JPH01500663A - 動物の生殖機能の調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物の生殖機能の調節 本発明は動物における生殖機能を調節する方法およびこの種の方法で使用するた めの動物用組成物に関する。

種々の方法で動物の生殖機能を調節することは従来の技術分野で知られている。

プロゲステロン、妊馬血清性ゴナドトロピン、メラトニンなどの合成および天然 産物が動物の生殖機能の調節のために提案された。しかしながら、この種の処置 は雌動物の排卵を減少または抑制するのに限界があることが判明した。

雌動物に関しては、外科的な去勢が未だに好適な避妊技術である。しかしながら 、出血、炎症、体重減少および成長速度の低下の可能性を含む去勢に伴う沢山の 欠点がある。

近年、動物の生殖機能を抑制するために黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−Ｒ Ｈ）に対する免疫を利用することが提案された。しかしながら、強力なアジュバ ントの使用による様々な応答および副作用〔アブセス（ａｂｓｅｓｓ）、肉芽腫 〕が何種かの動物で報告された。

更に、従来技術において、精巣や卵巣の機能に一時的かつ種々の影響が観察およ び報告されている。例えば、ＬＨ−ＲＨに対する抗体の産生が雄および雌のラッ ト、ウサギ、イヌ、サル、ヒツジ、ウシおよびウマで報告されている〔シャンバ ッハ−（Ｓ　ｈａｎｂａｃｈｅｒ）　Ｂ　、　Ｄ　、　、雄におけるＬＨ−ＲＨ に対する活性化免疫；シェフコート（Ｊｅｆｆｃｏａｔｅ）　Ｉ　、Ａ、、キー リング（Ｋ　ｅｅｌ　ｉｎｇ）　Ｂ　。

Ｋ、２、雌におけるＬＨ−ＲＨに対する活性化免疫、１９８４．哺乳動物におけ る生殖の免疫的観点：クリフトン（Ｃｒｉｇｈｔｏｎ）　Ｄ　、　Ｂ　、編、ブ タ−ワース（Ｂ　ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）　）。

疫の効果は、一時的であり、ＬＨ−ＲＨ抗体価に関係がある。

ＬＨ−ＲＨ免疫は全ての種の動物に同等な効果を有さず、そして、多数の免疫動 物は生殖機能の効果的な抑制が得られない。

外科的に無性化するのに代わるような効果がＬＨ−ＲＨ免疫にないことは、特に ウシで明らかである（シャンバッハ−１９８４＞　。

ＬＨ−ＲＨ自体は、サイズが小さい（約１２００ダルトン）ので抗原性はなく、 より大きい天然または合成キャリアー分子にＬＨ−ＲＨを結きさせる必要がある 。種々のキャリアー分子にＬＨ−ＲＨを結合する技術は、ゲルタールアルデヒド 縮合、トルエンジイソシアネート、ベンジジン誘導体およびカルボジイミドを用 いるものが知られている。これらの技術はコントロールが容易ではなく、予測可 能な組成物のコンジュゲートおよび一定の品質のコンジュゲートを生成するのが 非常に困難である。キャリアー分子とのＬＨ−ＲＨコンジュゲーションに最も広 く用いられる技術はカルボジイミド反応であり、そしてこの反応はとりわけ予測 がつかない（シャンバッハ−１９８４）、コンジュゲートの不均質性と産生され た抗原分子の非予測性形状は循環している内因性ホルモンを中和するための特定 の抗体の十分な抗体価を得るのを困難にしている。

同様に下垂体ホルモン、黄体化ホルモン（ＬＨ）に対する免疫について不均一な 結果が得られた。シャンバッハ−（１９８５）家畜繁殖学２４：５９ｒ黄体化ホ ルモンに対する雄ヒツジおよび雄ウシくいずれも去勢していない）の活性免疫の 効果」はヒツジＬＨに対する免疫は若い雄ウシに去勢様応答を惹起するが雄ヒツ ジー子ヒツジ（ｒａｍ　−Ｉａｎｂｓ）には効果がないことを明らかにした。反 対に、別の生殖ホルモン−テストステロン（Ｔ＞に対する免疫は、過剰に高値の 循環テストステロンを産生じ、高値の免疫複合体に加え腎炎が観察された。（Ｎ 、Ｂ、ハイネス（Ｈａｙｎｅｓ）およびＪ、Ａ、サラシー（Ｓ　ｏｕｔｈｅｅ） 、雌の内分泌学におけるステロイドホルモンに対する免疫の効果、１９８４、哺 乳動物における生殖の免疫学的観点、Ｄ、Ｂ、フライトン（Ｃｒｉｇｈｔｏｎ） 、ブラタ−ワース（Ｂ　ｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ）　）従って、従来技術に関連 した問題点の１以上を克服あるいは少なくとも軽減することが本発明の目的であ る。

