JPH10179162A - リンカー組成物及びこれを用いた５′−ｒａｃｅ法 - Google Patents
リンカー組成物及びこれを用いた５′−ｒａｃｅ法Info
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- JPH10179162A JPH10179162A JP8343119A JP34311996A JPH10179162A JP H10179162 A JPH10179162 A JP H10179162A JP 8343119 A JP8343119 A JP 8343119A JP 34311996 A JP34311996 A JP 34311996A JP H10179162 A JPH10179162 A JP H10179162A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ６塩基長以上の２本鎖部分と、その一方
の鎖の３′側に４塩基長以上の１本鎖部分を持つ部分２
本鎖ヌクレオチドの２種以上の混合物であって、各部分
２本鎖ヌクレオチド間の２本鎖部分の配列が共通であ
り、１本鎖部分の配列がランダムに異なっているヌクレ
オチドの混合物からなるリンカー組成物及びこれをリン
カーとして用いる５′−ＲＡＣＥ法。 【効果】 この方法によれば、５′側が欠落したｃＤＮ
Ａの５′側末端が効率よく、正確に修復、増幅できる。
の鎖の３′側に４塩基長以上の１本鎖部分を持つ部分２
本鎖ヌクレオチドの２種以上の混合物であって、各部分
２本鎖ヌクレオチド間の２本鎖部分の配列が共通であ
り、１本鎖部分の配列がランダムに異なっているヌクレ
オチドの混合物からなるリンカー組成物及びこれをリン
カーとして用いる５′−ＲＡＣＥ法。 【効果】 この方法によれば、５′側が欠落したｃＤＮ
Ａの５′側末端が効率よく、正確に修復、増幅できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、５′側ｃＤＮＡ末
端の迅速増幅法（５′−Rapid Amplification ofｃＤＮ
Ａ End法：５′−ＲＡＣＥ法）として知られている、
５′側の塩基配列が欠落したｃＤＮＡの５′側末端の迅
速増幅法の改良法に関する。
端の迅速増幅法（５′−Rapid Amplification ofｃＤＮ
Ａ End法：５′−ＲＡＣＥ法）として知られている、
５′側の塩基配列が欠落したｃＤＮＡの５′側末端の迅
速増幅法の改良法に関する。
【０００２】
【従来の技術】組織等から発現しているＤＮＡを解析す
るには、その組織から発現しているｍＲＮＡ群をまず抽
出し、プローブと呼ばれる既知のＤＮＡの一部（普通、
目的とするＤＮＡは蛋白質・アミノ酸から予測し、他の
ＤＮＡとは類似性を見ない部分を用いる）を使用して目
的のＲＮＡをつり上げ、そのＲＮＡから相補的なｃＤＮ
Ａを合成して解析する（分子細胞生物学基礎実験法：南
江堂 参照）。この時、何らかの事情によって、翻訳方
向に向かって上流部（５′側：ファイブプライム側）又
は下流部（３′側：スリープライム側）が欠落したｃＤ
ＮＡが得られる事がある。この不完全な遺伝情報から完
全なｃＤＮＡを再クローニングする方法としてＲＡＣＥ
法（Rapid Amprication of ｃＤＮＡ End法：Frohman e
t al., Natl. Acad. Sci. USA 85:8998〜9002(1988)）
が知られている。
るには、その組織から発現しているｍＲＮＡ群をまず抽
出し、プローブと呼ばれる既知のＤＮＡの一部（普通、
目的とするＤＮＡは蛋白質・アミノ酸から予測し、他の
ＤＮＡとは類似性を見ない部分を用いる）を使用して目
的のＲＮＡをつり上げ、そのＲＮＡから相補的なｃＤＮ
Ａを合成して解析する（分子細胞生物学基礎実験法：南
江堂 参照）。この時、何らかの事情によって、翻訳方
向に向かって上流部（５′側：ファイブプライム側）又
は下流部（３′側：スリープライム側）が欠落したｃＤ
ＮＡが得られる事がある。この不完全な遺伝情報から完
全なｃＤＮＡを再クローニングする方法としてＲＡＣＥ
法（Rapid Amprication of ｃＤＮＡ End法：Frohman e
t al., Natl. Acad. Sci. USA 85:8998〜9002(1988)）
が知られている。
【０００３】ＲＡＣＥ法とは、近年米国シータス社によ
って技術化されたポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣ
Ｒ法ともいう）を利用して欠落した部分のｃＤＮＡを修
復及び増幅させる方法であり、３′側欠落ｃＤＮＡを修
復及び増幅するＲＡＣＥ法を３′−ＲＡＣＥ法と呼び、
５′側欠落ｃＤＮＡを修復及び増幅するＲＡＣＥ法を
５′−ＲＡＣＥ法と呼ぶ。
って技術化されたポリメラーゼ連鎖反応法（以下、ＰＣ
Ｒ法ともいう）を利用して欠落した部分のｃＤＮＡを修
復及び増幅させる方法であり、３′側欠落ｃＤＮＡを修
復及び増幅するＲＡＣＥ法を３′−ＲＡＣＥ法と呼び、
５′側欠落ｃＤＮＡを修復及び増幅するＲＡＣＥ法を
