JPH08504439A

JPH08504439A - リポソーム組込みのためのホスホノ酸の脂質誘導体および使用方法

Info

Publication number: JPH08504439A
Application number: JP6514102A
Authority: JP
Inventors: ホステトラー，カール・ワイ; クマール，ラジュ
Original assignee: ベスター・インコーポレイテッド
Priority date: 1989-11-22
Filing date: 1992-12-17
Publication date: 1996-05-14
Also published as: CA2149753C; AU3328793A; PT674646E; US5194654A; EP0674646A1; WO1994013682A1; DE69232101T2; ES2165852T3; ATE206429T1; DE69232101D1; EP0674646B1; AU680812B2; EP0674646A4; CA2149753A1; DK0674646T3

Abstract

(57)【要約】脂質を含むプロドラッグが、サイトメガロウイルスおよび抗ウイルス剤の誘導体とともにヘルペス、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、エプスタイン−バー、および水痘帯状庖疹ウイルスによるウイルス感染症の治療のために提供される。化合物は、ホスホノ酸のホスフェート基またはカルボキシル基のいずれかを介して、脂質の選択された基のうちの１つと結合する抗ウイルス活性を示すホスホノ酸を含む。ホスホノ酢酸およびホスホノ蟻酸はしたがって、リン脂質、グリセロ脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、または脂肪酸に結合する。化合物は、細胞内加水分解後抗ウイルスホスホノ酸として持続する。脂質プロドラッグは、投与に続いてそれらの抗ウイルス活性の持続による抗ウイルスホスホノ酸の効能の改良において有効である。

Description

【発明の詳細な説明】リポソーム組込みのためのホスホノ酸の脂質誘導体および使用方法発明の背景本発明は一般に、抗ウイルス化合物の脂質誘導体を用いたウイルス感染症の治療に関する。特に、本発明は抗ウイルスホスホノ酸の脂質誘導体およびその用途に関する。脂質誘導化合物はリポソームの構造中に組込むことができ、それによってより多量のこれらの化合物をより少ない毒性で標的細胞に配達することができる、より安定なリポソーム複合体を形成できる。ここで参照されている出版物および他の参照資料は、ここに引用により援用され、便宜上この明細書の最後に添付されている文献目録に列挙されている。近年、ウイルス感染症を治療するための薬剤を開発することに非常に大きな関心が持たれている。過去において最も重要なウイルス性疾患は、肝炎を引起こすそれらのウイルスとともにヘルペスのウイルスおよびインフルエンザグループのウイルスによって引起こされるものであった。過去１０年の間には、ヒト免疫不全レトロウイルス（ＨＩＶ）による感染症が、主要な国民健康上の問題になってきた。有効な抗ウイルス剤は、ウイルスの遺伝情報の複製または転写を妨害する一方宿主細胞の正常な機能を阻害しないものである。ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）およびホスホノ蟻酸（ＰＦＡまたはホスカルネット（Foscarnet））は次に示す構造を有する。これらは、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびレトロウイルス感染症に対して（２）だけでなく、１型および２型の単純ヘルペスウイルスに対して（１）よい抗ウイルス活性を示す。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）によって引起こされる。ＨＩＶは、ＣＤ４＋ヘルパーリンパ球、ＣＤ４＋単核細胞およびマクロファージならびにある種の他のＣＤ４＋の細胞型のようなＣＤ４（Ｔ４）表面抗原を保有する細胞に感染するレトロウイルスである。ＣＤ４＋リンパ球のＨＩＶ感染の結果、ＡＩＤＳの免疫不全症の原因となる細胞崩壊および細胞死が起こる。しかしながら、ＣＤ４＋単核細胞およびマクロファージはウイルスによって大きくは害されないかもしれない。これらの細胞中におけるウイルス複製は、リンパ球中におけるよりも時間がかかるようであり、細胞障害がより少ないようである。その結果として単核細胞およびマクロファージはＨＩＶ感染の重要な貯蔵所となる。最近、ＨＩＶ抗体の存在の検査に対して陰性を示したあるＡＩＤＳ患者においても、マクロファージがＨＩＶ感染の貯蔵所として働いているかもしれないということが発見されてきている。ヌクレオシド類似体、特にジデオギシヌクレオシドが、命を引延し、かつＡＩＤＳに関係したある種の致命的な感染症の発生率を低減するということが見出されているが、ＡＩＤＳに対して利用できる有効な治療法はない。ジデオキシヌクレオシド類似体は、ＡＩＤＳの治療に対して現在知られている最も強力な薬剤であるが、これらの療法は完全には満足のいくものではない。最近のＡＺＴを用いたヒトの臨床試験において、貧血（２４％）および顆粒球減少症（１６％）により証明されているように重大な毒性が認められた（３、４）。ＨＩＶのいくつかの株に感染したとき、ある種の単核細胞誘導マクロファージは、リッチマン（Richman）他によって示されているように、インビトロでジデオキシチジン、アジドチミジン、および他のジデオキシヌクレオシドを用いる治療に対して耐性であるということが見出されてきている（５）。この耐性は、ＡＺＴ、ｄｄＣまたはｄｄＡをリン酸化する能力の低減をもたらす、ジデオキシヌクレオシドキナーゼの低いレベルに一部起因するかもしれない。ホスホノホルマート（ＰＦＡ）は、ヌクレオシド類似体に対する有効な代替的療法を提供するかもしれない。ＰＦＡは、インフルエンザウイルスＲＮＡポリメラーゼだけでなく広い範囲のＤＮＡポリメラーゼを阻害する。ＰＦＡはまた、１μＭを下回る濃度でＨＩＶおよび他のレトロウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）を阻害する。ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素よりもＰＦＡに対してそれほど敏感でないので、この薬剤がＨＩＶ感染症における使用に対してよい治療比を示すかもしれないという可能性がある。ホスホノ酸ＰＦＡおよびＰＡＡはまた、抗ウイルスヌクレオシドを用いる療法を補うかもしれない。ランバート（Lamber t）（６）は、ＰＦＡまたはＰＡＡが、ある抗ウイルスヌクレオシド、特に５− ブロモ−２′−デオキシウリジン（ＢＵｄＲ）と結合するとき、結合ヌクレオシドの単純ヘルペスウイルスに対する抗ウイルス活性は元のヌクレオシドの抗ウイルス活性よりも大きいということを見出した。抗ウイルスヌクレオシド類似体およびホスホノ酸の両方の効力を増大させる努力は、これらの薬剤の脂質との結合を含んでいる。さまざまな種類の癌の治療における化学療法剤としてのアラビノフラノシルシトシン（ａｒａ−Ｃ）およびアラビノフラノシルアデニン（ａｒａ−Ａ）のようなヌクレオシド類似体の治療効力を改良するための試みが、それらの異化作用の安定性を増大するためにそれらを化学的にリン脂質に結合させることによってなされてきている（７）。これらのリン脂質誘導剤は、ヌクレオシド類似体のみに関して低減された毒性および増大された安定性を示した。しかしながらそれらはまた、乏しい細胞摂取（６）および乏しい薬剤吸収（８）を示した。抗ウイルス剤の効力を増大させる別のアプローチは、細胞に対するそれらの配達を促進するリポソーム内へのカプセル化を含む。リポソームは、アレックスバングハム（Alex Bangham）の方法に従って形成され得る脂質小胞である。バングハムおよび共同研究者は１９６５年に、ホスファチジルコリンの乾燥した膜が水和によって閉じた２分子葉状小胞を自発的に形成するということを発見した（９）。薬における最も有効なリポソームの適用の１つは、治療剤を標的器官に配達する担体としての適用である。薬剤は、リポソーム形成の過程の間被包され、リポソームが細胞によって取込まれた後にインビボで遊離される。リポソームはそれによって、より高濃度の治療剤を標的器官に配達する手段を提供する。さらに、リポソームデリバリーはリポソームの摂取部位に治療を集中させるので、有毒な副作用を低減する。