JPH09508391A - ゴナドトロピン放出ホルモンに対するイムノゲン - Google Patents
ゴナドトロピン放出ホルモンに対するイムノゲンInfo
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Abstract
(57)【要約】
哺乳動物に抗GnRHに対する免疫応答を生ずることができる免疫原性物質を開示している。この免疫原性物質は、哺乳動物のゴナドトロピンおよび性腺ステロイドホルモン依存性疾患の治療法および免疫学的避妊法に有効である。
Description
【発明の詳細な説明】
ゴナドトロピン放出ホルモンに対するイムノゲン発明の背景
ゴナドトロピン放出ホルモンまたは性腺刺激ホルモン放出ホルモン("GnRH"、
黄体化ホルモン放出ホルモンまたは"LHRH"とも呼ばれる)は、受胎能の調節に対
して中心的重要性を持つホルモンである。Johnson M.,Everitt B.,Essential Reproduction
,第3版,Blackwell Scientific Publications,1988。男性およ
び女性において、GnRHは視床下部から血流中に放出され、血液を経て下垂体に移
行し、下垂体においてGnRHは性腺刺激細胞の作用により黄体化ホルモンと卵胞刺
激ホルモンという2種類のゴナドトロピン(性腺刺激ホルモン)類の放出を誘起
する。この2種類のゴナドトロピン類が、今度は性腺(生殖腺)に作用して、ス
テロイド生成および配偶子発生を誘起する。性腺から循環系に放出されたステロ
イド類がその後、各種の組織に作用する。
このゴナドトロピンホルモン・カスケードは、GnRHの生物学的活性の中和によ
り停止することがある。Fraser H.M.,「黄体化ホルモン放出ホルモンに対する抗
体の生理学的作用」Physiological Effects of Immunity Against Reproductive Hormones,
EdwardsおよびJohnson編,ケンブリッジ大学出版局,1976に掲載。G
nRHの中和の結果、ゴナドトロピン類および性腺ステロイド類が血液中に放出さ
れなくなり、そのためこれらの生物学的活性が消失する。GnRHの生物学的活性の
消失により、受胎能のホルモンによる調節が中断され、配偶子発生が停止する。
GnRHの中和は配偶子(卵子、精子)の生成を停止させる。従って、GnRHの中和は
有効な避妊手段である。
ゴナドトロピン類および性腺ステロイドホルモン類、特に性腺ステロイド類は
多くの重大な疾患に関与している。かかる疾患としては、とりわけ、胸部ガン、
子宮その他の婦人科のガン、子宮内膜症、子宮類繊維腫、前立腺ガン、および良
性前立腺肥大が挙げられる。これらの疾患に対して性腺ステロイドホルモンの刺
激の除去は重要な治療手段となる。これを達成する効果的な方法がGnRHの中和で
あり、この中和の結果これらの疾患を誘起および刺激する性腺ステロイドの消失
を生ずる。McLachlan R.I.,Healy D.L.,Burger G.B.,1986「婦人科学におけ
るLHRH類似物の臨床的様相:概観」 British Journal of Obstretics and Gynae cology
,93: 431-454。Conn P.M.,Crowley W.F.,1991「ゴナドトロピン放出ホ
ルモンとその類似物」New England Journal of Medicine,324: 93-103。Filico
ri M.,Flamigni C.,1988「GnRH作用薬および拮抗薬、最新臨床状況」Drugs, 3 5:
63-82。
GnRHの有効な中和手段の1つは、宿主または患者に抗GnRH抗体を誘導または導
入することである。かかる抗体は、GnRHイムノゲン(免疫原)による能動免疫、
または抗GnRH抗体の投与による受動免疫により誘導することができる。Fraser H
.M.「黄体化ホルモン放出ホルモンに対する抗体の生理学的作用」Physiological Effects of Immunity Against Reproductive Hormones,
EdwardsおよびJohnson
編,ケンブリッジ大学出版局,1976に掲載。抗GnRH抗体はGnRHの生物学的活性を
中和することができるので、免疫は、哺乳動物の受胎能の調節手段となると同時
に、性腺ステロイド類および他の生殖ホルモン類に依存する疾患の治療に対する
重要な手段ともなる。
GnRHはすべての哺乳動物において同一のアミノ酸配列(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-
Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2)(配列表の配列番号1)を有するので、単一の同じイム
