KR20020073494A - 약물내성 인체 면역결핍 바이러스 감염의 치료 - Google Patents

약물내성 인체 면역결핍 바이러스 감염의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 포스포노포르메이트 함유 제약학상 활성 화합물의 지질 유사체를 포함하는 HIV 감염의 치료를 필요로 하는 환자의 HIV 감염 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 실행에 사용할 수 있는 지질 유사체는 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬글리세롤, 알킬프로판디올, 알킬에탄디올 또는 관련된 성분에 (링커 분자를 통해 직접적으로 또는 간접적으로) 공유적으로 연결된 포스포노포르메이트를 포함한다. 특히, 본 발명은 현재 입수할 수 있는 항바이러스제에 대한 내성을 갖게 된 바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염의 치료 방법, 뿐만 아니라 치료 동안 약물내성 HIV 변이주의 선택을 최소화시키기 위하여 아지도데옥시티미딘과 함께 본 발명의 화합물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.

Description

약물내성 인체 면역결핍 바이러스 감염의 치료{Treatment of Drug-Resistant Human Immunodeficiency Virus Infection}
항바이러스제는 바이러스 감염에 의해 야기된 각종 질환을 치료하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 이들 약제는 바이러스의 복제를 억제함으로써, 예를 들면 바이러스 폴리머라제 복제 효소의 작용을 방해함으로써 바이러스 감염을 효과적으로 치료한다. 특히, HIV에 의해 야기된 감염은 모든 레트로바이러스에 공통적인 복제 효소인 바이러스 역전사효소(RT)의 정상적인 기능을 방해하는 약제에 의해 효과적으로 치료되어 왔다.
포스포노포르메이트(PFA 또는 포스카르넷)는 예를 들면 DNA 및 RNA 폴리머라제 및 역전사효소와 같은 바이러스 폴리머라제의 작용을 억제하는 그의 능력 때문에 효능있는 항바이러스제이다[크럼팩커(Crumpacker, C.S.),1992 The American Journal of Medicine 92(SA):3S-7S]. 그 자체로, 포스카르넷은 바이러스, 예를 들면 헤르페스 단순 바이러스, 인플루엔자, 사이토메갈로바이러스, 및 레트로바이러스, 예를 들면 HIV-1의 성장을 효과적으로 억제함이 입증되었다[바시갈럽(Bacigalup) 등,1994 Bone Marrow Transplantation13:753-758; 베르돈크(Verdonck) 등,1993 ibid.11:177-179; 바그스타프(Wagstaff) 등,1994 Drugs48:199-226].
포스포노포르메이트는, 뉴클레오티드 중합반응의 부산물이며 새로 만들어지는 DNA 스트랜드 내로 도입될 때 들어오는 뉴클레오티드 트리포스페이트로부터 절단된 β및 γ포스페이트로 이루어지는 피로포스페이트의 유사체이다. 이론에 얽매이길 원하지는 않지만, PFA는 역전사효소에 결합하여 다음 뉴클레오시드 트리포스페이트의 결합을 막고, 이에 의해 추가의 촉매작용을 차단함으로써 HIV-1과 같은 레트로바이러스의 복제를 억제하는 것으로 생각된다. 바이러스 감염을 치료하기 위하여 PFA를 사용하는 것이 이미 설명되어 있다. 예를 들면 문헌[크리스프(Chrisp) 등,Drugs41:104-129(1991); 비들(Beadle) 등,Antiviral Chem Chemother9:33-40(1997); 비들 등,Antiviral Chem Chemother9:33-40(1988); 호스테틀러(Hostetler) 등,Antiviral Res.31:59-67(1996); 호스테틀러 등,Antiviral Chem Chemother,11:213-220(2000); 키니(Kini) 등,Antiviral Res36:43-53(1997); 키니 등,Antiviral Res36:115-124(1997); 멜러스(Mellors) 등,Mol. Pharmacol.43:11-16(1992); 느구옌(Nguyen) 등,Antimicrob. Agents Chemother.,38:2409-2414(1994)]을 참조할 수 있다.
비록 항레트로바이러스제의 사용을 통해 AIDS의 치료에 진전이 이루어졌지만, 이 치료의 불행한 결과는 이들 동일한 항레트로바이러스제가 HIV-1을 돌연변이를 일으키는 선택적 압력 하에 두어 약물 무감각 및 열등한 치료 결과로 이어진다는 것이다[리치맨(Richman),Scientific American, 1988279:88]. HIV 감염의 치료에 사용된 항레트로바이러스 약물에 대한 바이러스 내성의 발생은 치료 실패의 주된 이유이고 대체용 항레트로바이러스 양생법에 대한 선택을 제한시킨다. 뉴클레오시드 유사체인 지도부딘(AZT), 디다노신(ddI), 잘시타빈(ddC), 라미부딘(3TC), 스타부딘(d4T) 및 아바카비르를 포함하는 HIV 역전사효소의 모든 뉴클레오시드 억제제(NRTI's), 뿐만 아니라 네비라핀, 델라비르딘 및 에파비렌즈와 같은 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI's)에 대한 내성이 발생하였다[허어쉬(Hirsch) 등,JAMA 1998279:1984-1991]. 추가로, HIV-1 프로테아제 억제제, 예를 들면 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르, 아게네라제 및 DMP-450에 대한 내성이 발생하였다.
따라서, 당 업계에서는 현재 입수할 수 있는 치료 양생법에 의한 바이러스 복제의 억제에 대한 내성을 갖게 된 HIV 변이주의 복제를 효과적으로 방해하는 항바이러스제를 필요로 하고 있다.
발명의 요약
본 발명은 포스포노포르메이트 또는 티오포스포노포르메이트의 1종 이상의 지질 유사체 유효량을 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 바이러스 감염 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 실행에 사용할 수 있는 지질 유사체는 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬글리세롤, 알킬프로판디올, 알킬에탄디올 또는 관련 성분에 (링커 분자를 통해 직접적으로 또는 간접적으로) 공유적으로 연결된 포스포노포르메이트를 포함한다. 특히, 본 발명은 현재 입수할 수 있는 항바이러스제에 대한 내성을 갖게 된 바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염의 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 한 면에서는 레트로바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염의 치료 방법이 제공된다. 본 발명의 특정 면에서는 항바이러스제, 예를 들면 역전사효소 억제제 등에 대한 내성을 갖게 된 레트로바이러스에 의해 야기된 바이러스 감염의 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 면에서는 HIV 역전사효소 억제제인 아지도티미딘(AZT)과 함께 포스포노포르메이트의 지질 유사체 유효량을 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 바이러스 감염의 치료 방법이 제공된다.
본 발명은 인체 면역결핍 바이러스(HIV) 감염의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 상기 바이러스의 복제를 억제하는 항바이러스제에 대한 내성을 갖게 된 HIV 변이주에 의해 야기된 바이러스 감염의 치료 방법에 관한 것이다.
도 1은 본 발명의 실행에 사용할 수 있는 포스포노포르메이트 지질 유사체의 예시적인 화학식을 예시한다.
본 발명에 따라, 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자의 바이러스 감염의 치료 방법이 제공된다. 이러한 치료 개재에 대한 적절한 표시로는 바이러스의 역전사효소가 각종 역전사효소 억제제, 예를 들면 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NRTI's), 비뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI's) 등에 대해 내성으로 된 인체 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 이환성 바이러스를 들 수 있다.