５′−ＲＡＣＥ法と呼ぶ。
【０００４】発現している蛋白のＤＮＡは、塩基配列の
最後にＡ（アデニン）の重複（以下、ポリＡとも呼ぶ）
が存在し、３′−ＲＡＣＥ法はこのポリＡを目安に修復
及び合成ができるので比較的容易である。
最後にＡ（アデニン）の重複（以下、ポリＡとも呼ぶ）
が存在し、３′−ＲＡＣＥ法はこのポリＡを目安に修復
及び合成ができるので比較的容易である。
【０００５】これに対し、５′−ＲＡＣＥ法の場合は、
翻訳方向に向かって上流部を修復しなければならないた
めに、逆転写反応を新たに加えなければならず、また、
欠失した上流部の塩基配列が未知なため、ベクターへの
組み込みやＰＣＲ法による増幅を可能にするために、合
成ヌクレオチドなど配列のわかっている塩基列（以下、
リンカーと呼ぶ）を付加させなければならない。
翻訳方向に向かって上流部を修復しなければならないた
めに、逆転写反応を新たに加えなければならず、また、
欠失した上流部の塩基配列が未知なため、ベクターへの
組み込みやＰＣＲ法による増幅を可能にするために、合
成ヌクレオチドなど配列のわかっている塩基列（以下、
リンカーと呼ぶ）を付加させなければならない。
【０００６】逆転写反応は既知の方法を用いれば良い
が、特に、配列のわかっているリンカーを付加する反応
においては、現在、ＲＮＡリガーゼを用いた方法（以
下、ＲＮＡリガーゼ法ともいう：クローンテック社）と
ターミナルデオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼ
を用いた方法（以下、ＴｄＴ法ともいう：ライフテック
サイエンス社）とがある。
が、特に、配列のわかっているリンカーを付加する反応
においては、現在、ＲＮＡリガーゼを用いた方法（以
下、ＲＮＡリガーゼ法ともいう：クローンテック社）と
ターミナルデオキシヌクレオチヂルトランスフェラーゼ
を用いた方法（以下、ＴｄＴ法ともいう：ライフテック
サイエンス社）とがある。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、５′−
ＲＡＣＥ法はＤＮＡ解析においてこれほど重要にも係わ
らず、リンカーの付加反応において、ＲＮＡリガーゼ法
ではリンカー同士が数殊繋ぎになって付加される等とい
う問題点があり、また、ＴｄＴ法では理由は定かではな
いがｃＤＮＡにＣ（シトシン）などのデオキシリボヌク
レオチドを連鎖状に付加するときの制御が困難であるな
どの問題点があった。従って、本発明の目的は５′−Ｒ
ＡＣＥ法におけるリンカーとして有用な組成物及びこれ
を用いる改良された５′−ＲＡＣＥ法を提供することに
ある。
ＲＡＣＥ法はＤＮＡ解析においてこれほど重要にも係わ
らず、リンカーの付加反応において、ＲＮＡリガーゼ法
ではリンカー同士が数殊繋ぎになって付加される等とい
う問題点があり、また、ＴｄＴ法では理由は定かではな
いがｃＤＮＡにＣ（シトシン）などのデオキシリボヌク
レオチドを連鎖状に付加するときの制御が困難であるな
どの問題点があった。従って、本発明の目的は５′−Ｒ
ＡＣＥ法におけるリンカーとして有用な組成物及びこれ
を用いる改良された５′−ＲＡＣＥ法を提供することに
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は
５′−ＲＡＣＥ法のリンカーについて鋭意検討を重ねた
結果、部分的に２本鎖となった特殊なリンカー組成物を
設計し、このリンカーをＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮ
Ａの３′側に連結すれば、どのようなｃＤＮＡにも汎用
的に対応できる新規な５′−ＲＡＣＥ法が確立できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
５′−ＲＡＣＥ法のリンカーについて鋭意検討を重ねた
結果、部分的に２本鎖となった特殊なリンカー組成物を
設計し、このリンカーをＤＮＡリガーゼを用いてｃＤＮ
Ａの３′側に連結すれば、どのようなｃＤＮＡにも汎用
的に対応できる新規な５′−ＲＡＣＥ法が確立できるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００９】すなわち、本発明は、６塩基長以上の２本
鎖部分とその一方の鎖の３′側に４塩基長以上の１本鎖
部分を持つ部分２本鎖ヌクレオチドの２種以上の混合物
であって、各部分２本鎖ヌクレオチド間の２本鎖部分の
配列が共通であり、１本鎖部分の配列がランダムに異な
っているヌクレオチドの混合物からなるリンカー組成物
を提供するものである。
鎖部分とその一方の鎖の３′側に４塩基長以上の１本鎖
部分を持つ部分２本鎖ヌクレオチドの２種以上の混合物
であって、各部分２本鎖ヌクレオチド間の２本鎖部分の
配列が共通であり、１本鎖部分の配列がランダムに異な
っているヌクレオチドの混合物からなるリンカー組成物
を提供するものである。
【００１０】また、本発明は、逆転写により得られたｃ
ＤＮＡの３′側に連結するリンカーとして当該リンカー
組成物を用いることを特徴とする５′−ＲＡＣＥ法を提
