JPH10191974A - ヒト成長ホルモンに特異的に反応するモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ヒト成長ホルモンに特異的に反応しサル成長
ホルモンと実質的に反応しないモノクローナル抗体、該
抗体を産生するハイブリドーマ、及びサルに投与したヒ
ト成長ホルモンを血中で測定し得る該抗体を用いたヒト
成長ホルモンの高感度免疫測定方法を提供する。 【解決手段】 ヒト成長ホルモンを免疫したマウスの脾
臓細胞を細胞融合しハイブリドーマを得、クローニン
グ、スクリーニング行うことで最終的に得られる細胞か
ら、ヒト成長ホルモンに反応しサル成長ホルモンに実質
的に反応しないモノクローナル抗体を調製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はヒト成長ホルモンの
測定等に利用されるモノクローナル抗体、該モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマ、及び該モノクロー
ナル抗体を用いるヒト成長ホルモンの高感度免疫測定法
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒト成長ホルモン（以下ｈＧＨと略記す
ることもある）はアミノ酸１９１個からなるペプチドホ
ルモンである。サルもやはり同様の成長ホルモンを有し
ているが、ヒトとの差異はわずかアミノ酸４個と酷似し
ている。ヒト成長ホルモンを医薬品として開発する場合
の非臨床試験や、体内での生理的意義を探索するために
は、動物モデルを用いた試験が必須となってくる。なか
でもヒトに類似した動物としてサルを使用する必要性は
大である。これまでに、サルの成長ホルモン（以下ｍＧ
Ｈと略記することもある）とヒト成長ホルモンの類似性
を利用して、サル体内のｍＧＨをｈＧＨの測定法を用い
て測定した例はあった（Laudenslager et al.,Developm
ental Psychobiology,vol.28(4) p.119(1995)等）。し
かし、ｍＧＨの混在する中で交差反応することなく、ｈ
ＧＨのみを正確に定量できる直接的な測定方法は未だ知
られていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ｈＧ
Ｈに特異的に反応しｍＧＨと実質的に反応しないモノク
ローナル抗体、該抗体を産生するハイブリドーマ、及び
サルに投与したｈＧＨを血中で正確にかつ直接定量し得
る該抗体を用いたｈＧＨの高感度免疫測定方法を提供す
ることである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記のよ
うな課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、ｍ
ＧＨと実質的に反応しないモノクローナル抗体を取得し
た。そして、更に該抗体を用いればサルに投与したｈＧ
Ｈを血中で特異的かつ高感度に測定可能であることを見
いだし、本発明を完成した。

【０００５】即ち本発明は、ｈＧＨに特異的に反応しｍ
ＧＨと実質的に反応しないことを特徴とするモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマ、及び該モノクローナル抗体を用いることを特徴と
するｈＧＨの免疫測定方法を提供するものである。

【０００６】

【発明の実施の形態】以下本発明の詳細について述べ
る。本発明のモノクローナル抗体が反応するｈＧＨと
は、ヒト下垂体由来のｈＧＨ、ヒト血中のｈＧＨ、遺伝
子組換えで生産されたｈＧＨ等であり、本発明のモノク
ローナル抗体が実質的に反応しないｍＧＨとは、サル下
垂体由来ｍＧＨ、サル血中のｍＧＨ等である。

【０００７】本発明のモノクローナル抗体が、ｈＧＨと
特異的に反応しｍＧＨと実質的に反応しないとは、モノ
クローナル抗体を用いた通常の免疫測定においてｈＧＨ
と十分な反応性を示しｍＧＨとは極めて低いか殆ど反応
性を示さないことを示し、例えば以下に例示するサンド
イッチ酵素免疫測定法においてその交差反応性が１％以
下であることを指している。

【０００８】本発明のモノクローナル抗体のグロブリン
タイプは、ｈＧＨに特異的に反応しｍＧＨと実質的に反
応しないモノクローナル抗体である限り特に限定されな
い。例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等
が挙げられる。