본 발명의 방법은 하기 화학식 1로 표시되는, 포스포노포르메이트 또는 티오포스포노포르메이트의 지질 유사체 유효량을 환자에 투여하는 것을 포함한다:
상기 식 중,
R1및 R1'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C24)알킬, -O(C1-C24)알케닐, -S(C1-C24)알킬, -S(C1-C24)알케닐, -O(C1-C24)아실, 또는 -S(C1-C24)아실이고, 이 때 R1및 R1' 중 적어도 하나는 -H가 아니며, 상기 알케닐은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 갖고, 상기 아실은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 가질 수도 있고;
R2및 R2'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C7)알킬, -O(C1-C7)알케닐, -S(C1-C7)알킬, -S(C1-C7)알케닐, -O(C1-C7)아실, -S(C1-C7)아실, -N(C1-C7)아실, -NH(C1-C7)알킬, -N((C1-C7)알킬)2, 옥소, 할로겐, -NH2, -OH, 또는 -SH이고;
R3은 그의 카르복실기 또는 그의 포스포네이트기를 통해 임의적인 링커 L 상의 관능기 또는 Cα상의 이용가능한 산소에 연결된 포스포노포르메이트이며, 이 때 R3이 그의 포스포네이트기를 통해 연결될 때에는 상기 포스포노포르메이트의 카르복실레이트기가 하기 화학식을 갖고
(여기서, Ry는 -H 또는 알킬, 또는 Na+, K+, NH4 +, 또는 임의의 다른 생리학적으로 허용되는 양이온임);
X는 존재할 경우
이고;
L은 존재할 경우, 화학식 -J-(CR2)t-G- (여기서, t는 1 내지 24의 정수이고, J 및 G는 독립적으로 -O-, -S-, -C(O)O-, 또는 -NH-이고, R은 -H, 알킬 또는 알케닐임)의 이관능성 연결 분자이고;
m은 0 내지 6의 정수이고;
n은 0 또는 1이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "알킬"은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-헥실 등을 포함하여 1 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 1가의 직쇄 또는 분지쇄 또는 환식 라디칼을 말한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "치환된 알킬"은 히드록시, (저급 알킬기의) 알콕시, (저급 알킬기의) 머캅토, 시클로알킬, 치환된 시클로알킬, 헤테로시클릭, 치환된 헤테로시클릭, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아릴옥시, 치환된 아릴옥시, 할로겐, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 니트론, 아미노, 아미도, -C(O)H, 아실, 옥시아실, 카르복실, 카르바메이트, 술포닐, 술폰아미드, 술푸릴 등으로부터 선택된 1개 이상의 치환체를 추가로 포함하는 알킬기를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "알케닐"은 1개 이상의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 약 2개 내지 최대 24개 범위의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 히드로카르빌기를 말하고, "치환된 알케닐"은 상기 열거한 1개 이상의 치환체를 추가로 포함하는 알케닐기를 말한다.
본 발명의 실행에 사용하기 위한 포스포노포르메이트의 예로는 바틸 알콜 첨가생성물, 1-O-옥타데실글리세로-3-PFA(B-PFA), 1-O-옥타데실-2-O-메틸글리세로-3-PFA(MB-PFA), 1-O-옥타데실-2-O-에틸-글리세로-3-PFA(EB-PFA), 및 본 명세서에서 그의 전체 내용을 참고문헌으로 인용하고 있는 미국 특허 제5,194,654호, 제5,411,947호, 제5,463,092호, 제5,696,277호, 제5,744,461호 및 제6,002,029호에; 및 미국 특허 출원 일련번호 제08/487,081호 및 제08/986,881호에 기재된 화합물을 들 수 있다.
바람직한 지질은 치환된 글리세롤, 프로판디올, 부탄디올, 및 에탄디올기를 포함한다. 특히 바람직한 지질은 글리세롤 성분을 포함한다.
본 발명의 바람직한 지질 유사체는 하기 화학식을 갖는다:
상기 식 중, R1은 O(C18알킬)이고, R1' 및 R2'은 각각 -H이고, R2는 -OH, -O메틸, 또는 -O에틸이고(이 때 얻어진 유사체는 각각 B-PFA, MB-PFA 또는 EB-PFA를 말함), Y는 생리학적으로 허용되는 양이온, 예를 들면 Na+, K+, NH4 +, 등이다.
본 발명의 방법은 예를 들면 HIV-1 등과 같은 레트로바이러스에 의해 야기된 감염의 치료에 특히 효과적이다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명의 방법은 예를 들면, HIV-1과 같은 포유동물 면역결핍 바이러스에 의해 야기된 감염을 치료하는데 유용하다. 본 발명의 방법은 역전사효소(RT)의 억제제(들)에 대해 내성으로 된 HIV-1의 변이주에 의해 야기된 감염의 치료에 특히 효과적이다. RT 억제제의 예로는 뉴클레오시드 유사체인 지도부딘(AZT), 디다노신(ddI), 잘시타빈(ddC), 라미부딘(3TC), 스타부딘(d4T), 에미리빈(FTC), 아바카비르 등, 뿐만 아니라 비뉴클레오시드 유사체, 예를 들면 네비라핀, 델라비르딘, 에파비렌즈 등을 들 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 예를 들면 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르, 아게네라제, DMP-450 등과 같은 프로테아제 억제제에 대한 내성을 갖게 된 HIV-1 변이주에 의해 야기된 감염의 치료에 유용할 수도 있다.
포스포노포르메이트의 지질 유사체 유효량을 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 바이러스 감염에 의해 야기된 병리학적 상태를 예방 또는 치료하기 위한 방법이 본 발명에 의해 추가로 제공된다.
HIV 변이주를 본 발명의 PFA 화합물에 민감하게 하는 돌연변이를 위해 선택되는, 포스포노포르메이트의 지질 유사체 유효량을 예를 들면 지도부딘(AZT, 아지도데옥시티미딘)과 같은 HIV 역전사효소 억제제와 함께 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 바이러스 감염의 치료 방법이 또한 본 발명에 의해 추가로 제공된다. 거꾸로 말하면, 본 발명의 화합물은 AZT 내성을 뒤집거나 또는 감소시키는 HIV RT 돌연변이를 위해 선택된다.
본 명세서에서 설명된 지질 유사체는 경구적으로 생체내이용가능한 것으로 나타나 있다(비들 등,Antiviral Chem. Chemo.,19989:33-40). HIV의 약물내성 균주로 감염된 AIDS 환자는 바람직하게는 본 명세서에서 설명된 지질 유사체의 경구 투여에 의해 치료될 수 있다. 따라서, 본 발명의 화합물은 예를 들면, 정제, 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 흡입된 액체 또는 고체 입자, 미세캡슐화 입자 형태로 다양한 방식으로, 스프레이로서, 경피 패치와 같은 기구에 의해 피부를 통해, 예를 들면 좌약 등의 형태로 직장으로 투여될 수 있다. 본 발명의 호지성 유도체는 경피 흡수 투여 및 전달 시스템에 특히 적합하며, 또한 치약 중에 사용될 수도 있다. 투여는 또한 정맥내, 피하, 복강내, 조 투여 등을 위한 주사용 용액의형태로 비경구적으로 행해질 수 있다.
본 발명의 실행에 사용된 제약학상 담체 또는 희석제는 종래의 고체 또는 액체 담체일 수 있다. 고체 담체의 예는 락토스, 슈크로스, 활석, 젤라틴, 한천, 펙틴, 아라비아고무, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 셀룰로스의 저급 알킬 에테르이다. 액체 담체의 예는 시럽, 낙화생유, 올리브유, 인지질, 지방산, 지방산 아민, 폴리옥시에틸렌 또는 물이다. 담체 또는 희석제로는 단독의 또는 물과 혼합된 글리세릴 모노스테아레이트 또는 디스테아레이트와 같이, 당 업계에 공지된 임의의 서방형 물질을 들 수 있다.
