JPH09509301A

JPH09509301A - Ｄｎａ配列決定用酵素

Info

Publication number: JPH09509301A
Application number: JP7506010A
Authority: JP
Inventors: グッドマン，マイロン，エフ．; リハークランヅ，リンダ，ジェイ．
Original assignee: ユニバーシティオブサザンカリフォルニア; ザガヴァナーズオブザユニバーシティオブアルバータ
Priority date: 1993-08-02
Filing date: 1994-08-01
Publication date: 1997-09-22
Also published as: EP0713535A1; WO1995004162A2; CA2168471A1; NZ269727A; KR960704067A; NO960408L; PL312836A1; HUT75841A; LV11486A; BR9407403A; US5660980A; CN1132529A; WO1995004162A3; BG100188A; SK14196A3; US5547859A; AU699498B2; AU7408894A; FI960469A0; FI960469A

Abstract

(57)【要約】３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を持たない突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼが提供される。これら突然変異ポリメラーゼはＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとしての用途を有する。配列決定につき従来使用されていない系統群ＢＤＮＡポリメラーゼおよび読み終りヌクレオチドによるＤＮＡ配列決定法が開発された。ここに開示した方法は、ＤＮＡ配列決定に用途を有することが従来知られていなかった系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ、たとえば突然変異型もしくは野生型のファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼもしくは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩをデオキシヌクレオチドと読み終りヌクレオチドとの新規な組合せと共に使用することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡ配列決定用酵素発明の背景本発明は、Ｆ．サンガーにより開発されたＤＮＡ配列決定法［Ｆ．サンガー、Ｓ．ニックレン、Ａ．Ｒ．クールソン（１９７７）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第７４巻、第５４６３〜５４６７頁］の改変、並びにＤＮＡ配列決定に使用しうる新規な酵素に関するものである。サンガーの配列決定法は、活性化された（ｐｒｉｍｅｄ）ＤＮＡテンプレートと２′−デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰ、第１図参照）と２′，３′−ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ、第１図）との存在下におけるインビトロＤＮＡ合成反応に基づいている。これは、ポリヌクレオチド連鎖中にＤＮＡポリメラーゼにより組み込まれると、その後の連鎖延長を停止させる。ＤＮＡ産生物はしたがって、テンプレートに対し相補的であると共に特定ジデオキシヌクレオチドにより終了した一連のポリヌクレオチド鎖である。ＤＮＡ配列決定用産生物は寸法により分離することができ、生成物のパターンがＤＮＡ配列を与える。原理的に、各種の生物および各種の読み終りヌクレオチドからのＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡを配列決定するのに有用である。実際上、数種のＤＮＡポリメラーゼおよび読み終りヌクレオチドがこの目的に適すると判明している。ＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼの例としてはバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シクエネース（登録商標））の開発が参照される［Ｓ．テーバーおよびＣ．Ｃ．リチャードソン（１９９０）、ジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー、第２６５巻、第８３２２〜８３２８頁］。明瞭なＤＮＡ配列を得るには、配列決定用産生物の大部分をジデオキシヌクレオチドで終了すると共に全配列決定用産生物が同等に提示されることを必要とする。２種のファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼ活性はＤＮＡ配列決定用産生物を分解させ、したがってジデオキシヌクレオチド−終了配列決定用産生物の分解を防止するには前記活性を除去せねばならない。一方の活性（すなわち３′→５′エキソヌクレアーゼ活性）は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠失突然変異種を作成することにより除去された。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼはピロ燐酸分解活性をも有して配列決定用産生物を分解させうる。ＤＮＡ配列決定反応で産生されたピロ燐酸塩を分解させるべくピロホスファターゼが添加された。ピロ燐酸塩がなければピロ燐酸分解が生じない。配列決定反応に関する他の精製は、Ｍｇ²⁺の代りにＭｎ²⁺を用いて反応生成物の一層均一な分配をもたらすことである。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼから配列決定用ポリメラーゼへの開発に関するこの概略は単純であるが、この概略は天然ＤＮＡポリメラーゼの改変と反応条件の開発とが読み終り配列決定法を用いる高品質のＤＮＡ配列情報を得るのに必要とされる点を示している。読み終り法を用いる最適なＤＮＡ配列決定条件はまだ得られていない。不明瞭な配列決定情報がまだ観察され、両ＤＮＡ鎖のＤＮＡ配列を決定することを必要とする。さらにＭｇ²⁺の代りにＭｎ²⁺を使用すれば、配列決定反応に必要とされるＤＮＡテンプレートの量も増加する。したがって、現存する配列決定法を改善し或いは補うよな新規な方法を開発することが有利である。野生型Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子がクローン化されると共に蛋白産生物が発現されており［Ｔ．Ｃ．リン、Ｊ．Ｒ．ラッシュ、Ｅ．Ｋ．スパイサおよびＷ．Ｈ．コーニッヒスベルグ（１９８７）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８４巻、第７０００〜７００４頁；リン等に係る米国特許第４，９３５，３６１号］、さらにイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩもクローン化されると共に発現されている［Ｃ．Ａ．ボナー、Ｓ．ヘイズ、Ｋ．マッケンチーおよびＭ．