【０００９】本発明のモノクローナル抗体を産生する細
胞株は、ｈＧＨに特異的に反応しｍＧＨと実質的に反応
しないモノクローナル抗体を産生する限り制限はない
が、抗体産生細胞とミエローマ細胞株との細胞融合によ
りハイブリドーマとして得ることができる。そのような
ハイブリドーマの例としては、例えばＭＴＣ６Ｂ株（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５６６３）が挙げられる。本発明のｈＧ
Ｈに特異的に反応しｍＧＨと実質的に反応しないモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマは、具体的には
次のような細胞融合法によって得られる。

【００１０】抗体産生細胞としては、免疫された動物か
らの脾細胞、リンパ節細胞、Ｂ−リンパ球が使用され
る。抗原としては、例えば下垂体から抽出されたｈＧ
Ｈ、遺伝子組換えで生産されたｈＧＨ等が例示される。
免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、
これらの動物への抗原の投与は常法に従って行われる。
例えば完全フロインドアジュバント、不完全フロインド
アジュバントなどのアジュバントと抗原であるｈＧＨと
の懸濁液もしくは乳化液を調製し、これを動物の静脈、
皮下、皮内、腹腔内等に数回投与することによって動物
を免疫化する。免疫化した動物から抗体産生細胞として
例えば脾細胞を取得し、これとミエローマ細胞とをそれ
自体公知の方法（G.Kohler et al .,Nature,256 495(19
75)）により融合することにより、本発明のハイブリド
ーマを作製することができる。

【００１１】細胞融合に使用するミエローマ細胞株とし
ては、例えばマウスではＰ３Ｘ６３Ａｇ８、Ｐ３Ｕ１
株、Ｓｐ２／０株などが挙げられる。細胞融合を行なう
に際しては、ポリエチレングリコール、センダイウイル
スなどの融合促進剤を用い、細胞融合後のハイブリドー
マの選抜にはヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジ
ン（ＨＡＴ）培地が常法により使用できる。

【００１２】細胞融合により得られたハイブリドーマを
限界希釈法等によりクローン化する。更に、その中でｈ
ＧＨ及びｍＧＨを用いた酵素免疫測定法によりスクリー
ニングを行なうことで、本発明のｈＧＨに特異的に反応
しｍＧＨに実質的に反応しないモノクローナル抗体産生
細胞株を得ることができる。

【００１３】このようにして得られたハイブリドーマか
ら目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常
の細胞培養法や腹水形成法により該ハイブリドーマを培
養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体
を精製すればよい。培養上清もしくは腹水からのモノク
ローナル抗体の精製は、常法により行なうことができ
る。例えば、硫安分画、ゲルろ過、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを
適宜組み合わせて使用できる。

【００１４】本発明のモノクローナル抗体を用いるｈＧ
Ｈの免疫測定方法としては、該モノクローナル抗体を利
用した、例えば酵素免疫測定法、ラジオイムノアッセ
イ、蛍光免疫測定法、発光免疫測定法等が例示され、好
ましくは酵素免疫測定法があげられる。特に酵素免疫測
定法において、該モノクローナル抗体を不溶性担体に結
合させてモノクローナル抗体結合不溶性担体を得、この
モノクローナル抗体結合不溶性担体を用いた、いわゆる
サンドイッチ酵素免疫測定法が好ましい。

【００１５】以下、サンドイッチ酵素免疫測定法に基づ
いて本発明の測定方法を説明する。第（１）の工程とし
て、本発明のモノクローナル抗体を不溶性担体に結合さ
せたモノクローナル抗体結合不溶性担体と、ヒト成長ホ
ルモンを含む被検液を反応させて、ｈＧＨのみを特異的
に該モノクローナル抗体結合不溶性担体に結合させた結
合体を形成する。該不溶性担体としては、マイクロプレ
ート、プラスティックビーズ、ガラスビーズ、磁性微粒
子等が挙げられる。モノクローナル抗体をこれらの不溶
性担体に結合させる方法は、公知の化学的結合方法でも
よいが物理的吸着方法で十分である。即ち、本発明のモ
ノクローナル抗体を炭酸緩衝液やリン酸緩衝液等に溶解
し、前記不溶性担体を加えて、０℃〜室温にて１時間以
上放置した後、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン・
ソルビタール・モノラウレート）、アジ化ナトリウム等
を添加したＴｒｉｓ塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等により
洗浄して未結合の抗体を除去する。次に、得られたモノ
クローナル抗体結合不溶性担体にヒト成長ホルモンを含
む被検液を反応させ、被検液中のｈＧＨを結合させる。

