PT674646E - Derivados lipidicos de fosfonoacidos destinados a ser incorporados nos lipossomas e processo de utilizacao - Google Patents

Description

I

DESCRICÃO

DERIVADOS LIPÍDICOS DE FOSFONOÁCIDOS DESTINADOS A SER INCORPORADOS NOS LIPOSSOMAS E PROCESSO DE UTILIZAÇÃO

ENQUADRAMENTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se, de uma maneira geral, ao tratamento de infecções virais através do uso de derivados lipídicos de compostos antivirais, Mais particularmente, a presente invenção refere-se a derivados lipídicos de fosfonoácidos antivirais e à sua utilização. Os compostos derivados de lípidos podem ser integrados na estrutura dos lipossomas formando, deste modo, um complexo de lipossomas mais estável, que pode libertar maiores quantidades destes compostos para as células alvo com menos toxicidade.

As publicações e outros materiais de referência aqui mencionados são, desta forma, incorporados a título de referência e listados por conveniência na bibliografia em anexo no final da presente memória descritiva

Tem havido um grande interesse nos últimos anos relativamente ao desenvolvimento de agentes para tratar infecções virais. No passado, as doenças virais mais significativas eram as causadas pelos vírus dos grupos de vírus do herpes e da gripe, bem como dos vírus que causam a hepatite. Na última década, as infecções causadas pelo retrovírus da imunodeficiência humana (HTV) tomaram-se um problema de saúde pública da maior importância. Os agentes antivirais eficazes são aqueles que interferem com a replicação ou com a transcrição da informação genética virai, ao mesmo tempo que não inibem as funções normais da célula hospedeira. O ácido fosfonoacético (PAA) e o ácido fosfonofórmico (PFA ou Foscamet), que têm as seguintes estruturas: 2 2

HOOCCH,-P-OH HOOC-P-OH 2 I I OH OH (PAA) (PFA)

revelaram ter uma boa actividade antiviral contra o vírus do herpes simplex tipos 1 e 2 (1), bem como contra o vírus da gripe, o vírus da hepatite B e as infecções provocadas pelos retrovírus (2). O síndroma da imunodefíciência adquirida (SIDA) é causado pelo vírus da imunodeficiência humana (HTV). O HIV é um retrovírus que infecta as células que contêm o antigene superficial CD4 (T4), tal como os linfócitos auxiliares CD4+, os monócitos CD4+ e os macrófagos e certos outros tipos de células CD4+. A infecção provocada pelo HIV dos linfócitos CD4+ resulta na citólise e na morte das células, o que contribui para a imunodefíciência da SIDA; contudo, os monócitos CD4+ e os macrófagos podem não ser grandemente danificados pelo vírus. A replicação virai nestas células parece ser mais prolongada e menos citotóxica do que nos linfócitos e, como resultado, os monócitos e os macrófagos representam reservatórios importantes de infecções pelo HTV. Descobriu-se recentemente que os macrófagos podem servir como reservatórios da infecção do HTV mesmo em certos doentes com SIDA, cujos testes se revelaram negativos relativamente à presença de anticorpos de HTV. Não existe cura eficaz para a SIDA, embora alguns análogos de nucleósidos, em particular os didesoxinucleósidos tenham mostrado prolongar a vida e reduzir a incidência de certas infecções fatais associadas com a SIDA.

Os análogos de didesoxinucleósidos são os agentes mais potentes actualmente conhecidos para o tratamento da SIDA, mas estas terapias não são inteiramente satisfatórias. Num ensaio clínico humano recente usando AZT, notou-se uma grave toxicidade, evidenciada por anemia (24 %) e granulocitopenia (16 %) (3,4). Certos macrófagos derivados de monóticos, quando infectados com algumas estirpes de HTV, têm-se revelado resistentes ao tratamento com didesoxicitidina, azidotimidina e outros didesoxinucleósidos in vitro, tal como é mostrado por Richman, et al. (5). A resistência pode ser devida em parte aos baixos níveis de didesoxinucleósido quinase que resulta numa capacidade reduzida para fosforilar o AZT, ddC ou ddA. O fosfonoformato (PFA) pode proporcionar uma terapia alternativa eficaz para fos análogos de nucleósidos. O PFA inibe uma larga gama de polimerases de ADN bem como a polimerase do RNA do vírus da gripe. O PFA inibe também a transcriptase inversa (Π) do HIV e outros retrovírus em concentrações inferiores a 1 μΜ. Uma vez que as polimerases de ADN são muito menos sensíveis ao PFA do que as transcriptases inversas, existe a possibilidade de este fármaco poder ter uma boa racio terapêutica para ser usado nas infecções provocadas pelo HTV. Os PFA e os PAA de fosfonoácidos podem também suplementar a terapia usando nucleósidos antivirais. Lambert (6) descobriu que, quando o PFA ou o PAA são acolados com certos nucleósidos antivirais, em particular a 5-bromo-2’-desoxiuridina (BUdR), a actividade antiviral do nucleósido acoplado contra o vírus do herpes simplex é superior à do nucleósido parente. Têm sido realizados esforços para aumentar a eficácia de ambos os análogos de nucleósidos antivirais e dos fosfonoácidos, esforços esses que incluem a associação destes agentes com Iípidos. Têm sido feitas tentativas no sentido de aumentar a eficácia terapêutica dos análogos de nucleósidos, tais como a arabinofuranosilcitosina (ara-C) e a arabinofuranosiladenina (ara-A) como agentes quimioterapêuticos no tratamento de vários tipos de cancro, ligando-os quimicamente a fosfolípidos, a fim de aumentar a sua estabilidade catabólica (7). Estes agentes derivados de fosfolípidos revelaram uma menor toxicidade e uma maior estabilidade relativamente aos análogos de nucleósidos sozinhos. Contudo, exibiram também uma fraca absorção celular (6) e uma fraca absorção dos fármacos (8).

Uma outra tentativa para aumentar a eficácia dos agentes antivirais compreende a encapsulação dentro dos lipossomas para facilitar a sua distribuiçãoção nas células. Os lipossomas são vesículas lipídicas que podem ser formadas de acordo com o método de Alex Bangham. Bangham e colaboradores descobriram em 1965 que películas secas de fosfatidilcolina formavam espontaneamente com a hidratação (9) vesículas de folhas bimoleculares fechadas. Uma das aplicações mais eficazes dos lipossomas na medicina é como agente veicular, para distribuir agentes terapêuticos aos órgãos alvo. Os agentes são encapsulados durante o processo de formação dos lipossomas e libertados in vivo depois de os lipossomas terem sido absorvidos pelas células. Os lipossomas proporcionam, deste modo, um meio para distribuírem maiores concentrações de ϊ

4 agentes terapêuticos a órgãos alvo. Além disso, uma vez que a distribuição lipossomal foca a terapia no sítio da absorção dos lipossomas, reduz os efeitos secundários tóxicos. A incorporação lipossomal revelou proporcionar uma forma mais eficaz de distribuir compostos antiparasíticos, o que não apenas aumenta a potência da dose mas também prolonga a sua eficácia e diminui a sua toxicidade. Por exemplo, os fármacos lipossomais antimonais são várias centenas de vezes mais eficazes do que o fármaco livre no tratamento da leishmaniase tal como é revelado independentemente por Black and Watson (10) e Alving, et al. (11). A anfotericina B envolvida pelos lipossomas parece ser mais eficaz do que o fármaco livre no tratamento de doentes imunodeficientes com doenças de fungos sistémicas (12). Outros usos para a encapsulação dos lipossomas incluem a restrição da toxicidade da doxorubicina (13) e a diminuição da toxicidade de aminoglicosidos (14).

Descobriu-se que o PFA inibe a replicação do HEV-1 em vários sistemas in vitro em concentrações que podem ser conseguidas nos doentes. Contudo, o baixo grau em que o PFA entra nas células faz com que sejam requeridos níveis muito mais elevados do que aqueles que se verifica serem eficazes em sistemas livres de células com a Ή do HTV (15). De igual modo, o PFA tem efeitos secundários tóxicos e é conhecido por se acumular nos ossos devido à sua semelhança com o pirofosfato. O ácido fosfonoacético (PAA), que possui uma actividade antiviral semelhante à do PFA, parece ter uma afinidade para os ossos que pode impedir o seu uso nos seres humanos (6). Têm sido levadas a cabo tentativas para aumentar a eficácia intracelular antiviral dos fosfonoácidos, encapsulando-os em lipossomas. Szoka, F. and Chu, C. (16) descobriu que a distribuição lipossomal aumentava a absorção celular e a actividade inibitória virai tanto do PFA como do PAA. O encapsulamento lipossomal diminuía de igual modo o efeito citopátíco do PFA; contudo, o efeito citopático do PAA lipossomal pareceu diminuir em comparação com o fármaco livre.

Tal como se mencionou anteriormente, pensa-se agora que os microfages são um reservatório importante de infecção do HIV (17, 18). Os macrófagos são também um sítio primeiro de absorção dos lipossomas (19, 20). Deste modo, seria desejável utilizar lipossomas para aumentar a eficácia dos fosfonoácidos antiviarais e dos ésteres de fosfonoácidos antivirais de nucleósidos antivirais no tratamento da SIDA e de outras 5

infecções virais. Claramente, seria útil ter vias mais eficazes de distribuir grandés quantidades de compostos de fosfonoformato antiviral efectivos a macrófa^os infectados com o vírus do HIV ou com outros vírus ο α outras células com infecções virais.

