CZ30696A3 - Dna sequencing enzymes - Google Patents

Dna sequencing enzymes Download PDF

Info

Publication number
CZ30696A3
CZ30696A3 CZ96306A CZ30696A CZ30696A3 CZ 30696 A3 CZ30696 A3 CZ 30696A3 CZ 96306 A CZ96306 A CZ 96306A CZ 30696 A CZ30696 A CZ 30696A CZ 30696 A3 CZ30696 A3 CZ 30696A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna polymerase
variant
dna
glu
ile
Prior art date
Application number
CZ96306A
Other languages
English (en)
Inventor
Myron Goodman
Linda J Reha-Krantz
Original Assignee
Univ Southern California
Univ Alberta
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Southern California, Univ Alberta filed Critical Univ Southern California
Publication of CZ30696A3 publication Critical patent/CZ30696A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Oblast techniky
Předložený vynále metody vyvinuté F.Sang
A.R. (1977) Proč.Nati.Acad.Sci.USA 74, 5463-5467) jakož i nových enzymů, které mohou být použit v sekvenování DNA. Sangerova sekvenační metoda na založena na in vitro DNA syntéznlch reakcích za přítomnosti primovaného DNA templátu,
2'-deoxyribonukleosidtrifosfátů (dNTP, viz obr.l) a 2',3'-dideoxyribonukleosidtrifosfátú (ddNTP, obr.l). Posledně uvedený, je-li inkorporován DNA polymerásou do polynukleotidového řetězce,ukončuje další prodloužení řetězce. DNA produkty jsou tak seriemi polynukleotidových řetězců komplementárních k templátu a ukončených specifickými dideoxynukleotidy. DNA sekvenační produkty mohou být rozděleny podle velikosti a typu produktů poskytnutím DNA sekvencí.
Dosavadní stav techniky
V zásadě, DNA polymerásy z různých organismů a různých řetězec ukončujících nukleotidů, by mohly být vhodné k sekvenování DNA. Prakticky bylo nalezeno málo DNA-polymerás a řetěz ukončujících nukleotidů jako vhodných pro tento účel. Jako příklad DNA sekvenující polymerásy, bude uveden vývoj bakteriofágové T7 DNA polymerásy, Sequenace™ (Tábor S a Richardson C.C.(1990) J.Biol.Chem.265, 8322-8328). Za účelem získání jednoznačné DNA sekvence je nezbytné, aby hlavní sekvenační produkty končily dideoxynukleotidem a aby všechny sekvenační produkty byly představeny stejně. Dvě fág T7 DNA polymerasové aktivity degradují DNA sekvenační produkty a tak tyto aktivity musí být odstraněny za účelem prevence degradace dideoxynukleotidem zakončených sekvenačních produktů. Jedna aktivita, 3' ->5' exonukleasová aktivita, byla odstraněna konstrukcí exonukleasové deficientní varianty T7 DNA polymerasy. T7 DNA polymerasa také má pyrofosfolytickou aktivitu, která degraduje sekvenační produkty. Pyrofosfatása byla přidána pro degradaci pyrofosfátů produkovaných v DNA sekvenačních reakcích; bez pyrofosfátů není pyrofosforolýzy. Dalším přečištěním sekvenačních reakcí bylo použití Mn2* místo Mg2+, které vede k mnohem jednotnější distribuci reakčních produktů. I když tento stručný popis převodu T7 DNA polymerasy na sekvenující polymerasu je zjednodušen, přehled ilustruje hledisko, že modifikace přírodní DNA polymerasy jakož i úprava reakčních podmínek jsou vyžadovány za účelem získání vysoké kvality DNA sekvenční informace za použití řetězec-terminující sekvenační metody.
Optimálních DNA sekvenujících podmínek za použití řetězec terminující metody ještě nebylo dosaženo. Nejasná sekvenční informace je ještě pozorována a tato znemožňuje stanovení DNA sekvence obou DNA řetězců. Také použití Mn2* místo Mg2+ zvyšuje množství DNA templátu vyžadované pro sekvenační reakce. Mělo by proto být výhodné vyvinout nové metody, které by mohly zlepšit nebo usnadnit existenci sekvenačních postupů.
Standardní typ T4 DNA polymerasového gemu byl klonován a proteinový produkt exprimován (Lin T.-C., Rush J.R., Spicer E.K. a Konigsberg W.H (1987) Proč.Nati.Acad.Sci. USA 84, 7000-7004; US patent 4935361, Lin a spol.) a E.coli DNA polymerasa II byla klonována a exprimována (Boner C.A., Hays S., McEntee K. a Goodman M.F. (1990) Proč.Nat1.Acad.Sci. USA 87, 7663-7667). Standardní oligonukleotid-řízené mutagenezní techniky byly použity pro konstrukci nových forem T4 DNA polymerasy a E.coli DNA polymerasy II. Tyto prostředky existují pro ekonomickou přípravu velkých množství standardního typu a variant T4 DNA polymerasy a E.coli DNA polymerasy II.
Jiným aspektem vynálezu je použití genetické analýzy pro identifikaci DNA polymerás s vlastnostmi vhodnými pro DNA sekvenování. T4 DNA polymerasa je jednou z nejintenzivněji geneticky charakterizovaných DNA polymerás (Reha-Krantz L.J.(1993) In Molecular Biology of Bacteriophage T4, vyd.Karam J., American Association for Microbiology, v tisku); tak některé mutantní DNA polymerasy již identifikované mohou mít vlastnosti vhodné pro DNA sekvenování a nové mutanty mohou být izolovány přímo. Způsob izolace nových T4 DNA polymerás se vhodnými DNA sekvenujíčími vlastnostmi by mohl mít další využit í.
Podstata vynálezu
V souladu s aspektem vynálezu jsou poskytnuty nové enzymy, které mohou být použity jako DNA sekvenující polymerasy. Tyto enzymy vznikají z genetických mutací skupiny B DNA polymerás. Tyto mutace eliminují 3' -> 5' exonukleasové aktivity této nové skupiny DNA polymerás.
V souladu s dalším aspektem vynálezu jsou poskytnuty metody, které umožňují, aby fágová T4 DNA polymerasa a E.coli DNA polymerasa II byly použity jako DNA sekvenující polymerasy. DNA polymerasové modifikace, které konvertují fágovou T4 DNA polymerasu a E.coli DNA polymerasu II na DNA sekvenující polymerasy mohou být také použity k podobné modifikaci DNA polymerás, majících proteinovou sekvenční homologii s těmito dvěma polymerasami. DNA polymerasy sprotein sekvenčními podobnostmi k T4 DNA polymerase a E.coli DNA polymerase II zahrnují, ale nejsou tak omezeny, skupinu DNA polymeras, která je nazvána skupina B DNA polymeras (Braithwaite D.K. a Ito J. (1993) Nucl.Acids Res. 21,----------787-802). Zvláště relevantní jsou DNA polymerasy z fágů T2 a T6, které mají intenzivní sekvenční homologii k T4 DNA polymerase. Jiným rozšířením metod zde popsaných je, že DNA polymerasy s funkčními podobnostmi k T4 DNA polymerase a E.coli DNA polymerase II mohou být také použity pro produkci DNA sekvenční informace s řetěz-terminujícími nukleotidy a metodami popsanými dále.
V souladu s dalším aspektem tohoto vynálezu je poskytnuta metoda identifikace DNA polymerasových modifikací, majících jednu nebo více specifických aminokyselinových substitucí v polymerasové proteinové sekvenci, která zlepší danou DNA polymerásu pokud jde o DNA sekvenačni aplikace.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr.l představuje strukturu standardních nukleotidů a nukleotidových analogů použitelných v praktickém provedení vynálezu.
Obr.2 představuje DNA sekvenačni gely, které vznikly z použití varianty E.coli DNA polymerasy II a T4 DNA polymerasy.
Obr.3 představuje DNA sekvenačni gel, ve kterém je dAIP použita ve velmi nízkých koncentracích ve srovnání s jinými standardními nukleotidy.
Obr.4 představuje příměrové prodloužení za templátovým abasickým místem (X) polymerasou standardního typu a mutant T4 DNA polymerasou.
Aspektu vynálezu, totiž identifikování modifikovaných DNA polymeras pro provádění DNA sekvenačních reakcí, je dosaženo navržením nové genetické selekční strategie, která identifikuje modifikované DNA polymerásy s vynikajícími DNA replikačními aktivitami. Nová genetická selekční strategie byla navržena u T4 DNA polymerásy.
T4 DNA polymerasa (SEQ ID NO: 3 a 4) a E.coli DNA polymerasa II (SEQ ID NO: 5 a 6), které dosud byly neschopné použiti jako sekvenační polymerásy, mohou být použity jako DNA sekvenující polymerásy v typu Sangerových reakcí, jsou-li použity nestandardní nebo nové kombinace řetězec terminujících nukleotidů. Navíc k tomuto objevu je zjištění, že inaktivace 3' -> 5' exonukleasové aktivity v T4 DNA polymerase a E.coli DNA polymerase II zlepšuje kvalitu získané DNA sekvenční informace. V dalším aspektu byly objeveny další polymerasové modifikace, které v kombinaci s jinými modifikacemi, které redukují 3' -> 5' exonukleasovou aktivitu, mají potenciál pro produkci vícenásobně modifikované DNA polymerásy ,s výhodnými DNA sekvenačními vlastnostmi. Díky rozsáhlé sekvenční homologii s T4 DNA polymerasou, DNA polymerásy jako jsou fágové T2 (SEQ ID NO:1 a 2) a T6 DNA polymerásy jsou zvláště vhodné v aplikaci metod podle vynálezu.
T4 DNA polymerasa a E.coli DNA polymerasa II mohou být použity jako účinné DNA sekvenující polymerásy, jestliže arabinonukleotidy (obr.l), araUTP a araCTP, se použijí místo standardních řetězec terminujících nukleotidů ddTTP a ddCTP. Standardní purinové dideoxynukleotidy (obr.l), ddATP a dd GTP, jsou účinné řetězec terminující nukleotidy pro T4 DNA polymerásu a E.coli DNA polymerásu II. DNA sekvenující reakce pro T4 DNA polymerásu a E.coli DNA polymerásu II se liší od standardních DNA sekvenačních reakcí použitím nové kombinace
řetězec terminujících nukleotidů. I když může být použit v zásadě jakýkoliv řetězec terminující nukleotid, liší še DNA polymerasa významně svojí schopností inkorporovat tyto nukleotidy do DNA řetězce. Pro T4 DNA polymerasu a E.coli DNA polymerasu II, nízká inkorporace ddTTP a dd CTP těmito enzymy bránila použití těchto standardních řetězec terminujících nukleotidů v sekvenačních protokolech. Objev, že alternativní řetězec terminující arabinonukleotidy, araCTP a araUTP, mohou být inkorporovány relativně účinně T4 DNA polymerasou a E.coli DNA polymarasou II, umožňuje aby tyto polymerasy byly použity jako sekvenující polymerasy. DNA sekvenační metoda, která používá reakce s novými kombinacemi řetěz terminujících nukleotidů - araCTP, araUTP, ddATP a ddGTP, je popsána dále v metodě I.
Dalším objevem je, že inaktivace nebo významná redukce 3’-> 5' aktivity T4 DNA polymerasy a E.coli DNA polymerasy II zvyšuje kvalitu DNA sekvenční informace získané použitím ímsekvenačních reakcí metody I. T4 DNA polymerasová 3' -> 5' exonukleasová aktivita může být významně snížena aminokyselinovou substitucí, zahrnující, aniž by tak byla omezena, jednu nebo více z následujících aminokyselinových substitucí v enzymu: D112A + E114A, D219A a D324A. Ve výše uvedené nomenklatuře, která je zde použita v popise, se pro aminokyseliny používá jedno písmeno. Čísla připojená k jednotlivým písmenům kódujícím aminokyseliny jsou čísla kodonů. Například D112A + E114A představuje alaninovou (A) substituci za aspartát (D) v kodonové poloze 112, D112A +
E114A označuje dvě aminokyselinové substituce v modifikované DNA polymerase. Pro dosažení těchto variant byly použity následující mutace: pro D112A A nukleotid v poloze 334 je nahrazen C nukleotidem, čímž se uskuteční změna D v i
aminokyselině na A v aminokyselině, jak je odborníkům v oboru
zřejmé jsou jiné nukleotidové změny schopny uskutečnění téže změny; u El 14,\ se nukleotid A v poloze 340 nahradí C nukleotidem, jak je známo, jiné nukleotidové změny mohou působit stejné aminokyselinovou změnu; u D219A A a C nukleotidy v poloze 655 a 656 jsou nahrazeny C a G nukleotidem, jak je známo jiné nukleotidové změny mohou působit stejnou změnu aminokyseliny; a pro D324A je A nukleotid v poloze 970 nahrazen C nukleotidem, jak je známo jiné nukleotidové změny mohou působit stejnou aminokyselinov ouzměnu. E.coli DNA polymerasová II 3’ -> 5' exonukleasová · aktivita může být významně redukována aminokyselinovou substitucí zahrnující, ale bez takového omezení, následující aminokyselinové substituce: D156A + E158A. Pro dosažení těchto variant byly použity následující mutace: u D156A je A nukleotid v poloze 467 nahrazen C nukleotidem, jak známo jiné nukleotidové změny mohou působit stejnou aminokyselinovou změnu; u E158A je A nukleotid v poloze 473 nahrazen C nukleotidem, jak známo jiné nukleotidové změny mohou b ýtpůsobit stejnou aminokyselinovou změnu. Konstrukce 3' -> 5' exonukleasových deficientních variant T4 DNA polymerasy a E.coli DNA polymerasy II je dosaženo standardními oligonukleotidovými mutagenezními postupy (například Kunkle T.A., Roberts J.D. a Zakour R.A. (1987) Method. Enz. 154,
367 -382).
Jiného aspektu vynálezu může být dosaženo použitím řetězec terminujících nukleotidů, které se nepoužívají ve standardních DNA sekvenujících reakcích. T4 DNA polymerasa a E.coli DNA polymerasa II mohou být také použity jako účinné DNA sekvenující polymerasy, jestliže se
3’amino-239,339-dideoxyribonukleotidy /3'NH2ŮNTP)(obr.1) použijí místo standardních ddNTP. Tato sekvenační metoda je zde popsána jako metoda II. Nemodifikovaná (standardní typ)
T4DNA polymerasa a 3' -> 5’ exonukleásové deficientní varianty mohou být použity v reakcích metody II; 31 -> 5' exonukleásové deficientní varianta E.coli DNA polymerasy II byla také úspěšně použita v reakcích metody II.
