JPH0763400B2 - 標的一本鎖ポリヌクレオチド配列を検出するための分光学的方法およびそれに用いるプローブ - Google Patents

標的一本鎖ポリヌクレオチド配列を検出するための分光学的方法およびそれに用いるプローブ

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JPH0763400B2
JPH0763400B2 JP61305611A JP30561186A JPH0763400B2 JP H0763400 B2 JPH0763400 B2 JP H0763400B2 JP 61305611 A JP61305611 A JP 61305611A JP 30561186 A JP30561186 A JP 30561186A JP H0763400 B2 JPH0763400 B2 JP H0763400B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明の分野はポリヌクレオチド（DNAまたはRNA）交雑
検定に使用するための、蛍光体で標識付したポリヌクレ
オチドプローブにある。一般的には、本発明は交雑検定
系においてより高感度で交雑を検定するための蛍光標識
プローブの特性向上方法に関し、更に詳細には、効率的
なエネルギー移動機構が顕著に改善された検出特性をも
つ１個または２個以上の蛍光プローブを生ずる２種以上
の蛍光体の選択および特異的な配置に関する。
発明の背景 交雑検定はDNA配列またはRNA配列を検出または同定する
ために使用することができる。特に、組換えDNAの研究
に使用されるような公表されている方法はメソッズ・イ
ン・エンチーモロジー（Method in Enzymology）第68
巻、第379〜469頁（1979年）；及び同第65巻パート１、
第468〜478頁（1968年）に記載されている。電気泳動に
よる核酸断片の予備分離を含む上述の方法の１つは「サ
ザン・ブロット・フィルター・ハイブリダイゼーション
・メソッド（Southern Blot Filter Hybridization Met
hod）」として既知である。イー・サザン（E.Souther
n）のジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
（J.Mol.Biol.）第98巻、第503頁（1975年）を参照され
たい。核酸交雑方法及び操作の最近のより完全な報告は
メインコース・ジェー（Meinkoth,J）及びワール・ジー
（Wahl,G）のアナリティカル・バイオケミストリー（An
alytical Biochemistry）第138巻、第267〜284頁（1984
年）に見ることができる。
蛍光標識合成ポリヌクレオチドプローブは米国において
商業的に入手できる。修飾ヌクレオチド類を合成ポリヌ
クレオチド類へ組込むための化学的方法は1985年８月30
日付で公開されたPCT出願WO 84/03285明細書中に記載さ
れている。次に、修飾ヌクレオチド（通常、リンカーア
ームヌクレオチドと呼称される）を含有する合成ポリヌ
クレオチドを蛍光成分により誘導することができる。上
述のPCT出願に記載されているように、ただ１つの蛍光
成分のみがプローブへ連結されている。
フルオレセイン、ローダミン、ピレン類のような商業的
に入手できる蛍光団により標識されたポリヌクレオチド
プローブを使用する場合に、ある問題点に遭遇する。最
も深刻な問題点は検定系でプローブを直接検出するため
の限定された感度を包含する。大抵の交雑検定におい
て、標識プローブの少なくとも1018モル（106個の標的
分子）の感度すなわち検出レベルが必要である。多くの
蛍光団は元来このレベルの感度をもつが、試料及び検定
系中の要素からの２次的な干渉がこれらのレベルの検出
感度を達成することを妨害する。蛍光プローブ1018モル
のレベルで、試料自体からの蛍光、レイリー散乱、支持
体（ニトロセルロースフィルター等）からの反射及び特
にラマン（水）散乱は蛍光プローブからの信号より幾桁
も高いバックグラウンド信号を生ずることがある。
理想的には、上述の検定系中での蛍光プローブの検出に
おける改善は、大きなストークスシフトすなわち最大
励起（EX）の波長と最大放射（EM）の大きな分離距離；
高量子収率（QY≧0.5）；高消衰係数（EC≧30,00
0）；600nm超の放射光（赤色蛍光体）；及びレーザ
ー線に近い最大励起波長（442nmヘリウム−カドミウム
または448nmアルゴン）をもつ蛍光団を選択することに
より得ることができる。不幸にも、上述の基準を完全に
満足する一般的な蛍光団はない。例えば、フルオレセイ
ン（EX:495nm、EM:525nm、QY＝0.5）はレーザー線に近
い最大励起をもつ高度な蛍光標識であるが、ストークス
シフトはわずかに約30nmである。
大きなストークスシフトは重複するスペクトルをもち且
つ供与体蛍光団と受容体蛍光団の間の非放射性エネルギ
ー転移のために非常に近接した位置に配置されている一
対の供与体／受容体蛍光団を使用することにより得るこ
とができることが知られている。この形態のエネルギー
転移は蛍光団間の分離距離についての転移効率の方程式
を見出したフェルスター（Forster）により提唱され
た。例えば、Th.フェルスターのAnn.Phys.［西ドイツ、
ライプチヒ（Leipzig）］第２巻（1948年）の第55〜75
頁を参照されたい。フェルスターの非放射性エネルギー
転移の最近の要約はジェー・アール・ラコウィッチ（J.