ノゲンがヒトを含む全ての哺乳動物種に有効であろう。しかし、GnRHに対する能
動免疫は、GnRHイムノゲンに付随する欠陥が原因でこれまでは実施できなかった
。従来の抗GnRHイムノゲンは、効力が十分ではないため、有効レベルの抗GnRH抗
体を誘導するには反復投与が必要である。また、このイムノゲンは、免疫した母
集団の許容できる割合に抗GnRH抗体を誘導することに関して信頼性があることも
実証されていなかった。発明の要約
本発明は、我々が検討した免疫母集団のすべての個体において、イムノゲンの
1回の投与に応答して抗GnRH抗体の中和性の(中和を達成する)抗体価を誘導す
る、GnRHに対する改善されたイムノゲンに関する。従って、本発明のイムノゲン
は、ステロイド依存性疾患の治療に使用することができ、また受胎能を調節する
ための免疫避妊薬としても使用できる。
本発明のイムノゲンは、イムノミミック(模擬免疫)領域とスペーサー領域と
いう2つの機能性領域からなるペプチドである。GnRHと免疫学的に交差反応する
イムノミミックの機能は、目標ホルモンに結合する抗体を誘導することである。
ペプチドのスペーサー要素は、イムノミミックをジフテリア・トキソイド("DT")
のような免疫学的キャリアーに結合させる結合部として機能し、イムノミミック
に対するワクチンを接種された哺乳動物により発生する免疫応答にも影響を及ぼ
す。例えば、本発明の1具体例では、イムノゲンのペプチドの配列は、pGlu-His
-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(配列表の配列番
号2)である。この("GnRH(1-10)-Arg10")ペプチドでは、pGlu-His-Trp-Ser-Tyr
-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-(配列表の配列番号3)の配列が、GnRHのイムノミミック
を構成する。このペプチド配列の残り、即ち-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(配列表
の配列番号4)がスペーサーを構成し、このスペーサーは上記GnRHイムノミミッ
クのアミノ酸番号10に結合する。
本発明の好適態様は4種類のスペーサー配列に組合わせられるGnRHの2種類の
ペプチドイムノミミックに関する。これらのペプチドを DT のような免疫学的キ
ャリアーに結合させて、それぞれ抗GnRHイムノゲンを生成させる方法が提供され
る。これらのイムノゲンを単独または組合わせて使用し、ワクチン接種した哺乳
動物に抗GnRH抗体応答を誘導することができる。従来の抗GnRHイムノゲンとは異
なり、本発明のイムノゲンは、試験した免疫動物の全てに、1回のイムノゲンの
投与後に生物学的に有効な免疫応答を誘導する。イムノゲンは、溶解状態および
沈殿を含む異なる物理的形態で投与することができる。本発明のイムノミミック
−スペーサー・ペプチドは、広範囲のペプチド:キャリアー置換比で免疫学的キ
ャリアーに結合させて、有効なイムノゲンを生ずることができる。
本発明はまた、本発明のイムノゲンを用いた免疫によりゴナドトロピンおよび
性腺ステロイドホルモン依存性疾患およびガンを治療する方法にも関する。本発
明の1具体例は、本発明のイムノゲンを投与することからなる哺乳動物の免疫学
的避妊法に関する。図面の簡単な説明
図1:免疫したウサギにおける免疫後の日数に対する抗原結合価("ABC")(
単位:ピコモル/ミリリットル)の平均値(平均ABC)により測定した、ペプチド
1〜4として示す本発明のイムノゲンと、ペプチド5として示す比較用の従来の
抗GnRHイムノゲンの、投与に対する抗GnRH抗体応答を示す。
図2:免疫後の日数に対する平均ABCにより測定した、ペプチド3と4の混合
物からなるイムノゲンによる免疫に対する抗体応答を示す。
図3:溶解性に基づいて分画したペプチド2のイムノゲン製剤の分画で免疫し
た後の、免疫後の日数に対する平均ABCにより測定したマウスの免疫結果を示す
。
図4:ペプチド:DTの置換比が異なるペプチド1および2の各種の結合体(con
jugates)で免疫した時の、免疫後の日数に対する平均ABCにより測定したマウス
の抗体応答を示す。
図5:ペプチド1と2のそれぞれの結合体の混合物で免疫した時の、免疫後の
日数に対する平均ABCにより測定した雄性ウサギの抗体応答を示す。免疫試験期
間中のこれら雄性ウサギの血清テストステロン濃度も併せて示す。発明の詳細な説明
実施例1
次の表1に示すアミノ酸配列を持つペプチドを、標準的な固相合成法により合
成および調製した。各ペプチドはアミノ酸濃度および純度に関する検証を行った
。
ペプチド1〜4のそれぞれは、GnRHのイムノミミックをスペーサーの前か後ろ
