JP2007145861A - 細胞表面分子に対する抗体の生産方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】患者における抗体介在性疾患を予防または治療するための、ヒトB細胞の表面上に位置するヒトCD40抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を含む組成物であって、該組成物は、そのような治療を必要とする患者に、薬学的に受容可能な賦形剤中で、該組成物を投与する工程を包含する方法において使用され、ここで該CD40抗原への該抗体の結合が、該B細胞の増殖または分化を妨げる、組成物。
【選択図】なし
Description
本発明は、膜関連抗原分子に特異的である抗体を生産する方法に関する。さらに詳細には、本発明では、宿主動物の免疫化および宿主動物から単離した抗体のスクリーニングに、これらの膜関連抗原を使用する方法を記載する。さらに、本発明は、免疫系疾患を治療する新規な方法に関する。特に、本発明は、(1)移植組織拒絶反応、移植片対宿主病、および、異物としての特異抗原の認識により生じるその他の免疫学的症状;ならびに、(2)IgE介在性疾患(アレルギー)、および、全身性エリテマトーデス(SLE)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)および特発性血小板減少性紫斑病(ITP)を含む自己免疫疾患のような、抗体介在性疾患;の予防または治療に関する。
I.モノクローナル抗体の産生
モノクローナル抗体は、免疫学的研究の有力な手段であることが立証されている。一般的には、モノクローナル抗体は、免疫原組成物中に存在するその他の抗原に対する抗体から、目的の抗原に対する抗体を判別するスクリーニングアッセイが可能であれば、免疫原として混合抗原を使用して産生し得る。目的の抗原が細胞表面分子であるときは、膜環境による高次構造制限を保持するために、免疫原として目的の分子を含有する細胞あるいは膜画分を使用するのが好ましい。
移植後の移植片拒絶反応の防止のための最近の戦略は、シクロスポリンA(CsA)、FK506、およびコルチコステロイドのような広域作用免疫抑制剤に基づく。これらの薬剤は、しばしば長期間摂取しなければならないので、重篤な感染、腎毒性および癌の危険性を増す。さらに、全ての被験体が、これらの免疫抑制剤の高用量に耐え得るわけではなく、しばしば移植片拒絶反応あるいは移植片対宿主病(GVHD)を生じる。移植片拒絶反応の最適な予防は、ドナー組織に対して特異的耐性を誘導することに基づく。従って、移植組織の拒絶反応を予防するための理想的な薬剤は、長期間の免疫抑制の必要性のない、ドナー反応性T細胞のクローン性非応答、すなわち、アネルギーを誘導すべきである。アネルギーは、「共刺激性」シグナルの非存在下の、T細胞レセプター(TCR)とペ
プチド提示主要組織適合性複合体(MHC)抗原との間の相互作用後の、細胞間シグナル化によると考えられている。非特許文献1。この共刺激性シグナルは、通常、抗原提示細胞(APC)の細胞表面により提供される。非特許文献2;および非特許文献3。
B細胞は、インビボにおける正常な免疫応答時に重要な役割をなす。外来抗原は、特異的B細胞上の表面免疫グロブリンに結合し、このことにより、エンドサイトーシス、プロセシング、MHCクラスII分子上のプロセスされたペプチドの提示、および、B細胞表面のB7抗原の上昇調節(up−regulation)を含む一連の事象の引金となる。次に、特異的T細胞は、MHCクラスII分子上に提示されたプロセス抗原のT細胞レセプター(TCR)認識を介してB細胞に結合する。TCRを介する刺激は、T細胞の活性化を開始し、T細胞のサイトカイン産生を始める。T細胞のCD28抗原とB細胞のB7抗原との間の相互作用は、さらにT細胞を活性化する第二のシグナルを提供し得、高レベルのサイトカイン分泌をもたらす。さらに、休止ヒトT細胞では発現されないCD40リガンドは、上記のシグナルを受けると、T細胞表面で上昇調節される。次に、B細胞は、B細胞表面のCD40抗原を介してCD40リガンドにより刺激され、そしてまた、可溶性サイトカインによっても刺激されて、このB細胞は成熟化して高レベルの可溶性免疫グロブリンを分泌する形質細胞になる。