R.Lakowicz）の「プリンシパルス・オブ・フルオレセン
ト・スペクトロスコーピー（Principles of Fluorescen
t of Spectro−scopy）」（1983年）の第10章に記載さ
れている。フェルスターの数字的分析は蛍光成分の距離
が近ければ近い程、エネルギー転移効率が大きいことを
意味している。これまでの実験的証拠は上述の予言を確
認した。
ストリアー（Stryer）及びハーグランド（Haugland）の
［Proc.Matl.Acad.Sci.第58巻第719〜729頁（1967
年）］はオリゴペプチド類へ連結したエネルギー供与体
と受容体の対について種々の間隔を用いた実験を報告し
ている。エネルギー供与基とエネルギー受容基は定めら
れた長さのスペーサーとして働くプロリンオリゴマー類
の末端へ連結させられた。１〜12単位の間隔が12〜46Å
の分離範囲により試験された。より長いオリゴマー類は
ヘリックス構造であることが観察された。エネルギー転
移効率は12Åの間隔での100％から46Åの間隔での16％
へ減少した。転移効率の距離への存在はフェルスター方
程式により示される依存性と良く一致したと結論付けら
れた。得られた結果は上述の著者らが分光学的定規とし
て非放射性エネルギー転移の使用を提唱した理論的な予
言と非常に良く近似していた。転移効率の距離への依存
性は他の研究者により報告されたモデル系を用いた関連
実験により追認されている。例えば、ガボアー（Gabo
r）のバイオポリマース（Biopolymers）第６巻（1968
年）の第809〜816頁及びカチルスキー−カッチャー（Ka
tchalski−Katzir）らのAnn.N.Y.Acad.Sci.第366巻（19
81年）の第44〜61頁を参照されたい。フェスターエネル
ギー転移効果の作用は以下の免疫蛍光検定方法の特許明
細書に記載されている。（米国特許第3,996,345号、同
第3,998,943号、同第4,160,016号、同第4,174,384号及
び同第4,199,599号明細書を参照されたい）。上述の特
許明細書に記載されているエネルギー転移免疫蛍光検定
方法は、受容蛍光体による蛍光再放出ではなく、供与蛍
光体の減少または消光に基づくものである［ウールマン
・イー・エフ（Ullman.E.F.）らのジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.,）第251
巻、14（1976年）の第4172〜4178頁］。
化学ルミネッセンス標識または生物発光蛋白質に基づく
均質免疫検定操作はパテール（Patel）らのクリニカル
・ケミストリー（Clin.Chem.）第29巻（９）（1983年）
の第1604〜1608頁及び1985年４月17日に公告された欧州
特許出願0137515号明細書に見られるように非放射性エ
ネルギー転移を包含することが報告されている。高転移
効率に関する非放射性エネルギー転移の原理によって供
与基−受容基の間隔を近接させることにより、均質免疫
検定を行なうことができることが提唱されている。均質
免疫検定は元来簡単に行なうことができるが、該検定の
使用は未結合標識プローブが溶液中に残存し、障害とな
るバックグラウンド信号を生ずるために制限を受ける。
1985年４月17日に公告された欧州特許出願第0137515号
は核酸−核酸相互作用を含む生物発光蛋白質類と共に使
用することができる種々の配位子−配位子相互作用に言
及している。しかし、実施例は核酸類ではなく蛋白質配
位子類に関するものである。
1983年１月26日付で公告された欧州特許出願第0070685
号は互いに100Å以内に位置する吸収剤／発光体間の非
放射性エネルギー転移を使用する均質核酸交雑検定法に
関する。既述されているように、交雑プローブは制限酵
素切断によりDNAまたはRNAから誘導された一対の一本鎖
ポリヌクレオチド断片の３′及び５′末端単位へ吸収剤
−発光体成分を連結させることにより調製される。一対
のポリヌクレオチド断片を選択して標識された端部が重
ならず且つ該端部間の塩基対間隔が僅かであるかまたは
全くない標識された端部で標的ポリヌクレオチドの隣接
する相補的配列へ交雑させる。好適な供与体成分は化学
ルミネッセンス触媒であり、吸収剤成分は蛍光団または
リン光体である。
発明の概要 本発明はポリヌクレオチド類（DNAまたはRNA）がポリヌ
クレオチドプローブへ連結した供与体−受容体蛍光成分
間の非放射性エネルギー転移に強く影響を及ぼす環境を
提供するという知見に部分的に基づくものである。本発
明以前には、ポリヌクレオチド類を実際に且つ効率的に
使用するために、特に受容体蛍光団による効率的な発光
に関して、供与体−受容体成分をもつ蛍光団標識プロー
ブをどのように設計するかは知られていなかった。蛍光
成分の新規な間隔がエネルギー転移を最大限にし且つ受
容体による非常に効率的蛍光を生じるために不可欠であ
ることが見出された。驚くことに、最適な間隔は蛍光成
分が連結しているヌクレオチド間に介在する塩基対単位
を必要とする。特に、フェルスターの非放射性エネルギ
ー転移に関する従来の知見と異なり、蛍光成分の直接隣
接するヌクレオチド単位（供与体／受容体の距離10〜15
Å）への連結または１個の介在単位のみをもつ蛍光成分
の連結は許容できない低転移効率となる。この新規な現
象の理論的な説明は知られていない。しかし、１個また
は２個以上の蛍光体プローブが標的ポリヌクレオチドへ
交雑する時の励起トラップの形成が明らかに関連してい
る。ヘリックス二本鎖ポリヌクレオチド類の上述の“微
環境”は非放射性エネルギー転移及び受容体による効率
的な蛍光の発光のための最適間隔において顕著な効果を
もつ。
更に詳細には、効率的な受容体発光に関して、交雑時に
供与体−受容体蛍光成分が少なくとも２個であり７個を
超えない介在塩基単位により分離されるべきである。１
個のプローブの場合または２個のプローブの場合、最適
効率に関しては３〜６個の塩基単位の分離範囲が好適で
ある。本発明の利点を最大限にするために、蛍光成分を
核酸（ピリミジンまたはプリン）塩基単位へ接続させる
リンカーアーム側鎖は４〜30Åの範囲内、好適には約10
〜25Åの長さをもたねばならない。１個のプローブの場
合または２個のプローブの場合に、蛍光成分はプローブ
の末端単位へ結合してはならない。
本発明のプローブは以下に記載する理由のために特異で
あると思われる：意外なことに、フェスター方程式に
より予想され且つ最大エネルギー転移効率を提供するた
めにこれまで研究者により実験的に確証された上述の供
与体と受容体の位置（例えば、20Åまたはそれ以下の距
離）は、交雑したポリヌクレオチドプローブについて観
察された最小効率をもつことが見出された。“受容体
による蛍光の発光に関して”観察される最大エネルギー
転移効率は、蛍光体間のより広いヌクレオチド間隔を必
要とする比較的制限された数の位置にだけ見出された。