【００１６】さらに第（２）の工程として、第（１）の
工程で得られた結合体に抗ｈＧＨ抗体を酵素標識したも
の（以下抗ｈＧＨ酵素標識抗体と略す）を反応させ、モ
ノクローナル抗体結合不溶性担体上に本発明の抗ｈＧＨ
モノクローナル抗体−ｈＧＨ−抗ｈＧＨ酵素標識抗体と
いうサンドイッチ状複合体を形成させる。ここで抗ｈＧ
Ｈ酵素標識抗体に用いる抗ｈＧＨ抗体は、前記の抗ｈＧ
Ｈモノクローナル抗体とは認識するエピトープの異なる
ｈＧＨのみに反応する抗体もしくはｈＧＨとｍＧＨの両
方に反応する抗体のいずれでもよく、モノクローナル抗
体またはポリクローナル抗体のいずれでもよい。特に、
好ましくはアフィニティ精製した抗ｈＧＨウサギポリク
ローナル抗体であり、しかも非特異的吸着を減少させる
ためにＦ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’フラグメント等が望ま
しい。更に、標識される酵素としては西洋ワサビペルオ
キシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等が挙げられる。こ
れらの酵素を抗ｈＧＨ抗体または抗体のＦ（ａｂ’）
2、Ｆａｂ’フラグメントに標識する方法は、酵素の糖
鎖を過ヨウ素酸で酸化し、生成したアルデヒド基に抗ｈ
ＧＨ抗体などのアミノ酸を結合させる方法や、酵素にマ
レイミド基あるいはピリジルスルフィド基等を導入し、
抗ｈＧＨ抗体のＦａｂ’フラグメントに存在するチオー
ル基と結合させる方法等の公知の方法で実施することが
できる。

【００１７】第（３）の工程として、第（２）の工程で
得られたサンドイッチ状複合体中の標識に用いた酵素の
活性量を測定する。すなわち該酵素の活性量は、最初に
反応させたｈＧＨ量に依存するので、被検液中のｈＧＨ
量のみを測定することができる。該酵素の活性測定はそ
の酵素の基質となる物資を添加することにより行なわれ
る。また、抗ｈＧＨ酵素標識抗体の代わりに、ビオチン
標識抗体を使用し、モノクローナル抗体結合不溶性担体
上に本発明の抗ｈＧＨモノクローナル抗体−ｈＧＨ−抗
ｈＧＨビオチン標識抗体というサンドイッチ状複合体を
形成さた後、酵素標識アビジンまたは酵素標識ストレプ
トアビジンを反応させ、本発明の抗ｈＧＨモノクローナ
ル抗体−ｈＧＨ−抗ｈＧＨビオチン標識抗体−酵素標識
アビジンまたは酵素標識ストレプトアビジンというサン
ドイッチ状複合体を形成させ、該サンドイッチ状複合体
中の酵素活性量を測定する方法でもよい。

【００１８】なお、上記サンドイッチ酵素免疫測定法に
おいて、本発明の抗ｈＧＨモノクロ−ナル抗体と抗ｈＧ
Ｈ酵素標識抗体とを入れ代えて用いる測定法も当然なが
ら可能であり、そのような方法も上記サンドイッチ酵素
免疫測定法と同等の効果を有するがゆえに、本発明の範
疇である。