リポソーム組込みは、抗寄生虫化合物を配達する方法において、用量の潜在能を増大させるだけでなくその効能を延長しかつその毒性を低減する、より有効な方法を提供するということが見出されてきている。たとえば、ブラック（Black ）およびワトソン（Watson）（１０）ならびにアルビング（Alving）他（１１）によって別々に示されているように、リポソームのアンチモン剤はリーシュマニア症の治療において遊離の薬剤と比べ数百倍有効である。リポソームに取込まれたアンホテリシンＢは、全身性真菌症で免疫抑制された患者の治療において遊離の薬剤よりも有効であるということがわかっている（１２）。リポソームカプセル化に対する他の用途は、ドキソルビシン毒性の抑制（１３）およびアミノグリコシド毒性の減少（１４）を含む。ＰＦＡは、患者において到達できる濃度で、インビトロ系のいくつかにおいてＨＩＶ−１の複製を阻害するということが見出されてきている。しかしながら、ＰＦＡが細胞に入り込む割合が低いため、ＨＩＶＲＴを伴うセルフリー系において有効であると見出されているよりもずっと高いレベルが要求されるようになる。また、ＰＦＡは有毒な副作用を示し、ピロリン酸塩に似ているために骨中に蓄積されるということが知られている。ＰＦＡのそれに類似した抗ウイルス活性を示すホスホノ酢酸（ＰＡＡ）は、ヒトにおけるその使用を妨げるかもしれない骨への親和性を有するということがわかっている（６）。ホスホノ酸の細胞内抗ウイルス効果を、リポソーム中にホスホノ酸を被包することによって増加させる試みがなされてきている。スゾカ（Szoka），Ｆ．およびチュウ（Chu），Ｃ．（１６）は、リポソームの配達がＰＦＡとＰＡＡの両方の細胞摂取およびウイルス阻害活性を増大するということを見出した。リポソームの被包はまた、ＰＦＡの細胞変性効果を減少させたが、リポソームＰＡＡの細胞変性効果は遊離の薬剤と比べて増大されることがわかった。前述したように、マクロファージはＨＩＶ感染の重要な貯蔵所であるということを考慮する（１７、１８）。マクロファージはまたリポソーム摂取の最初の部位である（１９、２０）。したがって、ＡＩＤＳおよび他のウイルス感染症の治療において、抗ウイルスヌクレオシドの抗ウイルスホスホノ酸エステルおよび抗ウイルスホスホノ酸の効力を増大するためにリポソームを利用することは望ましいであろう。明らかに、大量の有効な抗ウイルスホスホノホルマート化合物を、ＨＩＶまたは他のウイルスに感染したマクロファージ、およびウイルス感染症を有する他の細胞に配達する、より有効な方法を得ることは有用となるであろう。同時係属の米国特許第２１６，４１２号および第３１９，４８５号（２１、２２）は、それらの薬剤のリポソーム配達を含む療法をさらに改良するために、リポソームの構造中に組込むことができるヌクレオシド類似体の脂質誘導体を開示する。ホスホノ酸抗ウイルス剤をより有効に用いるために、薬剤の脂質プロドラッグを合成することが望ましい。それゆえ本発明の目的は、安定なリポソーム形に組込むことができるホスホノ酸脂質誘導体を製造する方法を提供することである。ここで開示される方法は、ＡＩＤＳおよび他のレトロウイルス病の治療におけるホスホノ酸の脂質誘導体の用途だけでなく、インフルエンザ、単純性庖疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒトヘルペスウイルス６、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）および水痘帯状庖疹ウイルス（ＶＺＶ）のような他のウイルスによって引起こされる病気の治療におけるホスホノ酸の脂質誘導体の用途にも適用される。図面の簡単な説明図１は、ＨＩＶ−感染細胞におけるプラーク形成に対する本発明の組成物の効果を示す。発明の概要本発明は、脂質成分を結合させた抗ウイルスホスホノ酸を含む抗ウイルス特性を有する組成物を提供する。好ましい具体例において、ホスホノ酸はホスホノ蟻酸であり、別の具体例において、ホスホノ酸はホスホノ酢酸である。ホスホノ酸は、リン酸エステルまたはカルボキシエステル結合のいずれかを介して脂質基に付着し得る。本発明はまたジホスフェート基を介して脂質に結合するホスホノ酸を含む。本発明の１つの具体例によると、ホスホノ酸に付着する脂質成分は、ジアシルグリセロールもしくはジアルキルグリセロールまたは１−アシル−２−Ｏ−アルキルグリセロール、もしくは１−Ｏ−アルキル−２−アシルグリセロールであり、他の具体例によると、脂質成分はモノアシルグリセロールもしくはモノアルキルグリセロオールまたは脂肪酸、リン脂質、またはたとえばスフィンゴシン、セラミド、カルジオリピン、もしくはビス（ジアシルグリセロ）ホスフェートのようなより複合的な脂質成分である。脂質成分は、各々が２から２４個の炭素原子を含む１から４個の長鎖脂肪族基を含んでよいが、それらは１から６個の二重結合を含み不飽和であってもよい。グリセロールの脂肪族基は、エステル、エーテル、またはビニルエーテル結合によって構成要素のグリセロールユニットに付着してもよい。１つより多いこのような基を有する脂質の脂肪族基は、構造において同じであってもよいしまたは異なってもよい。好ましいホスホノ酸脂質誘導体は１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸である。１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸は特に好ましい。他の好ましい具体例は１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニル−ホスホノ酸である。本発明の他の局面によれば、一般式（ＶＩ）のホスホノ酸の脂質の多い誘導体が提供され、ビスジアシルグリセロールホスフェートホスホノ酸およびホスホノ酸のジホスファチジルグリセロール誘導体を含む。本発明はさらに少なくとも一部が本発明の任意の組成物から形成されるリポソームを含む。本発明の他の局面は、哺乳動物におけるウイルス感染症の治療に使用するリポソーム懸濁物を調製するための方法であり、この方法は、脂質成分に結合するホスホノ酸からなるグループから選択される親油性の抗ウイルス剤を提供し、親油性の抗ウイルス剤と薬理学的に許容される水溶性の溶媒とを組合せて混合物を形成し、かつ親油性の抗ウイルス剤からリポソームを形成することを含む。本発明はさらに、哺乳動物のウイルス感染症を治療するための方法を含み、この方法は、本発明の組成物の任意の１つを有効な量で投与することを含む。好ましい具体例において、哺乳動物はヒトであり、ウイルスはレトロウイルスＨＩＶである。特に好ましい具体例において、本発明の方法はＡＺＴまたは他の抗レトロウイルス類似体の投与と結び付けて用いられる。この方法は、本発明の組成物の１つの形態において類似体を投与することにより、ＡＺＴまたは他の抗ウイルス類似体に対する耐性を回避することまたは克服することを含んでもよい。これらの化合物の親油性は、投与に従ってインビボでのそれらの持続性を延長することにより、ホスホノ酸単独での使用に対して利点を提供する。脂質−ホスホノ酸はまた、類似の親油性の分子に結合するとき、リポソームの層状構造に組込まれ得る。リポソームの形態においてこれらの抗ウイルス分子は、好ましくは、標的であるヒト免疫不全レトロウイルス（ＨＩＶ）を潜ませることが見出されている細胞であるマクロファージおよび単核細胞によって取込まれる。付加的な部位特異性はまた、ウイルスタンパク質に結合するタンパク質またはモノクロナール抗体または他のペプチドのようなリガンドを含めることにより、リポソームに組込むことができる。これらのプロドラッグは、抗レトロウイルス剤の従来の形態での療法に対して耐性を示すようになってきたＨＩＶ感染症において、ウイルス複製を妨げるということが見出されてきている。発明の詳細な説明本発明は、リポソームの脂質二重層に組込むことができるホスホノ酸の合成脂質誘導体を提供する。これらの誘導体は、成分の代謝過程によって抗ウイルスホスホノ酸に変換され、それらはしたがってインビボおよびインビトロで抗ウイルス効果を有する。ホスホノ酸は次式のような一般構造を有する。本発明の好ましい具体例において、ｎは０ないし１であり、ホスホノ酸はホスホノ蟻酸またはホスホノ酢酸である。本発明の脂質誘導体抗ウイルス活性を示すホスホノ酸の任意の脂質誘導体は、本発明の範囲内にある。最も有効であろう組成物は、安定な方法で物質をリポソーム二重層、細胞膜、脂質二重層、または他の高分子配列体に組込むことができるのに十分な脂質成分を有するであろう。ホスホノ酸に付着する脂質基は、たとえば糖脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、グリセロ脂質、または脂肪酸であり得る。