JPH0783927A - 超微粒子無機蛍光体標識特異的結合物質およびこれを用いた検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】粒径 1ｎｍないし 100ｎｍの超微粒子無機蛍光
体で標識された特異的結合物質。超微粒子無機蛍光体の
組成は、Ｌｎ₂ Ｏ₃ ：Ｒｅ、Ｌｎ₂ Ｏ₂ Ｓ：Ｒｅ、Ｚｎ
Ｏ、ＣａＷＯ₄ 、ＭＯ・ｘＡｌ₂ Ｏ₃ ：Ｅｕ、Ｚｎ₂ Ｓ
ｉＯ₄ ：ＭｎまたはＬａＰＯ₄ ：Ｃｅ，Ｔｂであり、Ｌ
ｎはＬａ、Ｇｄ、ＬｕまたはＹの少なくとも１種、Ｒｅ
はランタニド族元素のうちの少なくとも１種、Ｍはアル
カリ土類金属のうちの少なくとも１種、ｘは 0.5ないし
1.5である。この超微粒子無機蛍光体は、高周波プラズ
マ法を含むガス中蒸発法、スパッタリング法、ガラス結
晶化法、ゾル−ゲル法、水熱合成法を含む沈殿法または
スプレー法により調製される。 【効果】定量的な測定が可能であり、電子線、紫外線等
の照射下や保存時の劣化が少なく、十分な発光効率を有
する。また、 1μｍ以下の分解能で被測定物質の検出を
行なうことができ、複数の異なる被測定物質を同時に検
出することも可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は超微粒子無機蛍光体標
識特異的結合物質およびこれを用いた検出方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】従来より、医学・生物学分野では、ウイ
ルスや酵素の反応の研究あるいは臨床検査に、有機物分
子からなる蛍光物質を標識として用い、紫外線照射した
ときに発する蛍光を光学顕微鏡あるいは光検出器で測定
する方法がとられている。このような方法としては、例
えば、抗原−抗体蛍光法などがよく知られている。この
方法では、蛍光を発する有機蛍光体が結合した抗体が用
いられる。抗原−抗体反応は、鍵穴−鍵の関係に例えら
れるように非常に選択性が高い。このため、蛍光強度分
布から抗原の位置を知ることができる。

【０００３】ところで、この分野においては、近年、 1
μｍ程度より小さいものを観察し、より精密な抗体分布
を研究したいとする要求が強い。そしてこれを実現する
ためには、電子顕微鏡に頼らざるを得ない状況にある。
電子顕微鏡による観察では、検体の電子線反射率あるい
は透過率の差を利用して像を観察する。このため、電子
顕微鏡で抗体を観察する場合には、現時点では、原子量
の大きい鉄やオスミウムを含む分子、または 1〜 100ｎ
ｍ程度の大きさの金コロイドが抗体の標識として用いら
れている。このような標識を有する抗体の例として、金
コロイドを標識として用いた場合の抗体の模式図を図１
に示す。図１に示すように、抗体3 にはプロテインＡ1
と金コロイド2 との複合体が結合しており、抗原−抗体
反応を行なうことにより、この抗体3 が対応する抗原4
に結合する。したがって、検体上の金コロイド2 の位置
を測定することにより、抗原の局在部位を明らかにする
ことができる。さらに、大きさの異なる 2種以上の金コ
ロイドを複数種の抗体に結合させることにより、複数の
抗原を同時に観察することも可能である。しかしなが
ら、この方法では、測定時にコロイドが重なる可能性も
あり、コロイド数を測定するだけでは定量的な判定が困
難であるという欠点を有している。

【０００４】上述の有機物分子からなる蛍光体には、分
子状の有機蛍光体染料の他に、数十ｎｍの粒子径を有す
る赤色、緑色および青色光を発光するポリスチレン球が
含まれ、紫外線励起により明るい発光を示すことが従来
知られている。しかしながら、このポリスチレン球を含
めて、有機蛍光体は紫外線や電子線照射により染料の分
子結合が容易に破壊され、発光能力が低下する。事実、
これらの有機蛍光体を用いてカソードルミネセンス像の
観察を行なうと、元来発光効率が低いことに加えて、一
度の走査で著しく発光が弱まり、実用に耐えるものでは
ない。また、これら有機蛍光体は、保存時の安定性にも
欠け、劣化を生じる。