Os pedidos co-pendentes, U. S. Séries n°s 216,412 e 319,485 (21,22) revelam derivados lipídicos de análogos de nucieósidos que são capazes de ser incorporados na estrutura dos lipossomas, de forma a melhorar mais a terapia que compreende a distribuição lipossomal destes agentes. A fim de usar os fosfonoácidos antivirais de forma mais eficaz, é desejável sintetizar pro-fármacos lipídicos dos agentes. É, por isso, um objecto da presente invenção proporcionar métodos para a produção de derivados lipídicos de fosfonoácidos que possam ser incorporados na forma lipossomal estável. A WO-A-91/18914 (33) descreve, de uma forma genérica, o ácido fosfonoacético e o ácido fosfonofórmico ligados a fosfolípidos com um fosfato posicionado na posição 3 de uma agrupamento de glicerol, em que a ligação é entre o grupo fosfato do fosfolípido e o grupo fosfato do fosfonoácido. São especificamente descritos (página 22, linhas 35--37 e Exemplo 4) os compostos l,2-dilauroilglicero-3-fosfato-(piro)-fosfono formato e o l,2-dimiristoilglicero-3-fosfato-(piro)-fosfono formato. Contudo, a descrição limita-se a um processo de produção apenas, não sendo indicada a actividade antiviral, a não ser que se encontre também presente um agrupamento análogo de um nucleósido. A patente US-A-4052439 (34) descreve, de uma maneira geral, ésteres de carboxi alquilo em C3-C8, aralquilo e adamantilo do ácido fosfonoacético. Descreve-se também, de uma maneira geral, carboxi ésteres de glicerolípidos formados na posição 2-glicerol ou β-glícerol com ácido fosfono acético. O carboxi éster glícerolipídico específico descrito é o fosfono acetato de l,3-dipalmitoxi-2-propilo (coluna 3, linha 10). A US-A--4150125 (35), publicada depois da US-A-4052439, descreve a actividade contra o vírus do herpes em triglicéridos que contêm, na posição β, o agrupamento aniónico do ácido fosfonoacético. Nenhum dos documentos sugere que outras posições do glicerol teriam qualquer tipo de mérito que fosse. A presente invenção é também definida nas reivindicações anexas. A presente invenção aplica-se não apenas ao uso de derivados lipídicos de fosfonoácidos no tratamento da SIDA e de outros doenças retrovirais, mas também ao seu uso no tratamento de doenças causadas por outros vírus, tais como o vírus da gripe, o vírus do herpes simplex (HSV), o vírus do herpes humano 6, o citomegalovírus (CMV), o vírus da hepatite B, o vírus de Epstein-Barr (EBV) e o vírus da varicela zoster (VZV).

BREVE PESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 demonstra o efeito de uma composição da presente invenção na formação de placas em células infectadas com o HTV.

RESUMO PA INVENÇÃO A presente invenção proporciona compostos e composições que têm propriedades antivirais, que compreendem um fosfonoácido antiviral que tem ligado ao mesmo um agrupamento lipídico. De acordo com uma forma de realização preferida, o fosfonoácido é ácido fosfonofórmico e, de acordo uma com outra forma de realização, o fosfonoácido é ácido fosfonoacético. O fosfonoácido pode estar ligado ao grupo lipídico através, ou de um éster de fosfato ou de uma ligação de carboxi éster. A presente invenção inclui também fosfonoácidos ligados a lípidos através de grupos de difosfato.

De acordo com uma forma de realização da invenção, o agrupamento lipídico ligado ao fosfonoácido é um diacil glicerol ou um dialquil glicerol ou um l-acil-2-O-alquil glicerol, ou um l-O-alquil-2-acil glicerol; de acordo com outras formas de realização, o agrupamento lipídico é um monoacil glicerol ou um monoalquil glicerol ou um ácido gordo, um fosfolípido ou um agrupamento lipídico mais complexo, tal como, por exemplo, uma esfingosina, uma ceramida, uma cardiolipina ou um bis(diacilglicero) fosfato. O agrupamento lipídico pode compreender de 1 a 4 grupos alifáticos de cadeia longa, compreendendo cada um de 2 a 24 átomos de carbono, que podem ser não--saturados, contendo de 1 a 6 ligações duplas. Os grupos alifáticos de glicerois podem estar ligados à unidade constituinte de glicerol, por meio de ligações de éster, éter ou éter de vinilo. Os grupos alifáticos dos lípidos que têm mais do que um desses grupds,

I podem ter estruturas iguais dou diferentes.

Os derivados lipídicos de fosfonoácidos preferidos são o ácido l-0-alquil-5«-glicero-3--fosfónico. Os ácidos l-0-hexadecil-í»-glicero-3-oxicarbonil-fosfónicos são particularmente preferidos. Outras formas de realização preferidas são os ácidos 1-O-alquil-sn--glicero-3-oxicarbonil-fosfónicos.

De acordo com outro aspecto da invenção, proporcionam-se derivados ricos em lípidos de fosfonoácidos da fórmula geral (VI) e incluindo fosfonoácidos de bisdiacil glicerol fosfato e derivados de difosfatidil glicerol de fosfonoácidos. A invenção compreende ainda lipossomas formados, pelo menos em parte, a partir de qualquer dos compostos da invenção.

Um outro aspecto da presente invenção consiste num método para a preparação de uma suspensão de lipossomas para ser usada no tratamento de infecções virais em mamíferos, que compreende o fornecimento de um agente lipofílico antiviral seleccionado do grupo que consiste num fosfonoácido ligado a um agrupamento lipídico; a combinação do agente lipofílico antiviral e de um dissolvente aquoso farmacologicamente aceitável para formar uma mistura; e a formação de lipossomas a partir do agente lipofílico antiviral. A invenção proporciona assim métodos para o tratamento de infecções virais num mamífero, que compreende a administração de uma quantidade efectiva de qualquer uma das composições da invenção. De acordo com uma forma de realização preferida, o mamífero é um ser humano, e o vírus é o retrovírus do HtV. De acordo com formas de realização particularmente preferidas, é usado um composto da invenção em combinação com a administração de AZT ou outros análogos antiretrovirais. Os métodos podem incluir o processo de prevenir ou de ultrapassar a resistência ao AZT ou a outros análogos antivirais através da administração dos análogos na forma de um dos compostos da invenção. A natureza lipofílica destes compostos proporciona vantagens em relação ao uso dos fosfonoácidos sozinhos, prolongando a sua persistência in vivo a seguir à administração. 8

Os fosfonoácidos lipídicos podem também ser incorporados na estrutura lamelar dos lipossomas, quando combinados com moléculas lipofílicas semelhantes. Na forma de lipossomas, estas moléculas antivirais são de preferência absorvidas por macrófagos e monócitos, células que se descobriu albergarem o vírus da imimodefíciência humana (HIY) alvo. Pode ser incorporada uma especificidade adicional do sítio nos lipossomas através da inclusão de ligandos, tais como anticorpos monoclonais ou outros péptidos ou proteínas que se liguem às proteínas virais. Descobriu-se que estes profármacos impedem a replicação virai nas infecções de HTV, que se tenham tomado resistentes à terapia com as formas convencionais dos agentes antiretrovirais.

DESCRICÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A invenção proporciona derivados lipídicos sintetizados de fosfonoácidos que podem ser incorporados na bicamada lipídica dos lipossomas. Estes derivados são convertidos em fosfonoácidos antivirais por processos metabólicos constituintes e, deste modo possuem efeitos antivirais in vivo e in vitro. O fosfonoácido tem a estrutura geral o

II H0-p-o (CH2)n—C(O) 0‘ [13 o*

De acordo com formas de realização preferidas da invenção, n é 0 a 1, e o fosfonoácido é ácido fosfonofórmico ou ácido fosfonoacético.

Derivados Lipídicos da Invenção:

As composições que serão mais efectivas terão uma porção lipídica suficiente para ser capaz de incorporar o material, de uma forma estável, numa bicamada de lipossomas, membrana de células, bicamada lipídica ou outra ordem macromolecular. Os grupos lipídicos ligados aos fosfonoácidos podem, por exemplo, ser glicolípidos, esfingolípidos, fosfolípidos, glicerolípidos ou ácidos gordos. O fosfonoácido pode estar convenientemente ligado a um grupo hidroxilo disponível de um lípido ou através de uma ligação carboxi éster ou através de uma ligação fosfoéster.

Alguns derivados lipídicos preferidos de fosfonoácidos são membros das classes gerais! seguintes:

Fosfonoácidos antivirais de diacil elicerol:

Uma espécie desta classe de compostos lipídicos antivirais tem a estrutura: H,C-0-R. !

HC-O-R, O

I I H2c-O—p_(CH2)n— C(O)—O- [lia] O' em que n é 0 ou 1; um ácido alifático, ou fórmico ou acético, está ligado a P através de uma ligação de fosfonato para formar o fosfonoácido; e Ri e R2 são grupos alifáticos, abaixo definidos.