供するものである。
ＤＮＡの３′側に連結するリンカーとして当該リンカー
組成物を用いることを特徴とする５′−ＲＡＣＥ法を提
供するものである。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明のリンカー組成物は、２種
以上の部分２本鎖ヌクレオチドの混合物であって、各部
分２本鎖ヌクレオチドの２本鎖部分は６塩基以上であ
り、その一方の鎖の３′側の１本鎖部分は４塩基以上で
あるが、当該２本鎖部分の塩基長は、この２本鎖部分の
一部又は全部に相補的なヌクレオチドをプライマーとし
て用いる必要性及び経済性の点から６〜４０塩基が好ま
しく、９〜４０塩基がより好ましく、１２〜４０塩基が
特に好ましい。また、１本鎖部分の塩基長は、逆転写に
より得られたｃＤＮＡに結合する必要性から４塩基以上
であればよいが、４〜２０塩基、特に４〜１２塩基が好
ましい。２０塩基以上であると、リンカーを結合した後
のｃＤＮＡ合成効率が悪くなる。
以上の部分２本鎖ヌクレオチドの混合物であって、各部
分２本鎖ヌクレオチドの２本鎖部分は６塩基以上であ
り、その一方の鎖の３′側の１本鎖部分は４塩基以上で
あるが、当該２本鎖部分の塩基長は、この２本鎖部分の
一部又は全部に相補的なヌクレオチドをプライマーとし
て用いる必要性及び経済性の点から６〜４０塩基が好ま
しく、９〜４０塩基がより好ましく、１２〜４０塩基が
特に好ましい。また、１本鎖部分の塩基長は、逆転写に
より得られたｃＤＮＡに結合する必要性から４塩基以上
であればよいが、４〜２０塩基、特に４〜１２塩基が好
ましい。２０塩基以上であると、リンカーを結合した後
のｃＤＮＡ合成効率が悪くなる。
【００１２】本発明リンカー組成物に含まれる各部分２
本鎖ヌクレオチド間において２本鎖部分の配列は共通で
あり、１本鎖部分の配列はランダムに異なっている必要
がある。これは、前記のように、この２本鎖部分はプラ
イマーとの結合部位となる部分であるから、各ヌクレオ
チド間で配列が共通である必要があり、一方、１本鎖部
分は逆転写して得られたｃＤＮＡとの結合部位となる部
分であるから、なるべく多くの異なった配列を有してい
ることが望ましいからである。ランダムに異なった一本
鎖部分は、その塩基配列の全ての組み合わせ（４塩基配
列の場合、２５６通り）の１／２通り以上（４塩基配列
の場合、１２８通り以上）の異なった配列であることが
好ましく、更に好ましくは２／３通り以上（４塩基配列
の場合、１７０通り以上）の異なった配列である。特に
一本鎖部分が４塩基の場合、その全ての組み合わせであ
る２５６通りの異なった配列であることが好ましい。
本鎖ヌクレオチド間において２本鎖部分の配列は共通で
あり、１本鎖部分の配列はランダムに異なっている必要
がある。これは、前記のように、この２本鎖部分はプラ
イマーとの結合部位となる部分であるから、各ヌクレオ
チド間で配列が共通である必要があり、一方、１本鎖部
分は逆転写して得られたｃＤＮＡとの結合部位となる部
分であるから、なるべく多くの異なった配列を有してい
ることが望ましいからである。ランダムに異なった一本
鎖部分は、その塩基配列の全ての組み合わせ（４塩基配
列の場合、２５６通り）の１／２通り以上（４塩基配列
の場合、１２８通り以上）の異なった配列であることが
好ましく、更に好ましくは２／３通り以上（４塩基配列
の場合、１７０通り以上）の異なった配列である。特に
一本鎖部分が４塩基の場合、その全ての組み合わせであ
る２５６通りの異なった配列であることが好ましい。
【００１３】このようなリンカー組成物は、例えばまず
リン酸トリエステル法、ホスホルアミダイド法、Ｈ−ホ
スホネート法などを用いたＤＮＡ合成機を用いて、６塩
基長以上の１本鎖ヌクレオチド（Ａ）と、該ヌクレオチ
ド（Ａ）と５′側配列を少なくとも６塩基共通にする２
種以上の１０塩基長以上のヌクレオチド（Ｂ）をそれぞ
れ合成し、次いで該ヌクレオチド（Ａ）と２種以上のヌ
クレオチド（Ｂ）とをアニーリングさせることにより製
造することができる。
リン酸トリエステル法、ホスホルアミダイド法、Ｈ−ホ
スホネート法などを用いたＤＮＡ合成機を用いて、６塩
基長以上の１本鎖ヌクレオチド（Ａ）と、該ヌクレオチ
ド（Ａ）と５′側配列を少なくとも６塩基共通にする２
種以上の１０塩基長以上のヌクレオチド（Ｂ）をそれぞ
れ合成し、次いで該ヌクレオチド（Ａ）と２種以上のヌ
クレオチド（Ｂ）とをアニーリングさせることにより製
造することができる。
【００１４】ここで、アニーリング反応は、通常のアニ
ーリング法、例えば塩濃度の高い緩衝液中、高温（９５
℃以上）にした後、徐々に温度を下げることにより行う
ことができる。
ーリング法、例えば塩濃度の高い緩衝液中、高温（９５
℃以上）にした後、徐々に温度を下げることにより行う
ことができる。
【００１５】本発明の５′−ＲＡＣＥ法は、逆転写によ
り得られたｃＤＮＡの３′側に連結するリンカーとして
本発明リンカー組成物を用いる以外は、通常の５′−Ｒ
ＡＣＥ法に従って行われる。
り得られたｃＤＮＡの３′側に連結するリンカーとして
本発明リンカー組成物を用いる以外は、通常の５′−Ｒ
