HUT75841A - Dna sequencing enzymes - Google Patents

Dna sequencing enzymes Download PDF

Info

Publication number
HUT75841A
HUT75841A HU9600235A HU9600235A HUT75841A HU T75841 A HUT75841 A HU T75841A HU 9600235 A HU9600235 A HU 9600235A HU 9600235 A HU9600235 A HU 9600235A HU T75841 A HUT75841 A HU T75841A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
variant
dna polymerase
polymerase
dna
lys
Prior art date
Application number
HU9600235A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9600235D0 (en
Inventor
Myron F Goodman
Linda J Reha-Krantz
Original Assignee
Univ Alberta
Univ Southern California
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Alberta, Univ Southern California filed Critical Univ Alberta
Publication of HU9600235D0 publication Critical patent/HU9600235D0/hu
Publication of HUT75841A publication Critical patent/HUT75841A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

A jelen találmány tárgyát az F. Sanger által kifejlesztett DNS szekvenálási módszer módosítása [Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A.R.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 74, 5463-5467 (1977)], valamint a DNS szekve náláshoz használható új enzimek képezik. A Sanger módszer in vitro DNS szintézis reakciókon alapul, DNS templát, 2'-dezoxiribonukleozid-trifoszfátok (dNTP-k, lásd 1. ábra) és 2',3'-didezoxíribonukleotid-trifoszfátok (ddNTP-k, lásd 1. ábra) jelenlétében. Ez utóbbiak, ha a DNS polimeráz révén beépülnek egy polinukleotid láncba, akkor leállítják a további láncnövekedést. A DNS termék tehát egy sorozat, a templáttal komplementer és specifikus didezoxinukletodi-dokkal záródó polinukleotid lánc. A DNS szekvenálási termékek méret alapján szétválaszthatok, és a termékek mintázata adja a DNS szekvenciát.
Elvileg számos különböző szervezetből származó DNS polimeráz és számos különböző lánclezáró nukleotid használható a DNS szekvencia meghatározásához. A gyakorlatban csak néhány DNS polimerázról és lánclezáró nukleotidról derült ki, hogy alkalmas erre a célra. Egy DNS szekvenáló polimerázra példaként a bakteriofág T7 DNS polimeráz, a Sequenase™ kifejlesztését foglaljuk össze [Tábor, S. és
Richardson, C.C.: Journal of Biological Chemistry 265, 8322-8328 (1990)]. Ahhoz, hogy egyértelmű DNS szekvenciát kapjunk, arra van szükség, hogy a szekvenálás termékeinek többsége egy didezoxinukleotiddal végződjön, és minden szekvenálási termék azonos mennyiségben forduljon elő. A T7 fág DNS polimeráz két aktivitása elbontja a DNS szekvenálási termékeket, így ezeket az aktivitásokat eliminálni kell ►
- 2ahhoz, hogy megakadályozzuk a didezoxinukleotidra végződő termékek lebomlását. Az egyik aktivitást, a 3'-5' exonukleáz aktivitást a T7 DNS polimeráz exonukleáz deficiens variánsának elkészítésével távolítjuk el. A T7 DNS polimeráznak van pirofoszforiláz aktivitása is, amely képes lebontani a szekvenálás termékeit. A DNS szekvenálási reakcióban keletkező pirofoszfát lebontására pirofoszfatázt adunk a reakcióelegyhez; pirofoszfát nélkül nincs pirofoszforolízis. A szekvenálási reakció további finomítása az Mn2+ ionok alkalmazása az Mg++ ionok helyett, ami a reakciótermékek egyenletesebb eloszlását eredményezi. Jóllehet a T7 DNS polimeráz egy szekvenáló polimerázzá való átalakításának ez a rövid összefoglalása egyszerűsítés, az összefoglalás illusztrálja azt az állítást, hogy egy természetes DNS polimeráz módosítása, valamint a reakciókörülmények kifejlesztése szükséges ahhoz, hogy jó minőségű DNS szekvencia információt kapjunk a láncterminációs szekvenálási módszerrel.
A láncterminációs módszerrel még nem sikerült elérni az optimális DNS szekvenálási körülményeket. Még mindig megfigyelhetők kétértelmű szekvenálási információk, ami szükségessé teszi, hogy mindkét DNS szál DNS szekvenciáját meghatározzuk. Emellett az Mn++ használata az Mg++ helyett megnöveli a szekvenálási reakcióban szükséges DNS templát mennyiségét. Tehát előnyös lenne olyan új módszerek kifejlesztése, amelyek javítják, vagy kiegészítik a meglévő szekvenálási eljárásokat.
A vad típusú T4 DNS polimeráz gént klónozták és a fehérjeterméket expreszszálták [Lin, T.-C., Rush, J. R., Spicer, E.K. és Konogsberg, W.H.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84, 7000-7004 (1987); Lin és munkatársai: 4,935,361 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi bejelentés], emellett az Escherichia coli DNS polimeráz ll-t is klónozták és expresszálták [Bonner, C. A., Hays, S., McEntee, K. és Goodman, M. F.: Proceedings of the National Academy of
- 3Sciences, USA 87, 7663-7667 (1990)]. Standard oligonukleotiddal vezérelt mutagenezis technikát használtak a T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II új formáinak előállítására. így megvan a lehetőség arra, hogy gazdaságosan, nagy mennyiségben előállítsuk a vad típusú és variáns T4 DNS polimerázt valamint Escherichia coli DNS polimeráz ll-t.
A találmány tárgya tovább genetikai elemzés alkalmazása olyan DNS polimerázok azonosítására, amelyek a DNS szekvenálás céljára használható tulajdonságokkal rendelkeznek. A T4 DNS polimeráz egyike a genetikailag legalaposabban jellemzett DNS polimerázoknak [Reha-Krantz, L.J.: Molecular Biology of Bacteriophage T4; szerk.: Karam, J.; American Association fór Microbiology, in pressj; így a már azonosított néhány mutáns DNS polimeráznak lehetnek a DNS szekvenálásban használható tulajdonságai, és új mutánsok közvetlenül izolálhatok. Egy olyan módszernek, amellyel új, hasznos DNS szekvenálási tulajdonságokkal rendelkező T4 DNS polimerázokat lehet izolálni, további haszna lehet.
A találmány tárgyát új, DNS szekvenáló polimerázként használható enzimek képezik. Ezek az enzimek a B családba tartozó DNS polimerázokból származnak genetikai mutációk révén. Ezek a mutációk eliminálják ezeknek az új, B DNS polimerázoknak a 3'-5' exonukleáz aktivitását.
A találmány tárgyát képezik továbbá azok a módszerek, amelyek lehetővé teszik hogy a T4 DNS polimerázt és az Escherichia coli DNS polimeráz ll-t DNS szekvenáló polimerázokként lehessen használni. Azokat a DNS polimeráz módosításokat, amelyek a T4 fág DNS polimerázt és az Escherichia coli DNS polimeráz ll-t DNS szekvenáló polimerázokká alakítják, arra is lehet használni, hogy hasonlóképpen módosítsák az olyan DNS polimerázokat, amelyeknek az említett két polimerázhoz hasonló a fehérje szekvenciája. A T4 DNS polimerázhoz és az Escherichia coli DNS polimeráz ll-höz hasonló fehérje szekvenciával rendelkező DNS polimerázok közé tartozik anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a DNS polimerázok egy csoportja, az úgynevezett B család DNS polimerázok [Braithwaite, D.K. és lto,
J.: Nucleic Acids Research 21, 787-802 (1993)]. Különösen fontosak a T2 és T6 fágokból származó DNS polimerázok, amelyek kiterjedt fehérje szekvencia homológiával rendelkeznek a T4 DNS polimerázzal összehasonlítva. Az itt ismertetett módszereknek egy további kiterjesztése, hogy a T4 DNS polimerázzal és az Escherichia coli DNS polimerázzal funkcionális hasonlósággal rendelkező DNS polimerázok is használhatók arra, hogy a lánclezáró nukleotidokra és az alábbiakban ismertetett módszerekre vonatkozó DNS szekvencia információt nyerjünk belőlük.
A jelen találmány tárgya továbbá eljárás DNS polimeráz módosítások azonosítására, amelyek egy vagy több specifikus aminosav helyettesítést tartalmaznak a polimeráz fehérjeszekvenciájában, amelyek megjavítanak egy adott DNS polimerázt a DNS szekvenálásban való alkalmazhatóság szempontjából.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábrán a jelen találmány végrehajtása során alkalmazott standard nukleotidok és nukleotid analógok képlete látható.
A 2. ábrán DNS szekvenáló gélek láthatók, amelyeket a variáns Escherichia coli DNS polimeráz II és a T4 DNS polimeráz alkalmazásával kaptunk.
A 3. ábrán egy DNS szekvenáló gél látható, amelyben a dATP-t a többi standard nukleotidhoz viszonyítva nagyon alacsony koncentrációban használtuk.
A 4. ábrán egy templát abázikus hely (X) utáni primer extenzió látható, vad típusú és mutáns T4 DNS polimerázokkal.
A találmány összes célját, azaz olyan új, módosított DNS polimerázok azonosítását, amelyek javítják a módosított DNS polimerázoknak azt a képességét, hogy DNS szekvenálási reakciókat hajtsunk végre, úgy érjük el, hogy egy olyan új genetikai szelekciós stratégiát tervezünk, amellyel azonosítani lehet az alaposan meg• · · « javított DNS replikációs aktivitással rendelkező DNS polimerázokat. Az új genetikai szelekciós stratégiát a T4 DNS polimeráz köré terveztük.
A T4 DNS polimeráz (3. és 4. számú szekvencia) és az Escherichia coli DNS polimeráz II (5. és 6. számú szekvencia), amelyeket eddig nem lehetett szekvenáló polimerázokként alkalmazni, szekvenáló polimerázokként használhatók a Sanger típusú reakciókban, ha a lánclezáró nukleotidok nem-standard, vagy új kombinációját alkalmazzuk. Ehhez a felfedezéshez tartozik az is, hogy a 3'-5' exonukleáz aktivitás inaktiválása a T4 DNS polimerázban és az Escherichia coli DNS polimeráz ll-ben javítja a kapott DNS szekvencia-információ minőségét. Emellett további polimeráz módosításokat is felfedeztünk, amelyeknek, ha egyéb, a 3'-5' exonukleáz aktivitás csökkentését eredményező módosításokkal kombináljuk őket, megvan a potenciáljuk, hogy egy többszörösen módosított, előnyös DNS szekvenálási tulajdonságokkal rendelkező DNS polimerázt eredményezzenek. Mivel a T4 DNS polimerázzal kiterjedt szekvencia homológiával rendelkeznek, a T2 fág DNS polimeráz (1. és 2. számú szekvencia) és a T6 fág DNS polimeráz különösen alkalmas arra, hogy a jelen találmány szerinti módszerben alkalmazzuk őket.
A T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II is hatékonyan alkalmazható DNS szekvenáló polimerázként, ha az arabinonukleotidokat (1. ábra), azaz az araUTP-t és az araCTP-t használjuk a standard lánclezáró nukleotidok, azaz a ddTTP és a ddCTP helyett. A standard purin didezoxinukleotidok (1. ábra), azaz a ddATP és a ddGTP hatékony lánclezáró nukleotidok a T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II számára. A T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II esetében a DNS szekvenálási reakciókörülmé-nyek eltérnek a standard DNS szekvenálási reakciókörülményektől, mivel a lánclezáró nukleotidoknak egy új kombinációját használjuk. Jóllehet elvileg bármely lánclezáró nukleotid használható, a DNS polimerázoknak lényegesen eltérő az arra vonatkozó képessé- 6ge, hogy ezeket a nukleotidokat mennyire tudják beépíteni a DNS láncba. A T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II esetében, mivel ezek az enzimek alacsony szinten építik be a ddTTP és a ddCTP lánclezáró nukleotidokat, ez nem teszi lehetővé, hogy ezeket a standard nukleotidokat használjuk a szekvenálási protokollokban. Az a felfedezés, hogy az alternatív lánclezáró arabinonukleotidokat, azaz az araCTP-t és az araUTP-t a T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II viszonylag hatékonyan beépíti a láncba, lehetővé teszi, hogy ezeket a DNS polimerázokat szekvenáló polimerázokként tudjuk használni. A DNS szekvenálási módszert, amely a lánclezáró nukleotidok új kombinációját alkalmazza, azaz az araCTP, araUTP, ddATP és ddGTP kombinációt, az alábbiakban, az 1. módszer leírásában ismertetjük.
További felfedezés, hogy a T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II 3'-5' exonukleáz aktivitásának jelentős csökkentése fokozza az 1. módszer szerinti szekvenáló reakciókkal kapott DNS szekvencia információ minőségét. A T4 DNS polimeráz 3'-5' exonukleáz aktivitása jelentősen csökkenthető egy aminosav helyettesítéssel, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, azt hogy az enzimben egyet vagy többet elvégzünk az alábbi aminosav helyettesítések közül: D112A+E114A, D219 és D324A. Az említett nomenklatúrában, amelyet a továbbiakban végig alkalmazunk, az aminosavak egybetűs kódját használjuk. Az aminosavak egybetűs kódja mellett álló számok a kodon sorszámok. Példáuk, D112A+E114A azt mutatja, hogy a 112-es pozícióban egy alanint (A) aszparaginsavra cserélünk ki. A D112A+E114A azt mutatja, hogy két aminosav módosítás van a módosított DNS polimerázban. Ahhoz, hogy ezeket a variánsokat megkapjuk, az alábbi mutációkat alkalmazzuk: a D112A esetében a 334-es pozícióban levő A nukleotidot egy C nukleotiddal helyettesítjük, ezáltal a D aminosavat egy A aminosavra cseréltük ki (amint az a szakterületen jártas szakember számára