ホスホノ酸は、カルボキシエステル結合またはホスホエステル結合のいずれかを介して脂質の利用できる水酸基に都合よく結合し得る。いくつかの好ましいホスホノ酸の脂質誘導体は、次に示す一般クラスのメンバーである。抗ウイルスジアシルグリセロールホスホノ酸このクラスの抗ウイルス脂質化合物の１つの種は、次式のような構造を有する。式中、ｎ＝０または１であり、脂肪族酸、蟻酸または酢酸のいずれかホスホナート結合を介してＰに結合してホスホノ酸を形成する。また、Ｒ₁およびＲ₂は次に示すように定義される脂肪族基である。このクラスの化合物の別の種は、次式のような構造を有する１，２，−ジアシルグリセロールオキシカルボニルホスホノ酸である。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ₁およびＲ₂は、０〜６個の二重結合を有するＣ_2-24 脂肪族基であり、エステル結合を介してグリセロール基のＣ１およびＣ２に結合する。ホスホノ酸の１−Ｏ−アルキルグリセロール誘導体このクラスの１つの種は、次式のような一般構造を有するこれらの脂質誘導体である。式中、ｎ＝０または１であり、脂肪族酸、蟻酸または酢酸のいずれかがホスホナート結合を介してＰに結合する。また、Ｒ₁は次に示すように定義される脂肪族基である。このクラス化合物の別の種は、次式のような構造を有する。式中、ホスホノ酸、ホスホノ蟻酸（ｎ＝０）またはホスホノ酢酸（ｎ＝１）のいずれかは、カルボキシエステル結合によってグリセロール成分に結合する。ジアシルグリセロールホスフェートホスホノ酸このクラスの抗ウイルスホスホノ酸脂質は、次式のような一般構造を有する。式中、ｎ＝０または１であり、脂肪族酸基、蟻酸または酢酸のいずれかはホスホナート結合を介してＰに結合する。また、Ｒ₁およびＲ₂は次に示すように定義される脂肪族基である。セラミド抗ウイルスホスホノ酸抗ウイルスホスホノ酸はまた、次式のような構造を有するもののセラミド誘導体のリポソームデリバリー後、細胞中で生成し得る。式中、ｎ＝０または１であり、ＣＥＲは次に示すような構造を有するＮ−アシルスフィンゴシンである。式中、Ｒは下に示すように定義される脂肪族基、またはスフィンゴシンの脂質置換誘導体に同等のものである。このクラスの化合物は、ＡＩＤＳおよび他のウイルス性疾患の治療におけるリポソーム製剤において有用である。なぜなら、細胞中でスフィンゴミエリナーゼまたはホスホジエステラーゼによって、抗ウイルスホスホノ酸を生じさせる役割を果たし得るからである。上記で示した化合物に加えて、セラミドジホスフェートホスホノ酸を合成することもでき、これは細胞のピロポスファターゼによって分解され、ホスホノ酸およびセラミドホスフェートを与えることができるであろう。抗ウイルスホスホノ酸の脂質の多い誘導体リポソーム内でホスホノ酸の脂質誘導体のより大きな安定性を達成するためのアプローチは、脂質−ホスホノ酸構造と脂質二重層の間の脂質−脂質相互作用を増大することによる。したがって、好ましい具体例において、４つまでの親油性基を有するホスホノ酸の脂質誘導体は合成されてよい。次式を有する特定の組成物が提供される。（Ｌ）_m−（Ｖ）_n−Ｗ−Ｔ［VI］Ｏ）−Ｏ−（ｐ＝０または１）であり、Ｖはホスフェートであり、ｎ＝０〜２であり、Ｌは脂質成分であり、ｍ＝１〜３であり、Ｌはホスホエステル結合においてＶに直接結合し、Ｔはホスホナート結合を介してＷに結合する。別の具体例において、次式を有する組成物が提供される。ｎ＝０または１であり、Ｔは（ＣＨ₂）_p−Ｃ（Ｏ）−Ｏであり、ｐ＝０または１であり、Ｌは脂質成分であり、Ｌ₁は（ＣＨ₂−ＣＨＯＨ−ＣＨ₂）であり、ＬおよびＬ₁は各々ホスホエステル結合を介してＶに結合し、Ｔはホスホナート結合を介してＷに結合する。これらの１つのクラスは、次式のような一般構造を有するジホスファチジルグリセロール誘導体を含む。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ_1-4は２、３または４つの脂肪族基であり、それらは独立して以下に定義されるようなＲであり、前記基はアシルエステル、エーテル、またはビニルエーテル結合におけるものである。このクラスにおいて、ホスホノ酸はジホスフェート結合によって１つまたは両方のホスフェートに付着する。１つまたは２つのホスホノ酸は各分子に付着してよい。増加した脂質成分を有するホスホノ酸誘導体の別のクラスは、次式のような一般構造を有するビス（ジアシルグリセロ）ホスフェートホスホノ酸を含む。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ₁−Ｒ₄は先に定義されたとおりである。この化合物は、内因性ピロホスファターゼまたは他のエステラーゼによって細胞中でホスホノ酸に代謝されるであろう。これらの２種類の化合物は、より優れた代謝特性および物性を提供するであろう。脂質構造置換Ｒ基であるＲ₁およびＲ₂、ならびにビス（ジアシルグリセロ）種に対するＲ_3-4は、同じであってもよいし異なってもよく、０〜６個の不飽和部位を有するＣ₂からＣ₂₄の脂肪族基であり、好ましくは次の構造を有する。 CH₃-（CH₂）_a-（CH=CH-CH₂）_b-（CH₂）_c-Y 式中、ａとｃの合計は０〜２２であり、ｂは０〜６であり、Ｙは脂肪族基とグリセロール部分の間でそれぞれアシルエステル、エーテルまたはビニルエーテル結合を形成するＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｃ−Ｏ−、Ｃ＝Ｃ−Ｏ−、Ｃ（Ｏ）Ｓ−、Ｃ−Ｓ−、Ｃ＝Ｃ−Ｓである。したがってアシルエステル結合におけるこれらの脂肪族基は、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸およびリグノセリン酸のような天然に存在する飽和脂肪酸、ならびにパルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸およびアラキドン酸のような天然に存在する不飽和脂肪酸を含む。好ましい具体例は、モノエステルまたはジエステル、または１−エーテル、２−アシルエステルホスファチジル誘導体を含む。他の具体例において、脂肪族基は同じ炭素数の技分かれ鎖であり得、第１もしくは第２アルカノールまたはアルコキシ基、シクロプロパン基、および分子内エーテル結合を含む。グリセロ−ホスホ結合は、ラセミもしくはｓｎ−１もしくはｓｎ−３のエステル結合であってよく、あるいはホスフェート基はグリセロール部分の２−位に結合してもよい。必要に応じて１または２個の（ビス（ジアシルグリセロ）種に対しては３、または４個の）アシルエステル基、またはアルキルエーテルまたはビニルエーテル基があってもよい。任意の上記の具体例において、Ｌは次式のようなＲからなるグループから独立的に選択される。式中、Ｒ，Ｒ₁およびＲ₂は、独立して、エステル、エーテル、またはビニルエーテル結合におけるＣ₂からＣ₂₄の脂肪族基である。説明された任意の具体的な組成物において、Ｒ、Ｒ₁およびＲ₂は独立して０〜６の不飽和の部位を有し、次式のような構造を有する。 CH₃-（CH₂）₈-（CH=CH-CH₂）_b-（CH₂）_c-Y 式中、ａとｃの合計は０〜２２であり、ｂは０〜６であり、ＹはＣ（Ｏ）Ｏ−、Ｃ−Ｏ−、Ｃ＝Ｃ−Ｏ−、Ｃ（Ｏ）Ｓ、Ｃ−Ｓ、またはＣ＝Ｃ−Ｓである。ホスホノ酸の脂質誘導体の合成脂質がホスフェートエステル結合を介してホスホノ酸のホスフェートと結合するこのクラスのホスホノ酸脂質誘導体、たとえは式ＩＩａ、ＩＩＩａ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸの化合物は、例１、２、および５において説明されるように調製され得る。たとえば式ＩＩａのジアシルグリセロホスホノホルマートは、例１で１，２−ジミリストイル−グリセロ−３−ホスホホノホルマートの調製に対して、または例２で１，２−ジパルミトイル−グリセロ−３ −ホスホホノホルマートの調製に対して記述されるように、ピリジン中でトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリドを用いるジアシルグリセロールおよびホスホノ蟻酸の反応から合成され得る。一般式ＩＩＩａの１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸、または２−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸は、例５に従って類似の手順で調製され得る。