3' -> 5' exonukleásová deficientní forma T4 DNA polymerasy může být také použita pro produkci DNA sekvenční informace bez nukleotidových analogů, jestliže je koncentrace jednoho ze čtyř standardních dNTP příliš nízká. Například jsou-li koncentrace dGTP, dCTP a dTTP 100 μΜ a koncentrace dATP je 0,1 μΜ až IM potom jsou pozorovány sekvenační produkty, které terminují jednu polohu před tím než je dATP vyžadována pro inkorporaci. S paralelními reakcemi, každá s jednou dNTP přítomnou v nízké koncentraci a ostatními třemi dnTP přítomnými ve vysokých koncentracích, může být determinována DNA sekvence.Tato sekvenační metoda je zde označena jako metoda III.
Třetího objektu, a to identifikace varianty nebo modifikovaných DNA polymeras s novými vlastnostmi, které umožňují, že polymerasy mají větší sekvenační vlastnosti, bylo dosaženo navržením nové strategie pro výběr nových DNA polymeras. Nová strategie, typ genetické selekce, byla vyvinuta pro fág T4. Základní strategie začíná s fágovým T4 kmenem, který má jednu nebo více mutací v DNA polymerasovém genu, které vedou k variantní (mutant) DNA polymerase, která je částečně defektní v některém aspektu DNA replikace. Některé typy DNA polymerasových modifikací mohou redukovat schopnost DNA polymerasy replikovat účinně DNA. Například změny ve schopnosti DNA polymerasy vázat DNA templát nebo dNTP nebo schopnost DNA polymerasy k translokaci podél DNA templátu budou redukovat účinnost dNA replikace. U fága T4, mutanty DNA polymerasy se sníženou DNA replikační aktivitou mohou být snadněji identifikovány. Kmeny fága T4 s mutantníni DNA polymerasami, které jsou částečně defektní v DNA replikaci nemohou syntetizovat DNA, jestliže bakteriální hostitel použitý v infekci, obsahuje optAl mutaci. Jinými slovy, E.coli optAl hostitel omezuje růst T4 kmenů s mutantními DNA polymerasami defektními v DNA replikační aktivitě. Základem restrikce pozorované pro E.coli optAl kmen je, že jsou produkována zvýšená množství enzymu, který degraduje dGTP (Wurgler S.S. a Richardson C.C. (1990) Proč.Nati.Acad.Sci„ USA 87, 2740-2744). Tak fágové T4 kmeny s variantními DNA polymerasami s redukovanou DNA replikační aktivitou nemohou replikovat DNA a produkovat fágové potomstvo, jsou-li nukleotidové pooly, zejména dGTP, redukovány.
Pokud jde o vývoj genetické selekční strategie, byly stanoveny podmínky, které mohou být použity pro identifikaci DNA replikace defektních DNA polymerás jakož i pro omezení produkce potomstva z fágů s takovými defektními DNA polymerasami, totiž omezenou produkcí fágového potomstva v infekcích E.coli optAl bakteriálního hostitele. Tyto podmínky, popsané zde dále, umožňují selekci dalších modifikovaných (mutovaných) DNA polymerás s vynikající DNA replikační schopností. Jestliže jsou variantní DNA polymerasy s redukovanou DNA replikační aktivitou dále modifikovány, například jednou nebo více dalšími aminokyselinovými substitucemi, je možné, že další mutace/aminokyselinové substituce opravují nebo kompenzují počáteční defekt v DNA replikační aktivitě. Takové další modifikované DNA polymerasy budou nyní schopny replikovat DNA v E.coli optAl hostiteli a bude produkováno fágové potomstvo. Detekce fágového potomstva na E.coli optAl hostiteli v infekcích s fágem dříve omezeným v produkci potomstva na tomto hostiteli umožní selekci více mutantních DNA polymerás, které mají startovní mutaci (aminokyselinové substituce, které snižují DNA replikační aktivitu) plus jednu nebo více nových mutací, které kódují další aminokyselinové substituce, které ompravují nebo kompenzují startovní DNA replikační defekt. Nové opravené nebo kompenzované mutace (vgenetické terminologii nazývané také supresorové mutace) mohou být identifikovány sekvenací fágového DNA polymerasového genu za použití standardních postupů (McPheeters D.S., Christensen A., Young E.T., Stormo G. a Gold L. (1986) Nucleic Acid Res. 14, 5813-5826REha-Krantz L.J. (1988) J.Mol.Biol.202, 711-724). Nové mutace mohou být zavedeny do fág T4 DNA polymerasového genu nebo do T4 DNA polymerasových expresních vektorů pro další studie. Na rozdíl od startovních fágT4 DNA polymeras s redukovanou DNA replikační schopností, nové varianty DNA polymeras mají vynikající DNA replikační schopnost, protože tyto variantní DNA polymerasy byly vybrány na základě jejich schopnosti překonávat, kompenzovat nebo opravovat defekty ve variantní DNA polymerase s redukovanou DNAreplikační aktivitou.
Genetická strategie k identifikaci variantních DNA polymeras s vynikajícími DNA replikačními schopnostmi je vysoce senzitivní, protože může být vybrán jediný fág s výše uvedenými vlastnostmi z populace 108 až 109 fágů.
Navíc podle vynálezu mají variantní DNA polymerasy s vynikající DNA replikační aktivitou vlastnosti výhodné pro DNA sekvenující polymerasu, jako je zvětšený příměrový rozsah, který produkuje jednotnější distribuci sekvenačních produktů a zvýšenou DNA replikaci v templátových regionech, které mohou blokovat nebo bránit replikaci nemodifikovaných DNA polymeras. T4 DNA polymerasové varianty s vynikající DNA replikační schopností jsou určeny pro zlepšení kvality informace o DNA sekvenci produkované metodami I,II a III.
Genetická selekční strategie popsaná zde pro detekci různých DNA polymeras s vynikající DNA replikační schopností může být aplikována na DNA polymerasy jiných organismů, jestliže defektní DNA polymerasy mohou být identifikovány a jestliže varianty s opravnými nebo kompenzačními mutacemi mohou být vybrány.
Příklady provedení vynálezu
DNA sekvenační metoda I
T4 DNA polymerasa s významně redukovanou 3' -> 5' exonukleasovou aktivitou jako jsou variantní formy s bud D112A + E114A, D219A, nebo D324A aminokyselinovými substitucemi aE.coli DNA polymerasa II a významně redukovanou 3' -> 5’ exonukleasovou aktivitou, jako je variantní forma s D518A + E158A aminokyselinovými substitucemi, mohou být použity jako DNA sekvenační polymerasy s následující sadou řetězec terminujících nukleotidů: ddATP, ddGTP, araCTP a araUTP (obr.1).
Obe. 2 představuje fotografie tří DNA sekvenačních gelů. DNA sekvenační obrazce získané metodou I jsou na panelech A a B, dráhy 1-4 a panelu C. Panel A ukazuje DNA sekvenační reakce sexonukleásovou deficientní variantou E.coli DNA polymerasy II. Reakce s ddGTP je ve dráze 1, reakce s ddATP je ve dráze 2, reakce s araCTP je ve dráze 3 a reakce s araUTP je ve dráze 4. Panel B představuje DNA sekvenační reakce s exonukleasovou deficitní formou bakteriofágové T4 DNA polymerasy. Opět je reakce s ddGTP ve dráze 1, reakce s ddATP je ve dráze 2, reakce s araCTP je ve dráze 3 a reakce s araUTP je ve dráze 4. Reakce v panelech A a B mají Mg2* jako dvojmocný kovový kation. Sekvenační obrazce jsou také získány s Mn2* místo
Mg2 + . Reakce metody I s Mn2* s exonukleasovou deficientní formou E.coli DNA polymerasy II jsou uvedeny na levé straně panelu C, dráhy 1-4; reakce s exonukleasovou deficientní formou T4 DNA polymerasy jsou uvedeny na pravé straně panelu C, dráhy 1-4. Panel C, dráhy 1-4 obsahuje reakce s ddGTP (dráha 1), ddATP (dráha 2), araCTP(dráha 3) a araUTP(dráha 4).
DNA sekvenační metoda II
Standardní typ (nemodifikovaný) a 3' -> 5' deficientní formy T4 DNA polymerasy a 3' ->5' exonukleasově deficientní forma E.coli DNA polymerasy II mohou být použity jako DNA sekvenační polymerasy se 3'-amino-23'-dideoxyribonukleotidy (obr.l) jako řetězec terminujícími nukleotidy. Reakce metody II pro exonukleasovou deficientní formu E.coli DNA polymerasy II jsou uvedeny na obr.2, panel A,dráhy 5-7. Dráha pět ukazuje reakci se 3'-amino-2',3'-dideoxyGTP, dráha 6 ukazuje reakci se 3'-amino-23'-dideoxyATP; dráha 7 ukazuje reakci se 3'-amino-23'-dideoxyTTP. Reakce metody II pro exonukleasově deficientní formu T4 DNA polymerasy jsou uvedeny na panelu B, dráhy 5-7. Dráha 5,6 a 7 ukazuje reakce se
3'-amino-23'-dideoxyGTP, -ATP a -TTP.
Data demonstrují, že exonukleasově deficientní formy E.coli DNA polymerasy II a bakteriofágových T4 DNA polymeras mohou produkovat DNA sekvenční informaci za použití kombinace následujících řetězec terminujících nukleotidů: ddGTP nebo 31-amino-2',3'-dideoxyGTP; ddATP nebo 3'-amino-2’,3'dideoxyATP; araUTP nebo 3'-amino-23’-dideoxyTTP a araCTP. Vzhledem k dobrým sekvenačním obrazcům získaným se
3'-amino-2',31-dideoxy-GTP, -ATP a -TTP, je pravděpodobné, že
3'-amino-2',3'-dideoxyCTP mohou být také účinné řetězec terminující nukleotidy. Nebyl učiněn žádný pokus o optimalizaci podmínek metody I nebo II za účelem dosažení stejných intenzit pruhů nebo pro zvýšeni délky čitelné sekvence pro reakce uvedené na obr. 2. Přesto sekvenační metody mohou poskytovat sekvenční informaci pro alespoň 300 bází. Exonukleásová deficitní forma T4 DNA polymerasy. není važadována pro sekvenační reakce se 3' amino-2',3'-dideoxyribonukleos id-tri fosfáty.
Vzorkové pokusné podmínky pro metodu I a II (obr.2)
Značkovací reakce μΐ exonukleasová deficientní DNA polymerasa; 300-400 jednotek/ml pro T4 DNA polymerasu nebo pro E.coli DNA polymerasu II. Jedna jednotka T4 DNA polymerasy katalyzuje 10 nmol dTNP inkorporace do DNA ve 30 min při 30 °C. Jedna jednotka E.coli DNA polymerasy II katalyzuje inkorporaci 1 pmol dTMP do DNA v 1 min při 37 °C. I když se reakce typicky provádí při 37 °C, může být reakce provedena v teplotním rozmezí od asi 35 °C do asi 42 °C.
μΐ primer-M13 DNA komplex, 15 nM
15μ1 značkovací reakční roztok: 2 μΜ dGTP, dCTP, dTTPl μΜ [a32P]dATP; 50 mM Tris-HCl (pH 8,5); 5 mM MgCl2 nebo 6 mM MnCl2 pro E.coli DNA polymerasu II ; 5 mM MgCl2 nebo 0,5 mM MnCl2 pro T4 DNA polymerasu; 5 mM dithithreitol; 50 μΕ/πιΙ hovězí sérový albumin.
Reakční směsi byly inkubovány při 37 °C 5 min.
Primer může být také značen na 5'-konci nebo zahrnutím značeného nukleotidu do prodlužovací reakce a jinými
Prodlužovacl reakce μΐ reakční směsi (výše) .....
μΐ terminačního roztoku; 59 μΜ dGTP, dATP, dCTP a dTTP a jeden z terminačních analogů uvedených výše:
Metoda I: ddGTP, 1,6 mM; ddATP, 0,7 mM; araCTP, 0,5 mM; araUTP, 0,5 mM.
0,5 mM
Reakce byly inkubovány 5 min při 37 °C. Reakce byly ukončeny přídavkem formamidu/EDTA.
DNA sekvenační metoda III (obr.3)
Exonukleasově deficientní T4 DNA polymerasa může produkovat DNA sekvenční informaci v reakcích, kde je jeden dNTP v malé koncentraci (například 0,1 μΜ až 1 μΜ) a ostatní tři dNTP jsou ve vysokých koncentracích (100 μΜ)(obr.3). DNA sekvenační obrazce jsou produkovány jak se sekvenačními reakcemi s nukleotidovými analogy s tím rozdílem, že sekvenační produkty produkované touto metodou terminují jednu polohu před dNTP při vyžadovaných nízkých koncentracích.
Vzorkové pokusné podmínky:
mM Hepes (pH 7,5) mM NaOAc mM dithiothreitol
100 μΜ dGTP, dCTP a dTTP
ll t..
Λ·» 3^ * X?
> Τ' * «ss- -tr· » -“/fl -7)5 > ‘ ;r 9ÍŇ w **
{. -i* % * e
V
*“ - j - ‘ j ', Ή j- —
V, ( y r * ' <- < ♦* * *~ /*- *¥**>·· -*
-u. ·*
O »?t>'-fp.M dATP (ί μΜ dATP pro dělá i DNA produkty)
OTřTmgTinF hovězí sérový albumin - s. »
7,5 nM 5’[32P]značený primer-templát (vyjádřen jako koncentrace na 3’-primerovém konci) nM .exonukleásové deficientní T4 DNA polymerásy 6 mM Mg(OAc)2
Reakce uvedená na obr. 3 obsahuje 0,1 μΜ dATP a byla inkubována 1 min při 30 °C. Podmínky nebyly optimalizovány pro získání vysokých množství sekvenční informace; nicméně reakce ^veíkteřý.chTnízká koncentrace ’dNTP jé :1 μΜ poskytuje sekvenční ;^or^aW^ÍVéžl00 bází / ř- •psiwífrr'’* -_·=· „v.