それ故、本発明の第一の面によれば、 （ａ）　黄体化ホルモン（ＬＨ）、その類似物、その分画若しくはその誘導体、 または卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）、その類似物、その分画若しくはその誘 導体のタンパク質ホルモンコンジュゲート；および （ｂ）　黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、その類似物、その分画ま たはその誘導体のタンパク質ホルモンコンジュゲート； を含む動物用避妊ワクチンが提供される。

生殖制御機構の単一要素の別々の操作では、種々の動物に効果的な無性化技術を 提供しえないことが判明した。生殖のフィードバック機構の少なくとも２つの相 互に依存する成分に対する免疫は、異種動物のための効果的無性化ワクチンであ る。生殖制御機構の２要素に対する免疫は、事実上失敗のない機構を提供する。

避妊用ワクチンの成分（ａ）と（ｂ）は適当な相対量存在すればよい。（ａ）と （ｂ）の重量化は約１＝２から２：１の範囲であればよい効果を得るためには、 生殖制御機構の単一要素（例えばＬＨ−ＲＨ）に対する免疫に使用する技術は、 全個体において実質的に１００％効果的であるべきである。単一要素によってこ のレベルのコントロールを達成することは可能ではないことは十分な証拠がある 。しかしながら、２つの相互依存ホルモン（例えばＬＨ−ＲＨとＬＨ）に対する 免疫を用いる本発明による避妊ワクチンは、生殖機能を効果的に遮断あるいは中 断するそれぞれのホルモンに対する免疫応答の喚起に部分的に成功することが必 要なだけである。十分量のホルモンの供給とその価格の点における問題故に、下 垂体ホルモンに対する動物の免疫は最近まで商業的に実施できなかった０組み換 えＤＮＡ技術はこのような状況を変え、そしてこれらのホルモンあるいはそれら の分画は大量にしかも安価で生産されうる。

本発明による避妊用ワクチンはどんな動物種にでも使用することができる。ウシ 、ヒツジ、ヤギ、ネコ、モルモット、ブタ、イヌ、トナカイ、ウマおよび霊長目 の動物を含む動物種は、同様に処置されうる。避妊用ワクチンは特にイヌやネコ のような家庭用ベットに適用される。

ホルモン−タンパク質コンジュゲートは慣用技術を用いて形成することができる 。例えば、５ＰＤＰ、カルボジイミド、ゲルタールアルデヒドまたはビオチン／ アビジン系のような異形三機能性試薬（ｈｅｔｅｒｏｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ 　ａｇｅｎｔ）が使用されうる。

好ましくは、ホルモン−タンパク質コンジュゲートは反復かつ予測可能な方法を 用いて形成される。反復性と予測性があるので、この技術は特に大規模な製造に 適している。免疫系のための同一の抗原部位を常に有している適当な構造の抗原 の創製は、動物により一定の免疫応答を惹起する。特に、タンパク質キャリアー として、破傷風トキソイド（ＴＴ）が好適である。タンパク質キャリアーは６− マレイミドカプロン酸アシルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＣＳ） で活性化され、マレイミド反応基を導入する０例えば、マレイミド反応基が１０ ０，０００ダルトンあたり約３０の割合で導入されれば、ペプチドホルモンのた めの所望の数の結合部位が作られる。ペプチドホルモンはチオール化によって次 々と活性化される。チオール化は、例えばＮ−アセチルホモシスティンチオール アセトン（ＡＨＴＬ）との反応により活性化されうる。

本発明のこの面のより好適な形態によれば、（ｃ）　避妊ワクチン用の少なくと も１種のアジュバント、を更に含む上記の避妊用ワクチンが提供される。

少なくとも１種のアジュバントは、水酸化アルミニウム、フロインド不完全アジ ュバント、フロイント完全アジュバント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール 、ＰＣＧおよびポリＡポリＣまたはポリＵから選ばれうる。しかしながら、好適 な形態においては、ワクチンアジュバントは細胞壁免疫賦活化剤またはその混合 物を含む、細胞壁免疫賦活化剤はチモテ菌またはスメグマ菌の細胞壁分画であり うる。