ＡＣＥ法に従って行われる。
【００１６】また、ここでリンカーの連結手段はＤＮＡ
リガーゼにより行われる。ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ファージ由来）、ＰｆｕＤＮＡ
リガーゼ（Pyrococcus furiosis由来）、ＴａｑＤＮＡ
リガーゼ（Therms aquaticus由来）等が用いられる。こ
のうち、反応をより低温で行うことができることから、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるのがより好ましい。
リガーゼにより行われる。ＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼ（Ｔ４ファージ由来）、ＰｆｕＤＮＡ
リガーゼ（Pyrococcus furiosis由来）、ＴａｑＤＮＡ
リガーゼ（Therms aquaticus由来）等が用いられる。こ
のうち、反応をより低温で行うことができることから、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるのがより好ましい。
【００１７】Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いる場合のリンカ
ーの連結反応は、例えばpH７．２〜７．８（好ましくは
pH７．４〜７．６）の、３mM〜１５mM（好ましくは５mM
〜１０mM）の塩化マグネシウム、０．５mM〜３．０mM
（好ましくは１．０mM〜２．０mM）のジチオスレイトー
ル、及び０．５mM〜３．０mM（好ましくは１．０mM〜
２．０mM）のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を含む１０
mM〜１５０mM（好ましくは２５mM〜１００mM）のトリス
塩酸バッファー中に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００〜８０
０ユニット（好ましくは３００〜５００ユニット）、ｃ
ＤＮＡ量の０．１〜１．０μｇ（好ましくは０．２〜
０．８μｇ）、及びリンカー組成物量１．０〜１０．０
μｇ（好ましくは３．０〜８．０μｇ）を混合して、１
４〜１８℃（好ましくは１５〜１７℃）の温度で６時間
〜２４時間（好ましくは８時間〜１６時間）反応させる
ことにより行われる。
ーの連結反応は、例えばpH７．２〜７．８（好ましくは
pH７．４〜７．６）の、３mM〜１５mM（好ましくは５mM
〜１０mM）の塩化マグネシウム、０．５mM〜３．０mM
（好ましくは１．０mM〜２．０mM）のジチオスレイトー
ル、及び０．５mM〜３．０mM（好ましくは１．０mM〜
２．０mM）のＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を含む１０
mM〜１５０mM（好ましくは２５mM〜１００mM）のトリス
塩酸バッファー中に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２００〜８０
０ユニット（好ましくは３００〜５００ユニット）、ｃ
ＤＮＡ量の０．１〜１．０μｇ（好ましくは０．２〜
０．８μｇ）、及びリンカー組成物量１．０〜１０．０
μｇ（好ましくは３．０〜８．０μｇ）を混合して、１
４〜１８℃（好ましくは１５〜１７℃）の温度で６時間
〜２４時間（好ましくは８時間〜１６時間）反応させる
ことにより行われる。
【００１８】本発明の５′−ＲＡＣＥ法は、より具体的
には、例えば、５′側の塩基配列が欠落したｃＤＮＡの
うち配列の判明している３′側の配列の一部に相補的な
プライマー（１）を用いてｍＲＮＡの逆転写反応を行
い、得られたｃＤＮＡの３′側に本発明のリンカー組成
物をＤＮＡリガーゼにより連結させ、次いで該プライマ
ー（１）及び該リンカー組成物の２本鎖部分の配列の一
部又は全部に相補的なプライマー（２）を用いてＰＣＲ
反応を行うことによる５′側の塩基配列が欠落したｃＤ
ＮＡの５′側末端の迅速増幅方法である。
には、例えば、５′側の塩基配列が欠落したｃＤＮＡの
うち配列の判明している３′側の配列の一部に相補的な
プライマー（１）を用いてｍＲＮＡの逆転写反応を行
い、得られたｃＤＮＡの３′側に本発明のリンカー組成
物をＤＮＡリガーゼにより連結させ、次いで該プライマ
ー（１）及び該リンカー組成物の２本鎖部分の配列の一
部又は全部に相補的なプライマー（２）を用いてＰＣＲ
反応を行うことによる５′側の塩基配列が欠落したｃＤ
ＮＡの５′側末端の迅速増幅方法である。
【００１９】次に、本発明の５′−ＲＡＣＥ法をより詳
細に説明する。
細に説明する。
【００２０】（１）プライマー（１）の作製 まず最初に、５′側欠落ｃＤＮＡの判明している部分
で、相補的な配列のプライマー（１）（以下、下流部プ
ライマーとも呼ぶ）を作製する。プライマーは核酸の合
成反応においてヌクレオチド鎖が伸びていく出発点とし
て働く６〜４０塩基の１本鎖ヌクレオチドで、リン酸ト
リエステル法、ホスホルアミダイド法、Ｈ−ホスホネー