- 7nyilvánvaló, más nukleotid változtatások is alkalmasak ugyanennek a változásnak a kiváltására); az E114 esetében a 340-es pozícióban levő A nukleotidot egy C nukleotidra cseréljük ki (amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, más nukleotid változtatások is alkalmasak ugyanennek a változásnak a kiváltására); A D219A esetében a 655-ös és 656-os pozícióban levő A és C nukleotidokat cseréljük ki C és G nukleotidokra (amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, más nukleotid változtatások is alkalmasak ugyanennek a változásnak a kiváltására); és a D324A változtatásnál a 970-es pozícióban levő A nukleotidot egy C nukleotiddal helyettesítjük (amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, más nukleotid változtatások is alkalmasak ugyanennek a változásnak a kiváltására). Az Escherichia coli DNS polimeráz II 3'-5' exonukleáz aktivitását jelentősen csökkenteni lehet egy aminosav helyettesítéssel, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbi aminosav helyettesítéseket:
D156A+E158A. A variánsok kialakításához az alábbi mutációkat alkalmazzuk: a
D156A esetében a 467-es pozícióban levő nukleotidot helyettesítjük egy C nukleotiddal (amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, más nukleotid változtatások is alkalmasak ugyanennek a változásnak a kiváltására); az E158A esetében a 473-as pozícióban levő A nukleotidot helyettesítjük egy C nukleotiddal (amint az a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, más nukleotid változtatások is alkalmasak ugyanennek a változásnak a kiváltására). A T4 DNS polimeráz és az Escherichia coli DNS polimeráz II 3'-5' exonukleáz deficiens variánsainak készítését standard oligonukleotid mutagenezis eljárással végezzük [Kunkle, T.A., Roberts, J.D és Zakour, R.A.: Methods in Enzymology 154, 367-382 (1987)].
A találmány egyéb célkitűzését úgy érhetjük el, hogy a standard DNS szekvenálási reakciókban nem használt lánclezáró nukleotidokat használunk. Mind a T4
DNS polimeráz mind az Escherichia coli DNS polimeráz II hatékonyan alkalmazható DNS szekvenáló polimerázként, ha 3'-amino-2',3'-didezoxiribonukleotidokat (3'-NH2dNTP-k) (1. ábra) használunk a standard ddNTP-k helyett. Ezt a szekvenáló módszert a későbbiekben all. módszerben írjuk le. Módosítatlan (vad típusú) T4 DNS polimeráz és 3'-5' exonukleáz deficiens variánsok használhatók a II. módszerben ismertetett reakciókban; az Escherichia coli DNS polimeráz 3'-5' exonukleáz deficiens variánsát is sikeresen lehet alkalmazni a II. módszer reakcióiban.
A T4 DNS polimeráz 3'-5' exonukleáz deficiens formája is használható DNS szekvencia információ előállítására nukleotid analógok alkalmazása nélkül, ha a négy standard dNTP közül az egyiknek alacsony a koncentrációja. Például, ha a dGTP, a dCTP és a dTTP koncentrációja 100 μιτιοΙ/l, és a dATP koncentrációja 0,1 pmol/l-től 1 pmol/l-ig terjed, akkor szekvenálási termékek figyelhetők meg, amelyek egy pozícióval azelőtt érnek véget, mielőtt dATP-nek kellene beépülnie. Párhuzamos reakciókkal, mindegyikben az egyik dNTP alacsony koncentrációban van jelen, és a másik három dNTP nagy koncentrációban van jelen, a DNS szekvencia meghatározható. Ezt a szekvenálási módszert a későbbiekben a III. módszer leírásánál ismertetjük.
A harmadik célkitűzést, nevezetesen azt, hogy új tulajdonságokkal rendelkező variáns vagy módosított DNS polimerázokat azonosítsunk, amelyek lehetővé teszik, hogy a polimeráz megjavult szekvenálási tulajdonságokkal rendelkezzen, úgy lehet elérni, hogy új stratégiát tervezünk az új DNS polimerázok szelektálására. Az új stratégiát, egy bizonyos típusú genetikai szelekciót a T4 fághoz fejlesztettük ki. Az alapstratégia egy olyan T4 fág törzzsel kezdődik, amelynek egy vagy több mutációja van a DNS polimeráz génjében, amelynek az eredménye egy variáns (mutáns) DNS polimeráz, amely a DNS replikáció bizonyos részeiben részlegesen defektes. A DNS polimeráz módosításoknak számos típusa képes csökkenteni a DNS polimeráznak
- 9•··* «· ·· • · · · • · · · • · ♦ · · • «· ·» azt a képességét, hogy hatékonyan replikálja a DNS-t. Ha például megváltozik a DNS polimeráznak az a képessége, hogy megkösse a DNS templátot vagy a dNTPket, vagy megváltozik az a képessége, hogy transzlokálódjon a DNS templát mentén, ez mind csökkenti a DNS replikáció hatékonyságát. A T4 fág esetében könnyen lehet csökkent DNS replikációs aktivitással rendelkező DNS polimeráz mutánsokat azonosítani. Azok a T4 fág törzsek, amelyek olyan mutáns DNS polimerázokat tartalmaznak, amelyek részlegesen károsított DNS replikációval rendelkeznek, nem képesek DNS-t szintetizálni, ha a fertőzésre használt baktérium gazdasejt az optA1 mutációt tartalmazza. Másszóval, az Escherichia coli optA1 gazdasejtben a T4 törzseknek korlátozott a növekedésük a DNS replikációs aktivitásban defektív, mutáns DNS polimerázzal. Az Escherichia co// optA1 törzsnél megfigyelt korlátozás alapja az, hogy fokozott mennyiségben keletkezik a dGTP-t lebontó enzim [Wurgler, S.S., és Richardson, C.C.: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 2740-2744 (1990)]. Tehát a csökkent DNS replikációs aktivitással rendelkező variáns DNS polimerázok nem képesek a DNS replikálására, és fág utódok létrehozására, ha a nukleotid tartalékok, főleg a dGTP-é, lecsökkennek.
Egy genetikai szelekciós stratégia alapján olyan körülményeket hoztunk létre, amelyek használhatók DNS replikációban defektív DNS polimerázok azonosítására, valamint utódok létrejöttének korlátozására olyan fágokból, amelyek ilyen defektív DNS polimerázokat tartalmaznak, nevezetesen a fág utódok korlátozott létrejöttének előidézésére Escherichia co// optA1 gazdasejtek fertőzése esetében. Ezek a körülmények, amelyeket az alábbiakban ismertetünk, lehetővé teszik, hogy további módosított (mutált) DNS polimerázokat szelektáljunk, amelyek sokkal jobb DNS replikációs képességekkel rendelkeznek. Ha a csökkent DNS replikációs aktivitással rendelkező variáns DNS polimerázokat tovább módosítjuk, például egy vagy több további aminosav helyettesítésével, akkor előfordulhat, hogy az újonnan bevitt mutációk/aminosav • · · * · ·
-10- ........
helyettesítések kijavítják, vagy kompenzálják a DNS replikációs aktivitás induló hibáját. Az ilyen további módosított DNS polimerázok képesek lesznek a DNS replikációjára az Escherichia coli optA1 gazdaszervezetben és fágutódok keletkeznek. Tehát ha fágutódokat mutatunk ki az Escherichia coli optA1 gazdasejtekben olyan fággal való fertőzés után, amelyből korábban korlátozottan keletkeztek utódok, akkor ez lehetővé teszi, hogy többszörösen mutáns DNS polimerázokat szelektáljunk, amelyek rendelkeznek a kiindulási mutációval (olyan aminosav helyettesítés, amely csökkenti a DNS replikációs aktivitást), valamint egy vagy több új mutációval, amelyek további aminosav helyettesítéseket kódolnak, amelyek kijavítják vagy kompenzálják a kiindulási DNS replikációs hibát. Az új javító vagy kompenzáló mutációk (a genetikában ezeket szuppresszor mutációknak is nevezik) azonosíthatók, ha standard eljárásokkal szekvenáljuk a fág DNS polimeráz gént [McPheeters, D.s., Christensen, A., Young, E.T., Stormo, G. és Gold, L.: Nucleic Acids Research 14, 5813-5826 (1986); Reha-Krantz, L.J.: Journal of Molecular Biology 202, 711-724 (1988)]. Az új mutációk bevihetők a fág DNS polimeráz génbe vagy a T4 DNS polimeráz expressziós vektorokba, a további tanulmányozás céljából. A kiindulási T4 fág DNS polimerázokkal ellentétben, amelyek csökkent DNS replikációs képességekkel rendelkeznek, az új variáns DNS polimerázok sokkal jobb DNS replikációs képességekkel rendelkeznek, mivel ezeket a variáns DNS polimerázokat azon az alapon szelektáltuk, hogy képesek leküzdeni, kompenzálni vagy kijavítani a csökkent DNS replikációs aktivitással rendelkező variáns DNS polimerázban levő hibákat. A sokkal jobb variáns DNS polimerázok azonosítására irányuló genetikai stratégia nagyon érzékeny, mivel egyetlen, az előzőkben ismertetett tulajdonságokkal rendelkező fág szelektálható 10θ-10θ fág közül.
A találmány tárgya továbbá, hogy a sokkal jobb DNS replikációs aktivitással rendelkező variáns DNS polimerázok a DNS szekvenáló polimerázok számára > « hasznos tulajdonságokkal rendelkeznek, azaz például fokozott primer extenzióval, amely a szekvenáló termékek egyenletesebb eloszlását, valamint fokozott DNS replikációt eredményez azokban a templát régiókban, amelyek gátolhatják vagy akadályozhatják a módosítatlan DNS polimerázokkal végzett replikációt. A T4 DNS polimeráz variánsokról, amelyek sokkal jobb DNS replikációs képességekkel rendelkeznek, megjósolható, hogy fokozzák az I., II. és III. módszerrel kapott DNS szekvencia információ minőségét.
Az előzőkben ismertetett genetikai szelekciós stratégiát, amely sokkal jobb DNS replikációs képességgel rendelkező variáns DNS polimerázok kimutatására irányul, egyéb szervezetek DNS polimerázaira is alkalmazhatjuk, ha az ilyen defektív DNS polimeráz azonosítható, és javító vagy kompenzáló mutációk szelektálhatok.
I. DNS szekvenálási módszer
A jelentősen csökkent 3'-5' exonukleáz aktivitással rendelkező T4 DNS polimeráz, azaz akár a D112A+E114A, akár a D324A aminosav helyettesítéssel rendelkező variáns formák, és a jelentősen csökkent exonukleáz aktivitással rendelkező Escherichia coli DNS polimeráz II, azaz a D156A+E158A aminosav helyettesítéssel rendelkező variáns forma, használható DNS szekvenáló polimerázként, az alábbi lánclezáró nukleotidok alkalmazásával: ddATP, ddGTP, araCTP és araUTP (1. ábra).
A 2. ábrán három DNS szekvenáló gél fényképe látható. Az I. módszerrel kapott szekvenálási mintázatok az A és B paneleken láthatók, az 1-4. sávokban, és a C panelen. Az A panelen DNS szekvenálási reakciók láthatók, az Escherichia coli DNS polimeráz II exonukleáz deficiens variánsával. A ddGTP-vel való reakció az 1. sávban látható, a ddATP-vel való reakció a 2. sávban látható, az araCTP-vel való reakció a 3. sávban látható, és az araUTP-vel való reakció a 4. sávban látható. A B • ·· ·«·« r.
·· » · · * · • · · · ·· ·
-12- ' '··’ *· ’ panelen DNS szekvenálási reakciók láthatók, a T4 bakteriofág DNS polimeráz exonukleáz deficiens formájával. Itt is az a helyzet, hogy az 1. sávban látható a ddGTP-vel való reakció, a 2. sávban látható a ddATP-vel való reakció, a 3. sávban látható az araCTP-vel való reakció és a 4. sávban látható az araUTP-vel való reakció. Az A és B panelekben a reakcióelegyben Mg++ a kétértékű fémkation. Ha Mg++ helyett Mn++-t használunk, akkor is kapunk szekvenálási mintázatokat. A C panel bal oldalán, az 1-4-es sávokban az I. módszer szerinti reakciók láthatók, Mn++ ionnal és az Escherichia coli DNS polimeráz II exonukleáz deficiens formájával. A C panel, az 1-4-es sávok ddGTP-vel (1. sáv), ddATP-vel (2. sáv), araCTP-vel (3. sáv) és araUTP-vel végzett reakciókat tartalmaznak.
II. DNS szekvenálási módszer
A T4 DNS polimeráz vad típusú (módosítatlan) és 3'-5' exonukleáz deficiens formáit, valamint az Escherichia coli T4- DNS polimeráz II 3'-5' exonukleáz deficiens formáját használjuk DNS szekvenáló polimerázként 3'-amino-2',3'-didezoxiribonukleotidokkal (1. ábra) mint lánclezáró nukleotidokkal. Az Escherichia coli DNS polimeráz II exonukleáz deficiens formájának II. eljárás szerinti reakciói láthatók a 2. ábrán, az A panelen, az 5-7. sávban. Az ötödik sávban a 3'-amino-2',3'-didezoxi-ATP-vel, a 6.sávban a 3'-amino-2',3'-didezoxi-GTP-vel a 7. sávban a 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP-vel való reakció látható. A T4 DNS polimeráz exonukleáz deficiens formájának II. eljárás szerinti reakciói láthatók a 2. ábrán, a B panelen, az 5-7. sávban. Az ötödik sávban a 3'-amino-2',3'-didezoxi-ATP-vel, a 6.sávban a 3'-amino2',3'-didezoxi-GTP-vel a 7. sávban a 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP-vel való reakció látható.
-13Az adatok azt igazolják, hogy az Escherichia coli DNS polimeráz II és a T4 bakteriofág DNS polimeráz exonukleáz deficiens formáival kaphatók DNS szekvencia információk, az alábbi lánclezáró nukleotidok alkalmazásával: ddGTP vagy 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP, ddATP vagy 3'-amino-2',3'-didezoxi-ATP, araUTP vagy 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP és araCTP. A 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP-vel, -GTP-vel és -ATP-vel kapott jó szekvenálási mintázatok fényében az valószínű, hogy a 3'-amino-2',3'-didezoxi-CTP is egy hatékony lánclezáró nukleotid lesz. Nem tettünk kísérletet az I. és II. módszer szerinti reakciók optimalizálására abból a szempontból, hogy egyforma sávintenzitásokat kapjunk, vagy hogy növeljük a leolvasható szekvencia hosszát a 2. ábrán bemutatott reakciókban. Mindazonáltal a szekvenálási reakciók legalább 300 bázis hosszúságban képesek szekvencia információt adni. Nincs szükség a T4 DNS polimeráz exonukleáz deficiens formájára a szekvenálási reakciókban, a 3'-amino-2',3'-didezoxiribonukleozid-trifoszfátok alkalmazásával.
Példaként megadott kísérleti körülmények az I. és II módszerhez (2. ábra)