^6»ί£μϊ:Γ
K/wfc,
Izolace nových T4 DNA polymeras s vlastnostmi vhodnými pro DNA sekvenování
První stupeň v tomto aspektu vynálezuje identifikovat T4 kmeny s variantními (mutantními) DNA polymerasami v některém aspektu DNA replikace. T4 kmeny s mutantní DNA polymerásou, které mají aminokyselinové substituce uvedené výše, byly vybrány, ale genetická selekční strategie není omezena na tyto mutanty protože může být použita jakákoliv mutantní DNA polymerasa s defktní DNA replikační schopností. Variantní (mutantní) T4 DNA polymerásy, které jsou částečně defektní v některém aspektu DNA replikace nemohou replikovat DNA v E.coli optAl hostitel i.
T4 kmeny s mutantními DNA polymerasami s aminokyselinovými substitucemi W213S, 1417V, A737A nebo A777V nemohou replikovat DNA v E.coli optAl hostiteli. Pro dosažení těchto variant byly použity následující mutace: pro W213S G nukleotid v poloze 637 je nahrazen C nukleotidem; pro 1417V a nukleotid v poloze 1249 je nahrazen G nukleotidem; pro A737V C
^•£+:'-.!· h. -·-<<» -,+^-i ^^^ν^-χΦ^Λ-ττιΛ-.ν^ ir-^^-^^'\'xř*+^^?^ci*-'A<>--ř.--:-r-.,--'‘Ť-,*':r.’-*í,^Js7.
ΐίί J&fefUĚÍ&Šfs&l··.®5fc f*
-—P/Skýt/íSTixí nukleotid v poloze 2209 je nahrazen .T ?nukleotidém;^ípV^^S7\L 9
C nukleotid v poloze 2329 je nahrazen T nukleotidem.’ Jak známo jiné nukleotidové náhrady mohou vyvolat stejné aminokyselinové změny.
Druhý stupeň je výběr T4 kmenů, které mohou replikovat DNÁ v E.coli optAl hostiteli i když si DNA polymerasa ještě udržuje aminokyselinovou substituci, která samotná redukuje schopnost replikace DNA a brání replikaci DNA v E.coli optAl hostiteli. T4 kmeny, které získaly druhou DNA polymerasovou
mutaci (nebó více mutací) V bud spontánní mutaci nebo.,.., ^.íí^^í·..;.
mmuta’genezním^pracóýáníin,'\kteřá,;koduje :novou aminokysel inovoúW»-& substituci, která opravuje nebo kompenzuje DNA replikační defekt produkovaný první aminokyselinovou substitucí, budou schopné replikovat DNA v E.coli optAl hostiteli a produkovat fágové potomstvo. DNA polymerasy takto identifikované mají alespoň dvě aminokyselinové substituce: startovací aminokyselinovou substituci a jednu nebo více aminokyselinových substitucí, které obnovují DNA replikační aktivitu. Tato genetická selekční strategie je vysoce citlivá. Fág s mutantní DNA polymerasou, obsahující startovací aminokyselinovou substituci a aminokyselinovou substituci(e), která obnovuje DNA replikační aktivitu, může být zvolen z populace 108 až 109 fágů.
Třetím stupněm je identifikace DNA replikaci obnovující mutace(í). Tento stupeň využívá standardní sekvenačni postupy pro nalezení nové mutace(í) v T4 DNA polymerasovém genu. Jakmile byla nová mutace identifikována(y), může být mutace zavedena do fága nebo do T4 DNA polymerasa expresních vektorů použitím standardních postupů. Na rozdíl od startovní, DNA replikačně defektní DNA polymerasy, DNA polymerasy s opravnými nebo kompenzačními aminokyselinovými substitucemi mají vynikající DNA replikační aktivitu. Vzorekaminokyselinových substitucí objevených použitím genetické selekční strategie popsané výše zahrnuje, ale není tak omezen: I50L, G82D, G255S a E743K. Pro dosažení těchto variant byly použity následující mutace: pro I50L A nukleotid v poloze 148 je nahrazen C nukleotidem; u G82D je G nukleotid v poloze 244 nahrazen A nukleotidem; u G255S je G nukleotid v poloze 763 nahrazen A nukleotidem; a u E743K je G nukleotid v poloze 2227 nahrazen A nukleotidem. Jak je známo jiné nukleotidové náhrady mohou způsobit stejné aminokyselinové změny.
Variantní (mutantní, módifikované)T4 DNA polymerásy s aminokyselinovámi substitucemi, které přispívají ke zvýšené DNA replikační aktivitě mají nové vlastnosti výhodné pro DNA sekvenování. Jedním z častých DNA sekvenačních problémů je, že DNA polymerásy použité v sekvenačních reakcích vynechávají nebo diasociují v některých templátových místech. Jako následek tohoto prematurovaného ukončení v prodloužení řetězce, jsou produkovány sekvenační produkty, které nejsou ukončeny nukleotidem, ukončujícím řetězec. Jiným problémem je, že DNA polymerasová inkorporace nukleotidů a řetězcové ukončení nukleotidů je ovlivněno templátovou sekvencí, která může vést k nestejné distribuci sekvenačních produktů. Nové DNA polymerásy se zvýšenou DNA replikační aktivitou mohou překonat tento problém. G82D-T4 DNA polymerasa (známá také jako T4 mel 62 DNA polymerasa) byla testována ve zkoušce prodloužení primeru a tato nová DNA polymerasa byla shledána jako prodlužující primery, které jsou problematické pro standardní typ T4 DNA polymerásy. Příklad G82D-T4 DNA polymerasové syntézy je uveden na obr. 4.
Obr.4 představuje použití tří T4 polymeras pro kopírování
DNA templátové léze (abazická léze - báze není přítomna v templátovém řetězci,označeno X). Standardní typ T4 polymerasy obtížně inkorporoval nukleotid proti X jak je znázorněno velmi slabými pásy. 3'-exonukleasově deficientní T4 polymerasový mutant, EXO_17, je schopen inkorporovat nukleotidy proti X (viz intenzivní pás při X) a syntéza pokračuje za léz.í.· T4 mel 62 polymerasa je mutantní enzym (převádí mutátorový fenotyp in vivo), který má zjevné normální (standardní typ) hladiny 3'-exonukleásových a polymerasových aktivit. Přesto je také schopen inkorporovat nukleotidy proti X a pokračovat v syntéze za X. Co je nejzajímavější je, že nepřítomnost pausing pásů za X potvrzuje, že mel 62 DNA polymerasa zůstává navázána' k · primerovému templátu DNA těsněji než bud EXO-17 nebo standardní polymerasy. Je tak možné, že tento enzym může být schopen překnat templátové a substrátové překážky při syntéze dlouhých řetězců DNA.
Předpokládá se, že bude možno kombinovat jednu nebo více aminokyselinových substitucí, které přinášejí vynikající DNA replikační aktivitu s jednou nebo více aminokyselinový misubstitucemi, které významně redukují 3' -> 5' exonukleasovou aktivitu pro vytvoření vícekrát modifikované nové T4 DNA polymerasy s některými vlastnostmi, které jsou výhodné pro DNA sekvenační polymerasy.
Je známo, že polymerasy jako bakteriofágová T7 DNA polymerasa, mohou být použity spolu se svými průvodními proteiny, čímž se zvyšuje účinnost polymerasy snížením rychlosti disociace polymerasy z DNA řetězce, který je sekvenován.
V případě T4 polymerasy, její průvodní proteiny zahrnují, ale nejsou tak omezeny, následující T4 genové produkty: genový produkt 32, 41, 45 a 44/62 komplex. V případě E.coli DNA polymerasy II, jsou průvodní proteiny následující: β-protein; gama proteinový komplex, kde gama komplex je složen z gama, 6, δ', , ; a SSB (jednořetězcový vazebný protein)(β protein a gama komplex jsou E.coli pol III průvodní proteiny). Použití těchto průvodních proteinů zvyšuje účinnost polymeras- v sekvenování DNA.
Byly uvedeny základní nové rysy vynálezu, ale je třeba chápat, že jsou možné různé změny, substituce a vynechání v jeho formě a uvedených podrobnostech, které mohou provést odborníci, aniž by byla překročena myšlenka vynálezu. Vynález je omezen pouze rozsahem následujících nároků.
Seznam sekvencí (1) obecná informace (i) Přihlašovatel
Reha-Krantz (ii) Název vynálezu: DNA (iii) Počet sekvencí:6 (iv) Korespondenční adresa:
Goodman, Myron F. Linda J.
sekvenuj ící enzymy (A) Adresa: Robbins: Berliner (B) Ulice: 201 North Figueroa (C) Město: Los Angeles (D) Stát: Kalifornie (E) Země: USA (F) ZIP: 90012-2628 (v) Počítačově čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentin Release #1,0, (vi) Údaje o přihlášce:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání (C) Klasifikace:
(vii) Informace o zástupci/agentovi:
(A) Jméno: Spitals John P.
(B) Číslo registrace: 29215 (C) Referenční/docket číslo: 1920-305 (ix) Telekomunikační informace:
& Carspm .
Street, páté patro
Version #1,25 (A) Telefon: (237) 977-1001 (B) Telefax: (213) 977-1003 (2) Informace o SEQ ID NÓ:1:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2760 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Setězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 1..2760 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1:
CGT CAT CTT Arg His Leu
TTT TTT TTT Phe Phe Phe
CAT
His
TTT TTT TTT TTT TTT TTT Phe Phe Phe Phe Phe Phe
10
TTT TTT TTT TTT TTT TTT Phe Phe Phe Phe Phe Phe
TTT ATI ATT ATC AAA GAA TTT TAT ATC Phe Ile Ile Met lys Glu Phe Tyr Ile 20 25
TCT ATC GAA ACA Ser Ile Glu Thr
AAT AAT ATT ATT GAA CGT TAT Asn Asn Ile Ile Glu Arg Tyr 35 40
ATT GAT GAA AAC GGA AAG GAA Ile Asp Glu Asn Gly Lys Glu
164
GTC GGA
Val Gly | ο .
