KR960704067A - Dna 서열분석 효소 - Google Patents

Dna 서열분석 효소

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KR960704067A
KR960704067A KR1019960700551A KR19960700551A KR960704067A KR 960704067 A KR960704067 A KR 960704067A KR 1019960700551 A KR1019960700551 A KR 1019960700551A KR 19960700551 A KR19960700551 A KR 19960700551A KR 960704067 A KR960704067 A KR 960704067A
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dna polymerase
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dna
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KR1019960700551A
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미론 에프. 구드만
린다 제이. 레하-크란쯔
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데니스 에프, 도우히터.
유니버시티 오브 서던 캘리포니아
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더 거번너즈 오브 더 유니버시티 오브 알베르타
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Abstract

본 발명은 3'→7'엑소뉴클레아제 활성이 없는 변종 B족 DNA 중합효소를 제공한다. 이들 변종 중합 효소는 DNA 서열분석(sequencing) 중합효소로서 유용성을 가진다. B족 DNA 중합효소 및 사슬-종결 뉴클레오티드를 이용한 DNA 시퀀싱 방법이 개발되었으며 본 발명 이전에는 사용되지 않았던 것이다.
본 명세서에 개시된 방법은 이제까지 DNA 서열분석에 유용성이 있는 것으로 알려지지 않았던 T4 DNA 중합효소_또는 E. coli CNA 중합효소 Ⅱ의 변종 또는 야생형과 같은 B족 DNA 중합효소를 새로운 조합의 디옥시 뉴클레오티드 및 사슬-종결 뉴클레오티드와 함께 사용하는 것에 관한 것이다.

Description

DNA 서열분석 효소
본 내용은 요부공개 건이므로 전문내용을 수록하지 않았음
제1도는 본 발명의 실시에 유용한 표준 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체의 구조를 도식화한 것이다.
제2도는 변종 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ 및 T4 DNA 중합효소를 사용한 DNA 시퀀싱(sequen-cing)겔을 나타낸 것이다.
제3도는 다른 표준 뉴클레오티드에 비해 dATP를 매우 낮은 농도로 사용한 DNA 시퀀싱 겔을 나타낸 것이다.
제4도는 야생형 및 돌연변이종 T4 DNA 중합효소에 의한 주형의 염기부재(abasic) 자리(X)를 통과하는 프라이머 연장방법(primer extension)을 나타낸 것이다.

Claims (35)