のいずれかに含んでいる。GnRHのイムノミミックは次の2種類を使用した:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-(配列表の配列番号3)(表1のペ
プチド2および4)(スペーサーはGnRHのカルボキシ末端<アミノ酸番号10>を介
して結合)、および
-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(NH2)(配列表の配列番号8)(表の
ペプチド1および3)(スペーサーはGnRHのアミノ末端<アミノ酸番号1>で結合
)。
表2に示した4種類のスペーサーを使用した。
スペーサー名称の番号1および10は、スペーサーが結合するGnRHのアミノ酸番
号を意味する。表2にはGnRH分子のこれらのスペーサー領域を独立して示したが
、本発明の好適態様では、ペプチドは1個の連続したペプチド配列分子として合
成される。
表1に示した4種類のペプチド1〜4のそれぞれは、一端にスクシンイミジル
エステル基、他端にマレイミド基を含有するヘテロ2官能性結合剤を用いて、こ
のペプチド末端のシステイン残基を介して、ジフテリアトキソイド("DT")のよう
なキャリアーに存在するアミノ基に結合させる。
上記ペプチド1〜4のいずれかとキャリアーとの結合を行うため、このペプチ
ドのシステインをまず還元した。乾燥ペプチドを、30倍モル過剰のジチオトレイ
トール(dithiothreitol)("DTT")を用いて、0.1 M リン酸ナトリウム緩衝液(脱
気すみ)、pH 8.0中に溶解した。得られた溶液を、水飽和窒素ガス雰囲気下、室
温で3時間攪拌した。さらに15倍モル過剰のDTTを追加し、この混合物を水飽和
窒素ガス雰囲気下、室温でさらに1時間攪拌した。0.2 M 酢酸で平衡化したG10
セファデックス(Sephadex)カラム上、4℃でのクロマトグラフィーにより、シス
テインが還元されたペプチドを他の成分から分離した。分離したペプチドを凍結
乾燥し、使用するまで減圧下に保管した。
キャリアーであるDTは、ペプチドへの結合のために活性化した。この活性化は
、ヘテロ2官能性結合剤であるε−マレイミドカプロン酸N−ヒドロキシスクシ
ンイミドエステル("EMCS")を、分子量105のDT当たり遊離アミノ基約25個という
活性化を生ずるのに十分な量で用いて処理することにより行った。キャリアーが
DTである具体例では、この量は、DT 20 mgづつに対してEMCS(純度98%)6.18 m
gを添加することに相当した。
DTの活性化は、20 mg量のDTを1mlの0.5 M リン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.6
に溶解することにより行った。一方、EMCSは6.18 mg量をジメチルホルムアルデ
ヒド0.2 mlに溶解した。暗所条件下で、DT溶液を攪拌しなから、これにEMCS溶液
を50マイクロリットル(μl)づつ滴下した。この混合物を暗所で室温にて90分間
インキュベーションした後、0.1 mMエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩("ED
TA")を含有する0。1 M クエン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0で平衡化したG50 セフ
ァデックスカラムを用いて、4℃でクロマトグラフィー処理した(カラム=1.5
×120 cm;流速=8ml/hr;分画量=2ml)。A260分画を分光光度計を用いて決定
すると、DTを含有する分画を同定することができた。
EMCSで活性化したDTを含有する分画を、暗所条件下、窒素ガス雰囲気中にてPM
10限外濾過膜上で加圧濃縮した。濃縮液のタンパク質含有量をBCA法(PIERCE,
米国イリノイ州)により求めた。キャリアーのEMCS含有量は、活性化DTをシステ
イン-HClと共にインキュベーションした後、10 mM エルマン試薬[5,5'−ジチオ
−ビス(2−ニトロ安息香酸)]100μlと反応させることにより求めた。システイ
ン-HClを入れたブランク・チューブと、システイン-HClおよびキャリアーを入れ
たサンプル・チューブとの光学濃度の差から、412 nmでの5−チオ−2−ニトロ
安息香酸のモル吸光係数の値(13.6×103)を用いて、EMCS基含有量を算出した。
ペプチドの還元システイン含有量("-SH")もエルマン試薬を用いて決定した。
ペプチド約1mgを窒素ガスを飽和させた水1mlに溶解し、この溶液の0.1 ml量を
エルマン試薬と反応させた。5−チオ−2−ニトロ安息香酸のモル吸光係数の値
(13.6×103)を用いて、遊離のシステイン-SH の量を算出した。
還元したペプチドを次いで活性化したDTと結合させた。DTに存在する所定量の