ホスホノ酸がカルボキシエステル結合を介してホスホノ酸のカルボニル基とともに脂質基と結合する、式ＩＩｂおよびＩＩＩｂのホスホノ酸脂質誘導体は、例３および例４に示す方法に従って調製され得る。エステル化されていないグリセロールヒドロキシ基はベンジルのような保護基を有する。１−アシル−２−Ｏ−アルキルグリセロール、１−Ｏ−アルキル−２−アシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、１−アシルグリセロール、２−アシルグリセロール、２−Ｏ−アルキルグリセロールを含む他の類似体は、必要に応じて類似の保護基を用いる同様の方法により合成され得る。ジアシルグリセロールホスフェートホスホノ酸クラスの式ＩＶの化合物はまた、アグラノフ（Agranoff）およびスオミ（Suomi）（２３）によってシチジンジホスフェートジグリセリドに対して説明されているように、ホスホノ酸のモルホリダート（morpholidate）誘導体を調製し、乾燥ピリジン中でホスファチジン酸と結合することによって合成されてよい。あるいは、ホスファチジン酸のモルホリダートは、同様にホスホノ酸に直接結合してもよい。式Ｖのセラミドホスホノ酸は、出発物質を適当に変えることで、抗ウイルスホスホノ酸ジホスフェートジグリセリドを調製する方法に類似する方法を用いて調製されてよい。式ＩＸのビス（ジアシルグリセロ）ホスフェートホスホノ酸化合物は、例において示される縮合方法によってホスホノモルホリダートをビス（ジアシルグリセロ）ホスフェートのホスホエステル残基に結合することによって合成されてよい。ホスホノ酸の他の適した脂質誘導体は、同じ方法および出発物質として適切な新規の脂質を用いることによって合成されてよい。たとえば、脂質製剤を吸収する標的細胞により代謝の変換経路において効力のある抗ウイルス剤を生じるであろう抗ウイルスおよび抗レトロウイルスホスホノ酸のリン脂質誘導体を合成することが望ましい。リポソームの調製合成および精製の後、ホスホノ酸の脂質誘導体はリポソーム、または他の適した担体に組込まれる。組込みは、音波処理およびエクストルージョンのようなよく知られたリポソーム調製の手順に従って遂行され得る。リポソームの調製の適した一般的な方法は、限定されるものではなく、Bangham他（９）、Olson他（２４）、SzokaおよびPapahadjapoulos（２５）、Ｍayhew他（２６）、Kim他（２７）、およびMayer他（２８）によって開示される方法を含む。リポソームは、ホスホノ酸の脂質誘導体単独から、または、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、またはホスファチジルイノシトールのような卵、植物または動物源のような天然に由来するリン脂質を含む天然のリン脂質リポソーム材料、または合成リン脂質リポソーム材料の任意のものと組合せて形成されてもよい。用いられてもよい合成リン脂質は、限定されることなく、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジル−コリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリン、ならびに対応する合成ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロールを含む。コレステロールもしくは他のステロール、コレステロールヘミスクシナート、糖脂質、セレブロシド、脂肪酸、ガングリオシド、スフィンゴ脂質、１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイル）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ＤＬ−２，３−ジステアロイルオキシプロピル（ジメチル）−β−ヒドロキシエチルアンモニウム（２９）、またはサイコシンのような他の添加物はまた、一般的に知られているように加えられ得る。リポソーム中で用いられる添加物およびリン脂質の相対的な量は、必要に応じて変えられ得る。好ましい範囲は、約８０モル％から９５モル％のリン脂質（脂質ホスホノ酸を含む）および５モル％から２０モル％サイコシンまたは他の添加物である。コレステロール、コレステロールヘミスクシナート、脂肪酸またはＤＯＴＡＰは、０モル％から５０モル％の範囲の量で用いられてよい。リポソームの脂質層に組込まれるヌクレオシド類似体および抗ウイルスホスポノ酸の量は、約０．０１モル％から約１００モル％の範囲のそれらの脂質の濃度で変えられ得る。一般的な方法を用いて、溶液中に存在する約２０％から３０％のホスホノ酸をリポソーム中に捕らえることができ、したがって約７０％から８０％の活性化合物が無駄になる。これに比較して、脂質ホスホノ酸がリポソーム中に組込まれる場合では、実質的にすべての抗ウイルス化合物がリポソーム中に組込まれ、本質的に活性化合物は少しも無駄にならない。上記の製剤を用いるリポソームは、モノクロナール抗体または標的に対して特異的な他のリガンドを組込んでそれらの意図される標的に対してさらにより特異的なものにしてもよい。たとえば、ＣＤ４（Ｔ４）レセプタに対するモノクロナール抗体が、レザーマン（Leserman）他の方法（３０）によりリポソーム中に組込まれるホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）に対する結合によってリポソーム中に組込まれてもよい。ウイルス性疾患の治療本発明の脂質誘導体またはこれらの抗ウイルス剤を含み、かつバチルアルコールホスホノ蟻酸またはホスファチジルホスホノ蟻酸（ホスファチジル−ＰＦＡ）またはホスファチジルホスホノアセタート（ホスファチジル−ＰＡＡ）またはこのクラスの化合物の抗ウイルス類似体のような脂質誘導体を０．１％から１００％含むリポソームは、ＨＩＶまたはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に感染しているヒトに対して非経口経路によって投与されてよい。これらのリポソームは、ウイルス感染の重要な貯蔵所であるマクロファージおよび単核細胞への化合物のデリバリーを向上させるよう非経口投与によって、ＡＩＤＳまたはＣＭＶの患者に与えることができる。これは、修飾されたホスホノ酸のより低い投薬量の効果的な利用を可能にし、化合物の毒性を低減できるであろう。これらの抗ウイルス剤は、それだけで用いられてもよいしまたは従来提供されるようなこの一般的クラスの他の抗ウイルスヌクレオシドと組合せて用いられてもよい。加えて、同時係属出願（２２）に開示されているような、ＡＺＴ、ｄｄＣ、ｄｄＡ、ｄｄＩ、ｄ４ＴおよびｄｄＴのリポヌクレオチドはまた、単独または組合せでホスファチジル−ＰＦＡリポソームに組込まれ、ｐＰＦＡ／ジデオキシヌクレオシドの組合せ療法をもたらすかもしれない、ということに留意することが重要である。あるいはジデオキシヌクレオシドのリン酸エステルは、先に説明されているように（１６）、ｐＰＦＡリポソームの内部にカプセル化されてＨＩＶ感染症に対する組合せ療法をもたらすかもしれない。ＡＺＴおよびホスファチジル−ＰＦＡを用いたこれらの組合せ療法は、単独の薬剤療法の間に発生することが見出されてきたＡＺＴ−耐性（またはヌクレオシド−耐性）株（３１）をより有効に治療するために特に重要であるかもしれない。概説されたような組合せ療法の使用は、薬剤耐性のＨＩＶ変異株が現れる傾向を低減させるかもしれなく、それゆえＨＩＶ感染症の進行を抑える可能性を増加させるであろう。同じ論点が、耐性株を発生させる可能性に対して、サイトメガロウイルスまたはヘルペスウイルス感染症の治療において十分にうまく適用できるであろう。リポソームに組込まれた脂質−ホスホノ酸結合体は、投与するリポソームに対して利用される任意の知られた手順によって患者に投与される。リポソームは緩衝水溶液として、静脈内、腹腔内、筋内、硝子体内（intravitreally）または皮下に投与され得る。製薬上許容される任意の水溶性緩衝液または他の媒体は、リポソーム構造または脂質ホスホノ酸類似体の活性を消失させない限り利用されてよい。１つの適した水溶性緩衝液は、ｐＨが約７．４の５ｍＭのリン酸ナトリウムを含む１５０ｍＭのＮａＣｌまたは他の生理学的緩衝塩溶液である。ヒトを含む哺乳動物に対する投薬量は、感染の進行度とその重度さおよび投与される化合物の活性度に応じて変えられてもよい。ホスホノ酸に対する投薬量の水準は十分に確立されている（２、６、１６）。ホスホノ酸のリポソーム脂質類似体の投薬量の水準は、ホスホノ酸自身の水準と同様になるであろうが、一般に１日の基準として患者に約０．