Ｆ．グッドマン（１９９０）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８７巻、第７６６３〜７６６７頁］。標準的なオリゴヌクレオチド指向突然変異技術が新規な種類のＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩを作成すべく使用されている。したがって、多量の野生型および突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩを経済的に作成する手段が存在する。他面において本発明は、ＤＮＡ配列決定に有用な性質を有するＤＮＡポリメラーゼを同定すべく遺伝分析を使用する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは最も熱心に遺伝特性化されたＤＮＡポリメラーゼである［Ｌ．Ｊ．レハークランツ（１９９３）、モレキュラ・バイオロジー・オブ・バクテリオファージＴ４、Ｊ．カラム編、アメリカン・アソシエーション・フォー・マイクロバイオロジー、印刷中］。したがって、既に同定された幾種かの突然変異ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ配列決定に有用な性質を有することができ、新規な突然変異株を直接に分離することができる。有用なＤＮＡ配列決定特性を有する新規なＴ４ＤＮＡポリメラーゼを分離する方法も有用である。発明の要点本発明の一面によれば、ＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとして使用しうる新規な酵素が提供される。これら酵素は系統群ＢＤＮＡポリメラーゼの遺伝突然変異から生ずる。これら突然変異は、これら新規な系統群ＢＤＮＡポリメラーゼの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を除去する。本発明の他面によれば、ＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとしてファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩを使用することを可能にする方法が提供される。ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩをＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼまで変換させるＤＮＡポリメラーゼの改変を用いて、これら２種のポリメラーゼに対し蛋白質配列相同性を有するＤＮＡポリメラーゼを同様に改変することもできる。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩに対し蛋白質配列類似性を有するＤＮＡポリメラーゼは、限定はしないが系統群ＢＤＮＡポリメラーゼと呼ばれる１群のＤＮＡポリメラーゼを包含する［Ｄ．Ｋ．ブレイスウェイトおよびＪ．イトー（１９９３）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第２１巻、第７８７〜８０２頁］。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼに対し広い蛋白質配列相同性を有するファージＴ２およびＴ６からのＤＮＡポリメラーゼが特に適切である。ここに説明する方法の拡張によれば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩに対し機能類似性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて読み終りヌクレオチドおよび以下開示する方法によりＤＮＡ配列情報を得ることができる。本発明の他面によれば、ポリメラーゼ蛋白質配列に１つもしくはそれ以上の特定アミノ酸置換を有してＤＮＡ配列決定用途に関し所定のＤＮＡポリメラーゼを改良するようなＤＮＡポリメラーゼ改変の確認方法も提供される。図面の簡単な説明第１図は本発明の実施に有用な標準ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の構造を示し、第２図は突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて生じたＤＮＡ配列決定用ゲルを示し、第３図は他の標準ヌクレオチドと比較し極めて低濃度でｄＡＴＰを使用するＤＮＡ配列決定用ゲルを示し、第４図は野生型および突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるテンプレート失歩部位（Ｘ）にまたがるプライマー範囲を示す。発明の詳細な説明本発明の一面、すなわちＤＮＡ配列決定反応を行う改変ＤＮＡポリメラーゼの能力を向上させる新規な性質を持った改変ＤＮＡポリメラーゼを同定する特徴は、優秀なＤＮＡ複製活性を有する改変ＤＮＡポリメラーゼを同定する新規な遺伝選択手法の設計により達成される。配列決定用ポリメラーゼとして従来使用しえなかったＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＥＱＩＤＮＯ：３および４）並びにイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ＳＥＱＩＤＮＯ：５および６）は、非標準的または新規な読み終りヌクレオチドの組合せ物を用いれば、サンガー型反応にＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとして使用することができる。さらに、この知見に加えＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩにおける３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の失活は得られるＤＮＡ配列情報の品質を向上させることも判明した。他面において、３′→５ ′エキソヌクレアーゼ活性を低下させる他の改変と組合わせた際に有利なＤＮＡ配列決定特性を有する多重改変ＤＮＡポリメラーゼを産生する能力を持った他のポリメラーゼ改変も見出された。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼに対する広い配列相同性に基づき、たとえばファージＴ２（ＳＥＱＩＤＮＯ：１および２）並びにＴ６ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼが本発明の方法に用いるのに特に適している。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩは、アラビノヌクレオチド（第１図）、すなわちａｒａＵＴＰおよびａｒａＣＴＰを標準読み終りヌクレオチドｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰの代りに使用すれば、効果的なＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとして使用することができる。標準プリンジデオキシヌクレオチド（第１図）、すなわちｄｄＡＴＰおよびｄｄＧＴＰはＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩにつき効果的な読み終りヌクレオチドである。