ト法などを用いたＤＮＡ合成機等既知の方法で容易に合
成できる。
で、相補的な配列のプライマー（１）（以下、下流部プ
ライマーとも呼ぶ）を作製する。プライマーは核酸の合
成反応においてヌクレオチド鎖が伸びていく出発点とし
て働く６〜４０塩基の１本鎖ヌクレオチドで、リン酸ト
リエステル法、ホスホルアミダイド法、Ｈ−ホスホネー
ト法などを用いたＤＮＡ合成機等既知の方法で容易に合
成できる。
【００２１】（２）プライマー（１）を用いた逆転写反
応 次に、プライマー（１）を、組織より抽出したｍＲＮＡ
群の中に入れ、逆転写反応をする。組織よりのｍＲＮＡ
の抽出は、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム密
度勾配遠心法など既知の方法が利用できる。
応 次に、プライマー（１）を、組織より抽出したｍＲＮＡ
群の中に入れ、逆転写反応をする。組織よりのｍＲＮＡ
の抽出は、グアニジンチオシアネート／塩化セシウム密
度勾配遠心法など既知の方法が利用できる。
【００２２】逆転写反応の条件は既知の方法で行う事が
できるが、例を挙げると、pH７．８〜８．５（好ましく
はpH８．０〜８．２）の７５mM塩化カリウム、３mM塩化
マグネシウム及び１０mMジチオスレイトールを含む５０
mMトリス塩酸バッファー中において、逆転写酵素１０〜
１００ユニット（好ましくは３０〜８０ユニット）、Ｒ
ＮＡ量０．２〜５．０μｇ（好ましくは１．０〜３．０
μｇ）、ｄＮＴＰ（デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、
デオキシＧＴＰ、デオキシＴＴＰを等モル比で混合した
もの）を好ましくは各１mM、及びプライマー５０〜２５
０μＭ（好ましくは１００〜２００μＭ）を混合して３
７〜４５℃（好ましくは３８〜４２℃）の温度で３０分
〜３時間（好ましくは１時間〜２時間）反応させる。
できるが、例を挙げると、pH７．８〜８．５（好ましく
はpH８．０〜８．２）の７５mM塩化カリウム、３mM塩化
マグネシウム及び１０mMジチオスレイトールを含む５０
mMトリス塩酸バッファー中において、逆転写酵素１０〜
１００ユニット（好ましくは３０〜８０ユニット）、Ｒ
ＮＡ量０．２〜５．０μｇ（好ましくは１．０〜３．０
μｇ）、ｄＮＴＰ（デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、
デオキシＧＴＰ、デオキシＴＴＰを等モル比で混合した
もの）を好ましくは各１mM、及びプライマー５０〜２５
０μＭ（好ましくは１００〜２００μＭ）を混合して３
７〜４５℃（好ましくは３８〜４２℃）の温度で３０分
〜３時間（好ましくは１時間〜２時間）反応させる。
【００２３】使用される逆転写酵素には、ＲＡＶ−２
（Rous associated virus ２由来）、ＡＭＶ（Avian my
eloblastosis virus由来）などが挙げられ、限定はしな
いが、ＲＡＶ−２が望ましい。
（Rous associated virus ２由来）、ＡＭＶ（Avian my
eloblastosis virus由来）などが挙げられ、限定はしな
いが、ＲＡＶ−２が望ましい。
【００２４】（３）ｍＲＮＡの分解 次に、逆転写反応を行った溶液にＲＮＡ分解酵素ＲＮａ
ｓｅＨを添加してｍＲＮＡを分解し、相補的なｃＤＮＡ
のみ１本鎖にする。分解は、既知の方法で行う事ができ
るが、ＲＮａｓｅＨの濃度を１００〜５００ユニット、
好ましくは２００〜３００ユニットとなるように添加
し、室温〜３７℃で１０分〜１時間反応を行う。
ｓｅＨを添加してｍＲＮＡを分解し、相補的なｃＤＮＡ
のみ１本鎖にする。分解は、既知の方法で行う事ができ
るが、ＲＮａｓｅＨの濃度を１００〜５００ユニット、
好ましくは２００〜３００ユニットとなるように添加
し、室温〜３７℃で１０分〜１時間反応を行う。
【００２５】（４）リンカーの付加 次に、上流部に本発明リンカー組成物を連結させる。連
結反応は前記の条件で行われる。
結反応は前記の条件で行われる。
【００２６】（５）ＰＣＲ法による増幅 次に、連結したリンカーからプライマー（２）（以下、
付加塩基プライマーとも呼ぶ）を作製し、プライマー
（１）と併用してＰＣＲ法により増幅する。この時のＰ
ＣＲ法の条件は、特に限定はしないが、例を挙げると、
pH８．３の５０mM塩化カリウム、１．５mM塩化マグネシ
ウム及び１mMジチオスレイトールを含む１０mMトリス塩
酸バッファー中において、ＤＮＡポリメラーゼ０．５〜
２．５ユニット、好ましくは１．０〜２．０ユニット、
ｄＮＴＰ（デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシ
ＧＴＰ、デオキシＴＴＰを等モル比で混合したもの）を
好ましくは各０．１〜０．５μＭ、及びプライマー濃度
をそれぞれ０．１〜０．５μＭとなるように混合し、 １．ＤＮＡ変性、９４〜９８℃、３０秒〜３分 ２．プライマーのアニーリング、５０〜６０℃、１分〜
３分 ３．プライマーの伸長、６５〜７５℃ 1 〜３を３０〜５０回繰り返すのが普通である。