また、観察される最大受容体蛍光団発光は、プローブ
のその相補的標的配列への交雑に依存すること、すなわ
ち１個のプローブの場合には、交雑により効率が上昇す
ることが判明した。適正な間隔を用いると、受容体蛍
光団による蛍光発光について例外的に高い値（すなわち
80％）を得ることができる。
好適な実施態様の記載 本発明は10〜100個の塩基単位、特に15〜35個の塩基単
位を含む合成ポリヌクレオチドプローブへ適用できる。
合成プローブを用いる場合、蛍光団の正確な連結は1984
年８月30日に公開されたPCT出願WO 84/03285に記載され
た方法により得ることができる。これは必要なプローブ
の調製に関して本発明の実施を非常に簡略化するもので
ある。
本発明の好適な実施態様は１個のポリヌクレオチドまた
は２個のポリヌクレオチド中の所定の位置に配置され
た、選択された供与体蛍光団及び受容体蛍光団を利用す
ることにある。該プローブは大きなストークシフト及び
600nm超の波長で非常に効率的に供与体蛍光を発光する
ように設計することができる。１個のプローブの場合及
び２個のプローブの場合において、蛍光団は交雑される
際に、介在塩基単位をもつポリヌクレオチドへ連結され
る。本発明は通常、３個のプローブ及び４個のプローブ
並びに２個のプローブを包含する複数個のプローブに適
用できる。
１つの好適な実施態様は２個のポリヌクレオチドプロー
ブの末端塩基単位付近に配置された蛍光団を利用するも
のである。両端の塩基単位への蛍光団の連結を回避する
ことにより、適当な介在塩基単位が提供される。２個の
蛍光団プローブの相補的標的配列への交雑は本発明の必
要な問題に従って供与体蛍光団及び受容体蛍光団を正確
に配置することができる。
１個のプローブの場合において、供与体蛍光団および受
容体蛍光団は２〜７個の介在塩基単位の相対的分離距離
を提供する位置でポリヌクレオチドプローブへ連結させ
なければならない。２個のプローブの場合においてもま
た、両プローブを標的配列へ交雑させた後に、片方のプ
ローブ上の供与体蛍光団と他方のプローブ上の受容体蛍
光団を２〜７個の塩基単位の相対的分離距離を提供する
ように連結させなければならない。１個のプローブの場
合及び２個のプローブの場合についての好適な分離間隔
は３〜６個の介在塩基単位である。最適な間隔は４〜６
単位であると思われる。１個のプローブの場合及び２個
のプローブの場合において、プローブを標的ポリヌクレ
オチドと交雑させる場合には、供与体成分と受容体成分
を接続させる塩基単位は２〜７個の介在塩基単位により
分離される標的試料の塩基単位と対を為さねばならな
い。
蛍光団の選択 供与体蛍光団及び受容体蛍光団の選択は本発明の利点を
得るために重要なことである。通常、蛍光成分は供与体
成分の発光スペクトルが受容体成分の励起スペクトルと
重複しそれらの間の効率的な非放射性エネルギー転移を
提供するようにそれぞれ選択された供与体成分及び受容
体成分を含むものでなければならない。受容体成分の発
光スペクトルの最大波長は供与体成分の励起スペクトル
の最大波長より少なくとも100nm高いものでなければな
らない。
更に、蛍光供与体−蛍光受容体の対は、高効率フェス
ターエネルギー転移；大きな最終ストークシフト（＞
100nm）；可視スペクトルの赤色位置（＞600nm）へ可
能な限り発光をシフトすること；及び供与体励起波長
での励起により生ずるラマン水蛍光発光より高い波長へ
発光をシフトするように選択することが好ましい。例え
ば、供与体蛍光団はレーザー線に近い最大励起波長（特
に、ヘリウム−カドミウム442nmまたはアルゴン488n
m）、高消衰係数、高量子収率、および受容体蛍光団の
励起スペクトルとよく重複する供与体の蛍光発光スペク
トルをもつように選択できる。通常、受容体蛍光団は、
高消衰係数、高量子収率、供与体の発光スペクトルと良
好に重複する受容体の励起スペクトル、および可視スペ
クトルの赤色部分（＞600nm）の発光をもつように選択
することが好ましい。
フルオレセインは特に望ましい供与体成分である。ま
た、ルシファーイエロー（Lucifer Yellow）も供与体成
分として、特に受容体成分としてテキサスレッドを用い
て組合せて使用できる。フルオレセイン（EX約492nm、E
M約520nm、EC約70,000、QY高）及びルシファーイエロー
（EX約428nm、EM約540nm、EC約12,000、QY中）の発光ス
ペクトルはテキサスレッド（EX約590nm、EM約615nm、EC
約70,000、QY高）の励起スペクトルと充分に重複する。
フルオレセインの最大励起波長（約492nm）はアルゴン
レーザー線の488nmと非常に近く、ルシファーイエロー
の最大励起波長（約428nm）はヘリウム−カドミウムレ
ーザー線の442nmに非常に近い。更に、フルオレセイン
／テキサスレッド及びルシファーイエロー／テキサスレ
ッドの組合せはそれぞれ約130nm及び約170nmの大きなス
トークシフトを提供する。両方の場合において、615〜6
20nmのテキサスレッド発光はラマン水線（448nmの励起
について約585nm、および442nmの励起について約520n
m）より顕著に高い波長である。フルオレセインリポー
ターグループの単独の使用と比較して、テキサスレッド
受容体の併用は約490nmでの励起について615〜620nmの
発光領域での相対検出感度を10〜20倍上昇させる。ルシ
ファーイエローリポーターグループの単独の使用と比較
して、テキサスレッド受容体の併用は615〜620nmの発光
領域での相対検出感度を２〜３倍上昇させる。
フルオレセイン蛍光団は、モレキュラー・プローブス・
インコーポレーテッド（Molecular Probes Inc.,米国、
オレゴン州、ジャンクション・シティー）またはシグマ
・ケミカル・コーポレーション（Sigma Chemical.,米
国、マサチューセッツ州、セントルイス）から得ること
ができるフルオレセインイソチオシアン酸塩誘導体とし
て、ポリヌクレオチドプローブ中に組込むことができ
る。スチホローダミン（Suiforhadamine）101のテキサ
スレッドスルホニルクロリド誘導体はモレキュラー・プ
ローブス・インコーポレーテッドから得ることができ
る。また、テキサスレッドは、ティータス（Titus）ら
のJ.Immunol.Meth.第50巻（1982年）の第193〜204頁に
記載されているように、スルホローダミン101をオキシ
塩化リンと反応させることにより調製することができ
る。ルシファーイエローは、アルドリッチ・ケミカル・
コーポレーション（Aldrich Chemical Co.,米国、ウイ
スコンシン州、ミルウォーキー）からビニルスルホン誘
導体（ルシファーイエローVS）として得ることができ
る。ルシファーイエローVSは４−アミノ−Ｎ−［３−
（ビニルスルホニル）フェニル］ナフチルイミド−3,5
−ジスルホネート蛍光染料である。その使用方法の記載