..η., γ·.3./
CGT ACT CGT GAA GTA GAA ΤΑΤ CTT CCG ACT ATG TTT AGG CAT TGT AAG 192
Arg Thr Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr Met Phe Arg His Cys Lys
55 ~ 60
GAA GAG TCA AAA TAC AAA GAC ATC TAT GGT AAA AAC TGT GCT CCT CAA 240
Glu Glu Ser Lýs Tyr Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys Ala Pro Gin
70 75 80
AAA TTT CCA TCA ATG AAA GAT GCT CGA GAT TGG ATG AAG CGA ATG GAA 288
Lys Phe Pro Ser Met Lys Asp Ala Arg Asp Trp Met Lys Arg Met Glu
90 95
GAC ATC GGT CTC GAA GCT CTC GGT ATG AAC GAT TTT AAA CTC GCT TAT 336
Asp Ile Gly Leu Glu Ala Leu Gly Met Asn Asp Phe Lys Leu Ala Tyr
100 105 110
ATC AGT Ile Ser GAT ACG TAT GGT TCA GAA ATT GTT TAT GAC CGA AAA TTT GTT Asp Thr Tyr Gly Ser Glu Ile Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val 384
115 120 125
CCT GTA GCT AAC TGT GAC ATT GAG GTT ACT GGT GAT AAA TTT CCT GAC • 432
Arg Val Ala Asn Cys Asp Ile Glu Val Thr Gly Asp Lys Phe Pro Asp
130 135 140
CCA ATG AAA GCA GAA TAT GAA ATT GAT GCT ATC ACT CAT TAT GAT TCA 480
Pro Met Lys Ata Glu Tyr Glu Ile Asp Ala (le Thr His Tyr Asp Ser
145 150 155 160
ATT GAC GAC CGT TTT TAT GTT TTC GAC CTT TTG AAT TCA ATG TAC GGT 528
Ile Asp Asp Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Met Tyr Gly
165 170 175
TCA GTA TCA AAA TGG GAT GCA AAG TTA GCT GCT AAG CTT GAC TGT GAA 576
Ser Val Ser Lys Trp Asp Ala Lys Leu Ala Ala Lys Leu Asp Cys Glu
180 185 190
GGT GGT GAT GAA GTT CCT CAA GAA ATT CTT GAC CGA GTA ATT TAT ATG 624
Gly Gly Asp Glu Val Pro Gin Glu Ile Leu Asp Arg Val Ile Tyr Met
195 200 205
CCA TTT GAT AAT GAG CGT GAT ATG CTC ATG GAA TAT ATT AAT CTC TGG 672
Pro Phe Asp Asn Glu Arg Asp Met Leu Met Glu Tyr Ue Asn Leu Trp
210 215 220
GAA CAG AAA CGA CCT GCT ATT TTT ACT GGT TGG AAT ATT GAG GGG TTT 720
Glu Gin Lys Arg Pro Ala Ile Phe Thr Gly Trp Asn Ile Glu Gly Phe
225 230 235 240
GAC GTT CCG TAT ATC ATG AAT CGC GTT AAA ATG ATT CTG GGT GAA CGC 768
Asp Val Pro Tyr Ile Met Asn Arg Val Lys Met Ue Leu Gly Glu Arg
245 250 255
AGT ATG AAA CGT TTC TCT CCA ATC GGT CGG GTA AAA TCT AAA CTA ATT 816
Ser Met Lys Arg Phe Ser Pro Ite Gly Arg Val Lys Ser Lys Leu Ue
260 265 270
CAA AAT ATG TAC GGT AGC AAA GAA ATT TAT TCT ATT GAT GGC GTA TCT 864
Gin Asn Met Tyr Gly Ser Lys Glu Ile Tyr Ser Ile Asp Gly Val Ser
275 280 285
ATT CTT GAT TAT TTA GAT TTG TAC AAG AAA TTC GCT TTT ACT AAT TTG 912
Ile Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Phe Ala Phe Thr Asn Leu
290 295 300
CCG TCA TTC TCT TTG GAA TCA GTT GCT CAA CAT GAA ACC AAA AAA GGT 960
Pro Ser Phe Ser Leu Glu Ser Vat Ala Gin His Glu Thr Lys Lys Gly
305 310 315 320
1008
AAA TTA CCA TAC GAC GGT CCT ATT AAT AAA CTT CGT GAG ACT AAT CAT Lys Leu Pro Tyr Asp Gly Pro Ue Asn Lys Leu Arg Glu Thr Asn His 325 330 335
I
CAA CGA Gin Arg TAC ATT Tyr Ile 340 AGT Ser TAT AAC Tyr Asn ATC ATT GAC GTA GAA TCA GTT CAA GCA 1056
Ile tle 345 Asp Val Glu Ser Val Gin Ala --------35a----------------
ATT GAT AAA ATT CGT GGG TTT ATC GAT CTA GTT TTA AGT ATG TCT TAT 1104
Ile Asp Lys Ile 355 Arg Gly Phe Ile 360 Asp Leu Val Leu Ser Met Ser Tyr 365
TAT GCT AAA ATG CCT TTT TCT GGT GTA ATG AGT CCT ATT AAA ACT TGG 1152
Tyr Ala 370 Lys Het Pro Phe Ser 375 Gly Val Het Ser Pro 380 Ile Lys Thr Trp
GAT GCT ATT ATT TTT AAC TCA TTG AAA GGT GAA CAC AAG GTT ATT CCT 1200
Asp Ala 385 Ile Ile Phe Asn Ser 390 Leu Lys Gly Glu 395 His Lys Val Ile Pro 400
CAA CAA GGT TCG CAC GTT AAA CAG AGT TTT CCG GGT GCA TTT GTA TTT 1248
Gin Gin Gly Ser His 405 Val Lys Gin Ser Phe 410 Pro Gly Ala Phe Val Phe 415
GAA CCT AAA CCA ATT GCT CGT CGA TAC ATT ATG AGT TTT GAC TTG ACG 1296
Glu Pro Lys Pro 420 Ile Ala Arg Arg Tyr 425 Ile Het Ser Phe Asp Leu Thr 430
TCT CTG TAT CCG AGC ATT ATT CGC CAG GTT AAC ATT AGT CCT GAA ACT 1344
Ser Leu Tyr Pro 435 Ser Ile Ile Arg 440 Gin Val Asn Ile Ser Pro Glu Thr 445
ATT CGT GGT CAG TTT AAA GTT CAT CCA ATT CAT GAA TAT ATC GCA CGA 1392
Ile Arg 450 Gly Gin Phe Lys Val 455 His Pro Ile His Glu 460 Tyr Ile Ala Gly
ACA GCT CCT AAA CCA AGT GAT GAA TAT TCT TGT TCT CCG AAT GGA TGG 1440
Thr Ala 465 Pro Lys Pro Ser Asp 470 Glu Tyr Ser Cys 475 Ser Pro Asn Gly Trp 480
ATG TAT GAT AAG CAT CAA GAA GGT ATC ATT CCA AAG GAA ATC GCT AAA 1488
Het Tyr Asp Lys His 485 Gin Glu Gly Ile Ile 490 Pro Lys Glu Ile Ala Lys 495
GTA TTT TTC CAG CGT AAA GAT TGG AAA AAG AAA ATG TTC GCT GAA GAA 1536
Val Phe Phe Gin 500 Arg Lys Asp Trp Lys 505 Lys Lys Het Phe Ala Glu Glu 510
ATG AAT GCC GAA GCT ATT AAA AAG ATT ATT ATG AAA GGC GCA GGG TCT 1584
Het Asn Ala Glu 515 Ala Ile Lys Lys 520 Ile Ile Ke: Lys Gly Ala Gly Ser 525
TGT TCA ACT AAA CCA GAA GTT GAA CGA TAT GTT AAG TTC ACT GAT GAT 1632
Cys Ser 530 Thr Lys Pro Glu Val 535 Glu Arg Tyr Val Lys 540 Phe Thr Asp Asp
TTC TTA AAT GAA CTA TCG AAT TAT ACT GAA TCT GTT CTT AAT AGT CTG 1680
Phe Leu 545 Asn Glu Leu Ser Asn 550 Tyr Thr Glu Ser 555 Val Leu Asn Ser Leu 560
ATT GAA GAA TGT GAA AAA GCA GCT ACA CTT GCT AAT ACA AAT CAG CTG 1728
Ile Glu Glu Cys Glu 565 Lys Ala Ala Thr Leu 570 Ala Asn Thr Asn Gin Leu 575
AAC CGT AAA ATT CTT ATT AAC AGT CTT TAT GGT GCT CTT GGT AAT ATT 1776
Asn Arg Lys Ile 530 Leu Ile Asn Ser Leu 585 Tyr Gly Ala Leu Gly Asn Ile 590
CAT TTC CGT TAC TAT GAT TTA CGA AAT GCT ACT GCT ATC ACA ATT TTT 1824
His Phe Arg Tyr 595 Tyr Asp Leu Arg 600 Asn Ala Thr Ala Ile Thr Ile Phe 605
GGT CAA GTT GGT ATT CAG TGG ATT GCT CGT AAA ATT AAT GAA TAT CTG 1872
Gly Gin 610 Val Gly Ile Gin Trp 615 Ile Ala Arg Lys 1 le 620 Asn Glu Tyr Leu
GCT TCG TTA GAC TTC CTG TTT GGC 2760
Ala Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
...........915 920 - - -.....................
(2) Informace o SEQ ID NO: 2 :
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 920 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(X i) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
Arg 1 His Leu His Phe Phe 5 Phe Phe Phe Phe 10 Phe Phe Phe Phe Phe Phe 15
Phe Phe Phe Phe Ile Ile 20 Met Lys Glu Phe 25 Tyr Ile Ser Ile Gtu Thr 30
Val Gly Asn 35 Asn Ile Ile Glu Arg Tyr Ile 40 Asp Glu Asn 45 Gly Lys Glu
Arg Thr Arg 50 Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr 55 Met Phe Arg 60 His Cys Lys
Glu 65 Glu Ser Lys Tyr Lys 70 Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys 75 Ala Pro Gin 80
Lys Phe Pro Ser Met Lys 85 Asp Ala Arg Asp Trp Met Lys 90 Arg Met Glu 95
Asp Ile Gly Leu Glu Ala 100 Leu Gly Met Asn 105 Asp Phe Lys Leu Ala Tyr 110
Ile Ser Asp 115 Thr Tyr Gly Ser Glu Ile Val 120 Tyr Asp Arg 125 Lys Phe Val
Arg Val Ala 130 Asn Cys Asp Ile Glu Val Thr 135 Gly Asp Lys 140 Phe Pro Asp
Pro 145 Het Lys Ala Glu Tyr 150 Glu Ile Asp Ala Ile Thr His 155 Tyr Asp Ser 160
Ile Asp Asp Arg Phe Tyr 165 Val Phe Asp Leu 170 Leu Asn Ser Met Tyr Gly 175
Ser Val Ser Lys Trp Asp 180 Ala Lys Leu Ala 185 Ala Lys Leu Asp Cys Glu 190
Gly Gly Asp 195 Glu Val Pro Gin Glu Ile Leu 200 Asp Arg Val 205 Ite Tyr Met
Pro Phe Asp 210 Asn Glu Arg Asp Met Leu Met 215 Glu Tyr Ile 220 Asn Leu Trp
Glu 225 Gin Lys Arg Pro Ala 230 Ile Phe Thr Gly Trp Asn Ite 235 Glu Gly Phe 240
Asp Val Pro Tyr Ile Met 245 Asn Arg Val Lys 250 Met Ile Leu Gly Gtu Arg 255
Ser Met Lys Arg Phe Ser 260 Pro Ile Gly Arg 265 Vat Lys Ser Lys Leu I le 270
Gin Asn Met 275 Tyr Gly Ser Lys Glu 1le Tyr 280 Ser Ile Asp 285 Gly Val Ser
I le Leu Asp 290 Tyr Leu Asp Leu Tyr Lys Lys 295 Phe Ala Phe 300 Thr Asn Leu
té
AAT Asn 625 AAA Lys GTA Val TGC Cys GGA Gly ACT Thr 630 AAT Asn GAT Asp GAA Glu GAT Asp TTC Phe 635 ATC Ile GCA Ala GCA Ala GGT GAT Gly Asp 1920
640
ACT GAT TCG GTA TAT GTT TGT GTA GAT AAA GTT ATT GAA AAA GTT GGT 1968
Thr Asp Ser Val Tyr 645 Val Cys Val Asp Lys 650 Val Ile Glu Lys Val 655 Gly
CTT GAC CGA TTC AAA GAG CAG AAC GAT TTG GTT GAA TTC ATG AAT CAG 2016
Leu Asp Arg Phe 660 Lys Glu Gin Asn Asp 665 Leu Val Glu Phe Met 670 Asn Gin
TTT GGT AAG AAA AAG ATG GAA CCT ATG ATT GAT GTT GCA TAT CGT GAG 2064
. Phe Gly Lys 675 tys Lys Met Glu Pro 680 Met Ile Asp Val Ala 685 Tyr Arg Glu
TTA TGT GAT TAT ATG AAT AAC CGC GAG CAT CTG ATG CAT ATG GAC CGT 2112
Leu Cys 690 Asp Tyr Met Asn Asn 695 Arg Glu His Leu Met 700 His Met Asp Arg
GAA GCT ATT TCT TGC CCT CCG CTT GGT TCA AAG GGT GTT GGT GGA TTT 2160
Glu 705 Ala Ile Ser Cys Pro 710 Pro Leu Gly Ser Lys 715 Gly Val Gly Gly Phe 720
TGG AAA GCG AAA AAA CGT TAT GCT CTG AAC GTT TAT GAT ATG GAA GAT 2208
Trp Lys Ala Lys Lys 725 Arg Tyr Ala Leu Asn 730 Val Tyr Asp Met Glu 735 Asp
AAG CGA TTT GCT GAA CCG CAT CTA AAA ATC ATG GGT ATG GAA ACT CAC 2256
tys Arg Phe Ala 740 Glu Pro His Leu Lys 745 Ile Met Gly Met Glu 750 Thr Gin
CAG AGT TCA ACA CCA AAA GCA GTG CAA GAA GCA CTC GAA GAA AGT ATT 2304
Gin Ser Ser 755 Thr Pro Lys Ala Val 760 Gin Glu Ala Leu Glu 765 Glu Ser Ile
CGT CGT ATT CTT CAG GAA GGC GAA GAG TCT GTC CAA GAA TAT TAC AAG 2352
Arg Arg 770 Ile Leu Gin Glu Gly 775 Glu Glu Ser Val Gin 780 Glu Tyr Tyr Lys
AAC TTC GAG AAA GAA TAT CGT CAA CTT GAC TAT AAA GTT ATT GCT GAA 2400
Asn 785 Phe Glu Lys Glu Tyr 790 Arg Gin Leu Asp Tyr 795 Lys Val Ile Ala Glu 800
GTA AAA ACT GCG AAC GAT ATA.GCG AAA TAT GAT GAT AAA GGT TGG CCA 2443 * Val Lys Thr Ala Asn Asp Ile Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
GGA TTT Gly Phe AAA TGT CCG TTC CAT ATT Ile CGT GGT GTG CTA ACT TAT CGT CGA 2496
Lys Cys 820 Pro Phe His Arg 825 Gly Val Leu Thr Tyr 830 Arg Arg
GCT GTT AGT GGT CTG GGT GTA GCT CCA ATT TTG GAT GGA AAT AAA GTA 2544
Ala Val Ser Gly Leu Gly Val Ala Pro Ile Leu Asp Gly Asn Lys Val
835 840 845
ATG GTT CTT CCA TTA CGT GAA GGA AAT CCG TTT GGT GAT AAG TGC ATT 2592
Met Val Leu Pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys Cys Ile
850 855 860
GCT TGG CCA TCG GGT ACA GAA CTT CCA AAA GAA ATT CGT TCT GAT GTA 2640
Ala Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu I le Arg Ser Asp Val
865 870 875 880
CTA TCT TGG ATT GAC TAC TCA ACT TTG TTC CAA AAA TCG TTT GTT AAA 2688
Leu Ser Trp Ile Asp Tyr Ser Thr Leu Phe Gin Lys Ser Phe Val Lys
885 890 895
CCG CTT GCG GGT ATG TGT GAA TCG GCA GGT ATG GAC TAT GAG GAA AAA 2736
Pro Leu Ala Gly Met cys Glu Ser Ala Gly Met Asp Tyr Glu Glu Lys
900 905 910
Leu Cys Asp 690 Tyr Het Asn Asn Arg 695 Glu His Leu Het His 700 Met Asp i Arg
Glu Ala Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val Gly Gly ’ Phe
705 710 715 720
Trp Lys Ala Lys Lys Arg Tyr Ala Leu Asn Val Tyr Asp Het Glu Asp
725 730 735
Lys Arg Phe Ala Glu Pro His Leu Lys Ile Met Gly Met Glu Thr Gin
740 745 750
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Ala Val Gin Glu Ala Leu Glu Glu Ser ile