１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇの量、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの量で投与されるような用量であろう。本発明は、上記で示されているように、これらの化合物をマクロファージ、単核細胞およびリポソーム組成物を吸収する任意の他の細胞に導くため、リポソーム中に組込まれる抗ウイルスホスホノホルマート誘導体を用いる。リガンドがまた、リポソームの特異性に注目して組込まれてよい。説明された誘導体は、リポソームの水に可溶なホスホノホルマートに関していくつかの独特でかつ新規な利点を有する。第１に、それらは水溶性のコアコンパートメントに置かれる代わりにリポソームの壁の中に組込まれるので、脂質に対して薬剤をより高い割合までリポソーム中に処方することができる。第２に、上記で示された親油性のホスホノホルマート誘導体を含むリポソームは、生成物の安定性が向上しており、貯蔵の間漏れない。さらに、これらの組成物は、凍結乾燥され、室温において乾燥状態で保管され、使用のために再構成してもよく、貯蔵寿命が向上する。それらはまた、活性化合物の顕著な浪費なしに抗ウイルス化合物のリポソーム製剤への効率的な組込みを可能にする。さらなる利点は、インビボの治療で用いられる組成物は、投与される抗ウイルス脂質−ホスホノ酸結合体をより大きな割合で意図された標的に到達させることである。同時に組成物の使用は、一般に細胞によって吸収される量を低減し、それによってヌクレオシドの有毒な副作用は減少する。ホスホノホルマートの有毒な副作用は、リガンドをリポソーム中に組込むことによって、感染の実際の部位または潜在的な部位に結合するリポソームに標的を定めることによりさらに低減されるかもしれない。抗ウイルス剤の脂質誘導体は、脂質フリーの薬剤と比較して抗ウイルス効果が引き延ばされる。したがって、それらはリポソーム中に組込まれないときでさえ、薬剤としての治療上の利点を提供する。抗ウイルスホスホノ酸の非リポソーム脂質誘導体は、皮膚または粘膜または体内、たとえば経口、気管内または他の肺動脈のルート、腸内、直腸、鼻、膣、舌、静脈内、動脈内、筋内、腹腔内、皮内または皮下に対して適用されてもよい。本発明の製薬的調製物は活性剤を単独で含むことができ、またさらに製薬上有効な物質を含んでもよい。それらはさらに、製薬上許容される担体を含んでもよい。抗ウイルスホスホノ酸の脂質誘導体を含む製薬的調製物は、約０．１％から１００％、好ましくは約１％から５０％の有効成分を含むように通常の溶解および凍結乾燥によって製造される。それらは、使用するのに口に合うか好ましいものにするために、有効な補助剤、賦形剤、希釈剤、香料または香味料とともに軟膏剤、塗剤、錠剤、カプセル剤、粉剤またはスプレーとして調製することができる。経口摂取に対する製剤は、粉末化された有効薬剤のアンプル、錠剤、カプセル剤、丸剤の形態、または油性もしくは水性の懸濁液または溶液の形態である。錠剤または他の液体でない経口組成物は、ラクトースまたは炭酸カルシウムのような希釈剤、ゼラチンまたは澱粉のような結合剤、および口に合う調合剤を提供するために甘味料、着香料、着色料、または保存料からなる群から選択される１つまたはそれ以上の薬剤を含み、薬学的組成物の製造に対する技術で知られる可能な補助剤を含んでもよい。さらに、このような経口調合剤は、腸道におけるさらなる遅延崩壊および吸収に対する知られた技術を用いてコーティングされてもよい。水溶性の懸濁液は、メチルセルロースのような分散剤、レシチンまたは直鎖脂肪族アルコールのような潤滑剤を含む薬学的に許容される補助剤とともに混合物において有効成分を含んでもよい。前記水溶性懸濁液はまた、工業規格に従って防腐剤、着色料、着香料および甘味料を含んでもよい。局所および局部の適用に対する調合剤は、低級の脂肪族アルコール、グリセロール、ポリエチレングリコールのようなポリグリコール、脂肪酸のエステル、および油脂およびシリコーンを含んでもよい製薬的に適切な媒体において、エアロゾル、スプレー、ローション、ゲルおよび軟膏を含む。調合剤はさらに、アスコルビン酸またはトコフェロールのような抗酸化物、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸エステルのような防腐剤を含んでもよい。非経口の調合剤は、特に無菌または滅菌された生成物を含む。注入できる組成物は、活性化合物および任意のよく知られた注入できる担体を含んで提供されてもよい。それらは、浸透圧の調整のために塩を含んでもよい。脂質誘導体の治療上有効な量は、任意の特定の場合における適切な投薬量の選択において、患者の体重、一般的健康、代謝、年齢および薬剤に対する反応に影響を与える他のファクタが考慮されなければならないということに留意して、活性抗ウイルスホスホノ酸の勧められる量を参照することによって決定される。非経口の投薬量は、経口の投薬量よりも低い大きさのオーダが相応しいであろう。次に示す実施例を参照することによって、本発明をより完全に理解することができるが、それらの例は本発明を過度に限定するようには意図されない。例１１，２−ジミリストイル−グリセロ−３−ホスホノホルマートの合成三つ口反応フラスコに、４ｍｌの乾燥ピリジン（アルドリッチ（Aldrich）、M ilwauKee、WI）に溶解した０．６２０ｇのホスホノホルマート（ＰＦＡ）（Sigm a ChemicalCO.、St．Louis、MO）、および１．２８ｇのトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（Aldrich）が加えられた。４０ｍｌの１，２−ジミリストイルグリセロール（１０ｍｇ／ｍｌ）（Avanti Polar Lipids、Pelham、Alaba ma）は蒸発され、１０ｍｌの新たに蒸留した乾燥ピリジン中に溶かされてから、３０分以上の間反応混合物に滴下された。反応混合物は室温で一晩中攪拌された。２４時間後に冷０．１ＮＨＣｌを５０ｍｌ加えることによって反応は停止された。有機相か分離され、Ｐ₂Ｏ₅で乾燥されてから真空下で蒸発濃縮された。生成物は、２０℃でクロロホルムおよびアセトンから結晶化した。クロロホルム、メタノール、アンモニアおよび水（体積比７０／３０／１／１）の塩素系において展開させた、結晶化生成物の薄層クロマトグラフィーは３種類のリン含有生成物を与えた。必要な化合物のさらなる精製は、カラムクロマトグラフィーにより得られた。５０ｍｌのクロロホルム中の生成物は１×１４インチのガラスカラム中で４０ｇｍｓのシリカゲルＧ、７０−２００メッシュ上に載せられ、連続的に２００ｍｌのクロロホルム、２００ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：５）、２００ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１０）、および最終的に３００ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：１）で溶出された。純粋な１，２−ジミリストイル−３−ホスホノホルマートがクロロホルム／メタノール（１：１）画分中で回収された。化合物の純度は２種類の溶媒系、すなわちクロロホルム、メタノール、アンモニア、および水（７０／３０／１／１）、ならびにクロロホルム、メタノール、アンモニア、および水（６５／３５／４）を用いることによって調べられた。純粋な化合物は前記の塩素系においてＲｆ値０．５４である。例２１，２−ジパルミトイル−グリセロ−３−ホスホノホルマートの合成１ｇのホスホノ蟻酸（ＰＦＡ），三ナトリウム塩（Fluka、RonKonkoma、NY）が５０ｍｌの蒸留水に溶かされ、Ｄｏｗｅｘ５０−Ｘ８（Ｈ＋）、２００−４００メッシュの１．４×１０ｃｍカラムに通された。ＰＦＡ−Ｈ＋は水で溶出され、一晩凍結乾燥されてから室温で、真空オーブンにおいてＰ₂Ｏ₅により４８時間乾燥された。１５ｍｌの乾燥ピリジン（Aldrlch、MilwauKee、WI）を含んだ５０ｍｌ丸底フラスコに、１２０ｍｇの１，２−ジパルミトイルグリセロール（Sigm a、St．Louis、MO）、２３０ｍｇのＰＦＡ−Ｈ＋、および５２７ｍｇのトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（ＴＰＳ）（Aldrich、Milwakee、WI）が加えられた。容器はゴムのセラム・ストッパで密封され、アルゴンが流された。反応物はアルゴン下で一晩攪拌され、２４時間後に１５ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）が加えられてから、生成物は− ２０℃で１５ｍｌのアセトンを加えることによって沈澱させられた。