EMCS活性化アミノ基と反応させるのに十分な遊離-SH を含有する量のペプチドを
、0.1 mM EDTAを含有する0.1 M クエン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.0に溶解させ
、暗所条件下でEMCS活性化DTに滴下した。ペプチド溶液の全量を活性化DTに滴下
し終わった後、混合物を水飽和窒素ガス雰囲気中、室温で暗所中にて一晩インキ
ュベーションした。
ペプチドがEMCSを介してDTに結合している結合体を、0.2 M 重炭酸アンモニウ
ムで平衡化したG50 セファデックスカラムによる4℃での低圧クロマトグラフィ
ー(カラム=1.5×120 cm;流速=1.8 ml/15分;分画量=1.8 ml)により、混合
物の他の成分から分離した。この結合体はカラムボイド容積中に溶離し(A280
測定により検出)、凍結乾燥して使用時まで−20℃で乾燥保管した。
この結合体のペプチド含有量に関する検証は、重量増加、アミノ酸分析等をは
じめとする当業者に既知の多くの方法によっても実施できる。(1)DT活性化の
ためのEMCSの添加量を変更するか、および/または(2)EMCS活性化DTへの還元ペ
プ
チドの添加量を変更することにより、ペプチド:DTの置換比が異なる各種の結合
体が精度および再現性よく得られた。例えば、分子量100,000のDT 1 モルに対し
てEMCS 31 モルの比率でDTを活性化すると、分子量100,000 のDT当たり12±2個
のEMCS基が付加する。この分子量100,000 の活性化DT当たり14個のペプチド基の
添加は、分子量100,000 のDT当たり12±2個のペプチドという置換比を生じた。
これらの方法により生成させたペプチド1〜4のDTへの結合体をアミノ酸分析に
より分析したところ、分子量105のDT当たり4〜30モルのペプチドを有していた
。作成した全ての結合体が試験動物の免疫用イムノゲンとして適当であると考え
られた。
実施例2
比較のために、GnRHのペプチド・イムノミミックがスペーサー要素を含んでい
ない、従来のGnRHイムノゲン("ペプチド5")を作成した。ペプチド5の配列は、
Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2(配列表の配列番号8)であった
。
このペプチドを、m−マレイミドベンゾイルN−ヒドロキシスクシンイミドエ
ステル("MBS")により活性化した。[glu 1]-GnRH 20.0 mgをN,N−ジメチルホルム
アルデヒド("DMF")に溶解した。この溶液に1.0 mlのDMF に溶解したMBS 5.31 mg
を添加した。混合溶液を暗所で室温にて一晩攪拌した。
DT 40 mgを、2.2 mgの2−イミノチオランHCl("2-IT")を含有する炭酸ナトリ
ウム緩衝液(0.2 M,pH 9.0)10.0 ml中に溶解した。次いで、MBS活性化GnRHを
含有する溶液を、DT/2-IT 溶液にゆっくり添加し、得られた混合物を暗所で室温
にて8時問ゆっくり攪拌した。
生成した結合体を、セファデックスG50 によるカラムクロマトグラフィー(カ
ラム:1.5×100 cm;緩衝液:重炭酸アンモニウム、0.2 M ;分画:2.6 ml、15
分ごと)により精製した。結合体を含有する分画の同定は分光光度法(A254)
により行った。G50 精製した結合体を凍結乾燥し、使用時まで−20℃で乾燥保管
した。イムノゲン5の結合体のペプチド:DT置換比をアミノ酸分析により求めた
ところ、分子量105のDT当たりペプチド13個であった。
実施例3
異なる群の雌性ウサギをそれぞれ実施例1および2のペプチド1〜5の結合体
のいずれか1つで免疫した。各結合体を、200 μg/mlの norMDP アジュバントを
含有するリン酸塩緩衝食塩水(0.2 M,pH 7.2)中に2.0 mg/mlの濃度になるよう溶
解した。実施例1のペプチド1、2、3および4からなる各結合体はこの緩衝液
中に完全には溶解しなかったが、実施例2のペプチド5の結合体は上記緩衝液に
完全に溶解した。各混合物を同容積のスクアレン−アルラレセル(Arlacel)(スク
アレン:アルラセルの容積比=4:1)を用いて乳化して、1.0 mg/ml の結合体
と100 μg/mlの norMDP とを含有するイムノゲン組成物を調製した。
イムノゲン組成物1.0 mlを、試験0日に各ウサギの後脚筋肉(2部位、各部位
に0.5ml)に注射して投与した。0日の免疫前およびその後の所定日に各ウサギ
から血液を採取した。各血液試料から血清を調製し、抗GnRH抗体の存在を決定す
る分析に使用するまで−20℃で凍結保管した。
液相ラジオイムノアッセイ(RIA)を用いて抗GnRH抗体の検出と定量を行った。