755 760 765
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gly Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Vat 1le Ala Glu
785 790 795 800
Val Lys Thr Ala Asn Asp lle Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
Gly Phe Lys Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
820 825 830
Ala Val Ser Gly Leu Gly Val Ala Pro Ile Leu Asp Gly Asn Lys Val
835 840 845
Met Val Leu Pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys Cys Ile
850 855 860
Ala Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu Ile Arg Ser Asp Val
865 870 875 880
Leu Ser Trp lle Asp Tyr Ser Thr Leu Phe Gin Lys Ser Phe Val Lys
885 890 895
Pro Leu Ala Gly Het Cys Glu Ser Ala Gly Met Asp Tyr Glu Glu Lys
900 905 910
Ala Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
915 920
2) Inf ormace o SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristiky sekvence
(A) Délka: 2760 párů bází
(B) Typ: nukleová kyselina
(C) Řetězec: jediný
(D) Topologie: 1ineární
(i i) Typ molekuly : DNA (genomická)
(ix) Rysy:
(A) Jméno/klí č: CDS
(B) Lokace : 1 . . 2760
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:
CGT CAT CTT CAT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT
Arg His Leu His Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10 15
TTT TTT TTT TTT ATT ATT ATC AAA GAA TTT TAT ATC TCT ATT GAA ACA
Phe Phe Phe Phe Ile lle Met Lys Glu Phe Tyr Ile Ser tle Glu Thr
25 30
GTC GGA AAT AAC ATT GTT GAA CGT TAT ATT GAT GAA AAT GGA AAG GAA , 144
Val Gly Asn Asn Ile Val Glu Arg Tyr Ile Asp Glu Asn Gly Lys Glu
40 45
CGT ACC CGT GAA GTA GAA TAT CTT CCA ACT ATG TTT AGG CAT TGT AAG 192
Arg thr Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr Het Phe Arg His Cys Lys
55 60
GAA GAG TCA AAA TAC AAA GAC ATC TAT GGT AAA AAC TGC GCT CCT CAA 240
Glu Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys Ala Pro Gin
65 70 75 80
AAA TTT CCA TCA ATG AAA GAT GCT CGA GAT TGG ATG AAG CGA ATG GAA 288
Lys Phe Pro Ser Het Lys Asp Ala Arg Asp Trp Het Lys Arg Het Glu
85 * 90 95
GAC ATC GGT CTC GAA GCT CTC GGT ATG AAC GAT TTT AAA CTC GCT TAT 336
Asp Ile Gly Leu Glu Ala Leu Gly Het Asn Asp Phe Lys Leu Ala Tyr
100 105 110
ATA AGT GAT ACA TAT GGT TCA GAA ATT GTT TAT GAC CGA AAA TTT GTT 384
Ile Ser *Sp Thr Tyr Gly Ser Glu Ile Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val
115 120 125
CGT GTA GCT AAC TGT GAC ATT GAG GTT ACT GGT GAT AAA TTT CCT GAC 432
Arg Val Ala Asn Cys Asp Ile Glu Val Thr Gly Asp Lys Phe Pro Asp
130 135 140
CCA ATG AAA GCA GAA TAT GAA ATT GAT GCT ATC ACT CAT TAC GAT TCA 480
Pro Het Lys Ala Glu Tyr Glu Ile Asp Ala Ile Thr His Tyr Asp Ser
145 150 155 160
ATT GAC GAT CGT TTT TAT GTT TTC GAC CTT TTG AAT TCA ATG TAC GGT 528
Ile Asp Asp Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Het Tyr Gly
165 170 175
TCA GTA TCA AAA TGG GAT GCA AAG TTA GCT GCT AAG CTT GAC TGT GAA 576
Ser Val Ser Lys Trp Asp Ala Lys Leu Ala Ala Lys Leu Asp Cys Glu
180 185 190
GGT GGT GAT GAA GTT CCT CAA GAA ATT CTT GAC CGA GTA ATT TAT ATG 624
Gly Gly Asp Glu Val Pro Gin Glu I le Leu Asp Arg Val Ile Tyr Het
195 200 205
CCA TTC GAT AAT GAG CGT GAT ATG CTC ATG GAA TAT ATC AAT CTT TGG 672
Pro Phe Asp Asn Glu Arg Asp Het Leu Het Glu Tyr Ile Asn Leu Trp
210 215 220
GAA CAG AAA CGA CCT GCT ATT TTT ACT GGT TGG AAT ATT GAG GGG TTT 720
Glu Gin Lys Arg Pro Ala Ile Phe Thr Gly Trp Asn Ile Glu Gly Phe
225 230 235 240
GAC GTT CCG TAT ATC ATG AAT CGT GTT AAA ATG ATT CTG GGT GAA CGT 768
Asp Val Pro Tyr Ile Het Asn Arg Val Lys Het Ile Leu Gly Glu Arg
245 250 255
AGT ATG AAA CGT TTC TCT CCA ATC GGT CGG GTA AAA TCT AAA CTA ATT 816
Ser Het Lys Arg Phe Ser Pro Ile Gly Arg Val Lys Ser Lys Leu Ile
260 265 270
GAA AAT ATG TAC GGT AGC AAA GAA ATT TAT TCT ATT GAT GGC GTA TCT 864
Gin Asn Het Tyr Gly Ser Lys Glu Ile Tyr Ser I le Asp Gly Val Ser
275 280 285
ATT CTT GAT TAT TTA GAT TTG TAC AAG AAA TTC GCT TTT ACT AAT TTG 912
Ile Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Phe Ala Phe Thr Asn Leu
290 295 300
CCG TCA TTC TCT TTG GAA TCA GTT GCT CAA CAT GAA ACC AAA AAA GGT 960
Pro Ser Phe Ser Leu Glu Ser Val Ala Gin His Glu Thr Lys Lys Gly
305 310 315 320
AAA TTA CCA TAC Lys Leu Pro Tyr GAC GGT CCT ATT AAT AAA CTT CGT GAG ACT AAT CAT 1008
Asp Gly Pro 325 Ile Asn Lys 330 Leu Arg Glu Thr Asn 335 His
CAA CGA TAC ATT AGT TAT AAC ATC ATT GAC GTA GAA TCA GTT CAA GCA 1056
Gin Arg Tyr Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Asp Vat Glu Ser Val Gin Ala
340 345 350
ATC GAT AAA ATT CGT GGG TTT ATC GAT CTA GTT TTA AGT ATG TCT TAT 1104
Ile Asp Lys I le Arg Gly Phe Ile Asp Leu Vat Leu Ser Met Ser Tyr
355 360 365
TAC GCT AAA ATG CCT TTT TCT GGT GTA ATG AGT CCT ATT AAA ACT TGG 1152
Tyr Ala Lys Met Pro I he Ser Gly Val Met Ser Pro Ile Lys Thr Trp
370 375 380
GAT GCT ATT ATT TTT AAC TCA TTG AAA GGT GAA CAT AAG GTT ATT CCT 1200
Asp Ala Ile Ile Phe Asn Ser Leu Lys Gly Glu His Lys Val Ite Pro
385 390 395 400
CAA CAA GGT TCG CAC GTT AAA CAG AGT TTT CCG GGT GCA TTT GTG TTT 1248
Gin Gin Gly Ser His Val Lys Gin Ser Phe Pro Gly Ala Phe Val Phe
405 410 415
GAA CCT AAA CCA ATT GCA CGT CGA TAC ATT ATG AGT TTT GAC TTG ACG 1296
Glu Pro Lys Pro Ile Ala Arg Arg Tyr Ile Met Ser Phe Asp Leu Thr
420 425 430
TCT CTG TAT CCG AGC ATT ATT CGC CAG GTT AAC ATT AGT CCT GAA ACT 1344
Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Arg Gin Val Asn Ile Ser Pro Glu Thr
435 440 445
ATT CGT GGT CAG TTT AAA GTT CAT CCA ATT CAT GAA TAT ATC GCA GGA 1392
Ile Arg Gly Gin Phe Lys Val His Pro Ile His Glu Tyr Ile Ala Gly
450 455 460
ACA GCT CCT AAA CCG AGT GAT GAA TAT TCT TGT TCT CCG AAT GGA TGG 1440
Thr Ala Pro Lys Pro Ser Asp Glu Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Trp
465 470 475 480
ATG TAT GAT AAA CAT CAA GAA GGT ATC ATT CCA AAG GAA ATC GCT AAA 1488
Het Tyr Asp Lys His Gin Glu Gly Ile Ile Pro Lys Glu Ile Ala Lys
485 490 495
GTA TTT TTC CAG CGT AAA GAC TGG AAA AAG AAA ATG TTC GCT GAA GAA 1536
Val Phe Phe Gin Arg Lys Asp Trp Lys Lys Lys Met Phe Ala Glu Glu
500 505 510
ATG AAT GCC GAA GCT ATT AAA AAG ATT ATT ATG AAA GGC GCA GGG TCT 1584
Met Asn Ala Glu Ala Ile tys Lys Ile Ile Met Lys Gly Ala Gly Ser
515 520 525
TGT TCA ACT AAA CCA GAA GTT GAA CGA TAT GTT AAG TTC AGT GAT GAT 1632
Cys Ser Thr Lys Pro Glu Val Glu Arg Tyr Val Lys Phe Ser Asp Asp
530 535 540
TTC TTA AAT GAA CTA TCG AAT TAC ACC GAA TCT GTT CTC AAT AGT CTG 1680
Phe Leu Asn Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Glu Ser Val Leu Asn Ser Leu
545 550 555 560
ATT GAA GAA TGT GAA AAA GCA GCT ACA CTT GCT AAT ACA AAT CAG CTG 1728
- Ile Glu Glu Cys Glu Lys Ala Ala Thr Leu Ala Asn Thr Asn Gin Leu
565 570 575
AAC CGT AAA ATT CTC ATT AAC AGT CTT TAT GGT GCT CTT GGT AAT ATT 1776
Asn Arg Lys Ile Leu tle Asn Ser Leu Tyr Gly Ala Leu Gly Asn Ile
580 585 590
CAT TTC CGT TAC TAT GAT TTG CGA AAT GCT ACT GCT ATC ACA ATT TTC 1824
His Phe Arg Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Ala Thr Ala Ile Thr Ile Phe
595 600 605
GGC CAA GTC GGT ATT CAG TGG ATT GCT CGT AAA ATT AAT GAA TAT CTG Glu Tyr Leu
Gly Gin Val Gly Ile Gin Trp tle Ala Arg Lys Ile Asn 620
610 615
AAT AAA GTA TGC GGA ACT AAT GAT GAA GAT TTC ATT GCA GCA GGT GAT
Asn Lys Val Cys Gly Thr Asn Asp Glu Asp Phe Ile Ala Ala Gly Asp
62S 630 635 640
ACT GAT TCG GTA TAT GTT TGC GTA GAT AAA GTT ATT GAA AAA GTT GGT
Thr Asp Ser Val Tyr Val Cys Val Asp Lys Val Ile Glu Lys Val Gly
645 650 655
CTT GAC CGA TTC AAA GAG CAG AAC GAT TTG GTT GAA TTC ATG AAT CAG
Leu Asp Arg Phe Lys Glu Gin Asn Asp Leu Val Glu Phe Met Asn Gin
660 665 670
TTC GGT AAG AAA AAG ATG GAA CCT ATG ATT GAT GTT GCA TAT CGT GAG
Phe Gly Lys Lys Lys Met Glu Pro Met Ile Asp Val Ala Tyr Arg Glu
675 680 685
TTA TGT GAT TAT ATG AAT AAC CGC GAG CAT CTG ATG CAT ATG GAC CGT
Leu Cys Asp Tyr Met Asn Asn Arg Glu His Leu Het His Met Asp Arg
690 695 700 -
GAA GCT ATT TCT TGC CCT CCG CTT GGT TCA AAG GGC GTT GGT GGA TTT
Glu Ala Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val Gly Gly Phe
705 710 715 720
TGG AAA GCG AAA AAG CGT TAT GCT CTG AAC GTT TAT GAT ATG GAA GAT
Trp Lys Ala Lys Lys Arg Tyr Ala Leu Asn Val Tyr Asp Met Glu Asp
725 730 735
AAG CGA TTT GCT GAA CCG CAT CTA AAA ATC ATG GGT ATG GAA ACT CAG
Lys Arg Phe Ala Glu Pro His Leu Lys Ile Met Gly Met Glu Thr Gin
740 745 750
CAG AGT TCA ACA CCA AAA GCA GTG CAA GAA GCT CTC GAA GAA AGT ATT
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Ala Val Gin Glu Ala Leu Glu Glu Ser Ile
5 760 765
CGT CGT ATT CTT CAG GAA GGT GAA GAG TCT GTC CAA GAA TAC TAC AAG
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gly Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
AAC TTC GAG AAA GAA TAT CGT CAA CTT GAC TAT AAA GTT ATT GCT GAA
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Val Ile Ala Glu
785 790 795 800
GTA AAA ACT GCG AAC GAT ATA GCG AAA TAT GAT GAT AAA GGT TGG CCA
Val Lys Thr Ala Asn Asp Ile Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
GGA TTT AAA TGC CCG TTC CAT ATT CGT GGT GTG CTA ACT TAT CGT CGA
Gly Phe Lys Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
830
ATT TTG GAT GGA AAT AAA GTA Ile Leu Asp Gly Asn Lys Val 845
CCA TTT GGT GAC AAG TGC ATT Pro Phe Gly Asp Lys Cys Ile 860
AAA GAA ATT CGT TCT GAT GTG Lys Glu Ile Arg Ser Asp Val 880
820 825
GCT GTT AGC GGT TTA GGT GTA GCT CCA
Ala Val Ser 835 Gly Leu Gly Val Ala 840 Pro
ATG GTT CTT CCA TTA CGT GAA GGA AAT
Met Val 850 Leu Pro Leu Arg Glu 855 Gly Asn
GCT TGG CCA TCG GGT ACA GAA CTT CCA
Ala 865 Trp Pro Ser Gly Thr 870 Glu Leu Pro
CTA TCT TGG ATT GAC CAC TCA ACT TTG
Leu Ser Trp Ile Asp 885 His Ser Thr Leu
1872
1920
1968
2016
2064
2112
2160
2208
2256
2304
2352
2400
2448
2496
2544
2592
2640
875 880
TTC CAA AAA TCG TTT GTT AAA 2688 Phe Gin Lys Ser Phe Val Lys 890 895
CCG CTT GCG GGT ATG TGT GAA TCG GCT GGC ATG GAC TAT GAA GAA AAA 2736
Pro Leu Ala Gly Met Cys Glu Ser Ala Gly Met Asp Tyr Glu Glu Lys
900 — . 905 910
GCT TCG TTA GAC TTC CTG TTT GGC 2760
Ala Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
915 920
(2) Informace o SEQ ID NO:4:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 920 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein
(xi ) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Arg 1 His Leu His Phe 5 Phe Phe Phe Phe Phe Phe 10 Phe Phe Phe Phe Phe 15
Phe Phe Phe Phe Ile 20 Ile Met Lys Glu 25 Phe Tyr Ile Ser Ile Glu Thr 30
Val Gly Asn 35 Asn Ile Val Glu Arg Tyr 40 Ile Asp Glu Asn Gly Lys Glu 45
Arg Thr 50 Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro 55 Thr Met Phe 60 Arg His Cys Lys
Glu 65 Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Ile Tyr 70 Gly Lys 75 Asn Cys Ala Pro Gin 80
Lys Phe Pro Ser Met 85 Lys Asp Ala Arg Asp Trp 90 Met Lys Arg Met Glu 95
Asp Ile Gly Leu Glu 100 Ala Leu Gly Met 105 Asn Asp Phe Lys Leu Ala Tyr 110
Ile Ser Asp 115 Thr Tyr Gly Ser Glu Ile 120 Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val 125
Arg Val 130 Ala Asn Cys Asp Ile Glu Val 135 Thr Gly Asp 140 Lys Phe Pro Asp
Pro 145 Met tys Ala Glu Tyr Glu Ile Asp 150 Ala Ile 155 Thr His Tyr Asp Ser 160
Ile Asp Asp Arg Phe 165 Tyr Val Phe Asp Leu Leu 170 Asn Ser Met Tyr Gly 175
Ser Val Ser Lys Trp Asp Ala Lys Leu 180 185 Ala Ala Lys Leu Asp Cys Glu 190
Gly Gly Asp 195 Glu Val Pro Gin Glu Ile 200 Leu Asp Arg Val Ile Tyr Met 205
Pro Phe 210 Asp Asn Glu Arg Asp Met Leu 215 Met Glu Tyr 220 Ile Asn Leu Trp
Glu 225 Gin Lys Arg Pro Ala Ile Phe Thr 230 Gly Trp 235 Asn Ile Glu Gly Phe 240
Asp Val Pro Tyr Ile 245 Met Asn Arg Val Lys Met 250 Ile Leu Gly Glu Arg 255
Ser Mec Lys Arg Phe 260 Ser Pro Ile Gly 265 Arg Vat Lys Ser Lys Leu Ile 270
Gin Asn Met 275 Tyr Gly Ser Lys Glu Ile 230 Tyr Ser I le Asp Gly Val Ser 285
:
Ile Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Phe Ala Phe Thr Asn Leu 290 295 300
Pro Ser Phe Ser Leu Glu Ser Val Ala Gin Mís Glu Thr Lys Lys Gly 305 310 315 320
Lys Leu Pro Tyr Asp Gly Pro Ile Asn Lys Leu Arg Glu Thr Asn His
325 330 335
Gin Arg Tyr Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Asp Val Glu 1 Ser Val Gin Ala
340 345 350
Ile Asp Lys Ile Arg Gly Phe tle Asp Leu Val Leu Ser Met Ser Tyr
355 360 365
Tyr Ala Lys Het Pro Phe Ser Gly Val Het Ser Pro Ile Lys Thr Trp
370 375 380
Asp Ala Ile Ile Phe Asn Ser Leu Lys Gly Glu His Lys Val tle Pro
385 390 395 400
Gin Gin Gly Ser His Val Lys Gin Ser Phe Pro Gly Ala Phe Val Phe
405 410 415
Glu Pro Lys Pro Ile Ala Arg Arg Tyr Ile Het Ser Phe Asp Leu Thr
420 425 430
Ser Leu Tyr Pro Ser ile Ile Arg Gin Val Asn (le Ser Pro Glu Thr
435 440 445
Ile Arg Gly Gin Phe Lys Val His Pro Ile His Glu Tyr Ile Ala Gly
450 455 460
Thr Ala Pro Lys Pro Ser Asp Glu Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Trp
465 470 475 480
Het Tyr Asp Lys His Gin Glu Gly Ile Ile Pro Lys Glu Ile Ala Lys
485 490 495
Val Phe Phe Gin Arg Lys Asp Trp Lys Lys Lys Het Phe Ala Glu Glu
500 505 510
Het Asn Ala Glu Ala Ile Lys Lys Ile tle Het Lys Gly Ala Gly Ser
515 520 525
'Cys Ser Thr Lys Pro Glu Val Glu Arg Tyr Val Lys Phe Ser Asp Asp
530 535 540
Phe Leu Asn Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Glu Ser Val Leu Asn Ser Leu
545 550 555 560
Ite Glu Glu Cys Glu Lys Ala Ala Thr Leu Ala Asn Thr Asn Gin Leu
565 570 575
Asn Arg Lys Ile Leu Ile Asn Ser Leu Tyr Gly Ala Leu Gly Asn tle
580 535 590
His Phe Arg Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Ala Thr Ala Ile Thr Ile Phe
595 600 605
Oly Gin Val Gly Ile Gin Trp Ile Ala Arg Lys Ile Asn Glu Tyr Leu
610 615 620
Asn Lys Val Cys Gly Thr Asn Asp Glu Asp Phe Ile Ala Ala Gly Asp
625 630 635 640
Thr Asp Ser Val Tyr Val Cys Val Asp Lys Val Ile Glu Lys Val Gly
645 650 655
Leu Asp Arg Phe Lys Glu Gin Asn Asp Leu Val Glu Phe Met Asn Gin
660 665 670
Phe Gly Lys Lys Lys Met Glu Pro 680 Met Ile Asp Val Ala Tyr Arg 685 Clu
675
Leu Cys Asp Tyr Met Asn Asn Arg Glu His Leu Met His Met Asp Arg
690 695 700
Glu Ala Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val Gly Gly Phe
705 710 715 720
Trp Lys Ala Lys Lys Arg Tyr Ala Leu Asn Val Tyr Asp Met Glu Asp
725 730 735
Lys Arg Phe Ala Glu Pro His Leu Lys Ile Met Gty Met Glu Thr Gin
740 745 750
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Ala Vat Gin Glu Ala Leu Glu Glu Ser Ile
755 760 765
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gty Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Vat 1le Ala Glu
705 790 795 800
Val Lys Thr Ala Asn Asp Ile Ala Lys Tyr Asp Asp Lys Gly.Trp Pro
805 810 815
Gly Phe Lys Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
820 825 830
Ala Vat Ser Gty Leu Gly Vat Ala Pro Ile Leu Asp Gly Asn Lys Vat
835 840 845
Met Val Leu Pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys Cys I le
850 855 860
Ala Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu Ile Arg Ser Asp Val
865 870 875 880
Leu Ser Trp Ile Asp His Ser Thr Leu Phe Gin Lys Ser Phe Val tys
885 890 895
Pro Leu Ala Gly Met Cys Glu Ser Ala Gly Met Asp Tyr Glu Glu Lys
900 905 910
Ala Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
915 920
(2) Informace o SEQ ID NO:5:
(i) Charakteristiky sekvence:
(A) Délka: 2459 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jediný (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (ix) Rysy:
(A) Jméno/klíč: CDS (B) Lokace: 108..2456 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:
AAGCATGGCG CGAAGCCATA TTACGGGCAG TAATGACTGT A7AAAACCAC AGCCAATCAA 60
ACGAAACCAG GCTATACTCA AGCCTGGTTT TTTGATGGAT TTTCAGC GTG GCG CAG Val Ala Gin 1
116 «* ►.»
GCA CGT TTT ATC TTA ACC CGA CAC TGG CGG GAC ACC CCG CAA GGG ACA 164
Ala Gly 5 Phe tle Leu Thr Arg 10 His Trp Arg Asp Thr -15 Pro Gin Gly Thr
GAA GTC TCC TTC TGG CTG GCG ACG GAC AAC GGG CCG TTG CAG GTT ACG 212
Glu Val Ser Phe Trp Leu Ala Thr Asp Asn Gly Pro Leu Gin Val Thr
20 25 30 35
CTT GCA CCG CAA GAG TCC GTG GCG TTT ATT CCC GCC GAT CAG GTT CCC 260
Leu Ala Pro Gin Glu Ser Val Ala Phe tle Pro Ala Asp Gin Val Pro
40 45 50
CGC GCT CAG CAT ATT TTG CAG GGT GAA CAA GGC TTT CGC CTG ACA CCG 308
Arg Ala Gin His Ke Leu Gin Gly Glu Gin Gly Phe Arg Leu Thr Pro
55 60 65
CTG GCG TTA AAG GAT TTT CAC CGC CAG CCG GTG TAT GGC CTT TAC TGT 356
Leu Ala Leu Lys Asp Phe His Arg Gin Pro Val Tyr Gly Leu Tyr Cys
75 80
CGC GCC CAT CGC CAA TTG ATG AAT TAC GAA AAG CGC CTG CGT GAA GGT 404
Arg Ala His Arg Gin Leu Het 90 Asn Tyr Glu Lys Arg 95 Leu Arg Glu Gty
85
GGC GTT ACC GTC TAC GAG GCC GAT GTG CGT CCG CCA GAA CGC TAT CTG 452
Gly Val Thr Val Tyr Glu Ala Asp Val Arg Pro Pro Glu Arg Tyr Leu
100 105 110 115
ATG GAG CGG TTT ATC ACC TCA CCG GTG TGG GTC GAG GGT GAT ATG CAC 500
Met Glu Arg Phe I le Thr Ser Pro Val Trp Val Glu Gly Asp Met His
120 125 130
AAT GGC ACT ATC GTT AAT GCC CGT CTG AAA CCG CAT CCC GAC TAT CGT 548
Asn Gty Thr Ile Val Asn Ala Arg Leu Lys Pro His Pro Asp Tyr Arg
135 140 145
CCG CCG CTC AAG TGG GTT TCT ATA GAT ATT GAA ACC ACC CGC CAC GGT 596
Pro Pro Leu Lys Trp Val Ser Ile Asp Ile Glu Thr Thr Arg His Gly
150 155 160
GAG CTG TAC TGC ATC GGC CTG GAA GGC TGC GGG CAG CGC ATC GTT TAT 644
Glu Leu Tyr Cys Ile Gly Leu Glu Gly Cys Gly Gin Arg Ile Vat Tyr
165 170 175
ATG CTG GGG CCG GAG AAT GGC GAC GCC TCC TCG CTT GAT TTC GAA CTG 692
Met Leu Gly Pro Glu Asn Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asp Phe Glu Leu
130 185 190 195
uAA TAC GTC GCC AGC CGC CCG CAG TTG CTG GAA AAA CTC AAC GCC TGG 740
Glu Tyr Val Ala Ser Arg Pro Gin Leu Leu Glu Lys Leu Asn Ala Trp
200 205 210
TTT GCC AAC TAC GAT CCT GAT GTG ATC ATC GGT TGG AAC GTG GTG CAG 788
Pne Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Val Ile Ile Gly Trp Asn Val Val Gin
215 220 225
TTC GAT CTG CGA ATG CTG CAA AAA CAT GCC GAG CGT TAC CGT CTT CCG 836
Phe Asp Leu Arg Met Leu Gin Lys His Ala Glu Arg Tyr Arg Leu Pro
230 235 240
CTG CGT CTT GGG CGC GAT AAT AGC GAG CTG GAG TGG CGC GAC GAC GGC 884
Leu Arg Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Leu Glu Trp Arg Asp Asp Gly
245 250 255
TTT AAA AAC GGC GTC TTT TTT GCC CAG GCT AAA GGT GGG CTA ATT ATC 932
Phe Lys Asn Gly Val Phe Phe Ala Gin Ala Lys Gly Gly Leu Ile Ile
260 265 270 275
GAC GGT ATC GAG GCG CTG AAA TCC GCG TTC TGG AAT TTC TCT TCA TTC 980
Asp Gly Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Phe Trp Asn Phe Ser Ser Phe
280 285 290
t
TCG CTG GAA ACT GTC GCT CAG GAG CTA TTA GGC GAA GGA AAA TCT ATC 1028
Ser Leu Glu Thr Val Ala Gin Glu Leu Leu Gly Glu Gly Lys Ser Ile
295 300 ...................305 ........... GAT AAC CCG TGG GAT CGA ATG GAC GAA ATT GAC CGC CGT TTC GCC GAA 1076
Asp Asn Pro Trp Asp Arg Met Asp Glu Ile Asp Arg Arg Phe Ala Glu
310 315 320
GAT AAA CCT GCG CTG GCA ACT TAT AAC CTG AAA GAT TGC GAG CTG GTG 1124
Asp Lys Pro Ala Leu Ala Thr 330 Tyr Asn Leu Lys Asp 335 Cys Glu Leu Vat
325
ACG CAG ATC TTC CAC AAA ACT GAA ATC ATG CCA TTT TTA CTC GAA CGG 1172
Thr Gin Ile Phe His Lys Thr Glu Ile Met Pro Phe Leu Leu Glu Arg
340 345 350 355
GCA ACG GTG AAC GGC CTG CCG GTG GAC CGA CAC GGC GGT TCG GTG GCG 1220
Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Vat Asp Arg His Gty Gly Ser Val Ala
360 365 370
GCA TTT GGT CAT CTC TAT TTT CCG CGA ATG CAT CGC GCT GGT TAT GTC 1268
Ala Phe Gly His Leu Tyr Phe Pro Arg. Met His Arg Ala Gly Tyr Val
375 380' 385
GCG CCT AAT CTC GGC GAA GTG CCG CCG CAC GCC AGC CCT GGC GGC TAC 1316
Ala Pro Asn Leu Gly Glu Val Pro Pro His Ala Ser Pro Gly Gty Tyr
390 395 400
GTG ATG GAT TCA CGG CCA GGG CTT TAT GAT TCA GTG CTG GTG CTG GAC 1364
Val Met Asp Ser Arg Pro Gly Leu Tyr Asp Ser Vat Leu Val Leu Asp
405 410 415
TAT AAA AGC CTG TAC CCG TCG ATC ATC CGC ACC TTT CTG ATT GAT CCC 1412
Tyr Lys Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Arg Thr Phe Leu Ile Asp Pro
420 425 430 435
GTC GGG CTG GTG GAA GGC ATG GCG CAG CCT GAT CCA GAG CAC AGT ACC 1460
Val Gly Leu Vat Glu Gly Het Ala Gin Pro Asp Pro Glu His Ser Thr
440 445 450
GAA GGT TTT CTC GAT GCC TGG TTC TCG CGA GAA AAA CAT TGC CTG CCG 1508
Glu Gly Phe Leu Asp Ala Trp Phe Ser Arg Glu Lys His Cys Leu Pro
455 460 465
GAG ATT GTG ACT AAC ATC TGG CAC GGG CGC GAT GAA GCC AAA CGC CAG 1556
Glu Ile Val Thr Asn Ile Trp His Gly Arg Asp Glu Ata Lys Arg Gin
470 475 480
GGT AAC AAA CCG CTG TCG CAG GCG CTG AAA ATC ATC ATG AAT GCC TTT 1604
Gly Asn Lys Pro Leu Ser Gin Ala Leu Lys Ile He Het Asn Ala Phe
485 490 495
TAT GGC GTG CTC GGC ACC ACC GCC TGC CGC TTC TTC GAT CCG CGG CTG 1652
Tyr Gly Vat Leu Gly Thr Thr Ala Cys Arg Phe Phe Asp Pro Arg Leu
500 505 510 515
GCA TCG TCG ATC ACC ATG CGT GGT CAT CAG ATC ATG CGG CAA ACC AAA 1700
Ala Ser Ser Ile Thr Het Arg Gly His Gin Ile Het Arg Gin Thr Lys
520 525 530
GCG TTG ATT GAA GCA CAG GGC TAC GAC GTT ATC TAC GGC GAT ACC GAC 1748
Ala Leu Ile Glu Ala Gin Gly Tyr Asp Vat Ile Tyr Gty Asp Thr Asp
535 540 545
TCA ACG TTT GTC TGG CTG AAA GGC GCA CAT TCG GAA GAA GAA GCG GCG 1796
Ser Thr Phe Val Trp Leu Lys Gly Ala His Ser Glu Glu Glu Ala Ala
550 555 560
AAA ATC GGT CGT GCA CTG GTG CAG CAC GTT AAC GCC TGG TGG GCG GAA 1844
Lys Ile Gly Arg Ala Leu Val Gin His Val Asn Ata Trp Trp Ala Glu
565 570 575
¢) · A r.