고체 담체가 경구 투여에 사용된 경우, 제제는 정제화되거나 분말 또는 펠릿 형태로 경질 젤라틴 캡슐 중에 넣어질 수 있다. 고상 담체의 양은 광범위하게 변하게 되지만, 일반적으로는 약 25 mg 내지 약 1 gm이게 된다. 액체 담체가 사용되는 경우, 제제는 시럽, 에멀젼, 연질 젤라틴 캡슐, 무균 주사용 액체, 예를 들면 수성 또는 비수성 액체 현탁액 또는 용액 등의 형태일 수 있다.
정제는 활성 성분(즉, 1종 이상의 본 발명의 화합물)을 제약학상 불활성 무기 또는 유기 담체, 희석제 및(또는) 부형제와 혼합하여 제조한다. 정제의 제조에 사용될 수 있는 상기 부형제의 예로는 락토스, 옥수수 전분 또는 그의 유도체, 활성, 스테아르산 또는 그의 염을 들 수 있다. 젤라틴 캡슐에 적합한 부형제의 예로는 식물성유, 왁스, 지방, 반고상물 및 액체 폴리올을 들 수 있다. 지질 유사체는 또한 미세캡슐화 형태로 제조될 수도 있다.
비강내 투여의 경우, 제제는 에어로졸 적용을 위하여, 액체 담체, 특히 수성담체 중에 용해되거나 또는 현탁된 본 발명의 화합물을 함유할 수 있다. 담체는 용해제, 예를 들면 프로필렌 글리콜, 계면활성제, 흡수 증강제, 예를 들면 레시틴 또는 시클로덱스트린 또는 방부제를 함유할 수 있다.
본 발명은 제약학상 허용되는 무균 수성 또는 비수성 액체, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 뿐만 아니라 비경구 주사를 사용하기 직전에 무균 주사용 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 무균 분말을 함유하기 위한 제약 조성물의 사용을 포함한다. 본 발명의 화합물을 함유하는 제약학상 제제는 종래의 기술에 의해, 예를 들면 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences, 1985)에 기재되어 있는 바와 같이 제조될 수 있다.
용액 및 시럽의 제조에 적합한 부형제로는 물, 폴리올, 슈크로스, 전화당, 글루코스, 리포좀 등을 들 수 있다. 주사용 용액의 제조에 적합한 부형제는 물, 알콜, 폴리올, 글리세롤, 식물성유 등이다.
제약학상 생성물은 예를 들면 방부제, 용해제, 안정제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 향미제, 완충제, 코팅제, 항산화제, 희석제 등과 같은 임의의 각종 첨가된 성분들을 추가로 함유할 수 있다.
임의적으로, 본 발명은 또한 상이한 활성을 나태나는 1종 이상의 화합물, 예를 들면 항생제 또는 다른 제약학상 활성 물질과 함께 본 명세서에서 설명된 지질 유사체를 함유하는 제약 조성물도 포함한다. 상기 혼합물 및 그의 용도는 본 발명의 영역 내에 속한다.
본 발명의 지질 유사체에 적용되는 용어 "유효량"은 상기한 바이러스 감염과관련된 장애를 예방하거나 또는 뒤집게되는 양이다. "유효량"은 항바이러스 모 화합물의 권장 투여량에 기준하여 결정된다. 선택된 투여량은 선택된 화합물의 활성, 투여 경로, 치료하고자 하는 질병의 심각성, 및 치료하고자 하는 환자의 상태 및 이전의 병력에 따라 변하게 된다. 그러나, 원하는 치료 효과를 달성하는데 필요한 것보다 더 낮은 수준의 화합물(들)의 투여량으로 시작하여 바람직한 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당 업계의 일반적인 기술이다. 경우에 따라, 유효 1일 투여량을 예를 들면 1일 당 2 내지 4회 투여와 같은 투여를 위한 목적으로 다수회의 투여량으로 나눌 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 구체적인 투여량은 체중, 일반적인 건강상태, 음식물, 시간 및 투여 경로 및 다른 약물의 병용 및 치료하고자 하는 질환의 심각성을 포함하여, 다양한 인자에 의존하게 됨을 알 수 있을 것이다.
일반적으로, 본 발명의 화합물은 활성 성분 1% 내지 100%를 포함하는 단위 투여 형태로 투약된다. 치료 투여량 범위는 환자, 예를 들면 사람에게 약물로서 투여할 때 약 0.01 내지 약 1,000 mg/kg/일이고, 약 0.10 mg/kg/일 내지 100 mg/kg/일이 바람직하다. 본 발명의 제약 조성물 중의 활성 성분의 실제 투여량은 특정 환자에 바람직한 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 화합물(들)의 양을 투여하도록 변화될 수 있다.
본 발명을 이제 하기하는 비제한적인 실시예를 참고로 하여 보다 상세하게 설명하고자 한다.
화학물질. 하기 화합물을 앞에서 보고한 바와 같이 5 mM 리포좀 제제로 제조하였다(호스테틀러 등,Antiviral Chemistry and Chemotherapy 11:213-220; 및 키니 등,Antiviral Research 36:43-53 참조): 1-O-옥타데실-sn-글리세로-3-PFA(B-PFA), 1-O-옥타데실-프로판디올-3-PFA(DB-PFA), 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-PFA(MB-PFA) 및 1-O-옥타데실-2-O-에틸-sn-글리세로-3-PFA(EB-PFA). 화합물을 4℃에서 저장하고 사용하기 직전에 37℃로 가온시켰다. 3'-아지도-3'-데옥시티미딘(AZT) 및 포스포노포르메이트(PFA)를 미국 미저리주 세인트루이스 소재의 시그마 케미칼 캄파니(Sigma Chemical Company)로부터 구입하였다. AZT 및 PFA를 각각 DMSO 및 무균수 중에서 10 또는 30 mM 원액으로 제조하여 -20℃에서 저장하였다. 사용 직전에 화합물을 37℃로 가온시키고 RPMI 1640 배지 중에서 원하는 농도로 희석시켰다.
세포. MT-2 세포(AIDS Research and Reference Reagent Program, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health)를 10% 태내 소 혈청[FBS; 미국 캔사스주 레넥사 소재 제이알에이치 바이오사이언스즈(JRH Biosciences)], 10 mM HEPES 완충제, 50 IU/ml 페니실린 및 50 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640 중에 유지시켰다.
바이러스. MT-2 세포(1.3 x 107세포)를 HIV-1LAI의 프로바이러스 클론을 코딩하는 플라스미드 DNA 5-10 ㎍으로 일렉트로포레이팅(electroporating)시켜[바이오라드 진 펄서(BIORAD Gene Pulser)(등록상표), 미국 캘리포니아주헤르클레스(Hercules)] 균주 바이러스를 제조하였다[느구옌 등,Antimicrob. Agents Chemother. 38:2409-2414; 및 페덴(Peden) 등,Virology 185:661-672 참조]. 최대 세포변성 효과에서(일반적으로 트랜스펙션후 5-7일) 배양물 상징액을 수확하여 -80℃에서 저장하였다. MT-2 세포에서 행한 3배 종말점 희석 검정시험(각 희석 당 6개의 웰)으로 바이러스 감염가를 구하였다. 리드(Reed) 및 뮤엔치 (Muench) 방정식을 사용하여 50% 조직 배양액 감염량(TCID50)을 계산하였다(리드 등,Am. J. Hyg. 27:493 -496 참조).