Uma outra espécie desta classe de compostos são os fosfonoácidos de 1, 2, -diacil-gliceroloxi carbonilo, com a estrutura: H2C—O—R,

I HC-O-R,

l o O I ii ii H2c-O-C-(CHz)n—Py-o [Ilb] 0' em que n = 0 ou 1, e Ri e R2 são grupos alifáticos em C2-C24 tendo de 0 a 6 ligações duplas, e estão ligados ao Cl e C2 de um grupo glicerol através de uma ligação éster.

Derivados de fosfonoácidos de 1-O-alauil glicerol:

Uma espécie desta classe são os derivados lipídicos com a estrutura geral: H,C—O—R.

I

HC—OH I ° I » h2c o P (CH2)n C(O) O' [1IIa] O' em que n é 0 ou 1; um ácido alifático, ou fórmico ou acético, está ligado a P através de uma ligação de fosfonato; e Rj é um grupo alifático, abaixo definido.

Outra espécie desta classe de compostos têm a estrutura:

H2c—o—R1 HC—OH h2c- 0 1 -C-ÍCH2)„-

01 -p—O

[Hlb] em que um fosfonoácido, quer fosfono fórmico (n = 0), quer fosfono acético (n = 1), está ligado ao agrupamento glicerol por meio de uma ligação carboxi éster.

Fosfonoácidos antivirais de ceramida:

Os fosfonoácidos antivirais podem também ser gerados em células depois da distribuição lipossomal dos seus derivados de ceramiada, com a estrutura geral abaixo definida: o

CER O—P—(CH2)n—C(O)- O' em que n é 0 ou 1 e CER é uma N-acil esfíngosina com a estrutura: [V] 11 çh=ch-(ch2)12-ch3

CHOH

I

RC(0)NH-CH

I h2c- em que R é um grupo alifático, tal como se definiu abaixo, ou um derivado de esfingosina lipídico substituído equivalente. Esta classe de compostos é útil na formulação lipossomal na terapia da SIDA e outras doenças virais, uma vez pode actuar sobre as mesmas por esfingomielinase ou fosfodiesterases nas células que dão lugar ao fosfonoácido antiviral. Além do composto acima referido, os fosfonoácidos de difosfato de ceramida podem também ser sintetizados, os quais podem ser degradados por pirofosfatases celulares, para darem um fosfonoácido e fosfato de ceramida.

Derivados Ricos em Lípidos de Fosfonoácidos Antiviiais:

Uma tentativa para atingir uma estabilidade ainda maior dos derivados lipídicos de fosfonoácidos dentro dos lipossomas é através do aumento da interacção lípido-lípido entre a estrutura lípido-fosfonoácido e a bicamada lipídica. Deste modo, de acordo com formas de realização preferidas, podem ser sintetizados derivados lipídicos de fosfonoácidos que tenham até quatro grupos lipofilicos.

Proporcionam-se compostos específicos com a fórmula:

(L)m - (V)n - W - T 0

II em que W e —o—P— ; 1 o' T é (CH2)p-C(0)O-, em que p = 0 ou 1; V é fosfato; N = 0 a 2; L é um agrupamento lipídico; m = 1 a 3; e em que cada L está ligado directamente a V numa ligação fosfoéster e T está ligado a W através de uma ligação fosfonato; tal como se definiu na reivindicação 22. 12 /

De acordo com outra forma de realização, proporcionam-se compostos com a fórmula:^ T T I I ; T ; ou T I 1 1 w w | | 1 r l W 1 <J>n iy* (V » (Ί" [VII] L-V-Lj-V—L l/-v -L,~V-L Ii-V-I* em que W é o V é fosfato; n = 0 ou 1; T é(CH2)p-C(0)-0;péOoul;Léumagrupamentolipídico;Li é (CH2-CHOH-CH2); e em que L e Li estão, cada um deles ligado a V através de uma ligação fosfoéster e T está ligado a W através de uma ligação fosfonato.

Uma classe destes compostos compreende derivados de difosfatidil glicerol, com a estrutura geral: o

II

R, R,

Η H -C-CH [VIII ]

I I R3 em que n é 0 ou 1 e Rm são, dois, três ou quatro grupos alifáticos que são independentemente R tal como se define abaixo, em que os referidos grupos estão em ligações éster de acilo, éter ou éter de vinilo. Nesta classe, os fosfonoácidos estão ligados a um ou ambos os fosfatos por uma ligagão difosfato. Pode haver um ou dois fosfonoácidos ligados a cada molécula. Uma outra classe de derivados de fosfonoácidos com componentes lipídicos aumentados compreende os fosfonoácidos de bis(diacilglicero)fosfato, com a estrutura geral:

13 HC H H H ΟΙ I H R, R2 o <CH2>n-c(°>- o Η Η H -C C—CHH i I r3 r4 / / * / / i •0' f IX] em que π é 0 ou 1 e Ri - R4 são tal como se definiu anteriormente.

Este composto será metabolizado para um fosfonoácido nas células por pirofosfatases endógenas ou outras esterases. Estes dois tipos de compostos podem proporcionar propriedades metabólicas e físicas superiores..

Estruturas Lipídicas:

Os grupos Ri e R2 substituintes de R, bem como 0 R34 para a espécie bis(diacilglicero) podem ser iguais ou diferentes e são grupos alifáticos em C2-C24, que têm de 0 a 6 sítios de insaturação e que têm, de preferência, a estrutura

CH3-(CH2)8-(CH=CH-CH2)b-(CH2)0-Y em que a soma de a e c é de 0 a 22; e b é 0 a 6; e em que Y é 0(0)0", C-θ', C=C-0\ C(0)S-, C-S-, C=C-S-; formando ligações de éster de acilo, éter ou éter de vinilo, respectivamente, entre os grupos alifáticos e 0 agrupamento glicerol.

Estes grupos alifáticos na ligação de éster de acilo compreendem, por isso, os ácidos gordos saturados que aparecem naturalmente, tais como 0 ácido laurico, 0 ácido mirístico, 0 ácido palmítico, o ácido esteárico, 0 ácido araquídico e o ácido lignocérico, e os ácidos gordos não-saturados que aparecem naturalmente, tais como o ácido palmeico, 0 ácido oleico, o ácido linoleico, o ácido linolénico e o ácido araquidónico.

As formas de realização preferidas compreendem um monoéster ou diéster, ou um derivado de 1-éter, 2-acil éster fosfatidílico. De acordo com outras formas de realização, os grupos alifáticos podem scr de cadeia ramificada com o mesmo número de carbonos, 14 e compreendem grupos alcanol ou grupos alcoxi primários ou secundários, grupos ciclopropano e ligações de éter internas.

As ligações glicero-fosfo podem ser racémicas ou ligações de éster sn-1 ou sn-3; em alternativa, o grupo fosfato pode estar ligado na posição 2 do agrupamento glicerol. Pode haver 1 ou 2, (bem como 3 ou 4 para a espécie bis(diacilglicero)) grupos de éster de acilo. ou grupos de éter de alquilo ou de éter de vinilo, conforme for requerido.

Em qualquer das formas de realização acima, L é independentemente seleccionado do grupo que consiste em R;

-C-R 1

ch=ch-(ch2)12-ch3 HCOH

HjjC-R, H-C-Rj,* H2C-

RC(O)NH-CH h2c- ; e HC-R, i CHj)2-M(CH2) + 2 em que R, Ri e R2 são independentemente grupos alifáticos em C2 a C24 em ligação éster, éter ou éter de vinilo. Em qualquer das composições específicas descritas, R, Ri e R2 têm independentemente de 0 a 6 sítios de insaturação e têm a estrutura: CH3-(CH2)a-(CH=CH-CH2)b-(CH2)o-Y em que a soma de a e c é de 0 a 22; e b é 0 a 6; e em que Y é C(0)0-, C-Ο, C=C-0-, C(0)S, C-S ou C=C-S. Síntese de Derivados Lipídicos de Fosfonoácidos:

Esta classe de derivados lipídicos de fosfonoácidos em que o lípido está ligado através de uma ligação de éster de fosfato com 0 fosfato do fosfonoácido, por exemplo, os compostos de fórmula Ha, Hla, IV, V, VI, VH, VHI e IX, podem ser preparados tal como se descreve nos Exemplos 1, 2 e 5. Os diacilglicerofosfono formatos de fórmula Ha, por exemplo, podem ser sintetizados a partir da reacção de um diacilglicerol e ácido fosfonofórmico usando cloreto de triisopropilbenzeno sulfonilo em piridina, tal como se descreveu para a preparação de l,2-dimiristoil-glicero-3-fosfono formato no Exemplo I, ou l,2-dipalmitoil-glicero-3-fosfono formato no Exemplo 2. Os ácidos l-O-alquil-OT?' -glicero-3-fosfónicos, da fórmula geral IHa, ou os ácidos 2-O-alquil-^w-glicero-^--fosfónicos, podem ser preparados dc acordo com o Exemplo 5, num procedimento semelhante.

Os derivados lipídicos dos fosfonoácidos em que o fosfonoácido está ligado ao grupo lipídico através de uma ligação carboxi éster com o grupo carbonilo do fosfonoácido das fórmulas nb e Elb, podem ser preparados de acordo com o método referido nos Exemplos 3 e 4. Os grupos hidroxilo de glicerol não-esterificados tendo grupos de protecção, tais como o benzilo.