【０００５】これに対して、無機蛍光体は、紫外線照射
並びに電子線照射にも安定で劣化が少ない。現在工業用
途に用いられている無機蛍光体の粒子径は、ＣＲＴ用で
4〜7μｍ、蛍光ランプ用で 3〜 8μｍ、およびＸ線用
で 3〜 9μｍ程度である。粒子径がこのような値に設定
される理由としては、蛍光体が主に基板上に塗布されて
用いられており、これらの粒子径が塗布しやすい径であ
ること、蛍光膜が主に人間の目で観察されるためにこの
程度の大きさであれば十分な分解能になること、従来の
製造法ではこの程度の粒子径で発光効率を容易に最適化
することができ、これ以下では発光効率が低下するこ
と、などを挙げることができる。粒子径が小さくなると
発光効率が低下する理由は、個々の粒子表面が非発光層
で覆われており、粒子径を小さくすると非発光層の占め
る割合が大きくなるためであると考えられていた。実
際、テレビジョン学会技術報告ＥＤ-754、第21頁に掲載
される図６には、従来の製造条件で作製した蛍光体は、
粒子径を 7μｍから 1μｍ程度にまで小さくすることに
より発光効率が10〜50％程度に低下することが示されて
いる。これを外挿すると、 100ｎｍ以下の粒子径では発
光は期待できない水準になる。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このように、電子顕微
鏡を用いて微小領域を観察する場合、原子量の大きい元
素を含む分子、または金コロイドを標識剤として用いる
と定量的な測定が困難である。これらの物質の代わり
に、標識剤として蛍光体を用いることにより定量的な測
定は可能になるが、有機蛍光体は電子線、紫外線等の照
射下や保存中での劣化が著しく、また、粒径が小さくか
つ発光効率が十分に高い無機蛍光体は得られていない。

【０００７】したがって、この発明は、被測定物質と特
異的に結合する特異的結合物質であって、定量的な測定
が可能であり、電子線、紫外線等の照射下や保存時の劣
化が少なく、かつ十分な発光効率を有する粒径の小さい
標識剤で標識された特異的結合物質を提供することを目
的とする。また、この発明は、前記標識特異的結合物質
を用いる蛍光定量法を提供することを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】この発明による超微粒子
無機蛍光体標識特異的結合物質は、粒径 1ｎｍないし10
0ｎｍの酸化物無機蛍光体で標識された、被測定物質に
特異的に結合する特異的結合物質であることを特徴とす
る。

【０００９】この発明において、特異的結合物質とは、
被測定物質に特異的に結合する物質を意味し、その例と
しては、抗原、抗体、レセプターに対するリガンド、並
びにプローブ、プライマー等のポリヌクレオチドを挙げ
ることができる。

【００１０】この発明による超微粒子無機蛍光体標識特
異的結合物質では、この特異的結合物質に標識剤として
粒径 1ｎｍないし 100ｎｍの酸化物無機蛍光体が結合し
ている。ここで用いられる酸化物無機蛍光体としては、
Ｌｎ₂ Ｏ₃ ：Ｒｅ、Ｌｎ₂ Ｏ₂ Ｓ：Ｒｅ、ＺｎＯ、Ｃａ
ＷＯ₄ 、ＭＯ・ｘＡｌ₂ Ｏ₃ ：Ｅｕ、Ｚｎ₂ ＳｉＯ₄ ：
Ｍｎ、ＬａＰＯ₄ ：Ｃｅ，Ｔｂ （ここで、ＬｎはＬａ、Ｇｄ、ＬｕおよびＹからなる群
より選ばれる少なくとも１種の元素、Ｒｅはランタニド
族元素からなる群より選ばれる少なくとも１種の元素、
Ｍはアルカリ土類金属からなる群より選ばれる少なくと
も１種の元素、およびｘは 0.5ないし 1.5の値を示す）
を好適に挙げることができる。これらの酸化物無機蛍光
体は、その組成により発生する蛍光の色が異なる。