항바이러스 감수성 검정시험. MT-2 세포를 0.01 TCID50/세포의 감염 다중도(MOI)로 HIV-1LAI로 접종한 후 일련의 3배의 약물 희석액(각 희석 당 3개의 웰) 존재하여 인큐베이션시켜 각 화합물의 항바이러스 활성을 구하였다(멜러스 등,Antimicrob. Agents Chemother.39:1087-1092 참조). 감염후 5 또는 7일에 배양물 상징액을 수확하여, 0.5% 트리톤-X 100으로 용해시키고 시판되는 ELISA 분석[미국 델라웨어주 웰밍톤 소재 듀퐁(DuPont), 엔이엔 프로덕츠(NEN Products)]을 사용하여 p24 항원 농도에 대하여 검정시험하였다. 화합물의 항바이러스 활성은 IC50으로 표현되는데, 이것은 p24 항원 생성의 50%를 억제하는데 필요한 농도이다. 시험 바이러스의 IC50을 HIV-1LAI대조용 바이러스의 IC50으로 나누어 시험 바이러스의 내성 배수(fold-resistance)를 계산하였다.
내성 바이러스의 선택. 1.0 x 106MT-2 세포를 0.1의 MOI로 화합물 부재하에서 MT-2 세포에서 무세포 바이러스로서 10회 계대접종한 플라스미드 유래 HIV-1LAI로 접종시켜 선택을 개시하였다[바즈미(Bazmi) 등,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44:1783-1788 참조]. 세포를 바이러스로 접종하기 전에 2시간 동안 약물로 전처리하였다. 각 선택의 경우, 출발 농도는 화합물의 IC50이었고, 선택 압력(즉, 약물 농도)을 매 3회 계대접종마다 2배로 하였다. 바이러스 세포변성 효과(CPE)를 매일 모니터하였다. 2+CPE(100x필드 당 ≥2 신시티움)에서 무세포 바이러스 상징액을 수확하여 새로운 MT-2 세포 중에서 새로운 감염 사이클을 개시시키는데 사용하였다. 계대접종되지 않은 HIV-1LAI에 대한 EC50을 측정함으로써 계대접종된 바이러스를 화합물에 대한 감수성의 감소에 대하여 규칙적으로 모니터하였다(멜러스 등,Antimicrob. Agents Chemother.39:1087-1092).
유전자 분석. 배양물 상징액으로부터 25,000 x g에서 1시간 동안 원심분리시켜 비리온을 펠릿화시켰다. 전체 RNA를 트리졸(TRIZOL)(등록상표) 약제[미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재 지브코 비알엘(Gibco BRL)]를 사용하여 바이러스 펠릿으로부터 추출하여 디에틸 피로카보네이트 처리된 무균수 중에 재현탁시켰다. cDNA 합성 후, RT의 전체 길이 코딩 영역을 PCR을 사용하여 증폭시켰다(바즈미 등,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44:1783-1788 참조). 이어서 벌크 PCR 생성물을 상업적으로 입수할 수 있는 키트[위자드(Wizard)(등록상표) PCR 정제 시스템, 미국 위스콘신주 매디슨의 프로메가(Promega)]를 사용하여 정제하고 자동 서열화기[미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재의 피이 바이오사이언스즈 (PEBiosciences)]를 사용하여 서열화하였다.
재조합 HIV-1 돌연변이주의 생성. 원하는 돌연변이를 함유하는 HIV-1을 앞에서 설명한 바와 같이(멜러스 등,Molecular Pharm. 41:446-451) 올리고뉴클레오티드 유래 돌연변이유발[Altered Sites II, 프로메가]로 생성시켰다. 돌연변이유발 후, RT 돌연변이주를 RT의 5' 및 3' 단부에 위치하는 잠재성 Xmal 및 Xbal 제한 부위를 사용하여 pxxHIV-1LAI클로닝 벡터 내로 서브클로닝시켰다. 클론을 DNA 서열화하여 원하는 돌연변이(들)가 존재하는 지를 입증하고 상기한 바와 같이 MT-2 세포 내로 일렉트로포레이팅시켜 감염성 재조합 HIV-1 돌연변이주를 생성시켰다.
재조합 HIV-1의 생성을 본 명세서에서 참고문헌으로 인용한 멜러스 등 및 느구옌 등의 인용된 참고문헌에 설명되어 있는 바와 같이 수행하였다.
RT 돌연변이주를 올리고뉴클레오티드 유래 돌연변이유발을 통해 생성시키고 pXXHIV-1LAI 클로닝 벡터 내로 연결시켰다. pXXHIV-1LAI RT의 5' 및 3' 단부의 2개의 잠재성 제한 부위(각각 Xmal 및 Xbal)의 존재에 의해 클로닝이 용이하게 되었다. MT-2 세포를 돌연변이된 pXXHIV-1LAI 클론으로 일렉트로포레이팅시켜 감염성 재조합 HIV-1 돌연변이주를 생성시켰다. 원하는 돌연변이의 존재는 DNA 서열화에 의해 입증되었다.
다중-약물내성 HIV-1 균주인 11163p1 및 11588p1은 나타낸 RT 돌연변이를 갖는 사람의 임상학적 단리물이다. 본 발명의 지질 유사체로 처리된 HIV-1 균주로는 야생형, 예를 들면 xxLAI 등, 단일 돌연변이, 예를 들면 xxLAI M184V(3TC에 대한내성), xxLAI L74V(ddI 및 ddC에 대한 내성), xxLAI K65R(ddI, ddC, DAPD, DXG, 테노포비르 및 아데포비르에 대한 내성), xxLAI T215Y(AZT에 대한 내성) 등, 이중 돌연변이, 예를 들면 xxLAI M41L/T215Y(AZT에 대한 내성), xxLAI M184V/T215Y(3TC 및 AZT에 대한 내성) 등, 및 다중 돌연변이, 예를 들면 xxLAI 4XAZT((D67N, K70R, T215Y K219Q) AZT에 대한 내성), xxLAI 4XAZT/M184V((D67N, K70R, M184V, T215Y K219Q) AZT 및 3TC에 대한 내성), xxLAI M5456-12(AZT+NNRTI 내성: D67N, K70R, K103N, T215Y), xxLAI G2-3g(AZT/3TC 공내성: M41L, D67N, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y, I293V, E297A), 11163(멀티뉴클레오시드 내성 바이러스: M41L, A62V, V75I, F77L, K103N, F116Y, Q151M, Y181C, M184V), 11588(멀티뉴클레오시드 내성 바이러스: A62V, K65R, K70R, V75I, F77L, F116Y, Q151M, M184V, K219Q) 등을 들 수 있다.
PFA 및 PFA의 지질 유사체에 대한 시험관내 선택도 지수를 MT-2 세포에서 구하였는데, 다음과 같았다:
화합물 선택도 지수
PFA(포스카르넷)137
B-PFA781
MB-PFA953
EB-PFA1905
선택도 지수((50% 세포독성 투여량/50% 유효 투여량) x 100)가 PFA 그자체보다 PFA의 지질 유사체의 경우 훨씬 더 큰 것에 주목해야 한다. 지질 유사체는 PFA보다 훨씬 더 큰 경구 흡수를 갖기 때문에, 이들은 단독으로 또는 1종 이상의 항바이러스제와 함께 약물내성 HIV의 복제를 억제하기 위하여 경구로 제공될 수 있다. AZT가 PFA의 지질 유사체와의 혼합물로 특히 바람직하다.