この分画は精製したマイコバクテリウムの細胞壁のリソソーム消化によって得る ことができ、そして少なくとも一部を上記のような標準的アジュバント、特に最 も一般に使用されるフロイント完全アジュバントで交換することができる。この 細胞分画は体組ｍ調和性であり、ウィルスやタンパク質抗原に対する免疫応答を 刺激し、ツベルクリンに対する感受性を惹起しない。

これらの特徴がマイコバクテリウムの細胞壁製剤をコンパニオンおよび食物製造 用動物のためのワクチンを形成するのに著しく好適なものにする。

本発明の更なる面によれば、 （ａ）　黄体化ホルモン（ＬＨ）、その類似物、その分画若しくはその誘導体、 または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、その類似物、その分画若しくはその誘導体 のタンパク質−ホルモンコンジュゲート；および （ｂ）　黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、その類似物、その分画、 またはその誘導体のタンパク質−ホルモンコンジュゲート； を含む避妊ワクチンを用意し； 有効量のワクチンを処置される動物に投与することを含む動物の生殖機能を抑制 する方法が提供される。

動物の生殖機能を抑制する方法は雌動物における排卵および／または発情周期の 阻害または抑制、または雌動物における性行動の阻害または抑制を包含すること ができる。

ワクチンは非経口的に投与することができる。非経口投与には経皮、筋肉内また は静注、経口投与または皮膚を通して動物に植め込まれたあるいは動物の皮膚に 装着されたミニポンプによる吸着が含まれる。

用量速度効果は動物の体重または種によって変化するだろう。

それぞれの種の最適用量速度は、簡単な実験をすることによって選択することが できる。しかしながら、家庭用のイヌやネコのような小さな動物のための指標と しては、各投与用量は黄体化ホルモンまたは卵胞刺激ホルモンのコンジュゲート を約２００〜３００μｇおよび黄体化ホルモン放出ホルモンのコンジュゲートを 約２００〜３００μｇ含むことができる。使用されるワクチンコンジュゲートは 総量で約１５０〜２５０μ２でありうる。

好ましくは１回のワクチン接種のみが必要とされることであるが、安全のために ２回めのワクチン接種がなされてもよい。

本発明は、以下の実施例に関してより詳しく説明されるであろう、しかしながら 、以下の記載は単に例示するためのものであって、上記発明の一般性を何ら限定 するものでないことは理解するべきである。

Ｎ１匠 ２２１ン！ロＩＬ 凍結乾燥された細胞壁免疫賦活化剤（ラグランリサーチ、ＵＳＡ）を凍結乾燥さ れたホルモン−ＴＴコンジュゲートと混合した。免疫賦活化剤とコンジュゲート の比は各注入液が免疫賦活化剤２００μｇと各コンジュゲート２５０μｇを含む というようなものであった０次いで混合物を少量のマルコール−８２（Ｍ　ａｌ ｃｏｌ　−８２）油（総量の１％）と結合させ、０．５％ツイーン−８０（ポリ オキシエチレン　ソルビタンモノ−オレエート）を含む［ｔＦｆ化生理食塩液を 用いた超音波処理によって乳化した。

ホルモン １、Ｌ−Ｌｙｓ”−ＬＨ−ＲＨ（黄体化ホルモン放出ホルモン）類似物はベニン スララボラトリーズ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）ＵＳＡ から購入された。

２、ＬＨ（黄体化ホルモン）およびＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）。

ヒツジホルモン（ＮＩＨ−ＦＳＨ−３１２およびＮＩＨ−ＬＨ−８１８）はナシ ョナルホルモン　アンド　ビツーイタリ　プログラムＵＳＡ（Ｎａｔｉｏｎａｌ 　Ｈｏｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ｐｒｏｇｒａｍ＋＊ｅＵＳＡ ）から得た。

コンジュゲートのＩ゛告 キャリアータンパク質およびホルモンのコンジュゲートはり−（Ｌｅｅ）ら−（ １９８０）、モレキュラーイムノロジー　１７：７４９−７５６、「予測可能な 組成のβ−ｈＣＧ　Ｃ０ＯＨペプチド−キャリアーコンジュゲートの製造方法」 に従って製造した。キャリアーとして破傷風トキソイド（ＴＴ）が選ばれた。市 販のＴＴ（ＣＳＬ）を更に精製し、バイオ−ゲルＰ−６０のゲルｒ過によって濃 縮した。要約すると、タンパク質キャリアー（ＴＴ）を６−マレイミドカプロン 酸アシルＮ−ヒドロキシスクシンイミド　エステル（ＭＣ３＞と反応させ、１０ ０，０００ダルトンあたり約３０の割合でマレイミド反応基を導入した。キャリ アープロティンに対するＭＣ８のモル比を制御することによってチオール基（シ スティン残基）を含むペプチドホルモンに所望の結合部位を創製することができ た。