沈澱物は集められ、クロロホルム／アセトンから再結晶されて、約７０％の収率で１，２− ジパルミトイルグリセロ−ｓｎ−３−ホスホノホルマートが得られた。生成物は少量のクロロホルム／メタノール（１：２）中に集められ、少量のアリコートがシリカゲルＧプレート（UniPlate、Analtech）に与えられて、クロロホルム／メタノール／濃アンモニア／水（体積比７０／３０／１／１）またはクロロホルム／メタノール／水（６５／３５／６）で展開された。生成物は、それぞれ、０．６９または０．８０のＲｆ値でリン陽性スポットとして現れた。化合物の純度は、濃硫酸を用いて炭にした後、目視検査によって０％であると推定された。さらなる精製が、粗生成物の一部を、２０×２０ｃｍプレートのシリカゲルＧ（シリカ厚さ０．５ｍｍ、Analtech）を用いる分取薄層クロマトグラフィーに供しクロロホルム／メタノール／濃アンモニア／水（７０／３０／１）で展開することによって達成された。化合物は、きれいなガラスプレートで残りの部分の表面を覆うように注意しながら、リンスプレーを用いてプレートの外側の端にレファレンスガイドスポットを吹き付けることによって定着させられた。生成物を表わすスポットは削られ、クロロホルム／メタノール／水（１／２／０．８）で抽出された。クロロホルム相は、ブリフ（Bligh）とディア（Dye r）（３２）によって説明されているように、最終の溶媒比が１／１／０．９になるようクロロホルム／水（１／１）を加えることによって分離された。クロロホルム相は分離され、溶媒は真空蒸発され、生成物はシクロヘキサンからの凍結乾燥によって乾燥された。精製された生成物は、上記の２つの系において薄層クロマトグラフィー上に単一のスポットを与えた。例３１−Ｏ−オクタデシル，２−Ｏ−ベンジル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホナート（Ｃ−バチルＰＦＡ）の合成テトラヒドロフラン中の１−Ｏ−オクタデシル，２−Ｏ−ベンジル−ｓｎ−グリセロール（ＯＢＧ）（Bachem Bioscience、Philadelphia、Pennsylvania）（０．６８ｇ）が、温度０℃に保たれながらトリエチルアミン（５ｍｌ）中のホスゲン（１．５ｅｇ）の溶液に１．５時間の間加えられた。この添加が完了した後、反応混合物は０℃で４時間攪拌された。この時間の最後に、亜リン酸トリメチル（４当量）が０℃で加えられ、反応混合物は一晩徐々に室温へと温められた。中間体のビス（メトキシ）ホスホナートは脱メチル化され、粗生成物はクロマトグラフィーによって精製されて４０％の収率で表題に示した化合物を与えた。例４１−Ｏ−オクタデシル，２−Ｏ−ベンジル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホ酢酸（Ｃ−バチルＰＡＡ）の合成テトラヒドロフラン中のＯＢＧアルコール（０．６８ｇ）の溶液が、１時間の間冷却された（−５０℃から−５５℃）（ジクロロホスフィニル）アセチルクロリド（０．６ｇ）溶液に加えられ、混合物は−３０℃で１時間攪拌されてから０ ℃まで徐々に温められた。溶媒は蒸発され、残留物はメタノール（５ｍｌ）で処理され、混合物は室温で４時間攪拌された。その時間の最後に溶媒は減圧下で除かれ、固体はろ過されてから冷メタノールで洗浄されて５０％の収率で必要な生成物が得られた。例５バチル−ホスホノホルマートの合成０．９ｇのラセミバチルアルコール（１−Ｏ−オクタデシル−２，３−グリセロール）（Sigma Chemical、St．Louis、MO）、２．６ｇのトリイソプロピルベンゼンスルホニルクロリド（ＴＰＳ）（Aldrich、Milwaukee、WI）および０．１６ｇのホスホノホルマート（酸の形態）が、室温、窒素下で１５ｍｌの乾燥ピリジン中で反応させられた。反応は例３と同様に、薄層クロマトグラフィーによって半時間ごとにモニタされ、約２４時間で完了したと判断された。反応は、１０ｍｌのクロロホルム／メタノール／水（体積比１／２／０．８）を加えることによって停止された。有機相（下相）は、２ｍｌのクロロホルムおよび２ｍｌの水をさらに加えることによって分離された。有機相は取除かれて真空下で蒸発され、生成物は白い粉として得られた。粗生成物は少量のクロロホルム／メタノール（体積比１／１）に溶かされ、クロロホルム／メタノール／濃アンモニア／水（７０／３０／１／１）で展開される０．５ｍｍ層のシリカゲルＧプレート（Analtech、 Newark、DE）を用いて分取薄層クロマトグラフィーに供された。２つのＰＦＡ含有スポットが視覚化され、削られて、先に例３で説明したようにクロロホルム／メタノール／水で抽出された。２つの化合物は、それぞれバチル−ＰＦＡのトップおよびボトムと呼ばれる。例６ホスファチジル−ＰＦＡを用いたリポソーム生成滅菌した２．０ｍｌの音波処理容器に、７．５μモルのジオレオイルポスファチジルコリン、４．５μモルのコレステロール、および３μモルのｐＰＦＡが加えられた。溶媒は真空下で取除かれ、脂質混合物の薄膜が形成された。脂質の膜は、等張デキストロースを含んだ１０ｍＭ酢酸ナトリウム滅菌緩衝溶液（ｐＨ５．０）０．３ｍｌで水和された。混合物は１０分間断続的に渦巻き攪拌され、次に９０分から１２０分の間、出力コントロールセッティング＃９において熱システム超音波音波処理器（Heat Systems Ultrasonics sonicator）（モデル４３１Ｂ）のカップホーンを用いた音波処理を行ない、その処理の結果試料は清澄になった。この試料は、滅菌したＲＰＭＩ組織培養培地で希釈され、示された濃度でＨＩＶ実験に用いられた。例７ＨＴ４−６Ｃ細胞における抗−ＨＩＶ活性の証明ＨＴ４−６Ｃ細胞は、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンＧ、１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミンおよび１０％ウシ胎児血清（Hyclone La boratories、Logan、UT）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養された。細胞は、薬剤のないコントロールにおいて１つのウェルにつき１００〜３００のプラークを与えるのに十分な感染の増殖度でＨＩＶ−１（ＬＡＶ−１株、L．Montagnier 、Paris、France）に感染された。ウイルスは、３７℃で１時間吸着させられた。２つのバチル−ＰＦＡを含むリポソームが、例３で説明されているように調製された。超音波処理調製物が、滅菌ＲＰＭＩ緩衝溶液で希釈され、示された濃度で組織培養ウェルに加えられた。３７℃で３日間のインキュベーション後、細胞単層は１０％のホルムアルデヒドで固定され、０．２５％のクリスタルバイオレットで染色されてプラークが視覚化された。染色工程により、多核巨大細胞の個々の密集点が明らかとなり、これらは抗レトロウイルスの薬剤活性を評価するのに数えられ用いられた。実験結果は図１において示されている。バチル−ＰＦＡの両法（トップスポットおよびボトムスポット）の調製物が、この実験において活性であった。５０％の阻害（Ｉ．Ｃ．₅₀）を作るのに必要な薬剤の量は図から次に示すように見積もることができる。すなわち、ＰＦＡ２００ｕＭ、バチル−ＰＦＡ（トップ）１１０ｕＭおよびバチル−ＰＦＡ（ボトム）１８０ｕＭ。例８ホスホノホルマートおよびホスホノアセタートの脂質プロドラッグによるヒトサイトメガロウイルス−特異的ＤＮＡの阻害アッセイ法：ＭＣＲ−５細胞（ヒト肺繊維芽細胞）（２４ウェルプレートの１つのウェルにつき約５×１０⁴の細胞）が、薬剤を加える前に１日ないし２日間１０％ウシ胎児血清を伴ったＤＭＥ培地でプレート培養される。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の薬剤が、１％の最終ＤＭＳＯ濃度で培地に加えられた。化合物が容易に水またはＤＭＳＯに溶解することができないいくつかの場合、リポソームは、１０モル％薬剤／５０モル％ジオレオイルホスファチジルコリン／３０モル％コレステロールおよび１０モル％ジオレオイルホスファチジルグリセロールを含む音波処理によって調製された。コントロールリポソームはまた、薬剤を加えることなく調製され、コントロールとして調和した脂質濃度においてインキュベートされた。この培地はそれから吸引され、２％ＦＢＳ培地で作られる薬剤希釈物に変えられ、２４時間インキュベートされる。薬剤を含む培地は滅菌チューブに移され、ＡＤ−１６９ヒトＣＭＶウイルスプールの１：５０希釈物（約２０，０００ＰＦＵ）が１つのウェルにつき０．