に関しては、スチワート・タブリュー（Stewart W）の
ネーチャー（Nature）第292巻（1981年）の第17〜21頁
を参照されたい。
前述の記載はフルオレセインとテキサスレッドまたはル
シファーイエローとテキサスレッドの組合わせに本発明
を限定するものではないことを理解されたい。本発明の
原理により好適である組合わせはより広い範囲に適用で
きる。本発明の間隔特性は蛍光団の他の供与体−受容体
対も利用することができる。例えば、供与体としてフル
オレセイン及びルシファーイエローを用いる場合、以下
の蛍光試薬から調製された受容体蛍光団成分が許容でき
る：リサミン・ローダミンＢ（Lissamine rhodamine
B）スルホニルクロリド；テトラメチルローダミンイソ
チオシアネート；ローダミンＸイソチオシアネート；及
びエリトロシンイソチオシアネート。上述の受容体（テ
キサスレッドを含む）への他の適当な供与体はＢ−フェ
コエリトリン及び９−アクリジンイソチオシアネート誘
導体である。
フルオレセインを受容体成分として使用した場合に適当
な供与体は、ルシファーイエローVS;9−アクリジンイソ
チオシアネート;4−アセトアミド−４′−イソチオシア
ネートスチルベン−2,2′−ジスルホン酸;7−ジエチル
アミノ−３−（４′−イソチオシアネートフェニル）−
４−メチルクマリンから得ることができる。
ランタニドイオン類（ユーロピウム及びテルビウム）の
ジエチレントリアミンペンタアセテートまたは他のキレ
ート化合物を受容体として使用する場合には、適当な供
与体はスクシンイミジル−１−ピレン−ブチレート；及
び４−アセトアミド−４′−イソチオシアネートスチル
ベン−2,2′−ジスルホン酸誘導体から得ることができ
る。
リンカーアーム 蛍光成分をプローブの塩基単位へ接続するリンカーアー
ムの長さもまた本発明の利点を完全に得るための重要な
パラメーターである。本発明の目的のためのリンカーア
ームの長さは、プリン塩基またはピリミジン塩基に接続
する内端と蛍光団へ接続する外端との間のÅで表す距離
として規定される。通常、リンカーアームは４〜30Åの
長さをもつ。リンカーアームの好適な長さは、10〜25Å
である。リンカーアームは、PCT出願WO 84/03285号明細
書に記載されている種類のものであってもよい。該明細
書はリンカーアームの選択されたプリン塩基またはピリ
ミジン塩基への連結方法及び蛍光団のリンカーアームへ
の連結方法をも開示している。以下に記載するリンカー
アームは上述のPCT明細書に記載されているような本発
明に使用することができるリンカーアームを説明するも
のである。
上述のようなリンカーアームは鎖中に12単位を含み、約
14Åの長さをもつ。本発明によりプローブを調製する際
のこのリンカーアームの使用を実験例で更に説明する。
第１図及び第２図は好適な実施態様の図による説明を提
供するものである。まず、第１図について記載すれば、
５個のヌクレオチド塩基（ｎ＝５）間隔の蛍光団をもつ
１個のプローブを示すものである。ポリヌクレオチドプ
ローブは10〜100個のヌクレオチド塩基を含む。プロー
ブの５′末端及び３′末端の中間に、供与体蛍光団
（Ｄ）及び受容体蛍光団（Ａ）が４〜30Åのリンカーア
ームを介して塩基単位に連結している。リンカーアーム
が蛍光団を接続する単位は５個のヌクレオチド塩基単位
（＋５）により分離される。DNAの塩基をアルファベッ
トで示す:G＝グアニン、Ｔ＝チミン、Ａ＝アデニン、Ｃ
＝シトシン。矢印により示すように、プローブ上に向か
う励起光は供与体蛍光団により吸収され、非放射性エネ
ルギープロセスにより受容体蛍光団へ転移し、且つ受容
体蛍光団により蛍光を発生する。
第２図は、核酸試料の標的ポリヌクレオチド配列への２
個のプローブの交雑を説明するものである。試料及びプ
ローブはDNAの塩基（Ｇ、Ｔ、ＡおよびＣ）を含有す
る。交雑した状態で、ヌクレオチド塩基は２本鎖DNA
（Ｇ−Ｃ及びＴ−Ａ）の方法で対を為す。記載する説明
では、それぞれ25個のヌクレオチド塩基を含む。リンカ
ーアームは交雑した時にプローブの隣接する３′末端及
び５′末端から間隔をあけた塩基単位へ連結する。特
に、テキサスレッド蛍光団はプローブ（１）の３′末端
から３番目の単位であるチミン単位（Ｔ）へ結合する。
フルオレセインはプローブ（２）の５′末端から５番目
の単位であるチミン（Ｔ）へ結合する。これら２個のプ
ローブの交雑時の関係は、図示するように、供与体蛍光
団と受容体蛍光団が結合している塩基単位間の分離が６
単位（ｎ＝６）となる。リンカーアームは約14Åの長さ
をもち、上述に説明したリンカーアームよりなる。
第３図及び第４図は、１個の受容体蛍光団が複数の供与
体蛍光団と間隔をあけて配置されたプローブの修飾を示
すものである。これらの実施態様は塩基単位分離とリン
カーアーム長に関して上述したものと同様の間隔必要条
件を使用するものである。第３図は、受容体蛍光団プロ
ーブが、４塩基単位（ｎ＝４）だけ受容体蛍光団の塩基
から離れている塩基へ結合している２個の供与体蛍光団
の間に位置する中間の塩基に結合されている、１個のプ
ローブの実施態様を説明するものである。第４図は、受
容体蛍光団が１個のプローブへ結合し且つ受容体蛍光団
と供与体蛍光団が他のプローブへ結合している２個のプ
ローブの実施態様を説明するものである。説明したよう
に、プローブ（１）はその３′末端から３番目の塩基へ
結合した供与体蛍光団をもつ。プローブ（２）はその
５′末端から３番目の塩基へ結合した受容体結合をも
ち、且つ５′未端から８番目の塩基単位へ結合した供与
体蛍光団をももつ。これは、上述のプローブを第２図で
説明したように標的配列へ交雑させる場合に、プローブ
（２）の受容体蛍光団と供与体蛍光団の間に４個の塩基
単位の間隔を提供する。同様の間隔（ｎ＝４）はプロー
ブ（１）の供与体蛍光団とプローブ（２）の受容体蛍光
団の間にも与えられる。第３図及び第４図の供与体／受
容体蛍光団の配置によれば、受容体蛍光団への非放射性
エネルギーの量を増加することができる。
第５図は、２対の供与対蛍光団と受容対蛍光団を含む３
個のプローブの実施態様を示すものである。プローブ
（１）は,5′末端から３番目の塩基へ結合する供与体成
分をもち、この供与体成分はプローブ（２）の３′末端
から３番目の塩基へ結合する主要体成分と対を為し、そ
れによって４塩基単位（ｎ＝４）の分離が得られる。プ
ローブ（２）の５′末端は３番目の塩基へ結合する受容
体成分をもち、このプローブ（２）の受容体成分は、交
雑時にプローブ（３）の３番目の塩基に結合する供与体
成分と対を為し、これら成分の間にｎ＝４の間隔を与え
る。
検定操作 本発明のプローブはDNAまたはRNA交雑検定に使用される
上述の種類の不均質検定または均質検定に使用すること
ができる。しかし、本発明の利点を最大とするために
は、プローブを標的DNAまたはRNAを支持体へ交雑させる
不均質検定法と併用することが好ましい。標的配列を含