Ｌ−Ｌｙｓ・−ＬＨ−ＲＨはＮ−アセチルホモシスティンチオールアセトン（Ａ ＨＴＬ）との反応によってチオール化された。

チオール基を含むＭＣ３で修飾されたキャリアーとペプチドは次のようにしてコ ンジュゲートした：ＭＣＳ修飾ＴＴをＮ２飽和した０、１Ｍリン酸ナトリウム− ０，ＩＭＥＤＴｌｌｌ液（ｐＨ６，６）の少量中に溶解した。この溶液をキャリ アー中のマレイミド基がモル等量以上であるある量の乾燥ペプチドを含む反応バ イアルに加えた０反応を窒素雰囲気中室温で一晩行なった。コンジュゲートはｏ 、ｚＭＮＨ，Ｈｃｏ、緩衝液で平衡化した七フ７（Ｓｅｐｈ）Ｇ−２５カラムで 精製した。ボイドボリューム（ｖｏｉｄ　ｖｏｌｕｍｅ）に溶出されたコンジュ ゲートを凍結乾燥した。

飲狗ｌ−」ε度疫− 免疫に先だって６匹のバージンのメリノ種雌ヒツジの正常周期を１７日ごとに５ 周期観察した。雌ヒツジは５０匹の対照群から選ばれた。動物はジローシンハー ネス（Ｓｉｒｏ−８ｉｎｅ　ｈａｒｎｅｓｓ）をつけた雄ヒツジと一緒に飼育し た。実験動物をリン酸塩緩衝食塩水中に乳化したコンジュゲートの混合物と免疫 賦活化剤で免疫した。１ｘｌの筋肉内注射を２回２１日間隔で行った。最初の注 射は発情が認められたときに行った。

債Σ上 正常周期活性はコンジュゲートの最初の注射後に停止した。

１２ケ月の観察期間中、免疫動物では発情は雄ヒツジによっては検出されなかっ た。第２回めの注射は雌ヒツジにおいて生殖能力を抑制するのを助けていると思 われる。全ての免疫された動物において生殖能力は１または他のコンジュゲート に対するそれぞれの応答に関係なく１２ケ月以上にわたってなくなった０両コン ジュゲートに対する抗体の存在は、それが例え比較的低い力価であっても、雌ヒ ツジの生殖能力を壊すに十分であった（Ｆ　ｉｇ、　１およびＦｉｇ、２＞。