、その細胞表面から消える。CD40分子の抗CD40抗体との架橋は、B細胞に種々の効果を媒介する。CD40抗原はヒト神経成長因子(NGF)レセプターおよび腫瘍壊死因子−α(TNF−α)レセプターに関連することは周知であり、このことは、CD40がB細胞活性化における重要な機能を有するリガンドに対するレセプターであることを示唆する。
本発明は、選択された膜関連抗原に対して特異的に反応するモノクローナル抗原を産生し得る不死化細胞系を生産する方法を提供する。この方法では、典型的には、バキュロウイルスベクターを用いる抗原コーディング配列の組換え発現を経て、膜関連抗原は、昆虫細胞の細胞表面に産生される。これらの昆虫細胞を、宿主動物に注射する。膜関連抗原に対する抗体を産生し得る細胞を回収する;そのような細胞を、細胞培養において増殖するために不死化する。不死化細胞を、膜関連抗原に特異的な抗体の産生についてスクリーニングする。典型的には表面に膜関連抗原を有する非昆虫細胞を使用する結合アッセイを用いてスクリーニングを行う。上記非昆虫細胞表面の膜関連抗原に結合する抗体を産生する不死化細胞を、選択する。
する方法を提供し、この方法は、そのような治療を必要とする被験体に、薬学的に受容可能な賦形剤中の、ヒトB細胞表面に位置するヒトCD40抗原に結合し得るモノクローナル抗体の治療上有効な量を投与することを包含し、ここにおいて、抗体のCD40抗原への結合は、B細胞の成長あるいは分化を妨げる。
好ましい実施形態において、前記抗体介在性疾患は、IgE介在性疾患、全身性エリテマトーデス(SLE)、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、および特発性血小板減少性紫斑病(ITP)からなる群より選択される。
本明細書に記載されている発明は、以前に公表された刊行物および係属中の特許出願を引用する。例えば、このような刊行物は、科学報文、特許、あるいは係属中の出願からなる。以上あるいは以下に掲載されたこれらの全刊行物および出願は、本明細書中で参考として援用されている。
本明細書で使用される用語「膜関連抗原」、「細胞表面分子」および「細胞表面抗原」とはすべて、タンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドのことであり、このタンパク質、ポリペプチドあるいはペプチドの少なくとも1つの抗原性部分が、生物学的膜の表面に露出し、以下に示す1つまたはそれ以上の共有結合された部分を有し得る:1つまたはそ
れ以上の単糖あるいは複合糖部分(糖タンパク質として)、脂質部分(リポタンパク質として)、脂質および糖の組合せ部分、あるいは、その他翻訳後の改変。
この章では、免疫原としてトランスフェクトされた昆虫細胞を使用する、細胞表面分子に対する抗体の生産および選択の方法を記載する。本発明のトランスフェクトされた昆虫細胞はまた、スクリーニングアッセイに使用され得る。
選択された膜関連抗原に対する核酸コーディング配列は、公知の上記抗原のタンパク質成分に対するアミノ酸および/またはDNAコーディング配列に基づいて単離され得る。このコーディング配列は、生物学的ソースから標準の方法で単離され得る(Ausuelら;Maniatisら;Sambrookら)(例えば、ハイブリダイゼーション、分化ハイブリダイゼーション(differential hybridization)、クローニングおよびプラークスクリーニングなど)。また、目的の抗原をコーディングする合成オリゴヌクレオチド配列は、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製され得、または、例えばSynthetic Genetics社(San Diego,CA)から購入され得る。大きなコーディング配列の場合、上記オリゴヌクレオチドコーディング配列は、このコーディング配列に対応した多数のオリゴヌクレオチドフラグメントの縦列配列を包含する一連のクローニング工程を経て合成され得る(Crea;Yoshioら;Eatonら)。オリゴヌクレオチドコーディング配列は、標準の組換え方法(Maniatisら;Ausubelら)で、または、ポリメラーゼ連鎖反応(Mullis;Mullisら)で増幅され単離され得る。
み立てられ得る。このようなcDNAライブラリーは、一般にバクテリア系(例えば、ラムダgt10(Promega,Madison WI))を用いて組み立てられ得るだけでなく、従来技術を用いて、酵母または真核性発現系においても組み立てられ得る(Ausubel)。