실시예 1
야생형(xxLAI)으로 또는 상기 열거한 약물내성 HIV-1 균주로 감염된 MT-2 세포의 배양물을 PFA의 지질 유사체(B-PFA, MB-PFA 또는 EB-PFA)로 처리하였다. HIV의 약물내성 균주 복제의 50% 억제를 생성시키는데 필요한 μM 농도(EC50)를 표 1에 나타낸 바와 같이 구하였다. 배지 중의 p24(바이러스 단백질)를 검정시험하여 약물 효과를 측정하였다.
약물내성 HIV-1 균주 패널에 대한 B-PFA, MB-PFA 및 EB-PFA의 항바이러스 활성
바이러스 EC50, μM
PFA B-PFA MB-PFA EB-PFA
HIV-1LAI(대조물) 18.3 1.9 0.35 0.22
K65R 57.3 17.7 1.24 3.22
L74V 37.4 4.25 0.52 1.34
M184V 15.7 2.29 0.48 0.58
T215Y nd 0.84 0.27 0.14
M41L/T215Y 16.2 1.25 0.13 0.41
M184V/T215Y nd 1.49 0.54 0.48
4xAZT 8.82 1.25 0.46 0.33
AZT/K103N 18.6 2.72 0.50 0.80
4xAZT/M184V 15.7 2.29 0.48 0.58
G2-3g 7.6 1.47 0.26 0.32
* p24 감소 검정시험을 0.01의 MOI로 감염된 MT-2 세포 중에서 행하였다. nd=구할 수 없음. 바이러스 돌연변이 약칭: 표준 아미노산 문자 코드에 이어 돌연변이가 일어난 HIV RT의 위치를 쓰고, 그 다음에 아미노산 치환의 문자 코드를 써서 단일 또는 이중 돌연변이를 나타낸다; 다중 돌연변이를 갖는 다수개의 바이러스 균주의 경우, 4xAZT=D67N, K70R, T215Y, K219Q; G2-3g=M41L, D67N, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T214Y, I293V, E297V.
약물내성 HIV-1 바이러스 패널에 대하여 시험하였을 때, 본 발명의 화합물인B-PFA, MB-PFA 및 EB-PFA 모두는 포스카르넷(PFA)의 값보다 상당히 더 낮은 항바이러스 EC50값을 보유하였다. K65R을 제외하고는, ODG-PFA는 단일, 이중 및 다중 돌연변이를 갖는 HIV의 균주에서 0.84 내지 4.25 μM 대 7.6 내지 37.4 μM 범위의 EC50값을 가졌다. MB-PFA 및 EB-PFA는 일반적으로 EC50값이 < 1 μM 범위로 약물내성 HIV에서 매우 활성이었다. 희귀한 ddI 내성 돌연변이주인 K65R에서는, 야생형에 비하여 낮은 수준의 내성(3.5 대 14.6배)이 주목되었다. 대부분의 약물내성 HIV 균주(표 1)를 0.01의 감염 다중도(MOI)로 연구하였음을 주목해야 한다.
실시예 2
다중 약물내성 균주를 5배 더 큰 0.05의 MOI로 시험하였고, 그 결과를 표 2에 나타낸다.
다중 약물내성 HIV-1 균주에 대한 B-PFA, MB-PFA 및 EB-PFA의 항바이러스 활성
바이러스 EC50, μM
PFA B-PFA MB-PFA EB-PFA
HIV-1LAI(대조물) 20.1 3.01 1.04 0.76
11163p1 24.4 3.48 1.95 1.23
11588p1 23.5 9.31 1.16 0.73
* p24 감소 검정시험을 0.05의 MOI로 감염된 MT-2 세포 중에서 행하였다. 약칭은 표 1에서와 같다. 다중 약물내성 HIV-1 중에 존재하는 RT의 돌연변이: 11163p1=M41L, A62V, V75I, F77L, K103N, F116Y, Q151M, Y181C, M184V;11588p1=A62V, K65R, K70R, V75I, F77L, F116Y, Q151M, M184V, K219Q.
상기에서 나타낸 바와 같이, MB-PFA 및 EB-PFA는 5배 더 높은 감염 다중도에서 조차도 다중 약물내성 HIV-1 균주, 임상학적 단리물 11163p1 및 11588p1에서 조차도 EC50값이 0.73 내지 1.95 μM 범위 내로 매우 활성이었다.
3개의 본 발명의 화합물의 NRTI 내성 HIV-1 변이주 패널에 대한 활성도 또한 평가하였다(실시예 3-5 참조). NRTI 내성 패널은 수많은 NRTIs에 대한 내성을 부여하는 돌연변이를 함유하는 HIV-1LAI유래 재조합 바이러스로 이루어졌으며, 다수개의 NRTIs에 대해 내성인 수 개의 변이주를 포함하였다(표 3-5).
실시예 3
PFA 본 발명의 화합물에 대한 NRTI 내성 HIV-1의 감수성
HIV-1 변이주d EC50 a,b(μM) (내성 배수)c
B-PFA MB-PFA EB-PFA 유리 PFA
야생형 1.79±0.81 0.50±0.48 0.65±0.36 17.66±10.12
K65R(3.8) 14.68±6.61(8.2) 1.66±0.72(3.3) 2.91±1.30(4.5) 67.0±22.79
L74V(1.9) 4.45±2.26(2.5) 0.88±0.63(1.8) 1.21±0.85(1.9) 32.7±9.00
M184V(1.7) 1.93±0.54(0.7) 1.51±0.45(1.7) 1.36±0.93(0.7) 33.4±18.7
a MT-2 세포에서 p24 항원 생성의 억제를 측정하여 구한 EC50값b 3개 이상의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차c 야생형 바이러스에 대한 내성 배수d 표시한 내성 돌연변이를 코딩하는 HIV-1LAI
시험한 바이러스 중, 단지 K65R(ddI/DXG 내성)을 함유하는 것만이 본 발명의 화합물, 뿐만 아니라 개질되지 않은(유리) PFA에 대한 상당한 내성을 입증하였고, 내성 배수 값은 3.3-8.2(1.66-14.68 μM의 EC50) 범위이다. 3TC 및 ddI/ddC 내성 바이러스(각각 M184V 및 L74V 내성 돌연변이를 함유)는 PFA 본 발명의 화합물 및 개질되지 않은 PFA 모두에 대하여 민감하였다(내성 배수 < 3.0)(표 3).
실시예 4
본 발명의 화합물을 또한 표 4에 나타낸 바와 같이, 3개의 멀티뉴클레오시드 내성(MNR) 바이러스 패널에 대하여 평가하였다.
