JPH0758294B2 - 診断用具 - Google Patents

診断用具

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JPH0758294B2
JPH0758294B2 JP10435689A JP10435689A JPH0758294B2 JP H0758294 B2 JPH0758294 B2 JP H0758294B2 JP 10435689 A JP10435689 A JP 10435689A JP 10435689 A JP10435689 A JP 10435689A JP H0758294 B2 JPH0758294 B2 JP H0758294B2
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Description

【発明の詳細な説明】 種々のウイルス抗体の検出、とくにHIVに対する抗体の
検出は、遺伝子技術によつて製造されるウイルス抗原で
被覆されたビーズを用いて行われる。特定のウイルスに
対する抗原が存在すると、抗体はビーズ上に存在するウ
イルス抗原と反応する。免疫複合体の検出には、洗浄
後、適当な標識とくにペルオキシダーゼを付加された抗
−ヒト抗体が使用される。この抗−ヒト抗体が探索すべ
き抗体に結合する。
従来、遺伝子技術によつて製造されるウイルス抗原はビ
ーズに吸着によつて結合され、これは結合の様式が予測
できず、したがつてエピトープの露出は偶然にまかされ
ていることを意味する。
本発明は、診断用具、とくに、抗原と同時にそのエピト
ープも、明確に定められた様式で固相に結合している
（第１図参照）固相を有する診断用具に関する。これ
は、抗原と同時にそのエピトープも全くランダムに結合
して部分的には重複してしている（第２図参照）固相と
は対照的である。固相上への一定の様式での抗原の配置
は、遺伝子技術によつて製造され、ＮまたはＣ末端に隣
接ヒスチジン基を有する抗原を、金属イオンをもつニト
リロ三酢酸誘導体を介して結合させることによつて行わ
れる。
上述のニトリロ三酢酸誘導体は、次式 NH2-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2-COO-)2Me2+ （式中、ｘは2,3または４であり、Me2+は金属イオンを
示す）で表される構造を有する。
金属イオンとしては、Co2+，Ni2+，Cu2+またはZn2+が好
ましい。
金属イオンをもつ上述のニトリロ三酢酸誘導体は、ジヤ
ーナル・オブ・クロマトグラフイー、第４巻、第11号、
第177〜184頁（1987年）に記載されている。
スペーサー基は固体支持体とニトリロ三酢酸との間に挿
入することが望ましい。有用なスペーサーとしてはアフ
イニテイークロマトグラフイーに通常使用されるスペー
サー基があげられる。
固相としては、アフイニテイークロマトグラフイーおよ
びゲルクロマトグラフイーに用いられる材料、例えば架
橋デキストラン、アガロース（とくにセフアロースの
商標で知られている型）またはポリアクリルアミドが考
慮される。しかしながら、診断法において通常使用され
るガラスビーズがとくに適用であり、表面に予めエポキ
シド機能をもたせたものがとくに好ましい。
本発明によるタンパク質抗原の配置により、生物学的体
液中の種々のウイルス抗体の定量は驚異的に改善され
る。
本発明の診断用具は、主として、HIV I,HIV II,HIV Iお
よびHIV II,B型肝炎ウイルス，狂犬病ウイルス,HTLV I
ならびにHTLV IIに対する抗体の定量に適している。
問題の抗原を、たとえば大腸菌内で、ＮまたはＣ末端に
隣接ヒスチジン基を有するように、どのようにして発現
させねばならないかは、遺伝子技術者には自明であろ
う。
さらに、本発明は、種々のウイルス抗原、とくにHIV I,
HIV II,HIV IおよびHIV II,B型肝炎ウイルス，狂犬病ウ
イルス,HTLV IならびにHTLV IIに対する抗体の検出のた
めの診断用具の使用に関する。
以下の例は本発明を例示するものである。
例１ ビーズの製造 表面に既にエポキシド機能を有する市販のビーズを本発
明のビーズの製造に使用した。
水25mlに溶解したＮ−［５−アミノ−１−カルボキシペ
ンチル］イミノ二酢酸，H2N-(CH2)4CH(COOH)-N-(CH2COO
H)21.2g,Na2CO31.3gおよびオイペルギツト（Eupergit）
CB6200ビーズ（Ｒhm Pharm,Darmstadt）100個を丸底
フラスコに加えた。反応混合物を水浴中55℃で15時間イ
カキュベートした。次に、ビーズをクロマトグラフイー
カラムに充填し、水で中性になるまで洗浄した。ついで
ビーズを、最初10mlのCuSO4・6H2O（２重量％）で次に2
50mlの水で洗浄した。
生成した式 オイペルギツトCB-CH(OH)-CH2-NH-(CH2)4CH(COOH)-N-(C
H2COO-)2Cu2+で表されるビーズの銅イオン濃度は約3.5
ナノモル／ビーズであつた。
このビーズに、次例に記載するようにして、HIV抗原を
負荷した。
例２ ビーズのAIDS抗原による被覆 100個のビーズを各15mlの6mグアニジン塩酸塩pH8＋0.1M
リン酸ナトリウムで３回洗浄する。ついで、以下の抗原
を同じ緩衝液15mlに溶解する。
ａ）0.26mg（ENV-80）（GAG-Vll）（ヘキサヒス）（ア
ミノ酸配列は第３図参照） ｂ）0.26mg（ENV-80）（GAG-Vll）（ヘキサヒス）＋0.5
5mg（ヘキサヒス）（mDHFR）（ENV60）（アミノ酸配列
は第４図参照） 回転振盪機（New Brunswick）上、22℃で18時間、穏や
かな振盪を行う。次に過剰の抗原を吸引去し、各回15
mlの上記緩衝液で２回、0.1Mリン酸ナトリウムpH7で３
回洗浄して完全に除去する。ビーズはこの緩衝液中に
（湿潤）、または真空中で乾燥後（乾燥）、保存するこ
とができる。
例３ ヒト血清中のAIDS抗体の検出 ヒト血清中のAIDS抗体の試験には、市販のRoche AIDS診
断キツトの操作および全試薬溶液が使用できる［これに
関しては、Anti-HIV（HTLV III/LAV）EIA〈Roche〉Test
説明書、1987年４月刊、参照］。例２によるａ）型ビー
ズのみでなくｂ）型ビーズもAIDS陽性血清とAIDS陰性血
清を明瞭に識別する。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明の診断用具のビーズ表面における抗原
とエピトープの配置状態を模式的に示した図であり、第
２図は従来の吸着によつた場合のビーズ表面における抗
原とエピトープの配置状態を模式的に示す図である。第
３図は（ENV-80）（GAG-Vll）（ヘキサヒス）のアミノ
酸配列を示す構造図であり、第４図は（ヘキサヒス）
（mDHFR）（ENV-60）のアミノ酸配列を示す構造図であ
る。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/21 39/29 39/385 Ｃ１２Ｎ 15/09