【００１１】微粒子を得る方法としては、比較的粒径の
大きい粒子を粉砕する方法が従来よく知られている。し
かしながら、無機蛍光体の場合には、前述のように粉砕
によって発光効率が低下することもよく知られている。
実際、粉砕により調製した微粒子無機蛍光体をカソード
ルミネセンス像として観察したところ、微粒子のごく中
心部にのみ発光が認められ、その周囲の広い部分では発
光を観測することはできなかった。また、この方法では
均一な形状の微粒子を得ることができない。

【００１２】そこで、本発明者らが鋭意研究を行なった
結果、粉砕によらずに直接微粒子を調製することが可能
な方法によって上記組成を有する酸化物無機蛍光体を製
造することにより、粒径が小さく、かつ発光効率が十分
高い超微粒子無機蛍光体を得ることが可能であることを
見出した。直接微粒子を調製することが可能な方法とし
ては、高周波プラズマ法を含むガス中蒸発法、スパッタ
リング法、ガラス結晶化法、ゾル−ゲル法、水熱合成法
を含む沈殿法、およびスプレー法を挙げることができ
る。

【００１３】上記調製方法のうち、好ましい方法は調製
しようとする超微粒子無機蛍光体の組成により異なる。
例えば、上述の組成を有する無機蛍光体のうち、Ｌｎ₂
Ｏ₃：Ｒｅは高周波プラズマ法、Ｌｎ₂ Ｏ₂ Ｓ：Ｒｅは
スパッタリング法、ＺｎＯは高周波プラズマ法、ＣａＷ
Ｏ₄ は高周波プラズマ法またはアーク溶解法、ＭＯ・ｘ
Ａｌ₂ Ｏ₃ ：Ｅｕは水熱合成法、Ｚｎ₂ ＳｉＯ₄ ：Ｍｎ
は高周波プラズマ法または水熱合成法、ＬａＰＯ₄ ：Ｃ
ｅ，Ｔｂは水熱合成法で調製することが好ましい。

【００１４】このようにして調製された超微粒子無機蛍
光体は、電子線および紫外線の照射にも安定で十分な発
光を示し、かつ発光色が著しく変化することもない。こ
の発明において、標識剤としての超微粒子無機蛍光体の
粒径は、 1ｎｍないし 100ｎｍであることが好ましい。
粒径が 1ｎｍ未満である場合には、特に電子線照射の際
に発光効率が減少する傾向にあり、粒径が 100ｎｍを越
える場合には、大きすぎて生物・医学分野において用い
られる標識剤として実用的ではない。

【００１５】特異的結合物質をこれら超微粒子無機蛍光
体で標識する方法は特に限定されるものではなく、通常
この分野において用いられるいかなる方法をも用いるこ
とができる。例として、プロテインＡ−金コロイド法と
同様にプロテインＡを介して標識する方法を挙げること
ができる。この際、超微粒子無機蛍光体の液中での分散
性を高めることが望ましく、そのためには粒子表面の帯
電傾向を制御することが有効である。この目的を達成す
るために、粒子の表面を酸あるいは塩基で洗浄したり、
界面活性剤で処理することが可能である。

【００１６】この発明による超微粒子無機蛍光体標識特
異的結合物質を用いる被測定物質の検出・定量は以下の
通りに行なうことができる。まず、測定しようとする被
測定物質に特異的に結合する特異的結合物質を選択し、
これを上述の通りにして適当な超微粒子無機蛍光体で標
識する。次に、調製した超微粒子無機蛍光体標識特異的
結合物質を検体が存在する系に添加して適当な条件下で
反応させる。この反応条件は、被測定物質と特異的結合
物質とが反応することができる条件であればよく、特に
限定されるものではない。これにより、検体中に被測定
物質が存在する場合には、被測定物質に特異的結合物質
が結合する。所定の時間経過した後、検体を洗浄して未
反応の特異的結合物質を系から除去する。次いで、この
検体を、検出部に蛍光検出器を備えた電子顕微鏡にセッ
トし、蛍光の検出を行なう。これにより、蛍光体の位
置、すなわち被測定物質に結合した特異的結合物質の位
置をカソードルミネセンス像として 1μｍ以下の分解能
で検出することができ、ひいては被測定物質の位置を特
定することが可能になる。また、蛍光強度を測定するこ
とにより、被測定物質の定量を行なうことも可能であ
る。