PFA 본 발명의 화합물에 대한 멀티뉴클레오시드 내성 HIV-1의 감수성
HIV-1 변이주 EC50 a,b(μM) (내성 배수)c
B-PFA MB-PFA EB-PFA 유리 PFA
HIV-1LAI d 1.8±0.81 0.5±0.48 0.7±0.36 17.7±10.12
NL4-3d 2.6±1.5 2.3±1.9 0.2±0.2 15.1±6.1
11163p3e 1.1±0.53(0.6) 0.4±0.28(0.9) 0.5±0.06(0.8) 15.5±5.04(0.9)
Kf 4.2(1.6) 2.0±0.6(0.87) 0.9±0.7(4.5) 21.4±15.6(0.7)
9GCg 4.1±1.2(1.6) 2.3±0.5(0) 0.2±0.3(0) 13.2±12.8(1.1)
a MT-2 세포에서 p24 항원 생성의 억제를 측정하여 구한 EC50값b 2개 또는 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차c 야생형 바이러스에 대한 내성 배수d 야생형 바이러스e 돌연변이 A62V, V75I, F77L, K103N, F116Y, Q151M, Y181C, M184V를 갖는 멀티뉴클레오시드 내성 임상학적 단리물f 돌연변이 V75I, F77L, F116Y, Q151M을 갖는 멀티뉴클레오시드 내성 재조합 바이러스g 돌연변이 D67E, S68T, T69S[SA 삽입물], T215Y를 갖는 멀티뉴클레오시드 내성 재조합 바이러스
MNR 패널은 돌연변이 V75I, F77L, F116Y 및 Q151M을 함유하는 바이러스, T69S[SA 삽입물]를 함유하는 바이러스, 및 전통적인 MNR 유전자형 (62V/75I/77L/116Y/ 151M)을 갖는 임상학적 단리물로 이루어졌다. PFA 본 발명의 화합물 각각은 이들 바이러스에 대한 효능을 보유하였고, 내성 배수 값은 <2이다. 이것에 대한 유일한 예외는 EB-PFA에 대한 4.5배 내성을 나타낸 75I/77L/116Y/151M을 함유하는 바이러스이었다.
실시예 5
AZT 내성 바이러스는 2중(M41L/T215Y) 및 4중 돌연변이(D67N, K70R, T215Y,K219Q)를 갖는 HIV-1LAI유래 재조합체로 이루어졌다(표 5). 이들 AZT 내성 바이러스는 본 발명의 화합물 및 개질되지 않은 PFA에 대해 감수성이었다.
PFA 본 발명의 화합물에 대한 AZT 내성 HIV-1의 감수성
HIV-1 변이주d EC50 a,b(μM) (내성 배수)c
B-PFA MB-PFA EB-PFA 유리 PFA
야생형 1.79±0.81 0.50±0.48 0.65±0.36 17.66±10.12
M41L/T215Y 0.94±1.08(0.5) 0.18±0.11(0.4) 0.30±0.35(0.5) 13.86±4.14(0.8)
4XAZTe 1.47±0.63(0.8) 0.58±0.22(1.2) 0.34±0.24(0.5) 12.7±8.07(0.7)
4XAZT/M184V 2.29±1.59(1.3) 0.59±0.36(1.2) 0.56±0.08(0.9) 22.74±15.81(1.3)
4XAZT/K103N 3.87±2.36(2.2) 0.60±0.38(1.2) 0.88±0.14(1.4) 19.22±8.85(1.1)
G2-3gf 1.67±0.95(0.9) 0.40±0.26(0.8) 0.30±0.04(0.5) 8.85±3.49(0.5)
a MT-2 세포에서 p24 항원 생성의 억제를 측정하여 구한 EC50값b 3개 이상의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차c 야생형 바이러스에 대한 내성 배수d 표시한 내성 돌연변이를 코딩하는 HIV-1LAIe 4XAZT=D67N, K70R, T215Y, K219Qf AZT 및 3TC에 대해 공내성인 분자적으로 클로닝된 단리물; M41L, D67N, M184V, H208Y, L210W, R211K, L214F, T215Y, 1293V, E297A
M41L 및 T215Y 돌연변이를 함유하는 바이러스는 일관적으로 야생형 바이러스와 비교하여 각각의 본 발명의 화합물에 대한 증가된 감수성을 나타냈다: EC50의 배수 변화는 0.4 내지 0.53 범위이었다(0.18 내지 0.94 μM의 EC50값). 4중 AZT 내성 돌연변이 및 3TC 내성 돌연변이 M184V(HIV4XAZT/M184V) 또는 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI) 돌연변이 K103N(HIV4XAZT/K103N)을 모두 함유하는 바이러스도 또한 본 발명의 화합물에 대한 감수성을 나타냈다(내성 배수<3.0). 추가로, AZT 및 3TC에 대해 공내성인 분자적으로 클로닝된 임상학적 단리물(G2-3g)은 각 화합물에 대하여민감하였고, 내성 배수 값은 <1.0이다(0.30 내지 1.67 μM의 EC50값).
실시예 6
본 발명의 화합물에 대해 내성인 바이러스를 표 6에 나타낸 바와 같이 증가하는 농도의 본 발명의 화합물 존재하에 MT-2 세포 중에서 HIV-1LAI의 일련의 계대접종으로 시험관내 선택하였다.
시험관내 선택된 본 발명 화합물 내성인 HIV-1의 변화된 감수성 및 돌연변이
화합물 바이러스 계대접종 EC50 a 내성 배수b 코오돈 Δc AA Δc
DB-PFA 018 0.838.97 -10.8 TCA→ACACTT→TTT S117TL214F
MB-PFA 015 0.072.16 -30.9 GTA→TTAATG→ATACTT→TTT V75LM164IL214F
EB-PFA 015 0.093.70 -41.1 TGG→GGGCTT→TTT W88GL214F
PFA 01715 5.27122.3122.2 -23.223.2 TGG→GGGTCA→ACA W88GS117T
a MT-2 세포에서 p24 항원 생성의 억제를 측정하여 구한 EC50값b 기준 바이러스에 대한 내성 배수(HIV-1LAI계대접종 0)c 기준 바이러스에 대한 변화(HIV-1LAI계대접종 0)
무세포 바이러스 계대접종 15 라운드 후에 MB-PFA에 대해 27배 내성을 나타낸 바이러스를 단리하였다. MB-PFA 내성 바이러스로부터 RT 유전자(아미노산(AA) 1 내지 350)의 DNA 서열화는 3개의 돌연변이를 확인하였다: V75L, M164I 및 L214F. V75L, M164I 및 L214F 돌연변이를 코딩하는 재조합 바이러스를 구성하여 MB-PFA에대한 감수성을 시험하였다. M164I 및 L214F를 모두 함유하는 바이러스는 9.3배 내성을 나타냈다(EC50=8.1 μM). V75L 돌연변이 단독, 또는 M164I 또는 L214F와의 병용은 MB-PFA에 대한 상당한(<3배) 내성을 야기시키지 못하였다. MB-PFA 내성 바이러스의 선택을 반복하였다; 15 계대접종 후, 선택된 바이러스는 31배 MB-PFA 내성을 나타냈고, M164I 및 L214 돌연변이를 코딩하였지만, V75L 돌연변이는 코딩하지 못하였다.
DB-PFA에 대해 10.8배 내성을 나타내는 바이러스를 무세포 계대접종의 18 라운드 후에 단리하였다. DNA 서열화는 RT에서 2개의 돌연변이를 확인하였다: S117T 및 L214F. S117T를 코딩하는 재조합 바이러스는 DB-PFA에 대한 10.0배 내성을 입증하였다(EC50=9.0 μM). S117T를 코딩하는 바이러스에 L124F 돌연변이의 첨가는 DB-PFA 내성 수준을 증가시키지 못하였다(9.7배).