Outros análogos, que compreendem l-acil-2-O-alquil glicerois, l-O-alquil-2-acil glicerois, dialquil glicerois, 1-acil glicerois, 2-acil glicerois e 2-O-alquil glicerois podem ser sintetizados através dos mesmos métodos, usando grupos de protecção semelhantes, conforme for necessário. A classe de fosfonoácidos de diacil glicerol fosfato de compostos de fórmula IV pode também ser sintetizada preparando o derivado de morfolidato do fosfonoácido e acoplando-o ao ácido fosfatídico em piridina seca, tal como se descreveu para o diglicerido de difosfato de citidina por AgranofF e Suomi (23). Em alternativa, o morfolidato do ácido fosfatídico pode, da mesma forma, ser acoplado directamente ao fosfonoácido.

Os fosfonoácidos de ceramida de fórmula V podem ser preparados de acordo com um método semelhante ao método para a preparação de digliceridos de difosfato de fosfonoácidos antivirais com alterações apropriadas nos materiais de partida.

Os compostos de fosfonoácidos de bis(diacilglicerol)fosfato de fórmula IX podem ser sintetizados juntando um fosfonomorfolidato ao resíduo do fosfoéster do bis(diacilglicero) fosfato por meio dos métodos de condensação apresentados nos Exemplos.

Outros derivados lipídicos apropriados de fosfonoácidos podem ser sintetizados usando os mesmos métodos e usando lípidos novos apropriados como materiais de partida, É desejável, por exemplo, sintetizar derivados de fosfolípidos de fosfonoácidos antivirais 16 e antiretrovirais que darão lugar a agentes antivirais potentes cora cursos de metabolismo alternados pelas células alvo que absorvem a formulação lipídica.

Preparação dos Linossomas:

Depois da síntese e purificação, o derivado lipídico do fosfonoácido é incorporado em lipossomas ou outro agente veicular apropriado. A incorporação pode ser levada a cabo de acordo com procedimentos de preparação de lipossomas bem conhecidos, tais como tratamento por ultra-sons e extrusão. Os métodos convencionais apropriados de preparação de lipossomas incluem, mas não se limitam, aos descritos por Bangham, et al. (9) Olson, et al. (24), Szoka e Papahadjapoulos (25), Mayhew, et al. (26), Kim, et al. (27) e Mayer, et al. (28).

Os lipossomas podem ser feitos a partir de derivados lipídicos de fosfonoácidos sozinhos ou em combinação com qualquer dos materiais fosfolipidicos de lipossomas sintéticos ou naturais convencionais, incluindo os fosfolípidos de fontes naturais, tais como ovos, plantas ou animais, tais como a fosfatidil colina, a fosfatidil etanolamina, a fosfatidil glicerol, a esfingomielina, a fosfatidil serina ou a fosfatidilinositol. Os fosfolípidos sintéticos que podem também ser usados incluem, mas não se limitam, aos seguintes: a dimiristoilfosfatidil colina, a dioleoilfosfatidil colina, a dipalmitoilfosfatidil colina e a diestearoilfosfatidil colina e as correspondentes fosfatidil etanolaminas e os fosfatidil glicerois sintéticos. Tal como é convencionalmente sabido, podem também ser adicionados outros aditivos, tais como o colesterol ou outros esterois, hemi-succinato de colesterol, glicolípidos, cerebrosidos, ácidos gordos, gangliosidos, esfingolípidos, 1,2--bis(oleoiloxi)-3-(trimetil amónio) propano (DOTAP), cloreto de N-[l-(2,3-dioleoil)-propil]-N,N,N-trimetilamónio (DOTMA), DL-2,3-diestearoiloxipropil(dimetil)-p--hidroxietilamónio (29) ou psicosina. As quantidades relativas de fosfolípido e aditivos usados nos lipossomas pode variar se se desejar. As gamas preferidas situam-se entre cerca de 80 e 95 porcento em moles de fosfolípido (incluindo o fosfonoácido lipídico) e 5 a 20 porcento em moles de psicosina ou outro aditivo. O colesterol, o hemi-succinato de colesterol, os ácidos gordos ou o DOTAP podem ser usados em quantidades que variam entre 0 e 50 porcento em moles. As quantidades de fosfonoácidos antivirais e de análogo de nucleósido incorporadas na camada lipídica dos lipossomas pode variar com a concentração dos seus lípidos, que varia entre cerca de 0,01 e cerca de 100 porcento em moles. 17

Usando métodos convencionais, podem ser envolvidos aproximadamente 20 a 30 % cjo fosfonoácido presente na solução em lipossomas; assim, aproximadamente 70 a 80 % do composto activo é perdido. Em contraste, quando o fosfonoácido lipídico é incorporado nos lipossomas, virtualmente todo o composto antiviral é incorporado no lipossoma e não se perde essencialmente nada do composto activo.

Os lipossomas com as formulações acima podem ser tomados ainda mais específicos relativamente aos seus alvos pretendidos com a incorporação de anticorpos monoclonais ou outros ligandos específicos para um alvo. Por exemplo, podem ser incorporados no lipossoma anticorpos monoclonais para receptor CD4 (T4) através da ligação da fosfatidiletanolamina (PE) incorporada no lipossoma pelo método de Leserman, et al. (30).

Terapia de Doenças Virais:

Os derivados lipídicos da presente invenção ou os lipossomas que compreendem estes agentes antivirais e que contêm 0,1 a 100 % de um derivado lipídico, tal como ácido do álcool batílico e ácido fosfonofórmico ou ácido fosfatidilfosfonofórmico ((fosfatidil--PFA) ou fosfatidilfosfono acetato (fosfatidil-PAA) ou análogos antivirais desta classe de compostos podem ser administrados por vias parentéricas a pessoas infectadas com o HTV ou com citomegalovírus (CMV). Estes lipossomas podem ser dados a doentes com SEDA ou com CMV por administração parentérica, aumentando a distribuição do composto a macrófagos e monócitos, um importante reservatório de infecções virais. Isto vai permitir o uso eficaz de doses mais pequenas dos fosfonoácidos modificados, reduzindo a toxicidade do composto. Estes agentes antivirais podem ser usados sozinhos ou em combinação com outros nucleósidos antivirais desta classe geral, conforme dados convencionalmente. Além disso, é importante notar que os liponucleótidos de AZT, ddC, ddA, ddl, d4T e ddT, tal como descritos num pedido copendente (22), podem também ser incorporados nos lipossomas de fosfatidil-PFA sozinhos ou em combinação para produzirem terapias de combinação de pPFA / didesoxinucleósido. Em alternativa, podem ser encapsulados ésteres de fosfato dos didesoxinucleósidos no interior do lipossoma pPFA, tal como se descreveu anteriormente (16), para produzir uma terapia de combinação para infecções de HTV. ί 18 /

Estas terapias de combinação com AZT e fosfatidil-PFA podem ser especialmente/ 1 importantes a fim de tratar mais eficazmente as estirpes resistentes ao AZT (ou resistentes aos nucleósidos) que se tem verificado desenvolverem-se durante a terapia de fármaco único (31). O uso da terapia de combinação, tal como referida, pode reduzir grandemente a tendência de aparecimento de estirpes mutantes de HIV resistentes aos fármacos e, por isso, aumentar consequentemente a possibilidade de interromper a progressão da infecção de HTV. O mesmo argumento se poderia também usar no tratamento das infecções provocadas pelo citomegalovírus ou pelo vírus do herpes, relativamente à eventualidade de desenvolvimento de estirpes resistentes. O conjugado lípido-fósforo ácido incorporado nos lipossomas é administrado aos doentes através de quaisquer dos procedimentos conhecidos utilizados para a administração de lipossomas. Os lipossomas podem ser administrados por via intravenosa, intraperitonal, intramuscular, intravitral ou por via subcutânea sob a forma de uma solução aquosa tamponada. Pode ser utilizado qualquer tampão aquoso farmaceuticamente aceitável ou outro veículo, desde que não destrua a estrutura dos lipossomas ou a actividade dos análogos lipídicos de fosfonoácidos. Um tampão aquoso apropriado é o NaCl 150 mM contendo fosfato de sódio 5 mM com um pH de cerca de 7,4 ou outras soluções de sais fisiologicamente tamponadas. A dosagem para um mamífero, incluindo um ser humano, pode variar dependendo da extensão e gravidade da infecção e da actividade do composto administrado. Os níveis de dosagem para os fosfonoácidos estão bem estabelecidos (2, 6, 16). Os níveis de dosagem dos análogos lipídicos de lipossomas dos fosfonoácidos serão aproximadamente os mesmos que para o próprio fosfonoácido mas, em geral, deverão ser tais que seja administrado cerca de 0,1 mg/kg a 1000 mg/kg ao paciente numa base diária e, de maior preferência, desde cerca de 1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg. A presente invenção utiliza os derivados antivirais de fosfonoformato acima referidos incorporados em lipossomas, a fim de dirigir estes compostos a macrófagos, monócitos e outras células que absorvem a composição de lipossomas. Podem também ser incorporados ligandos para focar ainda mais a especificidade dos lipossomas. Os derivados descritos· têm várias vantagens únicas e novas sobre, os fosfonoformatos de lipossomas solúveis em água. Em primeiro lugar, podem ser formulados em lipossomas em muito maiores proporções de fármaco para o lípido, uma vez que são incorporados 19 na parede do lipossoma em vez de serem localizados no compartimento aquoso dó núcleo. Em segundo lugar, os lipossomas que contêm os derivados iipofílicos áe fosfonoformato acima referidas não vazam durante o armazenamento, proporcionando uma melhor estabilidade do produto. Além disso, estas composições podem ser lioftlizadas, armazenadas a seco à temperatura ambiente e reconstituídas para serem utilizadas, proporcionando uma maior duração em prateleira. Permitem também uma incorporação eficaz dos compostos antivirais nas formulações lipossomais sem a perda significativa de composto activo. Uma outra vantagem consiste no facto de as composições usadas no tratamento in vivo fazerem com que uma maior percentagem do conjugado lípido-fosfonoácido antiviral administrado atinja o alvo pretendido. Ao mesmo tempo, o uso das composições reduz a quantidade a ser absorvida pelas células em geral, diminuindo desta forma os efeitos secundários tóxicos dos nucleósidos. Os efeitos secundários tóxicos dos fosfonoformatos podem ser ainda reduzidos alvejando os lipossomas em que estão contidos para sítios actuais ou potenciais da infecção, incorporando ligandos nos lipossomas.