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩに関するＤＮＡ配列決定反応は、読み終りヌクレオチドの新規な組合せ物を使用する点において標準的ＤＮＡ配列決定反応とは相違する。原理的に任意の読み終りヌクレオチドを使用しうるがＤＮＡポリメラーゼはこれらヌクレオチドをＤＮＡ鎖中に組込む能力において顕著に相違する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩにつき、これら酵素によるｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰの低い組込みは配列決定手法におけるこれら標準読み終りヌクレオチドの使用を妨げている。代案の読み終りアラビノヌクレオチド、すなわちａｒａＣＴＰおよびａｒａＵＴＰをＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩにより比較的効率的に組込みうるという知見は、これらＤＮＡポリメラーゼを配列決定用ポリメラーゼとして使用することを可能にする。読み終りヌクレオチド、すなわちａｒａＣＴＰ、ａｒａＵＴＰ、ｄｄＡＴＰおよびｄｄＧＴＰの新規な組合せ物との反応を用いるＤＮＡ配列決定法につき、方法Ｉにて下記に説明する。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の失活または顕著な低下は、方法Ｉの配列決定反応を用いて得られるＤＮＡ配列情報の品質を向上させることも突き止められた。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、限定はしないが酵素における次のアミノ酸置換の１つもしくはそれ以上を包含するアミノ酸置換により顕著に減少させることができる：Ｄ１１２Ａ＋Ｅ１１４Ａ、Ｄ２１９ＡおよびＤ３２４Ａ。本明細書の全体で使用する上記の命名では、アミノ酸につき単一文字コードを使用する。アミノ酸につき単一文字コードに併記した数字はコドン番号である。たとえばＤ１１２Ａ＋Ｅ１１４Ａはコドン位置１１２におけるアスパラギン酸塩（Ｄ）に対するアラニン（Ａ）置換を示す。Ｄ１１２Ａ＋Ｅ１１４Ａは、改変ＤＮＡポリメラーゼにおける２つのアミノ酸置換を示す。これら突然変異種を得るため、次の突然変異を用いた：Ｄ１１２Ａについては位置３３４におけるＡヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換することによりＡアミノ酸に対するＤアミノ酸の変換を行い、当業者に知られるように他のヌクレオチド変化が同じ変化を行うこともできる；Ｅ１１４Ａについては位置３４０におけるＡヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換し、他のヌクレオチド変化が同じアミノ酸変化を行いうることも知られている。Ｄ２１９Ａについてはそれぞれ位置６５５および６５６におけるＡおよびＣヌクレオチドをそれぞれＣおよびＧヌクレオチドで交換し、他のヌクレオチド変化も同じアミノ酸変化を与えることが知られている。さらにＤ３２４Ａについては位置９７０におけるＡヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換し、他のヌクレオチド変化が同じアミノ酸変化を与えうることも知られている。イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ３′→５ ′エキソヌクレアーゼ活性は、限定はしないが次のアミノ酸置換を包含するアミノ酸置換により顕著に減少させることができる：Ｄ１５６Ａ＋Ｅ１５８Ａ。これら突然変異種を得るため、次の突然変異を用いた：Ｄ１５６Ａについては位置４６７におけるＡヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換し、他のヌクレオチド変化が同じアミノ酸変化を与えうることも知られている。Ｅ１５８Ａについては位置４７３におけるＡヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換し、他のヌクレオチド変化が同じアミノ酸変化を与えうることも知られている。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失突然変異種の作成は標準的オリゴヌクレオチド突然変異法［たとえばＴ．Ａ．クンケル、Ｊ．Ｄ．ロバーツおよびＲ．Ａ．ザクール（１９８７）、メソッズ・エンチモロジー、第１５４巻、第３６７〜３８２頁］により達成される。本発明の他の特徴は、標準的ＤＮＡ配列決定反応では使用されない読み終りヌクレオチドを用いて達成することができる。さらにＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩは、標準ｄｄＮＴＰの代りに３′ −アミノ−２′，３′−ジデオキシリボヌクレオチド（３′−ＮＨ₂ｄＮＴＰ）（第１図）を使用すれば、効果的ＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとして使用することができる。この配列決定法については方法ＩＩにて下記に説明する。未改変（野生型）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよび３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失突然変異種を方法ＩＩの反応に使用することができる。イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩの３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失突然変異種も方法ＩＩの反応に使用して成功を収めている。３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失型Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて、４種の標準ｄＮＴＰの１種の濃度が極めて低ければ、ヌクレオチド類似体なしにＤＮＡ配列情報を得ることもできる。たとえばｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰの濃度が１００μＭであると共にｄＡＴＰの濃度が０．１〜１μＭであれば、組み込みにつきｄＡＴＰを必要とする１つ前の位置で終了する配列決定用産生物が観察される。一方のｄＮＴＰが低濃度で存在すると共に他の３種のｄＮＴＰが高濃度で存在する並列反応にて、ＤＮＡ配列を決定することができる。この配列決定法を以下方法ＩＩＩと称する。第３の目的、すなわちポリメラーゼにより配列決定特性を向上させうる新規な性質を持った突然変異もしくは改変ＤＮＡポリメラーゼを同定する目的は、新規なＤＮＡポリメラーゼにつき選択する新規な手法を設計して達成された。この新規な手法、すなわち遺伝選択のタイプがファージＴ４につき開発された。基本的手法は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に１つもしくはそれ以上の突然変異を有するファージＴ４株から出発して、ＤＮＡ複製の或る面に部分的に欠陥を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼをもたらすことである。数種のＤＮＡポリメラーゼ改変は、ＤＮＡを効率的に複製するＤＮＡポリメラーゼの能力を減少させうる。たとえばＤＮＡテンプレートもしくはｄＮＴＰを結合するＤＮＡポリメラーゼの能力またはＤＮＡテンプレートに沿って移動するＤＮＡポリメラーゼの能力における変化はＤＮＡ複製を効率的に減少させる。ファージＴ４につき、減少したＤＮＡ複製活性を有するＤＮＡポリメラーゼ突然変異種を容易に同定することができる。ＤＮＡ複製にて部分的に欠陥がある突然変異ＤＮＡポリメラーゼを有するファージＴ４株は、感染に使用した細菌宿主がｏｐｔＡ１突然変異を持てば、ＤＮＡを合成することができない。換言すれば、イー・コリｏｐｔＡ１宿主は、ＤＮＡ複製活性に欠陥を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼを持ったＴ４株の増殖を制限する。イー・コリｏｐｔＡ１株につき観察される制限の基礎は、ｄＧＴＰを分解する増加量の酵素が産生されることである［Ｓ．Ｓ．ブルグラーおよびＣ．Ｃ．リチャードソン（１９９０）、プロシーディング・ナショナル・アカデミー・サイエンス、ＵＳＡ、第８７巻、第２７４０〜２７４４頁］。すなわち、減少したＤＮＡ複製活性を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼを持ったファージＴ４株は、ヌクレオチドプール（特にｄＧＴＰ）が減少すれば、ＤＮＡを複製することができず、またファージ後代を生産することもできない。遺伝選択手法の開発に関し、ＤＮＡ複製欠失ＤＮＡポリメラーゼを同定すると共に、この種の欠失ＤＮＡポリメラーゼを有するファージからの後代の生産を制限すべく（すなわちイー・コリｏｐｔＡ１細菌宿主の感染におけるファージ後代の制限された生産）用いうる条件が確立された。下記するこれら条件は、優秀なＤＮＡ複製能力を有する改変（突然変異）ＤＮＡポリメラーゼの選択を可能にする。減少したＤＮＡ複製活性を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼがたとえば１つもしくはそれ以上の追加アミノ酸置換によりさらに改変されれば、恐らく追加の突然変異／アミノ酸置換がＤＮＡ複製活性における初期の欠陥を修正または補うであろう。この種のさらに改変されたＤＮＡポリメラーゼはかくしてイー・コリｏｐｔＡ１宿主にてＤＮＡを複製することができ、ファージ後代が生産される。すなわち、事前にこの宿主にて後代を生産しないよう制限されたファージによる感染にてイー・コリｏｐｔＡ１宿主におけるファージ後代の検出は、出発突然変異（ＤＮＡ複製活性を減少させるアミノ酸置換）と、出発ＤＮＡ複製欠陥につき修正もしくは補う追加アミノ酸置換をコードする１つもしくはそれ以上の新たな突然変異とを持った多数突然変異ＤＮＡポリメラーゼを選択することを可能にする。この新規な修正もしくは補償性の突然変異（遺伝用語にてサプレッサ突然変異とも呼ばれる）は、標準的方法を用いてファージＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を配列決定することにより同定することができる［Ｄ．Ｓ．マックフィータース、Ａ．クリステンセン、Ｅ．Ｔ．ヤング、Ｇ．ストルモおよびＬ．コールド（１９８６）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、第１４巻、第５８１３〜５８２６頁；Ｌ．Ｊ．レハ−クランツ（１９８８）、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー、第２０２巻、第７１１〜７２４頁］。これら新たな突然変異をファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子中に或いはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ発現ベクター中に導入してさらに検討することができる。減少したＤＮＡ複製能力を有する出発ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、新規な突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、これら突然変異ＤＮＡポリメラーゼが減少ＤＮＡ複製能力を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼにおける欠陥を解消し、補い或いは修正する能力に基づいて選択されたので、優秀なＤＮＡ複製能力を有する。優秀なＤＮＡ複製能力を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼを同定するための遺伝手法は、上記性質を有する単一ファージを１０⁸〜１０⁹ファージの集団から選択しうるので、極めて鋭敏である。さらに本発明によれば、優秀なＤＮＡ複製活性を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼにつき有利な性質、たとえばより均一な配列決定用産生物を生産する向上したプライマー範囲および未改変ＤＮＡポリメラーゼにより複製を阻止し或いは妨げうるテンプレート領域における向上したＤＮＡ複製などの性質を有する。優秀なＤＮＡ複製能力を有するＴ４ＤＮＡポリメラーゼ突然変異種は、方法Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩにより得られるＤＮＡ配列情報の品質を向上させると予想される。優秀なＤＮＡ複製能力を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼの検出につき上記した遺伝選択手法は、この種の欠陥ＤＮＡポリメラーゼを同定しうると共に修正もしくは補償性突然変異を有する突然変異種を選択できれば、他の生物のＤＮＡポリメラーゼにも適用することができる。ＤＮＡ配列決定法Ｉ顕著に減少した３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＤ１１２Ａ＋Ｅ１１４Ａ、Ｄ２１９ＡもしくはＤ３２４Ａアミノ酸置換を有する突然変異種、並びに顕著に減少した３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、たとえばＤ１５６Ａ＋Ｅ１５８Ａアミノ酸置換を有する突然変異種を次の読み終りヌクレオチド：ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ａｒａＣＴＰおよびａｒａＵＴＰ（第１図）と共にＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとして使用することができる。第２図は３種のＤＮＡ配列決定用ゲルの写真図である。方法Ｉで得られたＤＮＡ配列決定パターンはパネルＡおよびＢ、レーン１〜４、並びにパネルＣである。パネルＡはイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩのエキソヌクレアーゼ欠失突然変異種に対するＤＮＡ配列決定反応を示す。ｄｄＧＴＰとの反応はレーン１であり、ｄｄＡＴＰとの反応はレーン２であり、ａｒａＣＴＰとの反応はレーン３であり、ａｒａＵＴＰとの反応はレーン４である。パネルＢは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠失型を用いたＤＮＡ配列決定反応を示す。