領域の調製に使用されるこのようなcDNAプライマーを、図2に示す。これらのプライマーは、CD40およびB7抗原に対する確立された完全なDNAコーディング配列に基づいて構築された(Freemanら、1989;Stamenkovicら、1989)。
膜関連抗原コーディング配列のバキュロウイルスベクターヘの挿入は、確立した方法に従って実行される(Ausubelら;Maniatisら;Sambrookら)。ヒトB7およびヒトCD40をコーディングする全長cDNAは、クローニングに対する制限部分を有するプライマーを用いたPCRによって生産された。PCR増幅に対する鋳型は、EBV形質転換ヒト脾臓B細胞RNAから生産されたcDNAであった。手短に言えば、単離されたDNAコーディング領域は、バキュロウイルス転移ベクター、または、pAcC8プラスミドのようなプラスミドに連結され、その結果、膜関連コーディング領域はポリヘドロンプロモーターの下流となる。このポリヘドロン遺伝子ATGはATTに突然変異し(図1A)、機能性ATGを有するコーディング配列を含有しない組換え型クローンにおける翻訳開始が起こらないようにする。生じるプラスミドDNAは、野生型バキュロウイルス(AcNPV)で、Spodoptera frugiperda(Sf9細胞)由来の昆虫細胞にトランスフェクションされ、野生型ウイルスと膜関連抗原遺伝子を運搬する組換え型ベクターとの間の生体内組換えを経て、組換え型ウイルス粒子を創造する。
上記の組換え型ウイルスは、次いで、昆虫細胞を共感染させるために使用された(実施例2)。これらの細胞は、次いで、異形のDNA挿入によってコーディングされた抗原を発現させた。
に感染したSf9細胞は、同定され、そしてクローン精製された(Summersら)。
ポリクローナル抗体の生産に適当な宿主動物には、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット、チンパンジー、およびイヌが挙げられる。本発明の1つの利点は、免疫化アジュバントが一般に必要とされないことである。
Dr.,Rockville MD 20852)に対するCD40およびB7の双方に対し陽性である血清力価(titre)を有したことを示す。これに対して、対照Sf9細胞によって免疫化されたマウスは、上記ARC細胞に対する活性を示さなかった。この結果は、宿主動物が、選択の膜関連抗原を発現させるSf9細胞によって免疫化され得ることを示し、免疫化の結果、組換え型抗原に対する抗体を含む免疫応答が起こることを示す。上記の免疫化は、Sf9昆虫細胞中でクローンされた組換え型ヒトタンパク質以外のヒトタンパク質と相互反応性である抗体を生じない。
モノクローナル抗体産生のための抗体産生リンパ球は、好ましくは、免疫化された宿主動物の骨髄、脾臓またはリンパ節から単離され得るようなB−リンパ球である(Harlowら)。
)固相の抗体/抗原、を用いる抗原捕捉。
EBV−形質転換細胞を、1次ハイブリドーマ上清液のスクリーニングに用い、そして限界希釈クローニングの後の生成物のスクリーニングに用いた。以下に示す複数の証拠は、4種の抗−(CD40)および1種の抗−(B7)モノクローナル抗体が生成されたことを示唆する。
モノクローナル抗体の生成のためには、精製した物質でマウスを免疫化することが最も望ましい。しかし、膜抗原の精製には専門的で複雑な技術を要し、そしてさらに膜からの抽出は、分子構造を改変させ得る。それに加えて、タンパク質を可溶化すると、その免疫原性がしばしば減少する。それ故に、細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体のほとんどは、全細胞または膜画分でマウスを免疫化した後に、得てきた。多くの場合、特異的なリンパ球のサブセットをマウスに注射し、モノクローナル抗体の一団を得てきた。これら
の抗体を、それらが結合する抗原の単離および特徴付けに用いてきた。マウスを全細胞で免疫化したとき、多数の異分子に対して抗体が作り出される。それ故、ハイブリドーマクローンによって生成された特異的抗体をスクリーニングするために、同じ細胞を用いることは困難である。