ACG CTC CM MA CAA Thr Leu Gin Lys Gin sao CGG CTG ACC AGC GCA TTA GAA CTG GAG TAT GAA 1892
Arg 585 Leu Thr Ser Ale Leu 590 Glu Leu Glu Tyr Glu 595
ACC CAT TTC TGC CGT TTT CTG ATG CCA ACC ATT CGC GGA GCC GAT ACC 1940
Thr His Phe cys Arg Phe Leu Met Pro Thr Ile Arg Gly Ale Asp Thr
600 605 610
GGC AGT AAA AAG CGT TAT GCC CGA CTG ATT CAG GAG GGC GAC AAG CAG 1988
Gly Ser Lys Lys Arg Tyr Ala Gly Leu tle Gin Glu Gly Asp Lys Gin
615 620 625
CGG ATG GTG TTT AAA GGG CTG GAA ACC GTG CGC ACC GAC TGG ACG CCG 2036
Arg Met Val Phe Lys Gly Leu Glu Thr Val Arg Thr Asp Trp Thr Pro
630 635 640
CTG GCC CAG CAG TTT CAG CAG GAG CTA TAC CTG CGC ATC TTC CGC AAC 2084
Leu Ala Gin Gin Phe Gin Gin Glu Leu Tyr Leu Arg Ile Phe Arg Asn
645 650 655
GAG CCA TAT CAG GAA TAT GTA CGC GAA ACC ATC GAC AAA CTG ATG GCG 2132
Glu Pro Tyr Gin Glu Tyr Val Arg Glu Thr Ile Asp Lys Leu Met Ala
660 665 670 675
GGT GAA CTG GAT GCG CGA CTG GTT TAC CGT AAA CGC CTT CGC CGT CCG 2180
Gly Glu Leu Asp Ala Arg Leu Val Tyr Arg Lys Arg Leu Arg Arg Pro
630 685 690
CTG AGC GAG TAT CAG CGT AAT GTG CCG. CCT CAT GTA CGC GCC GCT CGC 2228
Leu Ser Glu Tyr Gin Arg Asn Val Pro Pro His Val Arg Ala Ala Arg
695 700 705
CTT GCC GAT GAA GAA AAC CAA AAG CGT GGT CGC CCC TTG CAA TAT CAG 2276
Leu Ala Asp Glu Glu Asn Gin Lys Arg Gly Arg Pro Leu Gin Tyr Gin
710 715 720
AAT CGC GGC ACC ATT AAG TAC GTA TGG ACC ACC AAC GGC CCG GAG CCG 2324
Asn Arg Gly Thr Ile Lys Tyr Val Trp Thr Thr Asn Gly Pro Glu Pro
725 730 735
CTG GAC TAC CAA CGT TCA CCA CTG GAT TAC GAA CAC TAT CTG ACC CGC 2372'
Leu Asp Tyr Gin Arg Ser Pro Leu Asp Tyr Glu His Tyr Leu Thr Arg
740 745 750 755
. CAG CTA CAA CCC GTG GCG GAG GGA ATA CTC CCT TTT ATT GAG GAT AAT 2420
Gin Leu Gin Pro Val Ala Glu Gly (le Leu Pro Phe Ile Glu Asp Asn
760 765 770
TTT GCT ACA CTT ATG ACC GGG CAA CTT GGG CTA TTT TGA 2459
Phe Ala Thr Leu Met Thr Gly Gin Leu Gly Leu Phe
775 780
(2) Informace o SEQ ID NO:6:
(i) Ch iara kteristiky sekven ce :
(A) Délka: 783 amino kysel in
(B) Typ: aminokyseli na
(ii) Ty (D) Topologie: lineá rní
P m olekuly: protein
(xi) Po pi s sekvence: SEQ ID NO: 6 a
Val Ala Gin Ala Gly Phe Ile Leu Thr Arg His Trp Arg Asp Tnr ΗΓΟ
1 5 10 15
Gin Gly Thr Glu Val Ser 1 she Trp Leu Ala Thr Asp Asn Gly Pro Leu
20 25 30
Gtn Val Thr Leu Ala Pro l Gtn Glu Ser Val Ala Phe Ile Pro Ala Asp
35 ' 40 45
Gin Val 50 Pro Arg Ala Gin His 55 Ile Leu Gin Gly Glu Gin 60 Gly Phe Arg
Leu Thr Pro Leu Ala Leu Lys Asp Phe His Arg Gin Pro Val Tyr Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Cys Arg Ala His Arg Gin Leu Met Asn Tyr Glu tys Arg Leu
85 90 95
Arg Glu Gly Gly Val Thr Val Tyr Glu Ala Asp Val Arg Pro Pro Glu
100 105 110
Arg Tyr Leu Met Glu Arg Phe Ile Thr Ser Pro Val Trp Val Glu Gly
115 120 125
Asp Met His Asn Gly Thr Ile Val Asn Ala Arg Leu Lys Pro His Pro
130 135 140
Asp Tyr Arg Pro Pro Leu Lys Trp Val Ser Ile Asp Ile Glu Thr Thr
145 150 155 160
Arg His Gly Glu Leu Tyr Cys Ile Gly Leu Glu Gly Cys Gly Gin Arg
165 170 175
Ile Val Tyr Met Leu Gly Pro Glu Asn Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asp
180 185 190
Phe Glu Leu Glu Tyr Val Ala Ser Arg Pro Gin Leu Leu Glu Lys Leu
195 200 205
Asn Ala Trp Phe Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Val Ile ile Gly Trp Asn
210 215 220
Val Val Gin Phe Asp Leu Arg Met Leu Gin Lys His Ala Glu Arg Tyr
225 ‘ 230 ' 235 ' 240
Arg Leu Pro Leu Arg Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Leu Glu Trp Arg 245 250 255
Asp Asp Gly Phe Lys Asn Gly Val Phe Phe Ala Gin Ala Lys Gly Gly 260 265 270
Leu Ile Ile Asp Gly Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Phe Trp Asn Phe 275 280 235
Ser Ser Phe Ser Leu Glu Thr Val Ala Gin Glu Leu Leu Gly Glu Gly 290 295 300
Lys Ser Ile Asp Asn Pro Trp Asp Arg Met Asp Glu Ile Asp Arg Arg
305 310 315 320
Phe Ala Glu Asp Lys Pro Ala Leu Ala Thr Tyr Asn Leu Lys Asp Cys
325 330 335
Glu Leu Val Thr Gin Ile Phe His Lys Thr Glu Ile Met Pro Phe Leu 340 345 350
Leu Glu Arg Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Val Asp Arg His Gly Gly 355 360 365
Ser Val Ala Ala Phe Gly His Leu Tyr Phe Pro Arg Met His Arg Ala 370 375 380
Gly Tyr Val Ala Pro Asn Leu Gly Glu Val Pro Pro His Ala Ser Pro
335 390 395 400
Gly Gly Tyr Val Met Asp Ser Arg Pro Gly Leu Tyr Asp Ser Val Leu
405 4,0 4,5
Val Leu Asp Tyr Lys Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Arg Thr Phe Leu 420 425 430 — -- Λγ/ V *. / V*?/·»/ v w .
Ile Asp Pro Val Gly Leu Val Glu Gly Met Ala Gin Pro Asp Pro Glu 435 440 445
His Ser Thr Glu Gly Phe Leu Asp Ala Trp Phe Šer Arg Glu Lys His 450 455 460
Cys Leu Pro Glu Ile Val Thr Asn Ile Trp His Gly Arg Asp Glu Ala
465 470 475 480
Lys Arg Gin Gly Asn Lys Pro Leu Ser Gin Ala Leu Lys Ile Ile Met
485 490 495
Asn Ala Phe Tyr Gly Val Leu Gly Thr Thr Ala Cys Arg Phe Phe Asp . 500 505 510
Pro Arg Leu 515 i Ala Ser Ser Ile Thr Met Arg Gly His 520 i Gin Ile Met Arg 525
Gin Thr Lys 530 Ala Leu Ile Glu Ala Gin Gly Tyr Asp Val Ile Tyr Gly 535 540
Asp Thr Asp 545 Ser Thr Phe Val Trp Leu Lys Gly Ala 550 A . 555 His Ser Glu Glu 560
Glu Ala Ala Lys Ile Gly Arg Ala Leu Val Gin His 565 570 Val Asn Ala Trp 575
Trp Ala Glu Thr Leu Gin Lys Gin Arg Leu Thr Ser 580 585 Ala Leu Glu Leu 590
Glu Tyr Glu 595 Thr His Phe Cys Arg Phe Leu Met Pro 600 Thr Ile Arg Gly 605
Ala Asp Thr 610 Gly Ser Lys Lys Arg Tyr Ala Gly Leu 615 620 Ile Gin Glu Gly
Asp Lys Gin 625 Arg Met Val Phe Lys Gly Leu Glu Thr 630 635 Val Arg Thr Asp 640
Trp Thr Pro Leu Ala Gin Gin Phe Gin Gin Glu Leu 645 650 Tyr Leu Arg Ile 655
Phe Arg Asn Glu Pro Tyr Gin Glu Tyr Val Arg Glu 660 665 Thr Ile Asp Lys 670
Leu Met Ala 675 Gly Glu Leu Asp Ala Arg Leu Val Tyr 680 Arg Lys Arg Leu 685
Arg Arg Pro 690 Leu Ser Glu Tyr Gin Arg Asn Val Pro 695 700 Pro His Val Arg
Ala Ala Arg 705 Leu Ala Asp Glu Glu Asn Gin Lys Arg 710 715 Gly Arg Pro Leu 720
Gin Tyr Gin Asn Arg Gly Thr Ile Lys Tyr Val Trp 725 730 Thr Thr Asn Gly 735
Pro Glu Pro Leu Asp Tyr Gin Arg Ser Pro Leu Asp Tyr Glu His Tyr 740 745 750
Leu Thr Arg 755 Gin Leu Gin Pro Val Ala Glu Gly Ile 760 Leu Pro Phe Ile 765
Glu Asp Asn 770 Phe Ala Thr Leu Met Thr Gly Gin Leu 775 780 Gly Leu Phe
změněný list
JUDr. Ivan KOREČEK
Advokátní a patentová kancelář 160 00 Praha 6. Na bastó sv. Jiří 9 P.O. BOX 275, 160 41 Praha β — - Česká republika
EATENTOVzé N A E OK Y

Claims (31)

  1. (.Varianta rodiny B DNA polymerasy, nemající žádnou 3' -> 5' exonukleasovou aktivitu, vyznačuj ící setím, že, uvedená polymerasa je vybrána ze skupiny, zahrnující variantu T4 DNA polymerasy, variantu E.coli DNA polymerasy II, variantu T2 DNA polymerasy a variantu T6 DNA polymerasy.
  2. 2. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že isoleucin přítomný v kodonové poloze 50 je nahrazen leucinem.
  3. 3. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že glutamová kyselina přítomná v kodonové poloze 82 je nahrazena aspartovou kyselinou.
  4. 4. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že tryptofan přítomný v kodonové poloze 213 je nahrazen serinem.
  5. 5. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že glutamová kyselina přítomná v kodonové poloze 255 je nahrazena serinem.
    změněný list
  6. 6. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že isoleucin přítomný v kodonové poloze 417 je nahrazen valinem.
  7. 7. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že alanin přítomný v kodonové poloze 737 je nahrazen valinem.
  8. 8. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že alanin přítomný v kodonové poloze 743 je nahrazen valinem.
  9. 9. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že aspartová kyselina přítomná v kodonové poloze 112 je nahrazena alaninem.
  10. 10. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že isoleucin přítomný v kodonové poloze 114 je nahrazen leucinem.
  11. 11. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že aspartová kyselina přítomná v kodonové poloze 219 je nahrazena alaninem.
  12. 12. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, změněný list že aspartová kyselina přítomná v kodonové poloze 324 je nahrazena alaninem.
  13. 13. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje t- í m, že aspartová kyselina přítomná v kodonové poloze 156 je nahrazena alaninem.
  14. 14. Varianta B DNA polymerasy podle nároku 1, kde uvedená varianta T4 DNA polymerasy se vyznačuje tím, že glutamová kyselina přítomná v kodonové poloze 158 je nahrazena alaninem.
  15. 15. Způsob sekvenování DNA, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje stupně uvedení do styku polymerasy s primovaným DNA řetězcem, který má být sekvenován za přítomnosti dATP, dGTP, dTTP a prvním řetězec terminujícím nukleotidem vybraným ze skupiny, zahrnující ddATP a 3'-amino-23'dideoxy-ATP, druhým řetězec terminujícím nukleotidem vybraným ze skupiny, zahrnující ddGTP a 3'-amino-2',3'dideoxy-GTP, třetím řetězec terminujícím nukleotidem vybraným ze skupiny, zahrnující araCTP a 3'-amino-2',3'dideoxy-CTP a čtvrtým řetězec terminujícím nukleotidem vybraným ze skupiny, zahrnující araUTP a 3'-amino-23'dideoxy-TTP a ponechání tohoto styku probíhat za reakčních podmínek pro zachování polymerásové aktivity po dobu dostačující k získání sekvenční informace.
