JPH04503610A

JPH04503610A - 基質を酵素学的に処理する方法

Info

Publication number: JPH04503610A
Application number: JP3503068A
Authority: JP
Inventors: ルードルフ，ライナー; コペツキ，エルハルト; フィッシャー，シュテファン; グロスマン，アーデルベルト; ヘル―ノイゲバウアー，ベアベル
Original assignee: ベーリンガー　マンハイム　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフツング
Priority date: 1990-01-19
Filing date: 1991-01-18
Publication date: 1992-07-02
Also published as: EP0464184A1; AU7072491A; KR920701822A; WO1991010910A2; CA2047235A1; AU633686B2; WO1991010910A3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】基質を酵素学的に処理する方法本発明は、基質を酵素学的に処理する方法に関する酵素は、その基質特異性に基づき、広範囲にバイオチフィノロジー及び診断において、基質を意図的に変質するために使用される。例えば、澱粉誘導体はアミラーゼで処理することにより製造することができる。

診断においては、酵素を用いて、評価可能な信号を発生するために、特異的反応が実施される。更に、診断のためには部分的に、基質をその検出の前に特異的に変質させることが必要である。そのように例えばコレステロール測定のためには試料内に存在するコレステロールエステルを予めケン化しなければならない。この種の多くの用途のためには、酵素を固定化するのが有利である。この固定化は、一般に酵素を保持体に結合させることにより行われる。この際、酵素に結合は、一般に酵素の官能基に結合されるスペーサを介する共有結合である。この場合には、該結合を、酵素の酵素学的特性が固定化によって劣化されないように行わねばならない、かつ更に、活性中心が基質に接近可能に残るように行われねばならないという問題が生じる。更に、酵素の結合は、基質の反応過程の条件で溶離が行われるべきでない。

上記の目的のために使用される酵素は、しばしば遺伝子工学的方法で製造される。そのためには、所望の酵素を暗号化する遺伝子をプラスミド中に挿入し、適当な生物体に形質転換しかつ発現させる。酵素は細胞枠間後に溶解質から取得する。酵素の浄化はしばしば困難である、それというのも細胞枠間後に得られた溶解質内に極めて大量の蛋白質が存在し、その分離がその後使用するために無条件に必要であるからである。

本発明の課題は、基質の酵素学的処理のために、酵素が純粋な形で簡単に、その活性が劣化されず、かつ処理した基質を回収する際反応条件下で剥離が行われないように結合される生体触媒を提供すること、即ち可能な限り多くの反応サイクルのための生体触媒を提供することであった。

前記課題は、基質を酵素学的に処理する方法により解決され、該方法は、処理すべき基質を、生物学的活性物質のために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、適当な生物体に形質転換し、該生物体を培養し、細胞を砕開し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させ、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた生体触媒と接触させ、かつ引き続き酵素学的に処理した基質を取得することを特徴とする。

本発明によれば、生体触媒を製造するために、酵素を融合蛋白の形で分子間の相互作用により保持体に非共有結合で、該結合が基質反応の条件下で解放されないように固定化し、それによって固定化した酵素を後の反応サイクルに提供する。

酵素のＮ又はＣを末端とする末端部に融合されたペプチド配列を介する結合により、多数の利点が達成される。該結合は酵素の活性中心及び運動性に悪影響を及ぼさない。それにより、固定化した酵素に対する基質の接近性が改良される。

更に、精製は不必要である、それというのも酵素を結合ペプチドを介して直接溶解質から保持体に結合させることができるからである。

更に、固定化した酵素を生体触媒の再生のために当業者に公知の方法で保持体から剥離しかつ該保持体に新たに酵素含有溶解質を含浸させることができ、しかもそのためにバイオリアクターを空にするか又は保持体を取り出す必要はない。

本発明によれば、基質の酵素学的処理のために、分子間の相互作用を介して融合蛋白が結合された保持体を含有する生体触媒を使用する。この融合蛋白は、本方法のために必要な酵素及び保持体に対する結合を媒介する結合ペプチドからなる。本発明方法のためには、遺伝子工学で製造することができるあらゆる酵素、例えばα−グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アミノアシラーゼ、グルコース−イソメラーゼ、クレアチナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、プルラナーゼ、トレハラーゼ、トレハロース−ホスホリラーゼ、グルコース−デヒドロゲナーゼ、マンニット−ルーデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（Ｄ−八〇Ｃ）、アルドラーゼ、コレステリンエステラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＩ（）　、豚の肝臓エステラーゼ、スブチリジン、デハロゲナーゼ、ナフタリン−ジオキシゲナーゼ、キモトリプシン、β−アミラーゼ及び熱安定性アミラーゼ、リグニナーゼ、ニトリルヒドラターゼ、西洋わさび一ペルオキシダーゼが好適である。結合ペプチドとしては、保持体と相互作用を開始することができる、遺伝子工学で製造可能なアミノ酸配列が適当である。融合蛋白は、公知方法に基づき分子生物学的に製造することができる（　Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ。

’Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ及び５ａ１１ｂｒｏｏｋ、Ｊ、１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。

１９８７、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　ｏこのためには、酵素及び結合ペプチドを暗号化するＤＮＡ断片を適当なベクターに挿入する。該ベクターを、次いで適当な生物体に変質させかつ選択後に、この生物体を次いで通常の方法で培養する。培養した細胞を公知方法に基づき枠間し、該枠間の際に得られた、融合蛋白を含有する溶解質を保持体と接触させる。結合ペプチドを介して、融合蛋白は保持体に結合しかつそうして溶解賞内に含有される別の物質を分離することができる。