２ｍｌで各ウェルに加えられて３７℃で６０分間インキュベートされる。接種物はＤＭＥプラス２％ＦＢＳ培地中で作られる。インキュベーション後、接種物はウェルから吸引され、薬剤希釈物が再び加えられる。細胞は５日ないし６日間インキュベートされるが、そのとき５０〜１００％の細胞変性効果を示す。５日ないし６日のインキュベーション期間の最後に、存在するＣＭＶＤＮＡの定量が、診断用ハイブリッド（Diagnostic Hybrids）（Athens、OH）からのＣＭＶ抗ウイルス感受率試験キットを用いて核酸ハイブリッド形成により行なわれる。各々のウェルからの培地は完全に吸引され、２滴の溶菌溶液（ＤＮＡウイッキング（wicking）剤）がそれぞれのウエルに加えられる。約５秒後にハイブリウィックス（Hybriwix）フィルタ対が順番にウェルに置かれ、溶液は３０分間あるいはウェルが乾くまでフィルタ上で吸収される。ピンセットを用いて、Hybriw ixは取除かれてペーパータオル上に置かれる。Hybriwixの各々の対は、フィルタの分割ブリッジから垂直に切られる。Hybriwixは、バイアル当たり３つのネガティブコントロールHybriwixおよび２つのポジティブコントロールHybriwixとともにＩ¹²⁵ラベルされたＣＭＶプローブハイブリッド形成剤（Probe Hybridization Agent）（バイアルにつき最大２４のHybriwix）を含むバイアルに移される。バイアルは最小２時間から一晩の間６０℃の穏やかに振とうされる水浴中に置かれる。ハイブリッド形成後、溶液はバイアルから吸引され、放射性廃棄物容器の中に集められる。４ｍｌの蒸留水が洗浄のためにそれぞれのバイアルに加えられ、キャップされ、渦巻き攪拌されてから吸引される。６ｍｌの洗浄剤（Wash R eagent）が洗浄容器（Wash Container）に加えられ、Hybriwixはこれに移されて穏やかに渦巻き攪拌される。７３℃に予熱された１１４ｍｌの蒸留水が洗浄容器に加えられ、これは７３℃の水浴中に３０分間置かれる。洗浄溶液はそれから放射性廃棄物容器に取除かれ、Hybriwixはペーパータオル上に順番に置かれ、次いでガンマ計数チューブに移されて２分間計数される。結果：ブランク値の引算後、結果は薬剤のないコントロールの百分率として示される。ＣＭＶ−ＤＮＡ生産の濃度依存性がプロットされ、５０％（ＩＣ₅₀）までのコントロールレベルに低減するのに必要なそれぞれの薬剤の量が決定され、その結果は次に挙げる表に示されている。例９インビトロでのｍｒｃ−５ヒト肺繊維芽細胞によるｈｃｍｖ−特異的ＤＮＡ生産におけるホスホノホルマート、ホスホノアセタートおよびさまざまな脂質類似体の効果化合物ＩＣ₅₀ ＰＦＡ５５；６０ＤＭＧ−ＰＦＡ１７８；１１２バチル，ベンジル−ＰＦＡ１．７^* ；＜３．１６^* ＰＡＡ３１；２６ＤＭＧ−ＰＡＡ１９；５ＤＭＰ−ＰＡＡ４９；４０リポソームコントロール１２５^* ^*リポソーム製剤すべての他のデータは、１％ＤＭＳＯ中に直接溶解した化合物を用いてダルベッコ改変イーグル培地において得られたものである。略語ＰＦＡ：ホスホノ蟻酸ＰＡＡ：ホスホノ酢酸ＤＭＧ−ＰＦＡ−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ蟻酸バチル，ベンジル−ＰＦＡ：１−Ｏ−オクタデシル，２−ベンジル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ蟻酸ＤＭＧ−ＰＡＡ：１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酢酸ＤＭＰ−ＰＡＡ：１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ホスホノ酢酸先の表で証明されたように、ＰＦＡおよびＰＡＡのすべての脂質類似体は、細胞単層の視覚検査によって決定されたとき明白な毒性なしでＣＭＶ−特異的ＤＮＡ生産を低減する活性を示した。リポソームコントロールは、非常に高い脂質用量においてＣＭＶ−特異的ＤＮＡ生産を低減したが、リポソームのバチル、ベンジル−ＰＦＡの活性は、脂質薬剤なしで、合わされたリポソームコントロールよりも７４倍活性であった。以上のことから、他のホスホノ酸化合物およびそれらの脂質誘導体を、例３および例５において同様の結果を得るため置き換えることができるということが明らかである。たとえばヌクレオシド類似体ホスフェートのような他の抗ウイルス剤はまた、リポソームの水溶性コンパートメント中に含まれてよい（７）。たとえばヌクレオシド類似体ホスフェートのような脂質抗ウイルス剤のモル分率はまた、リポソームの水溶性コンパートメント中に含まれてよい（７）。脂質抗ウイルス剤のモル百分率は、全脂質混合物の０．１％から１００％まで変化してよい。さらに、抗ウイルスヌクレオシド脂質の混合物が、ウイルス性疾患の療法に対するリポソームの構成において用いられてよい（６）。本発明がある特定の抗ウイルスホスホノ酸の使用に限定されるものではなく、むしろ、本発明の有益な結果は、これらの物質の脂質誘導体の合成およびウイルス性疾患の治療に対する製剤のためのリポソームの使用から生じることをさらに強調すべきである。したかって、特定の抗ウイルスホスホノ酸が目下知られているか、あるいは将来知られるようになるかにかかわらず、目下意図されている脂質誘導体をそこから形成する方法は、当業者に明らかであるような確立した化学技術に基づいており、しかもリポソームへのそれらの組込みは先行する開示によって広範囲に可能である。本合成は本発明の実施における使用に対して本質的にすべてのホスホノ酸からの化合物の生成に広く適用可能である、ということを再び強調する。したがって、本発明はその意図するところおよび本質的な特性から外れることなしに他の具体的な形において実施されてよい。記述された実施例は、すべての点で単なる例示としてかつ限定的でないものとして考えられるベきであり、それゆえ本発明の範囲は前述よりもむしろ添付の請求の範囲によって示される。請求の範囲の法律上有効である均等な意味および範囲内で起こるすべての変更は、それらの範囲に包含されなければならない。参考文献

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９３年８月３１日【補正内容】ロール、１−アシル，２−Ｏ−アルキル−グリセロール、および１−Ｏ−アルキル，２−アシル−グリセロールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の化合物。９．１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項４記載の化合物。１０．１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項９記載の化合物。１１．１−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項９記載の化合物。１２．１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項５記載の化合物。１３．１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１２記載の化合物。１４．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１２記載の化合物。１５．１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項６記載の化合物。１６．１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１５記載の化合物。１７．１−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−オキノカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１５記載の化合物。１８．１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項７記載の化合物。１９．１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であるこどを特徴とする、請求項１８記載の化合物。２０．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１８記載の化合物。２１．前記脂質がリン脂質であることを特徴とする、請求項１記載の化合物。２２．