む供試試料を多数の既知の操作のいずれか１つにより調
製し、適当な固定化支持体へ結合させることができる。
該操作はメソッド・オブ・エンチーモロジー第66巻（19
79年）の第379〜469頁、同第65巻パート１（1980年）の
第468〜478頁及びアナリティカル・バイオケミストリー
（Analytical Biochemistry）第138巻（1984年）の第26
7〜284頁に記載されている。また、米国特許第4,358,53
9号明細書及び公告された欧州特許0070685号及び同0070
687号明細書を参照されたい。交雑検定に使用する通常
の支持体は若干の名前を挙げればニトロセルロースフィ
ルター、ナイロン［ゼータバインド（Zeta−bind）］フ
ィルター、ポリスチレンビート及びアガロースビート
（Agarose bead）を包含する。代表的な不均質検定操作
の更に詳細な説明を以下の実施例の１つに記載する。本
発明のプローブ、それらの使用方法及び得られる結果を
下記の実施例により説明する。
実施例１ 具体的説明のために、ｎ＝５の間隔をもつフルオレセイ
ンとテキサスレッド成分を含有するポリヌクレオチドプ
ローブの調製を以下の通り行なった。配列内に５個のヌ
クレオチドにより分離された２個の第１級アミン官能リ
ンカーアームヌクレオチドを含む合成［25マー（25単位
長）］ポリヌクレオチドプローブ約300μｇを原料とし
た。ポリヌクレオチド300μｇを0.5モル炭酸水素ナトリ
ウム緩衝溶液（pH＝8.8）約20μに吸収させた。10μ
の水に溶解したテキサスレッド約100μｇをポリヌク
レオチド溶液に添加した。制限された反応を０〜５℃で
約15分間にわたり行なった。この時点で７モル尿素溶液
約10μを添加し、反応混合物を0.7cm×3.0cmのＧ−25
セファデックス（Sephadex）・カラムで分離した。初期
区分（初期排出区分）は未反応ポリヌクレオチド、モノ
置換テキサスレッドポリヌクレオチドプローブ、及びジ
置換テキサスレッドポリヌクレオチドプローブを含有し
ていた。最終区分（塔内含有区分）は未反応テキサスレ
ッドを含有していた。初期区分をプールして凍結乾燥
し、最終区分を廃棄した。プールして凍結乾燥した区分
を3.5モル尿素の小体積量（５〜10μ）に添加した
後、ゲル電気泳動により分離した。
20％ポリアクリルアミドゲル（７〜８モル尿素）上での
電気泳動は試料を３種の異なる帯状帯域へ分離し、低部
帯状帯域が未反応ポリヌクレオチドであり、中間帯状帯
域がモノ置換テキサスレッドポリヌクレオチドであり、
上部帯状帯域がジ置換テキサスレッドポリヌクレオチド
であった。ポリヌクレオチドのジ置換テキサスレッドポ
リヌクレオチド誘導体への完全な転化を防止するよう
に、当所より反応条件を制御した。この時点で、モノ置
換テキサスレッドポリヌクレオチド誘導体を含有する帯
状帯域をゲルから注意深く取除き、該誘導体を水で抽出
し、得られた溶液を凍結乾燥して乾燥状態とした。凍結
乾燥した試料を小体積の水に添加し、Ｇ−25セファデッ
クス・カラム上で脱塩した。モノ置換テキサスレッドポ
リヌクレオチドプローブ含有区分をプールし、凍結乾燥
した。
この凍結乾燥物はフルオレセイン成分をモノ置換テキサ
スレッドポリヌクレオチドプローブへ組込むための第２
反応にいつでも使用できる試料である。試料を再度約20
0μの0.5モル炭素水素ナトリウム緩衝溶液（pH＝8.
8）に添加した。10μの水中にフルオレセインイソチ
オシアネート（FITC）約500μｇをモノ置換テキサスレ
ッドポリヌクレオチドプローブ含有緩衝溶液へ添加し
た。反応を約２時間にわたり０〜５℃で行なった。７モ
ルの尿素溶液10μを添加後、試料を上述のように他の
Ｇ−25セファデックス・カラム上へ送り、反応したポリ
ヌクレオチドプローブをFITCから分離した。再び、所定
の区分をプールし、凍結乾燥した。試料を再度20％ポリ
アクリルアミドゲル上で電気泳動して２種の帯状帯域へ
分離した；底部帯状帯域は未反応モノ置換テキサスレッ
ドポリヌクレオチドプローブであり、上部帯状帯域はフ
ルオレセイン及びテキサスレッドで置換されたポリヌク
レオチドプローブであった。上部帯状帯域を注意深く取
除き、抽出して凍結乾燥し、上述の如くＧ−25セファデ
ックス・カラム上で脱塩した。最終的に精製したフルオ
レセイン−テキサスレッドポリヌクレオチドプローブを
次に紫外線／可視光線分光光度計により分析した。260n
m、492nm及び592nmでの光学濃度（O.D.）を使用してプ
ローブの正確な化学量論値を計測した;25マーポリヌク
レオチドプローブは１個のフルオレセイン成分及び１個
のテキサスレッド成分を含有していた。
１個の蛍光団を含有するプローブの合成及び精製は容易
である。原料はプローブ内の所定の位置で組込まれた１
個だけアミン官能化されたリンカーアームヌクレオチド
を備える25マーポリヌクレオチドプローブである。テキ
サスレッド及びFITCの場合において、反応は長時間（約
２時間）にわたり行なわれ、蛍光団置換プローブの収率
を増加させる。精製のための次工程は上述と同様であ
る。
実施例２ 蛍光団成分間の分離がｎ＝０、ｎ＝１、ｎ＝５、ｎ＝
６、ｎ＝９及びｎ＝12である一連のフルオレセイン−テ
キサスレッド25マーポリヌクレオチドプローブ（Ｆ＆TR
プローブ）を調製した。プローブは単純性疱疹ウイルス
（タイプ１）標的DNAへ交雑するように設計された。操
作は上述に説明した14Åのリンカーアームを使用する実
施例１と同様であった。ｎ＝５、Ｆ＆TRプローブの実際
の配列及び蛍光団の相対位置を以下に示す。
蛍光団はプローブ上のどのリンカーアーム位置をも占有
することができることを指摘しなければならない。しか
し、プローブは１個のフロオレセイン及び１個のテキサ
スレッドのみを含む。蛍光分析は0.01モルリン酸ナトリ
ウム、0.1モル塩化ナトリウム緩衝溶液（pH＝7.6）250
μ中にＦ＆TRプローブ200ng〜２μｇを含む試料につ
いて行なった。
蛍光発光スペクトルは供与体（フロオレセイン）の最大
励起波長約490nm、及び受容体（テキサスレッド）の約
最大励起波長約590nmで各試料について得られた。全て
の値は一連のＦ＆TRプローブのそれぞれについての蛍光
励起スペクトルをも得ることによって確認された。受容
体の蛍光発光に関して観察されたエネルギー転移効率
は、490nmで励起（供与体すなわちフロオレセインの励
起）したＦ＆TRプローブの615nmでの蛍光発光と590nmで
励起（受容体すなわちテキサスレッドの励起）した１個
の標識のテキサスレッドプローブ（TRプローブ）の615n
mでの蛍光発光の比を100倍することによって測定した。
従って、値75はＦ＆TRプローブが490nmで励起された場
合に、590nmで励起されたTRプローブと等量（テキサス
レッドに関して）の蛍光発光（615nm）の75％の蛍光を
生ずることを意味する。観察されたエネルギー転移効率
