즉, 안정화 또는 정지)하거나; 종양의 치료를 가능하게 하거나 및/또는 종양에 대한 면역 반응을 유도하는 (적절한 기간 동안 그리고 적절한 빈도로 투여된) 양이다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 치료양은 본 발명에 비추어 일상적 실험을 이용하여 당업자가 결정할 수 있다. 그러한 결정은 인 비트로에서 효과적인 것으로 밝혀진 양 및 동물에서 효과적인 것으로 밝혀진 양으로 시작할 것이다. 치료적 유효량은 처음에는 배양 세포에 효과를 부여하는 것으로 밝혀진 농도 또는 농도들에 기초하여 결정될 것이다. 유효량은 세포 배양 내의 데이터로부터 외삽될 수 있으며 본 명세서에 개시된 것과 같은 인자에 기초하여 상향 또는 하향 조정될 수 있다. 유효량 범위의 예는 투여 당 10⁵ 바이러스 입자 내지 약 10¹² 바이러스 입자이다.

본 명세서에 개시된 바이러스계 면역자극 제제와 관련하여, "치료적 유효량" 또는 "유효량"은 종양 세포 성장을 감소, 억제 또는 폐기하여, 종양을 감소 또는 제거하기에 충분한, 또는 인 비트로에서 또는 개체에서 전이성 확산을 억제, 감소 또는 폐기하거나, 궁극적으로 경우에 따라 감소, 억제 및/또는 폐기 중 하나 이상을 야기할, 종양에 대한 면역 반응을 유발하기에 충분한 불활성화 MVA를 포함하는 조성물의 양을 말한다. 종양 세포 성장의 감소, 억제 또는 박멸은 괴사, 어팝토시스 또는 면역 반응 또는 전술한 것 중 둘 이상의 조합의 결과일 수 있다. 치료적으로 유효한 양은 조성물에 사용된 구체적인 불활성화 MVA, 치료되는 개체의 연령과 상태, 종양 형성의 정도, 다른 치료 양식의 존재 또는 부재 등과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 유사하게, 투여될 조성물의 투여량 및 그 투여 빈도는 활성 성분의 효능, 일단 투여된 후 그 활성의 지속기간, 투여 경로, 개체의 크기, 연령, 성별 및 물리적 상태, 부작용 위험 및 의료 실무자의 판단과 같은 다양한 인자에 의존할 것이다. 조성물은 주사액과 같은 다양한 투약 형태로 투여된다.

면역 체크포인트 억제제를 이용한 병용 요법에 관련하여, 면역 체크포인트 차단제를 위한 "치료적 유효량"은 치료되는 개체의 종양 세포에서 면역 체크포인트가 어팝토시스 반응을 피하는 것을 차단하기에 충분한 면역 체크포인트 차단제의 양을 의미한다. CTLA4 억제제(예를 들어, 이피리무맙)과 같은 CD28 억제제, PD-1 억제제(예를 들어, 니보루맙, 펨브로리주맙, 피디리주맙, 람브로리주맙), PD-L1 억제제(MPDL3280A, BMS-936559, MEDI4736, MSB 00107180) ICOS 및 BTLA 또는 그들의 유인용 분자를 비롯한 여러 면역 체크포인트 차단제가 승인되거나 임상 시험중이거나 개발 중이다. 여러 투약 임상 시험이 완료되어 다른 제제에의 외삽이 가능하므로 전술한 것들의 투여량 범위는 당업자에게 알려져 있거나 쉽게 알 수 있다.

바람직하게는, 종양은 특정 체크포인트를 발현하지만, 면역 체크포인트 차단제가 종양 세포, 기질 세포 및 종양 침윤 면역 세포에 의해 유발된, 종양 내의 면역 억제 기전을 보다 일반적으로 차단하므로 이는 반드시 필요하지는 않다.

예를 들어, 흑색종에서 수술 후 아쥬반트 치료법으로서 투여될 경우, CTLA4 억제제 이피리무맙은 총 4회 투여 동안 3주마다 총 3 mg/kg의 주입량을 위해 90분에 걸쳐 1-2 mg/mL로 투여된다. 이 치료법은 종종 심각한, 심지어 생명을 위협하는 면역-매개 부작용이 수반되어, 투여될 수 있는 누적량 및 내약 용량을 제한한다. 불활성화 MVA와 공동으로 투여될 경우 이피리무맙의 투여량 및/또는 누적량을 감소시키는 것이 가능할 것으로 예상된다. 구체적으로, 후술하는 실험 결과에 비추어, 불활성화 MVA와 동시에 또는 순차적으로 종양에 직접 투여된다면 CTLA4 억제제의 투여량을 감소시키는 것이 추가로 가능할 것으로 예상된다. 따라서, 이피리무맙을 위해 상기에 제공된 양은 공동 투여에서 환자에게 주어질 구체적 투여량과 누적량을 결정하기 위한 출발점이 될 것이지만, 최적 양을 결정하기 위해서는 투약 연구가 필요할 것이다.

펨브로리주맙은 흑색종에서의 아쥬반트 치료법으로서 투여를 위해 처방되며 25 mg/mL로 희석되어 3주마다 30분에 걸쳐 2 mg/kg의 투여량으로 투여된다.

니보루맙은 2주마다 60분에 걸친 정맥내 주입으로서 3 mg/kg의 투여를 위해 처방된다.

"약학적 허용 부형제"는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 등장 및 흡수 지연 제제 등과 같은, 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함한다. 또한 방부제 및 항균 및 항진균 제제를 포함한다. 생물학적 활성 물질을 위한 그러한 매질과 제제의 사용은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 부형제의 추가 상세 사항은 하기에 제공된다.

"전달"은 이것이 종양에의 국소 투여에 의해 이루어지던지 또는 전신 투여, 예를 들어, 정맥내 경로에 의해 이루어지던지 관계없이 종양 미세환경에서 본 발명의 불활성화-MVA의 침적과 관련하여 사용된다. 이 용어는 종양 자체에 도달하는 불활성화-MVA에 초점을 맞춘다.

본 명세서에서 "공동 투여"는 불활성화 MVA와 조합된 제2 치료 양식의 투여, 예를 들어, 불활성화 MVA와 시간적으로 인접하여 투여되는 면역 체크포인트 차단제를 말한다. 예를 들어, PD-1/PDL-1 억제제 및/또는 CTLA4 억제제(보다 구체적 실시형태에서, 항체)는 (불활성화-MVA가 상기한 대로 종양내로 또는 전신적으로 투여될 때 정맥내 또는 종양내 주사에 의해) 열-불활성화 MVA와 동시에 또는 불활성화-MVA 투여 전 또는 후에 투여될 수 있다. 만일 불활성화 MVA 투여 및 면역 체크포인트 차단제가 1-7일 또는 심지어 최대 3주 떨어져서 투여된다면, 이것은 본 명세서에 개시한 "시간적으로 인접한" 범위내일 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명은 하기 중 하나 이상을 야기하는데 효과적인 불활성화 MVA의 양을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 종양을 가진 개체에서 항종양 면역 반응을 유발하는 방법에 관한 것이다:

종양 내 및/또는 종양-배수 림프절 내 세포독성 CD8+ T 세포의 증가;

타입 I IFN의 유도를 통해 상기 종양에 침윤하는 수지상 세포의 성숙 유도;

개체에서 종양 내 및/또는 종양-배수 림프절 내 종양 세포를 인식하는 이펙터 T 세포의 유도;

종양 내에서 면역 억제(조절) CD4+ T 세포의 감소; 및

종양 세포가 그들의 표면에 MHC 클래스 I을 발현하고 타입 I IFN 또는 다른 염증성 사이토카인 또는 케모카인 중 하나 이상을 생산하도록 유도.

본 발명자들은 면역 반응의 기전을 탐구하였으며, 면역 반응이 타입 1 IFN의 생산을 매개하는 cGAS/STING에 의해 매개된 세포기질 DNA-센싱 경로에 의해 시작되는 것으로 결론내렸다. 기전 및 모집되는 면역 세포에 대한 추가의 이해는 실시예에서 제공된다. 실시예에서 제시된 결론은 이들 기전이 밝혀지는 특정 실험 환경에 한정되지 않는다.

일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 개시된 열-MVA의 치료적 유효량을 종양에 전달하는 것을 포함하는, 고형 종양으로 진단된 개체의 치료 방법을 제공한다.

일 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 불활성화 MVA를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 암으로 진단된 개체에서 항-종양 면역을 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 종양의 크기를 감소하거나, 종양을 박멸하거나, 종양의 성장을 억제하거나, 종양의 전이 또는 전이성 성장을 억제할 수 있는 항-종양 면역의 유도를 포함한다.

다른 실시형태에서, 본 발명은 고형 악성 종양으로 진단된 개체에서, 치료적 유효량의 불활성화 MVA에 종양을 노출시킴으로써 선천적 면역 반응 및/또는 획득 면역 반응, 예를 들어, T 세포 반응을 포함할 수 있는 항-종양 면역 반응을 향상, 자극 또는 유발하는 방법을 제공한다.

구체적 실시형태에서, 본 발명은 종양 세포에 대해 지시된 T-세포 세포독성면에서 그리고 역시 종양 세포에 대해 지시된 T 헬퍼 세포를 유발하는 면에서 획득 면역 반응을 매개하는 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 비복제성 열- 또는 UV-불활성화 MVA를 포함하는 조성물을 종양내로 또는 정맥내로 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 조성물의 투여는 종양에 대한 종양-특이적 면역 반응 및 결과적으로는 종양 성장의 감소, 억제 또는 폐기 및/또는 전이성 성장의 억제를 야기한다. 사실, 본 발명자들은 암세포가 사멸되며 면역 반응이 전이의 경우처럼 먼 위치로 이동할 수 있음을 보여주었다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 종양 세포에 대해 지시된 T-세포 세포독성면에서 그리고 역시 종양 세포에 대해 지시된 T 헬퍼 세포를 유발하는 면에서 획득 면역 반응을 매개하는 면역 반응을 유발하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 불활성화 MVA를 포함하는 조성물을 비경구로 개체에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 조성물의 투여는 종양에 대한 종양-특이적 면역 반응 및 결과적으로는 종양 성장의 감소, 억제 또는 박멸 및/또는 전이성 성장의 억제를 야기한다. 사실, 본 발명자들은 암세포가 사멸되며 면역 반응이 전이의 경우처럼 먼 위치로 이동할 수 있음을 보여주었다.

불활성화 MVA는 복제 능력이 없으므로, 복제 가능한 백신 또는 벡터와 동일한 방식으로 면역계에 그 효과를 나타내지 않는다. 따라서, 면역계의 자극이 암용해를 위한 효율에 장벽이라고 생각되는 한편[19], 불활성화 MVA는 세포독성 면에서 그리고 더욱 넓게는 종양에 대한 T 이펙터 세포 활성화의 면에서, 선천적 면역계를 활용하여 획득 면역을 자극할 수 있다.

본 발명은 따라서 세포독성 CD8+ 세포의 증가 및 조절 CD4+ 세포의 감소를 종양에서 야기하기에 효과적인 양의 불활성화-MVA를 개체의 종양에 전달하고 고형 종양으로 진단된 개체에서 면역 반응을 유도하여, 고형 악성 종양을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 고형 악성 종양을 치료함으로써 항종양 전신 면역을 생성하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 CD103⁺ DC, 세포독성 CD8⁺ 세포 및 CD4⁺ 이펙터 세포를 비롯한, 비주사 종양 내의 면역 세포의 상당한, 심지어 극적인 증가를 야기하는데 효과적인 양의 불활성화-MVA를 개체의 종양에 전달하여, 상기 개체에서 비주사 종양의 거부 및 종양 전이에 대한 저항(본 발명자들은 종양 재공격에 의해 시험함) 중 하나 또는 둘 모두를 야기하는 것을 포함한다.

변형 백시니아 안카라 ( MVA )

변형 백시니아 안카라(MVA) 바이러스는 폭스비리대(Poxviridae) 패밀리의 오르토폭스바이러스(Orthopoxvirus) 속의 일원이다. MVA는 백시니아 바이러스의 안카라 균주(CVA)의 닭 배아 섬유아세포(CEF) 상에서의 대략 570 연속 계대에 의해 생성되었다[80]. 이들 장기 계대의 결과로서, 생성되는 MVA 바이러스는 방대한 게놈 결실을 함유하며 숙주 세포가 조류 세포로 고도로 제한된다[30]. 생성되는 MVA가 상당히 비병원성임이 다양한 동물 모델에서 나타났다[76].

MVA의 안전성과 면역원성이 방대하게 시험되었으며, 특히 인간 천연두 질병에 대해 임상 시험에서 기록되었다. 이들 연구는 120,000명이 넘는 개인을 포함하였으며 인간에서 탁월한 효과와 안전성을 입증하였다. 또한, 다른 백시니아계 백신에 비하여, MVA는 병원성(감염성)이 약화된 한편, 우수한 특이적 면역 반응을 유발한다. 따라서, MVA는 특이적 면역 반응을 유도하는 능력을 가진 안전한 백신 벡터로서 확립되었다.

전술한 특징들로 인해, MVA는 재조합 유전자 발현 및 백신을 위해 사용된, 조작된 MVA 벡터의 개발을 위한 매력적인 표적이 되었다. 백신 벡터로서, MVA는 HIV, 결핵 및 말라리아를 비롯한 많은 병리학적 상태 및 암에 대해 조사되었다[33, 34].

인간 단핵구-유래 수지상 세포(DC)의 MVA 감염은 공자극성 분자의 상향조절 및 프로염증성 사이토카인의 분비를 특징으로 하는 DC 활성화를 야기함이 입증되었다[56]. 이와 관련하여, MVA는 DC를 활성화하지 못하는 표준 야생형 백시니아 바이러스(WT-VAC)와 상이하다. 수지상 세포는 두 가지 주요 서브타입으로 분류될 수 있다: 통상적 수지상 세포(cDC) 및 형질세포모양(plasmacytoid) 수지상 세포(pDC). 전자, 특히 CD8+ 서브타입은 특히 T 세포에의 항원 제시에 적응되며; 후자는 타입 I IFN의 강한 생산자이다.