Jelzési reakció μΙ exonukleáz deficiens DNS polimeráz; 300-400 egység/ml T4 DNS polimeráz vagy Escherichia coli DNS polimeráz II. Egy egység T4 DNS polimeráz 10 nmol dTMP beépülését katalizálja a DNS-be, 30 perc alatt 30 °C-on. Egy egység Escherichia coli DNS polimeráz II 1 pmol dTMP beépülését katalizálja a DNS-be, 1 perc alatt, 37 °C-on. Jóllehet a reakciót általában 37 °C-on végezzük, a reakciót végrehajthatjuk 35-42 °C közötti hőmérsékleten.
μΙ primer-M13 DNS komplex, 15 nmol μΙ jelzési reakcióoldat: 2 μίτιοΙ/Ι dGTP, dCTP, dTTP; 1 pimol/l [a.32p]dATP; 50 mmol/l TRIS-HCI (pH=8,5); 5 mmol/l MgCl2 vagy 6 mmol/l MnCl2 az Escherichia • · • · · · • · • ·
-14coli DNS polimeráz ll-höz; 5 mmol/l MgCl2 vagy 0,05 mmol/l MnCl2 a T4 DNS polimerázhoz; 50 pg/ml szarvasmarha szérumalbumin.
A reakcióelegyeket 5 percig 37 °C-on inkubáljuk.
A primert megjelezhetjük az 5' végen is, vagy úgy, hogy jelzett nukleotidot teszünk az extenziós reakcióba, vagy egyéb módszerekkel.
Extenziós reakció μΙ jelzési reakcióelegy (lásd fent), μΙ terminációs oldat: 50 μιτιοΙ/Ι dGTP, dATP, dCTP és dTTP és egy, az alábbiakban felsorolt terminációs analógok közül:
I. módszer: ddGTP, 1,6 mmol/l; ddATP, 0,7 mmol/l; araCTP, 0,5 mmol/l, araUTP, 0,5 mmol/l.
II. módszer: 3'-amino-2',3'-didezoxi-GTP, 0,5 mmol/l; 3'-amino-2',3'-didezoxiATP, 0,5 mmol/l; 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP, 0,5 mmol/l.
A reakcióelegyeket 5 percig 37 °C-on tartjuk. A reakciókat formamid/EDTA hozzáadásával állítjuk le.
III. DNS szekvenálási módszer (3. ábra)
Az exonukleáz deficiens T4 DNS polimerázzal DNS szekvencia információ kapható olyan reakciókból, amelyekben az egyik dNTP alacsony koncentrációban fordul elő (például 0,1 μΓηοΙ/1-től 1 pmol/l-ig terjedő koncentrációban), és a másik három dNTP nagy koncentrációban (100 μιτιοΙ/Ι) (3. ábra). A DNS szekvenálási mintázatok ugyanúgy létrejönnek mint a nukleotid analógokkal végzett szekvenálási reakciókban, azzal az eltéréssel, hogy az ezzel a módszerrel előállított szekvenálási termékek egy pozícióval azelőtt végződnek, hogy az alacsony koncentrációban jelenlevő dNTP-re szükség van.
• · ·«·· · · ··
-15Példaként megadott kísérleti körülmények mmol/l HEPES (pH=7,5) mmol/l NaOAc mmol/l ditiotreitol
100 μίτιοΙ/Ι dGTP, dCTP és dTTP
0,1 μίτιοΙ/Ι dATP (1 Limol/I a hosszabb DNS termékekhez)
0,2 mg/ml szarvasmarha szérumalbumin
7,5 nmol/l 5'[32p]jeizett primer-templát (a 3' primer végek koncentrációjában kifejezve) nmol/l exonukleáz deficiens T4 DNS polimeráz mmol/l Mg(OAc)2
A 3. ábrán bemutatott reakcióelegy 0,1 μιτιοΙ/Ι dATP-t tartalmaz, és 1 percig 30 °C-on inkubáljuk. Nem optimalizáltuk a körülményeket ahhoz, hogy nagymennyiségű szekvencia információt kapjunk; mindazonáltal azokból a reakciókból, amelyekben az alacsony koncentrációjú dNTP 1 nmol/l koncentrációban van jelen, több mint 100 bázis-ra kiterjedő információ nyerhető ki.
Új T4 DNS polimerázok izolálása, amelyek a DNS szekvenálás szempontjából előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek
A találmány szempontjából az első lépés olyan T4 törzsek izolálása, amelyek a DNS replikáció valamely oldalát tekintve variáns (mutáns) DNS polimerázzal rendelkeznek. Azokat a mutáns DNS polimerázzal rendelkező T4 törzseket választjuk ki, amelyek az alább listázott aminosav helyettesítéseket tartalmazzák, de a genetikai szelekciós stratégia nem korlátozódik ezekre a mutánsokra, mivel bármely olyan mutáns DNS polimeráz használható, amely detektív DNS replikációt biztosít. Azok a variáns (mutáns) DNS polimerázok, amelyek részlegesen detektívek a DNS repiiká-16ció szempontjából, nem képesek a DNS-t replikáim az Escherichia coli optA1 gazdaszervezetben.
Az olyan mutáns T4 DNS polimerázokkal rendelkező törzsek, amelyek W213S, 1417V, A737V vagy A777V aminosav helyettesítésekkel rendelkeznek, nem képesek replikálódni az Escherichia coli optA1 gazdaszervezetben. Ezeknek a variánsoknak az előállítására a következő mutációkat alkalmazzuk: a W213S esetében a 637-es pozícióban levő G nukleotidot egy C nukleotiddal helyettesítjük; az I417V esetében az 1249-es pozícióban levő A nukleotidot egy G nukleotiddal helyettesítjük; az KITTd esetében a 2209-es pozícióban levő C nukleotidot egy T nukleotiddal helyettesítjük; és az A777V esetében a 2329-es pozícióban levő C nukleotidot egy T nukleotiddal helyettesítjük. Amint az ismert, egyéb nukleotid helyettesítések is képesek ugyanilyen aminosav változásokat okozni.
A második lépés az olyan T4 törzsek kiválasztása, amelyek replikálják a DNSt az Escherichia coli optA1 gazdaszervezetben, jóllehet a DNS polimeráz még megtartja azt az aminosav helyettesítést, amely egyedül csökkenti a DNS replikációs képességet, és megakadályozza a DNS replikációját Escherichia coli optA1 gazdaszervezetben. Azok a T4 törzsek, amelyekben egy második DNS polimeráz mutáció (vagy több mutáció) fordul elő, akár spontán mutációként, akár mutagén kezelés eredményeképpen, amely egy olyan új aminosav helyettesítést tartalmaz, amely kijavítja vagy kompenzálja az első aminosav helyettesítés által okozott DNS replikáció defektet, képesek replikálódni az Escherichia coli optA1 gazdaszervezetben és fág utódokat létrehozni. Az így azonosított DNS polimerázokban legalább két aminosav helyettesítés található, és egy vagy több új aminosav helyettesítés, amely helyreállítja a DNS replikációs aktivitását. Ennek a genetikai szelekciós stratégiának nagy a szelektivitása. Egy mutáns DNS polimerázzal rendelkező fágot, amelyben a DNS polimeráz a kiindulási aminosav helyettesítéseket, valamint azokat az aminosav
-17helyettesítéseket tartalmazza, amelyek helyreállítják a DNS replikáció aktivitását, 10θ-10θ fág közül is ki lehet választani.
A harmadik lépés a DNS replikációt helyreállító mutáció(k) azonosítása.
Ebben a lépésben standard szekvenálási eljárásokat alkalmazunk a T4 DNS polimeráz génben levő új mutáció(k) azonosítására. Az új mutáció(k) azonosítása után a mutációt bevihetjük a fágba vagy a T4 DNS polimeráz expressziós vektorokba, standard eljárások alkalmazásával. A kiindulási DNS replikációban detektív DNS polimeráz enzimtől eltérően a javító vagy kompenzáló mutációkat tartalmazó DNS polimerázok nagyon jó DNS replikációs aktivitással rendelkeznek. Az előzőkben ismertetett genetikai szelekciós stratégiával felfedezett aminosav helyettesítések közé tartoznak az alábbiak, anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat: I50L,
G82D, G255S és E743K. Ezeknek a variánsoknak a kialakításához a következő mutációkat alkalmaztuk: az I50L esetében a 148-as pozícióban levő A nukleotidot egy C nukleotiddal helyettesítjük; a G82D esetében a 244-es pozícióban levő G nukleotidot egy A nukleotiddal helyettesítjük; a G255S esetében a 763-as pozícióban levő G nukleotidot egy A nukleotiddal helyettesítjük; és az E743K esetében a 2227-es pozícióban levő G nukleotidot egy A nukleotiddal helyettesítjük. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egyéb nukleotid helyettesítések is eredményezhetik ugyanazokat az aminosav cseréket.
Azok a variáns (mutáns, módosított) T4 DNS polimerázok, amelyek olyan aminosav helyettesítéseket tartalmaznak, amelyek jobb DNS replikációs aktivitást biztosítanak, új, a DNS szekvenálás szempontjából előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek. Egy gyakori DNS szekvenálási probléma, hogy a DNS polimerázok a szekvenálási reakciókban alkalmazott néhány templát pontban leállnak, vagy leválnak a templátról. A lánchosszabbodás ilyen idő előtti leállásának az a következménye, hogy olyan szekvenálási termékek keletkeznek, amelyek nem egy • · · ···· · · · ·
-18lánclezáró nukleotidra végződnek. Egy másik probléma, hogy a nukleotidoknak és lánclezáró nukleotidoknak a DNS polimeráz által való beépülését befolyásolja a templát szekvenciája, ami a szekvenáló termékek egyenlőtlen eloszlásához vezethet. Az új, javított DNS replikációs tulajdonságokkal rendelkező DNS polimerázok leküzdhetik ezt a problémát. A G82D-T4 DNS polimerázt (amely T4 mel 62 DNS polimeráz néven is ismert) primer extenziós vizsgálatokban vizsgáltuk, és erről az új DNS polimerázról kiderült, hogy ez az új DNS polimeráz meghosszabbítja azokat a primereket, amelyek a vad típusú T4 DNS polimeráz számára problematikusnak bizonyultak. A G82D-T4 DNS polimeráz szintézisre adunk meg egy példát a 4.
ábrán.
A 4. ábrán három T4 polimeráz használata látható, egy DNS templát lézió másolása során (egy abázikus lézió - azaz egy bázis hiányzik a templát szálon, X-szel jelezve). A vad típusú T4 DNS polimeráznak nehézségei vannak az X-szel szembeni nukleotid beépítésével, amit a nagyon gyenge csíkok mutatnak. Egy 3'-exonukleáz deficiens T4 polimeráz mutáns, az EXO17, képes az X-szel szembeni nukleotidok beépítésére (ez az X-nél levő intenzív csíkból látható), és folytatni a szintézist a lézió után is. A T4 mel 62 polimeráz egy mutáns enzim (in vivő egy mutátor fenotípust közvetít), amely látszólag normál (vad típusú) szintű 3'-exonukleáz és polimeráz aktivitással rendelkezik. Mindezek ellenére arra is képes, hogy nukleotidokat építsen be X-szel szemben, és hogy folytassa a szintézist az X után is Ami a legérdekesebb, az az, hogy az X után hiányzó leállt csíkok hiánya azt sugall ja, hogy a mel 62 DNS polimeráz sokkal szorosabban marad a primer templát DNS-hez kötve, mint akár az EXO17 akár a vad típusú polimerázok. így tehát lehetséges hogy ez az enzim képes lesz leküzdeni a hosszú DNS szintézisben a templát és a szubsztrát által okozott problémákat.
-19Az nyilvánvaló, hogy egy vagy több olyan aminosav helyettesítés, amely sokkal jobb DNS replikációs aktivitást biztosít, egy vagy több olyan aminosav helyettesítéssel van kombinálva, amely jelentősen csökkenti a 3'-5' exonukleáz aktivitást, olyan módosított új T4 DNS polimeráz kialakítása során, amely számos, a DNS szekvenáló polimerázok számára előnyös tulajdonsággal rendelkezik.
Az közismert, hogy a polimerázok, azaz például a T7 DNS polimeráz a hozzájuk kapcsolódó fehérjékkel együtt használhatók, ezzel fokozzák a polimeráz proceszszivitását, csökkentve a polimeráznak a szekvenálandó DNS szálról való leválásának gyakoriságát.
A T4 DNS polimeráz esetében a kapcsolódó fehérjék közé tartoznak anélkül hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az alábbiak: a 32-es, 41-es, 45-ös gének termékei és a 44/62-es komplex. Az Escherichia coli DNS polimeráz II esetében a kapcsolódó fehérjék az alábbiak: β fehérje; a γ fehérjekomplex, amelyben a γ komplex γ, δ, δ' χ és ψ egységekből áll; és SSB (egyszálú kötőfehérje) (megjegyezzük, hogy az β fehérje és a γ komplex Escherichia coli pol lll-hoz kapcsolódó fehérjék). Ezeknek a kapcsolódó fehérjéknek az alkalmazása fokozza a polimerázok hatékonyságát a
DNS szekvenálás során.
A jelen találmány alapvető új ismérveit mutattuk be és ismertettük az előzőkben, de az nyilvánvaló, hogy a bemutatott formában tett különböző kihagyások, helyettesítések és változtatások tehetők a szakterületen jártas szakemberek által, anélkül, hogy eltérnénk a találmány szellemétől.
Az alábbiakban ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.
-20·· ····
SZENVENCIA LISTA (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓ (i) BEJELENTŐ: Goodman, Myron F.
Reha-Krantz, Linda J.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: DNS szekvenáló enzimek (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 6 (iv) LEVELEZÉSI CÍM (A) CÍM: Robbins, Berliner & Carspm (B) UTCA: 201 North Figueroa Street, Fifth Floor (C) VÁROS: Los Angeles (D) MEGYE: California (E) ORSZÁG: AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK (F) POSTAI KÓD (ZIP): 1078 ED (v) SZÁMÍTÓGÉPES OLVASÁSI FORMA:
(A) A HORDOZÓ TÍPUSA: Floppy disk (B) SZÁMÍTÓGÉP: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, 1,25 # verzió (vi) A KORÁBBI BEJELENTÉS ADATAI:
(A) A BEJELENTÉS SZÁMA:
(B) A BEJELENTÉS IDŐPONTJA:
(C) OSZTÁLYOZÁS:
(viii) ÜGYVIVŐ/KÉPVISELŐ ADATAI:
(A) NÉV: Spitals, John P.
(B) A SZABADALOM SZÁMA: 29,215
Ik
-21·♦ ·*·· · · ·« • · · · · · • · · · · · • * · · · · (C) REFERENCIA/ÜGYSZÁM: 1920-305 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:
(A) TELEFON: (213) 977-1001 (B) TELEFAX: (213) 977-1003 (2) 1. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) Hosszúság: 2760 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Moiekulatípus: DNS (genomiális) (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1..2760 (xi) A szekvencia leírása: 1. számú szekvencia
CGT CAT CTT CAT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 48
Arg His Leu His Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
1 5 10 15
TTT TTT TTT TTT ATT ATT ATG AAA GAA TTT TAT ATC TCT ATC GAA ACA 96
Phe Phe Phe Phe I le I le Hét Lys Glu Phe Tyr Ile Ser Ile Glu Thr
20 25 30
GTC GGA AAT AAT ATT ATT GAA CGT TAT ATT GAT GAA AAC GGA AAG GAA 144
Val Gly Asn Asn I le He Glu Arg Tyr l le Asp Glu Asn Gly Lys Glu
35 40 45
CGT ACT CGT GAA GTA GAA TAT CTT CCG ACT ATG TTT AGG CAT TGT AAG 192