ここでもレーン１はｄｄＧＴＰとの反応を示し、レーン２ｄｄＡＴＰとの反応を示し、レーン３はａｒａＣＴＰとの反応を示し、レーン４はａｒａＵＴＰとの反応を示す。パネルＡおよびＢにおける各反応は二価金属陽イオンとしてＭｇ²⁺を有する。Ｍｇ²⁺の代わりにＭｎ²⁺を用いても配列決定パターンが得られる。イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩのエキソヌクレアーゼ欠失型を用いたＭｎ²⁺による方法Ｉの反応をパネルＣ、レーン１〜４の左側に示し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ欠失型を用いた反応をパネルＣ、レーン１〜４の右側に示す。パネルＣ、レーン１〜４はｄｄＧＴＰ（レーン１）、ｄｄＡＴＰ（レーン２）、ａｒａＣＴＰ（レーン３）およびａｒａＵＴＰ（レーン４）との反応を含む。ＤＮＡ配列決定法ＩＩ野生型（未改変）および３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失型のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、並びに３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失型のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩを、読み終りヌクレオチドとして３′−アミノ−２′，３′− ジデオキシリボヌクレオチド（第１図）と共にＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼとして使用することができる。エキソヌクレアーゼ欠失型のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩに関する方法ＩＩの反応を第２図、パネルＡ、レーン５〜７に示す。レーン５は３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＧＴＰとの反応を示し、レーン６は３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＡＴＰとの反応を示し、レーン７は３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＴＴＰとの反応を示す。エキソヌクレアーゼ欠失型のＴ４ＤＮＡポリメラーゼに関する方法ＩＩの反応をパネルＢ、レーン５〜７に示す。レーン５、６および７は３′−アミノ−２ ′，３′−ジデオキシ−ＧＴＰ、−ＡＴＰおよび−ＴＴＰとの反応をそれぞれ示す。このデータは、エキソヌクレアーゼ欠失型のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩおよびバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼが次の読み終りヌクレオチドの組合せ物を用いてＤＮＡ配列情報を与えうることを示す：ｄｄＧＴＰもしくは３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＧＴＰ；ｄｄＡＴＰもしくは３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＡＴＰ；ａｒａＵＴＰもしくは３′ −アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＴＴＰ；およびａｒａＣＴＰ。３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＧＴＰ、−ＡＴＰおよび−ＴＴＰを用いて得られる良好な配列パターンに鑑み、３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＣＴＰも効果的な読み終りヌクレオチドであると思われる。等しいバンド強度を得、または第２図に示した反応につき解読配列の長さを増大させるべく、方法ＩもしくはＩＩにつき条件を最適化する試みは行わなかった。しかしながら、配列決定法は少なくとも３００塩基につき配列情報を与えることができる。エキソヌクレアーゼ欠失型のＴ４ＤＮＡポリメラーゼは、３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートでの配列決定反応には必要とされない。方法ＩおよびＩＩのための試料実験条件（第２図）標識化反応５μＬのエキソヌクレアーゼ欠失ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼまたはイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩにつき３００〜４００単位／ｍＬ。１単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼは３０℃にて３０分間におけるＤＮＡ中への１０ｎモルのｄＴＭＰ組込みを触媒する。１単位のイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩは３７℃にて１分間におけるＤＮＡ中への１ｐモルのｄＴＭＰ組込みを触媒する。反応は典型的には３７℃で行われるが、反応は約３５〜約４２℃の温度範囲にて行うこともできる。１５μＬのプライマーＭ１３ＤＮＡ複合体、１５ｎＭ、１５μＬの標識化反応溶液：２μＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ；１μＭの［αＰ³²］ｄＡＴＰ；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）；イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩにつき５ｍＭのＭｇＣｌ₂もしくは６ｍＭのＭｎＣｌ₂；Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにつき５ｍＭのＭｇＣｌ₂もしくは０．５ｍＭのＭｎＣｌ₂；５ｍＭのジチオスレイトール；５０μｇ／ｍＬの牛血清アルブミン。反応混合物を３７℃で５分間培養した。プライマーを５′−末端にて標識することができ、或いは延長反応にて標識ヌクレオチドを含ませ、さらに他の標準的方法を用いて標識することができる。延長反応４μＬの標識化反応混合物（上記）、４μＬの停止溶液：５０μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ；並びに下記する停止類似体の１種：方法Ｉ：ｄｄＧＴＰ、１．６ｍＭ；ｄｄＡＴＰ、０．７ｍＭ；ａｒａＣＴＰ、０．５ｍＭ；ａｒａＵＴＰ、０．５ｍＭ。方法ＩＩ：３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＧＴＰ、０．５ｍＭ；３ ′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＡＴＰ、０．５ｍＭ；３′−アミノ−２ ′，３′−ジデオキシ−ＴＴＰ、０．５ｍＭ。反応物を３７℃にて５分間培養した。反応をホルムアミド／ＥＤＴＡの添加により停止させた。ＤＮＡ配列決定法ＩＩＩ（第３図）エキソヌクレアーゼ欠失Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、１種のｄＮＴＰが低濃度（たとえば０．