인간 세포의 바이러스 감염은 타입 I 인터페론, 특히 인터페론-알파(α)에 의해 매개된 선천적 면역 반응(방어 제1선)의 활성화를 야기한다. 이는 보통 활성화된 T 세포(CTL 및 헬퍼 둘 모두)의 모집 및 증식 및 궁극적으로는 항체 생산을 가진 면역학적 캐스캐이드의 활성화를 유도한다. 하지만, 바이러스는 숙주의 면역 반응을 약화시키는 인자를 발현한다. MVA는 WT-VAC 보다 더 나은 면역원이며 포유류 세포에서는 복제가 저조하다[81].

하지만, 이는 완전히 비복제성은 아니며, 본 발명자들이 보여주는 것처럼, 일부 면역억제 활성을 보유한다.

면역 반응

특정 면역계 활성(예를 들어, 항체 및/또는 사이토카인 생산, 또는 세포 매개 면역의 활성화)의 상향조절에 의한 면역 반응의 유도에 더하여, 면역 반응은 또한 항상성을 재확립하고 숙주 자신의 기관과 조직에 대한 과다한 손상을 방지하기 위하여, 검출가능한 면역의 억제, 약화 또는 임의의 다른 하향조절을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 따라 유도되는 면역 반응은 종양 세포의 사멸, 또는 증식 능력의 소실을 직접적으로 또는 간접적으로 야기할 수 있는 세포독성 CD8⁺ T 세포 또는 활성화 T 헬퍼 세포 또는 둘 모두를 생성한다.

본 발명의 방법에 의한 면역 반응의 유도는 다양한 잘 알려진 면역학적 파라미터 중 어느 하나를 검출함으로써 결정될 수 있다[82, 83]. 따라서 면역반응의 유도는 면역 분석을 비롯한 많은 잘 알려진 분석에 의해 확립될 수 있다. 그러한 분석은 가용성 면역글로불린 또는 항체의 인 비보, 엑스 비보 또는 인 비트로 결정; 사이토카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 등 및 다른 가용성 소 펩티드, 탄수화물, 뉴클레오티드 및/또는 지질 매개인자와 같은 가용성 매개인자; 면역계의 세포의 변경된 기능적 또는 구조적 특성, 예를 들어, 세포 증식, 변경된 이동성, 변경된 세포내 양이온 구배 또는 농도(예를 들어, 칼슘)에 의해 결정된 세포 활성화 상태 변화; 세포 폴리펩티드의 인산화 또는 탈인산화; 특정 유전자 발현 또는 세포용해 거동과 같은 특화된 활성의 유도; 변경된 표면 항원 발현 프로파일을 비롯한 면역계의 세포에 의한 세포 분화, 또는 어팝토시스(프로그램된 세포 사멸)의 개시; 또는 면역 반응의 존재가 검출될 수 있는 임의의 다른 기준을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 면역 세포 타입을 구별하는 세포 표면 마커는 CD4+, CD8+, 또는 NK 세포에 결합하는 특이적 항체에 의해 검출될 수 있다. 검출될 수 있는 다른 마커 및 세포 성분은 인터페론-γ(IFN-γ), 종양 괴사 인자(TNF), IFN-α, IFN-β, IL-6, 및 CCL5를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 면역 반응을 검출하는 일반적 방법은 유세포분석, ELISA, 면역조직화학을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 및 유사한 분석을 실시하는 절차는 널리 알려져 있으며 예를 들어, Letkovits(Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, Current Protocols in Immunology, 1998)에서 찾을 수 있다.

약학 조성물 및 제제

불활성화-MVA를 포함하는 약학 조성물은 담체 또는 희석제와 같은 하나 이상의 약학적 허용 부형제를 함유할 수 있다. 이들은 본 발명의 백신 성분의 활성 또는 효과를 방해하지 않으며 독성이 아닌 성분이다. 담체 또는 희석제는 예를 들어, 물, 덱스트로스 용액, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 혈청 알부민, 링거액, 적합한 그의 혼합물 및 식물 오일을 함유한 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 소듐 라우릴 설페이트 또는 에탄올과 같은 계면활성제 및/또는 습윤제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물의 작용의 방지는 다양한 방부제, 항균 및 항진균 제제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 솔브산, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드 등에 의해 이루어질 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 만니톨, 솔비톨, 락토스 같은 당 또는 소듐 또는 포타슘 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물 내에 사용함으로써 야기될 수 있다.

불활성화-MVA를 포함하는 약학 조성물 및 제제는 종래의 혼합, 용해, 유화 또는 동결건조 과정에 의해 제조될 수 있다. 약학 바이러스 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보 용도를 위해 적합한 바이러스 제제를 제형화하는 것을 촉진하는 하나 이상의 생리학적 허용 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 이용하여 종래 방식으로 제형화될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 추가의 생물학적 활성 제제(예를 들어, GM-CSF의 평행 투여)와 조합될 수 있으며 비경구 또는 종양내 투여에 적합한 본 발명의 약학(생물학적 포함) 또는 수의학 조성물을 생성하기 위해 약학적 허용 담체, 희석제 또는 부형제와 제형화될 수 있다.

많은 타입의 제형이 가능하며 알려져 있다. 선택된 구체적 타입은 본 기술분야에 잘 알려진 것처럼, 선택된 투여 경로에 의존한다. 예를 들어, 전신성 제형은 일반적으로 주사, 예를 들어, 정맥내 주사에 의한 투여를 위해 설계될 것이며 또한 종양내 투여를 위해 설계된다. 바람직하게는, 전신성 또는 종양내 제형은 멸균이다.

멸균 주사 용액은 필요에 따라, 본 명세서에 열거된 다양한 다른 성분을 가진 요구되는 양의 적절한 용매에 불활성화-MVA를 포함시키고, 적합한 멸균 수단에 의해 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 배지 및 상기에 열거한 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유한 멸균 비히클 내로 활성 성분을 포함시켜 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이며, 이들은 불활성-MVA + 전술한 멸균-여과된 그 용액으로부터의 임의의 추가의 원하는 성분의 분말을 생성한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 불활성화-MVA 조성물은 수용액에서, 또는 생리학적 양립성 용액 또는 버퍼, 예를 들어, 행크 용액, 링거액, 만니톨 용액 또는 생리학적 염수 버퍼에서 제형화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 불활성화-MVA 조성물 중 어느 하나는 제형화 제제, 예를 들어, 현탁, 안정화 침투 또는 분산 제제, 버퍼, 동결건조보호제 또는 방부제, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리소르베이트 80, 1-도데실헥사하이드로-2H-아제핀-2-온(라우로카프란), 올레산, 소듐 시트레이트, Tris HCl, 덱스트로스, 프로필렌 글리콜, 만니톨, 폴리소르베이트 폴리에틸렌소르비탄 모노라우레이트(Tween®-20), 이소프로필 미리스테이트, 벤질 알코올, 이소프로필 알코올, 에탄올 수크로스, 트레할로스를 함유할 수 있으며 다른 그러한 본 기술 분야에 일반적으로 알려진 것들이 본 발명의 조성물 중 어느 하나에 사용될 수 있다[84].

본 발명의 생물학 또는 약학 조성물은 그안에 함유된 바이러스가 개체에게 조성물의 투여시에 종양 세포 감염에 이용가능하도록 하기 위해 제형화될 수 있다. 투여 후 혈청, 종양 및 원하면 다른 조직 내의 바이러스의 수준은 항체계 분석(예를 들어, ELISA, 면역조직화학 등)과 같은 다양한 잘 확립된 기술에 의해 모니터될 수 있다.

불활성화- MVA의 투여량

일반적으로, 당업자에 의해 결정될 것처럼, 더 낮거나 더 높은 투여량이 투여될 수 있지만, 개체는 약 10⁵ 내지 약 10¹⁰ 플라크 형성 유닛(pfu) 범위의 불활성화-MVA 투여량이 투여된다. 바람직한 실시형태에서, 투여량은 약 10⁶-10⁹ pfu이다. 이 투여량은 약 1 내지 약 10 ml의 단위 투여량 형태로 제형화될 수 있다. 바이러스 입자에 대한 pfu의 등가성은 사용되는 구체적인 pfu 적정법에 따라 상이할 수 있다. 일반적으로, pfu는 약 5 내지 100 바이러스 입자와 동일하다. 불활성화-MVA의 치료적 유효량은 규정된 기간 동안 규정된 투여 빈도로 하나 이상의 분할 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 불활성화 MVA의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별, 체중 및 일반적 상태, 종양의 크기, 불활성화-MVA가 특정 개체에서 종양과 싸우기에 충분한 정도로 원하는 면역 반응을 유발하는 능력 및 개체의 면역계가 그러한 반응을 시작하는 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다.

암 치료 분야에서 일하는 사람들에게 명백한 것처럼, 투여량의 변화는 예를 들어, 치료되는 개체의 상태, 투여 경로 및 치료법에 대한 개체의 반응성 및 개체를 위한 최대 내약 용량에 따라 필수적으로 발생할 것이다. 개체에게 불활성화-MVA를 전달함에 있어서, 투여량은 또한 일반적 의료 상태, 이전의 의료 이력, 질병 진행, 종양 크기 등과 같은 인자에 따라 변할 것이다.

투여 용이성 및 투여량의 균일성을 위하여 본 발명의 조성물을 투여량 단위 형태로 제형화하는 것이 유익할 수 있다. 본 명세서에 사용될 때 투여량 단위 형태는 치료될 포유류 개체를 위한 단일 투여량으로서 맞춰진 물리적으로 구별되는 단위를 말하며; 각 단위는 요구되는 약학적 허용 담체와 연합되어 원하는 치료 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 선결된 양을 함유한다.

불활성화- MVA의 투여 및 치료 요법

불활성화-MVA의 투여는 비경구, 예를 들어, 종양내, 또는 정맥내 투여를 비롯한 경로의 조합을 이용하여 이루어질 수 있다. 일 실시형태에서, 불활성화-MVA는 직접적 국소 반응을 원하는 경우, 예를 들어 종양내 주사에 의해, 종양 내로 직접적으로 투여된다. 부가적으로, 불활성화-MVA의 투여 경로는 변할 수 있으며, 예를 들어, 종양내 주사를 이용하여 먼저 투여한 후, 이어서 정맥내 주사를 통해 투여하거나, 또는 임의의 그 조합일 수 있다. 불활성화-MVA 주사의 치료적 유효량은 규정된 기간 동안 규정된 투여 빈도로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 불활성화-MVA는 다른 치료 처리와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 불활성화-MVA는 부피가 큰 원발성 종양에 걸린 개체를 위해 신아쥬반트(neoadjuvant)(수술전) 또는 아쥬반트(수술후) 세팅에서 투여될 수 있다. 그러한 최적화된 치료 계획은 종양에 대한 면역 반응을 유도하고, 수술과 같은 일차 치료법 전 및/또는 후에 개체에서 종양 크기를 감소시킬 것으로 예상된다. 또한, 불활성화-MVA는 화학요법 또는 방사선과 같은 다른 치료적 처리와 함께 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 불활성화-MVA 바이러스는 떨어진 간격으로, 예를 들어, 매주 또는 매월 적어도 한번 반복적으로 투여되지만, 필요하면 더 자주, 예를 들어, 효과가 지속되는 한 수 주, 수 개월, 수 년 또는 무기한으로 매주 2회씩 투여될 수 있다. 용인된다면 그리고 지속되거나 증가된 효과를 야기한다면 더 빈번한 투여가 고려된다. 본 발명 방법의 효과는 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 암세포 수의 감소, 종양 크기의 감소, 종양의 박멸, 말초 기관 내로의 암세포 침윤의 억제, 전이성 성장의 억제 또는 안정화, 종양 성장의 억제 또는 안정화, 및 삶의 질의 안정화 또는 개선. 또한, 효과는 종양에 대한 면역 반응의 유도, T 헬퍼 세포의 활성화, 세포독성 CD8⁺ T 세포의 증가, 또는 조절 CD4+ 세포의 감소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 흑색종의 맥락에서, 효과는 흑색종의 처음 진단 후 1년, 2년, 3년, 4년, 5년 이상 이내에 재발 또는 전이가 없는 것일 수 있다. 유사한 평가가 결장암 및 다른 고형 종양에 대해 이루어질 수 있다.

일부 다른 실시형태에서, 종양 덩어리 또는 종양 세포는 인 비보, 엑스 비보 또는 인 비트로에서 불활성화-MVA로 처리된다.

실시예

재료 및 방법

일반적으로, 본 발명에서 이용되는 시약은 상업적 공급원으로부터 입수되거나 그렇지 않으면 그 대응물이 상업적으로 또는 공중이 입수가능하다.

바이러스 및 세포주

MVA 바이러스는 게르트 수터(Gerd Sutter)(뮌휀 대학)가 제공하였으며, BHK-21(베이비 햄스터 신장 세포, ATCC CCL-10) 세포에서 증식되었으나, 두 재료 모두 상업적으로 및/또는 공개적으로 이용가능하다. 바이러스를 36% 수크로스 쿠션을 통해 정제하였다. BSC40 세포를 5% 태아 소 혈청(FBS), 페니실린(100 units/ml), 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 구매가능함, Cat# 11965-092)에서 유지하였다. BHK-21을 10% FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산(NEAA), 및 50 mg/ml 젠타마이신을 함유한 이글 최소 필수 배지(Eagle's Minimal Essential Medium)(Eagle's MEM, 라이프 테크놀로지스로부터 구매가능함, Cat# 11095-080)에서 배양하였다. 쥐 흑색종 세포주 B16-F10은 원래 아이. 피들러(I. Fidler)(MD 앤더슨 암센터(Anderson Cancer Center))로부터 입수하였다. B16-F10 세포는 10% FBS, 100 Units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 0.1 mM NEAA, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 및 10 mM HEPES 버퍼로 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지하였다.

모든 세포는 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 성장시켰다.

열-MVA는 정제된 MVA 바이러스를 1시간 동안 55℃에서 항온처리하여 생성하였다. UV-MVA의 생성을 위하여, MVA를 15분 동안 365 nm UV 램프를 가진 스트라타링커(Stratalinker) 1800 UV 크로스-링커(스트라타진((Stratagene))에서 UV 조사하였다.