Arg Thr Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr Met Phe Arg His Cys Lys
50 55 60
GAA GAG TCA AAA TAC AAA GAC ATC TAT GGT AAA AAC TGT GCT CCT CAA 240
Glu Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys Ala Pro Gin
65 70 75 80
AAA TTT CCA TCA ATG , AAA GAT GCT CGA GAT TGG ATG AAG CGA ATG GAA 288
Lys Phe Pro : Ser Hét Lys Asp , Ala Arg Asp Trp Met Lys Arg Hét Glu
35 90 95
GAC , ATC I GGT I GTC GAA I GCT ι CTC I GGT . ATG AAC GAT TTT AAA CTC GCT TAT 336
Asp . I le I Gly Leu Glu Ala I Leu I Gly I Hét , Asn . Asp Phe Lys Leu , Ala Tyr
100 105 110
ATC AGT GAT ACG TAT GGT TCA GAA ATT GTT TAT GAC CGA AAA TTT GTT
I Le Ser Asp Thr Tyr Gly Ser Glu Ile Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val
115 120 125
CGT GTA GCT AAC TGT GAC ATT GAG GTT ACT GGT GAT AAA TTT CCT GAC
Arg Val Alá Asn Cys Asp I le Glu Val Thr Gly Asp Lys Phe Pro Asp
130 135 140
CCA ATG AAA GCA GAA TAT GAA ATT GAT GCT ATC ACT CAT TAT GAT TCA
Pro Met Lys Alá Glu Tyr Glu Ile Asp Alá Ile Thr His Tyr Asp Ser
145 150 155 160
ATT GAC GAC CGT TTT TAT GTT TTC GAC CTT TTG AAT TCA ATG TAC GGT
Ile Asp Asp Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Hét Tyr Gly
165 170 175
TCA GTA TCA AAA TGG GAT GCA AAG TTA GCT GCT AAG CTT GAC TGT GAA
Ser Val Ser Lys 180 Trp Asp Alá Lys Leu 185 Alá Alá Lys Leu Asp 190 cys Glu
GGT GGT GAT GAA GTT CCT CAA GAA ATT CTT GAC CGA GTA ATT TAT ATG
Gly Gly Aso 195 Glu Val Pro Gin Glu 200 Ile Leu Asp Arg Val 205 Ile Tyr Hét
CCA TTT GAT AAT GAG CGT GAT ATG CTC ATG GAA TAT ATT AAT CTC TGG
Pro Phe 210 Asp Asn Glu Arg Asp 215 Hét Leu Hét Glu Tyr 220 Ile Asn Leu Trp
GAA CAG AAA CGA CCT GCT ATT TTT ACT GGT TGG AAT ATT GAG GGG TTT
Glu 225 Gin Lys Arg Pro Alá 230 Ile Phe Thr Gly Trp 235 Asn Ile Glu ciy Phe 240
GAC GTT CCG TAT ATC ATG AAT CGC GTT AAA ATG ATT CTG GGT GAA CGC
Asp Val Pro Tyr Ile 245 Hét Asn Arg Val Lys 250 Hét He Leu Gly Glu 255 Arg
AGT ATG AAA CGT TTC TCT CCA ATC GGT CGG GTA AAA TCT AAA CTA ATT
Ser Hét Lys Arg 260 Phe Ser Pro Ile Gly 265 Arg Val Lys Ser Lys 270 Leu I Le
CAA AAT ATG TAC GGT AGC AAA GAA ATT TAT TCT ATT GAT GGC GTA TCT
Gin Asn Hét 275 Tyr Gly Ser Lys Glu 280 Ile Tyr Ser He Asp 285 Gly Val Ser
ATT CTT GAT TAT TTA GAT TTG TAC AAG AAA TTC GCT TTT ACT AAT TTG
Ile Leu 290 Asp Tyr Leu Asp Leu 295 Tyr Lys Lys Phe Alá 300 Phe Thr Asn Leu
CCG TCA TTC TCT TTG GAA TCA GTT GCT CAA CAT GAA ACC AAA AAA GGT
Pro 305 Ser Phe Ser Leu Glu 310 Ser Val Alá Gin His 315 Glu Thr Lys Lys Gly 320
AAA TTA CCA TAC GAC GGT CCT ATT AAT AAA CTT CGT GAG ACT AAT CAT
Lys Leu Pro Tyr Asp 325 Gly Pro Ile Asn Lys 330 Leu Arg Glu Thr Asn 335 His
CAA CGA TAC ATT AGT TAT AAC ATC ATT GAC GTA GAA TCA GTT CAA GCA
Gin Arg Tyr Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Asp Val Glu Ser Val Gin Alá
340 345 350
ATT GAT AAA Ile Asp Lys 355 ATT CGT GGG TTT ATC GAT CTA GTT TTA AGT ATG TCT TAT
I le Arg Gly Phe Ile Asp Leu Val Leu Ser Hét Ser Tyr
360 365
TAT GCT AAA ATG CCT TTT TCT GGT GTA ATG AGT CCT ATT AAA ACT TGG
Tyr Alá Lys Hét Pro Phe Ser Gly Val Hét Ser Pro He Lys Thr Trp
370 375 380
GAT GCT ATT ATT TTT AAC TCA TTG AAA GGT GAA CAC AAG GTT ATT CCT
Asp Alá Ile Ile Phe Asn Ser Leu Lys Gly Glu His Lys Val Ile Pro
385 390 395 400
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
1200 ·· tf *
CAA Gtn CAA GGT TCG CAC GTT AAA CAG Gin AGT TTT CCG GGT GCA TTT GTA TTT Ser Phe Pro Gly Alá Phe Val Phe 1248
Gin Gly Ser His 405 Val Lys
410 415
GAA CCT AAA CCA ATT GCT CGT CGA TAC ATT ATG AGT TTT GAC TTG ACG 1296
Glu Pro Lys Pro Ile Alá Arg Arg Tyr Ile Met Ser Phe Asp Leu Thr
420 425 430
TCT CTG TAT CCG AGC ATT ATT CGC CAG GTT AAC ATT AGT CCT GAA ACT 1344
Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Arg Gin Val Asn Ile Ser Pro Glu Thr
435 440 445
ATT CGT GGT CAG TTT AAA GTT CAT CCA ATT CAT GAA TAT ATC GCA GGA 1392
Ile Arg Gly Gin Phe Lys Val His Pro Ile His Glu Tyr He Alá .Gly
450 455 460
ACA GCT CCT AAA CCA AGT GAT GAA TAT TCT TGT TCT CCG AAT GGA TGG 1440
Thr Alá Pro Lys Pro Ser Asp Glu Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Trp
465 470 475 480
ATG TAT GAT AAG CAT CAA GAA GGT ATC ATT CCA AAG GAA ATC GCT AAA 1488
Met Tyr Asp Lys His Gin Glu Gly I le I le Pro Lys Glu Ile Alá Lys
485 490 495
GTA TTT TTC CAG CGT AAA GAT TGG AAA AAG AAA ATG TTC GCT GAA GAA 1536
Val Phe Phe Gin Arg Lys Asp Trp Lys Lys Lys Hét Phe Alá Glu Glu
500 505 510
ATG AAT GCC GAA GCT ATT AAA AAG ATT ATT ATG AAA GGC GCA GGG TCT 1584
Met Asn Alá Glu Alá Ile Lys Lys I le Ile Met Lys Gly Alá Gly Ser
515 520 525
TGT TCA ACT AAA CCA GAA GTT GAA CGA TAT GTT AAG TTC ACT GAT GAT 1632
Cys Ser Thr Lys Pro Glu Val Glu Arg Tyr Val Lys Phe Thr Asp Asp
530 535 540
TTC TTA AAT GAA CTA TCG AAT TAT ACT GAA TCT GTT CTT AAT AGT CTG · 1680
Phe Leu Asn Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Glu Ser Val Leu Asn Ser Leu
545 550 555 560
ATT I le GAA Glu GAA TGT GAA Glu 565 AAA GCA Lys Alá GCT Alá ACA CTT GCT AAT ACA AAT CAG CTG 1728
Glu Cys Thr Leu 570 Alá Asn Thr Asn Gin 575 Leu
AAC CGT AAA ATT CTT ATT AAC AGT CTT TAT GGT GCT CTT GGT AAT ATT 1776
Asn Arg Lys I le 580- Leu Ile Asn Ser Leu 585 Tyr Gly Alá Leu Gly 590 Asn Ile
CAT TTC CGT TAC TAT GAT TTA CGA AAT GCT ACT GCT ATC ACA ATT TTT 1824
His Phe Arg 595 Tyr Tyr Asp Leu Arg 600 Asn Alá Thr Alá Ile 605 Thr Ile Phe
GGT CAA GTT GGT ATT CAG TGG ATT GCT CGT AAA ATT AAT GAA TAT CTG 1872
Gly Gin Val Gly Ile Gin Trp I le Alá Arg Lys I le Asn Glu Tyr Leu
610 615 620
AAT AAA Asn Lys 625 GTA TGC GGA ACT AAT GAT GAA GAT TTC ATC GCA GCA GGT GAT 1920
Val Cys Gly Thr Asn 630 Asp Glu Asp Phe 635 Ile Alá Alá Gly Asp 640
ACT GAT TCG GTA TAT GTT TGT GTA GAT AAA GTT ATT GAA AAA GTT GGT 1968
Thr Asp Ser Val Tyr Val Cys Val Asp Lys Val I le Glu Lys Val Gly
645 650 655
CTT GAC CGA TTC AAA GAG CAG AAC GAT TTG GTT GAA TTC ATG AAT CAG 2016
Leu Asp Arg Phe Lys Glu Gin Asn Asp Leu Val Glu Phe Met Asn Gin
660 665 670
TTT GGT AAG AAA AAG ATG GAA CCT ATG ATT GAT GTT GCA TAT CGT GAG 2064
Phe Gly Lys Lys Lys Met Glu Pro Met Ile Asp Val Alá Tyr Arg Glu
675 680 685
TTA Leu TGT GAT TAT ATG AAT AAC CGC GAG CAT CTG ATG CAT ATG GAC CGT 2112
Cys Asp Tyr Hét 690 Asn Asn 695 Arg Glu His Leu Hét 700 His Met Asp Arg
GAA GCT ATT TCT TGC CCT CCG CTT GGT TCA AAG GGT GTT GGT GGA TTT 2160
Glu Alá Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val dy Gly Phe
705 710 715 720
TGG AAA GCG AAA AAA CGT TAT GCT CTG AAC GTT TAT GAT ATG GAA GAT 2208
Trp Lys Alá Lys Lys Arg Tyr Alá Leu Asn Val Tyr Asp Met Glu Asp
725 730 735
AAG CGA TTT GCT GAA CCG CAT CTA AAA ATC ATG GGT ATG GAA ACT CAG 2256
Lys Arg Phe Alá, Glu Pro His Leu Lys Ile Met Gly Hét Glu Thr Gin
740 745 750
CAG AGT TCA ACA CCA AAA GCA GTG CAA GAA GCA CTC GAA GAA AGT ATT 2304
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Alá Val Gin Glu Alá Leu Glu Glu Ser Ile
755 760 765
CGT CGT ATT CTT CAG GAA GGC GAA GAG TCT GTC CAA GAA TAT TAC AAG 2352
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gly Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
AAC TTC GAG AAA GAA TAT CGT CAA CTT GAC TAT AAA GTT ATT GCT GAA 2400
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Val Ile Alá Glu
785 790 795 800
GTA AAA ACT GCG AAC GAT ATA GCG AAA TAT GAT GAT AAA GGT TGG CCA 2448
Val Lys Thr Alá Asn Asp Ile Alá Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
GGA TTT AAA TGT CCG TTC CAT ATT CGT GGT GTG CTA ACT TAT CGT CGA 2496
Gly Phe Lys cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
320 825 830
GCT Alá GTT Val AGT GGT Ser Gly 835 CTG GGT GTA GCT CCA ATT TTG GAT GGA AAT AAA GTA 2544
Leu Gly Val Alá Pro Ile Leu Asp Gly Asn Lys Val
840 845
ATG GTT CTT CCA TTA CGT GAA GGA AAT CCG TTT GGT GAT AAG TGC ATT 2592
Hét Val 850 Leu Pro Leu Arg Glu 855 Gly Asn Pro Phe Gly 860 Asp Lys Cys I le
GCT TGG CCA TCG GGT ACA GAA CTT CCA AAA GAA ATT CGT TCT GAT GTA 2640
Alá Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu Ile Arg Ser Asp Val
865 870 875 880
CTA Leu TCT Ser TGG ATT GAC TAC TCA ACT TTG TTC CAA AAA TCG TTT GTT Val 895 AAA Lys 2688
Trp Ile Ásd 885 Tyr Ser Thr Leu Phe 890 Gin Lys Ser Phe
CCG CTT GCG GGT ATG TGT GAA TCG GCA GGT ATG GAC TAT GAG GAA AAA 2736
Pro Leu Alá Gly Met Cys Glu Ser Alá Gly Hét Asp Tyr Glu Glu Lys
900 905 910
GCT TCG TTA GAC TTC CTG TTT GGC Alá Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
915 920
2760 ··«« · ·· • · » · *
-25(2) 2. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) Hosszúság: 920 bázispár (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 2. számú szekvencia
Arg 1 His Leu His Phe 5 Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
10 15
Phe Phe Phe Phe I le lle Hét Lys Glu Phe Tyr He Ser I le Glu Thr
20 25 30
Val Gly Asn Asn lle He Glu Arg Tyr He Asp Glu Asn oly Lys Glu
35 40 45
Arg Thr Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr Hét Phe Arg His cys Lys
50 55 60
Glu Glu Ser Lys Tyr Lys Asp [le Tyr Gly Lys Asn cys Ata Pro Gin
65 70 75 80
Lys Phe Pro Ser Hét Lys Asp Alá Arg Asp Trp Hét Lys Arg Hét Glu
90 95
Asp lle Gly Leu Glu Alá Leu oly Hét Asn Asp Phe Lys Leu Alá Tyr
100 105 110
ILe Ser Asp Thr Tyr Gly Ser Glu lle Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val
115 120 125
Arg Val Alá Asn Cys Asp He Glu Val Thr Gly Asp Lys Phe Pro Asp
130 135 140
Pro Hét Lys Alá Glu Tyr Glu lle Asp Alá lle Thr His Tyr Asp Ser
145 150 155 160
lle Asp Asp Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Hét Tyr Oly
165 170 175
'Ser Val Ser Lys Trp Asp Alá Lys Leu Alá Alá Lys Leu Asp Cys Glu
180 185 190
oly Gly Asp Glu Val Pro Gin Glu lle Leu Asp Arg Val He Tyr Hét
195 200 205
Pro Phe Asp Asn Glu Arg Asp Hét Leu Hét Glu Tyr He Asn Leu Trp
210 215 220
Glu Gin Lys Arg Pro Alá lle Phe Thr Gly Trp Asn lle Glu Gly Phe
225 230 235 240
Asp Val Pro Tyr I le Met Asn Arg Val Lys Hét I le Leu Gly Glu Arg
245 250 255
Ser Met Lys Arg Phe Ser Pro lle Gly Arg Val Lys Ser Lys Leu lle
260 265 270
Gin Asn Hét Tyr Gly Ser Lys Glu He Tyr Ser lle Asp Gly Val Ser
275 280 285
lle Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Phe Alá Phe Thr Asn Leu
290 295 300
• ·« »··· » ·· ··* ♦ » » · * • · · · ·· ·
Pro ι Ser Phe Ser Leu ι Glu ι Ser Val Alá Gin ι His Glu t Thr Lys Lys Gly
305 310 315 320
Lys Leu Pro Tyr Asp , Gly Pro Ile Asn Lys Leu Arg Glu Thr Asn His
325 330 335
Gin Arg Tyr Ile Ser Tyr Asn I le Ile Asp Val Glu Ser Val Gin Alá
340 345 350
Ile Asp Lys Ile Arg Gly Phe Ile Asp Leu Val Leu Ser Met Ser Tyr
355 360 365
Tyr Alá Lys Met Pro Phe Ser Gly Val Met Ser Pro Ile Lys Thr Trp
370 375 380
Asp Alá Ile Ile Phe Asn Ser Leu Lys dy Glu His Lys Val Ile Pro
385 390 395 400
Gin Gin Gly Ser His Val Lys Gin Ser Phe Pro Gly Alá Phe Val Phe
405 410 415
Glu Pro Lys Pro Ile Alá Arg Arg Tyr Ile Met Ser Phe Asp Leu Thr
420 425 430
Ser Leu Tyr Pro Ser Ile I le Arg Gin Val Asn Ile Ser Pro Glu Thr
435 440 445
1 le Arg Gly Gin Phe Lys Val His Pro Ile His Glu Tyr Ile Alá Gly
450 455 460
Thr Alá Pro Lys Pro Ser Asp Glu Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Trp
465 470 475 480
Hét Tyr Asp Lys His Gin Glu Gly Ile Ile Pro Lys Glu He Alá Lys
485 490 495
Val Phe Phe Gin Arg Lys Asp Trp Lys Lys Lys Met Phe Alá Glu Glu
500 505 510
Hét Asn Alá Glu Alá Ile Lys Lys Ile ile Met Lys Gly Alá Gly Ser
515 520 525
cys Ser Thr Lys Pro Glu Val Glu Arg Tyr Val Lys Phe Thr Asp Asp
530 535 540
Phe Leu Asn Glu. Leu Ser Asn Tyr Thr Glu Ser Val Leu Asn Ser Leu
545 550 555 560
I le Glu Glu Cys Glu Lys Alá Alá Thr Leu Alá Asn Thr Asn Gin Leu
565 570 575
Asn Arg Lys I le Leu Ile Asn Ser Leu Tyr oly Alá Leu Gly Asn Ile
580 585 590
His Phe Arg Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Alá Thr Alá I le Thr I le Phe
595 600 605
Gly Gin Val Gly Ile Gin Trp Ile Alá Arg Lys 1 le Asn Glu Tyr Leu
610 615 620
Asn Lys Val Cys Gly Thr Asn Asp Glu Asp Phe Ile Alá Alá Gly Asp
625 630 635 640
Thr Asp Ser Val Tyr Val Cys Val Asp Lys Val He Glu Lys Val Gly
645 650 655
Leu Asp Arg Phe Lys Glu Gin Asn Asp Leu Val Glu Phe Met Asn Gin
660 665 670
Phe Gly Lys Lys Lys Met Glu Pro Met Ile Asp Val Alá Tyr Arg Glu
675 680 685
• 4»
Leu Cys Asp Tyr Met Asn Asn Arg Glu His Leu Met His Met Asp Arg 690 695 700
Glu Alá Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val Gly Gly Phe 705 710 715 720
Trp i Lys Alá Lys Lys Arg Tyr Alá Leu i Asn Val Tyr Asp Met Glu Asp
725 730 735
Lys Arg Phe Alá Glu Pro His Leu Lys Ile Met Gly Met Glu Thr Gin
740 745 750
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Alá Val Gin Glu Alá Leu Glu Glu Ser Ile
755 760 765
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gly Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Val Ile Alá Glu
735 790 795 800
Val Lys Thr Alá Asn Asp Ile Alá Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
Gly Phe Lys Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
820 825 830
Alá Val Ser Gly Leu Gly Val Alá Pro Ile Leu Asp Gly Asn Lys Val
835 840 845