保持体としては、結合ペプチドと分子間の相互作用を開始することができる材料を使用する。融合蛋白を保持体の固定化するために適当である、分子間の相互作用は、イオン性の、親水性相互作用、錯体形成、疎水性相互作用、結合ペプチド／１／セプタ相互作用並びに信号ペプチド／膜相互作用である。従って、結合ペプチドの配列及び保持体は、前記相互作用の１つを開始することができるように選択する。このために適当な蛋白及び保持体は、当業者に周知である。該結合は、イオン性相互作用（この場合融合蛋白の保持体もまた結合ペプチドも電荷を持つ基を有する）又は例えば金属キレートーアアイニテークロマトグラフィーでで利用されるような錯体の形成を介して行うのが有利である。

保持体としては、なかんずくクロマトグラフィーのためにも使用されるようなゲル又はイオン交換樹脂が使用される。特に適当であるのは、機械的に負荷可能な担体、特にフラクトゲル（Ｆｒａｋｔｏｇｅｌｅ）と称される親水性重合体及びテンタケルゲル（Ｔｅｎｔａｋｅｌｇｅｌｅ）と称されるマトリックスであり、これらは親水性マトリックスに結合されたテンタケルゲル様の重合体鎖の交換体中心を担持する。また、別の、例えばソフトゲルと称されかつクロマトグラフィーのために周知である、ポリサツカリドをベースとする材料、例えばデキストリン、アガロース又はセファロースも相応する誘導された形で適当である。誘導体としては、例えば以下のものを使用することができる：Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ”’　ｆｆ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）ＣＭ−３ｅｐｈａｒｏｓｅＬＲ’　ｆｆ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）ＳＰ−８ｅｐｈａｄｅｘ”’　Ｃ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）、バッチ用５Ｅ−ＥＵＰＥＲＧＩＴ”’　（Ｒｏｅｂｍ　Ｐｈａｒ＋１ａ）Ｂｉｏ−Ｒｅｘ”’　７Ｑ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｈｅｐａｒｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ”’　ＣＬ−６ＢＦｒａｋｔｏｇｅｌ°’　ＴＳＫ　５Ｐ−６５０（トーヨソーダ／Ｍｅｒｋ）Ｆｒａｋｔｏｇｅｌ”’　ＥＭＤ　５Ｏ３−−６５０（ｉｌｅｒｋ、　”Ｔｅｎｔａｋｅｌｇｅｌ、−）Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ”’　ｆｆ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　′Ｒ’＾−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ）、バッチ用ＱＡＭ−ＥＵＰＥＲＧＩＴ”’　（Ｒｏｅｈｍ　Ｐｈａｒｍａ）ＡＧ　ＭＰ−１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）Ｆｒａｋｔｏｇｅｌ”’　ＴＳＫ　ＤＥＡＥ−６５０（トーヨソーダ／Ｍｅｒｋ）Ｆｒａｋｔｏｇｅｌ”’　ＥＮＤ　ＴＭＡＥ−６５０（Ｍｅｒｋ、”Ｔｅｎｔａｋｅｌｇｅｌ”）保持体としては、結合ペプチドがアルギニン及びリシンをアミノ酸として含有していれば、フラクトゲル”’　ＥＩＩＤ　５Ｏｓ−−６５０を使用するのが有利である。結合ペプチドのために、グルタミン酸及びアスパラギン酸を使用する際には、フラクトゲル”’　ＥＩＩＤ　ＴＭＡＥ−６５０を使用するのが有利である。

更に、リガンドとしてイミノンアセテートを有するキレート結合する樹脂、例えばＴＳＫ−キレート５−ＰＷ又はキレート形成５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｒ）　６Ｂ　ｆｆ並びに融合蛋白を結合するためのトリス−（カルボキシメチル）−エチルジアミン−アガロースが適当である。保持体としては、金属キレート形成剤ニトリロ三酢酸（ＮＴ＾）を融合蛋白に対する結合を媒介するリガンドを含有するカラム材料を使用するのが特に有利である。その際、結合ために関与する、融合蛋白の蛋白配列はポリヒスチジンを有する。その際、結合は担体結合した金属イオンを介して官能性ヒスチジン基との錯体形成によって行われる。

負又は正の電荷を持つ基を有する保持体を使用するのが特に有利である。その際には、結合に関与する、融合蛋白の蛋白配列は、反対の電荷を持つ基を有し、該基はアミノ酸リシン及び／又はアルギニンもしくはグルタミン酸及び／又はアスパラギン酸によって導入することができる。この際、結合は多イオン性相互作用を介して行われる。

融合蛋白の結合ペプチド成分は多数のアミノ酸からなり、この場合ペプチドの長さは、保持体に対する融合蛋白の十分に強力な付着が保証されかつ酵素の活性位置が基質の結合のために利用できるように選択する。有利には、結合ペプチドは２〜３０個のアミノ酸からなる。有利な実施態様によれば、結合ペプチドは、保持体に対する結合のために必要な官能基を有するアミノ酸からなるだけでなく、更に尚酵素の接近性を改良する多数のアミノ酸を含有する。特に適当であるのは、１〜１０個のアミノ酸単位を有するプロリン又はグリシンポリマーの導入である。結合蛋白のためのアミノ酸配列は、好ましくは、プロテアーゼ消化に対して十分に抵抗性を有するように選択する。

結合ペプチドは同じアミノ酸の均質の鎖からなる必要はない。同様に、同じ電荷を持つアミノ酸の組合わせを有することができる。有利には、結合ペプチドは、アミノ酸アルギニン及び／又はリシンもしくはアスパラギン酸及び／又はグルタミン酸を含有する配列からなる。

融合蛋白の結合ペプチドを蛋白加水分解消化から保護するために、結合ペプチドの遊離末端基を、電荷を′有しておらずかつエキソブロテナーゼに対して接近困難である融合されたアミノ酸、例えばプロリンによって保護するのが有利である。

融合蛋白内に含有される酵素は回収によって部分的に変性された形で存在しかつこの場合その完全な活性を発揮することができないので、有利な１実施態様では、酵素を担体に固定化した後に自体公知方法に基づき復元する、この際まず変性した因子で処理しかつ引き続き復元工程を実施する。この場合、条件は、融合蛋白の剥離が行われ得ないように調整する。この場合、復元の際にさもなければ響念される再凝集が固定化に基づき不可能であるのが特に有利である。

融合蛋白を保持体に結合させるには、細胞枠間により得られた溶解質を保持体と結合のために好ましい条件下で接触させる。この場合、結合ペプチドはその官能基を介して保持体の相応する官能基に結合する。こうして得られた、生物学的活性の固定化された酵素を、次いで基質を処理するために使用することができる。

通常の方法で、該基質を固定化された酵素と接触させかつ引き続き酵素処理した基質を取得する。有利には、本発明に基づき使用される固定化された酵素をカラムに入れかつ該基質を自体公知方法で更に誘導する本発明のもう１つの課題は、レセプタが純粋な形で簡単に、その免疫学的活性が劣化されずかつ免疫学的測定を実施する際に反応条件下で剥離が行われないように結合される、酵素免疫学的測定で使用するための固相結合したもしくは粒子結合した、特異的に結合可能なペプチド及び蛋白物ｖｔ（レセプタ）を提供することであった。

この課題は、固相結合したレセプタを使用して不均質系免疫学的測定法の原理に基づき特異的に結合可能な物質を結合を検出する方法において、試料溶液並びに検出すべき物質と結合可能な、標識を付けた少なくとも１種のレセプタを、免疫学的活性物質にために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、適当な生物体に形質転換し、該生物体を培養し、細胞を砕関し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させ、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた固相結合したレセプタと接触させ、かつインキュベーション後に固相を液相から分離しかつ両者の相内の標識を測定することを特徴とすることにより解決される。

もう１つの実施態様として、粒子結合したレセプタを使用して不均質系免疫学的測定法の原理に基づき特異的に結合可能な物質を結合を検出する方法が提供され、該方法は、試料を、免疫学的活性物質のために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、適当な生物体に形質転換し、該生物体を培養し、細胞を枠間し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させる、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた検出すべき固相結合したレセプタと接触させ、かつインキュベージコン後に凝着を測定することを特徴とする。

本発明によれば、使用する固相結合したもしくは粒子結合したレセプタを融合蛋白の形で分子間の相互作用により保持体に非共有結合で固定化する、その際保持体は固相として、例えば管片、マイクロ滴定板又はポリスチレンポールの形で又は粒子、例えばラテックス粒子の形で存在することができる。融合蛋白は、該方法にために必要な、免疫学的活性物質と、保持体への結合を媒介する結合ペプチドとからなる。本発明方法のためには、遺伝子工学で製造することができるあらゆる免疫学的活性物質、例えばＨＩＶ又は肝炎抗原、又はハプテン例えばホルモン、薬剤等が適当である。結合ペプチドとしては、前記に列記したと同じペプチドが適当である。保持体としては、免疫学的測定において使用するために固相もしくは粒子として適当でありかつ結合ペプチドと分子間の相互作用を行うことができる材料を使用する。このために適当な保持体は、当業者に周知である。融合蛋白を製造するための方法は、前記のように実施する。そうして製造した固相結合したもしくは粒子結合したレセプタは、自体公知方法で不均質系及び均質系種類の免疫学的測定のために使用することができる。この免疫学的測定の実施は、当業者に周知でありかつここに詳細には説明しない。この際、原理的には試料溶液を少なくとも２つのレセプタと反応させ、その際不均質系免疫学的測定の場合には一方のレセプタは固相結合されておりかつ他方のレセプタは標識つけされており、かつ均質系免疫学的測定の場合には一方のレセプタは粒子結合されておりかつ他方のレセプタは検出すべき物質及び粒子結合したレセプタと結合することができる。レセプタと検出すべき物質から錯体が形成され、該錯体は信号変化を、不均一系免疫学的測定の場合には酵素、ルミネセンス、化学ルミネセンス又は放射性物質であってよい標識化により、かつ均質系免疫学的測定の場合には凝着により生じる。

本発明を以下の図面及び実施例により説明する。

図面において、第１図はα−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６発現ベクターの構造を示し、第２ａ図はｐＫＫ１７７−３／ＧＬｔｌＣＰＩ−＾ＲＧ６のプラスミド地図を示し、 “第２ｂ図はプラスミドｐＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＰ１．＾ＲＧ６のヌクレオシド配列を示し、第３図は完全な基質転化率をマルトース生体触媒のダイアグラム（基質緩衝剤：　１０　＠Ｍ　ＫＰＰ、１　ｍＷ　ＥＤＴＡ、０．１５Ｍマルトース、ｐＨ７，０）を示し、第４図は基質飽和で制限された基質反応率を有するマルトース生体触媒のダイアグラム（基質緩衝剤：１０菖Ｍ　ＫＰＰ、１　ｍＷ　Ｆ、ＤＴ＾、０．１５ｉ１マルトース。

ｐＨ７，０）を示しかつ第５図は担体上の変性されたα−グルコンダーゼ＾ｒｇ６の復元動力学的解析（変性緩衝剤　ｌ　Ｑ　＊Ｍ　ＫＰＰ、１ｍＭＥＤＴ＾、２　＋＋１１　ＤＴＥ、６Ｍ尿素、ｐＨ６，８；０１５Ｍマルトース、ｐＨ６，８；復元緩衝剤・１０１ＫＰＰ、ｌ冨Ｍ　ＥＤＴＡ、０．１５　Ｍマルトース。

ｐＨ６，８）を示す。

実施例ＤＮＡの操作のために、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他著（１９８２）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１１７２４に記載されているような標準法を利用した。使用した分子生物学的試薬は、製造元の仕様に基づき使用した。

材料：制限エンドヌクレアーゼ及びＴ４−ＤＮＡ−リガーゼは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｍｂ）１．　Ｈｅｆｅｅｘｔａｋｔ、　Ｂａｃｔ。

Ｔｒｙｐｔｏｎ製でありかつカサミド酸はＤｉｆｃｏ製であった。

菌株：メチル化されていないＤＮＡを製造するためのＥ。

Ｃｏ１１株ＨＢＩＯＩ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、（１’１２）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｒａｎｉｎｇ　：＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）又はＧＭ４８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５゜Ｇｅｎｅ　３３．１０３−１１９）を、プラスミド増幅ツタメツ受容株として利用した。Ｅ、　Ｃｏ１１株ＲＭ８２．１ａｃＩ’レセプタ及びトリメトプリム−レジストのために暗号化する（ｉ）Ｒ−プラスミドｐＲＥＭ６６７　（ｐｅＰＡ１１９．０３Ｍ３６９］Ｐ）、及び（１１）α−グルコンダーゼＰＩ−＾ｒｇ５制限プラスミドｐＫＫ１７７−３／ＧＬυＣＡＲＧ６　（アンピリジンー抵抗）を含有するＥＤ８６５４のメチオニン復帰突然変異体（Ｍｕｒｒａｙ　ｅｔ　ａｌ、。

１９７７、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１５０．５３−６１）を（１ −’ｊ　ル：）シダーゼーＰＩ−＾ｒｇ５融合蛋白の発現のために使用した。この菌株を以下には、ＲＭ８２　Ｉ＠／ｐＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＰＩ−＾ＲＧ６と称する。

例１ α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６制限プラスミドｐＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＡＲＧ６の構成パン酵母からのα−グルコシダーゼＰＩの構造遺伝子を３′−末端部でＩ　ＤＮＡ断片だけ拡大した、これをアミノ酸配列Ｇ１ｙＡｒｇＡｒｇＡｒｇＡｒｇＡｒｇＡｒｇのために暗号化する。それにより、Ｃ−末端の６個の付加的アルギニン基（ポリカチオン性アンカー配列）及びグリシンをスペーサとして含有するα− グルコシダーゼ−ＰＴ−融合蛋白が生じる。

このために、約４　、７　ｋＢｐの長さのプラスミドｐＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＰＩ　（この製造及び説明は以下の文献を参照：欧州特許公開第０３００４２５号明細書、　Ｋｏｐｅｔｚｋｉ。

Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、　Ｂｕｃｋｅｌ、　１９８９．　Ｍａｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１６゜１４９−１５５）を部分的に制限エンドヌクレオチドＥｃｏＲＩで及び完全にＢｃｌＩで消化した。単離した約４　、７　ｋＢｐの長さのＢｃｌＩ／　ＥｃｏＲＩ−ベクター断片に、合成りＮＡ断片５’　−ＡＡＴＴＡ丁ＧＡＣＡＴＡＴＣＣ−３’３’　−ＴＡＣＴＧＣＴＡＴＡＧＧＣＴＡＧ−５ ’ＭｅｔＴｈｒ１１ｅＳｅｒ、、、、。

を連結反応させた（構造：　Ｉ）ＫＫ１７？−３／ＧＬｕＣＰ１．ＳＤ）　、それによＥｃｏＲＩ／　ＢｃｌＩ制限区分サイトを分解させた。プラスミド　ＹＲｐ／ＧＬｔｌＣＩＰ　（ＤＳＭ　４１７３Ｐ）　（製法及び説明は欧州特許公開第０３２３８３８号明細書；　Ｋｏｐｅｔｚｋｉ。

Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ、　Ｂｕｃｋｅｌ、１９８９．　Ｙｅａｓｔ　”２．　１１−２４を見よ）から、約３００　Ｂｐ長さのＥｃｏＲＩ断片を単離した。これをＨｉｎｆＩ断片で後分割しかつ約９０Ｂｐ長さのＥｃｏＲＩ／Ｂｉｎｆｌ断片を単離した。

次イテ、約９０Ｂｐ長さのＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｆ　Ｉ断片、並びに合成りＮＡ断片・を三重結合を介して約２．８５ｋＢｐ長さのＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄｍ−ｐＫ）［１７？−３−ベクター断片（ＤＳＭ　３０６２）　ｌ：挿入シタ（構造：　ｐＫＫ１７７−３／ＥＨ）。

プラスミドｐＫＫ１７７−３／　Ｅｌから、約１３０８ｐ長さのＥｃｏＲＩ　／　Ｂｉｎｄｌｉ断片を単離しかつ約４．６５ｋＢｐ長さのＥｃｏＲＩ　／　Ｈｉｎｄｎｌ　−ｐＫＫ１７７−３／　ＧＬＵＣＰＩ−３Ｄベクタ一断片に結合させた（構造：　ｐＫＫ１７７−３／　ＧＬＵＣＰｌ、　ＡＲＧ６）。制限分析及びＤＮＡシークエンシングにより、α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６遺伝子の正確な会合体を確認した。α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６発現ベクターの構造は、第１図に略示されている。α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ５融合蛋白を発現させるために、プラスミド、ＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＰＩ　Ａｒｇ６　（第２ａ図及び第２ｂ図、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ）をＥ、ｃｏｌｉ株ＲＭ８２　Ｉ＠（ＥＤ−Ｉ＠、　ＤＳＭ　２１０２）に形質転換させた。

例２ α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白のＥ、ｃｏｌｉ内へ恋二１ α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６遺伝子の発現のために、α−グルコシダーゼ−ＰＩ−Ａｒｇ５発現プラスミド、及び１ａｃＩ＠−リプレッサー並びにトリメトプリム−抵抗のためにコードしたＲ−プラスミドを有するＥ、ｃｏｌｉ株Ｒ１１８２を使用した。α−グルコシダーゼの発現は、ｔａｃ−バイブリドプロモータの制御下に生じる。

“　培養条件修飾したＭ９−最少培地（ＮａｔＨＰＯａ　６　ｑ／ｉ、　ＫＨｚＰＯ４３９／１、　ＮａＣ１０，５９／ｌ、　Ｎｉｌ江１１　ｇｅｌ、チアミ７２　、５　ｍａｌｌ。

カサミノ酸５　ａｌｌ、　グリセリン（８７％）　２０　ｍｌ／１．　Ｍ　’ｇｓＯｎ４Ｈｔ００　、２５９／ｌ−アンピシリン５０　ｍａｉｌ、トリメトプリム１０５ｇ１ｌ”）を、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＲＭ８２−ｒ’／　ｐＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＰＩ〜＾ｒｇ６　（同様に前記培地中）のオーバナイト培養１％を接種した。該培養を３０℃で一定の振盪下にインキュベートした。成長は５５０ｎｍで光学濃度を測定することにより追跡した（ＯＤｓｓ。７．）。

α−グルコシダーゼの誘発ＯＤ　５ａｏ−−０、７〜０．９の細胞密度が達成された後に、ラクトースの添加（最終濃度０．５％）により、α−グルコシダーゼの形成を誘発した。約１６時間後に、細胞を遠心分離により収穫した。

細胞内のα−グルコシダーゼ含量の上昇は、誘発後の種々の時点で取り出しかつ分析した１１７＋培養試料につき追跡した。

α−グルコシダーゼ活性の測定Ｅ、ｃｏｌｉ培養１ｍｌからの細胞ベレットを、ｌＱｍＭ燐酸塩緩衝液０．５＠ｌ、１ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ７，０内に再懸濁させ、細胞を超音波で砕開し、細胞残滓を遠心分離により分離しかつ上澄みを細胞溶解生成物として更に処理した。

上澄み（場合により希釈）５０ｕｌを、α−グルコシダーゼ基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ｐ−ＮＰＧ　：　２諺Ｍ）を含有する燐酸カリウム緩衝液（１００＋Ｍ、ｐＨ６，８）３＠ｌと混合した。α−グルコシダーゼは酵素分解によりｐ−ニトロフェノールを遊離する。これを４０５１１１での吸光度増加につき測定した。

例３生体触媒の製造細胞枠間及び粗製抽出物の取得Ｅ、ｃｏ１ｉ培養５００＊１からの細胞ペレットを、ｌＱ＋＋Ｍ燐酸塩緩衝液３０〜５０ｍ１．　ＩｇＭ　ＥＤＴ＾、ｐＨ７，０内に再懸濁させ、機械的にフレンチプレス（１４０００ｐｓｉで２回通過：　１　ｐｓｉ＝　０．０６８　ａｔｍ）により砕開しかつ引き続き細胞残滓断片を遠心分離により分離した（１０ＩＩｌｉｎ、７０００ｒｐｍ）　、こうして取得した細胞溶解生成物を直接的に生体触媒を製造するために使用した。

吃炭傅交換基がフレキシブルなポリマー連鎖で立体的に自由に運動可能であるカチオン交換体フラクトゲル１５）ＥＤＭ　５ＯｓＪ５０　（テンタケルゲル）を使用した。それにより、カラム材料と結合すべき蛋白質との良好な交換作用が保証される。

カチオン交換体フラクトゲル”’　ＥＤＩＩ　Ｓｏｗ−６５０を、１９ｍＭ燐酸塩緩衝液３０〜５Ｑｍｌ、ｌ翼Ｍ　ＥＤＴ＾、ｐＨ７゜０で平衡させた。選択的に、ヘパリン−セファローゼ”’　ＣＬ−６Ｂをゲルマトリックスとして利用した。α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白質を、両者のゲル材料のために３０００Ｕ／ｍ７で測定した。

負荷度の測定 α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ５融合蛋白質のフラクトゲル”’ＥＤＩ　５ｏｎ− ６５０ないしはヘパリン−セファローゼ”’　ＣＬ−６Ｂでの固定化のために、粗製抽出物（α−グルコシダーゼ活性度約２００Ｕ／ｍｌ）を約１０カラム容積／時間のポンプ速度でカラムに装入した。次いで、該カラムをｌＱｍＭ燐酸塩緩衝液、１ｍＭＥＤＴ＾、ｐＨ７，０で洗浄しかつカラム材料のα−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白質での負荷を測定した。そのために、カラム溶離液（貫流及び洗浄緩衝液）中でカラムに結合しなかったα−グルコシダニゼの全活性を測定しかつカラムに装入した酵素量で減数した。α−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白質のフラクトゲル”’ＥＤＭ　Ｓ。

３−＝６５０ないしはヘパリン−セファローゼ”）ＣＬ−６８への結合率は９５〜９８％であった。

例４基質の転化率 α−グルコンダーゼ触媒の機能試験のために、α−グルコシダーゼ基質マルトース及びｐ−ＮＰＣに対する酵素加水分解特性を測定した。α−グルコシダーゼ触媒により単位時間当たりマルトースから遊離したグルコース及びｐ−ＮＰＣから遊離したニトロフェノールは、触媒効率の１つの尺度である。ｐ−二トロフェノールのｐ−ＮＰＣの遊離を、カラム溶離液中で光度分析により測定した（α−グルコンダーゼ測定に類似）。マルトースの加水分解はカラム溶離液中で遊離したグルコースにつき追跡した。

グルコース測定試験原理：試験バッチ。

トリエタノールアミン緩衝液（０、３１ＴＲＡ、４　ｌＩＭＭｇＣｌ、、ｐＨ７，５）６２５ｊＡ’＋＾ＴＰ／　ＮＡＤＰ溶液（１５０ｍＭ　ＡＴＰ、１２■Ｍ　ＮＡＤＰ、前記ＴＲ＾緩衝液中）５０μ１３６６ｎ−での吸光度（Ｅｌ）の読み取り＋酵素混合物（グルコース６−燐酸塩 −デヒドロゲナーゼ１富ｇ／ｗｌ及びヘキソキナーゼｌ　ｍｇ　／婁４　それぞｔＬ３．２Ｍ硫酸アンモニウム溶液中）１０＊１反応の沈静後、Ｅ２を３６６ｎｍで読み取った。差Ｅ。

−Ｅ、から、試料のグルコース含量を計算した。

ヘパリン−セファローゼ”’　ＣＬ−６Ｂカラム（カラム容積約３ｗ／）で、例３に記載した方法に基づきα−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６２５００Ｕを固定化した。該基質緩衝液はマルトース６１を含有し、ポンプ速度は０゜５讃ｌ／ｍｉｎであった。

連続運転で、マルトースの加水分解を３３日間に亙って観察した（第３図）。

結果：該バイオリアクターは全観察時間中に１００％の基質転化率を示した。

フラクトゲル”’　ＥＮＤ　５０３−６５０カラムで、例３に記載した方法に基づきα−グルコシダーゼ−Ａｒｇ６１８０Ｕを固定化した。基質転化率及び結合安定性を種々の温度で比較するために、該バイオリアクターを室温（ＲＴ）及びもう１つの同一に装填したバイオリアクターを３０℃で運転した。

該基質緩衝液はマルト一ス０．Ｉ５Ｍを含有し、ポンプ速度はＱ　、　５　ｓ＋Ｉ／ｍｉｎであった。

該バイオリアクターのマルＩ・−ス転化率を３０日間に亙って観察した。この時間中に最初の５０％から３８％（３０℃）および３６％から２８％（ＲＴ）への低下が判明した（第４図）。

例５精製したα−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白質約８０　Ｕ　／　ｍｇを１０１１Ｍ燐酸カリウム緩衝液、１寓１１ＥＤＴＡ’、６Ｍ尿素、２１１ＭＤＴ＾、ｐＨ７，０で変性しかつ変性緩衝液で平衡化した“テンタゲル”カラムに装入した。

試料を取り出した後に、該カラムを復元緩衝液［１０ｍＭ燐酸カリ’）ム（ＫＰＰ）　、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２ｍＭ　１．　４−ジチオエリトリット（ＤＴＥ）、ｐＨ７，ｏ］で浄化した（焼く１０倍カラム容積）。結合しかつ復元したα− グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白質の溶離は、ＩＱａｌｌ燐酸カリウム緩衝液、ＩＭ　ＮａＣ１，、ｐＨ７，０で行った。ｌ　Ｍ　ＮａＣ１で得られた溶離液は、約２０Ｕ／ｌｓ＋の比α−グルコシダーゼ活性度を検出することができた例６担体に自然に結合したα−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６の変性及び復元保持材料のフラクトゲル”’　ＥＤＩ　５Ｏ３−６５０にツク・フチ法で浄化したα−グルコシダーゼ−＾ｒｇ６融合蛋白質（約８００Ｕ）を負荷し、カラムに充填し、変性緩衝液（ｌ　Ｑｍｌｌ　ＫＰＰ、　１　肩Ｍ　ＥＤＴＡ、２■１ｌＤＴＥ、６Ｍ素、ｐＨ６，８）で１時間浄化し、かつ引き続き基質緩衝液（１０＋１１　ＫＰＰ、１　ｗＭ　ＥＤＴＡ、０．１５ｍＭマルトース、ｐＨ６８）で洗浄した。

α−グルコシダーゼの復元は、マルトースから遊離されるグルコースのカラム溶離液中の上昇で追跡することができる（第５図）。

例７ＨＩＶポリペプチドｌ（ＩＶ２（ｅｎｖｇｐ３２）−ＨＩＶＩ（ｐｏｌ、ｐ３２ −ｅｎｖｇｐ４１−ｇａｇｐＬ？−ｐ２４−１５−ポリ（＾ｒｇ−Ｌｙｓ）は、組換えＤＮＡ技術で製造した“多機能性”ＨＩＶ融合蛋白ペプチドである。これはＨＩＶ２レトロウィルスのＨＩＶＩＣｌ）　ｇａｇ、　ｐｏｔ及びｅｎｖドメインの蛋白質分域からなる。

更に、ＨＩＶポリペプチドＣ末端基は１３個の正の電荷を有するアミノ酸（アルギニン及びリジン）からの多カチオン性アンカー配列を有する。

ＨＩＶポリペプチドの蛋白質配列は、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示されている。

Ｅ、ｃｏｌｉにおけるＨＩＶ融合蛋白質の発現ＨＩＶ融合蛋白質の発現のために、ＨＩＶ融合蛋白質発現プラスミドｐＫＫ２３３−２／ＭＹＹＬ−ｇｌ）３２− ｐｏｌｐｐ３２−ｇｐ−４１−ｐ２４−ポリ＾ｒｇＬｙｓ及びｄｎａＹ−１ａｃＩｑプラスミドｐＵＢｓＥ５００を含有するＥ、ｃｏｌｉ株ＲＭ８２′″、　ＤＳＭ　５４４６　（ＲＭ８２のラクトース復帰変異体）を使用した。

ＨＩ　Ｖ発現プラスミドの構成は、１９９０年１月３０日の西独国特許出願第Ｐ４００２６３６．１号明細書に記載されている。

ｐＵＢｓ５００　（欧州特許公開第０３７３３６５号明細書）は、ｐＡＣＹＣ誘導体（Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ著、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３４（１９７ｇ）　１１４１−１１５１）であり、これはカナマイシン耐性の他に１ａｃＩ＠−リプレッサー遺伝子［Ｃａｒｌｏｓ。

Ｎａｔｕｒｅ　２７４　（１９７８）　７６２−７６５］及びＥ、ｃｏｌｉｉ：おいて希なｔ−ＲＮ＾アルギニンのための遺伝子（アンチコドン：＾ＡＧ、＾ＧＧ）を有する。

組換えＥ、ｃｏｌｔ細胞を、アンピシリン５０１９Ｎ＋カナマイシン５０１９／／を補給したＤＹＴ培地（１１当たりバクトリプトン１６９、酵母抽出物１０９、ＮａＣ１５ｙ）中で３０℃で培養した。５５０ｎ−で０．６〜０．８の光学濃度が達成された後に、該細胞をＩＰＴＧ　（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、最終濃度１ｍＭ）で誘導した。４〜１０時間の誘導後に、細胞を遠心分離し、１０１Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７，０で洗浄しかつ更に処理するまで一２０℃で貯蔵した。

細胞溶解、ＨＩＶ融合蛋白　の可溶性化Ｅ、ｃｏｌｉ細胞２０ｇ　（湿式重量）を１００ｍＭ１−リス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ６，５〜７．５中に再懸濁させ、リソチーム０．　２５ｍｇ／ｍ　］を添加しかつ室温で０．　５〜１時間インキュベートした。その後、該懸濁液を０〜４℃に冷却しかつその中に含有された細胞を超音波処理（フレンチプレス）により枠間した。細胞残滓及、び不溶性の凝集したＨＴＶ融合蛋白質（封入体）を遠心分離により分離しかつ該ペレットをＱ、５ＭＮａＣ１又はＫＣＩ及び１％（ｖ／ｖ）　トリトン−Ｘ−１００２００〜４００ｍ１で１〜２回洗浄した。その後、該ベレットを８Ｍ尿素及び５ｍＭβ−メルカプトエタノールを有するトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，０２０ｇ／中で撹拌（磁気撹拌機）下に室温で１時間再懸濁させかつ不溶性細胞成分を遠心分離により分離した。可溶性化した蛋白質の蛋白質濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）著［Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２　（１９７６）　２４８−２５４３の基づき変性させ、ゴタム（Ｇｏｔｈａｍ）他著［＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３　（１９８ｇ）　３５３−３５８］に基づき測定した。

ゲルマトリックスでのＨＩＶ２（ｅｎｖ　３２）−）ＩＩＶＩ（ｏｌ　３２−ｅｎｖ　４１−　ａ　１７−２４−１５−ポリ（Ａｒ−ＬＳ）ノ非共役固定化５０ＩＩＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ８，０及び８．０Ｍ尿素内で平衡化したカチオン交換体フラクトゲル”’　ＥＤトＳＯ，−６５０（Ｍ）　ｌ　ｍｌ内で、可溶性化したＨＩＶ融合蛋白質を室温で２〜６時間振盪下にインキュベートした。ゲルに結合しなかった蛋白質を、平衡化緩衝液で洗浄することにより除去した。その後、該ゲルを燐酸塩緩衝した食塩水溶液（ＰＢＳ、　０　、１５　ｙｓＭ燐酸ナトリウム：０゜９％のＨＣＩ：　ｐＨ７，２）中の牛の血清アルビミン１０諺ｇ／厘ｌで後インキュベートしかつ０．５％゛ンイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含有する脱塩水で洗浄した。

アンチＨＩＶ抗体の測定試料（ヒトの血清１０〜１００　ｕｌ）を子牛血清アルビミン成分１０％を有するＰＢＳ中で１００倍に希釈しかつ３７℃で４〜１２時間ＨＩＶ融合蛋白質を被覆したゲル１０ｙｌと一緒にインキュベートした。引き続き、洗浄液（脱塩した水中の０．５％のツイーン２０）１〜１．５ＩＩｌで洗浄した。

第２工程で、ヒトのＩｇＧのＦｃ７部分に対し向けられた、ペルオキシダーゼと多クローン性抗体の共役体（ＰＯＤ共役体、ＰＢＳ中ペルオキシダーゼ約３０肩Ｕ／＊ｌ）で４〜１２時間インキュベートしかつ３回洗浄液で洗浄した。

その後、基質溶液（１，６ｍＭ２．２’　−アジノージ−［３−エチルベンズチアゾリン−スルホン酸（６）］−ジアンモニウム塩（＾ＢＴＳ”’）　；　９５璽麗燐酸塩−クエン酸塩緩衝液、ｐＨ４，４：３．１＋＊Ｍ過ホウ酸ナトリウム）１．５＠ｔ’を加え、室温で１５〜６０分間インキュベートしかつ試料内に存在する特異抗体に対する尺度として４９２ｎｍで遠心分離した試料における吸光度を測定した。

正常血清は、アンチ−ＨＩＶブール血清と比較して相対的信号強度（（＋Ｄ４１１アンチーＨＩＶ−プール血清／□　Ｄ４＠２正常血清）７〜５０を示した（ＯＤ　４１！　。

４９２ｎ１１での吸光度）。

以下に、前記の細胞系統に関する寄託証明書を添付する。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１配列の種類・ヌクレオチド配列配列長さ　４６４８９０１部にに℃ゴ田買四コ實の品に工ロ寅πｘｎＧ貫江工品■−πに品９６１　Ｍｄｌ’Ｉαス詰−１１にλＩｎＣＭｌσ■μＤＧＩυ工に刃なα■℃コα込− ワ■ワにス２０４１　＾χテ仄フｍテＴｍ０ＩムリＵＮスＱｖＧり丁ｆｆｉχを戻過フ℃Ｎマ「コ端Ｉ罠〜マへズ℃２１０１　ＸンＡ工つ１℃π込コＩＪｎ闇λ ａ端Ｔ貫Ｃχゴα℃αニス印スαΣｍχπα℃八エフ；Ｃ３１８１Ｍ’！Ｇフごズスα工■マエ闇Ａα巴ＣブＧン１ＣＣＡＣア匡フχ℃αＸ恵より３テα工０： σＩテ３２４１　αｍｍｗ℃ｍ℃π℃Ｉｕ陪Ｔｃに口０フいフＣ４３２１Ｇｌ鴨 αマαＩλαエロに０マＣπ）αに−ＺｎＸ工λ閣ｍλＮマα工ＯｍにｍＯＩ庁閃ズ４３８１　？にπＩπフＣα）バ：’に？１１Ｇ：α刀λ＝丁フＣＸ工０フエｍσに０（テコ℃Ｘ刀Ａ）謬仄ゴ４６２１　ＸＩコにλ仄スαΣ入りＣχ℃α ンＣαシＣ３ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２配列の種類・アミノ酸配列配列長さニア７０アミノ酸鎖形ニ一本鎖Ｆ［Ｇ、２ａｐＫＫ１７７−３／ＧＬＵＣＰＩ−Ａｒｇ６のプラスミド地図ＦＩＧ　、　３ＦＩＧ、４ＦＩＧ、５の復元曲線要　約　書基質の酵素的処理のために、処理すべき基質を、生物学的活性物質にために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、適当な生物体に形賀転換し、該生物体を培養し、細胞を枠間し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させ、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた生体触媒と接触させ、かつ引き続き酵素学的に処理した基質を取得する。

Claims

【特許請求の範囲】

１．基質を酵素学的に処理する方法において、処理すべき基質を、生物学的活性物質のために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、適当な生物体に形質転換し、該生物体を培養し、細胞を砕関し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させ、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた生体触媒と接触させ、かつ引き続き酵素学的に処理した基質を取得することを特徴とする、基質を酵素学的に処理する方法。
２．結合ペプチドとして、主として正の電荷を有するアミノ酸から構成されたペプチドを使用する、請求項１記載の方法。
３．結合ペプチドとして、主として負の電荷を有するアミノ酸リシン及び／又はアルギニンから構成されたペプチドを使用する、請求項１記載の方法。
４．結合ペプチドとして、主として負の電荷を有するアミノ酸から構成されたペプチドを使用する、請求項１記載の方法。
５．結合ペプチドとして、主として負の電荷を有するアミノ酸アスバラギン酸及び／又はグルタミン酸から構成されたペプチドを使用する、請求項１記載の方法。
６．結合ペプチドとして、主として負の電荷を有するアミノ酸ヒスチジンから構成されたペプチドを使用する、請求項１記載の方法。
７．結合ペプチドとして、主として負の電荷を有するアミノ酸アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、トリプトシンヒスチジンから構成されたペプチドを使用する、請求項１記載の方法。
８．結合ペプチドが付加的に生物学的活性物質との結合位置に１〜１０個のアミノ酸基からなるスペーサを有する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
９．スペーサが２〜４個のアミノ酸基を有する、請求項８項記載の方法。
１０．スペーサのためにアミノ酸プロリン、グリシン、アラニン及び／又はセリンを使用する、請求項８又は９記載の方法。
１１．結合ペプチドを担持する融合蛋白の末端部が融合された、電荷を有しないアミノ酸（特にプロリン）によって保護されている、請求項１から１０までのいずれか１項記載の方法。
１２．保護アミノ酸としてプロリンを使用する、請求項１１記載の方法。
１３．保持体として、負の電荷をもつ基を持つ物質を使用する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
１４．保持体として、正の電荷を持つ基を有する物質を使用する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
１５．保持体として、錯体化した金属イオンを有する物質を使用する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
１６．保持体として、疏水性基を有する物質を使用する、請求項１から１２までのいずれか１項記載の方法。
１７．固相結合したレセプタを使用して不均質系免疫学的測定法の原理に基づき特異的に結合可能な物質を結合を検出する方法において、試料溶液並びに検出すべき物質と結合可能な、標識を付けた少なくとも１種のレセプタを、免疫学的活性物質のために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、適当な生物体に形質転換し、該生物体を培養し、細胞を砕開し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させ、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた固相結合したレセプタと接触させ、かつインキュベーション後に固相を液相から分離しかつ両者の相内の標識を測定することを特徴とする、特異的に結合可能な物質を結合を検出する方法。
１８．粒子結合したレセプタを使用して不均質系免疫学的測定法の原理に基づき特異的に結合可能な物質を結合を検出する方法において、試料を、免疫学的活性物質のために暗号化する遺伝子と、保持体と相互作用で登場することのできる結合ペプチドのために暗号化するＤＮＡ断片とを融合蛋白を製造するために適当なベクターに挿入し、過当な生物体に形質転換し、放生物体を培養し、細胞を砕開し、かつ融合蛋白質を含有する溶解質を、結合ペプチドと結合可能である保持体と接触させる、その際結合蛋白質は保持体に分子間の相互作用によって結合する、ことにより得られた検出すべき固相結合したレセプタと接触させ、かつインキュベーション後に凝着を測定することを特徴とする、特異的に結合可能な物質を結合を検出する方法。