付加塩基プライマーとも呼ぶ）を作製し、プライマー
（１）と併用してＰＣＲ法により増幅する。この時のＰ
ＣＲ法の条件は、特に限定はしないが、例を挙げると、
pH８．３の５０mM塩化カリウム、１．５mM塩化マグネシ
ウム及び１mMジチオスレイトールを含む１０mMトリス塩
酸バッファー中において、ＤＮＡポリメラーゼ０．５〜
２．５ユニット、好ましくは１．０〜２．０ユニット、
ｄＮＴＰ（デオキシＡＴＰ、デオキシＣＴＰ、デオキシ
ＧＴＰ、デオキシＴＴＰを等モル比で混合したもの）を
好ましくは各０．１〜０．５μＭ、及びプライマー濃度
をそれぞれ０．１〜０．５μＭとなるように混合し、 １．ＤＮＡ変性、９４〜９８℃、３０秒〜３分 ２．プライマーのアニーリング、５０〜６０℃、１分〜
３分 ３．プライマーの伸長、６５〜７５℃ 1 〜３を３０〜５０回繰り返すのが普通である。
【００２７】このようにして増幅されたｃＤＮＡは欠落
した５′側が修復されている。かくして修復、増幅され
たｃＤＮＡはベクターに組み込み、大腸菌、酵母などの
微生物に軽質転換させて、ＤＮＡの解析などに用いるこ
とができる。
した５′側が修復されている。かくして修復、増幅され
たｃＤＮＡはベクターに組み込み、大腸菌、酵母などの
微生物に軽質転換させて、ＤＮＡの解析などに用いるこ
とができる。
【００２８】
【発明の効果】本発明の５′−ＲＡＣＥ法によれば、解
析したいＤＮＡにおいてはどのようなものであっても、
５′側が修復されたｃＤＮＡを効率よく増幅することが
でき、本来のリンカーが重複せずに遺伝子組み換えベク
ターに組み込むことができる。また、この遺伝子組み換
えベクターを用いて、大腸菌、酵母等の微生物や動物細
胞を軽質転換し、培養することにより、そのＤＮＡの解
析やタンパク質組成物を産生することができる。
析したいＤＮＡにおいてはどのようなものであっても、
５′側が修復されたｃＤＮＡを効率よく増幅することが
でき、本来のリンカーが重複せずに遺伝子組み換えベク
ターに組み込むことができる。また、この遺伝子組み換
えベクターを用いて、大腸菌、酵母等の微生物や動物細
胞を軽質転換し、培養することにより、そのＤＮＡの解
析やタンパク質組成物を産生することができる。
【００２９】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に且
つ具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限さ
れるものではない。
つ具体的に説明するが、本発明はこれにより何ら制限さ
れるものではない。
【００３０】実施例１（ヒトβ−アクチン遺伝子のｃＤ
ＮＡ合成） （Ａ）ヒトβ−アクチン遺伝子下流部プライマーの設定 下流部のプライマーは下記式にて表されるプライマーを
作製した。（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニ
ン、シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキ
シリボヌクレオチドを意味する）
ＮＡ合成） （Ａ）ヒトβ−アクチン遺伝子下流部プライマーの設定 下流部のプライマーは下記式にて表されるプライマーを
作製した。（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニ
ン、シトシン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキ
シリボヌクレオチドを意味する）
【００３１】
【化１】
【００３２】これはＤＮＡＳＩＳ（ＤＮＡデータバン
ク）のヒトβ−アクチンＤＮＡデータより作製し、上流
部より約６００塩基の位置のものである。
ク）のヒトβ−アクチンＤＮＡデータより作製し、上流
部より約６００塩基の位置のものである。
【００３３】（Ｂ）ＲＮＡの逆転写 ヒト胎盤組織より発現しているｍＲＮＡをグアニジウム
イソチオシアネート法によって分離し、前記（Ａ）のプ
ライマーを用いて逆転写した。
イソチオシアネート法によって分離し、前記（Ａ）のプ
ライマーを用いて逆転写した。
【００３４】反応条件の詳細を下記に示す。 １．ＲＮＡ液（１μｇ相当） ２μｌ ２．ＤＥＰＣ水 １２μｌ ３．逆転写バッファー（逆転写酵素ＲＡＶ−２添付） １０μｌ ４．２．５mM ｄＮＴＰ（宝酒造社製） ２０μｌ ５．Ribonucleae Inhibitor（宝酒造社製） ２μｌ ６．前記Ａプライマー（１００μＭ／μｌ） ２μｌ ７．逆転写酵素ＲＡＶ−２（宝酒造社製） ２μｌ （１）１と２を混合し、９５℃２分間加熱した。 （２）更に３〜７の試薬を加え、４２℃２時間反応し
た。 調製されたｃＤＮＡ液はフェノール・クロロホルム法に
より処理し、エタノール沈殿による回収、乾燥の後、５
０μｌの精製水に溶解した（Ｂ反応液と呼ぶ）。
た。 調製されたｃＤＮＡ液はフェノール・クロロホルム法に
より処理し、エタノール沈殿による回収、乾燥の後、５
０μｌの精製水に溶解した（Ｂ反応液と呼ぶ）。
【００３５】（Ｃ）リンカーの連結 リンカー組成物は、下記式のものを用いた（式中、Ａ、
Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、シトシン、グアニン
及びチミン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドを意
味する、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴいずれかの塩基を有する
デオキシリボヌクレオチドを意味する。また、ＮＨ3−
はアミノ基を表し、Ｐ+はリン酸化されていること、Ｐ-
はリン酸化されていないことを表す）。
Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、シトシン、グアニン
及びチミン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドを意
味する、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ及びＴいずれかの塩基を有する
デオキシリボヌクレオチドを意味する。また、ＮＨ3−
はアミノ基を表し、Ｐ+はリン酸化されていること、Ｐ-
はリン酸化されていないことを表す）。
【００３６】
【化２】
【００３７】Ｂ反応液にＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）を
５μｌ加え、室温で３０分間反応させＲＮＡを分解し
た。反応液はフェノール・クロロホルム法により処理
し、エタノール沈殿による回収、乾燥の後、２０μｌの
精製水に溶解した（Ｃ反応液と呼ぶ）。
５μｌ加え、室温で３０分間反応させＲＮＡを分解し
た。反応液はフェノール・クロロホルム法により処理
し、エタノール沈殿による回収、乾燥の後、２０μｌの
精製水に溶解した（Ｃ反応液と呼ぶ）。
【００３８】 １．Ｃ反応液 １０μｌ ２．リンカー（１μｇ／μｌ） ４μｌ ３．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製） １０μｌ ４．５×ライゲーションバッファー（宝酒造社製） ６μｌ １〜４を混合し、１７℃１６時間反応させた。
【００３９】反応の後、Microcon（アミコン社製）を用
いてｃＤＮＡを回収し、精製水により洗浄した。最終的
には、４５μｌに調製した（反応液Ｃ）。
いてｃＤＮＡを回収し、精製水により洗浄した。最終的
には、４５μｌに調製した（反応液Ｃ）。
【００４０】（Ｄ）合成したｃＤＮＡの増幅 リンカー内の配列から新たにプライマーを設定した（リ
ンカープライマーと呼ぶ）。リンカープライマーは下記
式（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、シト
シン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリボヌ
クレオチドを意味する）。
ンカープライマーと呼ぶ）。リンカープライマーは下記
式（式中、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴはそれぞれアデニン、シト
シン、グアニン及びチミン塩基を有するデオキシリボヌ
クレオチドを意味する）。
【００４１】
【化３】
【００４２】前記下流部プライマーとリンカープライマ
ーを用いてＰＣＲ法により、ｃＤＮＡを増幅した。反応
条件の詳細を下記に示す。
ーを用いてＰＣＲ法により、ｃＤＮＡを増幅した。反応
条件の詳細を下記に示す。
【００４３】 １．反応液Ｃ ３８μｌ ２．１０×ＰＣＲバッファー（宝酒造社製） ５μｌ ３．２．５mM ｄＮＴＰ（宝酒造社製） ５μｌ ４．前記Ａプライマー（１００ｐＭ／μｌ） １μｌ ５．リンカープライマー（１１２ｐＭ／μｌ） １μｌ ６．Ｔａｑ ポリメラーゼ（宝酒造社製） ０．５μｌ １〜６を混合した後、次の反応条件においてＰＣＲを行
った。
った。
【００４４】ＰＣＲ反応条件 前反応９８℃ ３分 １． ９４℃ １分 ２． ５５℃ ２分 ３． ６８℃ ３分 １〜３×４０回繰り返し。全ての反応終了後４℃にて保
存した（反応液Ｄ）。
存した（反応液Ｄ）。
【００４５】合成したｃＤＮＡを１．５％アガロース電
気泳動により検討した結果、６００ｂｐに相当するｃＤ
ＮＡのみが得られた。
気泳動により検討した結果、６００ｂｐに相当するｃＤ
ＮＡのみが得られた。
【００４６】（Ｅ）合成ｃＤＮＡのプラスミドベクター
への組み込み 合成ｃＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ Ｉにて切断の後、大腸
菌用プラスミドベクターBluescript II KS＋（東洋紡社
製）のＸｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｖ部位に組み込んだ。
への組み込み 合成ｃＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ Ｉにて切断の後、大腸
菌用プラスミドベクターBluescript II KS＋（東洋紡社