Met Val Leu Pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys cys Ile
850 855 860
Alá Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu Ile Arg Ser Asp Val
865 870 875 880
Leu Ser Trp Ile Asp Tyr Ser Thr Leu Phe Gin Lys Ser Phe Val Lys
885 890 895
Pro Leu Alá Gly Met Cys Glu Ser Alá Gly Met Asp Tyr Glu Glu Lys
900 905 910
Alá Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
915 920
(2) 3. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) Hosszúság: 2760 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 1..2760 » ·
-28(xi) A szekvencia leírása: 3. számú szekvencia
CGT CAT CTT CAT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT 43
Arg His Leu His Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
5 10 15
TTT TTT TTT TTT ATT ATT ATG AAA GAA TTT TAT ATC TCT ATT GAA ACA 96
Phe Phe Phe Phe Ile Ile Hét Lys Glu Phe Tyr Ile Ser Ile Glu Thr
25 30
GTC GGA AAT AAC ATT GTT GAA CGT TAT ATT GAT GAA AAT GGA AAG GAA 144
Val Gly Asn Asn Ile Val Glu Arg Tyr Ile Asp Glu Asn Gly Lys Glu
40 45
CGT ACC CGT GAA GTA GAA TAT CTT CCA ACT ATG TTT AGG CAT TGT AAG 192
Arg Thr Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr Hét Phe Arg His Cys Lys
55 60
GAA GAG TCA AAA TAC AAA GAC ATC TAT GGT AAA AAC TGC GCT CCT CAA 240
Glu Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys Alá Pro Gin
70 75 30
AAA TTT CCA TCA ATG AAA GAT GCT CGA GAT TGG ATG AAG CGA ATG GAA 283
Lys Phe Pro Ser Hét Lys Asp Alá Arg Asp Trp Hét Lys Arg Hét Glu
90 95
GAC ATC GGT CTC GAA GCT CTC GGT ATG AAC GAT TTT AAA CTC GCT TAT 336
Asp Ile Gly Leu Glu Alá Leu Gly Hét Asn Asp Phe Lys Leu Alá Tyr
100 105 110
ATA AGT GAT ACA TAT GGT TCA GAA ATT GTT TAT GAC CGA AAA TTT GTT 384
Ile Ser Asp Thr Tyr Gly Ser Glu Ile Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val
115 120 125
CGT GTA GCT AAC TGT GAC ATT GAG GTT ACT GGT GAT AAA TTT CCT GAC 432
Arg Val Alá Asn Cys Asp Ile Glu Val Thr Gly Asp Lys Phe Pro Asp
130 135 140
CCA ATG AAA GCA GAA TAT GAA ATT GAT GCT ATC ACT CAT TAC GAT TCA 480
Pro Hét Lys Alá Glu Tyr Glu Ile Asp Alá Ile Thr His Tyr Asp Ser
145 150 155 160
ATT GAC GAT CGT TTT TAT GTT TTC GAC CTT TTG AAT TCA ATG TAC GGT 528
Ile Asp Asp Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Hét Tyr Gly
165 170 175
TCA GTA TCA AAA TGG GAT GCA AAG TTA GCT GCT AAG CTT GAC TGT GAA 576
Ser Val Ser Lys Trp Asp Alá Lys Leu Alá Alá Lys Leu Asp Cys Glu
130 185 190
GGT GGT GAT GAA GTT CCT CAA GAA ATT CTT GAC CGA GTA ATT TAT ATG 624
Gly Gly Asp Glu Val Pro Gin Glu Ile Leu Asp Arg Val Ile Tyr Hét
195 200 205
CCA TTC GAT AAT GAG CGT GAT ATG CTC ATG GAA TAT ATC AAT CTT TGG 672
Pro Phe Asp Asn Glu Arg Asp Hét Leu Met Glu Tyr Ile Asn Leu Trp
210 215 220
GAA CAG AAA CGA CCT GCT ATT TTT ACT GGT TGG AAT ATT GAG GGG TTT 720
Glu Gin Lys Arg Pro Alá Ile Phe Thr Gly Trp Asn Ile Glu Gly Phe
225 230 235 240
GAC GTT CCG TAT ATC ATG AAT CGT GTT AAA ATG ATT CTG GGT GAA CGT 763
Asp Val Pro Tyr Ile Hét Asn Arg Val Lys Hét Ile Leu Gly Glu Arg
245 250 255
AGT ATG AAA CGT TTC TCT CCA ATC GGT CGG GTA AAA TCT AAA CTA ATT 816
Ser Met Lys Arg Phe Ser Pro Ile Gly Arg Val Lys Ser Lys Leu Ile
260 265 270
CAA AAT ATG TAC GGT AGC AAA GAA ATT TAT TCT ATT GAT GGC GTA TCT Ile Tyr Ser Ile Asp Gly Val Ser 285 S64 912 960
Gin Asn Met 275 GAT Asp TTC Phe Tyr TAT Tyr TCT Ser Gly Ser Lys Glu
TTA Leu TTG Leu 280 GAT TTG TAC
A ι T I le CCG Pro 305 CTT Leu 290 TCA Ser AAG AAA TTC GCT TTT ACT AAT TTG
Asp GAA Glu 310 Leu Tyr 295 TCA GTT Lys GCT Alá Lys CAA Gin Phe CAT His 315 Alá Phe Thr Asn Leu 300
GAA ACC AAA Lys AAA GGT
Ser Val Glu Thr Lys Gly 320
AAA TTA , CCA TAC GAC GGT CCT ATT AAT AAA CTT CGT GAG ACT AAT CAT 1008
Lys Leu t Pro Tyr Asp Gly Pro I le Asn Lys Leu Arg Glu Thr Asn His
325 330 335
CAA CGA TAC ATT AGT TAT AAC ATC ATT GAC GTA GAA TCA GTT CAA GCA 1056
Gin Arg Tyr Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Asp Val Glu Ser Val Gin Alá
340 345 350
ATC GAT AAA ATT CGT GGG TTT ATC GAT CTA GTT TTA AGT ATG TCT TAT 1104
Ile Asp Lys Ile Arg Gly Phe Ile Asp Leu Val Leu Ser Met Ser Tyr
355 360 365
TAC GCT AAA ATG CCT TTT TCT GGT GTA ATG AGT CCT ATT AAA ACT TGG 1152
Tyr Alá Lys Met Pro Phe Ser Gly Val Met Ser Pro Ile Lys Thr Trp
370 375 380
GAT GCT ATT ATT TTT AAC TCA TTG AAA GGT GAA CAT AAG GTT ATT CCT 1200
Asp Alá Ile Ile Phe Asn Ser Leu Lys Gly Glu His Lys Val Ile Pro
385 390 395 400
CAA CAA GGT TCG CAC GTT AAA' CAG AGT TTT CCG GGT GCA TTT GTG TTT 1248
Gin Gin Gly Ser His Val Lys Gin Ser Phe Pro Gly Alá Phe Val Phe
405 410 415
GAA CCT AAA CCA ATT GCA CGT CGA TAC ATT ATG AGT TTT GAC TTG ACG 1296
Glu Pro Lys Pro Ile Alá Arg Arg Tyr Ile Hét Ser Phe Asp Leu Thr
420 425 430
TCT Ser CTG TAT Leu Tyr 435 CCG AGC ATT ATT CGC CAG GTT AAC ATT AGT CCT GAA ACT 1344
Pro Ser Ile I le Arg 440 Gin Val Asn Ile Ser 445 Pro Glu Thr
ATT CGT GGT CAG TTT AAA GTT CAT CCA ATT CAT GAA TAT ATC GCA GGA 1392
Ile Arg Gly Gin Phe Lys Val His Pro Ile His Glu Tyr Ile Alá Gly
450 455 460
ACA GCT CCT AAA CCG AGT GAT GAA TAT TCT TGT TCT CCG AAT GGA TGG 1440
Thr Alá Pro Lys Pro Ser Asp Glu Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Trp
465 470 475 480
ATG TAT GAT AAA CAT CAA GAA GGT ATC ATT CCA AAG GAA ATC GCT AAA 1483
Met Tyr Asp Lys His Gin Glu Gly Ile I le Pro Lys Glu He Alá Lys
485 490 495
GTA TTT TTC CAG CGT AAA GAC TGG AAA AAG AAA ATG TTC GCT GAA GAA 1536
Val Phe Phe Gin Arg Lys Asp Trp Lys Lys Lys Met Phe Alá Glu Glu
500 505 510
ATG AAT GCC GAA GCT ATT AAA AAG ATT ATT ATG AAA GGC GCA GGG TCT 1584
Met Asn Alá Glu Alá I le Lys Lys Ile Ile Met Lys Gly Alá Gly Ser
515 520 525
TGT TCA ACT AAA CCA GAA GTT GAA CGA TAT GTT AAG TTC AGT GAT GAT 1632
Cys Ser Thr Lys Pro Glu Val Glu Arg Tyr Val Lys Phe Ser Asp Asp
530 535 540
TTC TTA AAT GAA CTA TCG AAT TAC ACC GAA TCT GTT CTC AAT AGT CTG 1680
Phe Leu Asn Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Glu Ser Val Leu Asn Ser Leu
545 550 555 560 • · · · « • · · ·
ATT GAA GAA TGT GAA AAA GCA GCT ACA CTT GCT AAT ACA AAT CAG CTG 1728
1 le Glu Glu Cys Glu Lys 565 Alá Alá Thr Leu Alá Asn Thr Asn Gin Leu
570 575
AAC CGT AAA ATT CTC ATT AAC AGT CTT TAT GGT GCT CTT GGT AAT ATT 1776
Asn Arg Lys Ile Leu Ile Asn Ser Leu Tyr Gly Alá Leu Gly Asn Ile
580 585 590
CAT TTC CGT TAC TAT GAT TTG CGA AAT GCT ACT GCT ATC ACA ATT TTC 1824
His Phe Arg Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Alá Thr Alá I le Thr Ile Phe
595 600 605
GGC CAA GTC GGT ATT CAG Gin TGG ATT GCT CGT AAA ATT AAT GAA TAT CTG 1872
Gly Gin Val Gly Ile Trp 615 Ile Alá Arg Lys I le Asn 620 Glu Tyr Leu
610
AAT AAA GTA TGC GGA ACT AAT GAT GAA GAT TTC ATT GCA GCA GGT GAT 1920
Asn 625 Lys Val Cys Gly Thr 630 Asn Asp Glu Asp Phe 635 Ile Alá Alá Gly Asp 640
ACT GAT TCG GTA TAT GTT TGC GTA GAT AAA GTT ATT GAA AAA GTT GGT 1968
Thr Asp Ser Val Tyr Val Cys Val Asp Lys Val Ile Glu Lys Val Gly
645 650 655
CTT GAC CGA TTC AAA GAG CAG AAC GAT TTG GTT GAA TTC ATG AAT CAG 2016
Leu Asp Arg Phe Lys Glu Gin Asn Asp Leu Val Glu Phe Hét Asn Gin 670
660 665
TTC GGT AAG AAA AAG ATG GAA CCT ATG ATT GAT GTT GCA TAT CGT GAG 2064
Phe Gly Lys Lys Lys Hét Glu Pro Hét Ile Asp Val Alá Tyr Arg Glu
675 680 685
TTA TGT GAT TAT ATG AAT AAC CGC GAG CAT CTG ATG CAT ATG GAC CGT 2112
Leu cys Asp Tyr Hét Asn Asn Arg Glu His Leu Hét His Hét Asp Arg
690 695 700
GAA GCT ATT TCT TGC CCT CCG CTT GGT TCA AAG GGC GTT GGT GGA TTT 2160
Glu Alá Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val Gly Gly Phe
705 710 715 720
TGG AAA GCG AAA AAG CGT TAT GCT CTG AAC GTT TAT GAT ATG GAA GAT 2208
Trp Lys Alá Lys Lys Arg 'yr Alá Leu Asn Val Tyr Asp Hét Glu Asp
725 730 735
AAG CGA TTT GCT GAA CCG CAT CTA AAA ATC ATG GGT ATG GAA ACT CAG 2256
Lys Arg Phe Alá Glu Pro His Leu Lys Ile Hét Gly Hét Glu Thr Gin
740 745 750
CAG AGT TCA ACA CCA AAA GCA GTG CAA GAA GCT CTC GAA GAA AGT ATT 2304
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Alá Val Gin Glu Alá Leu Glu Glu Ser Ile
755 760 765
CGT CGT ATT CTT CAG GAA GGT GAA GAG TCT GTC CAA GAA TAC TAC AAG 2352
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gly Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
AAC TTC GAG AAA GAA TAT CGT CAA CTT GAC TAT AAA GTT ATT GCT GAA 2400
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Val I Le Alá Glu
785 790 795 800
GTA AAA ACT GCG AAC GAT ATA GCG AAA TAT GAT GAT AAA GGT TGG CCA 2448
Val Lys Thr Alá Asn Asp Ile Alá Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
GGA TTT AAA TGC CCG TTC CAT ATT CGT GGT GTG CTA ACT TAT CGT CGA 2496
Gly Phe Lys Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
820 825 830
GCT GTT AGC GGT TTA GGT GTA GCT CCA ATT TTG GAT GGA AAT AAA GTA 2544
Alá Val Ser 835 Gly Leu ciy Val Alá 840 Pro Ile Leu Asp Gly 845 Asn Lys Val
ATG GTT Met Val CTT Leu CCA TTA CGT GAA GGA AAT CCA TTT GGT GAC AAG TGC ATT 2592
Pro Leu Arg Glu 855 Gly Asn Pro Phe Gly 860 Asp Lys Cys Ile
850
GCT TGG CCA TCG GGT ACA GAA CTT CCA AAA GAA ATT CGT TCT GAT GTG 2640
Alá Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu I le Arg Ser Asp Val
365 870 875 880
CTA TCT TGG ATT GAC CAC TCA ACT TTG TTC CAA AAA TCG TTT GTT AAA 2688
Leu Ser Trp He Asp His Ser Thr Leu Phe Gin Lys Ser Phe Val Lys
385 890 895
CCG CTT GCG Pro Leu Alá GGT ATG TGT GAA TCG GCT GGC ATG GAC TAT GAA GAA AAA 2736
Gly 900 Met Cys Glu Ser Alá 905 Gly Met Asp Tyr Glu 910 Glu Lys
GCT TCG TTA GAC TTC CTG TTT GGC 2760
Alá Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly
915 920
(2) 4. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) Hosszúság: 920 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 4. számú szekvencia
Arg His Leu 1 His Phe í Phe ι Phe Phe Phe Phe Phe í Phe Phe t Phe Phe ! Phe
1 5 10 15
Phe Phe Phe Phe Ile Ile Met Lys Glu Phe Tyr Ile Ser Ile Glu Thr
20 25 30
Val Gly Asn Asn Ile Val Glu Arg Tyr Ile Asp Glu Asn Gly Lys Glu
35 40 45
Arg Thr Arg Glu Val Glu Tyr Leu Pro Thr Met Phe Arg His Cys Lys
50 55 60
Glu Glu Ser Lys Tyr Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asn Cys Alá Pro Gin
65 70 75 80
Lys Phe Pro Ser Met Lys Asp Alá Arg Asp Trp Met Lys Arg Met Glu
85 90 95
Asp Ile Gly Leu Glu Alá Leu Gly Met Asn Asp Phe Lys Leu Alá Tyr
100 105 110
Ile Ser Asp Thr Tyr Gly Ser Glu Ile Val Tyr Asp Arg Lys Phe Val
115 120 125
Arg Val Alá Asn cys Asp I le Glu Val Thr Gly Asp Lys Phe Pro Asp
130 135 140
Pro I Met Lys . Alá Glu Tyr Glu Ile , Asp , Alá Ile Thr His Tyr , Asp Ser
145 150 155 160
Ile Asp Asp Arg Phe Tyr Val Phe Asp Leu Leu Asn Ser Hét Tyr ciy
165 170 175
Ser Val Ser Lys Trp Asp Alá Lys Leu Alá Alá Lys Leu Asp Cys Glu
130 185 190
Gly Gly Asp Glu Val Pro Gin Glu Ile Leu Asp Arg Val I le Tyr Met
195 200 205
Pro Phe Asp Asn Glu Arg Asp Hét Leu Hét Glu Tyr Ile Asn Leu Trp 210 215 220
Glu Gin Lys Arg Pro Alá Ile Phe Thr Gly Trp Asn He Glu Gly Phe 225 230 235 240
Asp Val Pro Tyr Ile Met Asn Arg Val Lys Met l le Leu Gly Glu 255 Arg
245 250
Ser Met Lys Arg Phe Ser Pro Ile Gly Arg Val Lys Ser Lys Leu Ile
260 265 270
Gin Asn Hét Tyr oiy Ser Lys Glu Ile Tyr Ser Ile Asp Gly Val Ser
275 230 235
He Leu Asp Tyr Leu Asp Leu Tyr Lys Lys Phe Alá Phe Thr Asn Leu
290 295 300
Pro Ser Phe Ser Leu Glu Ser Val Alá Gin His Glu Thr Lys Lys Gly
305 310 315 320
Lys Leu Pro Tyr Asp Gly Pro Ile Asn Lys Leu Arg Glu Thr Asn His
325 330 335
Gin Arg Tyr Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Asp Val Glu Ser Val Gin Alá
340 345 350
Ile Asp Lys Ile Arg Gly Phe Ile Asp Leu Val Leu Ser Met Ser Tyr
355 360 365
Tyr Alá Lys Met Pro Phe Ser Gly Val Hét Ser Pro Ile Lys Thr Trp
370 375 380
Asp Alá He He Phe Asn Ser Leu Lys Gly Glu His Lys Val Ile Pro
335 390 395 400
Gin Gin Gly Ser His Val Lys Gin Ser Phe Pro Gly Alá Phe Val Phe
405 410 415
Glu Pro Lys Pro Ile Alá Arg Arg Tyr Ile Met Ser Phe Asp Leu Thr
420 425 430
Ser Leu Tyr Pro Ser I le Ile Arg Gin Val Asn I le Ser Pro Glu Thr
435 440 445
Ile Arg Gly Gin Phe Lys Val His Pro Ile His Glu Tyr Ile Alá Gly 450 455 460
Thr Alá Pro Lys Pro Ser Asp Glu Tyr Ser Cys Ser Pro Asn Gly Trp
465 470 475 430
Met Tyr Asp Lys His Gin Glu Gly Ile Ile Pro Lys Glu Ile Alá Lys
435 490 495
Val Phe Phe Gin Arg Lys Asp Trp Lys Lys Lys Hét Phe Alá Glu Glu 500 505 510
He: Asn Alá Glu Alá Ile Lys Lys Ile Ile Met Lys Gly Alá Gly Ser 515 520 525
Cys Ser Thr Lys Pro Glu Val Glu Arg Tyr Val Lys Phe Ser Asp Asp 530 535 540
Phe Leu Asn Glu Leu Ser Asn Tyr Thr Glu Ser Val Leu Asn Ser Leu 545 550 555 560
I le Glu Glu Cys Glu Lys 565 Alá Alá Thr Leu Alá Asn Thr Asn Gin Leu
570 575
Asn Arg Lys Ile Leu Ile Asn Ser Leu Tyr Gly Alá Leu cty Asn Ile
530 585 590
His Phe Arg Tyr Tyr Asp Leu Arg Asn Alá Thr Alá Ile Thr Ile Phe
595 600 605
Gly Gin Val Gly Ile Gin Trp Ile Alá Arg Lys Ile Asn Glu Tyr Leu
610 615 620 1
Asn Lys Val cys Gly Thr Asn Asp Glu Asp Phe Ile Alá Alá Gly Asp
625 630 635 640
Thr Asp Ser Val Tyr Val Cys Val Asp Lys Val Ile Glu Lys Val Gly
645 650 655
Leu Asp Arg Phe Lys Glu Gin Asn Asp Leu Val Glu Phe Met Asn Gin
660 665 670
Phe Gly Lys 675 Lys Lys Met Glu Pro Met Ile Asp Val Alá Tyr Arg Glu