【００１９】このように本発明の酵素免疫測定法におい
ては、ｍＧＨの影響なしにｈＧＨを特異的に測定するこ
とが可能である。検量線作製に用いる標準ｈＧＨとして
は、遺伝子組換えによって作製されたｈＧＨを用いるこ
とができる。このようにして本発明の測定方法により、
サル血中においてｈＧＨのみの直接的かつ正確な定量が
可能となる。

【００２０】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明を説明するが、
本発明はこれら実施例に限られるものではない。 実施例１ 抗ｈＧＨモノクローナル抗体の作製 (1)免疫 遺伝子組換えで生産され、精製されたｈＧＨ（特開平６
−２６９２９２に記載の方法で調製された）を抗原とし
て、Ｂａｌｂ／ｃ系マウス（５週令、メス）に対し、計
５回の免疫を行なった。初回は、フロインドの完全アジ
ュバント（Ｃｏｍｐｌｅｔ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｊｕ
ｖａｎｔ、DIFCO製）と混和したｈＧＨ１００μｇを腹
腔内に投与した。その後２週間隔で３回、フロインドの
不完全アジュバント（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔ Ｆｒｅｕｎ
ｄ’ｓ Ａｊｕｖａｎｔ、DIFCO 製）と混和したｈＧ
Ｈ ５０μｇを腹腔内に投与した。最終免疫は、４回目
の免疫の２週間後に生理食塩水に溶解したｈＧＨ ５０
μｇを尾静脈内に投与し、その３日後に免疫したマウス
の脾臓細胞を細胞融合に用いた。

【００２１】(2)細胞融合による抗体産生ハイブリドー
マの作製 免疫した脾臓細胞と、マウス骨髄腫細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ
８を約５：１〜１０：１の割合で混合し、５０％（Ｗ／
Ｖ）ポリエチレングリコール溶液（GIBCO製、平均分子
量４０００）を融合促進剤として使用し、常法に従い細
胞融合を行なった。融合後の細胞は、脾臓細胞換算で１
×１０⁶個／ｍｌになるように２０％ウシ胎児血清含有
ＩＭＤＭ培地（GIBCO製）にヒポキサンチン、アミノプ
テリン、チミジンを加えた培地（ＨＡＴ培地）に懸濁
し、９６ウエルマイクロプレート（Corning製）に１ウ
エル当たり０．１ｍｌずつ分注した。該融合細胞をＣＯ
₂インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ₂）で、３〜５日
毎に半量ずつ培地交換を行ないながら培養した。ＨＡＴ
培地で増殖可能なハイブリドーマのみ選択培養した。

【００２２】(3)スクリーニング コロニー形成の確認されたウエルについて、培養上清中
のｈＧＨに対する抗体の有無を確認するために、酵素免
疫測定法によるスクリーニングを行なった。０．１Ｍ炭
酸緩衝液（ｐＨ９．６）で１０μｇ／ｍｌに希釈したｈ
ＧＨを９６ウエルマイクロプレート（GREINER製）に、
１ウエル当たり５０μｌずつ分注し、４℃で１晩放置し
固定させた。このプレートを洗浄液（０．０２％アジ化
ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１０ｍＭ
トリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)）で洗浄後、ブロック液
１（０．５％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）を１０
０μｌずつ加えブロッキングした。ブロック液１を除去
し、上記(2)でコロニー形成の確認されたウエルの培養
上清を各ウエルに５０μｌずつ添加し、室温で２時間振
とうした。洗浄後、ブッロク液１で５００倍に希釈した
アルカリホスファターゼ標識抗マウスIgs-抗体（DAKO
製）をウエル当たり１００μｌずつ分注し、室温で２時
間振とうした。洗浄液で洗浄後、基質溶液（０．６％ｐ
−ニトロフェニルリン酸、０．５ｍＭ塩化マグネシウム
を含む９．６％ジエタノールアミン緩衝液(ｐＨ９．
６)）５０μｌを加え、室温で３０分間振とうした。反
応液に３Ｎ水酸化ナトリウム５０μｌを加え反応を停止
させ、４０５ｎｍにおける吸光度をイムノリーダー（日
本インターメッド製）にて測定し、ｈＧＨに反応するコ
ロニーを選択し、クローニングに供した。