Os derivados lipídicos dos agentes antivirais têm um efeito antiviral prolongado em comparação com os agentes livres de lípidos; por isso, proporcionam vantagens terapêuticas como medicamentos, mesmo quando não são incorporados nos lipossomas. Os derivados lipídicos não-lipossomais de fosfonoácidos antivirais podem ser aplicados à pele ou à mucosa ou no interior do corpo, por exemplo, por via oral, intratraqueal ou de outra forma, por via pulmonar, entérica, rectal, nasal, vaginal, lingual, intravenosa, intra-arterial, intramuscular, intraperitonal, intradérmica ou subcutânea. As presentes preparações farmacêuticas podem conter o agente activo sozinho ou podem conter outras substâncias farmaceuticamente valiosas. Podem ainda compreender um agente veicular farmaceuticamente aceitável.

As preparações farmacêuticas que contêm derivados lipídicos de fosfonoácidos antivirais são produzidas por processos convencionais de dissolução e liofílização para conterem desde cerca de 0,1 % a 100 %, de preferência de aproximadamente 1 % a 50 % do ingrediente activo. Podem ser preparadas sob a forma de unguentos, pomadas, comprimidos, cápsulas, pós ou pulverizações, em conjunto com excipientes efectivos, veículos, diluentes, fragrâncias ou apaladantes para os tomarem mais agradáveis ao paladar. 20

As formulações para ingestão oral estão na forma de comprimidos, cápsulas, pílulas, ampolas do agente activo em pó, ou suspensões oleosas ou aquosas ou soluções. Os comprimidos ou outras composições orais não-líquidas, podem conter excipientes aceitáveis , conhecidos na técnica do fabrico das composições farmacêuticas, compreendendo diluentes, tais como lactose ou carbonato de cálcio; agentes ligantes, tais como gelatina ou amido; e um ou mais agentes seleccionados do grupo que consiste em agentes edulcorantes, agentes apaladantes, agentes corantes ou agentes preservantes para proporcionarem uma preparação agradável ao paladar. Além disso, essas preparações orais podem ser revestidas por meio de técnicas conhecidas para retardar ainda a desintegração e a absorção no tracto intestinal.

As suspensões aquosas podem conter o ingrediente activo em mistura com excipientes farmacologicamente aceitáveis, compreendendo agentes de suspensão, tais como metil celulose; e agentes molhantes, tais como lecitina ou álcoois gordos de cadeia longa. As referidas suspensões aquosas podem também conter agentes preservantes, agentes corantes, agentes apaladantes e agentes edulcorantes de acordo com os padrões da indústria.

As preparações para a aplicação tópica e local compreendem pulverizações de aerossóis, loções, geles e unguentos em veículos farmaceuticamente apropriados que podem compreender álcoois alifáticos inferiores, poliglicois, tais como glicerol, polietileno glicol, ésteres de ácidos gordos, óleos e gorduras, e silicones. As preparações podem ainda compreender antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou tocoferol, e agentes preservantes, tais como ésteres do ácido p-hidroxibenzoico.

As preparações parentéricas compreendem, em particular, produtos estéreis ou esterilizados. As composições injectáveis podem ser fornecidas contendo o composto activo e qualquer dos agentes veiculares injectáveis bem conhecidos. Estas podem conter sais para regular a pressão osmótica. A quantidade terapeuticamente efectiva dos derivados lipídicos é determinada por referência às dosagens recomendadas do fosfonoácido antiviral activo, tendo em conta que, na selecção da dosagem apropriada em qualquer caso específico, se deve» ter em conta o peso do paciente, o estado de saúde em geral, o metabolismo, a idade e outros factores que influenciam a resposta ao fármaco. A dosagem parentética s< aproximadamente numa ordem de grandeza inferior à dosagem oral.

Pode obter-se uma compreensão mais completa da invenção por referência aos exemplos ilustrativos seguintes, que não se destinam, no entanto, a limitar indevidamente a invenção. EXEMPLO 1 Síntese de l,2-dimiristoil-glícero-3-fosfonoformato A um balão reaccional de três tubuladuras, adicionaram-se 0,620 gramas de fosfono formato (PFA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) dissolvidos em 4 ml de piridina seca (Aldrich, Milwaukee, WT) e 1,28 gramas de cloreto de triisopropilbenzeno sulfonilo (Aldrich). Evaporaram-se 40 ml de 1,2 dimiristoil glicerol (10 mg/ml; Avanti Polar Lipids, Pelham, Alabama) e dissolveram-se novamente em 10 ml de clorofórmio seco acabado de destilar e adicionaram-se, gotejando, à mistura reaccional num período de 30 minutos. Agitou-se a mistura reaccional durante a noite, à temperatura ambiente. Depois de 24 horas, interrompeu-se a reacção através da adição de 50 ml de HCL 0,1N frio. Separou-se a fase orgânica, secou-se sobre P2O5 e evaporou-se sob vácuo. Cristalizou-se o produto a partir de clorofórmio e acetona a 20° C. A cromatografia em camada fina do produto cristalizado, desenvolvida num sistema básico de clorofórmio, metanol, amónia e água (70/30/1/1 em volume) deu três produtos contendo fósforo. Obteve-se por cromatografia em coluna outra purificação do composto requerido. Carregou-se o produto em 50 ml de clorofórmio, em 40 gramas de gel de sílica G, 70--200 malhas, numa coluna de vidro medindo 1 x 14 polegadas e eluiu-se sequencialmente com 200 ml de clorofórmio / metanol (1:5), 200 ml de clorofórmio / metanol (1:10) e finalmente 300 ml de clorofórmio / metanol (1:1). Recuperou-se o 1,2--dimiristoil-3-fosfono formato puro na fracção de clorofórmio / metanol (1:1).

Verificou-se a pureza do composto usando dois sistemas de dissolvente, clorofórmio, metanol,'amónia e água (70/30/1/1) e clorofórmio, metanol amónia e água (65/35/4). O composto puro tinha um valor de Rf de 0,54 no sistema básico anterior. EXEMPLO 2 Síntese de l,2-dipalmitoiI-gIicero-3-fosfonoformato

Dissolveu-se 1 grama de sal do trisódio de ácido fosfonofórmico (PFA), (Fluka, Ronkonkoma, NY) em 50 ml de água destilada e passou-se através de uma coluna de Dowex 50-X8 (H+) de 1,4 x 10 cm, 200-400 malhas. Eluiu-se o PFA-H+ com água, liofilizou-se durante a noite e secou-se durante 48 horas sobre P2O5 num forno de vácuo à temperatura ambiente. A um balão de fundo redondo de 50 ml, contendo 15 ml de piridina seca (Aldrich, Milwaukee, WI), adicionaram-se 120 mg de 1,2-dipalmitoil glicerol (Sigma, St. Louis, MO) e 230 mg de PFA-H+ e 527 mg de cloreto de triisopropilbenzeno sulfonil (TPS, Aldrich Milwaukee, WI). Selou-se o vaso com uma rolha de borracha e lavou-se com jacto de árgon. Agitou-se a reacção durante a noite sob argon e 24 horas depois, adicionaram-se 15 ml de clorofórmio / metanol (1:2) e precipitou-se o produto através da adição de 15 ml de acetona a -20° C. Recolheu-se o precipitado e recristalizou-se a partir de clorofórmio / acetona, para se obter 1,2--dipalmitoil glicero-sn-3-fosfono formato com um rendimento de cerca de 70 %.

Retirou-se 0 produto num pequeno volume de clorofórmio / metanol (1:2) e aplicou-se uma pequena alíquota a placas de gel de sílica G (Uniplate, Analtech) e desenvolveu-se ou com clorofórmio / metanol / amónia concentrada / água (70/30/1/1 em volume) ou clorofórmio / metanol / água (65/35/6). O produto encontrava-se presente sob a forma de uma mancha de fósforo positiva com valores de Rf de 0,69 ou 0,80, respectivamente. Calculou-se que a pureza do composto era de 0 % por inspecção visual depois de se queoimar com ácido sulfurico concentrado.