最後に、種々の他の修飾および／または変更がここに概略した本発明の精神から 逸脱することなくなし得ることを理解するべきである。

＝６ ／；！ν４釆く干ｉ（メ／μシッフ・・−Ｉ／Ｊｊ−島姶イぢト、ニム 国際調査報告 ＧＢ　１５４７５５７　０Ｓ　４３３８３０５　ｔ’ｓ　４２７２４３２

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）黄体化ホルモン（ＬＨ）、その類似物、その分画若しくはその誘導体 、または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、その類似物、その分画若しくはその誘導 体のタンパク質−ホルモンコンジュゲート、および （ｂ）黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、その類似物、その分画、ま たはその誘導体のタンパク質−ホルモンコンジュゲート、 を含む動物用避妊ワクチン。
2. ２．タンパク質−ホルモンコンジュゲート（ａ）とタンパク質−ホルモンコンジ ュゲート（ｂ）の重量比が約１：２から２：１の範囲である、請求の範囲第１項 記載の動物用避妊ワクチン。
3. ３．黄体化ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートと黄体化ホルモン放 出ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートを含む、請求の範囲第２項記 載の動物用避妊ワクチン。
4. ４．卵胞刺激ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートと黄体化ホルモン 放出ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートを含む、請求の範囲第２項 記載の動物用避妊ワクチン。
5. ５．タンパク質が破傷風トキソイドである、請求の範囲第２項記載の動物用避妊 ワクチン。
6. ６．破傷風トキソイドタンパク質が６−マレイミドカプロン酸アシルＮ−ヒドロ キシスクシンイミドエステルで活性化されている、請求の範囲第５項記載の動物 用避妊ワクチン。
7. ７．各タンパク質−ホルモンコンジュゲートのホルモン成分がチオール化によっ て活性化されている、請求の範囲第６項記載の動物用避妊ワクチン。
8. ８．ホルモンがＮ−アセチルホモシステインチオールアセトンで活性化されてい る、請求の範囲第７項記載の動物用避妊ワクチン。
9. ９．（ｃ）水酸化アルミニウム、フロインド不完全アジュバント、フロインド完 全アジュバント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール、ＰＣＧおよびポリＡポ リＣ若しくはポリＵ、細胞壁免疫賦活化剤またはその混合物から選ばれた少なく とも１種の動物用避妊ワクチン用のアジュバント、を更に含む、請求の範囲第２ 項記載の動物用避妊ワクチン。
10. １０．少なくとも１種のアジュバントがチモテ菌またはスメグマ菌の細胞壁分画 から選ばれた細胞壁免疫賦活化剤を含む、請求の範囲第９項記載の動物用避妊ワ クチン。
11. １１．有効量の黄体化ホルモン放出ホルモン、その類似物、その分画若しくはそ の誘導体；および黄体化ホルモン、その類似物、その分画若しくはその誘導体、 または卵胞刺激ホルモン、その類似物、その分画若しくは誘導体；および有効量 のタンパク質キャリアーを用意し； タンパク質キャリアーの一部を黄体化ホルモン放出ホルモンと反応させ、第１の タンパク質−ホルモンコンジュゲートを形成し； タンパク質キャリアーの一部を黄体化ホルモンまたは卵胞刺激ホルモンと反応さ せ、第２のタンパク質−ホルモンコンジュゲートを形成し； そのように形成された第１と第２のコンジュゲートを混合する； ことを含む動物用避妊ワクチンの製造方法。
12. １２．タンパク質が破傷風トキソイドである、請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．破傷風トキソイドが６−マレイミドカプロン酸アシルＮ−ヒドロキシスク シンイミドエステルで活性化されている、請求の範囲第１２項記載の方法。
14. １４．各ベアチドホルモンがチオール化によって活性化されている、請求の範囲 第１３項記載の方法。
15. １５．水酸化アルミニウム、フロインド不完全アジュバント、フロインド完全ア ジュバント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール、ＰＣＧおよびポリＡポリＣ 若しくはポリＵ、細胞壁免疫賦活化剤またはその混合物から選ばれた少なくとも １種の動物用避妊ワクチン用アジュバントを用意し；少なくとも１種のアジュバ ントをタンパク質−ホルモンコンジュゲートの混合物と混合する； ことを更に含む請求の範囲第１２項記載の方法。
16. １６．（ａ）黄体化ホルモン（ＬＨ）、その類似物、その分画若しくはその誘導 体、または卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、その類似物、その分画、若しくはその 誘導体のタンパク質−ホルモンコンジュゲート、および （ｂ）黄体化ホルモン放出ホルモン（ＬＨ−ＲＨ）、その類似物、その分画、ま たはその誘導体 を含む動物用避妊ワクチンを用意し； そして、処置される動物に有効量のワクチンを投与する；ことを含む、動物の生 殖機能の抑制方法。
17. １７．動物の生殖機能の抑制が、雌動物における排卵および／または発情周期を 阻害若しくは抑制、または雄動物の性行動の阻害または抑制を含む、請求の範囲 第１６項記載の方法。
18. １８．タンパク質−ホルモンコンジュゲート（ａ）とタンパク質−ホルモンコン ジュゲート（ｂ）の比が約１：２から２：１の範囲である、請求の範囲第１７項 記載の方法。
19. １９．黄体化ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートおよび黄体化ホル モン放出ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートを含む、請求の範囲第 １８項記載の方法。
20. ２０．卵胞刺激ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートおよび黄体化ホ ルモン放出ホルモンのタンパク質−ホルモンコンジュゲートを含む、請求の範囲 第１８項記載の方法。
21. ２１．（ｃ）水酸化アルミニウム、フロインド不完全アジュバント、フロインド 完全アジュバント、ＤＥＡＥデキストラン、レバミゾール、ＰＣＧおよびポリＡ ポリＣ若しくはポリＵ、細胞壁免疫賦活化剤またはその混合物から選ばれた少な くとも１種の動物用避妊ワクチン用のアジュバント；を更に含む、請求の範囲第 １８項記載の方法。