【００２３】(4)ハイブリドーマのクローニング、ｍＧ
Ｈとの反応性の確認 ｈＧＨに反応する抗体を産生するハイブリドーマについ
て、限界希釈法によるクローニングを３回繰り返し行な
った。得られた抗ｈＧＨ抗体産生ハイブリドーマの培養
上清を上記(3)と同様の試験に供した。ただし今回は既
報の方法（Chohet al.,Science,124(1956)等）に準じて
サル下垂体より精製し作製したｍＧＨを固定し、ｍＧＨ
との反応性を調べた。この結果、ｈＧＨに特異的に反応
しｍＧＨに実質的に反応しない抗体を産生するハイブリ
ドーマ、ＭＴＣ６Ｂ株を取得した。ＭＴＣ６Ｂ株は、茨
城県つくば市東１丁目１番３号の通商産業省工業技術院
生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５
６６３として寄託されている。

【００２４】(5)ハイブリドーマが産生するモノクロー
ナル抗体のサブクラスの決定 得られたハイブリドーマＭＴＣ６Ｂ株の産生する抗ｈＧ
Ｈモノクローナル抗体のサブクラスをマウスモノクロー
ナル抗体アイソタイピング用試験紙（ISO Strip、ベー
リンガー・マンハイム製）を使用し決定した。ＭＴＣ６
Ｂ株の産生する抗ｈＧＨモノクローナル抗体のサブクラ
スは、Ｈ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。

【００２５】(6)モノクローナル抗体の調製 ＭＴＣ６Ｂ株を培養し増殖させ、１×１０⁷個の細胞を
２週間前にプリスタンを投与したＢａｌｂ／ｃマウスの
腹腔内に接種した。接種から１０〜１４日後、マウスの
腹腔から腹水を採取した。採取した腹水はプロテインＡ
（BIO RAD製）を用いたアフィニティークロマトグラフ
ィーで精製し、本発明の抗ｈＧＨモノクローナル抗体で
あるＭＴＣ６Ｂモノクローナル抗体を得た。

【００２６】参考例１ 抗ｈＧＨウサギポリクローナル
抗体及び抗ｈＧＨ標識抗体の作製 (1)免疫 遺伝子組換えで生産し、精製されたｈＧＨ（特開平６−
２６９２９２記載の方法で調製された）１００μｇをフ
ロインドの完全アジュバント（ＣｏｍｐｌｅｔＦｒｅｕ
ｎｄ’ｓ Ａｊｕｖａｎｔ、DIFCO製）と混和し、ウサ
ギ背部数カ所に投与し、初回免疫を行なった。その後２
週間隔で同様の投与法により計５回追加免疫を行なっ
た。

【００２７】(2)抗血清の精製 上記(1)で得られたウサギ抗血清を硫酸ナトリウム分画
（１８％飽和）後、１７．５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
６．３）で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（ＤＥ−５
２、Whattman製）に通し、非吸着画分を分取し、抗ｈＧ
Ｈウサギポリクローナル抗体ＩｇＧ画分を得た。