Conseguiu-se uma outra purificação submetendo uma porção do produto impuro a cromatografía em camada fina preparativa usando placas de 20 x 20 cm de gel de sílica G (0,5 mm de espessura de sílica, Analtech) desenvolvida com clorofórmio / metanol / amónia concentrada / água (70/30/1). O composto foi localizado pulverizando manchas guia de referência nas margens do lado de fora da placa com uma pulverização de fósforo, tendo o cuidado de cobrir a superfície do restante com uma placa de vidro limpo. A mancha representando o produto foi cortada e extraída com clorofórmio / metanol / água (1/2/0,8). Separou-se a fase de clorofórmio através da adição de clorofórmio / água (1/1) para que a proporção final dos dissolventes fosse 1/1/0,9, tal como descrito por Bligh and Dyer (32). Separou-se a fase de clorofórmio e evaporou-se o dissolvente em vácuo e secou-se o produto por liofilização a partir de ciclo-hexano. O produto purificado deu manchas simples depois de cromatografia em camada fina nos dois sistemas acima referidos. EXEMPLO 3 Síntese de 1-O-octadecil, 2-0-benzil-sn-gIicero-3-oxicarbonil fosfonato (C-batil PFA).

Adicionou-se uma solução de 1-O-octadecilo, 2-O-benzil-sn-glicerol (OBG) (Bachem Bioscience, Philadelphia, Pennsylvania) (0,68 g) em tetra-hidrofurano durante um período de 1,5 horas a uma solução de fósgenio (1,5 eg) em trietilamina (5 ml) enquanto se mantinha a temperatura a 0o C. Depois de a adição estar completa, agitou-se a mistura reaccional a 0o C durante 4 horas. No final deste tempo, adicionou-se fosfito de trimetilo (4 equiv) a 0o C e aqueceu-se gradualmente a mistura reaccional até à temperatura ambiente, durante a noite. O bis(metoxi)fosfonato intermediário foi desmetilado e o produto impuro purificado por cromatografia para originar o composto do título com um rendimento de 40 %. EXEMPLO 4 Síntese de ácido 1-0-octadecil, ácido 2-0-benzil-sn-gUcero-3-oxicarbonilfosfono acético (C-batil PAA).

Adicionou-se uma solução de álcool OBG (0,68 g) em tetra-hidrofurano durante um período de 1 hora a uma solução arrefecida (-50° a -55° C) de cloreto de (diclorofosfinil) acetilo (0,6 g) e agitou-se a mistura durante 1 hora a -30° C a queceu-se gradualmente até 0o C. Evaporou-se o dissolvente e tratou-se o resíduo com metanol (5 ml) e deixou-se agitar a mistura à temperatura ambiente durante 4 horas. No final deste -tempo removeu-se o dissolvente sob pressão reduzida, filtrou-se e lavou-se o sólido com metanol gelado, para originar o produto desejado com um rendimento de 50 %. EXEMPLO 5 Síntese de Batil-Fosfono formato

Fez-se reagir uma quantidade de 0,9 gramas de álcool batílico racémico (1-O-octadecil--2,3-glicerol, Sigma Chemical, St. Louis, MO), 2,6 gramas de cloreto de triisopropilbenzeno sulfonilo (TPS, Aldrich, Milwaukee, WI) e 0,16 gramas de fosfonoformato, na forma de ácido, em 15 ml de piridina seca, à temperatura ambiente, sob azoto. Monitorizou-se a reacção em intervalos de meia hora por cromatografía em camada fina, tal como no Exemplo 3, e considerou-se completa ao fim de cerca de 24 horas. Interrompeu-se a reacção através da adição de 10 ml de clorofórmio / metanol / água, 1/2/0,8 em volume). Separou-se a fase orgânica (inferior) através de outra adição de 2 ml de clorofórmio e 2 ml de água. Removeu-se a fase orgânica e evaporou-se em vácuo e obteve-se o produto sob a forma de um pó branco. Dissolveu-se o produto impuro num pequeno volume de clorofórmio / metanol (1/1 em volume) e submeteu-se a cromatografía em camada fina preparativa usando uma camada de 0,5 mm de placas de gel de sílica G (Analtech, Newark, DE) desenvolvida com clorofórmio / metanol / amónia concentrada / água (70/30/1/1). Visualizaram-se duas manchas contendo PFA, separaram-se e extraíram-se com clorofórmio / metanol / água, tal como se descreveu anteriormente no Exemplo 3. Os dois compostos são referidos como batil-PFA, da parte superior e da parte inferior, respectivamente. EXEMPLO 6

Formação de Lipossomas com Fosfatidil-PFA A um vaso de tratamento com ultra-sons de 2,0 ml esterilizado, adicionaram-se (numa solução de clorofórmio) 7,5 pmoles dioleoilfosfatidil colina, 4,5 pmoles de colesterol e 3 pmoles de pPFA. Removeu-se o dissolvente em vácuo, formando um película fina da mistura lipídica. A película lipídica foi hidratada com 0,3 ml de tampão de acetato de sódio 10 mM estéril (pH 5,0) contendo dextrose isotónica. Fez-se redemoinhar a mistura intermitentemente durante 10 minutos, seguida de tratamento com ultra-sons durante 90 a 120 minutos usando a asa do copo de um Aparelho de aplicação de ultra- 25 -sons Heat Systems Ultrasonics (Modelo 431B) com uma regulação do controlo de saída #9, tratamento esse que resultou na clarificação da amostra. Esta amostra foi diluída com meio de cultura de tecido RPMI esterilizado e usada em experiências de HIV nas contracções indicadas. EXEMPLO 7

Demonstração da Actividade anti-lllV em Células HT4-6C

Cultivaram-se células HT4-6C em meio de RPMI 1640 contendo 100 U/ml de penicilina G, 100 pg/ml de streptomicina, glutamina 2 mM e 10 % de soro fetal de bovino (Hyclone Laboratories, Logan, UT). Infectaram-se células com HTV-1 (estirpe LAV-1, L. Montagnier, Paris, França) numa multiplicidade da infecções suficientes para dar 100-300 placas por poço nos controlos sem fármaco. Deixou-se adsorver o vírus a 37° C durante uma hora. Prepararam-se lipossomas contendo os dois batil-PFAs, tal como se descreveu no Exemplo 3. A preparação tratada com ultra-sons foi diluída com tampão RPMI esterilizado e adicionada aos poços de cultura de tecido nas concentrações indicadas. Depois de uma incubação de 3 dias a 37° C, as monocamadas de células foram fixadas com 10 % de formaleído e manchadas com 0,25 % de violeta cristalino para visualizar as placas. O procedimento de manchamento revelou focos densos individuais de células gigantes multinucleadas, que foram contadas e usadas para determinar a actividade anti-retroviral do fármaco.

Os resultados da experiência estão mostrados na Figura 1. Ambas as preparações de batil-PFA (mancha da parte superior e marca da parte inferior) foram activas nesta experiência. A quantidade de fármaco requerida para produzir 50 % de inibição (C.I.50) pode ser avaliada a partir da figura, tal como se segue: PFA 200 μΜ; batil-PFA (parte superior) 110 μΜ e batil-PFA (parte inferior) 180 μΜ. EXEMPLO 8

Inibição de ADN humano especifico do citomegalovírus por profármacos lipídicos de fosfonoformato e fosfonoacetato. Método de Ensaio: Plaquearam-se células MCR-5 (fibroblastos do pulmão humano) (cerca de 5 x 104 células por poço de uma placa de 24 poços) em meio de DME com 10 % de soro fetal de bovino, um a dois dias antes da adição do fármaco. Adicionaram-se os fármacos em dimetilsulfóxido (DMSO) ao meio, numa concentração final de DMSO de 1 %. Em alguns casos, em que o composto não era facilmente solúvel em água ou DMSO, prepararam-se lipossomas por tratamento com ultra-sons contendo 10 % em moles de fármaco / 50 % em moles de dioleoilfosfatidil colina / 30 % em moles de colesterol e 10 % em moles de dioleoilfosfatidil glicerol. Prepararam-se também lipossomas de controlo sém o fármaco e incubaram-se em concentrações lipídicas ajustadas como controlos. Este meio é então aspirado e mudado para as diluições de fármaco feitas em 2 % de meio FBS e incubadas durante 24 horas. O meio contendo o fármaco é transferido para tubos esterilizados e adicionada aos poços uma diluição de 1:50 (cerca de 20.000 PFUs) da combinação de vírus de CMV humano AD-169, a 0,2 ml por poço, e incubada a 37° C durante 60 minutos. O inoculo é feito em DME mais 2 % de meio FBS. Depois da incubação, o inoculo é aspirado dos poços e voltam-se a adicionar as diluições de fármaco. As células são incubadas durante cinco a seis dias, quando deveriam revelar um efeito citopático de 50-100 %.

No final de um período de incubação de 5 a 6 dias, é feita a quantificação do ADN de CMV presente por hibridização de ácido nucleico usando uma biblioteca de ensaios de susceptibilidade antiviral de CMV da Diagnostic Hybrids (Athens, OH). O meio de cada poço é aspirado completamente e adicionado a cada poço duas gotas da solução de lis (agente “wicking” de ADN). Depois de cerca de cinco segundos, colocam-se pares de filtros Hybriwix nos poços por ordem numérica e a solução é absorvida em filtros durante cerca de 30 minutos ou até os poços estarem secos. Usando fórceps, removem--se os Hybriwix e colocam-se numa toalha de papel. Corta-se verticalmente cada par de Hybriwix pela parte partilhada do filtro. Os Hybriwix são transferidos para frascos contendo Agente de Hibridização de Sonda CMV marcada com I125 (um máximo de 24 27

Hybriwix por frasco) juntamente com três Hybriwix de controlo negativo e dois, Hybriwix de controlo positivo por frasco.