EB-PFA에 대해 41배 내성을 나타내고 W88G 및 L214F 돌연변이를 갖는 바이러스를 무세포 계대접종의 15 라운드 후에 단리하였다. W88G 돌연변이를 코딩하는 재조합 바이러스는 9.4배 내성을 나타냈고, 이것은 L214F 돌연변이를 첨가하였을 때 15.5배 내성(EC50=9.1 μM)으로 증가하였다. 15 계대접종 후에 두번째로 EB-PFA 내성 바이러스를 선택하였다. 이 바이러스는 또한 돌연변이 W88G 및 L214F를 함유하였다.
본 발명의 화합물 선택을 위한 대조물로서, HIV-1LAI를 개질되지 않은 PFA 존재 및 부재 하에 계대접종시켰다. PFA에 대한 23배 내성을 나타내는 바이러스를 2개의 독립적인 선택으로 무세포 계대접종 15 및 17 사이클 후에 선택하였다. 이들 PFA 내성 바이러스로부터 RT의 DNA 서열 분석은 RT 중에 1개의 돌연변이를 확인하였다: W88G(제1 선택) 및 S117T(제2 선택). W88G 및 S117T 돌연변이를 갖는 재조합 바이러스는 각각 PFA에 대한 6.2배 및 4.7배 내성을 나타냈다. 본 발명의 화합물에 의해 또는 유리 PFA에 의해 선택된 돌연변이는 모두 약물의 부재 하에 계대접종된 대조용 바이러스에서는 검출되지 않았다.
실시예 7
본 발명의 화합물을 또한 표 7에 나타낸 바와 같이 PFA 및 PFA 본 발명의 화합물에 대해 내성인 HIV-1LAI유래 재조합체 패널에 대하여 평가하였다.
PFA 및 PFA/AZT 내성 HIV-1의 본 발명의 화합물 감수성
HIV-1 변이주d EC50 a,b(μM) (내성 배수)c
B-PFA MB-PFA EB-PFA 유리 PFA
야생형 1.74±0.79 0.77±0.33 0.90±0.73 13.06±5.59
W88G(11.7) >30(>17.2) 5.88±4.42(7.6) 6.8±0.64(7.6) 152.24±14.28
W88S 20.7±1.20(11.9) 2.49±0.12(3.2) 2.39±0.15(2.7) 67.09±6.76(5.1)
E89G >30(>17.2) >30(>39.0) >26.11(>29.0) 241.25±54.1(18.5)
E89K >30(>17.2) 7.21±0.12(9.4) 5.21±0.16(5.8) 90.2±46.24(6.9)
Q161L >30(>17.2) 8.78±1.58(11.4) 6.73±0.04(7.5) 114.6±14.14(8.8)
Q161L/H208Y >30(>17.2) 12.84±9.00(17.7) 7.02±1.82(7.8) 126.4±33.09(9.7)
4XAZTe 1.47±0.63(0.8) 0.58±0.22(1.2) 0.34±0.24(0.5) 12.7±8.07(0.7)
4XAZTW88G 16.37±6.1(6.2) 2.46±0.11(2.9) 3.31±1.30(4.2) 86.2±12.16(4.9)
4XAZT/W88S 4.09±1.84(1.6) 1.54±0.81(1.8) 1.51±0.21(1.9) 18.44±10.40(1.0)
4XAZTE89K(7.6) 17.39±14.9(6.6) 9.28±9.20(11.1) 4.39±4.59(5.6) 133.75±122.72
4XAZTQ161L 6.64±2.10(2.5) 1.87±0.33(2.2) 1.18±0.61(1.5) 39.93±9.40(2.3)
4XAZTQ161L/H208Y 6.2±0.85(2.4) 2.3±0.14(2.7) 2.02±0.54(2.6) 43.13±17.50(2.4)
a MT-2 세포에서 p24 항원 생성의 억제를 측정하여 구한 EC50값b 3개 이상의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차c 야생형 바이러스에 대한 내성 배수d 표시한 내성 돌연변이를 코딩하는 HIV-1LAIe 4XAZT=D67N, K70R, T215Y, K219Q
표 7의 데이타를 살펴보면, PFA 내성 바이러스들이 PFA 본 발명의 화합물에 대한 유사한 수준의 내성을 나타냄을 알 수 있다. E89G 돌연변이를 함유하는 바이러스는 화합물에 대하여 가장 덜 민감하였고, 내성 배수 값은 >17.2배 내지 >39.0배 범위이었다. 화합물을 또한 PFA 및 AZT 내성 돌연변이를 모두 함유하는 HIV-1LAI유래 재조합 바이러스 패널에 대해서도 시험하였다. 앞에서와 같이, 바이러스들은 개질되지 않은 PFA 및 PFA 본 발명의 화합물 모두에 대하여 유사한 수준의 교차 내성을 입증하였다. 일반적으로, AZT 내성 돌연변이의 존재는 PFA 본 발명의 화합물에 대한 교차 내성 수준을 감소시켰다. AZT 내성 유전자 배경에서, RT 내 코오돈 89(G 또는 K)에서의 돌연변이는 개질되지 않은 PFA 및 PFA 본 발명의 화합물 모두에 대하여 최대의 내성을 제공하였고, 내성 배수 값은 5.6 내지 11.1 범위이다.
실시예 8
본 발명의 화합물에 의해 선택된 돌연변이를 함유하는 재조합 바이러스를 또한 표 8에 나타낸 바와 같이 AZT에 대한 그들의 감수성에 대하여 평가하였다.
재조합 HIV-1 LAI 돌연변이주의 AZT에 대한 감수성
HIV-1 변이주a AZT EC50 b,c(μM) 내성 배수d
야생형 0.021±0.008
L214F 0.035±0.033 1.7
S117T 0.017±0.007 0.8
S117T/L214F 0.022±0.010 1.1
M164I 0.012±0.004 0.6
M164I/L214F 0.008±0.003 0.4
W88G 0.019±0.013 0.9
W88G/L214F 0.015±0.015 0.7
4XAZTe 0.290±0.114 7.3
S117T/4XAZT 0.040±0.006 1.4
M164I/4XAZT 0.043±0.022 1.1
W88G/4XAZT 0.060±0.018 1.5
a 표시한 내성 돌연변이를 코딩하는 HIV-1LAIb MT-2 세포에서 p24 항원 생성의 억제를 측정하여 구한 EC50값c 3개 이상의 독립적인 실험으로부터의 평균 ± 표준 편차d 야생형 바이러스에 대한 내성 배수e 4XAZT=D67N, K70R, T215Y, K219Q
L214F를 포함하여 본 발명의 화합물에 의해 선택된 돌연변이는 모두 AZT에 대한 민감성을 감소시키지 못하였다. M164I 돌연변이는 AZT 감수성의 증가와 관련되었다(야생형에 비하여 0.6배 내성). PFA 본 발명의 화합물에 의해 선택된 내성을 또한 AZT 내성 배경(D67N/K70R/T215Y/K219Q)에 도입시켜 AZT 내성에 미치는 그들의 효과를 평가하였다. S117T, M164I 및 W88G 돌연변이는 모두 AZT 내성을 7.3배로부터 각각 1.4, 1.1 및 1.5배로 억제시켰다.
비록 본 발명을 명료하게 및 이해시키기 위하여 설명 및 실시예에 의해 상세하게 설명하였지만, 본 발명의 내용에 비추어 특정 변화 및 변형이 특허 청구의 범위의 본질 또는 영역으로부터 벗어나지 않고서 이루어 질 수 있음이 당 업계의 통상의 숙련인들에게는 자명할 것이다.

Claims (21)

  1. 포스포노포르메이트 함유 제약학상 활성 화합물의 지질 유사체 유효량을 약물내성 인체 면역결핍 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 환자의 약물내성 인체 면역결핍 바이러스 감염 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 지질 유사체가 하기 화학식 1로 표시되는 방법.