は、相補的標的ポリヌクレオチドへ交雑している一連の
完全なＦ＆TRプローブと未交雑Ｆ＆TRプローブの双方に
ついて測定された。一連のＦ＆TRプローブについての結
果を以下の表Ａに記載する。
表Ａの結果は、観察されたエネルギー転移効率は、一連
の交雑Ｆ＆TRプローブの中で、ｎ＝５のＦ＆TRプローブ
において最高（82）であったことを示す。一連の交雑し
たＦ＆TRプローブの中で、エネルギー移動はフェルスタ
ー方程式から予想される如く、より長い供与体−受容体
距離（ｎ＝６、９、12）をもつプローブにおいて減少す
ることが観察された。しかし、予想外にも、該エネルギ
ー転移効率はより近い供与体−受容体距離すなわちｎ＝
０及びｎ＝１をもつプローブについてもまた降下した。
一連のＦ＆TRプローブは予想されるタイプの挙動に従わ
なかった。高エネルギー転移効率は、ほぼ20〜30Åの間
の比較的制約された位置についてのみ観察された。これ
らの高効率はｎ＝３及びｎ＝４位置、並びに実験的に証
明されたｎ＝５及びｎ＝６やｎ＝７位置をも包含すると
思われる。
また、表Ａは、未交雑Ｆ＆TRプローブの結果は交雑プロ
ーブの結果と同様であるが、余りはっきりしないことを
示す。未交雑プローブについても、ｎ＝０及びｎ＝１の
値はフェルスター方程式から予想される値より低い。観
察された最高効率値は50であり、これはｎ＝9F＆TRプロ
ーブにおいてである。交雑はｎ＝５位置またはｎ＝５近
くでより高い観察される合計エネルギー転移効率を導く
改善された環境を提供し、且つｎ＝０及びｎ＝１位置で
該エネルギー転移効率の低下を生ずる。
実施例３ ２個の25マープローブ２組を実施例２と同様の操作及び
リンカーアームを使用して調製した。フルオレセイン−
テキサスレッドの最終分離（標的ポリヌクレオチドへの
交雑する場合）はｎ＝０及びｎ＝６塩基対単位であっ
た。
相補的標的ポリヌクレオチドへ交雑したプローブセット
（ｎ＝０）及びプローブセット２（ｎ＝６）の蛍光分析
についての結果を表Ｂに記載する。
表Ｂの結果はプローブセット２（ｎ＝６）について観察
されるエネルギー転移効率が高く、また、プローブセッ
ト１（ｎ＝０）について予想外に低いことを示すもので
ある。２個のプローブ系についての結果は一連の１個の
Ｆ＆TRプローブについて得られる結果を確証するもので
ある。再び、２個のプローブの結果は最適位置がｎ＝６
塩基対間隔付近の非常に狭い範囲内にあることを示すも
のである。
実施例４ ｎ＝５ヌクレオチド間隔をもち、供与体としてルシファ
ーイエロー、受容体としてテキサスレッドを含む25マー
プローブ（LY＆TRプローブ）を上述の基本操作を使用し
て調製した。435nmで励起した場合の615nmでの発光に関
して観察されたエネルギー転移効率は約20％と見出され
た。相対値はｎ＝5F＆TRプローブについての82％より低
い。この低相対値はルシファーイエローの消衰係数がフ
ルオレセインより顕著に低いこと、すなわちルシファー
イエローは約12,000であるのに対し、フルオレセインは
約75,000であることによる。この特性のために、ルシフ
ァーイエローは、フルオレセインのような良好な供与体
ではない。しかし、ルシファーイエロー／テキサスレッ
ド対は大きなストークシフト（約170nm）を生じ、且つ
供与体はレーザー光線（ヘリウム−カドミウム］、約44
2nm）により励起させることができる。
実施例５ 本実施例は、サンドイッチタイプの不均質検定フォーマ
ット中で実施例２の１個のプローブを使用した単純性疱
疹ウイルスDNAの検出に関するものである。技術的背景
として、サンドイッチタイプ検定法は、支持体（例えば
ポリスチレンビードまたはアガロスビード）上に固定さ
れた相補的プローブ（捕捉プローブ）により所定の標的
ポリヌクレオチドを交雑することによる初期捕捉を包含
する。捕捉（交雑により固定）された標的ポリヌクレオ
チドをリポーターグループ（フルオレセイン等）で標識
された他の相補的プローブと接触させると、交雑された
リポーターグループは標的ポリヌクレオチド配列の存在
の信号を発生する。
検定操作において、約50〜100個のアガロース単純性疱
疹ウイルス（HSV）捕捉ビード（直径約100ミクロン）を
使用した。アガロースHSV捕捉ビードは、アガロースビ
ードの活性化形態へ所定の相補的HSVプローブ（20〜50
個ヌクレオチド鎖長）を置換（共有結合）することによ
り調製される。単純性疱疹ウイルスDNAを含む試料DNA
（約１〜10mg）を、最終体積約100μの交雑緩衝溶液
［0.75モル塩化ナトリウム、0.075モルクエン酸ナトリ
ウム、１％（w/v）硫酸ドデシルナトリウム（SDS）、50
0μｇ牛血清アルブミン（結晶性ペンテックスフラクシ
ョンＶ）、500μｇポリビニルピロリドン］中で調製し
た。
アガロースHSV捕捉ビードをDNA試料溶液へ添加した。試
料溶液を穏やかに攪拌して、交雑を45〜55℃で15〜30分
間にわたり行なった。次に、ビードを過または遠心分
離により試料溶液から分離した。アガロースHSV捕捉ビ
ードを2mlの１×SSC＋0.1％SDS緩衝溶液（0.15モル塩化
ナトリウム、0.015モルクエン酸ナトリウム、0.1（w/
v）SDS、pH＝7.15、45〜50℃）で３回洗浄した。アガロ
ースHSV捕捉ビートは10〜100ngのフルオレセイン−テキ
サスレッドHSV25マープローブ（実施例２）を含む他の
交雑緩衝溶液100μ中に懸濁した。交雑は再度45〜55
℃の温度で15〜30分間にわたり穏やかに攪拌しながら行
なった。ビードを過または遠心分離により溶液から分
離した。ビートを2mlの１×SSC＋0.1％SDS緩衝溶液（45
〜55℃）で最初に３回、次に１×SSC緩衝溶液で３回洗
浄した。ビードを蛍光分析用の顕微鏡スライドまたは所
定の試料セルへ移した。蛍光分析は光子計測用エピ蛍光
体顕微鏡装置を用いて行なった。励起はアルゴンイオン
レーザー、高強度水銀（Hg）アークランプまたは480〜4
90nmで励起するために適当なフィルターを付けた他の高
強度光源を用いて行なった。エピ蛍光体顕微鏡は615〜6
30nmの領域での蛍光発光を監視するための所定の二色鏡
及びフィルターを備えていた。蛍光発光は顕微鏡に備え
られた光子計測用光電子増倍装置を使用して定量した。
蛍光プローブが交雑した標的DNAを含むアガロースビー
ドを１〜10秒間にわたり計測した。通常、試料１種類当
たり10〜15個のビードを計測する。試料の蛍光分析の合
計時間は５分以内であった。
アガロースビード試料を蛍光分析するための第２の方法
は、光学繊維光源によるビードの側照明を包含する。こ
の操作において、励起光は顕微鏡に入らないが、ビード
の側照明について試料セル（スライド）中に配置された
50〜100ミクロンの光学繊維に収束される。励起光は外
部、すなわち顕微鏡の対物レンズに対して、90゜の角度
にある。
【図面の簡単な説明】
第１図〜第５図は本発明を実施する際に使用するストー