本発明は、上記の方法によって生成されるような抗体を使用することを意図する。本発明の抗体は、以下の内のどちらかである。(1)ヒトB細胞の表面のヒトCD40抗原と結合し、B細胞の分化、成長を刺激しない、または(2)B7抗原に結合する。しかし、
これらの抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体(humanized antibodies)、一本鎖抗体、およびそれらのフラグメントであり得る。抗−CD40抗体は、単独で用いられる。一方、抗−B7抗体は、免疫抑制剤をも含有する組成物中で用いられる。
モノクローナル抗体5D12、3A8、3C6、およびB7−24を、本明細書中の詳細な説明の第II節および実施例1−7のように調製する。本発明の他のモノクローナル抗体も、これと同様に、または以下のように調製する。第1に、ポリクローナル抗体を、CD40またはB7抗原に対して生じさせる。第2に、CD40またはB7に特異的なモノクローナル抗体を選択する。
ポリクローナル血清は、従来の方法により調製する。一般的に、まずCD40またはB7抗原を含有する溶液を用いて、適切な動物、特にマウス、ラット、ウサギ、またはヤギを免疫化する。ウサギおよびヤギは、得られ得る血清量、および標識した抗ウサギ抗体および抗ヤギ抗体の有用性のために、ポリクローナル血清の調製に好適である。一般的に、免疫化は、生理食塩水中、好ましくはフロイント完全アジュバントのようなアジュバント中に、抗体含有溶液を混合、または乳化し、そしてその混合液または乳化液を、(一般的には、皮下または筋肉内)注射することにより行う。50−200μg/注射で、典型的には十分である。一般的に免疫化は、生理食塩水中のタンパク質を、1回またはそれ以上注射することにより、2−6週間後に高められる。この場合、フロイント不完全アジュバントを用いるのが好ましい。あるいは、当該分野で周知の方法を用いる、インビトロでの免疫化により抗体を生成し得る。本発明の目的では、インビトロでの上記の方法は、インビボでの免疫化と同等と考えられる。
モノクローナル抗体を、KohlerおよびMilstein,Nature(1975)256:495−96の方法、またはその改変方法を用いて調製する。典型的に、マウスまたはラットを、上記のように免疫化する。しかし、血清を抽出するために動物から採血するよりはむしろ、脾臓(および任意に数個の大きなリンパ節)を取り出し、単細胞に分離する方が良い。所望であれば、脾臓細胞を(非特異的付着細胞を取り除いた後)、細胞懸濁液をタンパク質抗原でコートしたプレートまたはウェルに注ぐことによりスクリーニングし得る。抗原に対して特異的な膜関連免疫グロブリンを発現するB細胞はプレートに結合し、そして懸濁液の残りと共には洗い流されない。次いで、得られたB細胞、または全ての解離した脾臓細胞は、ミエローマ細胞との融合を誘導され、ハイブリドーマを形成する、そして選択培地(例えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地、「HAT」)中で培養される。得られたハイブリドーマは、限界希釈によりプレーティングし、そして所望の免疫化細胞表面抗原に対して特異的に結合する(そして無関係の抗原には結合しない)抗体の生成についてアッセイされる。次いで、選択したmAb分泌ハイブリドーマは、(例えば、組織培養ビン、または中空ファイバーリアクターのような)インビトロ、または(マウスの腹水のような)インビボのどちらかで培養される。
、電子濃密試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドである。酵素は、典型的に、それらの活性によって検出される。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼは、通常3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB)を、分光光度計で定量可能な青い色素に変換する能力によって検出される。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原とそれに対する特異性を有するモノクローナル抗体との場合のように、高い特異性でリガンド分子に結合する能力を有するタンパク質を指す。他の特異的結合パートナーは、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、IgGとプロテインA、および当該分野で周知のおびただしいレセプター−リガンドカップルを包含する。