【００２８】(3)抗ｈＧＨ標識抗体の作製 上記(2)で得られた抗ｈＧＨウサギポリクローナル抗体
ＩｇＧ画分を０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍク
エン酸緩衝液（ｐＨ４．５）で透析した後、１Ｎ塩酸で
ｐＨを３．７に調整し、該抗ｈＧＨウサギポリクローナ
ル抗体ＩｇＧ画分に対し３％ペプシンを加え、３７℃で
３．５時間消化した。１Ｍトリス溶液でｐＨを７．５〜
８．０に調整し反応を停止した。これを２ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウム及び０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡
化したＳ−２００ＳＦカラム（Pharmacia製）でゲルろ
過し、最初に溶出するピークを分取した。分取した画分
に１／５０量の０．２Ｍ ２−メルカプトエチルアミン
液を加え３７℃で９０分反応させた。次に２ｍＭエチレ
ンジアミン四酢酸二ナトリウム及び０．１Ｍ塩化ナトリ
ウムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平
衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Pharmacia
製）でゲルろ過し、最初に溶出するピーク、Ｆａｂ’画
分を分取した。上記の操作とは別に西洋ワサビ由来ペル
オキシダーゼ（東洋紡製、以下ＰＯＤと略す）５ｍｇを
０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、それに
４．０ｍｇのＮ−サクシニミジル−４−（マレイミドメ
チル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレートを５０
μｌのジメチルフォルムアミドに溶解したものを添加
し、３０℃で６０分間保温した。これを２ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸二ナトリウム及び０．１Ｍ塩化ナトリウ
ムを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡
化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（Pharmacia
製）でゲルろ過し、最初に溶出するピーク、ピリジルジ
チオ基結合ＰＯＤ画分を分取した。前記Ｆａｂ’画分に
対してピリジルジチオ基結合ＰＯＤを等モル加え、４℃
で１夜放置した。この混合液を０．１Ｍ塩化ナトリウム
含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）で平衡化した
Ｓ−２００ＳＦカラムでゲルろ過し、最初に溶出するピ
ーク、ＰＯＤ標識抗ｈＧＨＦａｂ’画分を分取した。保
護安定剤としてウシ血清アルブミンを０．１％となるよ
うに添加し、使用時まで４℃で保存した。

【００２９】実施例２ サンドイッチ酵素免疫測定法に
よるＭＴＣ６Ｂモノクローナル抗体のｈＧＨとｍＧＨと
の反応性 実施例１で得られたＭＴＣ６Ｂモノクローナル抗体を用
いてｈＧＨとｍＧＨに対する反応性を確認した。ＭＴＣ
６Ｂモノクローナル抗体をＰＢＳで１０μｇ／ｍｌに希
釈し、９６ウエルマイクロプレート（GREINER製）に１
ウエル当たり５０μｌずつ分注し、４℃で１晩放置し
た。このプレートを洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．０)）で洗浄
後、ブロック液２（ブロックエース（雪印製）をＰＢＳ
で４倍希釈）でブッロキングした。ブロック液２を除去
した後、９６ウエル中３２ウエルにブッロク液２で適当
な濃度（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈したｈＧＨを１
００μｌ、３２ウェルに同様にブロック液２で適当な濃
度（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈したｍＧＨを１００
μｌ、残り３２ウェルに４０ｎｇ／ｍｌのｍＧＨを含む
サル血清（以下ｍＳと略記することもある）で適当な濃
度（０〜１００ｎｇ／ｍｌ）に希釈したｈＧＨを１００
μｌ添加し、室温で２時間振とうした。プレートを洗浄
液で洗浄した後、参考例１に記載のＰＯＤ標識抗ｈＧＨ
抗体Ｆａｂ’画分を抗体希釈液（ブロックエース（雪印
製）をＰＢＳで１０倍希釈）で５００倍に希釈したもの
をウエル当たり１００μｌずつ分注し、室温で２時間振
とうした。洗浄操作を行なった後、基質溶液（０．６７
ｍｇ／ｍｌｏ−フェニレンジアミンを含む０．０２％過
酸化水素水）１００μｌを加え、室温で３０分間振とう
した。反応液に１Ｍ硫酸を１００μｌ加え反応を停止さ
せ、４９０ｎｍにおける吸光度をイムノリーダー（日本
インターメッド製）により測定した。その結果を図１
（図１）に示す。実施例１で得られたＭＴＣ６Ｂモノク
ローナル抗体は、ｍＧＨとは１００ｎｇ／ｍｌの場合で
もほとんど反応せず、そのときの吸光度をｈＧＨの反応
曲線で計算すると、ｈＧＨ換算で０．３ｎｇ／ｍｌ以下
となった。よってその交差反応性は、１％以下と計算さ
れる。また、ｍＧＨを含むサル血清が混在していてもｈ
ＧＨとの反応性に影響はほとんどなかった。