Os frascos são colocados num banho de água a 60° C suavemente agitado durante um mínimo de duas horas até durante a noite. Depois de hibridização, a solução é aspirada dos frascos e colectada para um recipiente radioactivo descartável. Adicionam-se 4 ml de água destilada a cada frasco para o enxaguar, tapa-se, faz-se rodar e depois aspira-se. Adicionam-se 6 ml de Reagente Wash ao recipiente de Lavagem e transferem-se os Hybriwix para este e giram-se cuidadosamente. Adicionam-se 114 ml de água destilada, que foi pré-aquecida até 73° C, ao Recipente de Lavagem e coloca-se este num banho de água a 73° C durante 30 minutos. A solução de lavagem é então removida para um recipiente radioactivo descartável e os Hybriwix são colocados por ordem numérica numa toalha de papel e depois transferidos para tubos de contagem gama e contados durante dois minutos.

Resultados: Depois da subtracção dos valores em branco, os resultados são expressos como percentagem de controlo sem fármaco. A dependência da concentração da produção de ADN CMV foi registada graficamente e determinada a quantidade dos respectivos fármacos requeridos para reduzir o nível de controlo em 50 % (CI50) e os resultados estão mostrados na tabela seguinte. 28

EXEMPLO 9

Efeito do Fosfonoformato, Fosfonoacetato e Vários Análogos Lipídicos na Produção de ADN específico de hcmv por Fibroblastos de Pulmão Humano mrc-5 in vitro. COMPOSTO Çfeo PFA 55; 60 DMG-PFA 178; 112 BATIL, BENZIL-PFA 1,7*; <3,16* PAA 31; 26 DMG-PAA 19; 5 DMP-PAA 49; 40 CONTROLO DE LIPOSSOMAS 125* * Formulação de lipossomas. Todos os outros dados obtidos com os compostos dissolvidos directamente em 1 % de DMSO em meio de Eagle modificado por Dulbecco.

Abreviaturas: PFA, ácido fosfonofórmico; PAA, ácido fosfonoacético; DMG-PFA, ácido l,2-dimiristoil-í«-glicero-3-fosfonofórmico;

Batil, benzil-PFA, ácido 1-0-octadecil, 2-benzil-s«-glicero-3-fosfonofórmico; DMG-PAA, ácido l,2-dimiristoil-s«-glicero-3-fosfonoacético; DMP-PAA, ácido l,2-dimiristoil-.y«-glicero-3-fosfo-fosfonoacético.

Tal como demonstrado na tabela anterior, todos os análogos lipídicos de PFA e PAA exibiram actividode na redução da produção de ADN especifico do CMV humano sem a toxicidade aparente, tal como determinada por inspecção visual das monocamadas de células. Os controlos de lipossomas reduziram a produção de ADN específico do CMV em doses lipídicas muito elevadas, mas a actividade do batil, benzil PFA lipossómico foi 74 vezes mais activo do que os controlos de lipossomas ajustados sem o fármaco lipídico.

Deverá ser evidente do anterior que outros compostos de fosfonoácidos e seus derivados lipídicos podem ser substituídos nos Exemplos 3 e 5 para se obterem resultados semelhantes. Outros agentes antivirais, tais como, por exemplo, fosfatos de análogos de nucleósidos, podem também estar contidos nos compartimentos aquosos do lipossoma (7). A percentagem molar dos agentes lipídicos antivirais, tais como, por exemplo, os fosfatos análogos de nucleósidos, podem também estar contidos nos compartimentos aquosos do lipossoma (7). A percentagem molar do agente lipídico antiviral pode variar entre 0,1 e 100 % da mistura lipídica total. Além disso, podem ser usadas misturas de lípidos de nucleósidos antivirais na construção de lipossomas para a terapia de doenças virais (6). Deverá enfatizar-se novamente que as presentes sínteses são amplamente aplicáveis à formação de compostos destinados a ser utilizados na prática da presente invenção.

Deste modo, as formas de realização descritas devem considerar-se em todos os aspectos apenas como ilustrativas e não restritivas, sendo o âmbito da presente invenção, por isso, indicado pelas reivindicações em anexo, mais do que pela descrição anterior. 30 \ REFERÊNCIAS .., , . · -1 ------------------' 1. Helgestrand, E., et al. (1978) Science (Washington, D.C) 201:819. ^ 2. Patente U. S. No. 4,771,041 de Eriksson, et al. 3. Fischl, M.S., Richman, D.D., Grieco, M.H., et al. (1987) New Eng. J. Med.. 317: 185-191. 4. Richman, D.D., Fischl, M.A., Grieco, MA., et al. (1987) New Eng. J. Med., 317: 192-197. 5. Richman, D.D., Kombluth, R.S. e Carson, D.A. (1987) J. Exp. Med., 166: 11444--1149. 6. Lambert, R., et al. (1989) J. Med. Chem. 32:367-374. 7. Matsushita, T., Ryu, E.K., Hong, C.I. e MacCoss, M. (1981) Câncer Res., 41: 2707-2713. 8. Ho, D.W.H. e Neil, B.L. (1977) Câncer Res., 37:1640-1643. 9. Bangham, A.D., Standish, M.M e Watkins, J.C. (1965) J. Mol. Biol. 23:238-252. 10. Black, C.D.V., Watson, G.J. e Ward, R.J. (1977) Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg., 71: 550-552. 11. Alving, C.R., Steck, E.a., Chapman, W.L., Waits, V.B., Hendricks, L.D. Swartz, G.M. e Hanson, W.L. (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:2959-2963. 12. Lopez-Berestein, G. (1986) Ann. Int. Med., 103: 694-699. 13. Herman, E.H., Rahman, A., Ferrans, Y.J. Vick, J.A. e Shein, P.S. (1983) Câncer1 Res., 43: 5427-5432. 14. Ostro, Μ. (1987) Sei. Am. 256:103-111. 15. Oberg, D., Pharmacol. Ther. 19: 387-415 (1983). 16. Szoka, F. e Chu, C-J., “Antimicrobial Agents and Chemotherapy” (“Agentes Antimicrobianos e Quimioterapia”): 32(6) 858-864 (1988). 17. Salahuddin, S.Z., Rose, R.M., Groopman, J.E., Markham, P.D. e Gallo, R.C. (1985) Blood, 68: 281-284. 18. Koenig, S., Gendelman, H.E., Orenstein, J.M., Dalcanto, M.C. Pezeshkpur, G.H., Yungbluth, M. Janotta, F., et al. (1986) Science, 233:1089-1093. 19. Post, G., Kirsch, R. e Koestler, T. (1984) em “Liposome Technology” (“Tecnologia de Lipossomas”), Vol. ΙΠ, G. Gregoriadis, Ed., CRC Press, Boca Raton, p. 1-28. 20. Scherphof, G. (1986) em “Lipids and Biomembranes, Past, Present, and Future” (“Lípidos e Biomembranas, Passado, Presente e Futuro”), Op den Kamp, J., Roelofsen, B e Wirtz, K.W.A., Eds., Elsevier North Holland, Amsterdam, p. 113--136. 21. Hostetler, K.Y., U.S. Pedido de Patente para “LIPID DERIVATIVES OF ANTIVIRAL NUCLEOSIDES FOR LIP0S0MAL INCORPORATION” (“DERIVADOS LIPÍDICOS DE NUCLEÓSIDOS ANTIVIRAIS PARA INCORPORAÇÃO DE LIPOSSOMAS”)...Série No. 373,088 (1989). 22. Hostetler, K.Y. e D.D. Richman, Pedido de Patente U.S. Série No. 099,755 para “METHOD OF PREPARING ANTIVIRAL DRUGS FOR LIPOSOME ENCAPSULATION” (“MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE FÁRMACOS ANTIVIRAIS PARA ENCAPSULAMENTO DE LIPOSSOMAS”)... (1987). 23. Agranoff, B.W. E W.D. Suomi, “Biochemical Preparations” (“Preparações Bioquímicas”) 10:46-51 (1963). 24. Olson, F., Hunt, C.A. Szoka, F.C., Vail, W.J. e Papahadjopoulos, D. (1979) Biochim, Biophys. Acta, 557: 9-23. 25. Szoka, F., e Papahadjopoulos, D. (1978) Proc. Nat. Acad. Sei. 75:4194-4198. 26. Mayhew, E., Lazo, R., Vail, W.J., King, J., Green, A.M. (1984) 775:169-175. 27. Kim, S., Turker M., Chi, E., et al., Biochim. Biophys. Act, 728: 339:348. 28. Mayer, L.D., Hope, MJ. e Cullis, P.R. (1986) Biochim. Biophys. Acta, 858: 161--168. 29. Rosenthal, A.F. e R.P. Geyer (1960) J. Biol. Chem. 235(8): 2202-2206. 30. Leserman, L.D., Barbet, J. e Kourilsky, F. (1980) Nature 288:602-604. 31. Larder, B.A., Darby, G. and Richman, D.D. (1989) Science 243: 1731-1734. 32. Bligh, E.G. e W.J. Dyer Can. J, Biochem.. 37: 911 (1959). 33. Publicação do Pedido de Patente International (PCT) N° WO-91/18914 (publicada em 12 de Dezembro 1991). 34. Patente US N° 4,052,439 (publicada em 4 de Outubro 1977). 35. US Patent N° 4,150,125 (publicada em 17 de Abril 1979).