同じ標識でも幾つもの異なる様式で作用するので、上の試薬は、種々の標識を個々のクラスに分類することを意味するのではないことを理解すべきである。例えば、125Iは、放射性標識として、または電子濃密試薬として働く。HRPは、mAbに対する酵素または抗原として働き得る。さらに、所望の効果のために様々な標識を組合せ得る。例えば、mAbおよびアビジンもまた、本発明の実施において標識を必要とする:従って、ビオチンでmAbを標識するならば、125Iで標識したアビジンで、またはHRPで標識した抗ビオチンmAbで、mAbの存在を検出し得る。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内で、同等物と考えられる。
本発明の組成物は、2つの成分を含有する。2つの成分は、共同して、移植片拒絶反応、GVHD、またはリウマチ様関節炎を予防し、治療することに治療学的効果を有する。2つの成分は:(1)MAb B7−24のようなB7抗原に結合する分子;および(2)免疫抑制剤である。B7抗原に結合する分子は、上記第III節に記載のように、CD28、CTLA4、CTLA4Ig、および抗B7抗体を包含する。
本発明のCD40抗原エピトープは、抗CD40モノクローナル抗体との免疫反応性を有する分子である。この抗CD40モノクローナル抗体の、ヒトB細胞の表面にあるヒトCD40抗原への結合は、B細胞の成長または分化を妨げる。すなわち、こういったエピトープは、CD40抗原に対する該抗体の結合と競合する。これらのエピトープを同定するための系統だった技術は、H.M.Geysenによる、米国特許第4,708,871号(これは、本明細書中に参考として援用されている)に記載されているように、当該分野では周知である。典型的に、これらのエピトープは、短いアミノ酸配列である。これらの配列は、アクセスが可能な限り、より長いペプチドまたはタンパク質配列中にはめ込み得る。
本発明の抗体および組成物は、移植組織拒絶反応を抑止するために、または(1)GVHD、あるいはリウマチ様の関節炎、または(2)アレルギー、SLE、PBC、およびITPのような抗体介在性疾患を予防あるいは治療するために治療上有効な濃度で投与される。この目的を達するために、抗体または組成物は、公知の様々な受容可能な賦形剤を用いて処方され得る。代表的には、抗体または組成物は、静脈または腹腔内のどちらかに注射することにより投与される。この投与を行うための方法は、当業者に公知である。局所的または経口的に投与、または粘膜を通じて送達され得る組成物を得ることもまた可能で有り得る。
うな賦形剤の例は、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。不揮発油およびオレイン酸エチルのような非水賦形剤がまた用いられ得る。好ましい賦形剤は、生理食塩水中の5%デキストロースである。賦形剤は、緩衝液および防腐剤を含む、等張性および化学的安定性を増強する物質のような小量の添加剤を含有し得る。
Iscove’s modification of Dulbecco’s
Eagle培地(IMDM)、および胎仔ウシ血清を、JR Biosciences(Lenexa、KS)より得た;ペニシリンおよびストレプトマイシンを、Irvine(Santa Ana、CA)より得た;そしてポリエチレングリコール(分子量1500)を、Boehringer Mannheim(Indianapolis、IN)より得た。
H.Zubler、Hopital Cantonal Universitaire、Genevaより供与された。ヒトFcγ RIIaのHR(高応答性)対立遺伝子形態のハイブリッド分子を発現するマウス3T6の形質転換体細胞は、Dr.P.A.M.Warmerdam、Department of Experimental Immunology、University Hospital Utrecht、Utrecht、The Netherlandsより供与された。Warmerdamら、J.Immunol.(1991)147:1338。両細胞系をゲンタマイシン(80μg/ml)および10%の熱不活性化したウシ胎児血清(FCS)(Hyclone、Logan、Utah)で補足したIscove’s Modified Dulbecco’s Medium(IMDM)で培養した。B細胞活性化能力の欠失の可能性を避けるために、4〜8週間毎にEL4B5細胞の新規のバッチを解かして用いた。細胞系を、マイコプラズマリボソームRNA(GenProbe、San Diego、CA)用の3HラベルされたDNAプローブの使用により、マイコプラズマ汚染を定期的にテストし、そして実験の経過の間、マイコプラズマは検出されなかった。