【００３０】

【発明の効果】本発明のハイブリドーマは、ｈＧＨに特
異的に反応し、ｍＧＨと実質的に反応しないモノクロー
ナル抗体を産生する。本発明のモノクローナル抗体を利
用して、サンドイッチ酵素免疫測定法により直接サル血
中のｈＧＨのみを正確に定量することができる。そのた
め本発明の測定方法は、これまで測定不可能であった、
サルをモデルにした場合のｈＧＨの体内動態などの解明
にとって有効な手段となることが期待される。また本発
明の測定方法は、成長障害疾患の治療薬等として有用と
考えられるｈＧＨの開発においても、非臨床試験等での
動物モデルの可能性を広げた。

【図面の簡単な説明】

【図１】サンドイッチ酵素免疫測定法によるＭＴＣ６Ｂ
モノクローナル抗体のｈＧＨとｍＧＨ、サル血清に添加
したｈＧＨとの反応性を示す図である。図中ｈＧＨは比
と成長ホルモンを、ｍＧＨはサル成長ホルモンを、Ｓｍ
はサル血清をそれぞれ示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 橋本 吉秀 千葉県茂原市東郷1900番地の１ 三井東圧 化学株式会社内

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒト成長ホルモンに特異的に反応し、サ
   ル血中成分と実質的に反応しないことを特徴とするモノ
   クローナル抗体。
2. 【請求項２】 サル成長ホルモンとの交差反応性が１％
   以下である請求項１に記載のモノクローナル抗体。
3. 【請求項３】 ハイブリドーマＦＥＲＭ Ｐ−１５６６
   ３が産生する請求項１または２に記載のモノクローナル
   抗体。
4. 【請求項４】 請求項１、２または３に記載のモノクロ
   ーナル抗体を産生する細胞株。
5. 【請求項５】 細胞株がハイブリドーマＦＥＲＭ Ｐ−
   １５６６３である請求項４に記載の細胞株。
6. 【請求項６】 請求項１、２または３に記載のモノクロ
   ーナル抗体を用いることを特徴とするヒト成長ホルモン
   の免疫測定方法。
7. 【請求項７】 ヒト成長ホルモンの免疫測定方法が酵素
   免疫測定法である請求項６に記載の免疫測定方法。
8. 【請求項８】 以下の（１）〜（３）の工程よりなる、
   サンドイッチ酵素免疫測定法である請求項７に記載の免
   疫測定方法。 （１） ヒト成長ホルモンに特異的に反応しサル成長ホ
   ルモンと実質的に反応しないモノクローナル抗体を不溶
   性担体に結合させたモノクローナル抗体結合不溶性担体
   と、ヒト成長ホルモンを含む被検液を反応させて、ヒト
   成長ホルモンのみを特異的に該モノクローナル抗体結合
   不溶性担体に結合させた結合体を形成し、（２） 工程
   （１）で得られた結合体と、ヒト成長ホルモンに特異的
   に反応する抗体を酵素標識した抗ヒト成長ホルモン酵素
   標識抗体とを反応させて、該モノクローナル抗体結合不
   溶性担体上にモノクローナル抗体−ヒト成長ホルモン−
   抗ヒト成長ホルモン酵素標識抗体というサンドイッチ状
   複合体を形成させ、（３） 工程（２）で得られたサン
   ドイッチ状複合体の標識として用いた酵素の活性量を測
   定する。
9. 【請求項９】 モノクローナル抗体のサル成長ホルモン
   との交差反応性が１％以下である請求項６、７または８
   に記載の免疫測定方法。
10. 【請求項１０】 測定感度が０．００１〜０．０５ｎｇ
    ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜０．０３ｎｇ／ｍｌであ
    る請求項６〜９のいずれかに記載の免疫測定方法。