１〜１μＭ）であると共に他の３種のｄＮＴＰが高濃度（１００μＭ）である反応にてＤＮＡ配列情報をもたらしうる（第３図）。ＤＮＡ配列決定パターンは、この方法により産生される配列決定産生物が低濃度のｄＮＴＰを必要とする１つ前の位置で停止する以外は、ヌクレオチド類似体との配列決定反応と同様に得られる。試料実験条件２５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、６０ｍＭのＮａＯＡｃ、１ｍＭのジチオスレイトール、１００μＭのｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、０．１μＭのｄＡＴＰ（より長いＤＮＡ産生物につき１μＭのｄＡＴＰ）、０．２ｍｇ／ｍＬの牛血清アルブミン、７．５ｎＭの５′［Ｐ³²］標識プライマーテンプレート（３′−プライマー末端の濃度として現す）、３０ｎＭのエキソヌクレアーゼ欠失Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、６ｍＭのＭｇ（ＯＡｃ）₂。第３図に示した反応は０．１μＭのｄＡＴＰを含有し、これを３０℃にて１分間培養した。多量の配列情報を得るための条件を最適化させなかったが、低濃度ｄＮＴＰが１μＭである反応は１００塩基よりも高い配列情報を与える。ＤＮＡ配列決定につき有利な性質を有する新規なＴ４ＤＮＡポリメラーゼの分離本発明のこの面における第１工程は、ＤＮＡ複製の或る面に欠陥を有する突然変異（突然変異体）ＤＮＡポリメラーゼを持ったＴ４株を同定することである。下記するアミノ酸置換を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼを持ったＴ４株を選択したが、遺伝選択手法は欠陥ＤＮＡ複製能力を有する任意の突然変異ＤＮＡポリメラーゼを使用しうるので、これら突然変異種のみに限定されない。ＤＮＡ複製の或る面で部分的に欠陥を有する突然変異（突然変異体）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼはイー・コリｏｐｔＡ１宿主ではＤＮＡを複製することができない。アミノ酸置換Ｗ２１３Ｓ、１４１７Ｖ、Ａ７３７ＶもしくはＡ７７７Ｖを有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼを持ったＴ４株はイー・コリｏｐｔＡ１宿主にてＤＮＡを複製することができない。これら突然変異種を得るため、次の突然変異を用いた：Ｗ２１３Ｓについては位置６３７におけるＧヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換し；１４１７Ｖについては位置１２４９におけるＡヌクレオチドをＧヌクレオチドで置換し；Ａ７３７Ｖについては位置２２０９におけるＣヌクレオチドをＴヌクレオチドで置換し；さらにＡ７７７Ｖについては位置２３２９におけるＣヌクレオチドをＴヌクレオチドで置換した。公知のように、他のヌクレオチド置換も同じアミノ酸変化をもたらしうる。第２工程は、たとえＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ複製能力を減少させると共にイー・コリｏｐｔＡ１宿主におけるＤＮＡの複製を防止するアミノ酸置換を保持するとしても、イー・コリｏｐｔＡ１宿主にてＤＮＡを複製しうるようなＴ４株を選択することである。自然突然変異または第一アミノ酸置換により生じたＤＮＡ複製欠陥を修正もしくは補いうる新たなアミノ酸置換をコードする突然変異処理のいずれかによって、第２のＤＮＡポリメラーゼ突然変異（または複数突然変異）を獲得したＴ４株はイー・コリｏｐｔＡ１宿主にてＤＮＡを複製することができ、ファージ後代を生産することができる。このように同定されたＤＮＡポリメラーゼは少なくとも２つのアミノ酸置換、すなわち出発アミノ酸置換およびＤＮＡ複製活性を回復する１つもしくはそれ以上の新たなアミノ酸置換を有する。この遺伝選択手法は極めて鋭敏である。出発アミノ酸置換およびＤＮＡ複製活性を回復するアミノ酸置換を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼを持ったファージを１０⁸〜１０⁹ファージの集団から選択することができる。第３工程は、ＤＮＡ複製回復突然変異を確認することである。この工程は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子にて新たな突然変異を見出だすべく標準的配列決定法を用いる。新たな突然変異が確認された後、この突然変異をファージ中へ或いはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ発現ベクター中へ標準法により導入することがでる。出発ＤＮＡ複製欠陥ＤＮＡポリメラーゼとは異なり、修正もしくは補償アミノ酸置換を有するＤＮＡポリメラーゼは優秀なＤＮＡ複製活性を有する。上記遺伝選択手法を用いて見出だされたアミノ酸置換の試料は限定はしないが次のものを包含する：Ｉ５０Ｌ、Ｇ８２Ｄ、Ｇ２５５ＳおよびＥ７４３Ｋ。これら突然変異種を得るため、次の突然変異を用いた：Ｉ５０Ｌについては位置１４８におけるＡヌクレオチドをＣヌクレオチドで置換し；Ｇ８２Ｄについては位置２４４におけるＧヌクレオチドをＡヌクレオチドで置換し；Ｇ２５５Ｓについては位置７６３におけるＧヌクレオチドをＡヌクレオチドで置換し；さらにＥ７４３Ｋについては位置２２２７におけるＧヌクレオチドをＡヌクレオチドで置換する。公知のように、他のヌクレオチド置換も同じアミノ酸変化を与えることができる。増大したＤＮＡ複製活性を付与するアミノ酸置換を持った突然変異（突然変異体、改変）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定につき有利な新しい性質を有する。１つの頻繁なＤＮＡ配列決定問題は、配列決定反応に使用するＤＮＡポリメラーゼが幾つかのテンプレート部位にて停止もしくは解離することである。連鎖延長におけるこの尚早な停止の結果として、配列決定用産生物が生産され、これらは読み終りヌクレオチドにより停止しない。他の問題は、ヌクレオチドおよび読み終りヌクレオチドのＤＮＡポリメラーゼ組込みがテンプレート配列により影響を受けて配列決定用産生物の不均等な分配をもたらすことである。向上したＤＮＡ複製活性を有する新規なＤＮＡポリメラーゼはこれら問題を解決することができる。Ｇ８２Ｄ−Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４ｍｅｌ６２ＤＮＡポリメラーゼとしても知られる）をプライマー延長分析で試験し、この新規なＤＮＡポリメラーゼは野生型Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにつき問題のあるプライマを延長させることが判明した。Ｇ８２Ｄ−Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ合成の例を第４図に示す。第４図は、ＤＮＡテンプレート領域（失歩領域−塩基がテンプレートストランドでＸにより示されるように喪失する）をコピーする３種のＴ４ポリメラーゼの使用を示している。野生型Ｔ４ポリメラーゼは、極めて軽いバンドで示されるように、Ｘに対向するヌクレオチドを組込むのに困難性を示す。