【００１７】また、前述のように、無機蛍光体はその組
成により発生する蛍光の色が異なるので、これを利用し
て、特異性の異なる複数の特異的結合物質をそれぞれ発
光色の異なる超微粒子無機蛍光体で標識して同様の測定
を行なうことにより、異なる被測定物質の検出を同時に
行なうことができる。発光色の異なる複数の蛍光体のカ
ソードルミネセンス像を区別して観測するには、例え
ば、日本電子顕微鏡学会編「電子顕微鏡学」第 123頁に
記載されるカラー蛍光電子顕微鏡法を用いることができ
る。

【００１８】

【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
する。 製造例１ シュウ酸塩共沈法で粒子径約 3μｍのＹ₂ Ｏ₃ ：Ｅｕ蛍
光体を作製し、次いでこの蛍光体を高周波プラズマ法で
気化した後、冷却して微粒子を得た。得られた微粒子
は、一次粒子径が約10ｎｍないし 150ｎｍの球状粒子で
あった。その透過型電子顕微鏡写真を図２に示す。

【００１９】この蛍光体は紫外線照射下で赤色の発光色
を示し、発光効率は処理前の蛍光体の60％であった。ま
た、10ｋＶの電子線照射下においては処理前の蛍光体の
30％の発光効率を示した。この蛍光体を用いてカソード
ルミネセンス像を観測したところ、ポリスチレン有機蛍
光体が１回の観測で発光しなくなる条件下で、10回以上
繰り返し観測しても発光出力の低下は見られなかった。 製造例２ シュウ酸塩共沈法で粒子径約 2μｍのＹ₂ Ｏ₃ ：Ｐｒ蛍
光体を作製し、次いでこの蛍光体を高周波プラズマ法で
気化した後、冷却して微粒子を得た。得られた微粒子
は、一次粒子径が約10ｎｍないし 150ｎｍの球状粒子で
あった。

【００２０】この蛍光体は紫外線照射下で赤色の発光色
を示し、発光効率は処理前の蛍光体の約40％であった。
また、10ｋＶの電子線照射下においては処理前の蛍光体
の10％の発光効率を示した。この蛍光体は、有機蛍光体
と比較して充分高い出力維持率を示した。 製造例３ 市販のＣａＷＯ₄ 蛍光体を高周波プラズマ法により気化
させ、その後冷却して微粒子を得た。得られた微粒子
は、粒径50ｎｍないし 300ｎｍの球状粒子であった。次
に、この蛍光体を水中に懸濁させて静置し、その後浮遊
部分のみを選択する分級処理を行なって粒子径が 100ｎ
ｍ以上の粒子を除去した。Ｘ線回折によると、この蛍光
体はごく僅かにＷＯ₃ の相を含有していた。

【００２１】この蛍光体は、紫外線照射並びに電子線励
起により青色の発光を呈し、発光効率はそれぞれ処理前
の蛍光体の 5％および 3％であった。 製造例４ 市販のＺｎＯ蛍光体を高周波プラズマ法により気化さ
せ、その後冷却して微粒子を得た。次に、アルコール中
で得られた微粒子の分級処置を行ない、平均粒径40ｎｍ
の粒子を得た。

【００２２】この蛍光体は、紫外線照射並びに電子線励
起により緑白色の発光を示し、その発光効率はそれぞれ
処理前の蛍光体の50％および30％であった。 製造例５ 市販のＺｎ₂ ＳｉＯ₄ ：Ｍｎ蛍光体を高周波プラズマ法
により気化させ、その後冷却して微粒子を得た。次に、
アルコール中で得られた微粒子の分級処理を行ない、平
均粒径70ｎｍの粒子を得た。

【００２３】この蛍光体は、紫外線照射並びに電子線励
起により緑色の発光を呈し、その発光効率はそれぞれ処
理前の蛍光体の60％および40％であった。 製造例６ オートクレーブを用いた水熱反応法によりＢａＯ・ 2Ｍ
ｇＯ・16Ａｌ₂ Ｏ₄ ：Ｅｕを合成し、平均径50ｎｍ、厚
み10ｎｍの板状粒子を得た。