Research(1990)9:321に記載されているように、扁桃腺摘出を受けた子供から得た扁桃腺から単離した。要約すれば、組織をメスの刃で離散させ、食細胞およびNK細胞を5mMのL−ロイシンメチルエステル処理で減らし、そしてT細胞を2−アミノエチルイソチオウロニウムブロマイドで処理したヒツジ赤血球(SRBC)とのロゼッティングの1サイクルにより除去した。得られたBリンパ球調製物の純度は、抗(CD20)mAb B1(Coulter Clone、Hialeah、FA)、または抗(CD3)mAb OKT3(Ortho、Raritan、NJ)、ならびにウサギ抗(マウスIg)(Zymed、San Francisco、CA)のFITCが結合したF(ab’)2フラグメントを用いた間接的な免疫蛍光のラベリング、およびFACS分析で調査した。B細胞調製物は、以下を含有した(6つの単離物の平均±SD):95±4% CD20−陽性細胞、および2±1% CD3−陽性細胞。
抗(ヒト B7)モノクローナル抗体BB−1(Yokochiら、1982)をDr.E.A.Clark(University of Washington、Seattle、WA)から得、そして精製された抗体として用いた。抗(ヒトCD40)モノクローナル抗体G27.5(Clarkら、1986)をDr.J.A.Ledbetter(Oncogen Corporation、Seattle、WA)から得、そして精製された抗体として用いた。抗(CD40)モノクローナル抗体S2C6(Paulieら、1985)をDr.S.Paulie(University of Stockholm、Stockholm、Sweden)から得、そして精製された抗体として用いた。抗(ヒトCD26)モノクローナル抗体Ta−1、および抗(CD20)モノクローナル抗体B1をCoulter(Hialeah、FL)から得た。抗(CD3)モノクローナル抗体OKT3を、Ortho(Raritan、NJ)から得、そして抗(−LeuM3)モノクローナル抗体をBecton−Dickinson(San Jose、CA)から得た。ビーズ(Immunobeads)に結合した抗(IgM)抗体をBio−Rad(Richmond、CA)から得た。
ands)から供与された。抗CD3 Mab UCHT1(IgG、κ)を精製された抗体として用い、そしてそれはDr.P.Beverley(Imperial Research Cancer Fund,London,UK)から供与された。抗CD72 Mab WL225(IgG2a、κ)を精製された抗体として用い、そしてそれはDr.K.Thielemans(Vrije Universiteit Brusel、Belgium)により供与された。抗ICAM−1 Mab 84H10を希釈された腹水として用いた。抗CD40 mAb S2C6は、Dr.S.Paulie(University of Stockholm、Sweden)より供与された。Paulieら、J.Immunol.(1989)142:590。抗CD40 mAb G28.5は、Dr.J.A.Ledbetter(Oncogen Corporation、Seattle、WA、USA)より供与された。Clarkら、PNAS(USA)(1986)83:4494。コントロールの抗体は以下のものであった:抗(β−グルコセレブロシダーゼ) mAb 8E4 (IgG1)、Barneveldら、Eur.J.Biochem.(1983)134:585、ならびにミエローマ免疫グロブリンMOPC−21(IgG1)およびMOPC−141(IgG2b)(Sigma、St.Louis、MO)。すべてのmAbを精製された抗体調製物として用いた。hCD40.Hμ融合タンパク質は、Dr.P.Lane(Basel Institute for Immunology、Basel、Switzerland)より供与され、そしてそれをトランスフェクトされたJ558L細胞の5倍に濃縮された上清液として用いた。Laneら、Eur.J.Immunol.(1992)22:2573。