このRIAでは、0.04、0.2、1.0 または5.0 μl量の抗血清を、全容積400 μl中
で約150 fmole の3H標識したGnRH(比活性=53.2 Ci/mmole)と共にインキュベー
ションした。ウシ血清アルブミン1%を含有するFTA 血球凝集反応緩衝液(BBL,B
ecton Dickinson Microbiology Systems、米国メリーランド州)中で希釈を行っ
た。抗血清を標識ホルモンと共に室温で2時間インキュベーションした。次に加
熱不活化(56℃、30分)したウシ胎児血清(2〜8℃に冷却)の0.1 ml量を各チ
ューブに加えた後、25%ポリエチレングリコール(分子量=8,000 g/mole)(2〜
8℃に冷却)0.5 mlを加えて、抗体−ホルモン複合体(complex)を沈殿させた。沈
殿を遠心分離(1500 x gで30分間)によりペレット化して、上清を捨て、ペレッ
トを液体シンチレーションカウンターにより計数して、それに含まれている放射
能の量を測定した。次いで、放射性ホルモン沈殿の量から、非特異的なバックグ
ラウンド結合[抗血清希釈液を過剰量(〜105倍)のホルモンと共に予備インキ
ュベーションすることにより求めた]を差し引いた後、各抗血清の抗原結合価(A
BC)を求めた。過剰量の非標識ホルモンによる抗血清の阻害によっても、GnRHに
対する抗血清の特異性が確認された。免疫前にウサギから採取した血清は、非
免疫(正常)対照として用いた。
実施例1および2の結合ペプチドにより免疫したウサギから採取した血清中で
測定した平均ABC を表3および図1に示す。これらの結果が示すように、実施例
1のペプチド1、2、3および4からなる各イムノゲンは、1回の投与で、GnRH
に対する迅速かつ強力な抗体応答を誘導した。
これに対して、実施例2のペプチド5のイムノゲンの1回の投与により誘導さ
れた抗GnRH応答は、最小の応答しか誘導しなかった。これは、ペプチド5により
作成された結合体が低活性のイムノゲンであるためではない。最初の免疫から数
週間後に追加のブースター免疫のために投与を1回〜数回行うと、ペプチド5の
結合体は有効レベルの抗GnRH抗体(ABC=約12〜18 pmole/ml)を誘導する。この点
で、ペプチド5の結合体は標準的なGnRHイムノゲンと類似の挙動を示す。しかし
、ペブチド5で作成した結合体は、抗GnRH抗体の誘導に2回以上の投与を必要と
し、実施例1のペプチド1〜4の結合体に比べて、誘導した抗GnRH抗体のレベル
が低
く、有効な抗体レベルを引き出すのにより長時間を必要とする。
以上の結果はまた、実施例1のペプチド1、2、3および4の免疫原性に対す
るスペーサーの決定的な寄与を実証している。ペプチド5が持つGnRHのイムノミ
ミックは、ペプチド1および3と同じであるにもかかわらず、ペプチド5はイム
ノゲンとして劣っている。これは、ペプチド5が、ペプチド1および3には存在
しているスペーサー配列を持っていないからである。即ち、実施例1のペプチド
1、2、3および4におけるスペーサーの存在が、その免疫原性の増強に決定的
に寄与しているのである。
実施例4
実施例1のペプチド3および4からなる各結合体を、PBS 中2.0 mg/ml のタン
パク質濃度を生ずるように1:1の比率で混合した。この混合物を次いで、実施
例3と同様にしてイムノゲンとして調製し、ウサギに注射した。血清を実施例3
のRIAにより抗GnRH抗体について試験した。結果を表4および図2に示す。
表4からわかるように、ペプチド3と4の各結合体を混合して投与しても、有
効レベルの抗体が誘導された。抗体特異性試験により示されるように、両者のペ
プチド成分は抗GnRH抗体の誘導にほぼ等しく寄与した。GnRH(1-10)-Arg1ペプチ
ドは主にGnRHのカルボキシ末端に対して向けられた抗体を誘導し、GnRH(1-10)-A
rg10ペプチドは主にGnRHのアミノ末端に対して向けられた抗体を誘導した。従っ
て、この2種類のペプチドの結合体を混合すると、目標分子の両末端に対して抗
体を誘導するイムノゲンを与えることができる。
実施例5
実施例1のペプチドを実施例1に記載のようにしてDTに結合させ、調製すると
、生成物の一部は沈殿として存在する。沈殿の生成は、結合体の濃度、pHおよび
塩濃度を含む各種の物理的パラメータに依存する。本発明者は、実施例1のペプ
チド2のDTへの結合体を実施例1に記載のようにして調製した。これから、溶解
性に基づいて結合体の3種類の分画を調製した。結合体を0.01 Mリン酸塩緩衝液
,pH 7.2中で攪拌し、遠心分離により不溶分を集めて分画1とした。可溶分にNa
Clを添加し(0.5Mに)、0.1 M HClでpHを6.0に調整すると、さらに沈殿を生じた
ので、これを分画2として集めた。残りの可溶分を分画3とした。各分画を凍結