次に示す式のホスホノ酸の脂質の多い誘導体。（Ｌ）_m−（Ｖ）_n−Ｗ−ＴＯ）−Ｏ−（ｐ＝０または１）であり、Ｖはホスフェートであり、ｎ＝０〜２であり、Ｌはリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、セラミドまたはグリセロ脂質からなる群から選択される脂質成分であり、ｍ＝１〜３であり、各々のＬはホスポエステル結合におけるＶ基に直接結合しており、Ｔはホスホナート結合を介してＷに結合している。２３．請求項１〜７または２２の化合物のいずれか１つからの部分を形成するリポソーム。２４．哺乳動物におけるウイルス感染を治療するための方法であって、有効な量の請求項１記載の化合物を前記哺乳動物に投与することを含む、方法。２５．前記哺乳動物がヒトであり、前記レトロウイルスかヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。２６．さらに、有効な量の３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）を前記哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする、請求項２５記載の方法。２７．前記方法が、請求項１〜７または２２のいずれか１つの化合物と組合せた前記類似体を投与することによって、ＡＺＴまたは他のヌクレオシド類似体への耐性を避けるかまたは克服することを含むことを特徴とする、哺乳動物におけるＨＩＶ感染を治療するための方法。２８．以下に示す（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のステップを含むことを特徴とする、哺乳動物におけるウイルスの感染の治療で使用するためのリポソーム懸濁物を調製する方法。（ａ）リン脂質、グリセロ脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、セラミドまたは脂肪酸からなる群から選択される脂質と結合するホスホノ酢酸またはホスホノ蟻酸を含む両親媒性の抗ウイルス剤を供給するステップ、（ｂ）前記両親媒性抗ウイルス剤と薬理学的に許容される水溶性溶媒とを合わせて混合物を形成するステップ、および（ｃ）前記親油性抗ウイルス剤からリポソームを形成するステップ。

Claims

【特許請求の範囲】１．リン脂質、グリセロ脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、またはセラミドからなる群から選択される脂質に結合するホスホノ酸を含む、抗ウイルス活性を示す化合物。２．前記ホスホノ酸がリン酸エステル結合を介して、前記脂質の利用できる水酸基に結合することを特徴とする、請求項１記載の化合物。３．前記ホスホノ酸がカルボキシエステル結合を介して、前記脂質の利用できる水酸基に結合することを特徴とする、請求項１記載の化合物。４．次に示す構造を有することを特徴とする、請求項２記載の化合物。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ₁は、エーテル結合またはビニルエーテル結合を介してグリセロール水酸基に結合する、０〜６個の二重結合を有するＣ_2-24脂肪族基である。５．次に示す構造を有することを特徴とする、請求項２記載の化合物。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ₁およびＲ₂は、アシルエステル結合を介してグリセロール水酸基に結合する、０〜６個の二重結合を有するＣ_2-24脂肪族基である。６．次に示す構造を有することを特徴とする、請求項３記載の化合物。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ₁は、０〜６個の二重結合を有するＣ_2-24脂肪族基で、エーテル結合またはビニルエーテル結合を介してグリセロール水酸基に結合する。７．次に示す構造を有することを特徴とする、請求項３記載の化合物。式中、ｎ＝０または１であり、Ｒ₁およびＲ₂は、０〜６個の二重結合を有するＣ_2-24 脂肪族基で、かつＲ₁およびＲ₂は、各々アシルエステル結合を介してグリセロール水酸基に結合する。８．前記脂質がモノアシルグリセロール、モノアルキルグリセロール、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、１−アシル，２−Ｏ−アルキル−グリセロール、および１−Ｏ−アルキル，２−アシル−グリセロールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１記載の化合物。９．１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項４記載の化合物。１０．１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項９記載の化合物。１１．１−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項９記載の化合物。１２．１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項５記載の化合物。１３．１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１２記載の化合物。１４．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１２記載の化合物。１５．１−Ｏ−アルキル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項６記載の化合物。１６．１−Ｏ−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１５記載の化合物。１７．１−Ｏ−オクタデシル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１５記載の化合物。１８．１，２−ジアシル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項７記載の化合物。１９．１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１８記載の化合物。２０．１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−オキシカルボニルホスホノ酸であることを特徴とする、請求項１８記載の化合物。２１．前記脂質がリン脂質であることを特徴とする、請求項１記載の化合物。２２．次に示す式のホスホノ酸の脂質の多い誘導体。（Ｌ）_m−（Ｖ）_n−Ｗ−ＴＯ）−Ｏ−（ｐ＝０または１）であり、Ｖはホスフェートであり、ｎ＝０〜２であり、Ｌはリン脂質、スフィンゴ脂質、糖脂質、セラミドまたはグリセロ脂質からなる群から選択される脂質成分であり、ｍ＝１〜３であり、各々のＬはホスホエステル結合におけるＶ基に直接結合しており、Ｔはホスホナート結合を介してＷに結合している。２３．請求項１〜７および２２の化合物のいずれか１つからの部分を形成するリポソーム。２４．哺乳動物におけるウイルス感染を治療するための方法であって、有効な量の請求項１記載の化合物を前記哺乳動物に投与することを含む、方法。２５．前記哺乳動物がヒトであり、前記レトロウイルスがヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）であることを特徴とする、請求項２４記載の方法。２６．さらに、有効な量の３′−アジド−３′−デオキシチミジン（ＡＺＴ）を前記哺乳動物に投与するステップを含むことを特徴とする、請求項２５記載の方法。２７．前記方法が、請求項１〜７および２２のいずれか１つの化合物と組合せた前記類似体を投与することによって、ＡＺＴまたは他のヌクレオシド類似体への耐性を避けるかまたは克服することを含むことを特徴とする、哺乳動物におけるＨＩＶ感染を治療するための方法。２８．以下に示す（ａ）、（ｂ）および（ｃ）のステップを含むことを特徴とする、哺乳動物におけるウイルスの感染の治療で使用するためのリポソーム懸濁物を調製する方法。（ａ）リン脂質、グリセロ脂質、糖脂質、スフィンゴ脂質、セラミドまたは脂肪酸からなる群から選択される脂質と結合するホスホノ酢酸またはホスホノ蟻酸を含む両親媒性の抗ウイルス剤を供給するステップ、（ｂ）前記両親媒性抗ウイルス剤と薬理学的に許容される水溶性溶媒とを合わせて混合物を形成するステップ、および（ｃ）前記親油性抗ウイルス剤からリポソームを形成するステップ。