    <화학식 1>
    상기 식 중,
    R1및 R1'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C24)알킬, -O(C1-C24)알케닐, -S(C1-C24)알킬, -S(C1-C24)알케닐, -O(C1-C24)아실, 또는 -S(C1-C24)아실이고, 이 때 R1및 R1' 중 적어도 하나는 -H가 아니며, 상기 알케닐은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 갖고, 상기 아실은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 가질 수도 있고;
    R2및 R2'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C7)알킬, -O(C1-C7)알케닐, -S(C1-C7)알킬, -S(C1-C7)알케닐, -O(C1-C7)아실, -S(C1-C7)아실, -N(C1-C7)아실, -NH(C1-C7)알킬, -N((C1-C7)알킬)2, 옥소, 할로겐, -NH2, -OH, 또는 -SH이고;
    R3은 그의 카르복실기 또는 그의 포스포네이트기를 통해 임의적인 링커 L 상의 관능기 또는 Cα상의 이용가능한 산소에 연결된 포스포노포르메이트이며, 이 때 R3이 그의 포스포네이트기를 통해 연결될 때에는 상기 포스포노포르메이트의 카르복실레이트기가 하기 화학식을 갖고
    (여기서, Ry는 -H 또는 알킬, 또는 Na+, K+, NH4 +, 또는 임의의 다른 생리학적으로 허용되는 양이온임);
    X는 존재할 경우
    이고;
    L은 존재할 경우, 화학식 -J-(CR2)t-G- (여기서, t는 1 내지 24의 정수이고, J 및 G는 독립적으로 -O-, -S-, -C(O)O-, 또는 -NH-이고, R은 -H, 알킬 또는 알케닐임)의 이관능성 연결 분자이고;
    m은 0 내지 6의 정수이고;
    n은 0 또는 1이다.
  3. 제2항에 있어서, 상기 m이 0, 1 또는 2인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 m이 1인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 R1이 -O(C18)알킬이고, R1'이 H이고, R2가 -OH, -O메틸 또는 -O에틸이고, R2'이 -H이고, Cα상의 R2및 R2'이 각각 -H이고, R3이 포스포노포르메이트이고, n이 0인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 R2가 -OH인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 R2가 -O메틸인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 R2가 -O에틸인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 HIV가 역전사효소의 억제제(들)에 대해 내성인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 역전사효소의 억제제가 뉴클레오시드 유사체인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 유사체가 지도부딘(AZT), 디다노신 (ddI), 잘시타빈(ddC), 라미부딘(3TC), 스타부딘(d4T), 에미리빈(FTC), DAPD, DXG, 테노포비르, 아데포비르 또는 아바카비르인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 유사체가 지도부딘(AZT), 디다노신 (ddI), 잘시타빈(ddC) 또는 라미부딘(3TC)인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 유사체가 지도부딘(AZT)인 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 역전사효소의 억제제가 비뉴클레오시드 유사체인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 비뉴클레오시드 유사체가 네비라핀, 델라비르딘, 또는 에파비렌즈인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 HIV가 프로테아제 억제제에 대해 내성인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 프로테아제 억제제가 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르, 아게네라제, 또는 DMP-450인 방법.
  18. 포스포노포르메이트 함유 제약학상 활성 화합물의 지질 유사체 유효량을 AZT 내성 HIV 균주에 의해 야기된 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, AZT 내성 HIV 균주에 의해 야기된 바이러스 감염 치료 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 지질 유사체가 하기 화학식 1로 표시되는 방법.
    <화학식 1>
    상기 식 중,
    R1및 R1'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C24)알킬, -O(C1-C24)알케닐, -S(C1-C24)알킬, -S(C1-C24)알케닐, -O(C1-C24)아실, 또는 -S(C1-C24)아실이고, 이 때 R1및 R1' 중 적어도 하나는 -H가 아니며, 상기 알케닐은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 갖고, 상기 아실은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 가질 수도 있고;
    R2및 R2'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C7)알킬, -O(C1-C7)알케닐, -S(C1-C7)알킬, -S(C1-C7)알케닐, -O(C1-C7)아실, -S(C1-C7)아실, -N(C1-C7)아실, -NH(C1-C7)알킬, -N((C1-C7)알킬)2, 옥소, 할로겐, -NH2, -OH, 또는 -SH이고;
    R3은 그의 카르복실기 또는 그의 포스포네이트기를 통해 임의적인 링커 L 상의 관능기 또는 Cα상의 이용가능한 산소에 연결된 포스포노포르메이트이며, 이 때 R3이 그의 포스포네이트기를 통해 연결될 때에는 상기 포스포노포르메이트의 카르복실레이트기가 하기 화학식을 갖고
    (여기서, Ry는 -H 또는 알킬, 또는 Na+, K+, NH4 +, 또는 임의의 다른 생리학적으로 허용되는 양이온임);
    X는 존재할 경우
    이고;
    L은 존재할 경우, 화학식 -J-(CR2)t-G- (여기서, t는 1 내지 24의 정수이고, J 및 G는 독립적으로 -O-, -S-, -C(O)O-, 또는 -NH-이고, R은 -H, 알킬 또는 알케닐임)의 이관능성 연결 분자이고;
    m은 0 내지 6의 정수이고;
    n은 0 또는 1이다.
  20. 포스포노포르메이트 함유 제약학상 활성 화합물의 지질 유사체 유효량을 AZT와 함께 바이러스 감염의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 바이러스 감염 치료 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 지질 유사체가 하기 화학식 1로 표시되는 방법.
    <화학식 1>
    상기 식 중,
    R1및 R1'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C24)알킬, -O(C1-C24)알케닐, -S(C1-C24)알킬, -S(C1-C24)알케닐, -O(C1-C24)아실, 또는 -S(C1-C24)아실이고, 이 때 R1및 R1' 중 적어도 하나는 -H가 아니며, 상기 알케닐은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 갖고, 상기 아실은 1 내지 약 6개의 2중 결합을 가질 수도 있고;
    R2및 R2'은 독립적으로 -H, 치환 또는 비치환된 -O(C1-C7)알킬, -O(C1-C7)알케닐, -S(C1-C7)알킬, -S(C1-C7)알케닐, -O(C1-C7)아실, -S(C1-C7)아실, -N(C1-C7)아실, -NH(C1-C7)알킬, -N((C1-C7)알킬)2, 옥소, 할로겐, -NH2, -OH, 또는 -SH이고;
    R3은 그의 카르복실기 또는 그의 포스포네이트기를 통해 임의적인 링커 L 상의 관능기 또는 Cα상의 이용가능한 산소에 연결된 포스포노포르메이트이며, 이 때 R3이 그의 포스포네이트기를 통해 연결될 때에는 상기 포스포노포르메이트의 카르복실레이트기가 하기 화학식을 갖고
    (여기서, Ry는 -H 또는 알킬, 또는 Na+, K+, NH4 +, 또는 임의의 다른 생리학적으로 허용되는 양이온임);
    X는 존재할 경우
    이고;
    L은 존재할 경우, 화학식 -J-(CR2)t-G- (여기서, t는 1 내지 24의 정수이고, J 및 G는 독립적으로 -O-, -S-, -C(O)O-, 또는 -NH-이고, R은 -H, 알킬 또는 알케닐임)의 이관능성 연결 분자이고;
    m은 0 내지 6의 정수이고;
    n은 0 또는 1이다.
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