乾燥した。回収率(出発物質15 mg からの)は、分画1が36%、分画2が15%、
分画3が27%、損失22%であった
分画1〜3のそれぞれを、各群6匹づつのマウスの群に注射した[100 μg結
合体/マウス、25μgのnorMDPと共に、FTA緩衝液(結合体+アジュバントを含
有):スクアレン/アルラセルの1:1混合物0.1 ml中、腹腔内]。各マウスは
1回のイムノゲンの注射を受けた。その後、所定間隔で血清試料を採取し、実施
例3のRIA により抗GnRH抗体について試験した。この試験の結果を表5および図
3に示す。
上の結果が示すように、各マウス群は同じように有効な抗GnRH抗体応答を生じ
た。これは、実施例1のペプチドから作成した結合体の溶解性に差異があるにも
かかわらず、可溶性形態と不溶性形態のいずれもイムノゲンとして投与すること
ができ、均等な免疫原性を示すことを実証している。
実施例6
実施例1のペプチド1および2のDTへの結合体を、実施例1に記載したように
して作成した。還元したペプチドのDTへの添加量を変化させて、ペプチド:DTの
置換比が異なる結合体を作成した。得られた結合体のアミノ酸分析により求めた
置換比を表6に示す。
各結合体の調製物をイムノゲンとしてマウスを免疫した。免疫とその後の分析
操作は実施例5に記載した方法と同一であった(各群6匹のマウス)。この試験
の結果を表7および図4に示す。
上の結果が示すように、各結合体の調製物から顕著な抗GnRH応答が誘導された
。これは、実施例1のペプチドを広範囲のペプチド:キャリアー置換比でキャリ
アーに結合させて、有効なイムノゲンを作成することができることを実証してい
る。
実施例7
実施例1のペプチド1および2のDTへの結合体を、実施例1に記載したように
して作成した。ペプチド:DTの置換比は、ペプチド1[GnRH(1-10)-Ser1]につい
ては13.1:1、ペプチド2[GnRH(1-10)-Ser10]については12.8:1であった。
水性相(PBS中に2種類の結合体の混合物+norMDPを含有)を実施例3に記載
のようにして油性ビヒクルで乳化させてイムノゲンを調製した。使用した油性ビ
ヒクルはモノステアリン酸アルミニウム1.8 %を含有するモンタニド(Montanide
) ISA 703であった。"モンタニドISA 703 AMS"は、SEPPIC,Inc.社(フランス、
パリ)が製造・販売する製品である。得られたイムノゲン中の有効成分の最終濃
度は、GnRH(1-10)-Ser1-DT=0.5 mg/ml、GnRH(1-10)-Ser10-DT=0.5 mg/ml、norMD
P=0.1 mg/mlであった。イムノゲン1.0 mlを、試験0日に3匹の雄性ウサギのそ
れぞれの後脚筋肉(2部位、各部位に0.5 ml)に注射して投与した。免疫前およ
びその後の所定日に各ウサギから血液を採取した。各血液試料から血清を調製し
、抗GnRH抗体の存在を決定する分析(実施例3に記載したように実施)に使用す
るまで−20℃で凍結保管した。
上記3匹の雄性ウサギの血清中で測定した平均ABC の値を表8および図5に示
す。この結果が示すように、1.8 %のAMS を含有するモンタニドISA 703 中に乳
化させた実施例1のペプチド1および2のDT結合体を用いた1回の免疫で、GnRH
に対して強力な抗体応答が迅速に誘導された。この抗GnRH応答は、等量の水性相
と1.8 %のAMS を含有するモンタニドISA 703 とからなるエマルション中でnorM
DPと共に投与した時に本発明のペプチド結合体(個々にまたはその混合物)によ
り誘導される応答の代表例である。
実施例8
免疫した動物におけるGnRHイムノゲンの効力の尺度として、性腺ステロイドの
産生を評価することができる。実施例7の3匹の雄性ウサギから得た血清試料中
のテストステロンの濃度を測定した。テストステロン濃度は、テストステロン定
量用のラジオイムノアッセイ・キット("Coat-a-Count"、米国カリフォルニア州
ロスアンジェルスのDiagnostic Products Corp.社から購入)を使用して求めた
。結果を表9および図5に示す。この結果は、雄性ウサギ中のテストステロンの
産生を完全に阻害するレベルの抗GnRH抗体がイムノゲンにより誘導されたことを
示している。
上記試験で、2匹の試験動物(ウサギ)の血清中では24日までに、3匹全ての
ウサギで32日までにテストステロンが検出不可能になった。図5からわかるよう
に、血清テストステロン濃度の低下は抗GnRH抗体価の増大と対応している。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1996年1月18日
【補正内容】
あり、この中和の結果これらの疾患を誘起および刺激する性腺ステロイドの消失