Claims (19)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】遺伝子技術によって製造され、隣接ヒスチ
    ジン基を有する抗原が、金属イオンをもつニトリロ三酢
    酸誘導体を介し、所望によりさらにスペーサー基を介し
    て固相に結合されていることを特徴とする診断用具
  2. 【請求項２】金属イオンをもつニトリロ三酢酸誘導体
    は、式 NH2-(CH2)x-CH(COOH)-N(CH2COO-)2Me2+ （Ｉ） （式中、ｘは2,3または４であり、Me2+は金属イオンを
    示す）で表される構造を有する特許請求の範囲第１項の
    診断用具
  3. 【請求項３】Me2+はCO2+，Ni2+，Cu2+またはZn2+である
    特許請求の範囲第１項または第２項のいずれか一つの診
    断用具
  4. 【請求項４】固相は、診断法において慣用されるビーズ
    である特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか
    一つの診断用具
  5. 【請求項５】ビースはその表面にエポキシド機能を含有
    する特許請求の範囲第４項の診断用具
  6. 【請求項６】遺伝子技術によって製造される抗原はHIV
    I抗原である特許請求の範囲第１項から第５項までのい
    ずれか一つの診断用具
  7. 【請求項７】遺伝子技術によって製造される抗原はHIV
    IIである特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
    か一つの診断用具
  8. 【請求項８】遺伝子技術によって製造される抗原はHIV
    IおよびHIV IIである特許請求の範囲第１項から第５項
    までのいずれか一つの診断用具
  9. 【請求項９】遺伝子技術によって製造される抗原は狂犬
    病ウイルスである特許請求の範囲第１項から第５項まで
    のいずれか一つの診断用具
  10. 【請求項１０】遺伝子技術によって製造される抗原はHT
    LV Iである特許請求の範囲第１項から第５項までのいず
    れか一つの診断用具
  11. 【請求項１１】遺伝子技術によって製造される抗原はHT
    LV IIである特許請求の範囲第１項から第５項までのい
    ずれか一つの診断用具
  12. 【請求項１２】ウイルス抗原に対する抗体を検出するた
    めの特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれか一
    つの診断用具
  13. 【請求項１３】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用するHIV Iに対する抗体
    の検出方法
  14. 【請求項１４】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用するHIV IIに対する抗体
    の検出方法
  15. 【請求項１５】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用するHIV IおよびHIV II
    に対する抗体の検出方法
  16. 【請求項１６】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用するＢ型肝炎ウイルスに
    対する抗体の検出方法
  17. 【請求項１７】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用する狂犬病ウイルスに対
    する抗体の検出方法
  18. 【請求項１８】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用するHTLV Iに対する抗体
    の検出方法
  19. 【請求項１９】特許請求の範囲第１項から第５項までの
    いずれか一つの診断用具を使用するHTLV IIに対する抗
    体の検出方法
JP10435689A 1988-04-25 1989-04-24 診断用具 Expired - Lifetime JPH0758294B2 (ja)

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CH1537/88-0 1988-04-25
CH153788 1988-04-25
CH163588 1988-05-02
CH1635/88-0 1988-05-02

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Publication Number Publication Date
JPH01312465A JPH01312465A (ja) 1989-12-18
JPH0758294B2 true JPH0758294B2 (ja) 1995-06-21

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DK197589D0 (da) 1989-04-24
EP0339389B1 (de) 1993-09-22
EP0339389A1 (de) 1989-11-02
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DK197589A (da) 1989-10-26

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