製）のＸｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｖ部位に組み込んだ。
【００４７】 １．反応液 １０μｌ ２．Ｘｈｏ Ｉ−ＥｃｏＲ Ｖ切断Bluescript II KS＋（５μｇ） ６μｌ ３．Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製） ２μｌ ４．１０×ライゲーションバッファー（宝酒造社製） ２μｌ １〜４を混合し、１７℃１６時間反応させた。
【００４８】（Ｆ）前記Ｅのプラスミドを大腸菌ＪＡ−
１０９株に形質転換した。 形質転換したＪＡ−１０９株より、フェーノル・クロロ
ホルム法によりＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿による
回収の後、制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＥｃｏＲＶで切断
し、１．５％アガロース電気泳動にて組み込んだｃＤＮ
Ａを確認した。
１０９株に形質転換した。 形質転換したＪＡ−１０９株より、フェーノル・クロロ
ホルム法によりＤＮＡを抽出し、エタノール沈殿による
回収の後、制限酵素Ｘｈｏ Ｉ及びＥｃｏＲＶで切断
し、１．５％アガロース電気泳動にて組み込んだｃＤＮ
Ａを確認した。
【００４９】（Ｇ）合成ＤＮＡの遺伝子解析 Sequencing Kit Ver.2 ７−ＤＥＡＺＡ（宝酒造社製）
を使用してプラスミドに導入した合成ｃＤＮＡ上流部の
解析を行った。その結果、得られたｃＤＮＡはＤＮＡＳ
ＩＳ（ＤＮＡデータバンク）のヒトβ−アクチンＤＮＡ
データの５′側と完全に一致しており、本発明方法によ
り、５′側が完全に修復、増幅されたことが確認され
た。
を使用してプラスミドに導入した合成ｃＤＮＡ上流部の
解析を行った。その結果、得られたｃＤＮＡはＤＮＡＳ
ＩＳ（ＤＮＡデータバンク）のヒトβ−アクチンＤＮＡ
データの５′側と完全に一致しており、本発明方法によ
り、５′側が完全に修復、増幅されたことが確認され
た。
Claims (5)
- 【請求項１】 ６塩基長以上の２本鎖部分とその一方の
鎖の３′側に４塩基長以上の１本鎖部分を持つ部分２本
鎖ヌクレオチドの２種以上の混合物であって、各部分２
本鎖ヌクレオチド間の２本鎖部分の配列が共通であり、
１本鎖部分の配列がランダムに異なっているヌクレオチ
ドの混合物からなるリンカー組成物。 - 【請求項２】 ２本鎖部分の塩基長が６〜４０塩基であ
り、１本鎖部分の塩基長が４〜２０塩基である請求項１
記載のリンカー組成物。 - 【請求項３】 逆転写により得られたｃＤＮＡの３′側
に連結するリンカーとして請求項１又は２記載のリンカ
ー組成物を用いることを特徴とする５′−ＲＡＣＥ法。 - 【請求項４】 リンカーの連結手段がＤＮＡリガーゼに
よるものである請求項３記載の５′−ＲＡＣＥ法。 - 【請求項５】 ５′側の塩基配列が欠落したｃＤＮＡの
うち配列の判明している３′側の配列の一部に相補的な
プライマー（１）を用いてｍＲＮＡの逆転写反応を行
い、得られたｃＤＮＡの３′側に請求項１又は２記載の
リンカー組成物をＤＮＡリガーゼにより連結させ、次い
で該プライマー（１）及び該リンカー組成物の２本鎖部
分の配列の一部又は全部に相補的なプライマー（２）を
用いてＰＣＲ反応を行うことを特徴とする５′側の塩基
配列が欠落したｃＤＮＡの５′−ＲＡＣＥ法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8343119A JPH10179162A (ja) | 1996-12-24 | 1996-12-24 | リンカー組成物及びこれを用いた５′−ｒａｃｅ法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8343119A JPH10179162A (ja) | 1996-12-24 | 1996-12-24 | リンカー組成物及びこれを用いた５′−ｒａｃｅ法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10179162A true JPH10179162A (ja) | 1998-07-07 |
Family
ID=18359082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8343119A Pending JPH10179162A (ja) | 1996-12-24 | 1996-12-24 | リンカー組成物及びこれを用いた５′−ｒａｃｅ法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH10179162A (ja) |
-
1996
- 1996-12-24 JP JP8343119A patent/JPH10179162A/ja active Pending
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