を生ずる。McLachlan R.I.,Healy D.L.,Burger G.B.,1986「婦人科学におけ
るLHRH類似物の臨床的様相:概観」 British Journal of Obstretics and Gynae cology
,93: 431-454。Conn P.M.,Crowley W.F.,1991「ゴナドトロピン放出ホ
ルモンとその類似物」New England Journal of Medicine,324: 93-103。Filico
ri M.,Flamigni C.,1988「GnRH作用薬および拮抗薬、最新臨床状況」Drugs, 3 5:
63-82。
GnRHの有効な中和手段の1つは、宿主または患者に抗GnRH抗体を誘導または導
入することである。かかる抗体は、GnRHイムノゲン(免疫原)による能動免疫、
または抗GnRH抗体の投与による受動免疫により誘導することができる。Fraser H
.M.「黄体化ホルモン放出ホルモンに対する抗体の生理学的作用」Physiologica l Effects of Immunity Against Reproductive Hormones,
EdwardsおよびJohnso
n編,ケンブリッジ大学出版局,1976に掲載。抗GnRH抗体はGnRHの生物学的活性
を中和することができるので、免疫は、哺乳動物の受胎能の調節手段となると同
時に、性腺ステロイド類および他の生殖ホルモン類に依存する疾患の治療に対す
る重要な手段ともなる。
GnRHはすべての哺乳動物において同一のアミノ酸配列(pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-
Gly-Leu-Arg-Pro-GlyNH2)(配列表の配列番号1)を有するので、単一の同じイム
ノゲンがヒトを含む全ての哺乳動物種に有効であろう。しかし、GnRHに対する能
動免疫は、GnRHイムノゲンに付随する欠陥が原因でこれまでは実施できなかった
。従来の抗GnRHイムノゲンは、効力が十分ではないため、有効レベルの抗GnRH抗
体を誘導するには反復投与が必要である。また、このイムノゲンは、免疫した母
集団の許容できる割合に抗GnRH抗体を誘導することに関して信頼性があることも
実証されていなかった。
EP 0 380 230は、ペプチドホルモンガストリンのフラグメントで調製したイム
ノゲンを開示している。このガストリン・イムノゲンは、潰瘍、または増殖がガ
ストリンホルモンに依存するか、または刺激される腫瘍の治療に使用される。
Morrisonら(欧州特許出願公開No.EP 0 293 530)は、一般式:pGlg-His-Trp
-Ser-Tyr-X-Leu-Arg-Pro-Gly-Y-Z、ここでXはGlyまたはD-アミノ酸であり、Yは
同一または異別でよい1または2以上のアミノ酸残基を表し、ZはCysまたはTyr
である)で示されるLHRH類似物を開示している。このLHRH類似物は哺乳動物
の受胎能の低減用ワクチンの製造に使用される。発明の要約
本発明は、我々が検討した免疫母集団のすべての個体において、イムノゲンの
1回の投与に応答して抗GnRH抗体の中和性の(中和を達成する)抗体価を誘導す
る、GnRHに対する改善されたイムノゲンに関する。従って、本発明のイムノゲン
は、ステロイド依存性疾患の治療に使用することができ、また受胎能を調節する
ための免疫避妊薬としても使用できる。
本発明のイムノゲンは、イムノミミック(模擬免疫)領域とスペーサー領域と
いう2つの機能性領域からなるペプチドである。GnRHと免疫学的に交差反応する
イムノミミックの機能は、目標ホルモンに結合する抗体を誘導することである。
ペプチドのスペーサー要素は、イムノミミックをジフテリア・トキソイド("DT")
のような免疫学的キャリアーに結合させる結合部として機能し、イムノミミック
に対するワクチンを接種された哺乳動物により発生する免疫応答にも影響を及ぼ
す。例えば、本発明の1具体例では、イムノゲンのペプチドの配列は、pGlu-His
-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(配列表の配列番
号2)である。この("GnRH(1-10)-Arg10")ペプチドでは、pGlu-His-Trp-Ser-Tyr
-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-(配列表の配列番号3)の配列が、GnRHのイムノミミック
を構成する。このペプチド配列の残り、即ち-Arg-Pro-Pro-Pro-Pro-Cys(配列表
の配列番号4)がスペーサーを構成し、このスペーサーは上記GnRHイムノミミッ
クのアミノ酸番号10に結合する。
本発明の好適態様は4種類のスペーサー配列に組合わせられるGnRHの2種類の