  1. 3'→5'엑소뉴클레아제 활성을 가지지 않는 것을 특징으로 하는 변종 B족(family)DNA 중합효소.
  2. 제1항에 있어서, 상기 중합효소가 변종 T4 DNA 중합효소, 변종 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ, 변종 T2 DNA 중합효소 및 변종 T6 DNA 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  3. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 50에 있는 이소루이신이루이신으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  4. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 82에 있는 글루타민산이 아스파르트산으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  5. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 213에 있는 트립토판이 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  6. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 255에 있는 글루타민산이 세린으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  7. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 417에 있는 이소루이신이 발린으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  8. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 737에 있는 알라닌이 발린으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  9. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 743에 있는 알라닌이 발린으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  10. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 112에 있는 아스파르트산이 알라닌 으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  11. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 114에 있는 이소루이신이 루이신으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  12. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 219에 있는 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  13. 제2항에 있어서, 상기 변종 T4 DNA 중합효소가 코돈 위치 324에 있는 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  14. 제2항에 있어서, 상기 변종 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ가 코돈 위치 156에 있는 아스파르트산이 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  15. 제2항에 있어서, 상기 변종 E. coli DHA 중합효소 Ⅱ가 코돈 위치 158에 있는 클루타민산이 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 하는 변종 B족 DNA 중합효소.
  16. dATP, dGTP, dCTP, dTTP 그리고 ddATP 및 3'-아미노-2', 3'-디디옥시ATP로 이루어진 군으로부터 선택된 첫번째 사슬-종결 뉴클레오티드, ddGTP 및 3'-아미노-2', 3'-디디옥시GTP로 이루어진 군으로부터 선택된 두번째 사슬-종결 뉴클레오티드, araCTP 및 3'-아미노-2', 3'-디디옥시 CTP로이루어진 군으로부터 선택된 세번째 사슬-종결 뉴클레오티드 그리고 araUTP 및 3'-아미노-2'. 3'-디디옥시 TTP로 이루어진 군으로부터 선택된 네번째 사슬-종결 뉴클레오티드의 존재하에서 시퀀스하고자 하는 프라임된 DNA가닥을 중합효소와 접촉시키고; 서열분석 정보를 얻기에 충분한 시간동안 중합효소 활성을 유지하는 반응조건하에서 상기 접촉을 지속시키는; 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 시퀀싱 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 첫번째 사슬-종결 뉴클레오티드가 ddATP이고, 상기 두번째 사슬-종결 뉴클레오티드가 ddGTP이고, 상기 세번째 사슬-종결 뉴클레오티드가 araCTP이고, 상기 네번재 사슬-종결 뉴클레오티드가 ara- UTP인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 중합효소가 변종 T4 중합효소. 변종 E coli DNA 중합효소 Ⅱ 변종 T2 중합효소 및 변종 T6 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 중합효소가 변종 T4 중합효소인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 변종 T4 중합효소와 복합체를 형성하여 상기 변종 T4 중합효소의 추진성(Processivity)를 증가시키는 적어도 하나의 부속 단백질(accessory Protein)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 부속 단백질이 T4 유전자 산물 32, 41, 45 및 44/62 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 변종 중합효소가 변종 E coli DNA 중합효소 Ⅱ인 것을 특징으로 하는방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 변종 E. coli DNA 중합효소와 복합체를 형성하여 상기 변종 DNA 중합효소로의 추진성을 증가시키는 적어도 하나의 부속 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 부속 단백질이 β단백질, γ복합체, 및 SSB 단백질의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제16항에 있어서, 상기 첫번째 사슬-종결 뉴클레오티드가 3'-아미노-2', 3'-디디옥시ATP이고, 상기 두번째 사슬-종결 뉴클레오티드가 3'-아미노-2', 3'-디디옥시GTP이고. 상기 세번재 사슬-종결 뉴클레오티드가 3'-아미노-2', 3'-디디옥시CTP이고, 상기 네번째 사슬-종결 뉴클레오티드가 3'-아미노-2', 3'-디디옥시TTP인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 중합효소가 T4 중합효소, 변종 T4 중합효소, E. coli DNA 중합효소 Ⅱ, 변종 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ T2 중합효소, 변종 T2 중합효소, 변종 T6 중합효소 및 변종 T6 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 중합효소가 T4 중합효소 및 변종 T4 중합효소로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, T4 중합효소 또는 변종 T4 중합효소와 복합체를 형성하여 상기 T4 중합효소 또는 변종 T4 중합효소의 추진성을 증가시키는 적어도 하나의 부속 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 부속 단백질이 T4 유전자 산물 32, 41, 45 및 44/62 복합체로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 상기 변종 중합효소가 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ 및 E coli DNA 중합효소 Ⅱ인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ 또는 변종 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ와 복합체를 형성하여 상기 E. coli DNA 중합효소 Ⅱ 및 변종 E coli DNA 중합효소 Ⅱ의 추진성을 증가시키는 적어도 하나의 부속 단백질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 부속 단백질 β단백질, γ복합체 및 SSB 단백질의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 표준 뉴클레오티드 중 하나의 농도가 다른 표준 뉴클레오티드의 농도에 비하여 매우 낮은 조건의 표준 뉴클레오티드의 존재하에서 시퀀스되고자 하는 프라임된 DNA 가닥과 변종 T4 DNA 중합효소를 접촉시키고; 서열 분석 정보를 얻기에 충분한 시간 동안 중합효소 활성을 유지시키는 반응 조건에서 상기 접촉을 지속시키는; 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 DNA 시퀀싱 방법.
  34. DNA 복제의 몇몇 양상에서 결함이 있는 변종의 T4 DNA 중합효소를 가지는 T4 균주를 동정하고, E. coli optA1 숙주내에서의 선택에 의해서 상기 변종 T4 DNA 중합효소의 변형된 형태를 더 분리하고; DNA 복제에서의 상기 결함을 수정하거나 보상하는 적어도 하나 이상의 부가적인 돌연변이를 가지는 변종 T4 DNA 중합효소를 포함하는 T4 균주를 분리하고; 상기 변종 T4 DNA 중합효소내의 부가적인 수정/보상 돌연변이(들)를 동정하고; 그리고 상기 동정된 수정/보상 돌연변이(들) T4 DNA 중합효소를 T4 파아지 또는 T4 DNA 중합효소 발현벡터로 도입시키는; 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 변종 T4 DNA 중합효소를 동정하고 분리하는 방법.
  35. ※ 참고사항 : 최초출원 내용에 의하여 공개하는 것임.
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