680 685
Leu Cys Asp Tyr Met Asn Asn Arg Glu His Leu Met His Met Asp Arg
690 695 700
Glu Alá Ile Ser Cys Pro Pro Leu Gly Ser Lys Gly Val Gly cty Phe
705 710 715 720
Trp Lys Alá Lys Lys Arg Tyr Alá Leu Asn Val Tyr Asp Met Glu Asp
725 730 735
Lys Arg Phe Alá Glu Pro His Leu Lys I le Met Gly Met Glu Thr Gin
740 745 750
Gin Ser Ser Thr Pro Lys Alá Val Gin Glu Alá Leu Glu Glu Ser Ile
755 760 765
Arg Arg Ile Leu Gin Glu Gly Glu Glu Ser Val Gin Glu Tyr Tyr Lys
770 775 780
Asn Phe Glu Lys Glu Tyr Arg Gin Leu Asp Tyr Lys Val Ile Alá Glu
785 790 795 800
Val Lys Thr Alá Asn Asp Ile Alá Lys Tyr Asp Asp Lys Gly Trp Pro
805 810 815
Gly Phe Lys Cys Pro Phe His Ile Arg Gly Val Leu Thr Tyr Arg Arg
820 825 830
Alá Val Ser ciy Leu Gly Val Alá Pro I le Leu Asp Gly Asn Lys Val
835 840 845
Met Val Leu Pro Leu Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Asp Lys cys Ile
850 855 860
Alá Trp Pro Ser Gly Thr Glu Leu Pro Lys Glu Ile Arg Ser Asp Val
865 870 875 880
Leu Ser Trp Ile Asp His Ser Thr Leu Phe Gin Lys Ser Phe Val Lys
885 890 895
Pro Leu Alá Gly Met Cys Glu Ser Alá Gly Met Asp Tyr Glu Glu Lys 900 905 910
Alá Ser Leu Asp Phe Leu Phe Gly 915 920
-34(2) 5. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) Hosszúság: 2459 bázispár (B) Típus: nukleinsav (C) Száltípus: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (ix) Tulajdonság:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Lokalizáció: 108..2456 (xi) A szekvencia leírása: 5. számú szekvencia
AAGCATGGCG CGAAGGCATA TTACGGGCAG TAATGACTGT
ACGAAACCAG GCTATACTCA AGCCTGGTTT TTTGATGGAT
ATAAAACCAC AGCCAATCAA
TTTCAGC GTG GCG CAG Val Alá Gin
116
GCA Alá GGT TTT ATC Gly Phe Ile 5 TTA ACC CGA CAC TGG CGG GAC ACC CCG CAA GGG ACA 164
Leu Thr Arg 10 His Trp Arg Asp Thr 15 Pro Gin Gly Thr
GAA GTC TCC TTC TGG CTG GCG ACG GAC AAC GGG CCG TTG CAG GTT ACG 212
Glu Val Ser Phe Trp Leu Alá Thr Asp Asn Gly Pro Leu Gin Val Thr
20 25 30 35
CTT GCA CCG CAA GAG TCC GTG GCG TTT ATT CCC GCC GAT CAG GTT CCC 260
Leu Alá Pro Gin Glu Ser Val Alá Phe I le Pro Alá Asp Gin Val Pro
40 45 50
CGC GCT CAG CAT ATT TTG CAG GGT GAA CAA GGC TTT CGC CTG ACA CCG 308
Arg Alá Gin His He Leu Gin Gly Glu Gin Gly Phe Arg Leu Thr Pro
55 60 65
CTG GCG TTA AAG GAT TTT CAC CGC CAG CCG GTG TAT GGC CTT TAC TGT 356
Leu Alá Leu Lys Asp Phe His Arg Gin Pro Val Tyr Gly Leu Tyr Cys
70 75 80
CGC GCC CAT CGC CAA TTG ATG AAT TAC GAA AAG CGC CTG CGT GAA GGT 404
Arg Alá His Arg Gin Leu Mer Asn Tyr Glu Lys Arg Leu Arg Glu Gly
35 90 95
GGC GTT ACC GTC TAC GAG GCC GAT GTG CGT CCG CCA GAA CGC TAT CTG 452
Gly Val Thr Val Tyr Glu Alá Asp Val Arg Pro Pro Glu Arg Tyr Leu
100 105 110 115
ATG GAG CGG TTT ATC ACC TCA CCG GTG TGG GTC GAG GGT GAT ATG CAC 500
Met Glu Arg Phe Ile Thr Ser Pro Val Trp Val Glu Gly Asp Met His
120 125 130
AAT GGC ACT ATC GTT AAT GCC CGT CTG AAA CCG CAT CCC GAC TAT CGT 548
Asn Gly Thr Ile Val Asn Alá Arg Leu Lys Pro His Pro Asp Tyr Arg
135 140 145
í.'. u Pro CCG CTC AAG TGG GTT TCT ATA GAT ATT GAA ACC ACC CGC CAC His GGT Gly 596
Pro Leu 150 Lys Trp Val Ser I le 155 Asp Ile Glu Thr Thr 160 Arg
GAG CTG TAC TGC ATC GGC CTG GAA GGC TGC GGG CAG CGC ATC GTT TAT 644
Glu Leu Tyr Cys Ile Gly Leu Glu Gly Cys Gly Gin Arg Ile Val Tyr
165 170 175
ATG CTG GGG CCG GAG AAT GGG GAC GCC TCC TCG CTT GAT TTC GAA CTG 692
Hét Leu Gly Pro Glu Asn Gly Asp Ala Ser Ser Leu Asp Phe Glu Leu
1S0 185 190 195
GAA TAC GTC GCC AGC CGC CCG CAG TTG CTG GAA AAA CTC AAC GCC TGG 740
Glu Tyr val Ala Ser Arg Pro Gin Leu Leu Glu Lys Leu Asn Ala Trp
200 205 210
TTT GCC AAC TAC GAT CCT GAT GTG ATC ATC GGT TGG AAC GTG GTG CAG 788
Pne Ala Asn Tyr Asp Pro Asp Val Ile l le Gly Trp Asn Val Val Gin
215 220 225
TTC GAT CTG CGA AT G CTG CAA AAA CAT GCC GAG CGT TAC CGT CTT CCG 836
Phe Asp Leu Arg Hét Leu Gin Lys His Ala Glu Arg Tyr Arg Leu Pro
230 235 240
CTG CGT CTT GGG CGC GAT AAT AGC GAG CTG GAG TGG CGC GAC GAC GGC 884
Leu Arg Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Leu Glu Trp Arg Asp Asp Gly
245 250 255
TTT AAA AAC GGC GTC TTT TTT GCC CAG GCT AAA GGT GGG CTA ATT ATC 932
Phe Lys Asn Gly Val Phe Phe Ala Gin Ala Lys Gly Gly Leu Ile Ile
260 265 270 275
GAC GGT ATC GAG GCG CTG AAA TCC GCG TTC TGG AAT TTC TCT TCA TTC 980
Asp Gly Ile Glu Ala Leu Lys Ser Ala Phe Trp Asn Phe Ser Ser Phe
280 285 290
TCG Ser CTG GAA ACT GTC GCT CAG GAG CTA TTA GGC GAA GGA AAA TCT ATC Ile 1028
Leu Glu Thr 295 Val Ala Gin Glu Leu Leu 300 Gly Glu Gly Lys 305 Ser
GAT AAC CCG TGG GAT CGA ATG GAC GAA ATT GAG CGC CGT TTC GCC GAA 1076
Asp Asn Pro Trp Asp Arg Met Asp Glu Ile Asp Arg Arg Phe Ala Glu
310 315 320
GAT AAA CCT GCG CTG GCA ACT TAT AAC CTG AAA GAT TGC GAG CTG GTG 1124
Asp Lys Pro Ala Leu Ala Thr Tyr Asn Leu Lys Asp Cys Glu Leu Val
325 330 335
ACG CAG ATC TTC CAC AAA ACT GAA ATC ATG CCA TTT TTA CTC GAA CGG 1172
Thr Gin He Phe His Lys Thr Glu I le Met Pro Phe Leu Leu Glu Arg
340 345 350 355
GCA ACG GTG AAC GGC CTG CCG GTG GAC CGA CAC GGC GGT TCG GTG GCG 1220
Ala Thr Val Asn Gly Leu Pro Val Asp Arg His Gly Gly Ser Val Ala
360 365 370
GCA TTT GGT CAT CTC TAT TTT CCG Phe Pro CGA ATG CAT CGC GCT GGT TAT GTC 1268
Ala Phe Gly His 375 Leu Tyr Arg 380 Hét His Arg Ala Gly 385 Tyr Val
GCG CCT AAT CTC GGC GAA GTG CCG CCG CAC GCC AGC CCT GGC GGC TAC 1316
Ala Pro Asn Leu Gly Glu Val Pro Pro His Ala Ser Pro ciy Gly Tyr
390 395 400
GTG ATG GAT TCA CGG CCA GGG CTT TAT GAT TCA GTG CTG GTG CTG GAC 1364
Val Met Asp Ser Arg Pro Gly Leu Tyr Asp Ser Val Leu Val Leu Asp
405 410 415
TAT AAA AGC CTG TAC CCG TCG ATC ATC CGC ACC TTT CTG ATT GAT CCC 1412
Tyr Lys Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Arg Thr Phe Leu Ile Asp Pro
420 425 430 435
GTC GGG CTG GTG GAA GGC ATG GCG CAG CCT GAT CCA GAG CAC AGT ACC 1460
Val Gly Leu Val Glu Gly Met Ala Gin Pro Asp Pro Glu His Ser Thr
440 445 450
GAA GGT TTT CTC GAT GCC TGG TTC TCG CGA GAA AAA CAT His TGC cys 465 CTG Leu CCG Pro 1508
Glu Gly Phe Leu 455 Asp Alá Trp Phe Ser 460 Arg Glu Lys
GAG ATT GTG ACT AAC ATC TGG CAC GGG CGC GAT GAA GCC AAA CGC CAG 1556
Glu He Val 470 Thr Asn Ile Trp His 475 Gly Arg Asp Glu Alá 480 Lys Arg Gin
GGT AAC AAA CCG CTG TCG CAG GCG CTG AAA ATC ATC ATG AAT GCC TTT 1604
Gly Asn 485 tys Pro Leu Ser Gin 490 Alá Leu Lys Ile Ile 495 Met Asn Alá Phe
TAT GGC GTG CTC GGC ACC ACC GCC TGC CGC TTC TTC GAT CCG CGG CTG 1652
Tyr 500 Gly Val Leu Gly Thr 505 Thr Alá cys Arg Phe 510 Phe Asp Pro Arg Leu 515
GCA TCG TCG ATC ACC ATG CGT GGT CAT CAG ATC ATG CGG CAA ACC AAA 1700
Alá Ser Ser Ite Thr 520 Met Arg ciy His Gin 525 Ile Met Arg Gin Thr 530 Lys
GCG TTG ATT GAA GCA CAG GGC TAC GAC GTT ATC TAC GGC GAT ACC GAC 1748
Alá Leu He Glu 535 Alá Gin Gly Tyr Asp 540 Val Ile Tyr Gly Asp 545 Thr Asp
TCA ACG TTT GTC TGG CTG AAA GGC GCA CAT TCG GAA GAA GAA GCG GCG 1796
Ser Thr Phe 550 Val Trp Leu Lys Gly 555 Alá His Ser Glu Glu 560 Glu Alá Alá
AAA ATC GGT CGT GCA CTG GTG GAG CAC GTT AAC GCC TGG TGG GCG GAA 1844
Lys Ile 565 Gly Arg Alá Leu Val 570 Gin His Val Asn Alá 575 Trp Trp Alá Glu
ACG CTG Thr Leu 580 CAA Gin AAA CAA CGG CTG ACC AGC GCA TTA GAA CTG GAG TAT GAA 1892
Lys Gin Arg Leu Thr Ser Alá Leu Glu Leu Glu Tyr Glu
585 590 595
ACC CAT TTC TGC CGT TTT CTG ATG CCA ACC ATT CGC GGA GCC GAT ACC 1940
Thr His Phe Cys Arg Phe Leu Met Pro Thr I le Arg Gly Alá Asp Thr
600 605 610
GGC AGT AAA AAG CGT TAT GCC GGA CTG ATT CAG GAG GGC GAC AAG CAG 1988
Gly Ser Lys Lys Arg Tyr Alá Gly Leu I le Gin Glu Gly Asp Lys Gin
615 620 625
GGG ATG GTG TTT AAA GGG CTG GAA ACC GTG CGC ACC GAC TGG ACG CCG 2036
Arg Met Val Phe Lys Gly Leu Glu Thr Val Arg Thr Asp Trp Thr Pro
630 635 640
CTG GCC CAG CAG TTT CAG CAG GAG CTA TAC CTG CGC ATC TTC CGC AAC 2084
Leu Alá Gin Gin Phe Gin Gin Glu Leu Tyr Leu Arg Ile Phe Arg Asn
645 650 655
GAG CCA TAT CAG GAA TAT GTA CGC GAA ACC ATC GAC AAA CTG ATG GCG 2132
Glu Pro Tyr Gin Glu Tyr Val Arg Glu Thr Ile Asp Lys Leu Met Alá
660 665 670 675
GGT GAA CTG GAT GCG CGA CTG GTT TAC CGT AAA CGC CTT CGC CGT CCG 2180
Gly Glu Leu Asp Alá Arg Leu Val Tyr Arg Lys Arg Leu Arg Arg Pro
680 685 690
CTG AGC GAG TAT CAG CGT AAT GTG CCG CCT CAT GTA CGC GCC GCT CGC 2228
Leu Ser Glu Tyr Gin Arg Asn Val Pro Pro His Val Arg Alá Alá Arg
695 700 705
CTT GCC GAT GAA GAA AAC CAA AAG CGT GGT CGC CCC TTG CAA TAT CAG 2276
Leu Alá Asp Glu Glu Asn Gin Lys Arg Gly Arg Pro Leu Gin Tyr Gin
710 715 720
AAT CGC GGC ACC ATT AAG TAC GTA TGG ACC ACC AAC GGC CCG GAG CCG 2324
Asn Arg Gly Thr Ile Lys Tyr Val Trp Thr Thr Asn Gly Pro Glu Pro
725 730 735
CTG GAC TAC CAA CGT Leu Asp Tyr Gin Arg 740 TCA CCA CTG GAT TAC GAA CAC TAT Tyr CTG ACC CGC Leu Thr Arg 755 2372
Ser 745 Pro Leu Asp Tyr Glu 750 His
CAG CTA CAA CCC GTG GCG GAG GGA ATA CTC CCT TTT ATT GAG GAT AAT 2420
Gin Leu Gin Pro Val Alá Glu dy l le Leu Pro Phe He Glu Asp Asn
760 765 770
TTT GCT ACA CTT ATG ACC GGG CAA CTT GGG CTA TTT TGA 2459
Phe Alá Thr Leu Met Thr Gly Gin Leu Gly Leu Phe
775 730
(2) 6. SZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
(A) Hosszúság: 783 aminosav (B) Típus: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) A szekvencia leírása: 6. számú szekvencia
Val Alá Gin Alá Gly Phe Ile Leu Thr Arg His Trp Arg Asp Thr Pro
1 5 10 15
Gin Gly Thr Glu Val Ser Phe Trp Leu Alá Thr Asp Asn Gly Pro Leu
20 25 30
Gin Val Thr Leu Alá Pro Gin Glu Ser Val Alá Phe Ile Pro Alá Asp
35 40 45
Gin Val Pro 50 Arg Alá Gin His 55 lle Leu Gin Gly Glu Gin Gly 60 Phe Arg
Leu Thr Pro Leu Alá Leu Lys Asp Phe His Arg Gin Pro Val Tyr Gly
65 70 75 80
Leu Tyr Cys Arg Alá His Arg Gin Leu Met Asn Tyr Glu Lys Arg Leu
85 90 95
Arg Glu Gly Gly Val Thr Val Tyr Glu Alá Asp Val Arg Pro Pro Glu
100 105 110
Arg Tyr Leu Met Glu Arg Phe Ile Thr Ser Pro Val Trp Val Glu Gly
115 120 125
Asp Met His Asn Gly Thr I le Val Asn Alá Arg Leu Lys Pro His Pro
130 135 140
Asp Tyr Arg Pro Pro Leu Lys Trp Val Ser Ile Asp Ile Glu Thr Thr
145 150 155 160
Arg His Gly Glu Leu Tyr cys Ile Gly Leu Glu Gly Cys Gly Gin Arg
165 170 175
Ile Val Tyr Met Leu Gly Pro Glu Asn Gly Asp Alá Ser Ser Leu Asp
130 185 190
Phe Glu Leu Glu Tyr Val Alá Ser Arg Pro Gin Leu Leu Glu Lys Leu
195 200 205
···· ·>
Asn Alá Trp Phe Alá Asn Tyr Asp Pro Asp Val Ile I le Gly Trp Asn
210 215 220
Val Val Gin Phe Asp Leu Arg Met Leu Gin Lys His Alá Glu Arg Tyr
225 230 235 240
Arg Leu Pro Leu Arg Leu Gly Arg Asp Asn Ser Glu Leu Glu Trp Arg
245 250 255
Asp Asp Gly Phe Lys Asn Gly Val Phe Phe Alá Gin Alá Lys Gly Gly
260 265 270
Leu Ile Ile Asp Gly Ile Glu Alá Leu Lys Ser Alá Phe Trp Asn Phe
275 280 285
Ser Ser Phe Ser Leu Glu Thr Val Alá Gin Glu Leu Leu Gly Glu Gly
290 295 300
Lys Ser Ile Asp Asn Pro Trp Asp Arg Hét Asp Glu Ile Asp Arg Arg
305 310 315 320
Phe Alá Glu Asp Lys Pro Alá Leu Alá Thr Tyr Asn Leu Lys Asp Cys
325 330 335
Glu Leu Val Thr Gin Ile Phe His Lys Thr Glu I le Hét Pro Phe Leu
340 345 350
Leu Glu Arg Alá Thr Val Asn Gly Leu Pro Val Asp Arg His Gly Gly
355 360 365
Ser Val Alá Alá Phe Gty His Leu Tyr Phe Pro Arg Hét His Arg Alá
370 375 380
Gly Tyr Val Alá Pro Asn Leu ciy Glu Val Pro Pro His Alá Ser Pro
385 390 395 400
Gly Gly Tyr Val Hét Asp Ser Arg Pro Gly Leu Tyr Asp Ser Val Leu
405 410 415
Val Leu Asp Tyr Lys Ser Leu Tyr Pro Ser I le Ile Arg Thr Phe Leu
420 425 430
11 e Asp Pro Val Gly Leu Val Glu Gty Hét Alá Gin Pro Asp Pro Glu
435 440 445
His Ser Thr Glu Gly Phe Leu Asp Alá Trp Phe Ser Arg Glu Lys His
450 455 460
Cys Leu Pro Glu Ile Val Thr Asn Ile Trp His Gly Arg Asp Glu Alá
465 470 475 480
Lys Arg Gin Gly Asn Lys Pro Leu Ser Gin Alá Leu Lys Ile Ile Hét
485 490 495
Asn Alá Phe Tyr Gly Val Leu Gly Thr Thr Alá Cys Arg Phe Phe Asp
500 505 510
Pro Arg Leu Alá Ser Ser Ile Thr Hét Arg Gly His Gin Ile Hét Arg 515 520 525
Gin Thr Lys Alá Leu Ile Glu Alá Gin Gly Tyr Asp Val Ile Tyr Gly 530 535 540
Asp Thr Asp Ser Thr Phe Val Trp Leu Lys Gly Alá His Ser Glu Glu
545 550 555 560
Glu Alá Alá Lys Ile Gly Arg Alá Leu Val Gin His Val Asn Alá Trp
565 570 575
Trp Alá Glu Thr Leu Gin Lys Gin Arg Leu Thr Ser Alá Leu Glu Leu 580 585 590
Glu Tyr Glu Thr His Phe Cys Arg Phe Leu Met Pro Thr Ile Arg Gly 595 600 605 *
• · ·· ··
Alá Asp Thr Gly Ser Lys Lys Arg Tyr Alá Gly Leu lle Gin Glu Gly
610 615 620
Asp Lys Gin Arg Met Val Phe Lys Gly Leu Glu Thr Val Arg Thr Asp
625 630 635 640
Trp Thr Pro Leu Alá Gin Gin Phe Gin Gin Glu Leu Tyr Leu Arg I le
645 650 655
Phe Arg Asn Glu Pro Tyr Gin Glu Tyr Val Arg Glu Thr lle Asp Lys
660 665 670
Leu Met Alá Gly Glu Leu Asp Alá Arg Leu Val Tyr Arg Lys Arg Leu
675 680 685
Arg Arg Pro Leu Ser Glu Tyr Gin Arg Asn Val Pro Pro H i s Val Arg
690 695 700
Alá Alá Arg Leu Alá Asp Glu Glu Asn Gin Lys Arg Gly Arg Pro Leu
705 710 715 720
Gin Tyr Gin Asn Arg Gly Thr lle Lys Tyr Val Trp Thr Thr Asn Gly
725 730 735
Pro Glu Pro Leu Asp Tyr Gin Arg Ser Pro Leu Asp Tyr Glu His Tyr
740 745 750
Leu Thr Arg Gin Leu Gin Pro Val Alá Glu Gly lle Leu Pro Phe I Le
755 760 765
Glu Asp Asn Phe Alá Thr Leu Met Thr oly Gin Leu Gly Leu Phe
770 775 780
V -40-