ペプチドイムノミミックに関する。これらのペプチドをDT のような免疫学的キ
ャリアーに結合させて、それぞれ抗GnRHイムノゲンを生成させる方法が提供され
る。これらのイムノゲンを単独または組合わせて使用し、ワクチン接種した哺乳
動物に抗GnRH抗体応答を誘導することができる。従来の抗GnRHイムノゲンとは異
なり、本発明のイムノゲンは、試験した免疫動物の全てに、1回のイムノゲンの
投与後に生物学的に有効な免疫応答を誘導する。イムノゲンは、溶解状態および
沈殿を含む異なる物理的形態で投与することができる。本発明のイムノミミック
−スペーサー・ペプチドは、広範囲のペプチド:キャリアー置換比で免疫学的キ
ャリアーに結合させて、有効なイムノゲンを生ずることができる。
本発明はまた、本発明のイムノゲンを用いた免疫によりゴナドトロピンおよび
性腺ステロイドホルモン依存性疾患およびガンを治療する方法にも関する。本発
明の1具体例は、本発明のイムノゲンを投与することからなる哺乳動物の免疫学
的避妊法に関する。図面の簡単な説明
図1:免疫したウサギにおける免疫後の日数に対する抗原結合価("ABC")(単位
:ピコモル/ミリリットル)の平均値(平均ABC)により測定した、ペプチド1〜4
として示す本発明のイムノゲンと、ペプチド5として示す比較用の従来の抗GnRH
イムノゲンの、投与に対する抗GnRH抗体応答を示す。
図2:免疫後の日数に対する平均ABCにより測定した、ペプチド3と4の混合
物からなるイムノゲンによる免疫に対する抗体応答を示す。
図3:溶解性に基づいて分画したペプチド2のイムノゲン製剤の分画で免疫し
た後の、免疫後の日数に対する平均ABCにより測定したマウスの免疫結果を示す
。
図4:ペプチド:DTの置換比か異なるペプチド1および2の各種の結合体(con
jugates)で免疫した時の、免疫後の日数に対する平均ABCにより測定したマウス
の抗体応答を示す。
図5:ペプチド1と2のそれぞれの結合体の混合物で免疫した時の、免疫後の
日数に対する平均ABCにより測定した雄性ウサギの抗体応答を示す。免疫試験期
間中のこれら雄性ウサギの血清テストステロン濃度も併せて示す。発明の詳細な説明
実施例1
次の表1に示すアミノ酸配列を持つペプチドを、標準的な固相合成法により合
成および調製した。各ペプチドはアミノ酸濃度および純度に関する検証を行った
。
請求の範囲
1.
よりなる群から選ばれたペプチドが、免疫原性キャリアーに結合した結合体から
なる、抗GnRH免疫原性物質。
2.有効量の請求の範囲第1項記載の免疫原性物質と薬剤に許容される担体とを
含む薬剤組成物。
3.免疫原性キャリアーがジフテリア・トキソイドまたは破傷風トキソイドであ
る請求の範囲第2項記載の免疫原性物質。
4.ペプチド:キャリアーの置換比が4〜40の範囲内である請求の範囲第1項記
載の免疫原性物質。
5.ゴナドトロピンおよび関連する性腺ステロイドホルモン依存性疾患に対する
哺乳動物(ヒトを含む)の治療に用いる請求の範囲第2項記載の薬剤組成物。
6.哺乳動物(ヒトを含む)の免疫学的避妊薬として用いる請求の範囲第2項記
載の薬剤組成物。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ),AM,
AU,BB,BG,BR,BY,CA,CN,CZ,E
E,FI,GE,HU,JP,KG,KP,KR,KZ
,LK,LR,LT,LV,MD,MG,MN,MX,
NO,NZ,PL,RO,RU,SI,SK,TJ,T
T,UA,UZ,VN
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1. よりなる群から選ばれたペプチドが、免疫原性キャリアーに結合した結合体から なる、抗GnRH免疫原性物質。 2.有効量の請求の範囲第1項記載の免疫原性物質と薬剤に許容される担体とを 含む薬剤組成物。 3.免疫原性キャリアーがジフテリア・トキソイドまたは破傷風トキソイドであ る請求の範囲第2項記載の免疫原性物質。 4.ペプチド:キャリアーの置換比が4〜40の範囲内である請求の範囲第1項記 載の免疫原性物質。 5.治療有効量の請求の範囲第2項記載の薬剤組成物を哺乳動物に投与すること からなる、ゴナドトロピンおよび関連する性腺ステロイドホルモン依存性疾患に 対して哺乳動物を治療する方法。 6.有効量の請求の範囲第2項記載の薬剤組成物を哺乳動物に投与することから なる、哺乳動物に免疫学的避妊を施す方法。 7. 8. 9. 10. 11.免疫原性物質が薬剤に許容される担体中に可溶性ではなく、エマルションと して処方された、請求の範囲第2項記載の組成物。 12.免疫原性物質が薬剤に許容される担体中に可溶性である、請求の範囲第2項 記載の組成物。
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