３′−エキソヌクレアーゼ欠失Ｔ４ポリメラーゼ突然変異体、すなわちＥＸＯ−１７はＸに対向するヌクレオチドを組み込むことができ（Ｘにて強力なバンドに注目）、領域を越えた合成を継続する。Ｔ４ｍｅｌ６２ポリメラーゼは、見掛けにて正常（野生型）レベルの３′−エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を有する突然変異酵素である（これはインビボにて表現型突然変異体を運ぶ）。しかしながら、これはＸに対向してヌクレオチドを組込みうると共にＸを越えて合成を継続することができる。最も興味あることに、Ｘを越える「一次停止」バンドの不存在はｍｅｌ６２ポリメラーゼがＥＸＯ^-１７または野生型ポリメラーゼのいずれよりも堅固にプライマーテンプレートＤＮＡに結合し続けることを示唆する。すなわち、この酵素はテンプレートおよび基質の障害を解消して長範囲のＤＮＡを合成することができる。優秀なＤＮＡ複製活性を付与する１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を３′ →５′エキソヌクレアーゼ活性を顕著に減少させる１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換と組合せて、ＤＮＡ配列決定用ポリメラーゼにつき有利である幾つかの性質を持った複数改変の新規なＴ４ＤＮＡポリメラーゼを作成しうると思われる。たとえばバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼのようなポリメラーゼをその補助蛋白質と一緒に用いて、配列決定すべきＤＮＡ鎖からのポリメラーゼの解離速度を減少させることにより、ポリメラーゼの処理性を向上させうることが知られている。Ｔ４ポリメラーゼの場合、その補助蛋白質は限定はしないが次のＴ４遺伝子産生物を包含する：遺伝産生物３２、４１、４５および４４／６２複合体。イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩの場合、補助蛋白質は次のものである：β−蛋白質；γ−蛋白複合体［ここでγ−複合体はγ、δ、δ′、χ 、Ψ；およびＳＳＢ（一本鎖結合性蛋白質）で構成される］（β−蛋白質および γ−複合体はイー・コリｐｏｌＩＩＩ補助蛋白質であることに注目）。これら補助蛋白質の使用は、ＤＮＡを配列決定する際のポリメラーゼの効率を向上させる。以上、本発明の基本的に新規な特徴につき詳細に説明したが、本発明の思想および範囲を逸脱することなく、その構成に種々の改変をなしうることが当業者には了解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者グッドマン，マイロン，エフ. アメリカ合衆国，カリフォルニア州 91011，ラカナダ，アルミナーアヴェニュー 4719 (72)発明者リハークランヅ，リンダ，ジェイ. カナダ国，アルバータ州ティ６イー２エヌ９，エドモントン，エイティセブンスアヴェニュー 10044

Claims

【特許請求の範囲】１．３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を持たないことを特徴とする突然変位系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。２．前記ポリメラーゼが突然変位Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、突然変異Ｔ２ＤＮＡポリメラーゼおよび突然変異Ｔ６ＤＮＡポリメラーゼよりなる群から選択される請求の範囲第１項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。３．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置５０に存在するイソロイシンをロイシンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。４．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置８２に存在するグルタミン酸をアスパラギン酸で置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。５．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置２１３に存在するトリプトファンをセリンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。６．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置２５５に存在するグルタミン酸をセリンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。７．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置４１７に存在するイソロシンをバリンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。８．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置７３７に存在するアラニンをバリンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。９．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置７４３に存在するアラニンをバリンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１０．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置１１２に存在するアスパラギン酸をアラニンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１１．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置１１４に存在するイソロシンをロイシンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１２．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置２１９に存在するアスパラギン酸をアラニンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１３．前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼが、コドン位置３２４に存在するアスパラギン酸をアラニンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１４．前記突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩが、コドン位置１５６に存在するアスパラギン酸をアラニンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１５．