Claims (33)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy variáns B DNS polimeráz család, amelynek nincs 5'-3' exonukleáz aktivitása.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyhez az említett variáns polimerázt az alábbi csoportból választjuk: variáns T4 DNS polimeráz, variáns Escherichia coli DNS polimeráz II, variáns T2 DNS polimeráz és variáns T6 DNS polimeráz.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy az 50-es kodonpozícióban található izoleucint leucin helyettesíti.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 82-es kodonpozícióban található glutaminsavat aszparaginsav helyettesíti.
  5. 5. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 213-as kodonpozícióban található triptofánt szerin helyettesíti.
  6. 6. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 255-ös kodonpozícióban található glutaminsavat szerin helyettesíti.
  7. 7. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 417-es kodonpozícióban található izoleucint valin helyettesíti.
  8. 8. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 737-es kodonpozícióban található alanint valin helyettesíti.
    >
    -419. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 743-as kodonpozícióban található alanint valin helyettesíti.
  9. 10. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 112-es kodonpozícióban található aszpa raginsavat alanin helyettesíti.
  10. 11. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 114-es kodonpozícióban található izoleucint leucin helyettesíti.
  11. 12. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 219-es kodonpozícióban található aszparaginsavat alanin helyettesíti.
  12. 13. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett T4 DNS polimerázt az jellemzi, hogy az 50-es kodonpozícióban található izoleucint leucin helyettesíti.
  13. 14. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az említett Escherichia coli DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 156-os kodonpozícióban található aszparaginsavat alanin helyettesíti.
  14. 15. A 2. igénypont szerinti variáns B DNS polimeráz család, amelyben az em lített Escherichia coli DNS polimerázt az jellemzi, hogy a 158-as kodonpozícióban található glutaminsavat alanin helyettesíti.
  15. 16. Eljárás DNS szekvenálására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:
    egy polimerázt érintkezésbe hozunk egy prímért tartalmazó DNS szállal, dATP, dGTP, dCTP, dTTP jelenlétében, az első lánclezáró nukleotidot az alábbi csoportból választjuk: ddATP és 3'-amino-2',3'-didezoxi-ATP, a második lánclezáró ► '
    -42nukleotidot az alábbi csoportból választjuk: ddGTP és 3’-amino-2',3'-didezoxi-GTP, a harmadik lánclezáró nukleotidot az alábbi csoportból választjuk: araCTP és 3'-amino2',3'-didezoxi-CTP, a negyedik lánclezáró nukleotidot pedig az alábbi csoportból választjuk: araUTP és 3'-amino-2',3'-didezoxi-TTP, és hagyjuk az említett érintkezést lejátszódni olyan reakciókörülmények között, amelyek elég hosszú ideig fenntartják a polimeráz aktivitást ahhoz, hogy szekvencia információkat kapjunk.
  16. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett első lánclezáró nukleotid a ddATP, az említett második lánclezáró nukleotid ddGTP, az említett harmadik lánclezáró nukleotid araCTP, és az említett negyedik lánclezáró nukleotid araUTP.
  17. 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerázt az alábbi csoportból választjuk: T4 polimeráz, variáns Escherichia coli DNS polimeráz II, variáns T2 polimeráz és variáns T6 polimeráz.
  18. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimeráz egy variáns T4 polimeráz.
  19. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy legalább egy kapcsolódó fehérjét tartalmaz, amely komplexet képez az említett variáns T4 polimerázzal, és ezzel fokozza az említett variáns T4 polimeráz processzivitását.
  20. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsolódó fehérjét az alábbi T4 géntermék csoportból választjuk: 32, 41,45 és 44/62 komplex.
  21. 22. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a variáns polimeráz a variáns Escherichia coli DNS polimeráz II.
  22. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy legalább egy kapcsolódó fehérjét tartalmaz, amely komplexet képez az említett variáns Escherichia coli DNS polimeráz ll-vel, és ezzel fokozza az említett variáns Escherichia coli DNS polimeráz II processzivitását.
  23. 24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsolódó fehérje az alábbi fehérjék kombinációja: β-fehérje, γ-komplex és SSB fehérje.
  24. 25. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett első lánclezáró nukleotid a 3'-amino-2',3’-didezoxi-ATP, az említett második lánclezáró nukleotid a 3'-amino-2',3'-didezoxi-GTP, az említett harmadik lánclezáró nukleotid a 3'-amino-2',3'-didezoxi-CTP, és az említett negyedik lánclezáró nukleotid a 3'-amino2',3'-didezoxi-TTP.
  25. 26. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerázt az alábbi csoportból választjuk: T4 polimeráz, variáns T4 polimeráz, Escherichia coli DNS polimeráz II, variáns Escherichia coli DNS polimeráz II, T2 polimeráz, variáns T2 polimeráz, T6 polimeráz és variáns T6 polimeráz.
  26. 27. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimeráz vagy a T4 polimeráz vagy a variáns T4 polimeráz.
  27. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve továbbá, hogy legalább egy kapcsolódó fehérjét tartalmaz, amely komplexet képez a T4 polimerázzal vagy a variáns T4 polimerázzal, ezzel fokozva az említett T4 polimeráz vagy variáns T4 polimeráz processzivitását.
  28. 29. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kapcsolódó fehérjét az alábbi T4 géntermék csoportból választjuk: 32, 41,45 és 44/62 komplex.
  29. 30. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a variáns polimeráz Escherichia coli DNS polimeráz II vagy variáns Escherichia coli DNS polimeráz II.
    -44• · • · · ·· 9
  30. 31. A 30. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy kapcsolódó fehérjét tartalmaz, amely komplexet képez az Escherichia coli DNS polimeráz ll-vel vagy a variáns Escherichia coli DNS polimeráz ll-vel, fokozva ezzel az említett Escherichia coli DNS polimeráz II és a variáns Escherichia coli DNS polimeráz II processzivitását.
  31. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett kapcsolódó fehérje a β-fehérje, a γ-komplex és az SSB fehérje kombinációja.
  32. 33. Eljárás DNS szekvenálására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket tartalmazza:
    egy variáns T4 DNS polimerázt érintkezésbe hozunk egy prímért hordozó DNS szállal standard nukleotidok jelenlétében, aholis a standard nukleotidok közül az egyiknek a koncentrációja a többi standard nukleotidéhoz viszonyítva nagyon alacsony; és hagyjuk az említett érintkezést lejátszódni olyan reakciókörülmények között, amelyek között a polimeráz aktivitás elég hosszú ideig fennmarad ahhoz, hogy szekvencia információkat kapjunk.
  33. 34. Eljárás variáns T4 DNS polimerázok izolálására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk:
    olyan T4 törzseket azonosítunk, amelyek variáns T4 DNS polimerázt tartalmaznak, amennyiben ezek a polimerázok a DNS replikáció bizonyos lépéseiben detektívek;
    az említett variáns T4 DNS polimeráznak tovább módosított formáit izoláljuk, Escherichia coli optA1 gazdaszervezeten végzett szelekcióval;
    olyan T4 törzseket izolálunk, amelyek olyan variáns T4 DNS polimerázt tártál maznak, amelyekben legalább egy további mutáció található, amely kijavítja vagy kompenzálja az említett hibát a DNS replikációban;
    « k azonosítjuk a további javító/kompenzáló mutáció(ka)t az említett variáns T4 DNS polimerázokban; és az említett javító/kompenzáló mutáció(ka)t tartalmazó T4 DNS polimerázokat T4 tágba vagy T4 DNS polimeráz expressziós vektorba juttatjuk be.
HU9600235A 1993-08-02 1994-08-01 Dna sequencing enzymes HUT75841A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/101,593 US5547859A (en) 1993-08-02 1993-08-02 Chain-terminating nucleotides for DNA sequencing methods