  16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m,že uvedeným prvním řetězec terminujícím nukleotidem je ddATP, uvedeným druhým řetězec terminujícím nukleotidem je ddGTP, uvedeným třetím řetězec terminujícím nukleotidem je *
    změněný list araCTP a uvedeným čtvrtým řetězec terminujícím nukleotidem je araUTP.
  17. 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m,že polymerasou je varianta T4 polymerasy. .....
  18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se t í m,že dále obsahuje alespoň jeden průvodní protein, který tvoří komplex s uvedenou variantou T4 polymerasy, čímž zvyšuje výkonnost uvedené varianty T4 polymerasy.
  19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačuj ící se t í m,že průvodní protein je vybrán ze skupiny, zahrnující T4 genové produkty 32, 41, 45 a 44/62 komplex.
  20. 20. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m,že variantou polymerasy je varianta E.coli DNA polymerasy II.
  21. 21. Způsob podle nároku 20,vyznačuj ící se t í m,že dále obsahuje alespoň jeden průvodní protein, který tvoří komplex s variantou E.coli DNA polymerasy II, čímž zvyšuje výkonnost uvedené varianty E.coli DNA polymerasy II.
  22. 22. Způsob podle nároku 21,vyznačuj ící se t í m,že uvedený průvodní protein je kombinace β proteinu, gama komplexu a SSB proteinu.
  23. 23. Způsob podle nároku 15, vyznačující se t í m,že uvedeným prvním řetězec terminujícím nukleotidem je 3'-amino-2',3'dideoxy-ATP, druhým řetězec terminujícím nukleotidem je a 3'-amino-2',3'dideoxy-GTP, třetím řetězec terminujícím nukleotidem je 3'-amino-2',3'dideoxy-CTP změněný list a čtvrtým řetězec terminujícím nukleotidem je 3'-amino-23'dideoxy-TTP.
  24. 24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se t í m,že polymerasa je vybrána ze skupiny, zahrnující T4 polymerasu, varianty T4 polymerasy.
  25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se t í m,že dále obsahuje alespoň jeden průvodní protein, který tvoří komplex s T4 polymerásou nebo variantou T4 polymerasy, čímž zvyšuje výkonnost uvedené T4 polymerasy nebo varianty T4 polymerasy.
  26. 26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se t í m,že průvodní protein je vybrán ze skupiny, zahrnující T4 genové produkty 32, 41, 45 a 44/62 komplex.
  27. 27. Způsob podle nároku 23,vyznačující se t í m,že variantou polymerasy je E.coli DNA polymerasa II a varianta E.coli DNA polymerasy II.
  28. 28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se t i m,že dále obsahuje alespoň jeden průvodní protein, který tvoří komplex s E.coli DNA polymerásou II nebo variantou E.coli DNA polymerasy II, čímž zvyšuje výkonnost uvedené E.coli DNA polymerasy II varianty E.coli DNA polymerasy II.
  29. 29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se t í m,že uvedený průvodní protein je kombinace β proteinu, gama komplexu a SSB proteinu.
  30. 30. Způsob sekvenování DNA, vyznačující se t í m, že zahrnuje stupně změněný list uvedení do styku varianty T4 DNA polymerasy, která nemá žádnou 3'->5' exonukleasovou aktivitu, s primovaným DNA řetězcem, který má být sekvenován, za přítomnosti standardního nukleotidu, přičemž koncentrace jednoho ze standardních nukleotidů je velmi nízká ve srovnání s koncentrací jiných standardních nukleotidů a ponechání proběhnutí uvedeného styku za reakčních podmínek pro zachování polymerasové aktivity po dobu dostačující k získání sekvenční informace.
  31. 31. Způsob identifikace a izolace variantních T4 DNA polymeras, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně identifikace T4 kmenů, majících variantní T4 DNA polymerasy defektní v některém aspektu DNA replikace, izolace dalších modifikovaných forem uvedených variantních T4 DNA polymeras selekcí v E.coli optAl hostiteli, izolaci T4 kmenů, které obsahuji varianty T4 DNA polymeras, mající alespoň jednu další mutaci, která opravuje nebo kompenzuje uvedený defekt v DNA replikaci, identifikace další opravující/kompenzující mutace(í) v uvedených variantích T4 DNA polymerasách a zavedení uvedené identifikované opravující/kompenzující mutace(í) T4 DNA polymeras do T4 fágových nebo T4 DNA polymerasových expresních vektorů. / A ?í
    NUKLEOTIDOVÉ STRUKTURY
    2'-DEOXYRIBONUKLEOSIDTRIFOSFÁTY (dNTF)
    HN o A
    -4OjPjOCH2'0^ ° ^N·
    -40jPj0CH2.0.
    -4,
    OH dJTP
    -4,
    0jPj0CH2 o
    OH dCTP
    OH dÁTP N h2n^^n
    -4,
    2' ,3 ' -DIDPOXYRIBONUKLEOSIDTRIFOSFATY (ddNTP)
    B
    0jP30CH2.0'
    B=Thy
    B=Cyt
    B=Gua
    B=Ade
    0jP30CH2n
    OH dfíTP
    -r
    3'-AMINO-2'DEOXYRIBONUKLEOSIDTRIFOSFÁTY (3'-NH2-ddNTF)
    -4.
    OjP3OCH2/0,
    NH,
    B=1hy
    B=Cyt
    B=Gua
    B=Ade
    ARABINONUKLEOSIDTRIFOSFATY (araNTP) B
    OjPjOCfy/O.
    H0t
    OH
    Ura=
    HN
    Λ
    B=Ura
    B=Cyt ob
    - .1
    1/6
    RECTJFJED SHEET (RULE 91)
    JSA/EP
    Pol H exo :*W· «ΜΜ* -«WO* •*«Mť
    M* iWĚě
    S®» <Rížgř , . . ·»·*<*·
    1234567
    2/6
    RECTIFIEO SHEET (RULE 91)
    ISA/EP
    1234567
    3/6
    RECTIFJED SHEET (RULE 91)
    ISA/EP
    ΟΊοι~ . 2C _____________
    Pol n exo T4 exo MnCl 2
    1234 1234
    4/6
    RECT1FIED SHEET (RULE 91) ISA/EP + 19 — v
    +9 —
    5/6
    RECTIFIED SHEET (RULE 91)
    ISA/EP
    26mer
    ->-· —5 10 (MIN) 5 10 (MIN) 5 10 (MIN) 43+ EXO- 17 Mel 62
    6/6
    RECTIFIEO SHEET (BULE 91)
    ISA/EP
CZ96306A 1993-08-02 1994-08-01 Dna sequencing enzymes CZ30696A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/101,593 US5547859A (en) 1993-08-02 1993-08-02 Chain-terminating nucleotides for DNA sequencing methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ30696A3 true CZ30696A3 (en) 1996-06-12

Family

ID=22285458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ96306A CZ30696A3 (en) 1993-08-02 1994-08-01 Dna sequencing enzymes

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5547859A (cs)
EP (1) EP0713535A1 (cs)
JP (1) JPH09509301A (cs)
KR (1) KR960704067A (cs)
CN (1) CN1132529A (cs)
AU (1) AU699498B2 (cs)
BG (1) BG100188A (cs)
BR (1) BR9407403A (cs)
CA (1) CA2168471A1 (cs)
CZ (1) CZ30696A3 (cs)
FI (1) FI960469A (cs)
HU (1) HUT75841A (cs)
LV (1) LV11486B (cs)
NO (1) NO960408L (cs)
NZ (1) NZ269727A (cs)
PL (1) PL312836A1 (cs)
SK (1) SK14196A3 (cs)
WO (1) WO1995004162A2 (cs)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5614365A (en) * 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
EP0910664A1 (en) * 1996-04-15 1999-04-28 University Of Southern California Synthesis of fluorophore-labeled dna
US5827716A (en) * 1996-07-30 1998-10-27 Amersham Life Science, Inc. Modified Pol-II type DNA polymerases
US6291164B1 (en) * 1996-11-22 2001-09-18 Invitrogen Corporation Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
WO1999057321A1 (en) * 1998-05-01 1999-11-11 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and dna molecules
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US20040009486A1 (en) 1999-10-29 2004-01-15 Sorge Joseph A. Compositions and methods utilizing DNA polymerases
AU1239901A (en) * 1999-10-29 2001-05-14 Stratagene Compositions and methods utilizing dna polymerases
ATE356222T1 (de) 2000-10-06 2007-03-15 Univ Columbia Massives parallelverfahren zur dekodierung von dna und rna
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US7057026B2 (en) * 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
DK3363809T3 (da) * 2002-08-23 2020-05-04 Illumina Cambridge Ltd Modificerede nukleotider til polynukleotidsekvensering
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
DE602005020421D1 (de) 2004-02-19 2010-05-20 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur analyse von polynukleotidsequenzen
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
ATE507305T1 (de) 2004-05-25 2011-05-15 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur nukleinsäureimmobilisierung
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
GB0517097D0 (en) 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
US20090305248A1 (en) * 2005-12-15 2009-12-10 Lander Eric G Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
EP2071927A2 (en) 2006-09-28 2009-06-24 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
GB2457402B (en) 2006-12-01 2011-10-19 Univ Columbia Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
US20110014611A1 (en) 2007-10-19 2011-01-20 Jingyue Ju Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequences by synthesis
EP3431615A3 (en) 2007-10-19 2019-02-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators cleavable label modified nucleotide terminators
US7811810B2 (en) 2007-10-25 2010-10-12 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
CA2713909C (en) 2008-02-01 2023-12-12 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions
EP2475988B1 (en) 2009-09-09 2018-11-14 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles
EP2475989A4 (en) 2009-09-09 2013-02-27 Gen Hospital Corp USE OF MICROVESICLES IN THE ANALYSIS OF KRAS MUTATIONS
WO2012031008A2 (en) 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
EP2638057B1 (en) 2010-11-10 2019-03-06 Exosome Diagnostics, Inc. Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom
CA2887058C (en) 2012-10-03 2022-02-22 Exosome Diagnostics, Inc. Use of microvesicles in diagnosis, prognosis, and treatment of medical diseases and conditions
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
EP2970356B1 (en) 2013-03-15 2018-05-30 Illumina Cambridge Limited Modified nucleosides or nucleotides
US10451544B2 (en) 2016-10-11 2019-10-22 Genotox Laboratories Methods of characterizing a urine sample

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666892A (en) * 1984-03-06 1987-05-19 Sloan-Kettering Memorial Cancer Center Method and composition for hepatitis treatment with pyrimidine nucleoside compounds
DE3546374A1 (de) * 1985-12-31 1987-07-02 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur sequenzanalyse von dna
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
US4935361A (en) * 1986-09-18 1990-06-19 Yale University Cloning and expression of T4 DNA polymerase
US4942130A (en) * 1987-01-14 1990-07-17 President & Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5102785A (en) * 1987-09-28 1992-04-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of gene mapping
US4962020A (en) * 1988-07-12 1990-10-09 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
US5001050A (en) * 1989-03-24 1991-03-19 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHφ29 DNA polymerase
WO1991006679A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Stratagene An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
DE4214112A1 (de) * 1991-08-02 1993-02-04 Europ Lab Molekularbiolog Neues verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren
US5316948A (en) * 1992-09-04 1994-05-31 Life Technologies, Inc. N4 -methyl-2'-deoxycytidine 5'-triphosphate and its use in polymerase-catalyzed nucleic acid syntheses
US5541311A (en) * 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US5436149A (en) * 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995004162A2 (en) 1995-02-09
WO1995004162A3 (en) 1995-06-01
NO960408D0 (no) 1996-01-31
LV11486A (lv) 1996-08-20
JPH09509301A (ja) 1997-09-22
EP0713535A1 (en) 1996-05-29
BG100188A (en) 1996-12-31
SK14196A3 (en) 1996-06-05
CN1132529A (zh) 1996-10-02
FI960469A0 (fi) 1996-02-01
LV11486B (en) 1997-02-20
CA2168471A1 (en) 1995-02-09
NO960408L (no) 1996-03-27
US5660980A (en) 1997-08-26
AU7408894A (en) 1995-02-28
HU9600235D0 (en) 1996-03-28
KR960704067A (ko) 1996-08-31
PL312836A1 (en) 1996-05-13
FI960469A (fi) 1996-03-27
HUT75841A (en) 1997-05-28
NZ269727A (en) 1997-11-24
BR9407403A (pt) 1996-11-05
US5547859A (en) 1996-08-20
AU699498B2 (en) 1998-12-03
US5928919A (en) 1999-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ30696A3 (en) Dna sequencing enzymes
EP0866796B1 (en) Improvements in or relating to mutagenesis of nucleic acids
US6485909B1 (en) DNA polymerase having ability to reduce innate selective discrimination against fluorescent dye-labeled dideoxynucleotides
EP1934339B1 (en) Thermostable viral polymerases and methods of use
EP0854196B1 (en) Method for the uncoupled, direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules with the addition of a second thermostable DNA polymerase and its application
EP0849364A1 (en) Method for the direct, exponential amplification and sequencing of DNA molecules and its application
US20050287592A1 (en) Template-dependent nucleic acid polymerization using oligonucleotide triphosphates building blocks
EP0265293A2 (en) T7 DNA polymerase
CZ229997A3 (cs) Enzym tepelně stálé DNA polymerázy, způsob jeho přípravy a kit, který ho obsahuje
CN110741092A (zh) 扩增dna以维持甲基化状态的方法
US7060440B1 (en) Template-dependent nucleic acid polymerization using oligonucleotide triphosphates building blocks
US20120184017A1 (en) Mutant dna polymerases and uses therof
US20120083018A1 (en) Thermostable dna polymerases and methods of use
US20220127587A1 (en) Polymerase enzyme from pyrococcus furiosus
US20050089910A1 (en) DNA polymerase having ability to reduce innate selective discrimination against fluorescent dye-labeled dideoxynucleotides
US12006519B2 (en) Polymerase mutants and use with 3′-OH unblocked reversible terminators
KR100689795B1 (ko) 복합체 형성 방법
US20100291638A1 (en) Thermostable dna polymerases and methods of use
JP2004135628A (ja) Ｄｎａの変異導入法