6주 내지 10주령의 암컷 C57BL/6J 마우스를 잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory)(Stock # 000664)로부터 구입하여 골수-유래 수지상 세포의 제조를 위해 그리고 인 비보 실험을 위해 이용하였다. 이들 마우스를 슬로안 케터링 연구소(Sloan Kettering Institute)의 동물 시설에서 유지하였다. 모든 절차를 국립 보건원의 실험 동물의 보호 및 이용을 위한 지침(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institute of Health)의 권장 사항에 따라 엄격하게 수행하였다. 프로토콜은 슬로안-케터링 암 연구소(Sloan-Kettering Cancer Institute)의 동물 실험 윤리 위원회에 의해 승인되었다. cGAS^-/-, IRF3^-/-, IRF7^-/-, IRF5^-/-, Batf3^-/-, 및 STING^{Gt / Gt} 마우스는 지지안 첸(Zhijian Chen) 박사(텍사스 사우스웨스턴 대학 의료센터; cGAS^-/-), 타다츠구 타니구치 박사(Tadatsugu Taniguchi)(도쿄 대학; IRF3^-/- 및 IRF7^-/-), 탁 막(Tak Mak) 박사(토론토 대학; IRF5^-/-); 케네스 머피(Kenneth Murphy) 박사(워싱턴 대학; Batf3^-/-), 및 러셀 반스(Russell Vance) 박사(캘리포니아 대학 버클리 캠퍼스; STING^{Gt / Gt})의 실험실에서 생성되었다. IFNAR1^-/- 마우스는 에릭 파메르(Eric Pamer) 박사(슬로안 케터링 연구소)에 의해 제공되었으며; 마우스는 B&K 유니버셜(Universal)로부터 구매하여 6세대 넘게 C57BL/6 마우스와 역교배하였다. IRF5^-/- 마우스를 파울라 엠. 피타(Paula M. Pitha) 박사 실험실에서 적어도 6 세대 동안 C57BL/6J 마우스에 역교배한 후 슬로안 케터링 연구소로 옮겼다.

전술한 동물들의 상업적 공급원은 다음과 같다:

마우스	공급원	상품
cGAS-/-	지지안 첸	잭슨(Jackson) Stock# 026554
STINGGt / Gt	러셀 반스	잭슨 stock# 017537
IRF3-/-	티.타니구치	타니구치 랩(Taniguchi lab) http://www2.brc.riken.jp/lab/animal/detail.php?reg_no=RBRC00858
IRF7-/-	티.타니구치	타니구치 랩 https :// www2.brc . riken .jp/lab/animal/detail. php?brc _no=RBRC01420
IRF5-/-	탁 막	잭슨 stock# 017311
Batf3-/-	케네스 머피	잭슨 stock# 013755
IFNAR1-/-	에릭 파메르	잭슨 stock# 010830

골수-유래 수지상 세포의 생성

마우스의 경골 및 대퇴골로부터의 골수 세포를, 먼저 뼈로부터 근육을 제거한 후 10% FCS를 가진 RPMI를 가진 0.5 cc U-100 인슐린 시린지(벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))을 이용하여 세포를 세척하여 수집하였다. 원심분리 후, 세포를 1-3분 동안 얼음에서 항온처리하여 적혈구 용해를 위한 ACK 용해 버퍼(론자(Lonza))에 재현탁시켰다. 그 후 세포를 수집하고, 신선한 배지에 재현탁시키고, 40-㎛ 세포 스트레이너(BD 바이오사이언시즈(Biosciences))를 통해 여과하였다. 세포의 수를 계수하였다. GM-CSF-BMDC의 생성을 위해, 골수 세포(각각 15 cm 세포 배양 디쉬에 5백만 세포)를 10-12일 동안 GM-CSF(30 ng/ml, 슬로안 케터링 연구소의 단클론 항체 코어 시설(Monoclonal Antibody Core facility)에 의해 생산됨)의 존재하에서 CM에서 배양하였다. CM은 10% 태아 소 혈청(FBS), 100 Units/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신, 0.1mM 필수 및 비필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 1 mM 소듐 피루베이트 및 10 mM HEPES 버퍼로 보충된 RPMI 1640 배지이다. 이전 배지의 50%를 신선한 배지로 교체하여 2일 마다 세포에 공급하고 3-4일 마다 재플레이팅하여 부착 세포를 제거하였다. 비부착 세포만을 실험을 위해 사용하였다.

RNA 분리 및 실시간 PCR

알엔이지 미니(RNeasy Mini) 키트(퀴아젠(Qiagen))을 이용하여 RNA를 전세포 용해물로부터 추출하고 퍼스트 스트랜드(First Strand) cDNA 합성 키트(퍼멘타스(Fermentas))를 이용하여 역전사하였다. 유전자-특이적 프라이머를 이용하여 SYBR 그린 피씨알 메이터 믹스(Green PCR Mater Mix)(라이프 테크놀로지스) 및 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) 7500 실시간 PCR 장비(라이프 테크놀로지스)로 정량적 실시간 PCR을 세벌로 실시하였다. 상대적 발현을 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 수준에 정규화하였다.

하기 프라이머를 실시간 PCR을 위해 이용하였다: IFNA4 전방: 5'-CCTGTGTGATGCAGGAACC-3', IFNA4 역방: 5'-TCACCTCCCAGGCACAGA-3'; IFNB 전방: 5'-TGGAGATGACGGAGAAGATG-3', IFNB 역방: 5'-TTGGATGGCAAAGGCAGT-3'; GAPDH 전방: 5'-ATCAAGAAGGTGGTGAAGCA-3', GAPDH 역방: AGACAACCTGGTCCTCAGTGT-3'. 상대적 발현을 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제(GAPDH) 수준에 정규화하였다.

사이토카인 분석

세포를 1시간 동안 10의 MOI로 다양한 바이러스로 감염시키거나 가짜 감염시켰다. 접종물을 제거하고 세포를 PBS로 두 번 세척하고 신선한 배지로 항온처리하였다. 상등액을 감염 후 다양한 시간에 수집하였다. 사이토카인 수준은 IFN-α/β(PBL 바이오메디컬 래보래토리즈(Biomedical Laboratories)), IL-6, CCL4, 및 CCL5(R & D 시스템즈(systems))를 위한 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 이용하여 측정하였다.

웨스턴 블롯 분석

WT 및 KO 마우스로부터의 BMDC(1 x 10⁶)을 10의 MOI(감염 다중도)의 MVA 또는 등가량의 열-MVA, 또는 UV-MVA로 감염시켰다. 감염 후 다양한 시간에, 배지를 제거하고 세포를 수집하였다. 전세포 용해물을 제조하였다. 동량의 단백질을 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동시키고 폴리펩티드를 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. IRF3의 인산화를 IRF3의 포스포세린-396에 대해 특이적인 토끼 다클론 항체(셀 시그널링(Cell Signaling))를 이용하여 결정하였다. IRF3의 수준은 IRF3에 대한 토끼 다클론 항체(셀 시그널링)를 이용하여 결정하였다. 항-STING 항체는 셀 시그널링으로부터 구입하였다. 백시니아 E3 단백질 수준은 스튜어트 엔. 이삭스(Stuart N. Isaacs) 박사(펜실베니아 대학)가 제공한 항-E3 단클론 항체(MAb 3015B2)를 이용하여 결정하였다[85]. 항-글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(GADPH) 또는 항-β-액틴 항체(셀 시그널링)을 로딩 대조군으로 이용하였다.

B16-F10 흑색종 세포를 10의 MOI의 MVA 또는 등가량의 열-MVA로 감염시켰다. 세포 용해물을 감염 후 다양한 시간에 수집하였다. 전술한 항-포스포-IRF3, 항-IRF3, 및 항-GAPDH 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하였다.

일측 피내 종양 이식 및 면역 체크포인트 차단제의 전신 투여의 존재 또는 부재하에서 바이러스의 종양내 주사

B16-F10 흑색종(50 ㎕ 부피 내에 1x 10⁵ 세포)를 STING^{Gt / Gt} 또는 Batf3^-/- 또는 연령-매치된 WT C57BL/6J 마우스의 우측 옆구리 상의 면도된 피부내로 피내 이식하였다. 이식 후 10 내지 12일 후, 종양 크기를 측정하고, 마우스가 마취되었을 때 직경이 3 mm 이상인 종양에 열-MVA (50 ㎕ 부피 내에 2 x 10⁷ pfu의 MVA에 해당함)또는 PBS를 주사할 것이다. 바이러스는 각 실험에서 특정된 대로 매주 한번 또는 매주 두 번 주사하였다. 마우스를 매일 모니터하고 종양 크기를 일주일에 두 번 측정하였다. 종양 부피를 하기 식에 따라 계산하였다: l(길이) x w(넓이)x h(높이)/2. 고통의 신호가 있거나 종양의 직경이 10 mm에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다. 마우스가 안락사되었을 때 혈청을 수집하였다.

면역 체크포인트 차단제와 열-MVA의 조합을 평가하기 위하여, 본 발명자들은 복강내로 전달된 항-CTLA-4 항체(100 ㎕의 부피 내에 100 ㎍)의 존재 또는 부재하에서 열-MVA 또는 PBS의 종양내 주사로 마우스를 처리하였다. 마우스에게 3-4일 마다 바이러스와 항체를 제공하였다(매주 두 번씩). 매일 동물을 모니터하고, 3일 마다 종양 크기를 측정하였다. 하기 식에 따라 종양 부피를 계산하였다: l(길이) x w(넓이) x h(높이)/2. 고통의 신호가 있거나 종양의 직경이 10 mm에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.

일부 경우에, 1x 10⁵ MC38 결장 선암 세포를 면도된 마우스의 우측 옆구리 상에 피내로 이식하였다. 7일 후, 종양에 전술한 것과 동일한 투여량으로 매주 두번씩 PBS, 열-MVA, 또는 UV-MVA를 주사하였다. 매일 동물을 모니터하고, 3일 마다 종양 크기를 측정하였다. 하기 식에 따라 종양 부피를 계산하였다:l(길이) x w(넓이) x h(높이)/2. 고통의 신호가 있거나 종양의 직경이 10 mm에 도달했을 때 마우스를 안락사시켰다.

전신적 항종양 면역의 발달을 평가하기 위한 종양 공격

B16-F10 쥐 흑색종 모델에 대해, 우측 옆구리 상에 1 x 10⁵ 세포(50 ㎕ 부피 내)를 피내로 주사하여 종양을 이식하고 PBS 또는 열-MVA(50 ㎕ 부피 내의 열불활성화된 2 x 10⁷ pfu의 MVA의 등가물)을 종양내로 전달하여 처리하였다. 마우스를 종양 성장 및 생존에 대해 30-80일 동안 모니터하였다. 생존한 마우스를 대측에서 치사량의 B16-F10(1 x 10⁵ 세포)의 피내 전달로 재공격하였다. 마우스를 종양 성장에 대해 30-80일 동안 모니터하였다. 대안적으로, 그들을 치사량의 B16-F10(1 x 10⁵ 세포)의 정맥내 전달에 의해 공격한 후, 재공격 후 3주에 안락사시켜 폐 표면 상에 종양의 존재를 평가하였다.

MC38 쥐 결장 선암 모델에 대해, 우측 옆구리에 피내로 1 x 10⁵ 세포를 주사하여 종양을 이식하고 PBS, 열-MVA 또는 UV-MVA(열- 또는 UV-불활성화된 2 x 10⁷ pfu의 MVA의 등가물)을 종양내로 전달하여 처리하였다. 마우스를 종양 성장 및 생존에 대해 60일 동안 모니터하였다. 생존한 마우스를 대측에서 치사량의 B16-F10 (1 x 10⁵ 세포)의 피내 전달에 의해 재공격하였다. 종양 성장에 대해 마우스를 60일 동안 모니터하였다.

T 세포 고갈 실험

B16-F10 쥐 흑색종 세포(50 ㎕ 부피 내의 1 x 10⁵ 세포)를 6-8주령의 면도된 WT C57B/6 마우스의 우측 옆구리 내로 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 8일에, 매주 두 번씩 열-MVA(2 x 10⁷ pfu의 MVA의 등가 투여량) 또는 PBS를 종양에 주사하였다. CD4⁺, CD8⁺ 및 NK 세포에 대한 고갈 항체(200 ㎍의 GK1.5, 2.43, 및 PK136)(모노클로날 항체 코어 시설, MSKCC)(참고. Avogadri et al., PloS One 2010)를 바이러스 감염 전 1일에 시작하여 매주 두 번씩 복강 내로 주사하고, 동물이 사망하거나, 안락사되거나, 완전히 종양이 제거될 때까지 그들을 이용하였다. 매일 마우스를 모니터하고 종양 크기를 측정하였다. 표적화된 면역 세포의 고갈을 4회 항체 투여 후 마우스의 말초 혈액의 FACS에 의해 확인하였다.

양측 종양 이식 모델 및 면역 체크포인트 차단제의 전신 또는 종양내 투여의 존재 또는 부재하에서 종양내 바이러스 주사

요약하면, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 10⁵ 및 좌측 옆구리에 1 x 10⁵). 종양 이식 후 8일에, 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 2 x 10⁷ pfu의 MVA 또는 등가량의 열-MVA를 종양내로 주사하였다. 종양 크기를 측정하고 1주일에 2회씩 종양을 주사하였다. 마우스의 생존을 모니터하였다.

일부 실험에서, MC38 결장 선암 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 10⁵ 및 좌측 옆구리에 1 x 10⁵).

일부 실험에서, STING^{Gt / Gt}, Batf3^-/- 마우스 및 WT 연령-매치 대조군을 양측 B16-F10 흑색종 이식을 위해 사용하였으며, 마우스의 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 PBS 또는 열-MVA로 처리하였다.

일부 실험에서, 양측 종양을 가진 마우스를 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에의 열-MVA의 종양내 주사로 그리고 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1을 비롯한 면역 체크포인트 차단 항체의 복강내 전달로 처리하였다.

일부 실험에서, 양측 종양을 가진 마우스를 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에의 열-MVA 및 항-CTLA-4 항체(복강내 전달을 위해 사용된 투여량의 1/10)의 종양내 주사로 처리하였다. 주사 및 비주사 종양의 크기를 측정하고 마우스의 생존을 모니터하였다.

DC 성숙의 유세포 분석

DC 성숙 분석을 위하여, WT 및 STING^{Gt / Gt} 마우스로부터 BMDC를 생성하고 10의 MOI의 MVA로 또는 등가량의 열-MVA로 처리하였다. 세포를 감염 후 14시간에 수집한 후 37 ℃에서 15분 동안 픽스 버퍼(Fix Buffer) I(BD 바이오사이언시즈)로 고정시켰다. 세포를 세척하고, 얼음에서 30분 동안 펌버퍼(PermBuffer)(BD 바이오사이언시즈)로 투과성으로 만들었으며, 30분 동안 MHC 클래스 I, CD40, CD86, 및 CD80에 대한 항체로 염색하였다. 세포를 LSRII 유세포 분석기(BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타(Treestar))로 분석하였다.

종양 침윤 면역 세포의 유세포 분석

종양 또는 종양 배수 림프절 내의 면역 세포 표현형 및 특징을 분석하기 위하여, 본 발명자들은 하기 프로토콜(Zamarin et al., 2014)에 따라 FACS 분석을 하기 전에 세포 현탁액을 생성하였다. 먼저, PBS, MVA 또는 열-MVA로 첫번째 처리 후 7일 및 두번째 처리 후 3일에 겸자 및 수술 가위를 이용하여 주사 및/또는 비주사 종양을 분리하였다. 그 후 종양을 칭량하였다. 종양 또는 종양 배수 림프절을 잘게 으깬 후 37℃에서 30분 동안 리버라제(Liberase)(1.67 Wunsch U/ml) 및 DNase(0.2mg/ml)와 항온처리 하였다. 세포 현탁액을 반복 피펫팅에 의해 생성하고, 70-㎛ 나일론 필터를 통해 여과한 후, 완전한 RPMI로 세척한 후, 피콜(Ficoll) 정제하여 죽은 세포를 제거하였다. 세포를 항-CD3, CD45, CD4, 및 CD8 항체로 표면 라벨링하였다. 살아있는 세포는 고정 염료 eFluor506(이바이오사이언스(eBioscience))를 이용하여 죽은 세포로부터 구별된다. 이들을 FoxP3 고정 및 투과 키트(이바이오사이언스)를 이용하여 추가로 투과성으로 만들고 Ki-67, FoxP3, 및 그랜자임 B에 대해 염색하였다. LSRII 유세포분석기(BD 바이오사이언시즈)를 이용하여 데이터를 획득하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어(트리스타)를 이용하여 분석하였다.

ELISA에 의한 항-흑색종 및 항-바이러스 항체 측정

마우스의 혈청 내의 항-B16 흑색종 항체 농도를 결정하기 위하여, 100 ㎕ 배지 내의 5 x 10⁴ B16-F10 세포/웰을 96웰 배양 플레이트에 첨가하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 2회 세척하였다. 세포를 10% 완충된 포르말린(125 ㎕)로 처리하고 실온에서 15분 동안 고정시켰다. 그 후 플레이트를 PBS로 3회 세척하였다. 1시간 동안 실온에서 1% BSA(250 ㎕)를 가진 PBS로 차단한 후, 1% BSA를 가진 PBS에서 희석된 마우스 혈청(1:500)을 100 ㎕/웰로 추가하였다. 플레이트를 5회 PBST로 세척하였다. 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 그 후 1% BSA를 가진 PBS에서 희석된 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)-접합된 항-마우스 IgG (1:2000)를 플레이트에 추가하고 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBS로 5회 세척하고 10분 동안 실온에서 기질 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 TMB (100 ㎕/웰)과 항온처리하였다. 황산(2N, 50 ㎕/웰)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 각 웰의 광학 밀도를 450 nm에 설정된 미세플레이트 판독기를 이용하여 결정하였다.

마우스의 혈청에서 항-백시니아 바이러스 항체 농도를 결정하기 위하여, 100 ㎕ PBS 내의 열-MVA(10 ㎍/ml)/웰을 96웰 배양 플레이트에 첨가하고 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 2회 세척하였다. 1시간 동안 실온에서 1% BSA (250 ㎕)를 가진 PBS로 차단한 후, 1% BSA를 가진 PBS에서 희석된 마우스 혈청(1:200)을 100 ㎕/웰로 추가하였다. 검출 프로토콜의 나머지는 상기한 바와 동일하다.

시약

시약의 상업적 공급원은 다음과 같았다: CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 ODN2216(인비트로겐(Invitrogen)); 본 발명자들은 하기 항체를 사용하였다. 치료 항-CTLA4(클론 9H10 및 9D9), 항-PD1(클론 RMP1-14)를 바이옥스셀(BioXcell)로부터 구매하였으며; 유세포분석을 위해 사용된 항체는 이바이오사이언스(CD45.2 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 700, CD3 PE-Cy7, CD4 APC-efluor780, CD8 PerCP-efluor710, FOXP3 알렉사 플루오르 700, MHC 클래스 I APC, CD40 APC, CD80 APC, CD86 APC), 인비트로겐(CD4 QDot 605, 그랜자임 B PE-텍사스 레드(Texas Red), 그랜자임 B APC), BD 파르민겐(Pharmingen)(Ki-67-Alexa Fluor 488)로부터 구매하였다.

통계학

투-테일 언페어드 스튜던츠 t 테스트(Two-tailed unpaired Student's t test)를 연구 내의 두 그룹의 비교를 위해 사용하였다. 생존 데이터는 로그-순위( log-rank)(만텔-콕스(Mantel-Cox)) 테스트에 의해 분석하였다. 유의한 것으로 간주된 p 값은 다음과 같이 도면에 나타난다: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001; ****, p < 0.0001.

실시예 1

열-불활성화 MVA는 쥐 cDC에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN 생산을 유도한다

MVA의 열-불활성화(열-MVA)가 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN 유도를 야기하는지 여부를 시험하기 위하여, MVA를 1시간 동안 55℃에서 항온처리하여, 감염성이 1000-배 감소하였다. 골수-유래 수지상 세포를 GM-CSF(GM-CSF-BMDC 또는 cDC)의 존재하에서 배양하고 10의 감염 다중도(MOI)의 MVA로 또는 등가량의 열-MVA로 감염시켰다. 세포를 감염 후 6시간에 수집하고 감염된 세포 및 가짜감염 세포로부터 분리된 RNA의 정량적 실시간 PCR 분석을 수행하였다. cDC의 MVA 감염은 가짜감염 세포에 비하여, IFNA4 및 IFNB mRNA 수준을 각각 4.8-배 및 148-배 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, 열-MVA의 감염은 각각 IFNA4 및 IFNB mRNA 수준을 22.4-배 및 607-배 극적으로 증가시켰다(도 1a). 이들 결과는 열-MVA가 IFNA4 및 IFNB 유전자 발현의 유도에서 MVA 보다 더 강함을 나타낸다(***, p < 0.001).

열-MVA 또는 MVA-감염 cDC에 의한 타입 I IFN 분비 유도의 동력학을 평가하기 위하여, 열-MVA 또는 MVA 감염 후 다양한 시간(0, 4, 8, 16, 및 22 시간)에 상등액을 수집하고, 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 수준을 ELISA에 의해 결정하였다. 열-MVA는 감염 후 8시간에 IFN-α(1650 pg/ml) 및 IFN-β(1975 pg/ml) 둘 모두를 강하게 유도하여, 동일한 시점에서 MVA에 의해 유도된 것보다 10-배 및 6-배 더 높았다. MVA-유도된 IFN-α 및 IFN-β는 감염 후 8시간과 22시간 사이에 계속 상승한 반면, 열-MVA 유도된 IFN-α 수준은 이 기간 동안 보통으로 증가였으며, 열-MVA 유도된 IFN-β는 감염 후 8시간에 정점에 달한 후 감소하였다(도 1b). 웨스턴 블롯 분석은 선천적 면역 반응을 약화시키는 E3 단백질이 열-MVA 감염된 cDC에서는 생산되지 않았지만, MVA-감염된 세포에서는 발현되었음을 보여주었다(도 1c). 또한, 열-MVA는 감염 후 4시간 및 8시간에 MVA 보다 더 높은 수준의 IRF3 인산화를 야기하였다(도 1c). 모두 함께, 이들 결과는 열-MVA가 cDC에서의 타입 I IFN 생산에서 MVA 보다 강한 유도자임을 입증한다.

실시예 2

열- MVA -유도된 타입 I IFN 생산은 cGAS /STING에 의해 매개된 세포기질 DNA-센싱 경로, 및 전사 인자 IRF3 / IRF7 , 및 IFNAR1에 의존한다

cDC의 열-MVA 감염이 세포기질 DNA 센서 cGAS(시클릭 GMP-AMP 신타제)[62, 63], 및 그의 어댑터 STING[59, 69]에 의해 매개된 세포기질 DNA-센싱 경로를 통해 타입 I IFN 유도를 유발하는지 여부를 시험하기 위하여, cGAS^-/-[86] 마우스 및 연령-매치된 WT 대조군으로부터 cDC를 생성하고 열-MVA로 감염시켰다. 정량적 실시간 PCR 분석을 이용하여, 감염 후 6시간에 열-MVA-유도된 IFNA4 및 IFNB 유전자 발현이 둘 모두 cGAS-결핍 세포에서 감소하였음이 밝혀졌다(도 2a, 2b). 감염 후 22시간에 수집된 상등액의 분석은 또한 열-MVA-유도된 IFN-α/β 분비가 cGAS-결핍 세포에서 중단되었음을 보여주었다(도 2a, 2b).

STING은 세포기질 DNA-센싱 경로를 위한 중요한 어댑터이다[59, 69, 87, 88]. 또한 기능성 STING이 결핍된 STING^{Gt / Gt} 마우스로부터 cDC를 생성하였다[89]. 열-MVA 유도된 타입 I IFN 유전자 발현 및 cDC로부터의 IFN-α/β 분비 또한 STING에 의존하는 것으로 밝혀졌다(도 2c, d). 웨스턴 블롯 분석은 감염 후 4 및 8시간에 열-MVA가 ser-396에서 IRF3의 인산화를 유도하였음을 입증하였으며, 이는 cGAS 또는 STING-결핍 세포에서는 중단되었다(도 2e, f). 열-MVA 감염이 세포기질 DNA-센싱 경로를 통해 DC 성숙을 유발하는지 여부를 시험하기 위하여, STING^{Gt / Gt} 마우스 및 연령-매치된 WT 대조군으로부터의 cDC를 열-MVA로 감염시켰다. 세포를 감염 후 14시간에 수집하고 MHC 클래스 I (MHCI) CD40, CD86, 및 CD80을 비롯한 DC 활성화 마커에 대해 염색하였다. 열-MVA 감염은 WT 세포에서 CD40과 CD86의 발현을 주목할만하게 유도하였으며, MHC I 및 CD80의 발현을 온건하게 증가시켰다(도 2g). 하지만, 활성화 마커의 발현은 STING-결핍 세포에서는 유의하게 감소되었다(도 2g). 이들 결과는 DC 성숙의 열-MVA 유도가 세포기질 DNA-센싱 경로를 통해 주로 매개됨을 나타낸다. 본 결과는 MVA 및 열-MVA로부터의 바이러스 DNA가 감염된 cDC의 세포기질로 방출되며 세포기질 DNA 센서 cGAS에 의해 검출되며, 이는 다시 두번째 메신저 cGAMP를 생성하여, STING 및 다운스트림 시그널링 경로의 활성화를 야기함을 의미한다.

타입 I IFN의 열-MVA-유도가 cGAS 및 STING에 더하여, IRF3, IRF5 및 IRF7을 요구하는지를 시험하기 위하여, cDC를 IRF3^-/-, IRF5^-/-, IRF7^-/- 및 연령-매치된 WT 마우스로부터 생성하고, 열-MVA로 감염시켰다. 열-MVA-유도된 IFNA4 유전자 발현 및 IFN-α 단백질 생산은 IRF3 및 IRF7에 의존하였으나, IRF5에는 비의존성이었다(도 3a, b). 또한, 열-MVA-유도된 IFNB 유전자 발현, 그리고 IFN-α 분비와 유사하게, IFN-β 단백질 분비가 IRF3 및 IRF7에 의존하지만 IRF5에는 의존하지 않았다(도 3a, b). 열-MVA-유도된 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 생산은 IRF7-결핍 세포에서 각각 74% 및 67% 감소되었다(도 3a, b). 열-MVA-유도된 IFNA4 유전자 발현 및 IFN-α 단백질 분비는 IFNAR1에 의존성인 한편, 열-MVA-유도된 IFNB 유전자 발현 및 IFN-β 분비는 IFNAR1-결핍 세포에서 각각 82% 및 62% 감소되었다(도 3c, d). 이들 결과는 열-MVA-유도된 타입 I IFN 유도가 전사 인자 IRF3 및 IRF7 뿐만 아니라 IFNAR1에 의해 매개된 타입 I IFN 양성 피드백 루프를 요구함을 나타낸다.

실시예 3

열- MVA는 인 비보에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도한다

열-MVA가 인 비보에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도하는지 여부를 시험하기 위하여, 꼬리 정맥 주사를 통해 열-MVA 또는 MVA를 C57B/6 마우스 내로 접종하고, 감염 후 6시간에 혈청을 수집하였다. 혈청 내의 IFN-α 및 IFN-β의 수준은 MVA-처리된 마우스에서 보다 열-MVA-처리된 마우스에서 유의하게 더 높았다(도 4a) (***, p < 0.001). 이들 결과는 열-MVA가 배양된 cDC에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도할 뿐만 아니라, 인 비보에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도함을 나타낸다.

실시예 4

열- MVA는 STING/ IRF3 / IRF7 -의존 방식으로 인 비보에서 타입 I IFN 생산을 유발한다

타입 I IFN의 열-MVA 인 비보 유도가 IFNAR1을 요구하는지 여부를 시험하기 위하여, IFNAR1^-/- 및 WT 연령-매치된 대조군 마우스의 꼬리 정맥 주사를 통한 정제된 열-MVA의 정맥내(IV) 접종을 수행하였다. WT 마우스의 열-MVA 감염은 2256 pg/ml 및 1901 pg/ml의 수준까지 IFN-α 및 IFN-β 생산을 유도하였으며, 이는 IFNAR1^-/- 마우스에서는 각각 60% 및 35% 감소되었다(도 4b)(**,p < 0.01; ***, p < 0.001).

열-MVA-유도된 IFN-α 분비는 WT 대조군에 비하여 STING^{Gt / Gt} 마우스에서 89% 감소한 반면, 열-MVA-유도된 IFN-β 분비는 STING^{Gt / Gt} 마우스에서 중단되어(도 4c), 인 비보에서 열-MVA-유도된 타입 I IFN 생산 또한 STING에 의존함을 나타낸다. 또한, 열-MVA-유도된 IFN-α는 WT 대조군에 비하여 IRF3^-/- 마우스에서 74% 감소한 반면, 열-MVA-유도된 IFN-β는 IRF3^-/- 마우스에서 98% 감소하는 것으로 밝혀졌다. 열-MVA-유도된 IFN-α 및 IFN-β 분비는 IRF7^-/- 마우스에서 감소하였다(도 4c). 이들 결과는 열-MVA-유도된 타입 I IFN이 인 비보에서 STING 및 IRF3/IRF7을 요구함을 나타낸다.

실시예 5

B16-F10 흑색종 세포의 열- MVA 감염은 타입 I IFN 및 프로염증성 사이토카인 및 케모카인의 생산을 유도한다

종양 세포의 열-MVA 감염이 선천적 면역 반응을 유발하는지 여부를 시험하기 위하여, B16-F10 흑색종 세포를 10의 MOI의 MVA 또는 등가량의 열-MVA로 감염시키고, 감염 후 6시간에 세포를 수집하고 상등액을 감염 후 22시간에 수집하였다. 정량적 실시간 PCR 분석은 B16-F10 세포의 열-MVA 감염이 MVA 보다 더 높은 수준의 Ifna4, Ifnb, Ccl5, 및 Il6 유전자 발현을 유도함을 보여주었다(도 5a). ELISA 분석은 열-MVA가 B16-F10 세포에서 MVA 보다 더 높은 수준의 IFN-α, IFN-β, CCL5, 및 IL-6 단백질 분비를 유도하였음을 보여주었다(도 5b). 웨스턴 블롯 분석은 열-MVA 감염이 B16-F10 흑색종 세포에서 MVA 보다 더 높은 수준의 IRF3의 인산화를 유도함을 입증하였다(도 5c). 또한, 열-MVA 감염은 B16 세포 상에서 MHC 클래스 I 분자 발현을 유도한 반면, MVA 감염은 그렇게 하지 못했다. 이들 결과는 B16 세포의 열-MVA 감염이 타입 I IFN 및 프로염증성 사이토카인 및 케모카인의 방출을 통해 종양 세포에 대한 선천적 면역 반응을 유도할 뿐만 아니라, 종양 세포 상의 MHC 클래스 I 분자의 유도를 통해 종양의 면역원성을 변화시킴(향상시킴)을 제안한다.

실시예 6

1시간 동안 55℃가 MVA를 불활성화시키기 위한 최적의 조건이다

55℃가 MVA를 불활성화시키기 위한 최적 온도인지 여부를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 1시간 동안, 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 및 65℃를 비롯한 다양한 상이한 온도에서 MVA를 항온처리하였다. WT 마우스로부터의 cDC를 이들 바이러스 제제로 감염시키고 상등액을 감염 후 22시간에 수집하였다. 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 본 발명자들은 1시간 동안 55℃에서 불활성화된 MVA로 감염시킬 경우 cDC로부터 최고 수준의 IFN-α 및 IFN-β 분비를 유도하였음을 발견하였다(도 6a, b).

실시예 7

열- MVA의 종양내 주사는 쥐 이식가능 B16-F10 흑색종 모델에서 종양 박멸 및 전신성 항-종양 면역을 유도한다

이식가능 인 비보 B16-F10 흑색종 모델은 C57B/6 마우스의 옆구리의 일 측 상에 쥐 B16-F10 흑색종 세포 (1 x 10⁵)의 피내 이식에 관련된다. 종양 이식 후 10일에, 종양 직경이 대략 3 mm일 때, 열-MVA(2 x 10⁷ pfu MVA의 등가량) 또는 PBS를 매주 종양에 주사하였다. 열-MVA의 종양내 주사는 종양 박멸 및 마우스의 100% 생존을 야기하여(도 7a, b), 우수한 치료 효과를 입증하였다. 대조적으로, PBS가 종양내 주사된 모든 모델은 종양 성장이 계속되었으며, 종양 이식 후 19 및 21일에 안락사되었다(도 7a, b).

열-MVA의 종양내 주사 후 종양이 박멸된 마우스가 전신성 항-종양 면역이 발달하였는지 여부를 시험하기 위하여, 초기 종양의 박멸 후 8주에 대측에 치사량의 B16 흑색종 세포(1 x 10⁵)의 피내 이식에 의해 동물을 공격하였다. B16 흑색종 세포 또는 열-MVA에 노출된 적이 없는 천연 마우스를 대조군으로 사용하였다. 종양 공격 후 70일 동안 동물을 추적하였다. 열-MVA-처리된 마우스의 90%가 종양 공격에서 생존한 반면, 모든 천연 마우스가 종양이 성장하였으며 결국에는 안락사되었다(도 7c). 열-MVA-처리된 마우스가 전이와 유사하게, 상이한 기관에서 전신성 항-종양 면역을 발달시키는지 여부를 시험하기 위하여, 열-MVA-처리된 마우스가 B16-F10 흑색종 세포의 정맥내 전달을 통한 종양 공격을 거부할 수 있는지를 시험하였다. 천연 마우스 및 열-MVA-처리된 마우스 둘 모두가 정맥내 전달을 통해 1 x 10⁵ B16-F10 세포가 주어졌다. 마우스를 종양 공격 후 3-주에 안락사시켰다. 마우스의 폐를 수집하고 포르말린 함유 용액에서 고정시켰다. 폐 표면상의 종양을 해부 현미경하에서 가시화하여 계수하였다. 모든 천연 마우스가 폐 표면 상에 가시화된 평균 58개의 종양이 발생한 한편, 열-MVA-처리된 마우스 10마리 중 단지 한 마리만이 현미경 하에서 가시적인 2개의 종양 병소가 발생하였다(도 7d, ****, p < 0.0001). 종합적으로, 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 주사된 종양의 박멸 및 전신성 항종양 면역의 발달을 야기함을 나타낸다. 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 가능하게는 향상된 종양 항원 제시 및 종양-특이적 T 세포의 활성화를 통해, 강한 종양 백신 효과를 유발할 수 있음을 의미한다.

실시예 8

열- MVA는 종양 미세환경에서 면역학적 변화를 야기한다

열-MVA의 종양내 주사에 의해 유도된 종양 내의 면역학적 변화를 조사하기 위하여, 열-MVA 또는 PBS의 종양내 주사 후 3일에 종양을 수집하고 면역 세포 침윤물을 FACS에 의해 분석하였다. 종양 내의 생존 세포 중 CD3⁺CD45⁺ T 세포의 백분율은 PBS-처리된 종양에서의 6.5%에서 열-MVA-처리된 종양에서의 19.5%로 증가하였다(P=0.0002; 도 8a, g). 그랜자임 B를 발현하는(즉, 세포독성 표현형을 발현하는) CD8⁺ T 세포의 백분율의 증가가 또한 종양 내에서 관찰되었으며, 그 범위는 PBS-처리된 종양에서의 47.9% 내지 열-MVA-처리된 종양에서의 92.8%였다(P<0.0001; 도 8b, h). Ki-67⁺CD8⁺ T 세포(즉, 증식성 CD8⁺ T 세포)의 백분율은 51.2%에서 71.7%로 증가하였다(P=0.0008; 도 8c, i). 유사한 변화가 PBS로 처리된 종양에 비교하여 열-MVA로 처리된 종양 내의 CD4⁺ T 세포에 대해 관찰되었으며; 그랜자임 B⁺CD4⁺ T 세포(즉, 활성화된 T 헬퍼 세포)의 백분율이 PBS-처리된 종양에서의 3%에서 열-MVA-처리된 종양에서의 57%로 극적으로 상승하였다(P=0.0002; 도 8d, j). 부가적으로, Ki-67⁺CD4⁺ T 세포(즉, 증식성 CD4⁺ T 세포)의 백분율이 PBS-처리된 종양에서의 37.5%에서 열-MVA-처리된 종양에서의 79%로 증가하였다(P<0.0001; 도 8e 및 k). 대조적으로, Foxp3⁺CD4⁺ T 세포(즉, 조절 CD4⁺ T 세포)의 백분율은 PBS-처리된 종양에서의 34.7%에서 열-MVA-처리된 종양에서의 9.1%로 감소하였다(P<0.0001; 도 8f, n). 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 종양 내에서 헬퍼 CD4⁺, 세포독성 CD4⁺ (전체적으로, "이펙터 T 세포") 및 세포독성 CD8⁺ T 세포의 증식 및 활성화 및 CD4⁺ 조절 T 세포의 수반되는 감소를 비롯한, 종양 미세환경에서의 면역 반응을 극적으로 상향조절함을 나타낸다. 실시예 8의 결과와 함께, 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 종양 면역 억제 미세환경을 크게 변경시켜 항종양 면역의 발달을 촉진함을 나타낸다.

실시예 9

열- MVA는 또한 종양 -배수 림프절( TDLN )에서 면역학적 변화를 유도한다

열-MVA의 종양내 주사가 TDLN에서 면역학적 변화를 야기하는지 여부를 시험하기 위하여, TDLN을 열-MVA-처리된 또는 PBS-처리된 마우스로부터 분리하고 FACS에 의해 분석하였다. TDLN 내의 그랜자임 B⁺CD8⁺ T 세포의 백분율은 PBS로 처리된 마우스에서의 0.15%에서 열-MVA로 처리된 마우스에서의 3.04%로 증가하였다(P<0.0001; 도 9a 및 e). 또한, Ki-67⁺CD8⁺ T 세포의 백분율은 PBS로 처리된 마우스에서의 7.2%에서 열-MVA로 처리된 마우스에서의 17%로 증가하였다(P=0.0003; 도 9c, f). 이들 결과는 PBS-처리된 마우스에서 보다 열-MVA-처리된 마우스에서 TDLN 내에 더 많은 활성화되고 복제성인 CD8⁺ T 세포가 있음을 나타낸다. 활성화되고 복제성인 CD4⁺ T 세포의 유사한 증가가 또한 PBS-처리된 마우스에 비하여 열-MVA-처리된 마우스에서 관찰되었다. TDLN 내의 그랜자임 B⁺CD4⁺ T 세포의 백분율은 PBS로 처리된 마우스에서의 0.25%에서 열-MVA-처리된 마우스에서의 0.77%로 증가하였으며(P=0.002; 도 9b, g), TDLN 내의 Ki-67⁺CD4⁺ T 세포의 백분율은 PBS로 처리된 마우스에서의 10.6%에서 열-MVA-처리된 마우스에서의 18.4%로 증가하였다(P=0.002; 도 9d, h). 모두 함께, 이들 결과는 열-MVA의 종양내 주사가 종양 내에서뿐만 아니라 순환계에서도 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포 둘 모두의 활성화와 증식을 유도함을 나타낸다.

실시예 10

열- MVA의 종양내 주사는 야생형 대조군에 비하여 STING-결핍 마우스 또는 Batf3-결핍 마우스에서 B16 흑색종을 박멸하는데 있어서 덜 효과적이다

최근의 연구는 STING-매개 세포기질 DNA-센싱 경로가 종양에 대한 자발적 T 세포 반응 및 방사선-유도 항종양 면역에서 역할을 함을 보여주었다[7, 8, 90]. BATF3는 바이러스 및 종양 항원의 교차-제시에서 중요한 역할을 하는 CD8α⁺ 계통 DC의 발달을 위해 중요한 전사 인자이다[91, 92]. Batf3-결핍 마우스는 고도로 면역원성인 종양을 거부할 수 없었다[91]. STING 또는 Batf3가 열-MVA-매개 종양 소거에서 역할을 하는지 여부를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 WT C57B/6, STING^Gt/Gt, 또는 Batf3^-/- 마우스의 우측 옆구리 내로 B16-F10 흑색종 세포를 종양내로 이식하였다. 종양 이식 후 11일에, 종양에 열-MVA(2 x 10⁷ pfu의 등가 투여량) 또는 PBS를 표시된 대로 매주 주사하였다(도 10a 및 b). 본 발명자들은 열-MVA로 처리된 종양을 가진 WT 마우스 100%가 잔여 종양이 있다면 아주 적게 가지고서 생존한 한편, PBS로 처리된 모든 WT 마우스가 사망하였음(24일의 중앙 생존기간)을 발견하였다(도 10a 및 b). 본 발명자들은 또한 열-MVA로 처리된 STING-결핍 마우스의 7.7%만이 생존한 반면, PBS로 처리된 모든 STING-결핍 마우스가 사망하였음을 관찰하였다. 열-MVA 처리 후 WT 및 STING^{Gt / Gt} 마우스 사이의 생존의 차이는 통계적으로 유의하였다(P < 0.0001)(도 10a 및 b). STING^{Gt / Gt} 마우스에서 열-MVA 처리는 중앙 생존기간을 21일에서 28일로 연장시켰다(P < 0.0001)(도 10a 및 b). 더욱 놀랍게도, 모든 Batf3^-/- 마우스는 그들이 열-MVA 또는 PBS로 처리되었는지에 관계없이 사망하였다. 하지만, Batf3^-/- 마우스에서 열-MVA 처리는 중앙 생존 일수를 21일에서 30일로 연장하였다(P = 0.0025)(도 10a 및 b). 이들 결과는 STING-매개 세포기질 DNA-센싱 경로 및 CD8α⁺DC 둘 모두가 열-MVA-유도된 항종양 효과를 위해 요구됨을 입증한다.

실시예 11

CD8 ⁺ T 세포는 열- MVA -유도된 항종양 효과를 위해 요구된다

어느 면역 세포 타입이 열-MVA의 치료 효과를 위해 요구되는지를 결정하기 위하여, 본 발명자들은 항체 고갈 실험을 수행하였다. 요약하면, 본 발명자들은 WT C57B/6 마우스의 우측 옆구리 내로 B16-F10 흑색종 세포(2 x 10⁵)를 종양내로 이식하였다. 종양 이식 후 8일에, 표시된 대로 1주일에 2회씩 열-MVA(2 x 10⁷ pfu의 등가의 투여량) 또는 PBS를 종양에 주사하였다(도 10a). CD4⁺, CD8⁺ 및 NK 세포를 위한 고갈 항체(200 ㎍의 GK1.5, 2.43, 및 PK136)를 바이러스 주사 1일 전부터 시작하여 1주일에 2회씩 복강내로 주사하였다(도 11a). 본 발명자들은 열-MVA의 종양내 전달이 효율적인 종양 박멸을 야기하는 한편, CD8⁺ T 세포의 고갈은 열-MVA의 치료 효과의 극적인 소실을 야기함을 발견하였다(****, P < 0.0001)(도 11b, c, d, e). CD4⁺ 및 NK/NKT 세포의 고갈은 열-MVA의 치료 효과의 일부 소실만을 야기한다(도 11f, g). 이들 결과는 CD8⁺ T 세포는 열-MVA에 의해 유발된 항종양 효과에 필요한 한편, CD4⁺ 및 NK/NKT 세포 또한 항종양 효과에 기여함을 나타낸다. 항종양 효과에서 CD4⁺ T 세포의 역할은 CD4-고갈 항체의 존재하에서 열-MVA로 성공적으로 처리된 마우스에서 종양 공격으로부터의 보호의 부족에 의해 추가로 입증되었다(도 11h-i). 대조적으로, NK/NKT-고갈 항체의 존재 또는 부재하에서 열-MVA로 성공적으로 처리된 마우스는 종양 공격을 효과적으로 거부하였다(도 11h-i). CD4⁺ T 세포가 열-MVA-주사된 종양의 박멸에 절대적으로 필요하지는 않지만, 그들은 항-종양 획득 면역의 발달을 위해, 가능하게는 항종양 항체의 생성을 위해 중요한 것으로 결론짓는다. 실시예 8, 9, 10, 및 11과 함께, 본 발명자들은 열-MVA의 종양내 전달이 면역 세포 및 종양 세포에서 타입 I IFN의 유도를 야기하여, CD103⁺ 수지상 세포의 활성화를 유도하여, 종양 및 순환계 내에서 CD8⁺ T 세포에 종양 항원 교차-제시 및 획득 항종양 면역의 생성을 야기하는 것으로 추측한다.

실시예 12

STING-매개 세포기질 DNA- 센싱 경로 및 CD103 ⁺ DC 둘 모두가 열- MVA에 의한 항-흑색종 항체의 유도를 위해 요구된다

항-종양 항체 생산은 획득 면역의 중요한 양태이다. 열-MVA가 항-흑색종 항체 생산을 유도하는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 ELISA를 수행하여 열-MVA로 처리된 또는 가짜-처리된 마우스에서 항-B16 흑색종 항체의 혈청 농도를 결정하였다. 본 발명자들은 열-MVA 처리된 마우스만이 항-흑색종 항체를 생산함을 확인하였다(도 12a). 이 유도는 STING 또는 Batf3-결핍 마우스에서 중단된다(도 12a). 대조적으로, 항바이러스 항체의 생산은 STING 또는 Batf3에 의존하지 않는다(도 12b). 이들 결과는 이 동물 모델에서 종양 및 바이러스 항원 인식을 촉진하는 프로세스가 아마도 상이할 것임을 제안한다. 실시예 11로부터, 본 발명자들은 CD8⁺ T 세포가 주사 종양에서 종양 사멸을 위해 중요하며, 따라서 종양 항원의 방출을 위해 중요하며, 종양 항원은 B 세포에 의해 프로세싱되어 헬퍼 CD4⁺ T 세포의 존재하에서 항원-특이적 항체를 생성할 수 있음을 안다. 따라서, 본 발명자들은 Batf3-결핍 마우스에서, 항-종양 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포 둘 모두가 결핍되어, 항-흑색종 항체의 생산 실패에 기여하는 것으로 가정한다.

실시예 13

항- CTLA -4 항체의 복강내 전달과 열- MVA의 종양내 주 사의 조합은 일측 흑색종 이식 모델에서 상승적 항종양 효과를 유도한다

열-MVA의 종양내 주사가 면역 체크포인트의 차단제(예를 들어, 항-CTLA-4 항체)와 같은 현재의 면역요법의 치료 효과를 향상시키는 능력을 갖는지 여부를 조사하기 위하여, 종양-보유 마우스를 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달과 함께 열-MVA의 종양내 주사로 처리하였다. 요약하면, 본 발명자들은 WT C57B/6 마우스의 우측 옆구리 내로 B16-F10 흑색종 세포(2 x 10⁵)를 피내로 이식하였다. 종양 이식 후 10일에, 종양이 실시예 7, 10 또는 11에서의 것보다 크게 성장했을 때, 마우스를 하기 조합으로 처리하였다: PBS + 아이소타입 대조군, PBS + 항-CTLA-4 항체, 열-MVA + 아이소타입 대조군, 및 열-MVA + 항-CTLA-4. 도 11e에 나타난 대로, 종양 부피는 바이러스 주사 시작시에 시험된 그룹들 간에 일치하였다. PBS + 아이소타입 대조군 또는 PBS + 항-CTLA-4로 처리된 마우스를 종양 성장으로 인해 빨리 사망하였다(도 13a, b). 하지만, 열-MVA 처리 후, 열-MVA 주사를 맞은 종양은 유의하게 감소되거나 박멸되어, 마우스의 30%가 실험 종료시에(바이러스 주사 후 73일) 종양이 없었다(도 13c). 열-MVA 및 항-CTLA-4 항체를 이용한 처리는 열-MVA 처리 단독에 비하여 월등한 치료 효과를 야기하여, 마우스의 78%가 실험 종료시에 종양이 없었다(도 13d). 본 발명자들은 열-MVA의 종양내 주사와 항-CTLA-4 항체의 복강내 전달의 상승적 효과가 치유율 및 생존률에서의 극적인 증가를 야기함을 관찰하였다(도 13f, *, P < 0.05; **, P < 0.01; ****, P < 0.0001). 이들 결과는 열-MVA의 종양내 전달이 종양 면역 억제 미세환경의 변경을 야기하여, 항종양 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포 반응을 생성하며, 이는 항-CTLA-4 항체의 존재하에서 향상되거나 촉발됨을 나타낸다.

실시예 14

열- MVA는 MVA 보다 더 강한 항종양 면역 유도자이다

MVA는 대부분의 포유류 세포에서 비복제성인 약독화 백시니아 바이러스이다. 본 발명자들은 MVA가 B16 흑색종 세포에서 보통으로 복제함을 발견하였다(도 12a). 열-MVA는 감염성이 1000-배 감소되며 B16 흑색종 세포에서 복제하지 않는다(데이터 미도시). 본 발명자들은 열-MVA가 인 비트로에서(실시예 1 및 5) 뿐만 아니라 인 비보에서(실시예 4) 감염된 cDC 및 종양 세포에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도함을 고려할 때, 열-MVA가 MVA 보다 더 강한 항종양 면역 활성인자일 수 있다고 가정하였다. 본 발명자들은 양측 B16-F10 흑색종 이식 모델에서 열-MVA vs. MVA의 종양내 주사 간의 종양 박멸 효과 및 전신성 면역 생성을 직접적으로 비교하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 요약하면, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 10⁵ 및 좌측 옆구리에 1 x 10⁵). 종양 이식 후 8일에, 본 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 2 x 10⁷ pfu의 MVA 또는 등가량의 열-MVA를 종양내로 주사하였다. 종양 크기를 측정하고 1주일에 2회씩 종양에 주사하였다. 마우스 생존률을 또한 모니터하였다. 본 발명자들은 PBS로 처리된 마우스에서 종양이 우측 옆구리에서 빨리 성장하여 조기 사망을 야기함을 발견하였다(도 12c, d 및 b). 열-MVA 또는 MVA의 종양내 주사는 PBS에 비하여 종양 성장의 지연을 야기하고 생존률을 개선하였다(도 14b, ***, MVA vs. PBS를 위해 P < 0.001 , ****, 열-MVA vs. PBS를 위해 P < 0.0001). 열-MVA의 종양내 주사는 주사된 종양의 박멸에서(열-MVA의 경우 9/9 무종양 vs. MVA의 경우 6/9 무종양) 그리고 대측에서 비주사 종양의 성장을 지연하거나 억제하는데 있어서(열-MVA의 경우 5/9 무종양 vs. MVA의 경우에 1/9 무종양) MVA 보다 더 효과적이다(도 14e-h). 본 발명자들은 MVA-처리 마우스에 비하여 열-MVA-처리 마우스에서 개선된 생존률을 관찰하였다(도 14b, **, P < 0.01). 이들 결과는 (i) 바이러스 복제가 항종양 효과를 이루는데 필요하지 않으며; (ii) 열-MVA의 항종양 효과는 타입 I IFN을 강하게 유도하는 그 능력과 상관됨을 나타낸다.

실시예 15

열- MVA는 비주사 종양에서 MVA 보다 더 많은 면역 활성화 세포를 유도한다

전신성 항종양 면역의 유도에서 MVA에 비하여 열-MVA의 우월성의 기저의 면역 기전을 이해하기 위하여, 본 발명자들은 열-MVA 또는 MVA-처리 마우스에서 비주사 종양에서 면역 세포 침윤물을 조사하였다. 요약하면, 본 발명자들은 마우스의 좌측 옆구리에 2.5 x 10⁵ B16-F10 흑색종 세포를 그리고 우측 옆구리에 5 x 10⁵ B16-F10 흑색종 세포를 피내로 이식하였다. 이식 후 7일에, 본 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양 내로 2x 10⁷ pfu의 MVA, 또는 등가량의 열-MVA, 또는 PBS를 주사하였다. 주사를 3일 후에 반복하였다. 비주사 종양을 수집하고 세포 현탁액을 생성하였다. 종양 내의 살아있는 면역 세포 침윤물을 FACS에 의해 분석하였다. 본 발명자들은 MVA 또는 PBS로 처리된 마우스에 비하여 열-MVA로 처리된 마우스의 비주사 종양에서 CD45⁺, CD103⁺, CD3⁺ 및 CD8⁺ 면역 세포의 극적인 증가를 관찰하였다. MVA-처리 또한 PBS-처리된 마우스에 비하여 비주사 종양에서 이들 면역 세포의 증가를 야기하였지만, MVA는 비주사 종양에서의 면역 세포의 유도에서 열-MVA 보다 덜 강력하다(도 15a). 열-MVA-처리는 비주사 종양에서 세포독성 그랜자임 B 발현 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 모집과 증식을 야기하였다(도 15b). MVA는 비주사 종양에서 그랜자임 B⁺CD8⁺ 을 유도함에 있어서 열-MVA보다 덜 강력하다(도 15b). 이들 결과는 열-MVA가 비주사 종양에서, 다양한 면역 세포, 특히 그랜자임 B⁺CD8⁺ T 세포의 모집과 활성화에서 MVA보다 더 능력이 있음을 나타낸다. 이것은 비주사 종양의 성장의 박멸 또는 지연 및 생존의 연장에서 MVA에 비하여 향상된 효과와 상관된다.

실시예 16

열- MVA의 종양내 전달은 STING 또는 Batf3 -결핍 마우스에서 양측 종양 이식 모델에서 B16-F10 흑색종을 치유하지 못한다

실시예 10에서, 본 발명자들은 열-MVA의 종양내 전달이 일측 이식 모델에서 B16-F10 흑색종의 박멸에서 비효과적임을 입증하였다. 이 연구를 더 확장하기 위하여, 본 발명자들은 이측 종양 이식 모델에서 열-MVA의 종양내 전달의 효과를 시험하였다. PBS-처리된 그룹에서, 모든 마우스는 우측 옆구리 상의 더 큰 종양의 빠른 성장으로 인하여 16일의 중앙 생존기간으로 사망하였다(도 16 a, b, i). 열-MVA의 종양내 주사는 모든 주사된 종양의 박멸을 유도하지만, 10마리 WT 마우스 중 3마리에서만 비주사 종양을 소거하였다 (도 16 c, d, i, ****, 열-MVA vs. PBS의 경우 P < 0.0001). 본 발명자들은 열-MVA-처리가 WT 마우스에서 흑색종의 30% 치유를 야기하지만, Batf3 KO 마우스에서 치료 효과를 갖지 못함을 발견하였다(도 16 g, h, i). STING-결핍 마우스에서, 열-MVA의 종양내 주사는 종양 성장의 지연 및 중앙 생존기간의 연장을 유도하였다(도 16 e, f, i, **, P < 0.01). 실시예 10과 함께, 본 발명자들은 Batf3-의존성 CD103⁺ DC가 열-MVA의 종양내 전달에 의한 항종양 면역의 유도를 위해 중요한 것으로 결론내린다. STING에 의해 매개된 세포기질 DNA-센싱 경로 또한 열-MVA-유도된 획득 항종양 면역에서 중요한 역할을 한다.

실시예 17

Batf3 KO 마우스는 열- MVA의 종양내 전달에 대한 반응으로 항종양 CD8 ⁺ 및 CD4 ⁺ T 세포를 발달시키지 못한다

실시예 10 및 16에 나타난 열-MVA-유도된 항종양 면역에서 CD103⁺ DC의 중용성, 및 열-MVA-매개 항종양 효과에서 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 중요한 역할을 고려하여, 본 발명자들은 양측 종양 이식 모델을 이용하여 열-MVA의 종양내 주사에 대한 반응에서 Batf3 KO 마우스에서 항종양 CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포의 생성에서 결핍이 있는지 여부를 조사하였다. 요약하면, 본 발명자들은 Batf3^-/- 마우스 및 WT 연령-매치된 대조군의 좌측 옆구리에 2.5 x 10⁵ B16-F10 흑색종 세포를 그리고 우측 옆구리에 5 x 10⁵ B16-F10 흑색종 세포를 피내로 이식하였다. 이식 후 7일에, 본 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양 내로 열-MVA 또는 PBS를 주사하였다. 주사는 3일 후에 반복하였다. 첫번째 주사 후 7일에 비주사 종양을 수집하고, 세포 현탁액을 생성하였다. 주사 및 비주사 종양 내의 살아있는 면역 세포 침윤물을 FACS에 의해 분석하였다. 실시예 15와 유사하게, 본 발명자들은 PBS로 처리된 마우스에 비하여 열-MVA로 처리된 마우스의 주사 및 비주사 종양 둘 모두에서 CD3⁺ 및 CD8⁺ 면역 세포의 극적인 증가를 관찰하였다(도 17 a-b, **, P < 0.01; ***, P < 0.001). 본 발명자들은 또한 주사 및 비주사 종양 둘 모두에서 Ki-67⁺CD8⁺ 및 Ki-67⁺CD4⁺ T 세포의 유의한 증가를 관찰하였다(도 17 c-d, **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001). 대조적으로, Batf3 KO 마우스에서, 주사 및 비주사 종양으로의 CD8⁺ 및 CD4⁺ T 세포의 모집 및 증식이 감소하였다(도 17a-d). 이들 결과는 CD103⁺ DC가 종양 항원을 교차-제시하고 열-MVA 처리에 대한 반응으로 항종양 CD8⁺ T 세포를 생성함에 있어서 중요함을 나타낸다. CD103⁺ DC 외의 다른 많은 세포 타입이 천연 CD4⁺ T 세포에 MHC 클래스 II 상의 종양 항원을 제시할 수 있다. 여기서 본 발명자들은 비주사 종양 내의 종양-반응성 CD4⁺ T 세포의 수가 WT 마우스에서 보다 Batf3^-/- 마우스에서 훨씬 낮음을 발견하였다(도 17d). Batf3^-/- 마우스에서 종양 내의 CD8⁺ T 세포의 결핍은 결함있는 종양 사멸 및 빈약한 종양 항원 방출을 야기하여, 종양-반응성 CD4⁺ T 세포의 생성에 영향을 주는 것이 가능하다. 실시예 10, 12 및 16과 함께, 본 발명자들은 종양-반응성 CD8⁺, CD4⁺ T 세포의 생성 및 항-종양 항체의 생성을 비롯한, 열-MVA-유도된 항종양 효과에서 Batf3-의존성 CD103⁺/CD8αDC가 중요한 역할을 하는 것으로 결론내린다.

실시예 18

열- MVA의 종양내 주사와 면역 체크포인트 차단제의 복강내 전달의 조합은 양측 흑색종 이식 모델에서 상승적 치료 효과를 유도한다

본 발명자들은 이어서 열-MVA의 종양내 주사가 전이성 질병을 가진 개인을 시뮬레이트하는 양측 B16-F10 흑색종 모델에서 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체와 같은 면역 체크포인트 차단 요법의 치료 효과를 향상시키는지를 조사하였다. 요약하면, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 10⁵ 및 좌측 옆구리에 1 x 10⁵). 종양 이식 후 8일에, 본 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 열-MVA(열-불활성화 2 x 10⁷ pfu의 MVA) 또는 PBS를 매주 2회씩 종양내로 주사하였다. 4 그룹의 마우스를 열-MVA로 처리하였으며, 각 그룹에게 아이소타입 대조군, 또는 항-CTLA-4, 또는 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 항체를 복강내로 전달하였다(도 18a).

PBS-처리 마우스가 다음 20일에 걸쳐 종양 성장 증가로 빨리 사망한 한편 (도 18b, c, d), 열-MVA + 아이소타입 대조군으로 처리된 마우스는 주사된 종양이 박멸되고 대측에서의 비주사 종양의 성장이 지연되었다(도 18e, f). 그 결과, 열-MVA + 아이소타입의 처리는 PBS 그룹에 비하여 생존을 유의하게 연장시켰다(도 18b, ****, P < 0.0001). 열-MVA의 종양내 주사와 항-CTLA-4, 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체의 전신성 전달의 조합은 추가로 비주사 종양을 지연시키거나 제거하였다. 그 결과, 열-MVA + 아이소타입으로 처리된 마우스의 10%가 무종양인 것에 비하여, 열-MVA + 항-CTLA-4로 처리된 마우스의 50%, 열-MVA + 항-PD-1로 처리된 마우스의 50% 및 열-MVA + 항-PD-L1로 처리된 마우스의 70%가 실험 마지막에(바이러스 주사 후 57일) 종양이 없었다(도 18e-l).

비주사된 먼 곳의 종양의 성장을 제어하는 능력은 열-MVA + 아이소타입 대조군에 비하여 열-MVA + 면역 체크포인트 차단제를 이용한 조합 그룹에서의 개선된 생존률과 상관되었다(도 18b, **, P < 0.0001). 항-CTLA-4, 항-PD-1, 또는 항-PD-L1 단독의 복강내 전달은 B16-F10 흑색종 모델에서 최소의 치료 효과를 가진다(도 13b 및 데이터 도시 안함). 이들 결과는 열-MVA의 종양내 전달이 전이성 B16 흑색종 모델에서 면역 체크포인트 차단제에 대한 치료 저항성을 극복함을 나타내며, 유익한 결과를 가지고 이 방법을 인간 치료법으로 전달하기 위한 전조이다.

이 실험은 조합된 면역 체크포인트 차단제와 불활성화 MVA 치료법의 장기 효과를 평가하기 위하여 반복될 것이다.

실시예 19

UV- MVA는 STING-의존 방식으로 cDC에서 타입 I 인터페론을 유도한다

본 발명자들은 MVA의 자외선 불활성화가 또한 STING-매개 세포기질 DNA-센싱 경로의 활성화를 통해 면역 활성화 바이러스를 야기할 수 있는 것으로 가정하였다. 이 가설을 시험하기 위하여, 본 발명자들은 STING^{Gt / Gt} 및 그들의 연령-매치된 WT 대조군 마우스로부터의 cDC를 감염시켰다. 세포(1 x 10⁶)를 10의 MOI의 MVA 또는 등가량의 열-MVA 또는 UV-MVA로 감염시켰다. 상등액을 감염 후 22시간에 수집하였으며, 분비된 IFN-α 및 IFN-β의 농도를 ELISA에 의해 결정하였다. 열-MVA와 유사하게, UV-불활성화 MVA 또한 WT cDC에서 MVA 보다 더 높은 수준의 타입 I IFN을 유도한다(도 19a, b). UV-MVA-유도된 타입 I IFN은 STING-결핍 세포에서 완전히 중단된다(도 19a, b, ***, p < 0.001). 이들 결과는 IFN-α 및 IFN-β의 열-MVA 및 UV-MVA-매개 유도 둘 모두가 STING 경로에 의존함을 나타내며, 열-MVA 및 UV-MVA가 유사한 기전을 통해 그들의 종양 억제 효과를 나타냄을 확증한다.

실시예 20

UV- MVA 및 열- MVA의 종양내 주사는 일측 결장 선암 모델에서 주사된 종양의 박멸 및 전신성 항종양 면역의 발달을 유도한다

실시예 7 및 14에 개시된 실험 연구는 열-MVA의 종양내 주사가 쥐 이식가능 B16-F10 흑색종 모델에서 종양 박멸 및 전신성 항-종양 면역을 유도함을 보여주었다. 열-MVA 또는 UV-MVA가 다른 고형 종양을 박멸할 수 있는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 쥐 MC38 결장 선암 이식 모델에서 열-MVA 또는 UV-MVA의 항-종양 효과를 시험하였다. 결장 선암은 흑색종과 관련되지 않는 고형 종양의 대표이지만 다르게는 임의적 선택이었다. 5 x 10⁵ MC38 결장 암종 세포를 C57B/6 마우스의 우측 옆구리 내로 피내 이식하였다. 종양을 7일 동안 성장시킨 후, (2 x 10⁷ pfu의 MVA의 열 또는 UV-불활성화를 통한) 열-MVA 또는 UV-MVA 또는 PBS 대조군을 1주일에 2회씩 종양내로 주사하였다. 1주일에 2회씩 종양을 측정하고 하기 식에 따라 종양 부피를 계산하였다: l(길이) x w(넓이)x h(높이)/2. 본 발명자들은 PBS로 처리된 모든 마우스가 종양 성장으로 인해 사망하였음을 발견하였다(도 20d, g). 70%의 열-MVA-처리 마우스와 71%의 UV-MVA-처리 마우스가 실험 마지막에(바이러스 주사 후 약 60일) 생존하였다(도 20e, f). 따라서, 열- 또는 UV-MVA의 종양내 주사는 PBS 대조군에 비하여 마우스의 생존을 유의하게 연장시켰다(도 20g, ****, p < 0.0001).

생존한 마우스가 전신성 항종양 면역을 발달시켰는지를 시험하기 위하여, 본 발명자들은 대측에서 치사량의 MC38 세포(1 x 10⁵)로 마우스를 공격하고 생존을 모니터하였다. 본 발명자들은 모든 천연 마우스가 종양이 발생하고 사망한 반면, 열- 또는 UV-MVA-처리 마우스의 100%가 종양 공격을 거부하였음을 발견하였다(도 20h). 본 발명자들은 또한 열-MVA 또는 UV-MVA를 이용한 MC38 세포의 감염이 MVA 보다 더 높은 수준의 염증성 사이토카인과 케모카인을 유도하는지를 시험하였으며, 본 발명자들은 10의 MOI의 MVA로 또는 등가량의 열-VMA 또는 UV-MVA로 MC38 세포를 감염시켰다. 상등액을 감염 후 22시간에 수집하였다. 상등액 내의 분비된 IL-6, CCL4 및 CCL5의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 본 발명자들은 또한 열-MVA 및 UV-MVA가 MVA 보다 더 높은 수준의 IL-6, CCl4 및 CCL5를 MC38 세포로부터 유도하였음을 발견하였다(도 20a, b, c). 종합적으로, 실시예 7, 14, 및 실시예 20에서 관찰된 결과는, 열-MVA 및 UV-MVA가 다양한 고형 종양에서 항-종양 효과를 촉진하는데 효율적이며 본 명세서에 개시된 사실들이 흑색종에 제한되지 않으며 다양한 기원의 다른 고형 종양에 외삽될 수 있음을 입증한다.

실시예 21

열- MVA의 종양내 주사와 면역 체크포인트 차단제의 복강내 전달의 조합이 양측 MC38 결장 선암 이식 모델에서 상승적 치료 효과를 유도한다

본 발명자들은 추가로 열-MVA의 종양내 주사가 전이성 질병을 가진 개체를 시뮬레이트하는 다른 양측 종양 이식 모델에서 항-CTLA-4, 항- 또는 항-PD-L1 항체와 같은 면역 체크포인트 차단요법의 치료 효과를 향상시키는지 여부를 조사하였다. 요약하면, MC38 결장 선암 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 10⁵ 및 좌측 옆구리에 1 x 10⁵). 종양 이식 후 8일에, 본 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 열-MVA(열-불활성화된 2 x 10⁷ pfu의 MVA) 또는 PBS를 매주 2회씩 종양내로 주사하였다. 3 그룹의 마우스를 PBS로 처리하였으며, 각 그룹에게 PBS, 또는 항-CTLA-4, 또는 항-PD-L1 항체를 복강내로 전달하였다(도 21a-f). 3 그룹의 마우스를 열-MVA로 처리하였으며, 각 그룹에게 아이소타입 대조군, 또는 항-CTLA-4, 또는 항-PD-L1 항체를 복강내로 전달하였다(도 21g-l). PBS-처리된 마우스는 다음 14일에 걸쳐 종양 성장이 증가하면서 빨리 사망하였으며(도 21b, c, d), PBS + 항-CTLA-4, 또는 PBS + 항-PD-L1으로 처리된 모든 마우스는, 면역 체크포인트 차단제의 복강내 주사가 PBS 그룹에 비하여 생존을 지연시켰음에도 불구하고 사망하였다(도 21a-f, m, ***, p < 0.001). B16-F10 양측 이식 모델에서 관찰한 것과 유사하게(실시예 14 참고), 열-MVA의 종양내 주사는 주사된 MC38 종양의 박멸을 유도하지만(도 21g, 8/10 무종양), 대측 비주사 종양의 성장을 지연시키지만 단지 그들 중 1/10만 박멸시켰다(도 21h, ****, p < 0.0001 열-MVA vs. PBS). 대조적으로, 열-MVA의 종양내 전달과 항-CTLA-4 항체 또는 열-MVA + 항-PD-L1의 복강내 전달의 조합은 열-MVA 단독보다 훨씬 더 높은 효율로 비주사된 먼거리 종양의 박멸을 유도하며(도 21g-l), 이는 열-MVA 단독에 비하여 병용요법에서 개선된 생존을 상관시켰다(도 21n, *, p < 0.05, **, p < 0.01). 이들 결과는 전이성 고형 종양의 치료를 위해 불활성화 MVA와 면역 체크포인트 차단제의 조합을 이용하는 것을 의미한다.

실시예 22

열- MVA의 종양내 주사와 면역 체크포인트 차단제 항- CTLA -4 항체의 종양내 전달의 조합이 양측 B16-F10 이식 모델에서 상승적 치료 효과를 유도한다

실시예 13, 18, 및 21에서, 본 발명자들은 열-MVA의 종양내 주사와 면역 체크포인트 차단제의 전신성 (복강내) 전달의 조합이 흑색종 및 결장 선암 모델에서 상승적 항종양 효과를 유도함을 보여주었다. 본 실시예에서 본 발명자들은 열-MVA 및 항-CTLA-4 항체(복강내 전달을 위해 사용된 투여량의 1/10)의 공동투여가 엄격한 양측 종양 이식 모델에서 항종양 효과를 이룰 것인지를 시험한다. 요약하면, B16-F10 흑색종 세포를 C57B/6 마우스의 좌측 및 우측 옆구리에 피내로 이식하였다(우측 옆구리에 5 x 10⁵ 및 좌측 옆구리에 1 x 10⁵). 종양 이식 후 8일에, 본 발명자들은 우측 옆구리 상의 더 큰 종양에 열-MVA(열-불활성화된 2 x 10⁷ pfu의 MVA) 또는 PBS를 1주에 2회씩 종양내로 주사하였다. 3 그룹의 마우스를 열-MVA로 처리하였으며, 각 그룹에게 (i) 항-CTLA-4(100 ㎍/마우스)의 복강내 전달 (ii) 아이소타입 항체(10 ㎍/마우스)의 종양내 전달, 또는 (iii) 항-CTLA-4 항체(10 ㎍/마우스)의 종양내 전달 (도 22)을 제공하였다. 모든 PBS-처리된 마우스는 주사 및 비주사 종양의 빠른 성장으로 인해 조기에 사망하였다(도 22a-b). 열-MVA 및 아이소타입 항체의 종양내 공동주사는 주사된 종양 10개 중 7개를 박멸시켰으나, 비주사 종양 10개 중 1개만을 소거하였다(도 22 c-d). 대조적으로, 열-MVA 및 항-CTLA-4 항체(10 ㎍/마우스)의 종양내 공동주사는 주사 종양 10개 중 10개를 박멸시켰으며, 비주사 종양 10개 중 7개를 소거하였으며(도 22 e-f), 이는 열-MVA의 종양내 주사와 항-CTLA-4 항체(100 ㎍/마우스)의 복강내 전달의 조합의 치료 효과에 견줄만한다(도 22 g-h). 이들 결과는 열-MVA 및 훨씬 낮은 투여량의 면역 체크포인트 차단제, 항-CTLA-4 항체를 공동 투여하는 것이 열-MVA의 종양내 전달과 더 높은 투여량의 항-CTLA-4 항체의 전신성 전달의 조합과 유사한 전신성 항종양 효과를 이룰 수 있음을 나타낸다. 이러한 혁신적인 접근방법은 여러가지 이점을 가진다: (i) 이는 STING-의존성 세포기질 DNA-센싱 기전을 통한 선천적 면역의 활성화 및 Batf3-의존성 CD103⁺/CD8α 교차-제시 DC를 통한 획득 면역의 활성화를 통한 "인 시추 치료 백신"을 제공하며; (ii) 이는 항-CTLA-4 항체의 존재하에서 CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포독성 T 세포의 강한 활성화를 가능하게 하며; (iii) 이 조합은 CD4⁺ 조절 T 세포의 추가 고갈을 야기하며; (iv) 이는 CD8⁺ 및 CD4⁺ 세포독성 T 세포의 작용, 종양 항원의 방출, 및 항-종양 항체를 비롯한 항-종양 획득 면역의 적절한 생성을 통한 대량 종양 사멸을 야기하며; 및 (v) 이 접근법은 또한 복강내 전달에서 사용되는 투여량의 1/10로 종양내로 전달되어 항-CTLA-4 항체의 전신 독성을 낮춘다.

항-CTLA-4 및 항-PD-1 항체의 조합이 III상 임상 시험에서 PD-L1-음성 종양에서 단독 제제보다 더 효과적임을 고려하여(Larkin et al., 2015), 본 발명자들은 조합된 불활성화 MVA 및 항-CTLA-4 및 항-PD-1/항-PD-L1를 전달할 것이다(단독요법보다 낮은 투여량으로 그리고 상이한 경로(예를 들어, 종양내 v. 정맥내)에 의한 공동 투여보다 낮은 투여량으로 전달된 차단제는 종양내로 전달될 것이다). 이것은 항종양 면역의 추가적인 증대 및 부작용 발생 감소와 함께 더 개선된 생존률을 야기할 것으로 예상된다. 또한, 항-LAG-3, 항-TIM-3, 및 항-TIGIT 항체와 같은 보다 최근에 개발된 면역 체크포인트 차단 항체는 상술한 것과 같은 전임상 모델에서 다양한 고형 종양의 치료를 위한 그러한 공동 전달에 포함될 것이다.

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전술한 실시예는 본 명세서에 개시된 방법과 특징의 예시이며 제한하고자 하는 것이 아니다. 또한, 그들은 본 명세서에의 일반적 적용가능성의 진술을 함유하며 그러한 진술은 그들이 나타나는 구체적 실시예에 제한되지 않으며 본 명세서에 개시된 실험 결과의 결론 서술 및 더 넓은 의미의 표현을 구성한다.

모든 인용된 참고문헌의 내용은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 완전히 개시된 것처럼 그 전체가 참고로 포함된다.

Claims (60)

1. 불활성화 변형 백시니아 안카라(inactivated modified vaccinia Ankara)(불활성화 MVA)를 종양의 세포에 전달하여 종양을 치료하는 것을 포함하는, 하나 이상의 고형 악성 종양에 걸린 개체를 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 그 양은 하기 중 하나 이상을 이루기에 효과적인 방법:
   g. 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도;
   h. 종양의 크기 감소;
   i. 종양의 박멸;
   j. 종양의 성장 억제;
   k. 종양의 전이 억제; 및
   l. 전이성 종양의 감소 또는 박멸.
3. 제2항에 있어서, 종양은 불활성화 MVA 전달 부위에 위치한 종양, 또는 상기 부위 및 개체 신체 내의 그 밖의 곳 둘 모두에 위치한 종양을 포함하는 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
   f. 종양 내 및/또는 종양-배수(tumor-draining) 림프절 내의 세포독성 CD8⁺ T 세포의 증가;
   g. 타입 I IFN의 유도를 통해 상기 종양을 침윤하는 수지상 세포의 성숙 유도;
   h. 종양 내에서 또는 전신적으로 종양 세포를 인식하는 개체 내 활성화 CD4⁺ 이펙터 T 세포의 유도;
   i. 종양 내의 면역 억제(조절) CD4⁺ T 세포의 감소; 및
   j. 종양 세포가 그들의 표면 상에 MHC 클래스 I을 발현하고 타입 I IFN를 생산하도록 유도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 원발성 또는 전이성 흑색종 또는 원발성 또는 전이성 결장 암종인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA의 전달은 떨어진 시간 간격으로 반복되는 방법.
7. 제6항에 있어서, 반복 전달은 효과가 지속되는 한 또는 최대 내약 용량이 도달될 때까지 수 주, 수 개월 또는 수년 동안 또는 무기한으로 계속되는 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA의 전달은 비경구 경로에 의한 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 불활성화 MVA의 전달은 종양내 또는 정맥내 주사에 의한 것인 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화-MVA는 약 10⁵ - 10¹⁰ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되는 방법.
12. 제11항에 있어서, 불활성화-MVA는 약 10⁶ 내지 약 10⁹ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 전달은 한달에 한번 내지 1주일에 2회 범위 내의 빈도로 반복되는 방법.
14. 제13항에 있어서, 전달은 매주 한번 반복되는 방법.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA는 UV-불활성화 MVA인 방법.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA는 열-불활성화 MVA인 방법.
17. 제4항에 있어서, 이펙터 T 세포의 유도 및 활성화는 상기 종양에서 조절 CD4⁺ 세포의 감소를 수반하는 방법.
18. 제4항에 있어서, 불활성화-MVA는 타입 I IFN의 유도를 통해 상기 종양을 침윤하는 수지상 세포의 성숙을 유도하는 방법.
19. 제4항에 있어서, 불활성화-MVA는 감염된 종양 세포에서 MHC 클래스 I의 발현 및 타입 I 인터페론의 유도를 유발하는 방법.
20. 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하기에 효과적인 양의 불활성화-MVA를 개체의 종양 세포에 전달하는 것을 포함하는, 개체에서 고형 악성 종양을 치료하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 면역 반응은 전신성인 방법.
22. 제20항에 있어서, 면역 반응은 종양 크기 감소, 종양 박멸, 종양 또는 전이성 성장 억제 중 하나 이상을 일으키거나 기여하는 방법.
23. 제20항 또는 제21항에 있어서, 불활성화 MVA는 하기 중 하나 이상을 이루기에 효과적인 방법:
    m. 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도;
    n. 종양의 크기 감소;
    o. 종양의 박멸;
    o. 종양의 성장 억제;
    q. 종양의 전이 억제; 및
    r. 전이성 종양의 감소 또는 박멸.
24. 제23항에 있어서, 종양은 불활성화 MVA 전달 부위에 위치한 종양, 또는 상기 부위 및 개체 신체 내의 그 밖의 곳 둘 모두에 위치한 종양을 포함하는 방법.
25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응은 하기 중 하나 이상을 포함하는 방법:
    k. 종양 내 및/또는 종양-배수 림프절 내의 세포독성 CD8⁺ T 세포의 증가;
    l. 타입 I IFN의 유도를 통해 상기 종양을 침윤하는 수지상 세포의 성숙 유도;
    m. 종양 내에서 또는 전신적으로 종양 세포를 인식하는 개체 내 활성화 CD4⁺ 이펙터 T 세포의 유도;
    n. 종양 내의 면역 억제(조절) CD4⁺ T 세포의 감소; 및
    o. 종양 세포가 그들의 표면 상에 MHC 클래스 I을 발현하고 타입 I IFN을 생산하도록 유도.
26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 종양은 원발성 또는 전이성 흑색종 또는 원발성 또는 전이성 결장 암종인 방법.
27. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA의 전달은 떨어진 시간 간격으로 반복되는 방법.
28. 제27항에 있어서, 반복 전달은 효과가 지속되는 한 또는 최대 내약 용량이 도달될 때까지 수 주, 수 개월 또는 수년 동안 또는 무기한으로 계속되는 방법.
29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA의 전달은 비경구 경로에 의한 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 불활성화 MVA의 전달은 종양내 또는 정맥내 주사에 의한 것인 방법.
31. 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 개체는 인간인 방법.
32. 제31항에 있어서, 불활성화-MVA는 약 10⁵ - 10¹⁰ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되는 방법.
33. 제32항에 있어서, 불활성화-MVA는 약 10⁶ 내지 약 10⁹ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되는 방법.
34. 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 전달은 한달에 한번 내지 1주일에 2회 범위 내의 빈도로 반복되는 방법.
35. 제34항에 있어서, 전달은 매주 한번 반복되는 방법.
36. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA는 UV-불활성화 MVA인 방법.
37. 제20항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA는 열-불활성화 MVA인 방법.
38. 개체의 면역계가 종양에 대한 면역 반응을 시작하도록 유도하기에 효과적인 양의 불활성화-MVA를 개체의 종양 세포에 전달하고, 이와 함께 종양 세포, 기질 세포 또는 종양 침윤 면역 세포에 의해 유발된 종양내 면역 억제 기전을 차단하기에 효과적인 면역 체크포인트 차단제의 제2 양을 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 악성 종양을 치료하는 방법.
39. 제38항에 있어서, 투여는 비경구 경로에 의한 것인 방법.
40. 제39항에 있어서, 전달은 종양내 주사에 의해 그리고 투여는 정맥내 경로에 의한 것인 방법.
41. 제39항에 있어서, 전달 및 투여 둘 모두가 정맥내 경로에 의한 것인 방법.
42. 제39항에 있어서, 전달 및 투여 둘 모두가 종양내 주사에 의한 것인 방법.
43. 제38항에 있어서, 면역 체크포인트 차단제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제 및 CTLA4 억제제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
44. 제44항에 있어서, 상기 억제제의 각각은 항체인 방법.
45. 제38항에 있어서, 종양은 원발성 또는 전이성 흑색종 또는 원발성 또는 전이성 결장 암종인 방법.
46. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 떨어진 간격의 그 자신의 투여 스케쥴에 따라 불활성화 MVA는 전달되고 면역 체크포인트 차단제는 투여되는 방법.
47. 제47항에 있어서, 불활성화 MVA의 제1 투여량이 먼저 전달되고 시간 경과 후 면역 체크포인트 차단제의 제1 투여량이 투여되는 방법.
48. 제48항 또는 제49항에 있어서, 전달과 투여는 동일한 전체 기간동안 평행하게 발생하는 방법.
49. 제48항에 있어서, 불활성화 MVA와 면역 체크포인트 차단제 중 하나 또는 둘 모두는 효과가 지속되고 최대 내약 용량이 도달되지 않는 한 수 주, 수 개월 또는 수년동안 또는 무기한의 기간 동안 각각 전달되고 투여되는 방법.
50. 제38항 또는 제48항에 있어서, 불활성화-MVA는 약 10⁵ - 10¹⁰ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되는 방법.
51. 제51항에 있어서, 불활성화-MVA는 약 10⁶ 내지 약 10⁹ 플라크-형성 단위(pfu)의 범위 내의 투여 당 투여량으로 전달되는 방법.
52. 제47항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA 전달은 한달에 한번 내지 1주일에 2회 범위 내의 빈도로 반복되는 방법.
53. 제53항에 있어서, 불활성화 MVA 전달은 매주 1회씩 반복되는 방법.
54. 제38항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA는 UV-불활성화 MVA인 방법.
55. 제38항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성화 MVA는 열-불활성화 MVA인 방법.
56. 제38항에 있어서, 불활성화 MVA 및 면역 체크포인트 차단제는 동시에 투여되는 방법.
57. 제57항에 있어서, 불활성화 MVA 및 면역 체크포인트 차단제는 동일한 조성물로 투여되는 방법.
58. 제57항에 있어서, 불활성화 MVA 및 면역 체크포인트 차단제는 종양내로 전달되는 방법.
59. 제38항에 있어서, 불활성화 MVA 및 면역 체크포인트 차단제는 순차적으로 투여되는 방법.
60. 제60항에 있어서, 불활성화 MVA 및 면역 체크포인트 차단제는 종양내로 전달되는 방법.
    
    

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