クシフトプローブの好適な実施態様を説明する図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ｉ）蛍光成分をもつ１個のポリ−または
    オリゴ−ヌクレオチドプローブを標的ポリヌクレオチド
    へ交雑させるか、または（ii）蛍光成分をもつ複数個の
    ポリ−またはオリゴ−ヌクレオチドプローブを前記標的
    ポリヌクレオチドへ交雑させることからなる標的ポリヌ
    クレオチドの検出および／または検定のための分光学的
    方法であって、 前記１個または複数個のプローブ中に別々のヌクレオチ
    ドに接続された少なくとも一対の蛍光成分を存在させ、
    その際に、 前記１個または複数個のプローブを標的ヌクレオチドと
    交雑させたときに、前記一対の蛍光成分に接続している
    ヌクレオチドがそれぞれ、２〜７個のヌクレオチドによ
    り分離させられている標的ポリヌクレオチドのヌクレオ
    チドと交雑により対をなし、 そして該蛍光成分間の干渉に基づく蛍光手段により該交
    雑を検出および／または検定する、標的ポリヌクレオチ
    ドの検出および／または検定のための分光学的方法。
  2. 【請求項２】前記１個または複数個のプローブを標的ポ
    リヌクレオチドと交雑させたときに、前記蛍光成分に接
    続しているヌクレオチドがそれぞれ、３〜６個のヌクレ
    オチドにより分離させられている標的ポリヌクレオチド
    のヌクレオチドと対をなす、特許請求の範囲第１項に記
    載の方法。
  3. 【請求項３】前記１個または複数個のプローブを標的ポ
    リヌクレオチドと交雑させたときに、前記蛍光成分に接
    続しているヌクレオチドがそれぞれ、４〜６個のヌクレ
    オチドにより分離させられている標的ポリヌクレオチド
    のヌクレオチドと対をなす、特許請求の範囲第１項に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】（ｉ）蛍光成分をもち、標的一本鎖ポリヌ
    クレオチドに対して相補的な１個のポリヌクレオチドプ
    ローブを前記標的一本鎖ポリヌクレオチドへ交雑させる
    か、または（ii）蛍光成分をもち、前記一本鎖ポリヌク
    レオチドの逐次隣接する帯域に対して相補的な複数個の
    ポリヌクレオチドプローブを交雑させることからなる標
    的一本鎖ポリヌクレオチドの検出および／または検定の
    ための分光学的方法であって、 前記１個または複数個のプローブ中に別々のヌクレオチ
    ドにリンカーアームにより接続された少なくとも一対の
    蛍光成分を存在させ、 該蛍光成分はそれぞれ供与体成分の発光スペクトルが受
    容体成分の励起スペクトルと重複して受容体蛍光団によ
    り効率的に蛍光発光することにより非放射性エネルギー
    転移を可能にするように選択された供与体成分および受
    容体成分よりなり、受容体成分の励起スペクトルの最大
    波長が供与体成分の励起スペクトルの最大波長より少な
    くとも100nm大きく、 前記リンカーアームが長さ４〜30Åをもち、供与体成分
    及び受容体成分を前記１個のプローブ中で非隣接的にヌ
    クレオチドへ接続させるか、または前記複数個のプロー
    ブ中で複数のヌクレオチドに接続させることにより、 前記１個または複数個のプローブを標的一本鎖ポリヌク
    レオチドと交雑させたときに、前記供与体成分及び受容
    体成分に接続しているヌクレオチドがそれぞれ、２〜７
    個のヌクレオチドにより分離させられている標的一本鎖
    ポリヌクレオチドのヌクレオチドと交雑により対をな
    す、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記供与体成分および受容体成分が１個の
    プローブ上にある、特許請求の範囲第４項に記載の方
    法。
  6. 【請求項６】前記供与体成分および受容体成分が一対の
    プローブ上にある、特許請求の範囲第４項に記載の方
    法。
  7. 【請求項７】前記供与体成分がフルオレセインであり、
    前記受容体成分がテキサスレッドである、特許請求の範
    囲第４項から第６項までのいずれか１項に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記リンカーアームが10〜25Åの長さをも
    つ、特許請求の範囲第４項に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記１個または複数個のプローブを標的一
    本鎖ポリヌクレオチドと交雑させたときに、前記供与体
    成分及び受容体成分に接続しているヌクレオチドがそれ
    ぞれ、３〜６個のヌクレオチドにより分離させられてい
    る標的一本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドと対をな
    す、特許請求の範囲第４項に記載の方法。
  10. 【請求項１０】（ｉ）蛍光成分をもち、標的一本鎖ポリ
    ヌクレオチドに対して相補的な１個のポリヌクレオチド
    プローブを前記標的一本鎖ポリヌクレオチドへ交雑させ
    るか、または（ii）蛍光成分をもち、前記一本鎖ポリヌ
    クレオチドの逐次隣接する帯域に対して相補的な複数個
    のポリヌクレオチドプローブを交雑させ、その際に、前
    記１個または複数個のプローブが各々10〜100個のヌク
    レオチドを含む合成ポリヌクレオチドである、支持体上
    に不動化された標的一本鎖ポリヌクレオチドを検出およ
    び／または検定するための分光学的方法であって、 前記１個または複数個のプローブ中に別々のヌクレオチ
    ドにリンカーアームにより接続された少なくとも一対の
    蛍光成分を存在させ、 該蛍光成分はそれぞれ供与体成分の発光スペクトルが受
    容体成分の励起スペクトルと重複して受容体蛍光団によ
    り効率的に蛍光発光することにより非放射性エネルギー
    転移を可能にするように選択された供与体成分および受
    容体成分よりなり、受容体成分の励起スペクトルの最大
    波長が供与体成分の励起スペクトルの最大波長より少な
    くとも100nm大きく、 前記リンカーアームが長さ10〜25Åをもち、供与体成分
    及び受容体成分を前記１個のプローブ中で非隣接的にヌ
    クレオチドへ接続させるか、または前記複数個のプロー
    ブ中で複数のヌクレオチドへ接続させることにより、 前記１個または複数個のプローブを標的一本鎖ポリヌク
    レオチドと交雑させたときに、前記供与体成分及び受容
    体成分に接続しているヌクレオチドがそれぞれ、２〜７
    個のヌクレオチドにより分離させられている標的一本鎖