【００２４】この蛍光体は、紫外線励起により青色発光
を示した。また、その発光効率は、市販の同組成の蛍光
体の40％であった。 製造例７ オートクレーブを用いた水熱反応法によりＬａＰＯ₄ ：
Ｃｅ，Ｔｂを合成し、平均径80ｎｍの粒子を得た。

【００２５】この蛍光体は、紫外線励起により緑色発光
を示した。また、その発光効率は、市販の同組成の蛍光
体の60％であった。 製造例８ 市販のカラーＴＶ用Ｙ₂ Ｏ₂ Ｓ：Ｅｕ蛍光体をターゲッ
トとし、低真空度のアルゴン中においてスパッタ処理を
行なうことによってアルミニウム箔上に微粒子を生成さ
せた後、生成した微粒子を回収した。得られた微粒子の
平均径は30ｎｍであり、カソードルミネセンス像を繰り
返し明瞭に観測することができた。 実施例１ プロテインＡ−金コロイド複合体作製法において、金コ
ロイドの代わりに製造例１で作製した蛍光体を用いて複
合体を作製した。すなわち、まず製造例１で作製した蛍
光体微粒子を水に懸濁し、これにプロテインＡを混合し
た後、遠心沈降を行なってプロテインＡ−蛍光体複合体
を作製した。 実施例２ ３種類の抗原に対する３種類の抗体に、それぞれ上記製
造例１、３および４において作製した蛍光体を結合させ
た。次いで、これらの蛍光体標識抗体と前記３種類の抗
原を有する検体との抗原−抗体反応を行なった後、カソ
ードルミネセンス像を観測した。

【００２６】その結果、赤、緑、青に発光する部位を分
離して観測することができた。また、繰り返し観測を行
なった場合でも、有機物蛍光体を用いた場合のように発
光出力が低下することはなかった。 比較例１ 粒子径10ｎｍの赤色蛍光性ポリスチレン球（ Duke 社
製、製品名バイオクリーン蛍光マイクロビーズＡＲ 10
0）のカソードルミネセンス像を製造例１と同様の条件
下で行なった。その結果、発光強度は製造例１の場合と
比べて 1／30以下であり、測定を１回行なうことにより
さらにその 1／10以下に低下した。

【００２７】

【発明の効果】以上のように、この発明により、被測定
物質と特異的に結合する特異的結合物質であって、定量
的な測定が可能であり、電子線、紫外線等の照射下や保
存時の劣化が少なく、かつ十分な発光効率を有する粒径
の小さい標識剤で標識された特異的結合物質が得られ
る。また、この発明による超微粒子無機蛍光体標識特異
的結合物質を用いることにより、 1μｍ以下の分解能で
被測定物質の検出を行なうことができ、さらに、複数の
異なる被測定物質を同時に検出することも可能となる。

【００２８】なお、この発明において標識剤として用い
られる超微粒子無機蛍光体は、標識剤としてだけではな
く、蛍光クロマトグラフィー、色素レーザー、電気泳
動、蛍光インク、蛍光洗剤、蛍光ランプ、高分解能ディ
スプレー蛍光面等に応用することも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】従来の金コロイド標識抗体と抗原との反応を模
式的に示す図。

【図２】この発明の製造例１において製造された超微粒
子無機蛍光体の形状を示す透過型電子顕微鏡写真。

【符号の説明】

1…プロテインＡ、 2…金コロイド、 3…抗体、 4…抗
原

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 粒径 1ｎｍないし 100ｎｍの超微粒子無
   機蛍光体で標識された特異的結合物質。
2. 【請求項２】 被測定物質に特異的に結合する特異的結
   合物質と検体とを反応させ、未反応の特異的結合物質を
   除去した後、検体に結合した特異的結合物質を検出する
   ことを具備する被測定物質の検出方法であって、該特異
   的結合物質が粒径 1ｎｍないし 100ｎｍの超微粒子無機
   蛍光体で標識されている検出方法。