Lisboa, 2 6 DEZ. 2001

Maria Silvina Ferreira ADVOGADA

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Claims (30)

1. REIVINDICAÇÕES Composto tendo actividade anliviral, que compreende: um fosfonoácido seleccionado do grupo que consiste em, ácido fosfonofórmico e ácido fosfonoacético, ligado a um lípido seleccionado do grupo que consiste em fosfolípidos, glicerolípidos, glicolípidos, esfíngolípidos ou ceromidas; com a condição de que, quando o referido lípido é um fosfolípido com um fosfato posicionado na posição 3 do glicerol, e o referido fosfonoácido está ligado ao referido fosfato, então a referida ligação é uma ligação de carboxi éster; e com a condição de que, quando o referido lípido é um diacilglicerolípido e o referido fosfonoácido é ácido fosfonoacético ligado ao mesmo por uma ligação de carboxi éster, a referida ligação de carboxi éster é formada na posição 1-glicerol ou 3-glicerol. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fosfonoácido está ligado a um grupo hidroxilo disponível do referido lípido, através de uma ligação de éster de fosfato. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o referido fosfonoácido está ligado a um grupo hidroxilo disponível do referido lípido, através de uma ligação de carboxi éster. Composto de acordo com a reivindicação 2, que tem a seguinte estrutura: n,c—o—u, * I ' i HO—OH 0 1 1^0—0— —C(O)—O' O' em que n = 0 ou 1; e Ri é um grupo alifático em C2-C24, tendo 0 a 6 ligações duplas, ligado a um grupo hidroxilo de glicerol através de uma ligação éter ou de uma ligação de éter vinílico. Composto de acordo com a reivindicação 2, que tem a estrutura: h2c-o-r, hc-o-r, (O)-O* I f. H2c—O p— (CH2) O' em que n = 0 ou 1; e Ri e R2 são grupos alifáticos em C2-C24, tendo de 0 a 6 ligações duplas, ligados a um grupo hidroxilo de glicerol através de uma ligação éster ou de uma ligação éter. Composto de acordo com a reivindicação 3, que tem a seguinte estrutura:

   hc—OH o o B II h2c-O-C-{CHj)„ —P—o em que n = 0 ou 1; e Ri é um grupo alifático em C2-C24, tendo de 0 a 6 ligações duplas, e está ligado a um grupo hidroxilo de glicerol através de uma ligação éter ou de uma ligação éter de vinilo. Composto de acordo com a reivindicação 3, que tem a estrutura: Η,ο-ο-η, HC-O-Rj I O o I 1 11 HjC-O-C-(CH2)n p—o O' em que n = 0 ou 1; e Ri e R2 são grupos alifáticos em C2-C24, tendo 0 a 6 ligações duplas, e Ri e R2 estão cada um deles ligado a um grupo hidroxilo de glicerol através de uma ligação éster ou de uma ligação éter. Ο 3
2. 8. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o referido lípido é seleccionado do grupo que consiste num monoacilglicerol, um monoalquilglicerol, um diacilglicerol, um dialquilglicerol, um 1-acil, 2-O-alquil--glicerol e um 1-0-alquíl, 2-acil-gIicerol.
3. 9. Composto de acordo com a reivindicação 4, que é ácido l-0-alquil->y«-glicero-3--fosfónico.
4. 10. Composto de acordo com a reivindicação 9, que é ácido l-O-hexadecil-sn-glicero--3-fosfónico.
5. 11. Composto de acordo com a reivindicação 9, que é ácido l-O-octadecil-sn-glicero--3-fosfónico.
6. 12. Composto de acordo com a reivindicação 5, que é ácido l,2-diacil-s«-glicero-3--fosfónico.
7. 13. Composto de acordo com a reivindicação 12, que é ácido 1,2-dimiristoil-sn--glicero-3-fosfónico.
8. 14. Composto de acordo com a reivindicação 12, que é l,2-dipalmitoil-áw-glicero-3--fosfonoácido.
9. 15. Composto de acordo com a reivindicação 6, que é ácido 1 -0-alquil-.s«-glicero-3--oxicarboníl fosfónico.
10. 16. Composto de acordo com a reivindicação 15, que é ácido 1 -O-hexadecil-sM--glicero-3-oxicarbonil fosfónico.
11. 17. Composto de acordo com a reivindicação 15, que é ácido l-O-octadecil-sn--gIicero-3-oxicarbonil fosfónico.
12. 18. Composto de acordo com a reivindicação 7, que é ácido 1,2-diacil-.sn-glicero-3--oxicarbonil fosfónico. 4 -----"VjUv
13. 19. Composto de acordo com a reivindicação 18, que é ácido 1,2-dimiristoil-s«--glicero-3-oxicarbonil fosfónico.
14. 20. Composto de acordo com a reivindicação 18, que é ácido 1,2-dipalmitoil-iw--glicero-3-oxicarbonil fosfónico.
15. 21. Composto de acordo com a reivindicação 5. em que n = 0 e Ri e R2 são grupos alifáticos em C2-C24 tendo zero ligações duplas,
16. 22. Composto de acordo com a reivindicação 4, em que a ligação éter ou a ligação vinil éter de ao grupo hidroxilo de glicerol é uma de C-O-, C=C-0-, C-S- e OC-S-.
17. 23. Composto de acordo com a reivindicação 5, em que a ligação éster ou a ligação éter é uma de C(0)0-, C-O-, OC-O-. C(0)S-, C-S- e C=C-S-.
18. 24. Composto de acordo com a reivindicação 6, em que a ligação éter ou a ligação vinil éter ao grupo hidroxilo de glicerol é uma de C-O-, C=C-0-, C-S- e C=C-S-.
19. 25. Composto de acordo com a reivindicação 7, em que a ligação éster ou a ligação éter é uma de C(0)0-, C-O-, C=C-0-, C(0)S-, C-S- e C=C-S-.

    27. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que o referido lípido é um fosfolípido. Derivado rico em lípidos de um fosfonoácido da fórmula (L)m - (V)„ - W - T em que W é o o p ò" T é (CH2)p - C(O) - O em que p = 0 ou 1; V é fosfato; né0a2;Léum agrupamento lipídico seleccionado do grupo que consiste em fosfolípidos, esfmgolípidos, glicolípidos, ceramidas ou glicerolípidos; m = 1 a 3; e em que cada 5 L está ligado directamente a um grupo V numa ligação fosfoéster e T está ligado a W através de uma ligação fosfonato; com a condição de que, quando L for um fosfolípido e m = 1, então a referida ligação fosfoéster é formada na posição 1-glicerol ou 2-glicerol (Dl).
20. 28. Lipossoma formado em parte a partir de um composto de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores
21. 29. Uso, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma infecção virai num mamífero, de um composto ou lipossoma de uma qualquer das reivindicações anteriores.
22. 30. Uso de acordo com a reivindicação 29, em que o mamífero é um ser humano e o vírus é o vírus da imunodeficiência humana (HTV).
23. 31. Uso de acordo com a reivindicação 29, em que é usado um análogo de nucleósido em combinação com o referido composto ou lipossoma.
24. 32. Uso de acordo com a reivindicação 31, em que o análogo de nucleósido compreende 3’-azido-3’-desoxi-timidina (AZT).
25. 33. Composto ou lipossoma de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, para uso como um medicamento no tratamento de uma infecção virai num mamífero.
26. 34. Composto ou lipossoma de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, para ser usado como um medicamento no tratamento de uma infecção provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (HTV) num ser humano.
27. 35. Composto ou lipossoma de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, para ser usado como um agente para evitar ou ultrapassar a resistência a análogos de nucleósidos no tratamento da infecção provocada pelo vírus da imunodeficiência humana (HTV) num mamífero.
28. 36. Composição farmacêutica para ser usada no tratamento de uma infecção virai num mamífero, que compreende um composto ou lipossoma de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, em associação com um agente veicular farmaceuticamente aceitável.
29. 37. Composição farmacêutica para ser usada no tratamento de uma infecção virai num mamífero, que compreende um composto ou lipossoma de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 28, em combinação com AZT em associação com um agente veicular farmaceuticamente aceitável.
30. 38. Método para a preparação de uma suspensão de lipossomas para ser usada no tratamento de infecções virais num mamífero, que compreende as fases de: (a) se proporcionar um agente anfifático antiviral que compreende um ácido fosfonoacético ou um ácido fosfonofórmico ligado a um lípido seleccionado do grupo que consiste em fosfolípidos, glicerolípidos, glicolípidos, esfingolípidos, ceramidas ou ácidos gordos; (b) se combinar o referido agente antiviral anfifático e um dissolvente aquoso farmacologicamente aceitável para formar uma mistura; e (c) se formarem lipossomas a partir do referido agente lipofílico antiviral. Lisboa, 2 6 DEZ, 2001

    Maria Silvina Ferreira ADVOGADA Agente Oficial de Propriedade Industrial R. Castilho, 50-5?- 1250 - 071 LISBOA Tel. 21 38150 50 - Fax. 21 383 1150