前記突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩが、コドン位置１５８に存在するグルタミン酸をアラニンで置換してなることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の突然変異系統群ＢＤＮＡポリメラーゼ。１６．ポリメラーゼを、ｄＡＴＰとｄＧＴＰとｄＣＴＰとｄＴＴＰとｄｄＡＴＰおよび３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＡＴＰよりなる群から選択される第２読み終りヌクレオチドとｄｄＧＴＰおよび３′−アミノ−２′，３′− ジデオキシ−ＧＴＰよりなる群から選択される第２読み終りヌクレオチドとａｒａＣＴＰおよび３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＣＴＰよりなる群から選択される第３読み終りヌクレオチドとａｒａＵＴＰおよび３′−アミノ−２′ ，３′−ジデオキシ−ＴＴＰよりなる群から選択される第４読み終りヌクレオチドとの存在下に、配列決定すべき活性化されたＤＮＡ鎖と接触させ、前記接触を配列決定情報を得るのに充分な時間にわたりポリメラーゼ活性を維持する反応条件下で進行させることを特徴とするＤＮＡの配列決定法。１７．前記第１読み終りヌクレオチドがｄｄＡＴＰであり、前記第２読み終りヌクレオチドがｄｄＧＴＰであり、前記第３読み終りヌクレオチドがａｒａＣＴＰであり、前記第４読み終りヌクレオチドがａｒａＵＴＰである請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．ポリメラーゼが突然変異Ｔ４ポリメラーゼ、突然変位イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、突然変位Ｔ２ポリメラーゼＩＩおよび突然変異Ｔ６ポリメラーゼよりなる群から選択される請求の範囲第１７項に記載の方法。１９．ポリメラーゼが突然変異Ｔ４ポリメラーゼである請求の範囲第１８項に記載の方法。２０．前記突然変異Ｔ４ポリメラーゼとの複合体を形成することにより前記突然変位Ｔ４ポリメラーゼの処理性を向上させる少なくとも１種の補助蛋白質をさらに含む請求の範囲第１９項に記載の方法。２１．補助蛋白質がＴ４遺伝子産生物３２、４１、４５および４４／６２複合体よりなる群から選択される請求の範囲第２０項に記載の方法。２２．突然変異ポリメラーゼが突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩである請求の範囲第１８項に記載の方法。２３．突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体を形成することにより前記突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩの処理性を向上させる少なくとも１種の補助蛋白質をさらに含む請求の範囲第２２項に記載の方法。２４．前記補助蛋白質がβ−蛋白とγ−複合体とＳＳＢ蛋白との組合せ物である請求の範囲第２３項に記載の方法。２５．前記第１読み終りヌクレオチドが３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＡＴＰであり、前記第２読み終りヌクレオチドが３′−アミノ−２′，３′ −ジデオキシ−ＧＴＰであり、前記第３読み終りヌクレオチドが３′−アミノ− ２′，３′−ジデオキシ−ＣＴＰであり、前記第４読み終りヌクレオチドが３′ −アミノ−２′，３′−ジデオキシ−ＴＴＰである請求の範囲第１６項に記載の方法。２６．ポリメラーゼがＴ４ポリメラーゼ、突然変異Ｔ４ポリメラーゼ、イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、突然変位イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩ、Ｔ２ポリメラーゼ、突然変異Ｔ２ポリメラーゼ、Ｔ６ポリメラーゼおよび突然変異Ｔ６ポリメラーゼよりなる群から選択される請求の範囲第２５項に記載の方法。２７．ポリメラーゼがＴ４ポリメラーゼおよび突然変異Ｔ４ポリメラーゼよりなる群から選択される請求の範囲第２６項に記載の方法。２８．Ｔ４ポリメラーゼもしくは突然変位Ｔ４ポリメラーゼとの複合体を形成することにより前記Ｔ４ポリメラーゼもしくは突然変位Ｔ４ポリメラーゼの処理性を向上させる少なくとも１種の補助蛋白質をさらに含む請求の範囲第２７項に記載の方法。２９．補助蛋白質がＴ４遺伝子産生物３２、４１、４５および４４／６２複合体よりなる群から選択される請求の範囲第２８項に記載の方法。３０．突然変異ポリメラーゼがイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩおよび突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩである請求の範囲第２６項に記載の方法。３１．イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩもしくは突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体を形成することにより前記イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩＩもしくは突然変異イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩの処理性を向上させる少なくとも１種の補助蛋白質をさらに含む請求の範囲第３０項に記載の方法。３２．前記補助蛋白質がβ−蛋白とγ−複合体とＳＳＢ蛋白との組合せ物である請求の範囲第３１項に記載の方法。３３．突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを標準ヌクレオチドの存在下に配列決定すべき活性化されたＤＮＡ鎖と接触させ、一方の標準ヌクレオチドの濃度を他方の標準ヌクレオチドの濃度と対比して極めて低くし；前記接触を配列決定情報を得るのに充分な時間にわたりポリメラーゼ活性を維持する反応条件下で進行させることを特徴とするＤＮＡの配列決定法。３４．ＤＮＡ複製の或る面に欠陥を持った突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを有するＴ４株を同定し；前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのさらに改変された形態をイー・コリｏｐｔＡ１宿主での選択により分離し：ＤＮＡ複製における前記欠陥を修正もしくは補償する少なくとも１つの追加突然変異を持った突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを含有するＴ４株を分離し；前記突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼにおける追加の修正／補償突然変異を確認し；前記確認された修正／補償突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼをＴ４ファージもしくはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ発現ベクターに導入することを特徴とする突然変異Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの同定および分離方法。