    ポリヌクレオチドのヌクレオチドと交雑により対をな
    す、特許請求の範囲第１項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記供与体成分および受容体成分が１個
    のプローブ上にある、特許請求の範囲第10項記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】前記供与体成分および受容体成分が一対
    のプローブ上にある、特許請求の範囲第10項記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】前記供与体成分がフルオレセインであ
    り、前記受容体成分がテキサスレッドである、特許請求
    の範囲第10項から第12項までのいずれか１項に記載の方
    法。
  14. 【請求項１４】前記供与体成分及び受容体成分が１個の
    プローブ上で該プローブの３′未満または５′未満以外
    のヌクレオチドに接続されており、 該プローブを標的一本鎖ポリヌクレオチドと交雑させた
    ときに、前記供与体成分及び受容体成分へ接続している
    ヌクレオチドがそれぞれ、４〜６個のヌクレオチドによ
    り分離させられている標的一本鎖ポリヌクレオチドのヌ
    クレオチドと対をなす、特許請求の範囲第４項または第
    10項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記供与体成分及び受容体成分がそれぞ
    れ標的一本鎖ポリヌクレオチドの隣接するヌクレオチド
    へ交雑される３′末端および５′末端をもつ一対のプロ
    ーブ上にあり、 該交雑を行うときに、供与体成分および受容体成分に接
    続しているヌクレオチドが４〜６個のヌクレオチドによ
    り分離させられている標的一本鎖ポリヌクレオチドのヌ
    クレオチドと対をなす、特許請求の範囲第４項または第
    10項に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記供与体成分がフルオレセインであ
    り、前記受容体成分がテキサスレッドである、特許請求
    の範囲第14項または第15項に記載の方法。
  17. 【請求項１７】（ｉ）蛍光成分をもつ１個のポリ−また
    はオリゴ−ヌクレオチドプローブからなるか、または
    （ii）蛍光成分をもつ複数個のポリ−またはオリゴ−ヌ
    クレオチドプローブからなるプローブであって、 前記１個または複数個のプローブ中に別々のヌクレオチ
    ドに接続された少なくとも一対の蛍光成分を存在させ、
    その際に、 前記１個または複数個のプローブを標的ヌクレオチドと
    交雑させたときに、前記一対の蛍光成分に接続している
    ヌクレオチドがそれぞれ、２〜７個のヌクレオチドによ
    り分離させられている標的ポリヌクレオチドのヌクレオ
    チドと交雑により対をなす、ポリ−またはオリゴ−ヌク
    レオチドプローブ。
  18. 【請求項１８】前記１個または複数個のプローブを標的
    ポリヌクレオチドと交雑させたときに、前記蛍光成分へ
    接続するヌクレオチドがそれぞれ、３〜６個のヌクレオ
    チドにより分離させられている標的ポリヌクレオチドの
    ヌクレオチドと対をなす、特許請求の範囲第17項に記載
    のプローブ。
  19. 【請求項１９】前記１個または複数個のプローブを標的
    ポリヌクレオチドと交雑させたときに、前記蛍光成分へ
    接続するヌクレオチドがそれぞれ、４〜６個のヌクレオ
    チドにより分離させられている標的ポリヌクレオチドの
    ヌクレオチドと対をなす、特許請求の範囲第17項に記載
    のプローブ。
  20. 【請求項２０】（ｉ）蛍光成分をもつ１個の合成一本鎖
    ポリヌクレオチドからなるか、または（ii）蛍光成分を
    もつ第１のプローブの３′末端が蛍光成分をもつ第２の
    プローブの５′末端に隣接して標的一本鎖ポリヌクレオ
    チドの隣接配列と交雑する第１及び第２の一対の合成一
    本鎖ポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドプロー
    ブであって、 前記１個または一対のそれぞれのプローブは各々10〜10
    0個のヌクレオチドを含んでおり、その際、 前記１個または一対のプローブの３′末端および５′末
    端以外の２つのヌクレオチドに長さ４〜30Åのリンカー
    アームにより蛍光成分が接続されており、 該アームの１つには供与体蛍光成分が、そして他のアー
    ムには受容体蛍光成分が接続されており、 これらの蛍光成分は供与体成分の発光スペクトルが受容
    体成分の励起スペクトルと重複して受容体蛍光団により
    効率的に蛍光発光することにより非放射性エネルギー転
    移を可能にするように選択された成分であり、受容体成
    分の発光スペクトルの最大波長が供与体成分の励起スペ
    クトルの最大波長より少なくとも100nm大きく、 前記プローブを標的一本鎖ポリヌクレオチドに交雑させ
    たときに、前記供与体成分及び受容体成分に接続してい
    るヌクレオチドがそれぞれ、２〜７個のヌクレオチドに
    より分離させられている標的一本鎖ポリヌクレオチドの
    ヌクレオチドと交雑により対をなす、特許請求の範囲第
    17項に記載のプローブ。
  21. 【請求項２１】前記リンカーアームが10〜25Åの長さを
    もつ、特許請求の範囲第20項に記載のプローブ。
  22. 【請求項２２】前記供与体成分がフルオレセインであ
    り、前記受容体成分がテキサスレッドである、特許請求
    の範囲第20項に記載のプローブ。
  23. 【請求項２３】前記１個または一対のプローブを標的一
    本鎖ポリヌクレオチドと交雑させたときに、前記供与体
    成分及び受容体成分に接続しているヌクレオチドがそれ
    ぞれ、３〜６個のヌクレオチドにより分離させられてい
    る標的一本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドと交雑に
    より対をなす、特許請求の範囲第17項に記載のプロー
    ブ。
  24. 【請求項２４】前記１個または一対のプローブを標的一
    本鎖ポリヌクレオチドと交雑させたときに、前記供与体
    成分及び受容体成分に接続しているヌクレオチドがそれ
    ぞれ、４〜６個のヌクレオチドにより分離させられてい
    る標的一本鎖ポリヌクレオチドのヌクレオチドと対をな
    す、特許請求の範囲第23項に記載のプローブ。
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