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9600235D0 HU9600235D0 (en) 1996-03-28
HUT75841A true HUT75841A (en) 1997-05-28

Family

ID=22285458

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600235A HUT75841A (en) 1993-08-02 1994-08-01 Dna sequencing enzymes

Country Status (18)

Country Link
US (3) US5547859A (hu)
EP (1) EP0713535A1 (hu)
JP (1) JPH09509301A (hu)
KR (1) KR960704067A (hu)
CN (1) CN1132529A (hu)
AU (1) AU699498B2 (hu)
BG (1) BG100188A (hu)
BR (1) BR9407403A (hu)
CA (1) CA2168471A1 (hu)
CZ (1) CZ30696A3 (hu)
FI (1) FI960469A (hu)
HU (1) HUT75841A (hu)
LV (1) LV11486B (hu)
NO (1) NO960408L (hu)
NZ (1) NZ269727A (hu)
PL (1) PL312836A1 (hu)
SK (1) SK14196A3 (hu)
WO (1) WO1995004162A2 (hu)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406855B1 (en) 1994-02-17 2002-06-18 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US6335160B1 (en) 1995-02-17 2002-01-01 Maxygen, Inc. Methods and compositions for polypeptide engineering
US5614365A (en) * 1994-10-17 1997-03-25 President & Fellow Of Harvard College DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing
WO1997039150A1 (en) * 1996-04-15 1997-10-23 University Of Southern California Synthesis of fluorophore-labeled dna
US5827716A (en) * 1996-07-30 1998-10-27 Amersham Life Science, Inc. Modified Pol-II type DNA polymerases
US6291164B1 (en) 1996-11-22 2001-09-18 Invitrogen Corporation Methods for preventing inhibition of nucleic acid synthesis by pyrophosphate
US6780591B2 (en) 1998-05-01 2004-08-24 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
JP3813818B2 (ja) * 1998-05-01 2006-08-23 アリゾナ ボード オブ リージェンツ オリゴヌクレオチドおよびｄｎａ分子のヌクレオチド配列の決定方法
US7875440B2 (en) 1998-05-01 2011-01-25 Arizona Board Of Regents Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules
US6818395B1 (en) 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
EP1226255B1 (en) * 1999-10-29 2006-03-29 Stratagene California Compositions and methods utilizing dna polymerases
US20040009486A1 (en) 1999-10-29 2004-01-15 Sorge Joseph A. Compositions and methods utilizing DNA polymerases
US9708358B2 (en) 2000-10-06 2017-07-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding DNA and RNA
CA2425112C (en) 2000-10-06 2011-09-27 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massive parallel method for decoding dna and rna
GB0129012D0 (en) 2001-12-04 2002-01-23 Solexa Ltd Labelled nucleotides
US7057026B2 (en) * 2001-12-04 2006-06-06 Solexa Limited Labelled nucleotides
US7414116B2 (en) 2002-08-23 2008-08-19 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
JP2006509040A (ja) 2002-08-23 2006-03-16 ソレックサ リミテッド 修飾されたヌクレオチド
US11008359B2 (en) 2002-08-23 2021-05-18 Illumina Cambridge Limited Labelled nucleotides
US7169560B2 (en) 2003-11-12 2007-01-30 Helicos Biosciences Corporation Short cycle methods for sequencing polynucleotides
ATE463584T1 (de) 2004-02-19 2010-04-15 Helicos Biosciences Corp Verfahren zur analyse von polynukleotidsequenzen
US7635562B2 (en) 2004-05-25 2009-12-22 Helicos Biosciences Corporation Methods and devices for nucleic acid sequence determination
US7476734B2 (en) 2005-12-06 2009-01-13 Helicos Biosciences Corporation Nucleotide analogs
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
US7482120B2 (en) 2005-01-28 2009-01-27 Helicos Biosciences Corporation Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction
GB0517097D0 (en) * 2005-08-19 2005-09-28 Solexa Ltd Modified nucleosides and nucleotides and uses thereof
US7666593B2 (en) 2005-08-26 2010-02-23 Helicos Biosciences Corporation Single molecule sequencing of captured nucleic acids
WO2007070642A2 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Helicos Biosciences Corporation Methods for increasing accuracy of nucleic acid sequencing
US8399188B2 (en) 2006-09-28 2013-03-19 Illumina, Inc. Compositions and methods for nucleotide sequencing
US7883869B2 (en) 2006-12-01 2011-02-08 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators
EP2209911B1 (en) 2007-10-19 2013-10-16 The Trustees of Columbia University in the City of New York Dna sequencing with non-fluorescent nucleotide reversible terminators and cleavable label modified nucleotide terminators and a deoxyinosine analogue with a reversible terminator group
EP4310194A2 (en) 2007-10-19 2024-01-24 The Trustees of Columbia University in the City of New York Design and synthesis of cleavable fluorescent nucleotides as reversible terminators for dna sequencing by synthesis
US7811810B2 (en) 2007-10-25 2010-10-12 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
US7767441B2 (en) * 2007-10-25 2010-08-03 Industrial Technology Research Institute Bioassay system including optical detection apparatuses, and method for detecting biomolecules
CN102084000B (zh) 2008-02-01 2016-03-16 总医院有限公司 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后以及治疗中的用途
WO2011031877A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles
WO2011031892A1 (en) 2009-09-09 2011-03-17 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing kras mutations
US20140045915A1 (en) 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
WO2012064993A1 (en) 2010-11-10 2012-05-18 Exosome Diagnosties, Inc. Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom
CA2887058C (en) 2012-10-03 2022-02-22 Exosome Diagnostics, Inc. Use of microvesicles in diagnosis, prognosis, and treatment of medical diseases and conditions
WO2014144883A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
BR112015022448B1 (pt) 2013-03-15 2020-12-08 Illumina Cambridge Limited molécula de nucleotídeo ou nucleosídeo modificado, métodos para preparar o crescimento de polinucleotídeo complementar a polinucleotídeo alvo de fita simples em reação de sequenciação e para determinar a sequência de polinucleotídeo alvo de fita simples e kit
US10451544B2 (en) 2016-10-11 2019-10-22 Genotox Laboratories Methods of characterizing a urine sample

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4666892A (en) * 1984-03-06 1987-05-19 Sloan-Kettering Memorial Cancer Center Method and composition for hepatitis treatment with pyrimidine nucleoside compounds
DE3546374A1 (de) * 1985-12-31 1987-07-02 Max Planck Gesellschaft Verfahren zur sequenzanalyse von dna
CA1340806C (en) * 1986-07-02 1999-11-02 James Merrill Prober Method, system and reagents for dna sequencing
US4935361A (en) * 1986-09-18 1990-06-19 Yale University Cloning and expression of T4 DNA polymerase
US4942130A (en) * 1987-01-14 1990-07-17 President & Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5102785A (en) * 1987-09-28 1992-04-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method of gene mapping
US4962020A (en) * 1988-07-12 1990-10-09 President And Fellows Of Harvard College DNA sequencing
US5001050A (en) * 1989-03-24 1991-03-19 Consejo Superior Investigaciones Cientificas PHφ29 DNA polymerase
WO1991006679A1 (en) * 1989-10-24 1991-05-16 Stratagene An improved method for hybridizing nucleic acids using single-stranded nucleic acid binding protein
DE4214112A1 (de) * 1991-08-02 1993-02-04 Europ Lab Molekularbiolog Neues verfahren zur sequenzierung von nukleinsaeuren
US5316948A (en) * 1992-09-04 1994-05-31 Life Technologies, Inc. N4 -methyl-2'-deoxycytidine 5'-triphosphate and its use in polymerase-catalyzed nucleic acid syntheses
US5541311A (en) * 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US5436149A (en) * 1993-02-19 1995-07-25 Barnes; Wayne M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension

Also Published As

Publication number Publication date
AU699498B2 (en) 1998-12-03
NO960408D0 (no) 1996-01-31
BR9407403A (pt) 1996-11-05
US5660980A (en) 1997-08-26
AU7408894A (en) 1995-02-28
LV11486A (lv) 1996-08-20
NZ269727A (en) 1997-11-24
FI960469A0 (fi) 1996-02-01
BG100188A (en) 1996-12-31
KR960704067A (ko) 1996-08-31
PL312836A1 (en) 1996-05-13
US5928919A (en) 1999-07-27
CA2168471A1 (en) 1995-02-09
CZ30696A3 (en) 1996-06-12
WO1995004162A2 (en) 1995-02-09
WO1995004162A3 (en) 1995-06-01
LV11486B (en) 1997-02-20
JPH09509301A (ja) 1997-09-22
US5547859A (en) 1996-08-20
HU9600235D0 (en) 1996-03-28
EP0713535A1 (en) 1996-05-29
CN1132529A (zh) 1996-10-02
SK14196A3 (en) 1996-06-05
FI960469A (fi) 1996-03-27
NO960408L (no) 1996-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HUT75841A (en) Dna sequencing enzymes
US7501237B2 (en) Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
RU2235773C2 (ru) Модифицированная термостабильная днк-полимераза, способ её получения и применение
US4795699A (en) T7 DNA polymerase
US4994372A (en) DNA sequencing
US4921794A (en) T7 DNA polymerase
WO1998035060A9 (en) Polymerases for analyzing or typing polymorphic nucleic acid fragments and uses thereof
EP1934339B1 (en) Thermostable viral polymerases and methods of use
WO1998006736A1 (en) Stable compositions for nucleic acid amplification and sequencing
CN110741092A (zh) 扩增dna以维持甲基化状态的方法
US5173411A (en) Method for determining the nucleotide base sequence of a DNA molecule
US20120184017A1 (en) Mutant dna polymerases and uses therof
JP2005514003A (ja) 高いプライミング特異性を有するｄｎａの低温サイクル伸長
US20040132985A1 (en) Thermophilic DNA polymerases from Thermotoga neapolitana
US12006519B2 (en) Polymerase mutants and use with 3′-OH unblocked reversible terminators
JP2004135628A (ja) Ｄｎａの変異導入法

Legal Events

Date Code Title Description
DFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee