JPH07509359A - 細胞表面分子に対する抗体の生産方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 細胞表面分子に対する抗体の生産方法 発明の分野 本発明は、膜関連抗原分子に特異的である抗体を生産する方法に関する。さらに 詳細には、本発明では、宿主動物の免疫化および宿主動物がら単離した抗体のス クリーニングに、これらの膜関連抗原を使用する方法を記載する。さらに、本発 明は、免疫系疾患を治療する新規な方法に関する。特に、本発明は、（１）移植 組織拒絶反応、移植片対宿主病、および、異物としての特異抗原の認識により生 じるその他の免疫学的症状；ならびに、（２）ＩｇＥ介在性疾患（アレルギー） 、および、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ） および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）を含む自己免疫疾患のような、抗体 介在性疾患；の予防または治療に関する。

発明の背景 ！、モノクローナル　の　！ モノクローナル抗体は、免疫学的研究の有刃な手段であることが立証されている 。一般的には、モノクローナル抗体は、免疫原組成物中に存在するその池の抗原 に対する抗体から、目的の抗原に対する抗体を判別するスクリーニングアッセイ が可能であれば、免疫原として混合抗原を使用して産生じ得る。目的の抗原が細 胞表面分子であるときは、膜環境にょ各高次構造制限を保持するために、免疫原 として目的の分子を含有する細胞あるいは膜画分を使用するのが好ましい。

全細胞によるマウスの免疫化では、通常は、多くの異なる分子に対する抗体を生 産する、強い免疫応答を示す。この広範な免疫応答は、次の、マウス肺臓細胞あ るいはリンパ球細胞由来のハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生につ いてのスクリーニングでの、この免疫原細胞の使用を妨害する。

さらに、目的の抗原が低濃度で発現される場合には、その抗原に特異的なマウス Ｂ細胞の頻度は比較的低い。この低頻度により、目的の抗原に対する抗体を産生 ずるクローンを同定するために、膨大な数のハイブリドーマクローンのスクリー ニングが必要とされる。

ヒト細胞表面抗原を発現する同系移植ネズミの線維芽細胞は、特異的抗体を産生 ずるために、マウスを免疫化するのに使用されてきた（　ＤｉＳａｎｔｏら、１ ９９１）。適切なマウス株に注射すると、線維芽細胞に存在するバックグラウン ドの抗原タンパク質が免疫原性にはならず、免疫応答が異種移植組換えタンパク 質に集中する。しかし、この方法には、抗体産生が望まれる各々の種あるいは株 に対する特異的な組換え細胞の構築が必要である。

（以下余白） ＋＋、　自およびＣＤ２８−Ｂ７５ 移植後の移植片拒絶反応の防止のための最近の戦略は、シクロスポリンＡ（Ｃｓ Ａ）、ＦＫ５０６、およびフルチコステロイドのような広域作用免疫抑制剤に基 づく。これらの薬剤は、しばしば長期間摂取しなければならないので、重篤な感 染、腎毒性および癌の危険性を増す。さらに、全ての被験体が、これらの免疫抑 制剤の高用量に耐え得るわけではなく、しばしば移植片拒絶反応あるいは移植片 対宿主病（ＧＶＩＩＤ）を生じる。

移植片拒絶反応の最適な予防は、ドナー組織に対して特異的耐性を誘導すること に基づく。従って、移植組織の拒絶反応を予防するための理想的な薬剤は、長期 間の免疫抑制の必要性のない、ドナー反応性子細胞のクローン性非応答、すなわ ち、ア不ルギーを誘導すべきである。アネルギーは、「共刺激性」シグナルの非 存在下の、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）とペプチド提示主要組織適合性複合体（ ＭＭＣ）抗原との間の相互作用後の、細胞間シグナル化によると考えられている 。Ｍｕｅｌｌｅｒ、　Ｄ、Ｌ、ら、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、（ １９８９）　７：４４５゜この共刺激性シグナルは、通常、抗原提示細胞（ＡＰ Ｃ）の細胞表面により提供される。

ｔｌａｗｒｙｌｏｗｉｃｚ、Ｃ，Ｍ、ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８ｇ）１ ４１：４０８３；　およびＳｐｒｉｎｇｅｒ、Ｔ、Ａ　ら、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８７）　ｆｉ：２２３゜■細胞は、イノビボでの正常な 免疫応答時に重要な役割をなす。それらには、細胞毒性、遅延型過敏、およびＢ 細胞によるＴ細胞依存性抗体産生が含まれる。さらに、Ｔ細胞は、インターロイ キン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、リンホカインン、γイ ンターフェロン（ＩＦＮ−γ）、および１１　粗球マクロファージコロニー刺激 因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のような広範囲の種々のリンホカインを産生じ得る。

■細胞の活性化は、リガンドーレセブクー相互作用に起因する。生理学的条件下 で、ＴＣＲ／ＣＤ３　複合体は、ＡＰＣのＭＭＣ分子により提示される抗原性ペ プチドに結合する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、抗原誘導活性化において２つの役 割をなす。第一は、抗原提示ＭＨＣ分子成分中の特異的抗原の認識である。第二 は、その認識事象が、シグナル化機構により形質膜を通って伝達される。

しかし、抗原のＴＣＲのみへの結合は、最大のＴ細胞活性化には十分ではない。

Ｔ細胞表面のその他の多くの補助分子が、付着あるいはシグナル化または両方に 重要な役割をなすことは周知である。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ２分子は、ＡＰＣ のＬＦＡ−３に結合し得るが、さらに、抗体のＣＤ２への結合は、ＴＣＲ／ＣＤ ３？ｊＥ合体により示されるシグナルを増大し得ることもまた示された。Ｔ細胞 活性化に関するその他のりガントベアーは、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４ ／ＭＩＣり５　スＩＩ抗原、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ、および、最も重要なＣＤ２ ８７Ｂ７である。

ＴＣＲ刺激が、全Ｔ細胞活性化あるいはＴ細胞アネルギーを導くかを決定する共 刺激性シグナルの適当な候補物は、Ｔ細胞上のＣＤ２ｇとＡＰＣの８７との相互 作用により生産される。ＣＤ２８分子の架橋結合が、Ｔ細胞のア不ルギー性にな るのを救い得ることが、インビトロにおいて実証された。Ｈａｒｄｉｎｇ、　Ｆ 、Ａ、ら、■ｔｕｒｅ（１９９２）　出：６０７゜ＣＤ２８は、見かけの分子量 が４４　ｋＤａである、ホモダイマーのトランスメンブラン糖タンパク質であり 、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである（Ａｒｕｆｆ。

、Ａ、および５ｅｅｄ、　Ｂ、　踵組ユ用訂（１９Ｂ？）　■：８５７３）　ｏ 　ＣＤ２８分子は、ＣＤ４陽性Ｔ細胞の約９５％、および、ＣＤ８陽性Ｔ細胞の ５０％に発現する。ＴＣＲ／ＣＤ３１合体およびＣＤ２８に対するモノクローナ ル抗体によるＴ細胞の共刺激により、■細胞は非常に活性化される。Ｔｈｏ＋ｍ ｐｓｏｎ、Ｃ，Ｂ、ら、上値に旦ジけ（１９８９）　８６：１３３３−１３３７ ；　Ｊｕｎｅ、　Ｃ，Ｈｏら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８９）　１４３：１ ５３−１６１；およびＬｉｎｄｓＬｅｎ、　Ｔ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９＋ １９）　２４４：３３９−３４３゜この効果には、ＩＬ−２を含む数種のリンホ カインのｍＲＮＡの安定化に明らかに関連し、これらのリンホカインの産生を大 いに促進する。Ｊｕｎｅ、Ｃ，ｌ＋、ら、前出；および、Ｌｉｎｄｓｔｅｎ、　 Ｔ、ら、前出。さらに、ＣＤ２８応答要素は、ＩＬ−２遺伝子のエン／Ｎフサ− で実証され、このことは、転写レベルでの調節もまた存在することを示唆してい る。Ｆｒａｓｅｒ、　Ｊ、Ｄ、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）　２５１：３ １３、および、Ｖｅｒｖｅｙ、Ｃ，Ｌ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、（１９９ １）２６６：１４１７９−１４１８２゜ＣＤ２８に介在されるＴ細胞活性化のあ る種のモデルが、ＣｓＡによる阻害に対して比較的に耐性であることが報告され た。Ｊｕｎｅ、Ｃ，Ｈ，ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ　、（１９Ｂ？） 　ヱ：４４７２−４４８１゜Ｂ７は、見かけの分子量が４５−６５　ｋＤａであ る、トランスメンプラノ糖タンパク質であり、ＣＤ２ｇのように免疫グロブリン スーパーファミリーノメンハーテある。Ｆｒｅｅ＋ｍａｎ、　Ｇ、Ｊ、ら、ムー １ｍｕｎｏ１．　（１９８９）　１４３：２７１４−２７２２゜８７発現ＣＩＯ 細胞は、ＴＣＲ刺激と相乗作用し得、このことによりＩＬ−２分泌およびＴ細胞 増殖をもたらす。Ｌｉｎ５ｌｅｙ、Ｐ、Ｓ、ら、Ｊ、Ｅｘ　、Ｍｅｄ、（１９９ １）　ｕ１ニア２１−７３０；　および、Ｇ１ｍｍ１．　Ｃ，Ｄ、ら、７　（１ ９９１）　［）８：６５７５゜Ｂ７はまた、ＣＴＬＡ−４分子の組換え融合タン パク質に結合する。

Ｌｉｎ５ｌｅｙ、Ｐ、Ｓ、ら、ムーム１工】犯Ｌ（１９９１）　１１ｉ：５６１ −５６９゜ＣＴＬＡ−４もまた免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーで あり、モしてＣＴＬＡ−４およびＣＤ２ｇの細胞質領域は、存意に相同である。

Ｈａｒｐｅｒ、　Ｋ　ら、Ｊ、Ｉ＋ｍｍｕｎｏ１．　（１９９１）　１４７：１ ０３７゜８７分子は、活性化Ｂ細胞（Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｇ、Ｊ、ら、前出）、 ＩＦＮ−７で刺激された単球（Ｆｒｅｅｄｍａｎ、　Ａ、Ｓ、ら、Ｃｅ１１．　 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９９１）ｕＬ：４２９−４３７）、および、単離された 末梢血樹枝状細胞（Ｙｏｕｎｇ、　Ｊ、Ｗ、ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ、　（１９９２＞　９０：２２９−２３７）で発現される。免疫組織化学の研 究によれば、８７分子はまた、インビボにおいて、リンパ組織および非すンノ＜ 組織の両方の樹枝状細胞上に構成的に発現される。Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ、 　Ｐ、ら、　−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”　（１９ ９３）。

インビボにおいて、Ｂ７抗原は、移植組織拒絶反応時にＴ細胞活性化に関連する 。Ｌｅｎｓｃｈｏｖおよび共同研究者は、ヒｌ−ＣＴＬＡ−４と免疫グロブリン ＧＩ　Ｆｃ領域との可溶性融合タンノくり質（ＣＴＬＡ４１ｇ）　（これは、マ ウスおよびヒトＢ７の両方に強（結合する）を使用して、マウスへの移植後の、 ヒト膵島の拒絶反応を予防した（Ｌｅｎｓｃｈｏｗ、　Ｄ、　Ｊ、ら、５ｃｉｅ ｎｃｅ　（１９９２）　２５ユニ７８９−７９２）。ここでＣＴＬＡ４１ｇは、 異種移植（Ｔ細胞が由来する種ζこ対する外来抗原）の拒絶反応を遮断する。

Ｂ７とＣＤ２Ｂ抗原間の相互作用を妨害する分子は公知である。

可溶性ＣＴＬＡ４−１ｇ融合タンパク質は、この相互作用を部分的に遮断するこ とが知られている。Ｌｉｎ５ｌｅｙ、　Ｐ、Ｓ、ら、ム」ＬＬ」０よ（１９９１ ）　７４：５６１゜抗ＣＤ２ｇ抗体もまたこの相互作用を遮断することが知られ ている。さらに、抗Ｂ７抗体が当該分野にお（鳥で公知である。Ｙｏｋｏｃｈｉ 、　Ｔ、ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　（１９８２）　■：８２３；　Ｆｒｅｅｄ ｍａｎ、Ａ、Ｓ、ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８７）　１３９：３２６０； 　Ｖａｌｌｅ、Ａ、ら、　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９９０）　６９：５３１゜１１ １．８′！　およびＣＤ４０　−リガンド、Ｂ細胞は、インビボにおける正常な 免疫応答時に重要な役割をなす。外来抗原は、特異的Ｂ細胞上の表面免疫グロブ リンに結合し、このことにより、エンドサイト−シス、プロセシング、ＭＨＣク ラスＩ＋分子上のプロセスされたペプチドの提示、および、Ｂ細胞表面のＢ７抗 原の上昇調節（ｕｐ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を含む一連の事象の引金となる。

次に、特異的Ｔ細胞は、ＭＨＣクラス］Ｉ分子上に提示されたプロセス抗原のＴ 細胞レセプター（ＴＣＲ）認識を介してＢ細胞に結合する。ＴＣＲを介する刺激 ＋１、Ｔ細胞の活性化を開始し、■細胞のサイトカイン産生を始める。Ｔｌ田胞 のＣＤ２Ｂ抗原とＢ細胞の８７抗原との間の相互作用１よ、さらにＴ細胞を活性 化する第二のシグナルを提供し得、高レベルのサイトカイン分泌をもたらす。さ らに、休止ヒトＴ細胞で（ま発現されないＣＤ４０リガンドは、上記のシグナル を受器すると、Ｔ細胞表面で上昇調節される。次に、Ｂ細胞は、Ｂ細胞表面のＣ Ｄ４０抗原を介してＣＤ４０リガンドにより刺激され、モしてまｔこ、可溶性サ イトカインによっても刺激されて、このＢ細胞は成熟化して高レベルの可溶性免 疫グロブリンを分泌する形質細胞になる。

数年前に、Ｚｕｂ　ｌｅｒら、Ｌ−ユｙ四１１よ（１９８５）　ｉｌｌ：３６６ ２では、ＥＬ４ＢＳとして知られるマウス胸腺腫ＥＬ−４系の変異体サブクロー ンは、ネズミおよびヒト起源の両方のＢ細胞を強く刺激して増殖し、インビトロ において免疫グロブリンを分泌する形質細胞に分化し得た。この活性化は、抗原 非依存的であり、ＭＢＣ制限されないことが見いだされた。ヒトＢ細胞の最適刺 激には、活性化ヒトＴ細胞由来の上清液の存在が必要であるが、ＥＬ４ＢＳ細胞 がホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）あるいはＩＬ− １で予め活性化されているときには、Ｂ細胞応答もまた生じた。Ｚｕｂｌｅｒら 、Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　ｉｃａ　Ｒｅｖｉｅｖｓ　（１９８７）　９９：２８１： および、Ｚｈａｎｇら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９０）　１４１：２９５５ ゜この培養系でのＢ細胞活性化は効率がよいｍ−制限希釈実験は、ヒトＢ細胞の 大部分が、活性化されて増殖し、抗体分泌細胞に分化し得ることを示した。Ｗｅ ｎら、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８７）　１７：８８７゜ これらの変異体ＥＬ−４細胞が、ネズミおよびヒト両方のＢ細胞を活性化する機 構は、以前には解明されなかった。しかし、ＥＬ４Ｂ５に誘導されるＢ細胞の活 性化には、細胞−細胞接触が必要であることは明らかである。第一に、Ｂ細胞は 、ＰＭＡに刺激されるＥＬ４ＢＳ細胞に由来の上清液の存在下では増殖しない。

Ｚｕｂｌｅｒら、（１９８５）前出。第二に、Ｂ細胞は、半透過濾過膜により、 ＰＭＡで処理したＥＬ４ＢＳ細胞から分離されると、増殖しない。ｚｈａｎｇら 、前出。マウスＬＦＡ−１、ヒトＬＦＡ−１あるいはヒトＬＦＡ−３に対する抗 体、および、マウスあるいはヒトＭＩＩＣクラス１１分子に対する抗体は、ヒト あるいはネズミＢ細胞のＥＬ４ＢＳに誘導される増殖を抑制しない。Ｚｕｂｌｅ ｒら、（１９８７）およびＺｈａｎｇら、前出。

ＣＤ４０抗原は、Ｂ細胞の細胞表面に発現される糖タンパク質である。Ｂ細胞の 分化のときに、この分子はまず前Ｂ細胞上に発現され、次いで、Ｂ細胞が形質細 胞になるときに、その細胞表面から消える。ＣＤ４０分子の抗ＣＤ４０抗体との 架橋は、Ｂ細胞に種々の効果を媒介する。ＣＤ４０抗原はヒト神経成長因子（Ｎ ＧＦ）レセプターおよび腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）レセプターに関連する ことは周知であり、このことは、ＣＤ４０が８細胞活性化における肖要な機能を 有するリガンドに対するレセプターであることを示唆する。

ＣＤ４０のリガンドは、活性化Ｔ細胞の細胞表面で同定された。

Ｆｅｎ５ｌｏｖら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９２）　＋４９：６５５：　Ｌ ａｎｅら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９９２）　２２：２５７３：　Ｎｏｅｌｌｅら、Ｐｒｏｃ 、Ｎａｔ　、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ユ皿Ａｎ（１９９２）　８９：６５５０ｏ　ＣＤ４０リガンドのｃＤＮ Ａクローニンクハ、ＴＮＦ−αと相同である１１型トランスメンブラン２１９ン バク質の特性を有する分子を明らかにした。Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ 　（１９９２＞　３５７：８０、および、ＳｐｒｉｇｇＳら、Ｊ、ＥＸ　、Ｍｅ ｄ、（１９９２）ｖ」・１５４３゜ＣＤ４０リガンドの細胞外ドメインは、トラ ンスメンプラン領域に近接した２つのアルギニン残基を含有し、これらはタンパ ク質分解的切断を受けてリガンドの可溶性形態を生じ得る可能性のある部位を提 供する。組換えＣＤ４０リガンドの発現は、この分子が精製Ｂ細胞の増殖を刺激 し、そしてＩＬ−４と共同してＩｇＨの分泌を媒介し得ることを示した。Ａｒｍ ｔｔａｇｅら、およびＳｐｒ　１ｇｇ５ら、前出。結果として活性化Ｔ細胞上の 機能性分子がなくなる、ＣＤ４０リガンドの遺伝子の異常のせいで、彼験体が１ ｇＭ以外の抗体イソ型を正常なレベルで産生できないことに特徴があるまれな病 気であるＸ連鎖性高１８Ｍ症候群が起こることが報告された。Ａ１１ｅｎら、　 社」１蔵（１９９３）　２１３．：９９０、および、Ｋｏｒ　ｔｈＭｕｅｒら、 Ｎａｔｕｒｅ　（１９９３）　出：５３９゜当業者に公知の全ての抗ＣＤ４０抗 体は、ヒ）Ｂ細胞に刺激効果を有する。公知の抗ＣＤ４０抗体を用いるＢ細胞表 面上へのＣＤ４０分子の架橋は、Ｂ細胞に種々の効果を媒介する。抗ＣＤ４０モ ノクローナル抗体（ａＡｂ）は、細胞間接着、増殖、および、ある種のサイトカ インと共同して、抗体を分泌する細胞への成熟化を誘導し得る。例えば、公知の 抗ＣＤ４０　ｎ＋Ａｂは、Ｂ細胞活性化においてＴヘルパー細胞の効果を模倣す ることを示した。ＦｅγＲ１＋を発現する付着細胞上にもたらされると、これら の抗体はＢ細胞の増殖を誘導する。Ｊ、　Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、５ｃｉｅｎ ｃｅ　（１９１１９）ｌｊ１＋７０゜　さらに、公知のＣＤ４０　ｍＡｂは、Ｉ Ｌ−４の存在下で、ＩｇＭ、　１ｇＧおよびＩｇＨの分泌のためのＴヘルパーシ グナルに代わり得る。

１１、　Ｇａ５ｅａｎら、Ｊ、１ｍ＋１ｕｎｏ１．　（１９９１）　１７：８゜ さらに、公知の抗ＣＤ４０　ｍＡｂは、リンパ節から単離されたＢ細胞のプログ ラムされた細胞死（アボートシス）を防止し得る。

本発明は、モノクローナル抗体産生細胞を生産する方法を提供する。この抗体は 、特定の細胞表面分子に対して結合特異性を有する；この方法は、上記の方法の 制限を克服する。

本発明はまた、抗Ｂ７抗体あるいはＢ７抗原（こ結合する分子を、その池の免疫 抑制剤と共に使用して、Ｔ細胞アネルギーを弓１き起こし、そしてそのことによ り移植片ｔｆｆｌ１色反応ある０ζｔＧＶ）ＩＤを予防あるいは治療する方法を 提供する。ざらに、本発明（±また、（１）Ｂ細胞応答を阻害し得、そして、り ２）抗体介在性疾患の予防あるいは治療に使用し得る新いＡ抗ＣＤ４０抗体を提 供する。

発明の要旨 本発明は、選択された膜関連抗原（こ対して特異的に反応するモノクローナル抗 原を産生じ得る不死化５胞系を生産する方法を提供する。この方法では、典型的 （こに！、〕＜キ二口ウイルスベクターを用いる抗原コープインク配７ｊ＋１の 組換え発現を経て、膜関連抗原は、昆虫細胞の細胞表面１こ産生される。これら の昆虫細胞を、宿主動物に注射する。膜関連抗原に対する抗体を産生じ得る細胞 を回収する；そのような細胞を、細胞培養において増殖するために不死化する。

不死イヒ細胞を、膜関連抗原に特異的な抗体の産生（こつ０てスクＩＪ−ニング する。典型的には表面に膜関連抗原を有するｎ昆虫細胞を使用する結合アッセイ を用いてスフ１ノーニンク゛を行う。上言己ジ１昆虫細胞表面の膜関連抗原に結 合する抗体を産生ずる不死イし細胞を、選択する。

１つの実施態様では、膜関連抗原をコードするＤＮＡ配夕配合１選択された昆虫 細胞での抗原発現に適したバキ１０ウィルスベクター中に、作動可能に挿入する 。抗原をコードするＤＮＡ配列を有するベクターを、例えばベクターのトランス フェクションにより、昆虫細胞へ導入する。細胞表面の膜関連抗原を産生ずるベ クターで形質転換された昆虫細胞を、選択する。

目的の膜関連抗原をコードする標的ＤＮＡ配列を単離する１つの方法は、標的Ｄ ＮＡ配列を含有するＤＮＡあるいはＲＮＡテンプレートのいずれかを使用するポ リメラーゼ連鎖反応を用いることである。本発明の実施に有用な昆虫細胞は、５ ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから得られ得る。膜関連抗原に対す る抗体分子を産生じ得る、一般的に使用される動物細胞は、牌細胞あるいはリン パ球である；宿主動物細胞の不死化を、標準的な方法により完了する。本発明の １つの実施態様では、宿主動物はマウスである。

上記の方法では、表面に膜関連抗原を有する、ヒト細胞を含む多（の非昆虫細胞 を使用し得る。このような非昆虫細胞は、初代細胞あるいは培養細胞であり得る 。１つの実施態様では、非昆虫細胞は、培養ヒトリンパ球、特に形質転換Ｂ細胞 であり得る。

本発明の方法において、有用な膜関連抗原には、以下のものが含まれる：ヒト細 胞表面タンパク質；末梢血単核細胞の抗原標識タンパク質、例えば、ＣＤ４０あ るいはＢ７ｉおよび、ヒト細胞表面に存在するウィルス抗原タンパク質０本発明 ではまた、選択された膜関連抗原に特異的な抗体を含有する血清を産生ずる方法 を記載する。この方法おいて、膜関連抗原は昆虫細胞の細胞表面に存在し、この 細胞を宿主動物に注射し、そして、膜関連抗原に特異的な抗体の存在について動 物由来の血清をスクリー・ニングする。このようなスクリーニングには、典型的 には、細胞表面に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイを使用す る。

また、スクリーニングアッセイで、抗原を発現する組換え非昆虫細胞を用いて、 選択された膜関連抗原に対する抗体の存在について、血清およびハイブリドーマ 上清液を試験し得る。

本発明はまた、Ｂ７抗原に結合する分子（上記の方法により産生された抗Ｂ７モ ノクローナル抗体のような）と、免疫抑制剤との、被験体への共投与が、アロ抗 原（Ｔ細胞と同種の細胞固宵の抗原）に対して長期間継続するＴ細胞アネルギー を誘導し得るという発見に基づいている。

従って、本発明は、被験体における移植組織拒絶反応を予防する方法を提供し、 この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤 中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、　ＦＫ ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を投与 することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する分子 は抗Ｂ７抗体である。

さらに、本発明は、被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防あるいは 冶療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬 学的に受容可能な賦形剤中の、（１）Ｂ７抗原に結合する分子、および（２）シ クロスポリンＡ、　ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤 の治療上有効な量を投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、 Ｂ７抗原に結合する分子は抗Ｂ７抗体である。

さらに、本発明は、被験体のりウマチ様関節炎の予防および治療する方法を提供 し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦 形剤中の、（１）８７抗原に結合する分子、および（２）シクロスポリンＡ、　 ＦＫ５０６あるいはコルチコステロイドのような免疫抑制剤の治療上有効な量を 投与することを包含する。本発明の好ましい実施態様では、Ｂ７抗原に結合する 分子は抗Ｂ７抗体である。

上記の方法のさらに好ましい実施態様では、抗Ｂ７抗体は、本明細書に記載され ているように産生された、モノクローナル抗体であり、最も好ましくはＢ７−２ ４モノクローナル抗体である。

本発明はさらに、上記の方法により産生されたヒトＢ細胞の成長および分化を刺 激しない抗ＣＤ４０抗体の発見に基づく。逆に、これらの抗体は、比較的低濃度 で、ヒトＢ細胞表面を阻害し得る。従って、ヒトＢ細胞表面により産生される抗 体に介在される疾患あるいは症状を、予防あるいは治療するためにこれらの抗体 を使用し得る。これらの抗体はまた、Ｂ細胞応答を調節するのに有用な、ＣＤ４ ０抗原上の新規なエピトープを認識する。

従って、本発明は、ヒ）Ｂ細胞表面に位置するヒｌ−ＣＤ４０抗原に結合し得る モノクローナル抗体を提供し、ＣＤ４０抗原への抗体の結合は、Ｂ細胞の成長あ るいは分化を抑制する。

さらに、本発明は、被験体の抗体介在性疾患を予防あるいは治療する方法を提供 し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦 形剤中の、ヒトＢ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクロー ナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含する。ここにおいて、抗体のＣ Ｄ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げる。

さらに、本発明は、被験体のアレルギーのようなＩｇＥ介在性疾患を予防あるい は治療する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、 薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒ）Ｂ細胞表面に位置するヒ）　ＣＤ４０抗原 に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、こ こにおいて、抗体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を妨げ る。

さらに、本発明は、被験体の抗体介在性自己免疫疾患を予防あるいは冶療する方 法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容 可能な賦形剤中の、ヒ）Ｂ細胞表面に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモ ノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここにおいて、抗 体のＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長ある（１（ヨ分化を妨げる。この方 法によって治療が期待される特定の自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス （５ＬＥ）、原発性胆２）性肝硬変（ＰＢＣ）および特発性血小板減少性紫斑病 （ＩＴＰ）が含まれる。

さらに、本発明は、ＣＤ４０抗原の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体への結合と競 合し得るＣＤ４０抗原エピトープを提供し、ここにおいて、この抗体のヒ）Ｂ細 胞表面に位置するヒ）　ＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長あるいは分化を 抑制する。

上記目的のさらに好ましい実施態様では、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、上 記の方法により産生され、そして５Ｄ１２．３Ａ８あるいは３Ｃ６のいずれかで ある。

図面の簡単な説明 図ＩＡは、バキュロウィルス転移ベクターｐＡｃｃＢおよび多重クローニング部 位の配列の図解を示す。図ＩＢは、本発明の方法に従って、ヒ）　ＣＤ４０ある いはＢ７抗原を発現するＳｆ９細胞生産の図解を示す。

図２は、ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７抗原のコーディング領域を調製するのに使 用する、ポリメラーゼ連鎖反応プライマーの配列を示す。これらのプライマーは 、抗原Ｂ７およびＣＤ４０の公表されている全ＤＮＡコーディング配列（Ｆｒｅ ｅｍａｎら、１９８９；　Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｅら、１９８９）に基づいて構 築した。

図３は、抗（Ｂ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１と、ＡｃＢ７ウイルスに感染さ せたＳｆ９細胞およびヒトＣＤ２６を発現するＳｆ９細胞との反応を試験する、 ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

図４は、抗（ＣＤ４０）モ／　クロー　ｆ　ル抗床５２Ｃ６と、ＣＤ４０を発現 するＳｆ９細胞およびＢ７を発現するＳｆ９細胞との反応を試験する、ＥＬＩＳ Ａアッセイの結果を示す。

図５Ａ−Ｃは、ＣＤ４０あるいはＢ７を発現する、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞１ＡＲ ｃ細胞の蛍光細胞染色の結果を示す。

図６Ａ−Ｆは、ＣＤ４０およびＢ７を発現するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ細 胞、ならびに可溶性ＣＤ４０およびＢ７抗原の蛍光細胞染色を用いた競合アッセ イの結果を示す。

図７は、抗Ｂ７　Ｍａｂ　８７−２４のＦａｂフラグメントによる、Ｔ細胞の抗 ＣＤ３銹導Ｂ７介在性増殖の阻害を示す。

図８は、抗Ｂ７　Ｍａｂｓ　Ｂ７−２４　（四角）あるいはＢＢ−１（三角）に よる、Ｔ細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の阻害を示す。

図９は、（Ａ）ＭＡｂ　８７−２４あるいは（Ｂ）ＭＡｂ　ＢＢ−１による、３ 日間の一次ＭＬＣ（黒丸）および３日間の二次ＭＬＣ（白丸）時の、８７／ＣＤ ２８相互作用のブロッキング効果を示す。

図１０は、ＣｓＡによる、■細胞の抗ＣＤ３誘導Ｂ７介在性増殖の抑制を示す。

データは、異なるドナーのＴ細胞を用いた、３回の個別実験の平均値±Ｓ、Ｄで ある。

図１１は、二次ＭＬＣ時のアロ抗原誘導ＣＴＬ活性のブロッキングにおける、抗 Ｂ７　Ｍａｂ　８？−２４とＣｓＡとの相乗効果を示す。Ｔ細胞のＣＴＬ活性は 、培地のみ；　４００μｇ／ｍｌ　ＣｓＡ；　１０ｕｇ／＋Ｉｌｌ　Ｍａｂ　Ｂ ？−２４；あるいは、４００μｇ／ｍｌ　ＣｓＡおよび１０ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｍａ ｂ　Ｂ？−２４の存在下での、ＥＢＶ形質転ＰＡＢ細胞系ＡＲＣによる３日間の 再刺激後に測定した。

図１２Ａは、３つの新規な抗ＣＤ４０　ｍＡｂおよび１つの従来の抗ＣＤ４０　 ｍＡｂの、抗１ｇＭ誘導ヒｌ−Ｂ細胞増殖を共刺激する能力の比較である。図１ ２Ｂは、組換えインターロイキン−２（ｒｌＬ−２）の存在下での、図５Ａの実 験の繰り返しを示す。

図１３は、３つの新規な抗ＣＤ４０　ｍＡｂの、固定化抗１ｇＭおよび抗ＣＤ４ ０　ｍＡｂ　５２Ｃ６との共刺激により誘導されたヒ）Ｂ細胞増殖を阻害する能 力を示す。

図１４は、３つの新規な抗ＣＤ４０　ｍＡｂの、ＥＬ４Ｂ５誘導ヒトＢ細胞増殖 に対する効果を示す。

図１５は、可溶性ＣＤ４０　（ｈｃＤ４０．μ）の、ＥＬ４ＢＳ誘導ヒトＢ細胞 増殖に対する効果を示す。

図１６Ａおよび１６Ｂは、１つの新規な抗ＣＤ４０　＋ａＡｂ　５Ｄ１２の、ヒ トＢ細胞による、ヒ）Ｔ細胞誘導免疫グロブリン産生に対する効果を示す。

発明の詳細な説明 本明細書に記載されている発明は、以前に公表された刊行物および係属中の特許 出願を引用する。例えば、このような刊行物は、科学報文、特許、あるいは係属 中の出願からなる。

以上あるいは以下に掲載されたこれらの全刊行物および出願は、本明細書中で参 考として援用されている。

（以下余白） １、定ｊし 本明細書で使用される用語「膜関連抗原」、「細胞表面分子」および「細胞表面 抗原」とはすべて、タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドのことであり、 このタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドの少な（とも１つの抗原性部分 が、生物学的膜の表面に露出し、以下に示す１つまたはそれ以上の共有結合され た部分を有し得る：　１つまたはそれ以上の単糖あるいは複合糖部分（糖タンパ ク質として）、脂質部分（リポタンパク質として）、脂質および糖の組合せ部分 、あるいは、その他關訳後の改変。

「タンパク質」とは、典型的にはアミノ酸の長い鎖に基づくポリマー（ポリペプ チド）のことである。タンパク質は、１つ、２つ、あるいはそれ以上のポリペプ チド鎖から構成され得、さらに、炭水化物のようなポリペプチド鎖に関連するそ の他の型の物質を含有し得る。タン、ｆり質の大きさは、　（任意の数である） ｓ、ｏｏｏから数十万ｇ／ｍｏｌｅの広範囲におよ」；。

ｓ、ｏｏｏの数は、およそ４０−４５個のアミノ酸の存在に対応する。

約５．０００　ｇ／ｍｏｌｅ未満のタンパク質は、典型的にはポリペプチドある いは単にペプチドと呼ばれる（Ｂｏｈｉｎｓｋｉ）。

不明１１ｉ１１Ｆで使用される用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノク ローナル抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体、および、Ｆ　３Ｃ’ｓ　Ｆ＋！ｂ’＋ ２、Ｆｕのようなそれらのフラグメント、ならびに、親抗体の抗原結合機能をと どめているその他のフラグメントのことである。

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体分布を有す る抗体組成物のことである。この用語は、抗体の種あるいは起源に関して限定さ れず、さらに産生される様式により限定されることも意図されない。この用語は 、全免疫グロブリン、および、Ｆａｂ・、Ｆ＋ａｂ・）２、Ｆυ、およびその抗 体の抗原結合機能をとどめているその他のフラグメントのことを指す。いかなる 補乳類橿のモノクローナル抗体でも、本発明に使用され得る。しかし実際問題と して、モノクローナル抗体を産生ずるために要求されるハイブリッド細胞系する いはハイブリドーマをつくるのに使用するラットあるいは不ズミ細胞の入手可能 性の理由により、抗体は典型的にはラットあるいはネズミ起源となる。

本明細書で使用される用語「ヒト化抗体」とは、免疫グロブリンの枠組み構造領 域の少なくとも一部が、ヒト免疫グロブリン配列に由来することを意味する。

本明細書で使用される用語「１本鎖抗体」とは、結合抗体の結合ドメイン（重鎮 および軽鎖の両方）を決定し、結合機能を保存し得る連結部分を供給することに より調製される抗体のことである。本質的にこれは、抗原への結合に必要な可変 領域部分のみを有する、根本的に短縮された抗体の形をとる。１本鎖抗体の決定 および構築は、Ｌａｄｎｅｒらの米国特許第４．９４６．７７８号に記載されて いる。

本明細書で使用される用語ｒＢ７抗原に結合する分子」とは、同じ環境下ではそ の他の物質が８７抗原に複合体化されない環境下で、Ｂ７抗原と複合体を形成し 得る分子を意味する。その複合体は、ＣＤ２８あるいはＣＴＬＡ４抗原を介する 、Ｂ７の正常なシグナル変換経路を遮断する様式で形成される。Ｂ７抗原に結合 する分子には、ＣＤ２ｇ、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ　４１　ｇおよび抗Ｂ７抗体が 含まれる。

本明細書で使用される用ＫＭ　ｒ　ＣＤ４０抗原エピトープ」とは、ＣＤ４０抗 原それ自身を除いた、本発明の抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応し得る 分子のことである。ＣＤ４０抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグ メンント、ペプチド、炭水化物、脂質、およびその他の分子を含み得るが、本発 明の目的に対しては、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリ ゴペプチド擬似体（すなわち、ＣＤ４０抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合 物）、あるいはそれらの組合せである。適切なオリゴペプチド擬似体は、特に、 ＰＣＴ出願ｔｌｓ９１１０４２８２に記載されている。

Ｉｌ、°、　に文・　る　の この章では、免疫原としてトランスフェクトされた昆虫細胞を使用する、細胞表 面分子に対する抗体の生産および選択の方法を記載する。本発明のトランスフェ クトされた昆虫細胞はまた、スクリーニングアッセイに使用され得る。

１つの実施態様では、本発明は、細胞表面抗原に対するポリクローナル抗体を産 生ずる方法を包含する。この方法は以下の工程を包含する：（１）目的の抗原を コードする核酸コーディング配列の選択および単離、（目）コーディング配列の 効率よい発現を得るための、バキニロウィルス発現ベクターヘノコーディング配 列の挿入、（ｉｉｉ）選択された抗原を発現する組換え昆虫細胞を得るための、 発現ベクターの昆虫細胞へのトランスフェクト、および（ｉｖ）膜関連抗原を発 現する昆虫細胞を用いた宿主動物の免疫；を包含する、免疫工程。

免疫後に、宿主動物の血清を、目的の抗原を発現する、昆虫細胞以外の細胞に対 してスクリーニングする。あるいは、目的の抗原を含有する膜画分、またはある 場合には、精製した組換え産生抗原自体を、血清をスクリーニングするために使 用し得る。典型的には、（ａ）予め採血された血清、（ｂ）目的の抗原を発現し ない昆虫細胞で免疫した宿主動物の血清、および（ｃ）組換え昆虫細胞で免疫し た宿主動物の血清を、スクリーニングする。目的の抗原に特異的な抗体の存在は 、血清（ａ）および（ｂ）による陰性反応、および血清（ｅ）による陽性反応に よって示される。

本発明の別の実施態様では、本発明は、細胞表面タンパク質に対するモノクロー ナル抗体を産生ずる、ハイブリドーマの生産方法を包含する。この方法には、上 記の（ｉ）から（ｉｖ）の工程が包含される。組換え昆虫細胞を用いた宿主動物 の免疫後に、抗体産生細胞を、動物から単離する。本発明の好ましい実施態様で は、このような抗体産生細胞は、ハイブリドーマ細胞を生産するために使用され 、このハイブリドーマ細胞はクローン化されてモノクローナル抗体の産生に使用 される。

このようなハイブリドーマ細胞由来の上清液を、例えば、以下に記載されている 細胞に基づくスクリーニングアッセイにより、特異的な抗体産生についてスクリ ーニングする。

（以下余白） Ａ、　に文・　るコープ　ング　１の 選択された膜関連抗原に対する核酸コーディング配列は、公知の上記抗原のタン パク質成分に対するアミノ酸および／またはＤＮＡコーディング配列に基づいて 単離され得る。このコーディング配列は、生物学的ソースから標準の方法で単離 され得る（　Ａｕ５ｕｂｅｌらＨＭａｎｉａｔｉｓらＨＳａｍｂｒｏｏｋら）（ 例えば、ハイブリダイゼーション、分化ハイブリダイゼーシッン（ｄｉｆｆｅｒ ｅｒ＋Ｌｉａｌ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）、クローニングおよびプラーク スクリーニングなど）。また、目的の抗原をコーディングする合成オリゴヌクレ オチド配列は、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得、ま たは、例えば５ｙｎｔｈｅｔｉｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ社（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、 　ＣＡ）から購入され得る。大きなコーディング配列の場合、上記オリゴヌクレ オチドコーディング配列は、このコーディング配列に対応した多数のオリゴヌク レオチドフラグメントの縦列配列を包含する一連のクローニング工程を経て合成 され得る（ＣｒｅａＨＹｏｓｈｉｏらＨＥａｔｏｎら）。オリゴヌクレオチドコ ーディング配列は、標準の組換え方法（ＭａｎｉａｔｉｓらＨＡｕ５ｕｂｅｌら ）で、または、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｍｕｌｌｉｓ；　Ｍｕｌｌｉｓら）で増 幅され単離され得る。

上記膜関連抗原の配列が公知のまたは一部公知の場合、特異的な抗原コーディン グ配列が単離され得る。典型的には、この抗原コーディング配列は、ｃＤＮＡラ イブラリーから単離され、ＤＮＡフラグメントを、選択されたソースからベクタ ーへ挿入することによって生産され得る。膜抗原含有ソ−ス由来のＤＮＡフラグ メントを含有するｃ　ＤＮＡライブラリーは、標的ＲＮＡ分子から生産されたラ ンダムフラグメントｃ　ＤＮＡ分子を用いて組み立てられ得る。このようなｃＤ ＮＡライブラリーは、一般にバクテリア系（例えば、ラムダｇｔ１０　（Ｐｒｏ ｍｅｇａ、　Ｍａｄｉｓｏｎ　Ｗｌ））を用いて組み立てられ得るだけでなく、 従来技術を用いて、酵母または真核性発現系においても組み立てられ得る（Ａｕ ｓｕｂｅｌ）　。

このライブラリーは、典型的には、プローブとして、公知の、または、抗原コー ディング領域とノ＼イブリダイゼーンヨン可能なコンセンサス配列を有するオリ ゴヌクレオチドを用いて、膜関連抗原ＤＮＡ配列の存在に対してスクリーニング される（通常はハイブリダイゼーションによるＨ　Ａｕ５ｕｂｅｌら；Ｍａｎｉ ａｔｉｓら）。上記プローブは、放射性同位元素、ピオチンおよびンゴキンゲニ ンを含む多くの検出部分を有し得る。また、核酸プローブ配列が利用できない場 合、目的のコーディング領域を有するクローンのスクリーニングは、例えば、免 疫スクリーニングを用いて実行され得る（Ｐｒｏｍｅｇａ社製”ＰＲＯＴＯＣＬ ＯＮＥ−ｌａｍｂｄａ　ｇｔｌｌ系を使用ＨＹｏｕｎｇらＨＨｕｙｎｈら）０コ ーデイング領域は、正のシグナルを与える組換え型単離体から（ハイブリダイゼ ーションまたは免疫学的スクリーニングのいずれかによって）単離される。典型 的には、コーディング領域を含有するＤＮＡフラグメントは、制限消化によって 単離され、次いでサイズ分画およびフラグメント精製される。このような核酸コ ーディング領域は、次いで、以下のＢ項に記述されるｐＡｃｃ８ベクター（図Ｉ Ａ）のようなバ牛ユロウイルス転移ベクターに挿入するために加工され得る。ま た、ｐＶＬ１３９３ベクター（Ｌｕｃｋｏｗら）およびｐＡｃ３Ｔ３ベクター（ Ｓｕｍｍｅｒｓう）を含有するバキュロウィルスベクターが利用できる。

また、コーディング配列は、ボソメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅（Ｍｕｌｌｉ ｓＨＭｕｌｌｉｓら）によっても単離され得ル。上記ＰＣＲに有用なプライマー は、公知の核酸配列いずれからも調厚され得る。正確な配列が公知でない場合、 縮重プライマーが使用され得る（Ｍｕｌｌｉｓ；　Ｍｕｌｌｉｓら）。典型的に は、これらのプライマーは、８個またはそれ以上の共直線ヌクレオチドからなる ２つの核酸配列であり、ここで、この２つの配列は、標的配列を生産するために 、ある一定の間隔で分割され（実施例１）、対向するストランドに相捕的である 。

典型的なＰＣＲサイクルは以下の工程を包含した；高温での溶融、続いてアニー リング、および伸張。この反応を２５−３０サイクル繰り返す。ＰＣＲ生成物は 制限酵素によって消化され得、そして、分離用１．５％アガロースゲルを用いて 電気泳動で分析され得る。クローンに特異的な、増幅されたフラグメントは、典 型的には電気泳動ゲルサイズ分画法によって同定される。このクローンされた特 異的なりＮＡフラグメントは、次いで、例えば”ＧＥＮＥ　ＣＬＥＡＮ”系（Ｂ ＩＯ１０１，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）を用いて、上記ゲルから回収される。必 要であれば、このＤＮＡは、フェノールおよび／またはフェノール：クロロホル ム（１：　１）で抽出され得る。単離されたＤＮＡは、エタノールで沈澱する。

沈澱後、このＤＮＡは、バキュロウィルス発現ベクターに挿入するために使用さ れる。

ヒトＣＤ４０またはＢ７抗原を発現するＳｒ９細胞の生産を、模式的に図ＩＢに 示す。図に示すように、ＲＮＡは、エプスタイン−バーウィルス（ＥＢＶ）形質 転換ヒト肺臓細胞群から、標準の方法を用いて単離される（Ｃｈｉｒｇｖｉｎら ）。総ＲＮＡは、確立した方法によるランダムヘキサマーブライミングを用いて 、ｃ　ＤＮＡに転化される（詳細は実施例１に示す）。目的の膜関連抗原分子を コーディングするＤＮＡ分子は、５゛末端におけるクローニングに対する制限部 分を有する順方向および逆方向プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅によって生産さ れる。ヒトＣＤ４０およびヒトＢ７抗原に対するコーディング領域の調製に使用 されるこのようなｃ　ＤＮＡプライマーを、図２に示す。これらのプライマーは 、ＣＤ４０およびＢ７抗原に対する確立された完全なりＮＡココ−ィング配列に 基づいて構築された（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９８９；　Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ ら、１９８９）　。

さらに図ＩＢに関して、ｃ　ＤＮＡは、Ｔｈｅｒｗ＋ｕｓ　ａｑｕａｔｉｅｓか ら得られたポリメラーゼのような熱安定性ポリメラーゼ、等モルのデオキシヌク レオチドの混合物、および緩衝液系の存在下で、順方向プライマーおよび逆方向 プライマーと混合される（実施例１）。この混合物は、熱循環器中で増幅され、 得られたＰＣＲ産物は、バキュロウィルス転移ベクターのポリリンカー中でサブ クローニングされる。このようなベクターの１つであるｐＡｅｃ８を、図ＩＡに 図形的に示す。ポリへドロンプロモーター（Ｍｉｌｌｅｒ）　（ｐｏｌｙｈｅｄ ｒｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の下流に独特な制限エンドヌクレアーゼ部分を含有 する多くのこのようなバ牛ユロウイルス転移ベクターはいずれも、本発明の実施 に使用され得る：　Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角 体病ウィルス　（ＡｃＮＰＶ）　（ＷｕらＨＭａｔｓｕｕｒａらＨＴａｋｅｈａ ｒａら）、または、Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ核多角体病ウィルス（ｐＢｍＮＰＶ ）ポリヘトリンｍＲＮ　Ａ　（ＮｙｕｎｏｙａらＨ５ｅｋｉｎｅら）０バキユロ ウイルス中の発現前に、ＤＮＡの挿入は、典型的には配列決定分析によってＰＣ Ｒ誘導突然変異について検査され膜関連抗原コーディング配列のバキュロウィル スベクターへの挿入は、確立した方法に従って実行される（　Ａｕ５ｕｂｅｌら ；Ｍａｎｊａｔｉｓら；　Ｓａａ＋ｂｒｏｏｋら）。ヒトＢ７およびヒトＣＤ４ ０をコーディングする全長ｃＤＮＡは、クローニングに対する制限部分を有する プライマーを用いたＰＣＨによって生産された。ＰＣＲ増幅に対する鋳型は、Ｅ ＢＶ形質転換ヒト牌臓Ｂ細胞ＲＮＡから生産されたｃＤＮＡであった。手短に言 えば、単離されたＤＮＡコーディング領域は、バキュロウィルス転移ベクター、 または、ｐＡｅｃ８プラスミドのようなプラスミドに連結され、その結果、膜関 連コーディング領域はポリへドロンプロモー９−の下流となる。このポリへドロ ン遺伝子ＡＴＧはＡＴＴに突然変異しく図ＩＡ）、機能性ＡＴＧを有するコーデ ィング配列を含有しない組換え型クローンにおける躬訳開始が起こらないように する。生じるプラスミドＤＮＡは、野生型バキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ）で、 ５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｓｆ９細胞）由来の昆虫細胞 にトランスフェクンヨンされ、野生型ウィルスと膜関連抗原遺伝子を運搬する組 換え型ベクターとの間の生体内組換えを経て、組換え型ウィルス粒子を創造する 。

実施例１−２は、ＤＮＡの異形セグメントを含有する組換え型バキュロウィルス ベクターの単離を記述する：すなわち、ｐＡｃｃＤ４０　（全長ＣＤ４０分子を コーディングする）、ｐＡｃｃＤ４０−ＥＤ／Ｇｌｕ　（ＣＤ４０の細胞外ドメ インをコーディングする）、ｐＡｃＢ７　（全長８７分子をコーディングする） 、およびｐｃｅＢ７−ＥＤ／Ｇｌｕ　（８７分子の細胞ドメインをコーディング する）の単離を記述する。

Ｃ１のバキュロウィルスベタ　−による感上記の組換え型ウィルスは、次いで、 昆虫細胞を共感染させるために使用された（実施例２）。これらの細胞は、次い で、異形のＤＮＡ挿入によってコーディングされた抗原を発現させた。

Ｓｆ９細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ；　ＳｕｍＩｌｌｅ ｒｓら）は、１０６細胞／ｍ＋の音度で、組換え型ウィルスで感染させた。組換 え型／イキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞は、同定され、そしてクローン精 製された（　Ｓｕｍｍｅｒｓら）。

細胞表面抗原を発現させる細胞は、４８時間後に収穫され、そして宿主動物の免 疫化に使用された。分泌組換えタンパク質の生産のために、上記細胞は７２時間 の培養後収穫された。

Ｓｆ９細胞表面上の組換え型分子の発現（実施例３）は、ＥＬＩＳＡ／ステム（ Ｈａｒ　ｌｏｗら）を用いて試験された。図３は、抗（Ｂ７）モノクローナル抗 体ＢＢ−１は、ＡｃＢ７ウイルスに感染したＳｆ９細胞のみと反応し、ヒ）　Ｃ Ｄ２６を発現させるＳｆ９細胞とは反応しなかったことを示す。対照的に、抗（ ＣＤ２６）モノクローナル抗体Ｔａ−１は、ＣＤ４０を発現させるＳｆ９細胞の みと反応した。図４は、抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体５２Ｃ６が、ＣＤ４ ０を発現させるＳｆ９細胞のみと反応し、Ｂ７を発現させるＳｆ９細胞とは反応 しなかったことを示す。これらの結果は、バキ二ロウイルス系における選択され た膜関連抗原の生産に対する本発明の方法の特異性を示す。これらの結果は、膜 関連抗原がＳｆ９細胞表面上でさらされることも示す。

さらに、これらの結果は、選択された膜関連抗原を発現させるＳｆ９細胞が、選 択された抗原に対する反応性を有する抗体の存在に対して、血清およびハイブリ ドーマ上清液をスクリーニングするために使用され得ることを示唆する。

Ｄ６、を　る　の　への ポリクローナル抗体の生産に適当な宿主動物には、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツ ジ、モルモット、チンノずンジー、およびイヌが挙げられる。本発明の１つの利 点は、免疫化アジュ／＜ントか一般に必要とされないことである。

モノクローナル抗体の生産に使用される適当な宿主動物：こは、通Ｘ、ラット、 ハムスター、およびマウスが挙げられる。

しかし、ヒトに免疫的に近い抗体の生産を所望する場合、このような抗体のソー スは、チン、ｆンジーのような高等な霊長類を含み得る。ヘテロミエローマ融合 ツク−トナーとの融合（＝、モノクローナル抗体の生産に使用され得る（Ｃａｒ ｒｏｌｌ；　Ｐｅｒｋｉｎｓ、　１９９１）。このような融合は、混合した細胞 のボ１ノエチレングリコールへの曝露、および、細胞の強（Ｘ１１場への曝ｎ（ 電気融合）を含む多くの当業者に公知の方法によって達成され得る（　Ｈａｒｌ ｏｔら）。ハイブリドーマは、選択培地中での増殖によって選択され、次いで、 以下に記載のように抗原特異性ニついて試験さレル。

ＣＤ４０およびＢ７に対するモノクローナル抗体の生産１こつ（Ａて、マウスが 、細胞表面上に上記分子を発現させるＳｆ９細胞ζこよって免疫化された（実施 例５）。２回目の免疫化の１週間後、マウスは採血され、そして、血清は、特異 性抗体の存在：こ対してＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光細胞染色により分析された （実施例３）。図５は、上記細胞染色の結果を示す。この李田胞染色は、ＣＤ４ ０またはＢ７を発現させるＳｆ９細胞によって免疫イヒされたマウスが、ＥＢＶ 形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ　（Ａ、Ｔ、Ｃ，Ｃ，）、１２３０１　Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄ ｒ、、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ　２０８５２）に対するＣＤ４０およびＢ７ の双方（二′ｊ寸し陽性である血清力価（ｔｉｔｒｅ）を有したことを示す。こ れ４こ対して、対照Ｓｆ９細胞によって免疫化されたマウスは、上記ＡＲＣ細胞 ↓こ対する活性を示さなかった。この結果は、宿主動物が、選択の膜関連抗原を 発現させるＳ「９細胞によって免疫化され得ることを示し、免疫化の結果、組換 え型抗原に対する抗体を含む免疫応答が起こることを示す。上ｇ己の免疫化は、 Ｓｆ９昆虫細胞中でクローンされた組換え型ヒトタンパク質以外のヒトタンパク 質と相互反応性である抗体を生じない。

あるマウスにはＳｆ９細胞を発現させるＣＤ４０を、あるマウスにはＳＦ９細胞 を発現させるＢ７を、最終ブースター注射で投与した。

ブースター注射の３日後、ＩＩ４！臓は除去され、そして肺細胞は５Ｐ２１０ネ ズミミエローマ細胞と融合された。

Ｅ、　−な　ｔ　リンパＬの　および、モノクローナル抗体産生のための抗体産 生リンパ球は、好ましくは、免疫化された宿主動物の骨髄、ｐｓ臓またはリンパ 節から単離され得るようなり一リンパ球である（Ｈａｒｌｏｔら）。

また、Ｂ−リンパ球は末梢循環から単離され得る。この場合、血液試料は遠心分 離され、そして勾配分離法（ｇｒａｄｉｅｎｔ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ）によって粗（ｃｒｕｄｅ）末梢血リンパ球（ＰＢＬ）混合物を 産生する。単球およびＴ−リンパ球は、確立した手法によって、選択的にこの細 胞混合物から除去される（Ｍｉｓｈｅｌｌ）。上記の残りの細胞には、「バンニ ング（ｐａｎｎｉｎｇ）　Ｊ手続のような選択手続がとられ得る。この手続中に 、抗原親和性を有する細胞は、抗原を含有する親和性マトリックスによる選択的 捕捉によって濃縮される。本発明の意味からは、このようなマドソックスは、膜 関連抗原を発現させる細胞を含有する。

Ｂ−リンパ球が上記の循環から単離される場合、エプスタイン−バーウィルスの ような形質転換ウィルスによる形質転換が有利であり得る。形質転換細胞（リン パ芽球様細胞）は、継代培養ウェル中で分配され、そして培地中で数週間維持さ れ、特異性抗体産生に対して試験される。このような特異性抗体産生を示す培地 は、拡張され、そして、上記のようなポリエチレングリコールまたは電気融合を 含む１つまたはそれ以上の標準の融合プロトコルを用いて、種に適するミエロー マパートナ−細胞と融合される。種々のソース由来のＢ−リンパ球の１１１離お よび不死化の方法は、当業者に周知である。

本発明を支持すべ（実行された実験において、免疫化されたマウス由来の牌細胞 は、以前にｄｅ　Ｂｏｅｒら（１９８８）によって記述されたように、５Ｐ２７ ０ネズミミエローマ細胞ポリエチレングリコールと融合された。ハイブリドーマ クローンは実施例６に記載のように処理された。

表１　（実施例６）は、融合データを要約する。ＣＤ４０融合の後、細胞の半分 のみが、４８０ウエル中でシードされた。この結果、ハイブリドーマが３５１ウ エル中で増殖した。Ｂ７融合の後、この細胞は９６０のウェル中に分配され、そ して、この融合によりハイブリドーマが３１２ウエル中で増殖した。融合の１４ 日後、１２ウエルの上清液がプールされ、このプールは、ＡＲＣ細胞反応性であ る抗体の存在について試験された。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ４０融合由来の４つの プールおよびＢ７融合由来の１つのプールがＡＲＣ細胞に対して反応性であるこ とを明らかにした。反応性を示すプール由来の個々の上清液が再試験され、ＣＤ ４０反応性の４ウエルおよび８７反応性のｌウェルが同定された。上記の反応性 ウェル由来の細胞は、限界希釈によってクローニングされ、そして、３回の細胞 増殖の後、４つの安定な抗−（ＣＤ４０）ハイブリドーマクローン（ＣＤ４０− ３Ａ８、ＣＤ４Ｏ−３Ｃ６、ＣＤ４Ｏ−５Ｄ１２、ＣＤ４Ｏ−５）および１つの 安定な抗−（Ｂ７）ハイブリドーマクローン（Ｂ７−２４）が確立された。これ らの結果は、選択された膜関連抗原に対するモノクローナル抗体を分泌する安定 なハイブリドーマクローンを達成する能力を示す。

ハイブリドーマ融合物をスクリーニングする多くの方法が利用でき（ｌｌａｒｌ ｏｗら）、これらは以下を包含する：　（ｉ）例えば、放射性ｖＡ識された一部 精製または精製抗原のような標識された抗原、（１１）例えば、組換え型抗原を 発現させるＳｆ９細胞のような全細胞または透過細胞、を用いる抗体捕捉、およ び、　（１）溶液中の抗体／抗原、　（ｉｉ）固相の抗体／抗原、を用いる抗原 捕捉。

Ｆ、モノクローナル　の　の ＥＢＶ−形質転換細胞を、１次ハイブリドーマ上清液のスクリーニングに用い、 そして限界希釈クローニングの後の生成物のスクリーニングに用いた。以下に示 す複数の証拠は、４種の抗−（ＣＤ４０）および１種の抗−（Ｂ７）モノクロー ナル抗体が生成されたことを示唆する。

第１に、５種のハイブリドーマクローン全部からの上清液は、ＡＲＣ細胞および 他のＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系と反応したが、Ｔ細胞系の１ｌｓＢ（Ａτ、Ｃ， Ｃ，）およびＣＥｈｌＭ（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，）とは反応しなかった。

第２に、競合結合実験を、本発明のモノクローナル抗体および可溶形標的抗原を 用いて行った（実施例７）。ハイブリドーマ上清液を可溶形ＣＤ４０およびＢ７ とあらかじめインキュベートした〈実施例７）。続いて、混合物を蛍光細胞染色 のためにＡＲＣ細胞に添加した。競合実験の結果を図６に示す。データは、可溶 性Ｂ７が、ＡＲＣ細胞に対する抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体８７−２４の結 合を遮断し得たが、可溶性ＣＤ４０はし得なかったことを示す。逆に、可溶性Ｃ Ｄ４０は、ＡＲＣ細胞に対する抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体ＣＤ４Ｏ− ３Ａ８の結合を遮断し得たが、可溶性Ｂ７はし得なかったことを示す。別の３種 の抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体でも、類似の結果を得た。さらに、可溶 性ＣＤ４０が抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体に及ぼす効果、および可溶性 Ｂ７が抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体に及ぼす効果は、濃度に依存するもので あった。可溶性タンパク質の量が減少すると、ＡＲＣ細胞に対する抗体の結合の 遮断が減少した。

さらに分析するために、抗−（ＣＤ４０）および抗−（Ｂ７）モノクローナル抗 体を、それらの扁桃Ｂ細胞に結合する能力について試験した（実施例８）。表２ は、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の８９−９５パーセントが、４種の抗−（ＣＤ４ ０）モノクローナル抗体で陽性に染色されたことを示す。はぼ同じパーセントの 細胞が、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｇ２１１．５に陽性であった（Ｃ １ａｒｋら）。表３は、新たに単離した扁桃Ｂ細胞の１２−１７バーセントが、 抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４で陽性に染色されたことを示す。し かし、扁桃Ｂ細胞を固定化抗−（ＩｇＭ）抗体およびＩＬ−２の存在下で、５日 間インキュベートした場合、Ｂ７−２４に対する陽性細胞のパーセントは、約２ ５パーセントまで増加した。

さらに、扁桃Ｂ細胞が抗−（ＩｇＭ）抗体およびＩＬ−２で刺激された場合、８ ７−２４に陽性の８細胞の数が増加するだけでなく、細胞１個当りの蛍光染色量 にも著しい増加がみられ、これは刺激後、Ｂ７の発現が増加することを示唆した 。

上記のデータは、膜関連抗原と特異的に反応するモノクローナル抗体を単離する 手段が、本発明の方法によって与えられることを示唆する。本発明の方法により 得られたモノクローナル抗体は、上記のように類型され得るｆＨａｒｌｏｔら） 。

Ｇ、且建 モノクローナル抗体の生成のためには、精製した物質でマウスを免疫化すること が最も望ましい。しかし、膜抗原の精製には専門的で複雑な技術を要し、そして さらに膜からの抽出は、分子構造を改変させ得る。それに加えて、タンパク質を 可溶化すると、その免疫原性がしばしば減少する。それ故に、細胞表面抗原に対 するモノクローナル抗体のほとんどは、全細胞または膜画分でマウスを免疫化し た後に、得てきた。

多くの場合、特異的なリンパ球のサブセットをマウス＋：注射し、モノクローナ ル抗体の一団を得てきた。これらの抗体を、それらが結合する抗原の単離および 特徴付けに用いてきた。

マウスを全細胞で免疫化したとき、多数の異分子に対して抗体が作り出される。

それ故、ハイブリドーマクローンによって生成された特異的抗体をスクリーニン グするために、同じ細胞を用いることは困難である。

上記で触れた問題を避けるために、本発明の方法は、昆虫細胞中の膜関連抗原の 発現、および宿主動物を免疫化するためのこれら昆虫細胞の使用を包含する。Ｐ ＣＲ技術（Ｓａｉｋｉら、１９８５：　５ａｉｋｉら、１９８８；　Ｍｕｌｌｉ ｓ；　Ｍｕｌｌｉｓ、ら）を導入して以来、コードする核酸のコード配列がすで に公開されているタンパク質に対するｃＤＮＡをクローン化することは比較的直 接的になった。発現ベクターへのクローニングを容易にするために、完全なコー ド領域のみにわたるＰＣＢプライマーを使用し得、そしてこのプライマー中に制 限部位を取り込ませ得る。

ヒトの細胞内、分泌、およびトランスメンブランタンパク質は、ポリヘトリンタ ンパク質に対する必須でないバキュロウィルス遺伝子での調節下の細胞内におい て発現する場合、昆虫細胞中で高レベルで発現し得る（ｒｅｂｂら、１９８９； 　Ｌｕｃｋｏｗｉにより再検討、１９９０＞。本発明を支持すべく行った実験で は、ヒ）　ＣＤ４０またはヒトＢ７を発現する５Ｘ１０’個のＳｆ９細胞を２回 だけ注射すると、これらの抗原に対する良好な血清力価（ｔｉｔｒｅＳ）を得ら れることが示された。さらに、昆虫細胞自体は、ヒト細胞と相互反応性の免疫応 答を誘起しなかった。これは、ハイブリドーマクローンによる特異的抗体産生の スクリーニングに、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を使用することを可能にした。ここて 、偽陽性の結果を得る危険は最小であった。本発明の方法によって得た全ての陽 性１次ウェルは、実際、免疫化に用いられた抗原に特異的であった。

本発明の方法により得た抗体は、膜関連抗原に対するものであり、膜関連抗原を 検出するための診断試薬として使用するのに有利である。例えば、細胞表面マー カータンパク質に対する抗体、または細胞表面から突き出ているウィルスのタン パク質に対する抗体である。

■Ｆ！ｉの診断上の構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）は、ウィルス特異的抗 原の検出能力を有する抗ウイルス抗体の使用を包含する。

例えば、抗原は、抗原捕獲アッセイによって検出される。このアッセイでは、被 験体の血清試料中に存在するウィルス抗原は、抗原特異的モノクローナル抗体、 または抗原特異的ポリクローナル抗体と反応する。抗体は固体基質に結合し、次 いで、抗原は、抗−ウィルス抗体に対する、第２の異なった標識をした抗体によ って検出される。

本発明の方法によって得た抗ウイルス抗体は、抗ウイルス免疫応答を強化する手 段として使用され得る。それは、抗体−ウィルス複合体が、マクロファージおよ び他のエフェクター細胞によって、典型的に認識されるからである。抗体は、他 の治療で用いる抗体の投与量と同量を投与し得る。例えば、狂犬病、はしかおよ びＢ型肝炎のようなウィルス性疾患の早期インキュベーション中に、プールした ガンマグロブリンを、０．０２−０．１ｍｌ／ポンド体重で投与して、ウィルス が細胞内に入り込むことを阻害する。このように、膜関連ウィルス抗原と反応す る抗体は、単独で、他の抗ウイルス抗体の入った「カクテル（ｃｏｃｋｔａｉｌ ）　Ｊで、または他の抗ウイルス薬剤との複合体中で、受動的に投与され得、免 疫応答および／または抗ウイルス薬剤の効力を強化する。

１１］、　を　る 本発明は、上記の方法によって生成されるような抗体を使用することを意図する 。本発明の抗体は、以下の内のどちらかである。（１）ヒトＢ細胞の表面のヒト ＣＤ４０抗原と結合し、Ｂ細胞の分化、成長を刺激旦呈旦、または（２）Ｂ７抗 原に結合する。しかし、これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル 抗体、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、一本鎖抗体 、およびそれらのフラグメントであり得る。抗−ＣＤ４０抗体は、単独で用いら れる、一方、抗−８７抗体は、免疫抑制剤をも含有する組成物中で用いられる。

Ａ、！生立用１ モノクローナル抗体５Ｄ１２．３Ａ８．３Ｃ６、およびＢ７−２４を、本明細書 中の詳細な説明の第１１節および実施例１−７のように調製する。本発明の他の モノクローナル抗体も、これと同様に、または以下のように調製する。第１に、 ポリクローナル抗体を、ＣＤ４０または８７抗原に対して生じさせる。第２に、 ＣＤ４０またはＢ７に特異的なモノクローナル抗体を選択する。

１、ボデクローナル　。

ポリクローナル血清は、従来の方法により調製する。一般的に、まずＣＤ４０ま たはＢ７抗原を含有する溶液を用いて、適切な動物、特にマウス、ラット、ウサ ギ、またはヤギを免疫化する。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清量、および 標識した抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の有用性のために、ポリクローナル血清 の調製に好適である。一般的に、免疫化は、生理食塩水中、好ましくはフロイン ト完全アジュバントのようなアジュバント中に、抗体含有溶液を混合、または乳 化し、そしてその混合液または乳化液を、（一般的には、皮下または筋肉内）注 射することにより行う。５０−２００μｇ／注射で、典型的には十分である。一 般的に免疫化は、生理食塩水中のタンパク質を、１回またはそれ以上注射するこ とにより、２−６週間後に高められる。この場合、フロイント不完全７ジニバン トを用いるのが好ましい。あるいは、当該分野で周知の方法を用いる、インビト ロでの免疫化により抗体を生成し得る。本発明の目的では、インビトロでの上記 の方法は、インビボでの免疫化と同等と考えられる。

ポリクローナル抗血清を、以下のようにして得る。免疫化した動物から採血し、 ガラスまたはプラスチックの容器に入　′れて、その血液を２５°Ｃで１時間イ ンキュベートし、次いで、４°Ｃで２−１８時間インキュベートする。血清を遠 心分離（例えば、］、０００Ｘ　ｇで１０分間）により回収する。ウサギから１ 回の採血当り約２０２０−５Ｏを得る。

２、モノクローナル モノクローナル抗体を、にｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ 　（１９７５）　２５６：　４９５−９６の方法、またはその改変方法を用いて 調製する。典型的に、マウスまたはラットを、上記のように免疫化する。しかし 、血清を抽出するために動物から採血するよりはむしろ、肺臓（および任意に数 個の大きなリンパ節）を取り出し、単細胞に分離する方が良い。所望であれば、 肺臓細胞を（非特異的付着細胞を取り除いた後）、細胞懸１１！５液をタンパク 質抗原でコートしたプレートまたはウェルに注ぐことによりスクリーニングし得 る。抗原に対して特異的な膜関連免疫グロブリンを発現するＢ細胞はプレートに 結合し、そして懸濁液の残りと共には洗い流されない。次いで、得られたＢ細胞 、または全ての解離した肺臓細胞は、ミエローマ細胞との融合を誘導され、ハイ ブリドーマを形成する、そして選択培地（例えば、ヒボキサンチン、アミノプテ リン、チミジン培地、ｒＨＡＴＪ　）中で培養される。得られたハイブリドーマ は、限界希釈によりブレーティングし、そして所望の免疫化細胞表面抗原に対し て特異的に結合する（そして無関係の抗原には結合しない）抗体の生成について アッセイされる。次いて、選択したｍＡｂ分泌ハイブリドーマは、（例えば、組 織培養ビン、または中空ファイバーリアクターのような）インビトロ、またはく マウスの腹水のような）インビボのどちらがで培養される。

所望であれば、（ポリクローナルまたはモノクローナル）抗体は、従来技術を用 いて標識し得る。好適な標識は、発蛍光団、発色団、放射性原子（特に３２ｐお よび＋２５１　）、電子濃密試薬、酵素、および特異的結合パートナ−を有する リガンドである。酵素は、典型的に、それらの活性によって検出される。

例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常３，３°、５．５−ｆトラメチル ベンジジン（ＴＭＢ）を、分光光度計で定量可能な青い色素に変換する能力によ って検出される。「特異的結合パートナ−」とは、例えば、抗原とそれに対する 特異性を有するモノクローナル抗体との場合のように、高い特異性でリガンド分 子に結合する能力を有するタンパク質を指す。他の特異的結合パートナ−は、ビ オチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロティンＡ１　お よび当該分野で周知のおびただしいレセプター−リガンドカップルを包含する。

同じ標識でも幾つもの異なる様式で作用するので、上の試薬は、種々の標識を個 々のクラスに分類することを意味するのではないことを理解すべきである。例え ば、１′Ｉは、放射性標識として、または電子濃密試薬として働（。ＨＲＰは、 ｍＡｂに対する酵素または抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために様 々な標識を組合せ得る。例えば、ｍＡｂおよびアビジンもまた、本発明の実施に おいてｔＸＸａを必要とする：従って、ビオチンでｍＡｂを標識するならば、１ ２５１で標識したアビジンで、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンｌ１ｌＡｂで 、ａ＋Ａｂの存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明ら かであり、そして本発明の範囲内で、同等物と考えられる。

ＩＶ、　を　る 本発明の組成物は、２つの成分を含有する。２つの成分は、共同して、移植片拒 絶反応、ＧＶＨＤ、またはリウマチ様関節炎を予防し、治療することに治療学的 効果を有する。２つの成分は：　（１）　ＭＡｂ　Ｂ７−２４のようなり７抗原 に結合する分子；および（２）免疫抑制剤である。Ｂ７抗原に結合する分子は、 上記第１Ｉ＋節に記載のように、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＣＴＬＡ４１ｇ、およ び抗Ｂ７抗体を包含する。

本発明の抗Ｂ７抗体（またはＢ７抗原に結合する他の分子）は、１つ、またはそ れ以上の免疫抑制剤との組合せにより与えられる。免疫抑制剤は、Ｔ細胞の活性 化または増殖を、遮断または阻害する薬剤である。本発明の免疫抑制剤は、シク ロスポリンＡ　（ＣｓＡ）、コルチコステロイド（メトトレキサート、プレドニ ゾロン、デキサメタシン）、ＦＫ５０６、およびラバマイシン（ｒａｐａｍｙｃ ｉｎ）を、包含する。好ましくは、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡＳ１４５０ ６、またはコルチコステロイドであり、最も好ましくは、シクロスポリンＡであ る。

（以下余白） Ｖ、　ＣＤ４０　エピトープ 本発明のＣＤ４０抗原エピトープは、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体との免疫反 応性を有する分子である。この抗ＣＤ４０モノクローナル抗体の、ヒトＢ細胞の 表面にあるヒトＣＤ４０抗原への結合は、Ｂ細胞の成長または分化を妨げる。す なわち、こういったエピトープは、ＣＤ４０抗原に対する該抗体の結合と競合す る。これらのエピトープを同定するための系統だった技術は、Ｈ，Ｍ、　Ｇｅｙ ｓｅｎによる、米国特許第４．７０８．８７１号（これは、本明細書中に参考と して援用されている）に記載されているように、当該分野では周知である。典型 的に、これらのエピトープは、短いアミノ酸配列である。これらの配列は、アク セスが可能な限り、より長いペプチドまたはタンパク質配列中にはめ込み得る。

本発明のエピトープは、固相合成法のような標準ペプチド合成技術により調製さ れ得る。あるいは、本発明の配列は、組換え法によって、より大きなペプチドま たはタンパク質に組み込み得る。これは、目的の配列をコードするＤＮＡカセッ トを調製すること、および、適切な部位において修飾されるべきタンパク質をコ ードしているＤＮＡ中にそのカセットを連結することにより、最も容易に達成し 得る。配列ＤＮＡは、標準合成技術によって合成され得、または、好適な制限酵 素を用いて、ファージｐ　ＩＩＩ遺伝子から切り取られ得る。

本明細書中、同定したエピトープは、簡単な固相技術によって調製し得る。最小 の結合配列は、例えば、Ｈ，Ｍ、　Ｇｅｙｓｅｎによる米国特許第４．７０１１ ．８７１号に記載の方法を用０る標準技術によって、各エピトープについて系統 的に決定し得る。簡単に言えば、それぞれのビン上のただ一つのオリゴペプチド によって、各ピン上に独特のオリゴペプチドを宵するビンの固相配列に結合する ＣＤ４０抗原由来の重複オリゴペプチドの１セ、トを合成し得る。ビンを、９６ −ウェルのマイクロタイタープレートのフォーマットに合うように並べることで 、例えｉｆ、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体への結合に対して、全てのビンを同 時にアッセイすることが、可能になる。本方法を用０ることにより、連続したア ミノ酸の可能なサブセ・ノド全部に対する結合親和性を容易に決定し得る。

本発明のアナログも、標準固相方法により調製され、そしてそれらの方法は、Ｐ ＣＴ出願米国第９１７０４２８２号に記載されて０る。

〈以下余白） Ｖ＋、　および 本発明の抗体および組成物は、移植組織拒絶反応を抑止するために、または（１ ）ＧＶＨＤ、あるいはりウマチ様の関節炎、または（２）アレルギー、ＳＬＥ、 　ＰＢＣｌおよびＩＴＰのような抗体介在性疾患を予防あるいは治療するために 治療上有効な濃度で投与される。この目的を達するために、抗体または組成物は 、公知の様々な受容可能な賦形剤を用いて処方され得る。代表的には、抗体また は組成物は、静脈または腹腔内のどちらかに注射することにより投与される。こ の投与を行うための方法は、当業者に公知である。局所的または経口的に投与、 または粘膜を通じて送達され得る組成物を得ることもまた可能で有り得る。

被験体に投与する前に、処方成分が抗体に添加され得る。

液体の処方物が好ましい。例えば、これらの処方成分は、油、ポリマー、ビタミ ン、炭水化物、アミノ酸、塩、緩衝液、アルブミン、界面活性剤、あるいは充填 剤を含有し得る。好ましくは、炭水化物は、モノ、ジ、またはポリサッカライド のような糖または糖アルコール、あるいは水溶性グルカンを包含する。サツカラ イドまたはグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコー ス、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキスト ラン、プルラン、デキストリン、αおよびβシクロデキストリン、溶性デンプン 、ヒドロキシエチルデンプン、およびカルボキンメチルセルロース、またはそれ の混合物を包含し得る。

スクロースが最も好ましい。「糖アルコール」は、−〇Ｈ基を有するＣ４からＣ ８の戻化水素として定義され、そしてガラクチトール、イノシトール、マンニト ール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、およびアラビトールを包含 する。マンニトールが最も好ましい。上記のこれらの糖または糖アルコールは、 個別にまたは組み合わせて用いられ得る。糖または糖アルコールは、水性調製物 で可溶性である限り、使用される量に固定された制限はない。好ましくは、糖ま たは糖アルコール濃度は、１．Ｏｖ／ｖ％〜？、Ｏｖ／ｖ％の間であり、より好 ましくは２．０〜６．　Ｏｗ／ｖ％の間である。好ましくはアミノ酸は、カルチ ニン、アルギニン、およびベタインの左旋性（Ｌ）型を包含するが、他のアミノ 酸も添加され得る。好ましいポリマーは、平均分子量が２．　Ｇｏｏ〜３，００ ０の間であるポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、または平均分子量が３．０００ 〜５，０００の間であるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。凍結乾 燥前、または再構成後に溶液中のｐＨ変化を最小にするために組成物中で緩衝液 を用いることも好ましい。はとんどの生理的緩衝液が用いられ得るが、クエン酸 塩、リン酸塩、コハク酸塩、およびグルタミン酸塩の緩衝液、またはそれの混合 物が好ましい。最も好ましいのはクエン酸塩緩衝液である。好ましくはその濃度 は、０．０１〜０．３璽ｏ１／リツトルである。処方物に添加され得る界面活性 剤は、欧州特許第２７０．７９９号、および第２６８．１１０号に示される。

さらに抗体は、例えば、ポリマーへの共有結合により、化学的に改変され得、そ の循環半減期を増加する。好ましいポリマー、およびペプチドにそれらを付着す る方法は、本明細書中で参考としてそのすべてが援用される、米国特許第４．７ ６６、１０６号；第４．１７９．３３７号；第４．４９５．２８５号；および第 ４．６０９．５４６号に示されている。好ましいポリマーは、ポリオキシエチル 化されたポリオール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ は、室温で水に可溶性であり、そして一般式：Ｒ（０−ＣＨ２−ＣＨ２）、Ｏ− Ｒを有する。ここでＲは、水素あるいはアルキルまたはアルカノール基のような 保護基で有り得る。好ましくは、その保護基は、１〜Ｂの戻素を有し、より好ま しくは、それはメチルである。記号ｎは、正の整数であり、好ましくは１〜１． ０００の間、より好ましくは２〜５００の間である。ＰＥＧは、好ましくは１０ ００〜４０．０００の間の平均分子量を有し、より好ましくは２０００〜２０， ０００の間の、最も好ましくは３，０００〜１２，０００の間の平均分子量を有 する。好ましくは、ＰＥＧは少なくとも１つの水酸基を有し、より好ましくはそ れは末端の水酸基である。

この水酸基は、好ましくは活性化されインヒビター上の遊離アミノ基と反応する 。しかし反応基の型と量は、変動され得、本発明の共有結合的に結合されたＰＥ Ｇ／抗体を達成し得ることが理解され得る。

水溶性のポリオキシエチル化されたポリオールがまた、本発明において有用であ る。それらはポリオキシエチル化されたソルビトール、ポリオキシエチル化され たグルコース、ポリオキシエチル化されたグリセロール（ＰＯＧ）、などを包含 する。

ＰＯＧが好ましい。１つの理由は、ポリオキシエチル化されたグリセロールの骨 格が、例えば、動物およびヒトで天然にモノ−、ジー、トリグリセリドで存在す る骨格と同一だからである。

従って、この分枝は必ずしも身体で異質な物質として見られない。ＰＯＧは、好 ましくはＰＥＧと同一の範囲の分子量を有し得る。ＰＯＧの構造は、Ｋｎａｕｆ ら、１９８８年、Ｌ肛ｏ、＜Ｊｌｌｌ！１．　Ａｌ１５０６４〜１５０７０に示 され、モしてＰＯＧ／ＩＬ−２結合体の議論が、米国特許第４．７６６、１０６ 号で見い出される。その両者は、参考として本明細書に援用されている。

循環半減期の増加のための他の薬剤送達系は、リポソームである。リポソーム送 達系の調製方法は、Ｇａｂｉｚｏｎら、釦ル」Ｌ■ｕ五崩（１１Ｂ２）　ｄ：４ ７３４；　Ｃａｆｌｓｏ、　Ｂｌｏｃ　ｒａ　ｏ　ｓ　ｃｔｉ　（１９８１）　 ６４９：１２９；および５ｚｏｋａ、ｎ　Ｒｅｖ　ｓ　（１９８０）　９：４６ ７で議論されている。他の薬剤送達系は、当該技術で公知であり、そして例えば 、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら、ＤＲＵＧ　ＤＥＬＩＶＥＲＹ　ＳＹＳＴＥＭＳ　（Ｒ ，Ｌ、Ｊｕｌｉａｎｏ編、０ｘｆｏｒｄ、　Ｎ、Ｙ、１９８０）　Ｉ）ｐ、２５ ３〜３１５；　Ｍ、Ｌ、　Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ、　肱鉦Ｌ■■（１９８４）　３ ６：２７７に記載されている。

液体薬学的組成物が調製された後、好ましくは、分解を予防し、そして無菌状態 を維持するために、凍結乾燥される。

液体組成物を凍結乾燥する方法は、当業者に公知である。使用する直前に、組成 物は付加成分を含有し得る無菌の希釈液（例えば、リンガ−液、蒸留水、または 無菌の生理食塩水）で再構成され得る。再構成に際し、組成物は、好ましくは当 業者に公知の方法を用いて被験者に投与される。

上述したように、本発明の抗ＣＤ４０抗体および組成物は、ヒトの被験体を治療 するために用いられ、アレルギー、ＳＬＥ、　ＰＢＣおよびＩＴＰのような抗体 介在性疾患を予防または治療する。

抗Ｂ７抗体は、好ましくは移植組織拒絶反応、ＧＶＨＤ、またはリウマチ様の関 節炎の予防または治療に用いられる。これらの抗体の好ましい投与経路は、非経 口である。非経口投与において、本発明の組成物は、薬学的に受容可能な非経口 賦形剤と組み合わせて溶液、懸濁液、またはエマルジ璽ンのような注射可能な形 態で単位用量で処方され得る。そのような賦形剤は、本来、非毒性であり、そし て非治療的である。そのような賦形剤の例は、生理食塩水、リンガ−液、デキス トロース溶液、およびハンクス溶液である。不揮発油およびオレイン酸エチルの ような非水賦形剤がまた用いられ得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の５％ デキストロースである。賦形剤は、緩衝液および防腐剤を含む、等優性および化 学的安定性を増強する物質のような小量の添加剤を含有し得る。

投与の用量および様式は、個体に依存し得る。一般的に組成物は、抗体が１μｇ ／ｋｇ〜ｚｏｍｇ／ｋｇの間、より好ましくは２ｏμｇ／ｋｇ〜１０諷ｇ／ｋｇ の間、最も好ましくは１〜７■ｇ／ｋｇの間の投与量で与えられるように投与さ れる。好ましくは、それは瞬時投与で与えられ、瞬時投与後、４〜６時間の閉循 環レベルを１０〜２０倍増加する。瞬時投与の後、連続注入がまた使用され得る 。

ソノ場合、抗体は５〜２０μｓ／ｋｇ／分の投与で、より好ましくは７〜１５μ ｇ／ｋｇ／分の投与で注入され得る。

以下の実施例は本発明を例示し、本発明を制限する意図ではない。

社且亙圭Ｕ方法 １ｓｃｏｖｅ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｕｌｂｅｃｅｏｏｓ　 Ｅａｇｌｅ培地（ＩＭＤＭ）、および胎仔ウシ血清を、ＪＲＢｉｏｓｅｉｅｎｃ ｅｓ　（Ｌｅｎｅｘａ％Ｉｓ）より得た；ペニシリンおよびストレプトマイシン を、１ｒｖｌｎｅ　（Ｓａｎｔａ　Ａｎａ％ＣＡ）より得た；そしてポリエチレ ングリコール（分子量１５００）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｌｍ 　（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ）より得た。

！ＬＩＬ！Ｌ！ｉｌｌエ　５Ｐ２１０マウスミエローマ細胞、ハイブリドーマ細 胞、精製されたＴ細胞、ＥＢＶ形質転換されたＢ細胞、および細胞系ヲストレプ トマイシン（２００μｇ／■ｌ）、ペニシリン（２０００７■Ｉ）および１０％ の熱不活性化した胎仔ウシ血清を補足したＩＭＤＭ（完全ＩＭＤＭ）内で培養し た。Ｓｆ９昆虫細胞を、攪拌された（１２５〜１５Ｇｒｐ■）シェイカーフラス コで、０．５％の胎仔ウシ血清を補足したＭａｉｏｒｅｌｌａら（１９１１９） に記載された培地を用いて培養した。

３Ｔ６−Ｆｃ７　Ｒ［［細胞を、アミノプテリン（０，２ｐ　ｇ、　／ｓｌ）、 チミジン（５μｇ／■ｌ）、牛サンチン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒボキサンチン（ １５μｇ／ｌｌ）、マイコフェノール酸（２０μｇ／■ｌ）、デオキシシチジン （２゜３μｇ／ｍｌ）、および１０％の熱不活性化した胎仔ウシ血清で補足した ５０％のＤｕｌｂｅｃｅｏ’　ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’　ｓ培地、 および、５０％のＨＡＭ−Ｆ　１０培地からなる培地（完全ＤＭＥ／ＨＡＭ−Ｆ ＩＯ）で培養した。

３Ｔ６−Ｆｅ２　Ｒ１１／Ｂ７細胞を、４００　μｇ／ｉ＋ｌの０４１８（Ｇｉ ｂｃｏ）を含有する完全ＤＭＥ／ＨＡＭ−ＦＩＯ培地で培養した。

オヨ　抹消血単核細胞を、フィコール−ハイバック密度差遠心分離により、ヘパ リン化された血液（健康なボランティアより得た）から単離した。Ｔ細胞をＬｙ ｙａｐｈｏｋｗｌｋ（Ｌａｍｂｄａ、　Ｃａ１１ｆｏｒｎｉａ）（１λ）を用い て単核細胞およびＢ細胞を除去することにより濃縮した。ＥＢＶ形質転換された Ｂ細胞系ＡＢＣ１およびＰ８１５細胞系、Ｆａｙ　Ｒ１１およびＦＣ７ＲＩｌ＋ を発現するＮＫ耐性マウス肥絆細胞腫細胞系（Ｉｌａ、　Ｃ，ら、■江■（１９ ８幻旭ニア５２）を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）より得た。Ｗａ ｒｉ＋ｅｒｄａ（Ｐ、Ａ。

Ｍ、ら、Ｊ、　Ｅ　、ｅｄ、（１９９０）　広：１９１：記載されたようニ３７ ６−ＦｃγＲ１１，ＣＤ３２を発現するマウスの線維芽細胞細胞系、ヒトのＦｃ ７１０１高応答性対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）は、Ｄｒ、　Ｊ、　ｖａｎ　ｄｏ 直ｎｋｅｌ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈ８５ｐｉｔａｌＳＵｔｒｅｃｈｔ、　 Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）より快く供与された。突然変異型のマウスの 胸腺腫ＥＬ−４サブクローンＥＬ４ＢＳは、Ｄｒ、Ｒ，Ｈ，Ｚｕｂｌｅｒ、　Ｈ ｏｐｉｔａｌ　Ｃａｎｔｏｎａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｊｔａｊｒｅ、　Ｇｅｎｅｖ ａより供与された。ヒトＦｃ７ＲＩＩａのＨＲ（高応答性）対立遺伝子形態のハ イブリッド分子を発現するマウス３Ｔ６の形質転換体細胞は、Ｄｒ、　Ｐ、Ａ、 Ｍ、　Ｗａｒｍｅｒｄａｍ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｌ　１ｍｓｕｎｏｌｏｇｙｂ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｕ ｔｒｅｃｈｔ、　Ｕｔｒｅｃｈｔ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓより供与 された＠Ｗａｒｍｅｒｄａ−ら、Ｌ−土引■ユ（社）、、　（１９９１）　ｌ［ ：１３３８゜両細胞系をゲンタマイシン（８０μｇ／ｌ）および１０％の熱不活 性化したウシ胎児血清（ＦＣＳ）（１１ｙｃｌｏｎｅ、　Ｌｏｇａｎ、　ｔｌｔ ａｈ）で補足した１ｓｅｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂａｃｃｏ’ｓ 　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）で培養した。Ｂ細胞活性化能力の欠失の可能性を避 けるために、４〜８週間毎にＥＬ４ＢＳ細胞の新規のバッチを解かして用いた。

細胞系を、マイコプラズマリポソームＲＮ＾（ＧｅｎＰｒｏｂｅ、　Ｓａｎ　Ｄ ｉｅｇｏ、ＣＡ）用の３ＨラベルされたＤＮＡプローブの使用により、マイコプ ラズマ汚染を定期的にテストし、そして実験の経過の間、マイコプラズマは検出 されなかった。

１上ｌ［乙９　８ＩＪンパ球を、本質的にＤｅ　Ｇｒｏｏｔら、迦ｈｏｋｉｎｅ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９９０）　ｉ：３２１に記載されているように、扁桃 腺摘出を受けた子供から得た扁桃腺から単離した。要約すれば、組織をメスの刃 で離散させ、食細胞およびＮＫ細胞を５１ＭのＬ−ロイシンメチルエステル処理 で減らし、モしてＴ細胞を２−アミノエチルイソチオウロニウムブロマイドで処 理したヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）とのロゼッティングの１サイクルにより除去し た。得られた８９２８球調製物の純度は、抗（ＣＤ２０）　ｍＡｂ　Ｂｌ（Ｃｏ ｕｌｔｅｒ　Ｃ１ｏｎｅ、　Ｈｉａｌｅａｈ％ＦＡ）、または抗（ＣＤ３）　ｌ Ａｂ　０ＫＴ３（Ｏｒｔｈｏ、　Ｒａｒｊｔａｎ、　ＮＪ）、ならびにウサギ抗 （マウス　Ｉｇ）　（Ｚｙｍｅｄ、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ）の ＦＩＴＣが結合したＦ（ａｂ’）２フラグメントを用いた間接的な免疫蛍光のラ ベリング、およびＦＡＣＳ分析で調査した。Ｂ細胞調製物は、以下を含有した（ ６つの単離物の平均±ＳＤ）　：　９５±４％ＣＤ２０−陽性細胞、および２± １％ＣＤ３−陽性細胞。

近体　抗（ヒトＢ７）モノクローナル抗体ＢＢ−１（Ｙｏｋｏｃｈｉら、１９８ ２）をＤｒ、　Ｅ、Ａ、　Ｃ１ａｒｋ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗａｓ ｈｉｎｇｔｏｎ、　５ｅａｔｔＩｅ、　ＷＡ）から得、そして精製された抗体と して用いた。抗（ヒ）　ＣＤ４０）モノクローナル抗体Ｇ２７．　Ｓ　（Ｃ１ａ ｒｋら、１９８６）をＤｒ、　Ｊ、Ａ、　Ｌｅｃｌｂｅｔｔｅｒ　（Ｏｎｃｏｇ ｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　５ｅａｔＬｌｅ、　ＷＡ）がら得、そして精 製された抗体として用いた。抗（ＣＤ４０）モノクローナル抗体５２Ｃ６（Ｐａ ｕｌｉｅら、１９８５）をＤｒ、　Ｓ、　Ｐａｕｌｉｅ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｌｔ ｙｏｆ　Ｓｔｏｅｋｈｏｌｍ、　ＳｔｏｃｋｈｏｌｍＳＳｗｅｄｅｎ）から得、 そして精製された抗体として用いた。抗（ヒトＣＤ２６）モノクローナル抗体Ｔ ａ−１、および抗（ＣＤ２０）モノクローナル抗体Ｂ１をＣｏｕｌｔｅｒ　（Ｈ ４ａｌｅａｈ、　ＰＬ）から得た。抗（ＣＤ３）モ／　りｏ　−ｆ　ル抗体０Ｋ Ｔ３を、０ｒｔｈｏ　（Ｒａｒｉｔａｎ、　ＮＪ）から得、そして抗（ＬｅｕＭ ３）モノクローナル抗体をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　（Ｓａｎ　Ｊｏ ｓｅｓ　ＣＡ＞から得た。ビーズ（１＋＊ｍｕｎｏｂｅａｄｓ）に結合した抗（ ＩｇＭ）抗体をＢｉｏ−Ｒａｄ　（Ｒ４ｃｔｖｏｎｄ、　ＣＡ）から得た。

抗Ｂ７　Ｍａｂ　Ｂ７−２４　（ＩｇＧ２ａ、　ｘ　）、ならびに抗ＣＤ４０　 ｍＡｂｓ　５Ｄ１２．３Ｃ６および３Ａ８を上記の１１節に記載したように得、 そして精製された抗体として用いた。抗ＣＤ３　Ｍａｂ　ＣＬＢ−Ｔ３／４．１ 　（ＩｇＧ１、χ）を希釈された組織培養の上清液として用い、そしてそれは好 意によりＤｒ、　Ｌ、　Ａａｒｄｅｎ　（Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒｅｄ　Ｃｒｏｓｓ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ 　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ａ＋ｍｓｔｅｒｄａｍＳＴｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ）から供与された。抗ＣＤ３　Ｍａｂ　ＵＣＨＴＩ　（ＩｇＧ、　ｒ）を精製さ れた抗体として用い、そしてそれはＤｒ、　Ｐ、　Ｂｅｖｅｒｌｅｙ　（ｌｅｐ ｅｒｉａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｆｕｎｄ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　 ＵＫ）から供与された＠抗ＣＤ７２　Ｍａｂ　ＷＬ２２５　（ＩｇＧ２ａ、　ｘ 　）を精製された抗体として用い、そしてそれはＤｒ、　Ｋ、　Ｔｈ１ｅｌｅ＋ ５ａｎｓ　（Ｖｒｉｊｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ　Ｂｒｕｓｓｅｌｂ　Ｂｅ ｌｇｉｕｗ＋）により供与された。抗ＩＣＡＭ−Ｉ　Ｍａｂ　８４Ｈ１０を希釈 された腹水として用いた。抗ＣＤ４０　ｍＡｂ　５２Ｃ６は、Ｄｒ、　Ｓ、　Ｐ ａｕｌｉｅ　（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｒ　５ｔｏｃｋｈｏｌｉ、　Ｓｗｅｄ ｅｎ）より供与された。　Ｐａｕｌｉｅら、Ｊ、Ｉｓｍｕｎｏｌ、（１９ｇ９） 　ｌｊｉ：５９０ｏ　抗ＣＤ４０　＋ｅＡｂ　０２ｇ、５は、Ｄｒ、　Ｊ、Ａ、 　ＬｅｄｂｅｔＬｅｒ　（Ｏｎｅｏｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　５ｅａ ｔＬｌｅ％ＷＡ。

ＵＳＡ）より供与された。Ｃ１ａｒｋら、［＜１９８６）　８３：４４９４゜コ ントロールの抗体は以下のものであった：抗（β−グルコセレブロシダーゼ）　 ＩＡｂ　１ｌＥ４　（ＩｇＧ１）、Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら、ｈＬ」２Ｂｉｏｃｈ ｅｔ　（１９８３）　出：５８５、ならびにミエローマ免疫グロブリンＭＯＰＣ −２１（ＩｇＧ１）およびＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）　（Ｓｉｇｓａ、　 Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）。すべてのｍＡｂを精製された抗体調製物として 用いた。

ｈｃＤ４０．ｌ（μ融合タンパク質は、Ｄｒ、　Ｐ、　Ｌｉｎｅ　（Ｂａｓｅｌ 　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｂａ５ｅｌ、５ｗ１ ｔｚｅｒｌａｎｄ）より供与され、そしてそれをトランスフェクトされたＪ５５ ８Ｌ細胞の５倍に濃縮された上演液として用いた。Ｌａｎｅら、　ｕｒ、　Ｊ、 　Ｉｍ＋ｍｕ　ｏ　、（１９９２）　＠ｉ：２５７３゜ 本発明のモノクローナル抗体は、以下を包含する多くのリポータ一部分を用いて 、標準方法によりラベルされ得る：蛍光ラベル（一般にアビジンをリンクされた 、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン（ＴＭＲＩ ＴＣ）、ローダミン６００（ＸＲＩＴＣ）、「テキサスレッド（ＴＥＸＡＳ　Ｒ ＥＤ）Ｊなど）；放射活性部分（＋２Ｊなど）；発光物（ルシフェラーゼなど） ；酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオ キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなど）。

さらに、リポータ−抗体（本発明のモノクローナル抗体に結合特異性を有する抗 体、例えばヤギの抗マウス　ＩｇＧ）がまた、上記に記載したラベル性部分を用 い得る。

およ　オ「ゴヌ　レオチド　Ｅ、ｃｏｌｌ　ＤＮＡポリメラーゼ１（フレノウフ ラグメント）を、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｌｍ　Ｂｌｏｃｈｅｍｉ ｅａｌｓ　（ＢＭＢ）（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｌｓ、ＩＮ）から得た。　Ｔ４　 ＤＮＡリガーゼおよびＴ４　ＤＮＡポリメラーゼを、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）より得た；ニトロセルロースフィル ターを５ｅｈｌｅｌｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ　（Ｋｅｅｎｅ、　ＮＨ ）より得る。合成オリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーを、市販されて いる自動化されたオリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製した。または、注文 設計された合成オリゴヌクレオチドを、例えばＳｙｎ　ｔｈａｔ　１ｅ　Ｇｅｎ ｅｔｉｃｓ　（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）より購入し得る。ｃＤＮＡ合成キ ットおよびランダムプライミングラベリングキソトを、Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｌｍ　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊１ｃａｌ　（ＢＭＢ、１ｎｄｉａｎａｐｏ ｌｌｓ、ＩＮ）より得る。ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列は、上 述したようにいずれかで合成され得る。または、ペプチドは、標準のインビトロ 技術（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ％Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ　ＣＡ ）によって直接合成され得る。

ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の作業で行った通常の操作は、抗体の 精製を含めて、標準の手順（Ｈａｒｌｏｔら）により行った。

’　ＦＡＣＳアッセイ　細胞（１０’／試料）を１０μｌの一次抗体中で（１％ ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムで補足したＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢ ＳＳ　（ハンクス平衡塩類溶液、Ｇｉｂｅ。

／ＢＲＬ）中の１０μｌ／＋ａｌ）　４℃で２０分間、インキュベートした。Ｐ ＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、細胞を４℃で２０分間 、ヤギの抗（マウス　ＩｇＧ）抗体（ＪａｃｋｓｏｎＳＷｅｓｔ　’Ｇｒｏｖｅ 、　ＰＡ）のＦＩＴＣラベルしたＦａｂ・２フラグメント１００μｍ中でインキ ュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄し、そしてＰ ＢＳで１回洗浄した後、細胞を０．５１のＰＢＳ中で再度懸濁した。分析をＦＡ ＣＳＳＣＡＮ　Ｖ　（Ｂｅｃｔｏｎ　ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＳＳａｎ　Ｊｏｓｅ、 　ＣＡ）で行った。

（以下余白） ８７　Ｔ　ア　セイ 精製Ｔ細胞を、Ｆｅ７ＲＩｌａ高等応答動物（ｈｉｇｈ　ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ） の対立遺伝子でトランスフェクトされた３Ｔ６線維芽細胞および８７分子と共に 培養した（ｄｅ　Ｂｏｅｒ、　Ｍら、Ｅｕｒ、　Ｊ、ｍｍｕｎｏ　、（１９９２ ）　２２＋３０７１−３０７５）。′Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を測定 した。簡単に言えば、９６ウ工ル平底組織培養プレートにおいて、抗ＣＤ３　Ｍ ａｂ　ＣＬＢ−Ｔ３／４．１含有または未含有ノ２ｏｏμｌ／つ１にノ完全Ｉ　 ＭＤＭ中で、１０′個の放射線照射（２５００５ド）された３Ｔ６−Ｆｅ　７　 ＲＩ　Ｉ／Ｂ７細胞と共に、４　Ｘ　１０’個のＴ細胞を培養した。７２時間の 培養期間のうち最後の１６時間の間は、ｌμＣｉ／つ！ルの３Ｈ−チミジンでそ の細胞をパルスした。Ｔ細胞の増殖を３つのウェルの平均ｅｐｌｎとして表す。

Ｔ　ア・・セイ 精製Ｔ細胞を、ＦｃγＲＩ　Ｉａ高等応答動物の対立遺伝子でトランスフェクト された３Ｔ６線維芽細胞および８７分子と共に培養した。簡単に言えば、２４つ １ル平底組織培養プレートにおいて、抗ＣＤ３　Ｍａｂ　ＵＣＨＴ１＋７）存在 下テｌ　ｍｌ／つＪノ完全ＩＭＤＭ中で、０．２Ｘ　１０６個の放射線照射（２ ５００ラド）された３Ｔ６−Ｆａｙ　Ｒ１１／Ｂ７細胞と共に、１０６個のＴ細 胞を３〜４日間培養した。抗ＣＤ３再方向性細胞毒性アッセイにおいて、リンパ 球の細胞毒活性を下記のように分析した。

゛ムリンパ　立　ＭＬＣアッセイ 混合リンパ球培養（ＭＬＣ）において、刺激細胞としてＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞 系ＡＲＣを用いて、精製Ｔ細胞の増殖を測定した。

９６ウ工ル丸底組織培養プレート（Ｃｏｒｎ！ｎｇ）において、２００μｌ／ウ エルの完全ＩＭＤＭ培地中で、５Ｘ１０’個の放射線照射（５０００ラド）され た刺激細胞と共に、５Ｘ１０’個のＴ細胞を培養した。７２時間の培養期間のう ち最後の１６時間の間は、１μＣｉ／ウエルの３Ｈ−チミジンでその細胞をパル スした。Ｔ細胞の増殖を３つのウェルの平均ｅｐＨとして表す。二次ＭＬＣに対 しては、−次ＭＬＣに対する上記のように細胞を刺激した。二次ＭＬＣに対する Ｔ細胞芽細胞を、５〜７日の一次ＭＬＣ中で、続いて刺激細胞の非存在下で２〜 ４日間培養して生産した。−次または二次ＭＬＣ中に生産されるＴ細胞の細胞毒 活性を、マウスＰ８１５細胞を用いた抗ＣＤ３再方向性細胞毒性アッセイにおい て下記のように分析した。あるいは、ＣＴＬ活性を誘導するのに用いられるＥＢ Ｖ−形質転換Ｂ細胞は、標的細胞として役立った。

柵ＪＬＬＬ乙ユ瀘ヱー 標的として、Ｐ８１５ネズミ肥満細胞腫細胞またはＡＲＣＥＢＶ−形質転換Ｂ細 胞を用いて、４時間の標的細胞溶解アッセイにおいて、ＣＴＬ活性を測定した。

Ｐ８１５標的細胞の場合には、２μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３　Ｍａｂ　０ＫＴ３を用 いて、ＣＴＬを標的細胞に非特異的に架橋させた。標的細胞としてＡＲＣ細胞を 用いた場合には、アロ抗原特異性ＣＴＬのみがキリング工程（ｋｉｌｌｉｎｇ　 ｐｒｏｃｅｓｓ）において関与する。１０６個の標的細胞を、２００μＣｉの’ ＋　Ｉ　（ｒ−クロム酸ナトリウム（Ａｍｓｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌ＞と共に１時間培養し、続いて洗浄した。９６ウエルＶ底マイクロタイ タープレートにおいて、種々の量のエフェクター細胞と共に５ｏｏｏの５１Ｃｒ ｌ識の標的細胞を用いて総容ｆｉ　２００μｌ／ウエルでＣＴＬアッセイを行っ た。（それぞれ、自然放出及び最大放出の評価のために）、４個のウェルを２０ ０μｌ培地単独の５×１０３個の標的細胞で満たし、そして４個のウェルを１０ ０μ！培地および１００μｌサポニンの５×１０３個の標的細胞で満たした。Ｐ ８１５の場合には、（バックグラウンドの実験的溶解を測定するために）、３個 のウェルを抗ＣＤ３　Ｍａｂの非存在下でエフェクター細胞および標的細胞で満 たした。他の３個のウェルもまた、抗ＣＤ３の存在下で総溶解量を測定するため に、２μｇ７ｍ　ｌの抗ＣＤ３　Ｍａｂを含有した。プレートを２００　Ｘｇで １０分間遠心分離し、そして３７℃で４時間インキュベートした。その後、各ウ ェルの上清液１００μｍをガンマカウンターでカウントした。結果を、Ｐ８１５ 標的細胞に対する抗ＣＤ３依存性特異性放出の百分率、すなわちＡＲＣ標的細胞 に対するアロ抗原特異性放出の百分率として表す。

Ｂ　アッセイ 平底９６ウエルマイクロタイタープレートにおいて、１０％ウシ胎児血清を補足 した２００μｌのＩ　ＭＤＭ中で、Ｂ細胞（ｌウェル当り４×１０４個）を培養 した。固定化した抗−（ＩｇＭ）抗体（イムノピーズ；　５　ｕ　ｇ／ｍｌ　； 　ＢｉｏＲａｄ、　Ｒｉｃｈ＋＋ａｎｄ、　ＣＡ）を加えることによりＢ細胞を 刺激した。指示されたところに１０００／ｓ＋１の組換えＩＬ−２を加えた。さ まざまな濃度のｍＡｂを微量培養の開始時に加え、そして１８時間のパルシング 後、３日目の［３旧−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を評価し た。

Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ　Ｂ　アッセイ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕらによって、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８９）　２５ユ・７ ｏに記載されたのと類似の培養系において、抗ＣＤ４０　ｍＡｂがＢ細胞増殖を 刺激する能力を試験するために、ヒ）ＦｃγＲ１１のＩＩＲ対立対立遺伝金形現 するマウス３Ｔ６トランスフエクタント細胞を用いた。Ｂ細胞（ｌウェル当り２ Ｘ１０’個）を、平底マイクロウェルにおいて（５０００ラドで放射線照射され た）ＩＸＩＯ’個のトランスフェクタント細胞の存在下、１０％０％ラン血清お よび１００　Ｕ／ｌｌの組換えＩＬ−４を補足した２ｏｏｔＩｌのＩＭＤＭ中で 培養した。そのＢ細胞を加える前に、３Ｔ６細胞を培養プラスチックに少なくと も５時間面着サセタ。抗ＣＤ４０　ｍＡｂを１５　ｎｇ／＠ｌから２０００　ｎ ｇ／ｍｌまテノさまざまな濃度で加え、そして［３Ｈ］−チミジンで１８時間パ ルシングして７日月にチミジンの取り込みを測定することにより、Ｂ細胞の増殖 を評価した。

ＥＬ４ＢＳ　とのＢ　°　アッセイ Ｂ細胞（ｌウェル当り１０００個）を、放射線照射（ｓｏｏｏラド）されたＥＬ ４ＢＳ細胞（１ウェル当り５Ｘ１０’個）と共に、平底マイクロタイタープレー トおいて、熱処理により不活性化した１０％ウシ胎児血清、５　ｎｇ／ｍｌのホ ルボール−１２−ミリステート　１３−アセテ−１−（５４ｇｍｓ）および５罵 とトＴ細胞上溝液を補足した２００μｍのＩＭＤＭ中で培養した。さまざまな濃 度の麿Ａｂを培養の開始時に加え、そして［３Ｈ］−チミジンで１８時間のパル シング後６臼目にチミジンの取り込みを評価した。Ｔ細胞上清液を調製するため に、Ｉｕｇ／ｍｌのＰＨＡおよび１０　ｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下、精製Ｔ細 胞を１０６個／１の密度で３６時間培養した。Ｗｅｎら、上述。その細胞を遠心 分離することによりＴ細胞上清液を得て、そしてそれを−２０°Ｃで貯蔵した。

Ｔ細胞上清液がＥＬ４ＢＳ−Ｂ細胞培養液中でヒ）Ｂ細胞の増殖を高める効力を 試験し、そして最も効力のある上清液をプールし、そして実験に用いた。

Ｂ　による　に・　るヒトＴ　ヘルバーア　セ盃 ９６ウ工ル組織培養プレートを、抗ＣＤ３　ｍＡｂ　ＣＬＢ−Ｔ３／３（ＣＬＢ 、　Ａｓｓｔｅｒｃｌａｍ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の腹水液の１ ＋ＳＯＯ希釈液でコートした。示されるように、共刺激性ｍＡｂを加えた：抗Ｃ Ｄ２　ｍＡｂ　ＣＬＢ−Ｔ１１．１／１およびＣＬＢ−Ｔｌｌ、２／１（ＣＬＢ 、　Ａｌｓｔｅｒｄａｍ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、共に腹水１： １０００および抗ＣＤ２［１ｍＡｂ　ＣＬＢ−２８／１（ＣＬＢ、　Ａｓｓｔｅ ｒｄａｍ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。次いで、扁桃（ｔｏｎｓｉｌ ｌａｒ）のＴ細胞（３０００ラド放射線照射；１ウェル当り１０５個）、扁桃の Ｂ細胞（１ウェル当り１０′個）およびｒｌＬ−２（２０Ｕ／諷ｌ）を加えた。

各細胞培養の最終容量は２００μｍであった。８日後、細胞を遠心し、そして細 胞を含まない上清液を集めた。（希釈された）試料中のヒトＩｇＭおよびＩｇＧ の濃度を以下のようにＥＬＩＳＡにより算出した。

グロブワンの　に・　るＥＬＩＳＡアッセイヒトＩｇＭおよびＩｇＧの濃度をＥ ＬＩＳＡにより算出した。４μｇ／冒ｌのマウス抗ヒトＩｇＧ　ｓＡｂ　ＭＨ１ ６−０１（ＣＬＢ、　Ａ＋ａｓｔｅｒｄａｔ　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ ）または１．２μｇ／ｍｌのマウス抗ヒトＩｇＭ　ｍＡｂ　４１０２（Ｔａｇｏ 、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）の０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６） を用いて、４℃で１６６時間インキュページンすることにより、９６ウエルＥＬ ＩＳＡプレートをコートした。プレートをＰＢＳ−０，０５％Ｔｖｅｅｎ−２０ （ＰＢＳ−Ｔ曹ｅｅｎ）で３回洗浄し、そしてＢＳＡで１時間飽和させた。２回 洗浄後、試験試料の種々の希釈液でプレートを３７℃で１時間インキュベートし た。３回の洗浄後、ｌμｇ／冒１のベルオキシダーゼ標識のマウス抗ヒトＩｇＧ 震Ａｂ　Ｍｌ　１６−０１（ＣＬＢ）またはマウス抗、ヒトＩｇＭ　ｍＡｂ　Ｍ Ｗ　１５−０１（ＣＬＢ）で３７℃で１時間インキュベーシゴンすることにより 、結合した１ｇを検出した。プレートを４回洗浄し、そして基質として０−フ二 二レンジアミンを加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を示した。

各アッセイに対して標準曲線を作成するために、ヒトの標準血清（ＨＯＤ、　Ｃ ＬＢ）を用いた。

゛　ア・・セイ ＡＲＣ細胞（１０６個／試料）を１００μｌの一次抗体（ＰＢＳ−ＢＳＡ、また は、Ｉ　Ｘ　ＢＳＡおよび０．０５％アジ化ナトリウムを補足したＲａｎｋｓ平 衡塩類溶液（）ＩＢＳＳ）中１０μｇ／ｍｌ）中で４°Ｃで２０分間インキュベ ートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたは）ＩＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄後、ヤギ抗（マ ウスＩｇＧ＞抗体（Ｊａｃｋｓ６ｎ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡ）のＦＩ ＴＣ標識Ｆ（ａｂ’）２フラグメント１００μｍ中で細胞を４℃で２０分間イン キュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたはＪＩＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄し、そし てＰＢＳで１回洗浄した後、細胞を０．５　ｍｌ　ＰＢＳ中に再懸濁した。ＦＡ ＣＳＣＡＮＶ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ、　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、　Ｃ Ａ）により分析を行った。

あるいは、ＰＭＡ（５ｎｇ／■１）およびヒトＴ細胞上清液（５％）を含む培地 中で培養する前に、および培養中の異なった時点でＥＬ４ＢＳ細胞を集めた。０ ．０５％アジ化ナトリウムを補足したＨａｎｋ平衡塩類溶液（４℃）１００μｍ 中で希釈されたｈｃＤ４０−Ｈμを含む、トランスフェクトされた細胞の上清液 １０μｌを用いて、細胞を３０分間インキュベートした。これに続いて、ウサギ 抗（ヒト１ｇＭ）のＦＩＴＣ−複合Ｐ（ａｂ’）２フラグメント（Ｃｅｎｔｒａ ｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　。

ｆ　ｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ、　Ａｖｓ ｔｅｒｄａｍ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でインキユベーシヨンした 。コントロールとして、ＦＩＴＣ−１１［合体のみで細胞をインキュベートした 。分析のために、ＦＡＣＳｅａｎ−４細胞蛍光分析機（ＢｅｅｔｏｎおよびＤｉ ｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた。

ヨウ化プロビジウムの使用により、分析から非生存細胞を除外した。

案ｍ上 ＣＤ４０およびＢ７のＰＣＩ’ｌクローニングＣｈｉｒｇｖｉｎら（１９７９） により本質的に記載されるように、ＥＢＶ−形質転換ヒト肺臓細胞集団からＲＮ Ａを単離した。簡単に言えば、細胞を、リン酸塩緩衝化生理食塩水ＣＰＢＳ）で ２回洗浄し、そして０．１Ｍ２−メルカプトエタノールの存在下で５Ｍグアニジ ウムチオシアネート中で溶解した。細胞溶解物を、不連続ＣｓＣｌ勾配（Ｃｈｉ ｒｇｖｉｎら）上で層化し、そしてＢｅｃｋｓａｎ　５Ｗ２８０−ターを用いて ２６．００Ｏｒｐｍで１６時間遠心分離した。ペレットをＤＥＰＣ処理Ｈ２０に 溶かすことによりＲＮＡを回収した。ＲＮＡをエタノールで１回沈澱させ、ＤＥ ＰＣ処理Ｈ２０に再懸濁し、そして−７０℃で貯蔵した。

５００単位のＬＭｖ−ＲＴ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）、　５　μＭシランムへキサ？ −（Ｐｈａｒ＋ｍａｅｉａ、　Ｐｌｓｃａｔａｖａｙ、　ＮＪ）、１　ｍＭ　Ｄ ＴＴ、　ｄＮＴＰ混合物（各０．５＋＊Ｍ）、１０　ｍＭ　Ｔｒｌｓ−ＨＣｌ　 ｐ）Ｉ　［１，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ、　２．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２および０． １　ｍｇ／ｍｌ　ＢＳ屓ウシ血清アルブミン）を含む反応緩衝液５０μｌ中でラ ンダムへ牛サマーブライミングを用いて、全ＲＮＡ（１０μｇ／反応）をｃＤＮ Ａに変換した。３７℃で１時間インキニベーシヨンした後、試料を３分間煮沸し 、そして−７０℃で貯蔵した。既知のＣＤ４０およびＢ７の配列に相同性を有す る配列を含んだプライマーを用いて、ＣＤ４０および８７分子をコードするＤＮ ＡをＰＣＨにより生産し、そこでプライマーはまたクローニングに有用な制限部 位をコードした（図２）。これらのプライマーは、Ｂ７およびＣＤ４０に対する 公知のｅＤＮＡコード配列に基づいていた（Ｆｒｅｅｍａｎら、　１９１１９： 　ｓｔａｍｅｎｋｏｖｔｃら、　１９８９）。すべてのプライマーは、５°末端 で、続いてクローニングのための制限部位でＣ−Ｇクランプにより開始する（図 ２において太字で示される）。可溶形のＢ７およびＣＤ４０のクローニングのた めの、逆方向プライマーにおける下線の配列は、アフィニチイ精製に用いられる モノクローナル抗体により認識されるエピトープを表す。括弧内の数字は、ＣＤ ４０およびＢ７に対する公知のｃＤＮＡに関するプライマーの位置を表す。

ＰＣＲ増幅に対して、１μｍのｃＤＮＡは、ｌμ１（１０ピコモル）の順方向プ ライマー、１μ１（１０ピコモル）の逆方向プライマー、および４７μｍのＰＣ Ｒ混合物を混合して作られた。ＰＣＲ混合物は、１．２５単位のＴａｑポリメラ ーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ、　Ｎｏｒ−ｗａｌｋ、　ＣＴ） 、ｄＮＴＰａ合物（各０．２＋＊Ｍ）、１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ｃＨＬ　ｐＨ８ ，３，５０ｍＭ　ＫＣＩ。

２．５　＋ｉＭ　ＭｇＣｌ２および０．１　ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡから成っていた 。７０μｍの鉱油を５０μｍのＰＣＲ混合物にかぶせ、そしてＰｅｒｋｌｎ−Ｅ １ｍｅｒ／Ｃａｔｕｓ　ｔｈｅｒ１０ｃｙｃｌｅｒ中で増幅を２５サイクル行っ た（９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のブライマーアニーリングおよび７ ２℃で１゜５分の伸張反応〉。増幅を２５サイクル行った後、ＰＣＲ産物を得た 。

増幅産物を、Ｂｇｌ　Ｉ　＋およびＫｐｎｌで消化しく図ＩＢ）、そしてサイズ 分画により単離した。バキュロウィルスでの発現前に、ＰＣＲ誘発の変異の導入 を防ぐために、配列分析により各フラグメントのＤＮＡ配列を確認した。バキュ ロウィルス転移ベクターｐＡｃＣ８もまたＢｇｌｌ＋およびＫｐｎｌで消化した （図ＩＢ）。

増幅されたフラグメントを線状１）ＡＣＣ８ベクターに連結した（挿入片二ベク ターの比は３：１であった）。連結産物を細菌株ＤＨ５α（Ｇｉｂｅｏ／ＢＲＬ 、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ）内に形質転換し、そして組換えｐＡｃｃ ８ベクターをアンピシリン耐性に基づいて選別した。

組換えプラスミドを細菌クローン（ＭａｎｉａｔｉｓらＨＡｕ５ｕｂｅｌら）か ら単離し、そして目的の挿入片の存在をポリメラーゼ連鎖反応を用いて確認した （上記参照）。標準的手法により、プラスミドの大量調製を行った（Ａｕｓｕｂ ｅｌら：　ＭａｎｉａｔｉｓらＨＳａｍｂｒｏｏｋら）。

（以下余白） 裏Ｊｕｌ ヒトＣＤ４０およびＢ７のバキュロウィルス転移ベクターのｐＡｃｃＤ４０（全 長ＣＤ４０分子をコードする）、ｐＡｃＣＤ４０−ＥＤ／Ｇｌｕ（ＣＤ４０の細 胞外ドメインをコードする）、ｐＡｃＢ？（全長８７分子をコードする）および 匹ｃＢ７−ＥＤ／Ｇｌｕ（８７分子の細胞ドメインをコードする）を用いて、ヒ トＣＤ４０およびヒトＢ７をコードする配列をＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉ ｆｏｒｎｉｃａバキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ）中に組換えした。

プラスミドを野生型バキュロウィルスＤＮＡ（２−１０ｐｆｕ）（ＡｃＮＰＶ； 　Ｓｕｍｍｅｒら）と共に、１０６細胞／＋ｔｌの密度でＳＦ９　（Ｓｐｏｄｏ ｐｔｅｒａｆ　ｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞内にトランスフェクトした（Ｓｕ＋ｓ ｍｅｒｓら）。組換えバキュロウィルス感染Ｓｆ９細胞を同定し、そしてクロー ン精製した（Ｓｕｍｍｅｒｓら）０ 組換えタンパクの細胞表面の発現のために、培養の４８時間後に細胞を集めた； 分泌された組換えタンパクの産生のために、培養の７２時間後に細胞を集めた。

Ｌ立五ユ 江ｌ」■ＬＩＳＡ 組換えウィルスで感染されたＳｆ９昆虫細胞を２４ウエルプレート内で４８時間 培養した。組織培養培地を除去後、抗体を含む１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（ＰＢＳ− ＢＳＡ）　０．２５−１を用いて、室温（ＲＴ）で４５分間プレートをインキユ ベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡで３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに 複合化したヤギ抗（マウス全１ｇ）免疫グロブリフ（Ｚｙ＋＊ｅｄ、　５ｏｕｔ ｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｅｉｓｃｏ、　ＣＡ）のＰＢＳ−ＢＳＡによる１／２５０ 希釈液２５０μｍを用いて、ＲＴで３５分間インキコヘートシた。ＰＢＳ−ＢＳ Ａで５回洗浄することにより、未結合のペルオキシダーゼ活性を除去した。２議 ｇ／ｍ　１の３，３°、５，５°−テトラメチルベンジジンのエタノール液０． ５　ｍｌを、１０　ｍＭ酢酸ナトリウム、１０　ｗＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（ｐ）Ｉ 　５．０）で１０　ｍｌまで希釈し、そして０．０３％（Ｖ／Ｖ）　［１２０２ を加えることにより調製されたアッセイ混合物を加えることにより、結合したペ ルオキシダーゼ活性を表した。１０分後に、Ｉ　Ｍ　Ｈ２ＳＯ４１００μｌを加 えることにより反応を停止した。

生存Ｓｆ９細胞に関して行われた上記のＥＬＩＳＡアッセイは、以下の結果を与 えた。図３は、２４ウエルプレート内で４８時間培養したｐＡｅＢ？およびｐＡ ｃｃＤ２６で感染したＳｆ９細胞に対するデータを表している。ＥＬＩＳＡに使 用される抗体は以下の通りであった：８７−２４、抗−ＣＢ？）（白抜き棒）、 Ｔａ−１、抗−（ＣＤ２６）（線影棒）、および非一次抗体（灰色棒）。

図４は、２４９ｚルプレート内で４８時間培養したｐＡｃＢ？およびｐＡｃｃＤ ４０で感染した生存Ｓｆ９細胞に対するデータを表している。

ＥＬＩＳＡに使用される抗体は以下の通りであった：　５２Ｃ６、抗−（ＣＤ４ ０）（白抜き棒）および非一次抗体（線影棒）。

（以下余白） 尖上１１土 １五ｌ」ｌＪｋ立 Ａ、１ヱｆｆｌ東色 １０μｍの一次抗体（、ＰＢＳ−ＢＳＡ、または１％ＢＳＡおよび０．０５％ア ジ化ナトリウムを補足したＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌ ｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ、　Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中ｉｏμｇ／ｍｌ）中で細胞（ １０６個／試料）を４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡまたは ＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄後、ヤギ抗−（マウスＩｇＧ＞抗体のＦＩＴＣ標識 Ｆａｂ’２フラグメント（Ｊａｅｋｓｏｎ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ、　ＰＡ） １００μｌ中で、細胞を４℃で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡま たはＨＢＳＳ−ＢＳＡで３回洗浄して、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＰＢＳ　０． ５　ｍｌ中で細胞を再懸濁した。ＦＡＣ３ＳＣＡＮ　Ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｊｃ ｋｌｎｓｏｎ、　Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ、　ＣＡ）で分析を行った。

流動細胞定量分析の一般プロトコルおよび流動細胞定量法の臨床データ分析は、 ＫｅｒｅｎらおよびＣｏｏｎらによって詳細に記載されている。一般血液細胞カ ウンテイング技術およびＤＮＡ定量は、Ｐｏｗｅｒｓ、　ＫｅｒｅｎらおよびＣ ｏｏｎらにより記載されている。

ＡＲＣＥＢＶ形質転換Ｂ細胞の蛍光性細胞染色のデータを、図５に表す。図５Ａ において、８７発現Ｓｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１：１００希 釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色の結果を示 す。

図５Ｂにおいて、ＣＤ４０発現Ｓｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の１ ：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染色 の結果を示す。

図５０において、コントロールのＳｆ９細胞で免疫化されたマウスからの血清の １：１００希釈（実線）または正常マウス血清の１：１００希釈（点線）での染 色の結果を示す。

Ｂ　ロ　ムア　セイ 可溶性Ｂ７および可溶性ＣＤ４０の存在下および非存在下で、抗−（８７）モノ クローナル抗体および抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体で、ＡＲＣＥＢＶ− 形質転換Ｂ細胞を染色した。ＡＲＣ細胞を加几る前に、抗体と、可溶性Ｂ７、可 溶性Ｃ，Ｄ　４０またはフントロールとをＲＴｔ’　２０分間プレインキコベー トした。

図６Ａは、Ｂ７−２４　（点線）または二次抗体単独（実線）による染色の結果 を示す。図６Ｂは、Ｂ７−２４単独（点線）または可溶性Ｂ７でブレインキュベ ートしたＢ７−２４（実線）による染゛色の結果を示す。

図６０は、Ｂ７−２４単独（点線）または可溶性ＣＤ４０でブレインキュベート したＢ７−２４による染色の結果を示す。図６Ｄは、ＣＣＤ４０−３Ａ　（点線 ）または二次抗体単独（実線）による染色の結果を示す。図６Ｅは、ＣＤ４０７ Ａ８単独（点線）または可溶性Ｂ７でブレインキュベートしたＣＤ４０３Ａ８（ 実線）による染色の結果を示す。図６Ｆは、ＣＤ４０３Ａ８単独（点線）または 可溶性ＣＤ４０でブレインキュベートしたＣＤ４０３Ａ８　（実線）による染色 の結果を示す。

（以下余白） 案！［１ 宣ユ１１１障先化 ０日目および１４４日目、ＡｃＣＤ４０ウイルスＡｃＢフウイルスまたはＡｃＣ ｄ５ウィルス（コントロールのウィルス）で感染された５×１０６個のＳｆ９細 胞を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に注入した。

２１１日目、特異的抗体の存在を試験するために１００８ｍの血清を得た。残り の期間が少なくとも２週間となった後、マウスに、ＡｅＣＤ４０ウィルスまたは ＡｃＢ７ウイルスで感染された５×１０６個の細胞による最終の注入を行った。

この最終の注入後３日目に、細胞融合のために肺臓細胞を用いた。

Ｌ胤五エ バイブリド−マクローンの Ｂｏｅｒら＜１９８８）により以前に記載されているように、５０％ポリエチレ ングリコールを用いて、免疫化ＢＡＬＢ／ｅマウスから得た牌細胞を５Ｐ２７０ ネズミミエローマ細胞と１０＝１の割合で融合した。

ヒポキサンチン（０，１−Ｍ）、アミノプテリン（０，０１ｍＭ）、チミジン（ ０，０１６ｍＭ）および０．５　ｎｇ／ｍｌ　ｈｌＬ−６（Ｇｅｎｚｙｗ＋ｅ、 　Ｃａｍｂｒｌｄｇｅ。

ＭＡ）を補足した完全ＩＭＤＭ培地中に、融合細胞を再懸濁した。次いで、各ウ ェルが平均１個の成長するハイブリッドを含むように、融合細胞を９６ウ工ル組 織培養プレートのウェル間に分配した。

１０〜１４日後、特異的抗体の産生に対してハイブリドーマ集団の上清液をスク リーニングした。ハイブリドーマクローンによる特異的抗体の産生をスクリーニ ングするために、１２ウエルの上清液をプールし、そして実施例４に記載のよう に、それをＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞の蛍光性細胞染色のために用いた。

次いで、陽性プールの上清液を別々に試験した。０．５ｎｇ／■１ｈｌＬ−６含 有ＩＭＤＭ／ＦＢＳ中での希釈を制限することにより、陽性ハイブリドーマ細胞 を３回クローン化した。分析の結果を表１に表す。

％１＋　”　６−ＣＤ４０　１ｙ　−Ｂ７＆Ａｆ知；シーＦ・２択励、、ッζ、 　４８０°　９６０／＼イＴ’）Ｊ−ｚ　？　／）Ａ長、Ｊ、１．−ｖｙｌ、、 、ｙ＜（３５１３１２偽・用知Ｖ蚊１′４１ 柘］−１ゝンｍｌしつり唆’１”　１．１５　０．３１実ｆｆｉ 区肌ｍ駁致 ａｅｃｒｏｏｔら（１９９０）により記載のように、扁桃摘出を受けている子供 から得た扁桃から、扁桃Ｂ細胞リンパ球を単離した。

簡単に言えば、メスの刀身で組織を散らし、５ｍＭＬ−ロイシンメチルエステル で処理することにより食細胞およびＮＫ細胞を除去し、そして臭化２−アミノエ チルイソチオウロニウムで処理されたヒツジ赤血球を用いてｌサイクルのロゼ・ ノド形成させることにより、Ｔ細胞を除去した。

上記の実施例４に記載のように、蛍光性細胞染色を用いて、扁桃Ｂ細胞に結合す る能力に対して、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体および抗−（Ｂ７）モノ クローナル抗体を試験した。培養された扁桃Ｂ細胞の蛍光染色分析に対して、死 細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムを用いた。

表２は、抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体の高純度扁桃Ｂ細胞への結合に対 する上記分析の結果を示す。

（以下余白） 定した結果を示す。

ＩＬ　’ｎ’ＮＪ−’Ｅ　了戊□２）生季ｐ１″ｉａは　ン台０ＫＴ３　ＣＤ： ｌ　２＋１ ＬｅｕＭコ　ＬａｕＭ３　２．５ ＥＩ　ＣＤ２０　８８．０ Ｇ２Ｂ、５　ＣＤ４０　９２．１ ＣＤ４０−５Ｈ７ＣＤ４０　９：３．７ＣＤ４０−５Ｄ１２　ＣＤ４０　９５． ０ＣＤ４０−３Ｃ６ＣＤ４０　８８．９ ＣＤ４０−３人８　ＣＤ４０　９３．３１実施例４に記載の蛍光細胞染色により 陽性扁桃細胞のパーセントを測定した。

これらのデータは、新鮮な単離された扁桃Ｂ細胞の８９〜９５パーセントが、４ つの抗−（ＣＤ４０）モノクローナル抗体を用いて陽性に染色したことを示す。

本質的に同様の方法により、扁桃Ｂ細胞とモノクローナル抗体０２８．５（Ｃ１ ａｒｋら）との反応を試験した：すなわち、本発明の抗−（ＣＤ４０）モノクロ ーナル抗体に対するのとおよそ同じパーセントの細胞が、０２８．５に対して陽 性であった。

表３は、抗−（Ｂ７）モノクローナル抗体Ｂ７−２４の高純度扁桃Ｂ細胞への結 合を、実施例４に記載の蛍光性細胞標識により測要ナトメインに結合するという こと−ｔＰ千す−シー々Ｉ−）　０１１実ｉｆｌ ／クロスポ１ンＡおよび　たはＭａｂ７−４　いる１１」Ｌ１兄１弓巳駈 上記のＴ細胞増殖アッセイを使用して、ＢＴによるＴ細胞の共刺激が、ＣｓＡを 用いる阻害に対しても抵抗性があるかどうか測定した。図１０は、Ｔ細胞が抗Ｃ Ｄ　３Ｍａｂにより増殖を誘導されると、ＢＴによる共刺激が、用量に依存する ようにＣｓＡよって阻害され得ることを示す。しかし、有毒でないＣｓＡ濃度で Ｔ細胞の活性化を゛完全に遮断することは不可能であった。−次ＭＬＣ（結果は 示さず）または二次ＭＬＣ（表４を参照のこと）を遮断するためにＣｓＡを使用 しても、同様の結果が得られた。これらの実験は、８７−ＣＤ２ｇ／ＣＴＬＡ４ 介在Ｔ細胞増殖が、ＣｓＡの阻害作用に対し、部分的にのみ感受性であることを 明確に示す。このように、インビトロでＴ細胞がＢＴと共刺激されるときに、完 全に阻害されないことは、移植片拒絶または急性ＧＶＨＤの際に、ＣｓＡによる 治療にもかかわらずインビボで起こることに類似し得た。

（以下余白） 紅 ＣｓＡおよびＭａｂ　ＢＴ−２４の　中２．５　９７１　６０９　６０１　７９ ０　６９７　１，１５９　２５，２０９０．２５　５５３　５４５　６０＋　７ ８８　５５９　８８２　２０．７５３０．０２５　８９７　９３９　１，１２１ 　１，５９２　１，５７０　２，８１８　２９，３６４ｒｉし　１２，６ｇ７　 １５，５９３　２３．４８４　２４，５８９−２７．６２９　３３，２３５　６ ２，５９８＊表の記入事項はＣＰＭ中のＴ細胞の増殖を表す。増殖は上記のＴ細 胞増殖アッセイを用いて測定した。データは、４回の実験の内の１回について示 す。

表４は、ＣｓＡ単独またはｍＡｂ　ＢＴ−２４単独では、Ｔ細胞活性化が用量依 存的に、しかし、不完全に阻害されることを示す。

しかし、ＣｓＡおよびＢＴ−２４を共に用いると、Ｔ細胞活性化は、完全に遮断 された。興味深いことに、０．０２５μｇ／ｍｌのＢＴ−２４の添加は、２．５ μｇ／墓ｌの添加とほとんど同量の遮断を起こした。

さらに、０．０２５μｇ／ｍｌの８７−２４の存在下で、ＣｓＡ濃度を６０倍に 減少させても、Ｔ細胞活性化は９０％以上阻害された。この阻害は、最高濃度の ＣｓＡ単独で最大に阻害されたときよりも大きかった。

表５中に示すように、同一の増殖アッセイにおいて、ＩＣＡＭ−１またはＣＤ？ ２のどちらか一方にＭａｂを用いても相乗効果は観察されなかったので、Ｍａｂ 　ＢＴ−２４とＣｓＡとの間のこの、相乗効果は、Ｂ７／ＣＤ２１１相互作用に 対して特異的であった。

表」− 二　〇でＴ２ ７　−　たはＣａｂ　Ｃｓの ＢＴ−２４２，５３３３４０ ８４Ｈ１０２，５７６斜　８１　１１５０．２５　８０　８０　７６　９９ ｖ／Ｌ２２５　２．５　１０６　１０７　８９　９８０．２５　１０８　１０６ 　９１　１００＊表の記入事項はＣＰＭ中のＴ細胞の増殖を表す。増殖は上記の Ｔ細胞増殖アッセイを用いて測定した。

案ｉｆ乱上」− 他の免疫抑制剤と共にＭａｂ　ＢＴ−２４を用いてＴ細胞増殖の遮断を示すため に、上記の実施例９のプロトコルを用いる。（Ａ）ＦＫ５０６、　（Ｂ）　ラバ マイシン、　＜Ｃ＞　メトトレキセート、　（Ｄ）プレドニソロン、または（Ｅ ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用い、実施例９の増殖アッセイプロトコル と同様にして行った。

ＣｓＡおよびＢＴ−２４がまた、Ｔ細胞のアロ抗原特異的活性化においても、Ｃ ＴＬ活性の誘導を遮断することに共に作用し得たかどうかを試験するために、上 記の細胞毒性アッセイを用いた。

精製Ｔ細胞を、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣで６日間刺激し、引続き培地の みで２日間培養した。培地のみの存在下で、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣと 共に３日間の再刺激した後、図１１に示すようにＴ細胞のＣＴＬ活性を分析した ；４００μｇ／ｍｌのＣｓＡ；１０μｇ／ｍｌのＭａｂ　ＢＴ−２４；または４ ００μｇ／ｍｌのＣｓＡおよび１０μｇ／ｍｌのＭａｂ　８７−２４゜約５０％ のＡＲＣ標的細胞が、４時間のアッセイで溶解され得たので、これらの培地中で アロ抗原により活性化されたＴ細胞は、効果的に誘導され細胞溶解性となった。

二次ＭＬＣにおける、ＣＴＬ活性のこの誘導は、４００ｎｇ／ｍｌのＣｓＡでは 若干阻害され得るのみであった。二次ＭＬＣの間の１０μｇ／ｌ＊　ｌのＭａｂ Ｂ７−２４の添加は、約４０％の阻害を引き起こした。しがしながら、ＣｓＡと Ｍａｂ　Ｂ７−２４とを組み合わせると、ＣＴＬ活性化のほとんど完全な遮断を もたらした。

（以下余白） 実長Ｉ Ｍａｂ　Ｂ７−２４および　の　での Ｔリンパ　°　の・ 他の免疫抑制剤と共にＭａｂ　Ｂ７−２４を用いて細胞毒性１９７８球活性の遮 断を示すために、上記の実施例１１のプロトコルを用いる。　（Ａ）　ＦＫ５０ ６、（Ｂ）ラバマイシン、　（Ｃ）メトトレキセート、　（Ｄ）プレドニソロン 、または（Ｅ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用いて、実施例１１の細胞毒 性ア／セイプロトコルと同様に行った。

Ｌ五叢上ユ アロ　・Ｔ　′　の　の ＣｓＡとＭａｂ７−２　の　ムせ 一次ＭＬＣア・１セイ中に、ＣｓＡおよびＭａｂ　Ｂ？−２４の存在下で、アロ 抗原により（上記のように）刺激されたＴ細胞が、二次抗原刺激に応答し得るか どうかを調べた。精製Ｔ細胞を、ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用い、６日 間、１０μｇ／ｍｌのＭａｂ　Ｂ？−２４および４００μｇ／ｍｌのＣｓＡの存 在下または非存在下で刺激し、引続き培地のみで２日間培養した。ＥＢＶ−形質 転換Ｂ細胞系ＡＲＣを用いて３日間の再刺激をした後、Ｔ細胞のＣＴＬ活性を分 析した。

表６のデータは、代表的な実験のデータであり、ＣｓＡまたはＭａｂ　Ｂ’１− ２４単独の存在下ではなくて、ＣｓＡおよびＭａｂ　Ｂ７−２４の両方の存在下 で、アロ抗原に６日間曝すことは、二次ＭＬＣにおけるアロ抗原によるその後の 誘発に対する全体の非応答性を生じたことを示す。対照実験では、固定化抗ＣＤ ３　Ｍａｂまたは無関係なアロ抗原を発現している細胞を用いて刺激した後でも 、その細胞群が細胞毒性になるように調厚され得たことから、この非応答性は、 −次ＭＬＣ後における細胞の生存力の欠如によるものではなかった（結果は示さ ず）。

表」− ＣｓＡおよ　７−２４の　４せによ　れるアロ　・Ｔ　−０ 一次ＭＬＣの間の培養培地の添加＊　（％特異的放出）Ｐ８１Ｓ　ＡＲＣ なし　８０４９ Ｂ？−２４（１０μｇ／議１）　７８　２４ＣｓＡ（４００ｎｇ／＋ｅｌ）　７ ６　３７Ｂ７−２４およびＣｓＡ　ＯＯ ＊上記−次Ｍｌ、Ｃ後の、刺激細胞としてのＡＢＣ細胞との二次ＭＬＣでの精製 Ｔ細胞のＣＴＬ活性。ＣＴＬ活性は、上記のＴ細胞細胞毒性アッセイで測定され た。

）ＪＪＬ上互 アロ　、・Ｔ　゛　の　の Ｍａｂ　Ｂ７−２と　との　みＡせ 他の免疫抑制剤と共にＭａｂ　Ｂ？−２４を用いて二次抗原刺激を遮断する能力 を示すために、上記の実施例１３のプロトコルを用いる。　（Ａ）　ＦＫＳＯ６ 、（Ｂ）ラバマイシン、　（ｃ）メトトレキセート、　（Ｄ）プレドニソロン、 または（Ｅ）デキタメタゾンをＣｓＡの代わりに用いて、実施例１３のＣＴＬア ッセイプロトコルと同様に行った。

実Ｕ ＣＤ４０　ｍＡｂを　いるＢ　の　１゜ヒトＣＤ４０に対するモノクローナル抗 体を産生じている４種のハイブリドーマを、実施例１〜７に記載のようにして生 産した。これらのｍＡｂは、抗ＣＤ４０　＋＊Ａｂ　Ｇ２８．５が結合すると同 様の割合の扁桃Ｂ細胞に結合することが示された。ｄｅ　Ｂｏｅｒら、Ｊ、　Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９２）　ｌｉｌ：１５゜これらのモノク ローナル抗体の内、１ｇＧ２１ブクラステある３種（５ＤＩＺ、３Ａｌｌおよび ３０６）を、上記のＢ細胞増殖アッセイにおいて、ヒトＢ細胞に対して活性化シ グナルを発する能力について試験した。

ヒ）ｉ桃Ｂ細胞（４Ｘ１０’／ウエル）を、セファロースビーズ（５μ／ｍｌ） に結合した抗１ｇＭの存在下（図１２Ａ）、または抗１ｇＭ＋　ｒｌＬ−２（１ ００Ｕ／ｍｌ）の存在下（図１２Ｂ）で、マイクロウェル中において２００μｌ を培養した。濃度の異なる抗ＣＤ４０謹Ａｂ　５２Ｃ６，５Ｄ１２．３Ｃ６また は３Ａ８を添加し、そして［３Ｈ］チミジンの取り込みを、１８時間のパルンン グの３日後に測定した。

図１２Ａに示したデータは、３つの異なるドナーからのＢ細胞調製物を用いたデ ュブリケートインキニベーシロン（ｄｕｐｌ１ｅａｔｅ　Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ ）を伴う実験から導かれた平均値である。

図１２Ｂのデータは、共通する結果を有する２つの実験の内の１つの実験から得 られたデュプリケートインキュベーシｉンの平均値である。

どの新規な抗ＣＤ４０　ｍＡｂも、固定化抗１ｇＭの存在下、または固定化抗１ ｇＭおよびＩＬ−２の存在下で、ヒ）Ｂ細胞増殖を実質的には共刺激し得なかっ た。対照的に、抗ＣＤ４０　ｍＡｂ　５２Ｃ６は、ヒトＢ細胞増殖を濃度依存的 な様式で共刺激した。

実】Ｕ乱１」− ＣＤ４０１ｂ　いるＢ　の 実施例１５で試験したｍＡｂを、ヒ）Ｂ細胞の増殖を誘導するそれらの能力につ いて、上ＭＥＢａｎｃｈｅｒｅａｕ様アッセイで・　すなわち、Ｆｃγ［１＋１ を発現する接着細胞上の抗ＣＤ４０■Ａｂを提示することにより試験した。抗体 提示細胞として、ヒトＦｃ７ＲＩＩのＨＲ対立遺伝子形を発現するマウス３Ｔ６ トランスフエクタント細胞を用いた。上記の系において、抗ＣＤ４０　ｍＡｂ　 ５２Ｃ６は、ＩＬ−４と共に、扁桃ヒ）Ｂ細胞の実質的な増殖を誘導することを 観察し、それを［３Ｈ］チミジンの取り込みの測定により評価した。

しかし、抗ＣＤ４０■Ａｂ　５０１２．３Ｃ６または３Ａ８は、上記の培養系に おいて、ヒトＢ細胞の増殖を誘導しなかった（データは示さず）。

（以下余白） 大上、ＬＬ工 ＣＤ４０　ｍＡｂを　いるＸ　の 抗ＣＤ４０　＋ＩＡｂをまた、抗ＣＤ４０　ｓＡｂ　５２Ｃ６によるヒトＢ細胞 増殖の共刺激を阻害する能力について、上記のＢ細胞増殖アッセイを用いて試験 した。ヒト扁桃Ｂ細胞（４Ｘ１０’／ウエル）を、セファロースピーズ（５μｇ ／ｌ）に結合した抗１ｇＭおよび抗ＣＤ４０　＋ｅＡｂ　５２Ｃ６（１，２５μ ｇ／菖１）の存在下で、マイクロウェル中において２００μＩを培養した。濃度 の異なる抗ＣＤ４０　ｓ＋Ａｂ　５Ｄ１２．３Ｃ６または３Ａ８を添加し、［’ Ｈ］チミジンの取り込みを、３日後に評価した。コントロールとして、抗−（グ ルコセレブロシダーゼ”）　ｍＡｂ　８Ｅ４を、同濃度で添加した。Ｂａｒｎｅ ｖｅｌｄら、ＥＪＬＬｎ■匹上ｌ工（１９８３）出：５８５゜データは、デニブ リケートインキコベーシクンした２つの異なるドナー由来のＢ細胞を用いた実験 から導かれた平均値上標準偏差である。

抗ＣＤ４０　ｉＡｂ　５Ｄ１２．３Ａ８および３Ｃ６の各々が、抗１ｇＭ調厚ヒ トＢ細胞増殖の共刺激を、ｍＡｂ　５２Ｃ６により阻害し得ることが見出された （図１３）。対照的に、β−グルコセレブロシダーゼに対して、同量の非関連で あるｍＡｂ　８Ｅ４では、有意な阻害は見られなかった。Ｂａｒｎｅｖｅｌｄら 、上記。このように、上記の抗ＣＤ４０　ｍＡｂは、ヒ）Ｂ細胞の増殖を刺激す るシグナルを発しないが、それとは逆に、他のｍＡｂで抗ＣＤ４０を引き起こす ことにより働（刺激シグナルを阻害し得る結論に達した。従って、これらのｍＡ ｂは、ＣＤ４０を介するシグナル化が、ＥＬ４ＢＳ細胞によるヒ）Ｂ細胞増殖を 刺激する役割を有するかどうかを調べるための優れた道具であると考えられた。

爽立五上１ ５　ヒトＢ　への　Ｏｌｂの 抗ＣＤ４０　ｍＡｂのＥｔ、ｔａ５１を導ヒ）Ｂ細胞増殖に対する効果を、上記 のＢ細胞活性化アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃Ｂ細胞（１，ｏｏｏ／ウェ ル）を、活性化ヒトＴ細胞の５％上清液およびＳｎｇ／ｍｌのＰＭＡの存在下で 、放射線照射ＥＬ４ＢＳ細胞（Ｓｏ、　０００／ウエル）と共に培養した。抗Ｃ Ｄ４０　ｍＡｂ　５Ｄ１２．３Ｃ６またＩま３＾８を、種々の濃度で添加した。

コントロールとして、ｍＡｂ　ＭＯＰＣ−１４１（ＩｇＧ２ｂ）を添加した。６ 日間の培養の後、［’Ｈ］　チミジンの取り込みを評価した。

図１４は、抗ＣＤ４０　ｉＡｂ　５Ｄ１２．３Ｃ６または３Ａ８の添加力ｆ、濃 度に依存してヒ）Ｂ細胞増殖の阻害をもたらしたことを示す。

データは、デエプリケートインキニベーションをした４つの興なるドナー由来の Ｂ細胞を用いた実験から導かれた平均値上標準偏差である。ｍＡｂなしでのイン キ二ベーシ１ンで得られた［３Ｈ］チミジンの取り込み値は、４つの異なる実験 で、それぞれ１０４６０±ＩＵ３ｃｐｍ、６９８ｚ±１’ｌＨｃｐｍ、４３６ｚ ±１０２０ｃｐ−および１５４３±３１９０　（平均値上標準偏差）であった。

Ｂ細胞単独での〔Ｊｌチミジンの取り込みは、４θ±５ｅｐ−の総量であり、放 射線照射ＥＬ４ＢＳ細胞単独では、３１±ｌ５ｅｐ■であった。

非常に有効な阻害が生じた。各々Ｉｏｎｇ／■ｌと（１う低−）濃度で、３つの 抗ＣＤ４０■Ａｂ　５ＤＩＺ、３Ｃ６および３Ａ８１よ、ヒトＢ細胞増殖を、完 全に阻害した。最大の阻害の半分が、約１　ｎｇ／ｍｌで見出された。対照的に 、アイソタイプ−散性１ｇＧ２ｂマウスミエローマタンパク質ＭＯＰＣ−１４１ は、［’Ｈ］チミジンの取り込みに有意な効果を示さなかった。同様の阻害を、 ［３Ｈ］チミジンの取り込みを、６日目ではなく培養の４日目に評価した際に観 察した。

このように、観察された効果が、抗ＣＤ４０　ｍＡｂの影響下での増殖の速度論 的変化によるものであるという可能性は、排除された（データは示さず）。

比較のために、他のＢ細胞表面構造に対する、い（っかのｍＡｂの影響を調べた 。抗ＣＤ２０罷Ａｂ　Ｂｌおよび抗Ｂ７■Ａｂ　Ｈ７−２４（後者のｍＡｂを、 図１４で用いた抗ＣＤ４０■Ａｂを生産するために用いた手順と同様の手順によ り、抗ＣＤ４０　ｍＡｂを用いた実験において使用した濃度と同一の濃度で生産 した）のどちらも、ＥＬ４ＢＳ誘導ヒ）Ｂ細胞増殖に対し如何なる影響も与えな かった（データは示さず）。従って、抗ＣＤ４０　ｍＡｂのＥｌ、４８５銹導Ｂ 細胞増殖に対する阻害効果が、Ｂ細胞表面のマスキングによるものではない結論 に達し得る。

Ｌ五五上ユ ５　ヒトＢ　への　ｈｐＯ９の ＥＬ４ＢＳ細胞が、ＣＤ４０に結合する膜構造を発現し得るかどうかを調べるた めに、ＣＤ４Ｇの細胞外ドメインおよびヒトＬｇＭの定常ドメインＣＨ２、ＣＨ ａおよびＣＨ４（ｈｃＤ４Ｇ、Ｈμ）からなる融合タンパク質を、流動螢光定置 分析に用いた。Ｌａｎｅら、上記。非活性化ＥＬ４ＢＳ細胞は、融合タンパク質 に結合しなかった。しかし、ＥＬ４ＢＳ細胞を、ヒ）Ｂ細胞の活性化に必要な条 件であるＰＭＡ　（５％ｇ／■１）および５％のヒトＴ細胞上消液と共に培養す ると、軽度のｈｃＤ４０．　Ｈμの結合が見出された（データは示さず）。この 螢光の小さいシフトは、３回の独立した実験で常に見出された。ＣＤ４Ｏ結合の 誘導に必要な最短の活性化期間は、２４時間であった。抗ＣＤ４０　ｍＡｂが阻 害したように、ＥＬ４ＢＳ細胞に対するｈＣＤ４０．　Ｈμの結合が、ＥＬ４Ｂ Ｓ誘導ヒ）Ｂ細胞増殖を阻害するかどうかを決定するために、上記のＢ細胞活性 化アッセイを用いて、融合タンパク質を、ヒ）Ｂ細胞とＥＬ４ＢＳ細胞との共培 養物中で滴定した。図１５は、融合タンパク質が、まさに全く、［３Ｈ］チミジ ンの取り込みを濃度依存的に阻害し、そして、図１４に示される実験で使用され た抗ＣＤ４０　ｍＡｂと同様に、ＥＬ４ＢＳ細胞により誘導されたＢ細胞増殖を 完全に阻害し得たことを示す。

ｉ五！立 ヒトＢ　による　ヒトＴ　への 籠」１Ｌ１１１肱果 上記のＴ細胞へルパーアツセイを用いて、活性化Ｔ細胞により接触依存的に刺激 されたＢ細胞による免疫グロブリン産生を阻害する能力についても、抗イ本を試 験した。抗ＣＤ３　ｓ＋Ａｂでコートされ、かつＴ細胞を共刺激する異なったｍ Ａｂでコートされるか、または、コートされない９６ウエルプレートにおいて、 ヒト扁桃Ｂ細胞（１０’／ウエル）を、放射線照射された精製Ｔ細胞（３，００ ０ラド、１０５／ウエル）と共に培養した。培養８日後に、Ｂ細胞による免疫グ ロブリンの産生の測定のために、上清液を採取した。Ｂ細胞による免疫グロブリ ン産生は、上記のＥＬＩＳＡアッセイにより評価した。抗ＣＤ４０　ｍＡｂ　５ Ｄ１２を、培養当初から種々の濃度で添加した。コントロールとして、■ＡｂＭ ＯＰＣ−１４１を添加した。図１６Ａは、Ｔ細胞が、固定北枕ＣＤ３１Ａｂによ り刺激され、可溶性の抗ＣＤ２および抗ＣＤ２８　ｍＡｂにより共刺激されると 、抗ＣＤ４０　ｍＡｂ　５Ｄ１２の添加が、ヒトＢ細胞によるＩｇＧ産生の阻害 を濃度に依存して引き起こしたことを示す。

Ｂ細胞による１ｇＭ産生は、同程度に阻害された。同様の結果を、抗ＣＤ４０　 ｍＡｂ　３Ｃ６および３Ａ８Ｔ、ならびｌ：ｈｃＤ４０．Ｈμ融合タンハク質で 得た。

本発明の抗ＣＤ４０　ｉＡｂは、非常に有効な阻害を示した。約３゜ｎｇ／■ｌ 程度の低い濃度で、３つの抗ＣＤ４０　ｍＡｂの各々が、５０％の最大阻害を示 した。対照的に、アイソタイプ一致性のＩｇＧ２ｂマウスミマウーマタンパク質 ＭＯＰＣ−１４１は、免疫グロブリンの産生に影響しなかった。

３つの抗ＣＤ４０■Ａｂによる阻害効果は、ＣＤ４０リガンドヘルパー活性を提 供しているＴ細胞の活性化の様式に対し特異的でなかった。図１６８は、全ての Ｔ細胞増殖条件下（抗ＣＤ３単独：抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２　；抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２ ８　；および抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２＋抗ＣＤ２８）で、抗ＣＤ４０■Ａｂ　５Ｄ１ ２の添加が、ヒトＢ細胞による免疫グロブリン産生の強度の阻害をもたらしたこ とを示す。この阻害は、ＣＤ４Ｏ−ＣＤ４０リガンド相互作用を完全に遮断する ことで知られるｈｃＤ４０．Ｈμ融融合タンパクセよる阻害の量に匹敵する。

阻害の百分率は、Ｔ細胞活性化条件に依存して、４０〜７０％に変化した。対照 的に、アイソタイプ一致性のＩｇＧ２ｂマウスミマウーマタンパク質ＭＯＰＣ− １４１、あるいはヒトＩｇＭ　（ｈｃＤ４ｏ、　Ｈμ融融合タンパクセコントロ ールとして）は、ヒトＢ細胞による免疫グロブリンの産生に影響しなかった。

ＩＪＬ立寄丘 上記の実施例中で使用されたハイブリドーマは、ブダペスト条約の条項に基づき 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ１ン（ＡＴＣＣ）、１２３０１　 Ｐａｒｋｌａｖｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡに寄託され、受理された。この寄託は、これらのハ イブリドーマが、上記の発明または下記の請求項に記載の発明を実施するのに必 須であることを示すものではない。

ハイブリドーマ　１丘旦　工ｌ」６（１−Ｂ？−２４１９９３年５月６日　ＨＢ 　１１３４１３Ｃ６１９９３年５月６日　Ｈ８１１３４０ＳＤＩ２　１９９３年 ５月６日　ＨＢ　１１３３９本発明は、特定の実施態様を参考にして記載した。

しかし、本出願は、添付の請求の範囲の意図および範囲から離れることな（、当 業者により行われ得る変更および置換を、包含することが意図される。

参考文献 ！１；ｌ：４４９４　（１９８６）、′ｄｅ　Ｂｏ＠！ｒ、Ｍ、ら　、Ｊ、Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、Ｍａｔｈｏｄｓ　２Ｊｋ：Ｌ：１４）（１９８Ｂ）　＋ ＤｅＧｒｏｏセｔ　Ｃ−’ｙ　ｒ　ＬｌｙｌＴＩｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅｓ＠ａｒ ｃｈ　２：コ２１（１９９０）　。

ＤｉＳａｎｔｏ、、：ｒ、ｐ、；　、Ｊ、工＋ｕｍｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ 　よ１上：Ｌ２３Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｇ、Ｊ、　９　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　ｋｕ：２７１４　（１９Ｂ９）。

）１ａｒｌｏｗ、　ｒ：、　’７　を八ｔｉｂ　’ｅｓ：　ａ　ｏ　ａｔ剋志ｕ 狙江、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｐａ辷 ｈｏｌｏｑｉｓｔｓ（１９８９１。

Ｍａｔｓｕｕｒａ、Ｙ、ｌニア　、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒ、旦Ｑ２ＱＩ　：　１２ コ］−１２５０（１９１３７１゜ 、２！２＝２３　（１９８５１。

Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら　＋　ｃｕ　’：ａｂ−５ａｉｋｉ、　Ｒ，に、ら 　、　５ｃｉｅｎｃｅ　ｎＰ２Ｏ５（１９８８１゜５ｅｋｉｎｅ、　＋１．　； ２　、　Ｇｅｎｅ　、１（２）：１８７−１９３　（１９８８１゜Ｓヒａｍｅｎ ｋｏｖｉｃ、工、＋２　、ＥＭＩＩＯＪ、旦＝１４０３　（１９８９１。

Ｓｕｍｍｅｒｔａ、　Ｍ−０，１７＋ ａ　ｖ’　Ｖ　＠ 已５９ｕ旦口１ｒ　”ｘａ”　ｑ”ｃｕｌセｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａ ｌ　Ｓ辷ａセ１ｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎ、Ｎｏ、１５５５　［１９８７）。

Ｔａｋｔｌ’１ａｒｌ、Ｋ、ら　、、１．　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、ｊｌ（ｐｔ、 １１）：２７６コーＶａｌｌＬ　＾、　ら　、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　旦２：５ コｌ　（１９９０）。

Ｗｅｈｂ、　）１．Ｆｔ−Ｌ、　、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｉ：１７１　（１９ ９ｏ）。

Ｗ＠ｂｂ、Ｎ、Ｒ，？２　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、 Ａ。

ａ旦＝７７コｌ　（１９８９）。

（ふ゛大王づに１色ン 配列表 （１）一般的情報： （ｉｌ、発明の名称：細胞表面分子に対する抗体の生産方法（ｉｌｌ）配列数− ５ （ｉｖ）連絡住所： （Ａ）住所人：シータス　オンコロジー　コーホレイシーン（Ｂ）番地：ホート ン　ストリート　４５６０．　Ｒ−４４０（Ｃ）市：エミリービル （ＤＪ州：カリフォルニア （Ｅ１国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　９４６０ｇ （ｖ）コンビ５−ター読み出し形態 （＾）［体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンビ１−ター：　ＩＢＭ　ＰＣ互換用（Ｃ）操作システム：　ｐｃ−ｏ ｏｓ／Ｔｈｌ５−ｏｏｓ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース８ニ、０（ ｖｌ）現在の出願データ： （＾）出願番号： （Ｂ）出願日：　１９９３年７月９日 （Ｃ）分類： （ｗｉｌｌ）代理人／事務所情報二 （Ａ）氏名：マックガリグル　フィリフプ　エル。

（Ｂ）登録番号：３１ｊＨ （Ｃ）照会／記ａｔ号：　０９２５．　１００（ＬＸ）電話回線情報： （＾）電話：　（５１０）８０１−２７１８（Ｂ）？し７ｙｙクス：　（５１０ ）＠５５−３５４２（２）配列番号：ｌの情報： （１）配列の特色： （Ａ）長さ＝２７塩基対 （Ｂ）！！：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：Ｉｔ鎖状 （ＩＩ）配列の種ＩＩ：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｌｃ）（ｘｌ）配列；配列番号： １： ＱＣＧＣＴＧＣＡＧＣ　ｋＴｃＴＧｋｋＧｃｃ　ｋＴＧＧＧｃｃ　２７（２）配 列番号＝２の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ：２１塩基対 （Ｂ）Ｉ！２二ｍ酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ＩＩ）配列の種ＩＩ　ＤＮＡ（ｇｏｎｏｓｌｅ）（夏１）配列：配列番号：２ ： （２）配列番号：３の情報： ０）配列の特色： （＾）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木調 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ＩＩ）配列の種類：　ＤＮＡ軸ｔｎｏ＋＊１ｃ）（ｘｉ）配列：配列番号：３ ： ｃｃｃＣｉｃｅ＾ｃｃ　＾丁ｅｒｃ＾ｋＧｃＣ　ｋＴＧＧＧｃｃ　’フ（２）配 列番号、４の情報： （１１配列の特色： （Ａ）長さ：６１塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｍ配列の種１１：ＤＮ＾軸ｅｎｏｓｌｃ）（ｘｉ）配列：配列番号、４： ＧＣＩ：；ＣＸＱＧ丁＾ｅｃ　ＴＴｈＣＴＣｃＡＴＧ　ＧＧＣｋＴＧＴｋ丁Ｔ　 ＣＣＴＣ丁ＴＣＣＴＣ０７！ＡτＣ＾ＣＧＡ　＾＾入ＷＣＴfτテ　Ｇ　６１ （２）配列番号＝５の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種１１：ＤＮ＾（ｇｅｎｏｍｉｃ）（！ｉ）配列：配列番号、５ ： Ｇ（ＣＴＡＧＡＴＣＴ　ＧＧＴＣＴＣｋＣＣＴ　ＣＧＣＩＪ’Ｌ’ＧＧＴＴ　Ｃ Ｏ３２（２）配列番号＝６の情報： ０）配列の特色： （Ａ）長さ：３４塩基対 （Ｂ）盟：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種ａｌｌ：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ）（ｘｉ）配列：配列番号＝ ６： ＧＣＧＴＧＣ：ＴｋＣＣＣＣＡ（ｌＪｃＴｅｅＴ　ＧＧＣＴ１１５’ｍｅ　ｋＧ ｃｃ　３４（２）配列番号７の情報： （ｉ）配列の特色： （＾）長さ：３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　＋）配列の種類：　ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｌｅ）（ｘｉ）配列：配列番号７ ： （２）配列番号二８の情報： （１）配列の特色： （＾）長さ：６１塩基対 （Ｂｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー零値 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （Ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｅ）（ｘｉ）配列：配列番号二８： ｃａＸ Ｆｉｇ、：ＬＡ Ｓｆ９−８７　５ｆ　９−ＣＤ２６ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４ し○Ｇ　玄　６　ＰＬ ＦＩＧ、６Ａ ＦＩＧ、６Ｂ ＦＩＧ、６Ｅ ％　）ち ０Ｆｘ、　９Ａ 癒え　（μｃ＋Ｚｍｌ） ＦＩＧ、１１ ヅ。ゲト１１事鞍 ％　信トツ７１，４艶 °Ａ儒・シマ６閉 ｉｎ＋Ａｂｌ　（ｕＧｌ／ｒｎｌ） Ｆｉｇ、　１６Ｂ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．選択された膜関連抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生する不死 化細胞系を生産する方法であって、該方法が以下の工程を包含ずる、方法： 昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する工程；該昆虫細胞を宿主動物内に 注入する工程；抗体分子を産生し得る細胞を該宿主動物から回収する工程；細胞 培養における増殖のために該抗体分子を産生し得る細胞を不死化する工程； 非昆虫細胞の表面上に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合アッセイで、 膜関連抗原に特異的な抗体の産生に対して該不死化細胞をスクリーニングする工 程；および該非昆虫細胞の表面上で膜関連抗原に結合する抗体を産生するこれら の不死化細胞を選別する工程。
2. ２．前記産生する工程が、以下の工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法 ； 選択された昆虫細胞内で前記抗原の発現に適するバキュロウイルスベクター内に 、前記膜関連抗原をコードするＤＮＡ配列を作動可能に挿入する工程； 該ベクターを用いて昆虫細胞をトランスフエクトする工程；および 該昆虫細胞の細胞表面上で腰関連抗原を産生する該ベクターで形質転換された昆 虫細胞を選別する工程。
3. ３．選択された膜関連抗原に対して特異的な抗体を含有する血清を生産する方法 であって、該方法が以下の工程を含む、方法； 昆虫細胞の細胞表面上で膜関連抗原を産生する工程；該昆虫細胞を宿主動物内に 注入する工程；および細胞表面上に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を用いる結合 アッセイにおいて、膜関連抗原に特異的な抗体の産生に対して該動物から血清を スクリーニングする工程。
4. ４．被験体における移植組織の拒絶反応を予防する方法であって、そのような治 療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７抗原に結 合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を包含する 、方法。
5. ５．被験体における移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を予防または治療する方法であ って、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、 （ａ）Ｂ７抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与 する工程を包含する、方法。
6. ６．被験体におけるリウマチ様関節炎を予防または治療する方法であって、その ような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、（ａ）Ｂ７ 抗原に結合する分子および（ｂ）免疫抑制剤の治療上有効な量を投与する工程を 包含する、方法。
7. ７．前記Ｂ７抗原に結合する分子が、抗−Ｂ７抗体である、請求項４、５または ６に記載の方法。
8. ８．前記免疫抑制剤が、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラバマイシンおよびコ ルチコステロイドからなる群より選択される、請求項４、５、６または７に記載 の方法。
9. ９．被験体における抗体介在性疾患を予防または治療する方法であって、そのよ うな治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトＢ細胞の 表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有 効な量を投与する工程を包含し、ここで該ＣＤ４０抗原への該抗体の結合が、該 Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、方法。
10. １０．前記抗体介在性疾患が、ＩｇＥ介在性疾患、全身性エリテマトーデス（Ｓ ＬＥ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、および特発性血小板減少性紫斑病（１ ＴＰ）からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
11. １１．前記モノクローナル抗体が、５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６からなる群よ り選択される、請求項９または１０に記載の方法。
12. １２．抗ＣＤ４０モノクローナル抗体と免疫反応するＣＤ４０抗原エピトープで あって、ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原への該モノクローナル 抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または分化を妨げる、ＣＤ４０抗原エピトープ。
13. １３．モノクローナル抗体Ｂ７−２４。
14. １４．ヒトＢ細胞の表面上に位置するヒトＣＤ４０抗原に結合し得るモノクロー ナル抗体であって、該ＣＤ４０抗原への該抗体の結合が、該Ｂ細胞の成長または 分化を妨げる、モノクローナル抗体。
15. １５．５Ｄ１２、３Ａ８および３Ｃ６からなる群より選択される、請求項１４に 記載のモノクローナル抗体。