BSS(ハンクス平衡塩類溶液、Gibco/BRL)中の10μl/ml)4℃で20分間、インキュベートした。PBS−BSAまたはHBSS−BSAで3回洗浄した後、細胞を4℃で20分間、ヤギの抗(マウス IgG)抗体(Jackson、West Grove、PA)のFITCラベルしたFab’2フラグメント100μl中でインキュベートした。PBS−BSAまたはHBSS−BSAで3回洗浄し、そしてPBSで1回洗浄した後、細胞を0.5mlのPBS中で再度懸濁した。分析をFACSSCAN V (Becton Dickinson、San Jose、CA)で行った。
精製T細胞を、Fcγ RIIa高等応答動物(high responder)の対立遺伝子でトランスフェクトされた3T6線維芽細胞およびB7分子と共に培養した(de Boer,M.ら、Eur.J.Immunol.(1992)22:3071−3075)。3H−チミジンの取り込みにより増殖を測定した。簡単に言えば、96ウェル平底組織培養プレートにおいて、抗CD3 Mab CLB−T3/4.1含有または未含有の200μl/ウェルの完全IMDM中で、104個の放射線照射(2500ラド)された3T6−Fcγ RII/B7細胞と共に、4X104個のT細胞を培養した。72時間の培養期間のうち最後の16時間の間は、1μCi/ウェルの3H−チミジンでその細胞をパルスした。T細胞の増殖を3つのウェルの平均cpmとして表す。
精製T細胞を、Fcγ RIIa高等応答動物の対立遺伝子でトランスフェクトされた3T6線維芽細胞およびB7分子と共に培養した。簡単に言えば、24ウェル平底組織培養プレートにおいて、抗CD3 Mab UCHT1の存在下で1ml/ウェルの完全IMDM中で、0.2X106個の放射線照射(2500ラド)された3T6−Fcγ RII/B7細胞と共に、106個のT細胞を3〜4日間培養した。抗CD3再方向性細胞毒性アッセイにおいて、リンパ球の細胞毒活性を下記のように分析した。
混合リンパ球培養(MLC)において、刺激細胞としてEBV−形質転換B細胞系ARCを用いて、精製T細胞の増殖を測定した。96ウェル丸底組織培養プレート(Corning)において、200μl/ウェルの完全IMDM培地中で、5X104個の放射線照射(5000ラド)された刺激細胞と共に、5X104個のT細胞を培養した。72時間の培養期間のうち最後の16時間の間は、1μCi/ウェルの3H−チミジンでその細胞をパルスした。T細胞の増殖を3つのウェルの平均cpmとして表す。二次MLCに対しては、一次MLCに対する上記のように細胞を刺激した。二次MLCに対するT細胞芽細胞を、5〜7日の一次MLC中で、続いて刺激細胞の非存在下で2〜4日間培養して生産した。一次または二次MLC中に生産されるT細胞の細胞毒活性を、マウスP815細胞を用いた抗CD3再方向性細胞毒性アッセイにおいて下記のように分析した。あるいは、CTL活性を誘導するのに用いられるEBV−形質転換B細胞は、標的細胞として役立った。
標的として、P815ネズミ肥満細胞腫細胞またはARC EBV−形質転換B細胞を用いて、4時間の標的細胞溶解アッセイにおいて、CTL活性を測定した。P815標的細胞の場合には、2μg/mlの抗CD3 Mab OKT3を用いて、CTLを標的細胞に非特異的に架橋させた。標的細胞としてARC細胞を用いた場合には、アロ抗原特異性CTLのみがキリング工程(killing process)において関与する。106個の標的細胞を、200μCiの51Cr−クロム酸ナトリウム(Amsersham International)と共に1時間培養し、続いて洗浄した。96ウェルV底マイクロタイタープレートにおいて、種々の量のエフェクター細胞と共に5000の5
1Cr標識の標的細胞を用いて総容量200μl/ウェルでCTLアッセイを行った。(それぞれ、自然放出及び最大放出の評価のために)、4個のウェルを200μl培地単独の5X103個の標的細胞で満たし、そして4個のウェルを100μl培地および100μlサポニンの5X103個の標的細胞で満たした。P815の場合には、(バックグラウンドの実験的溶解を測定するために)、3個のウェルを抗CD3 Mabの非存在下でエフェクター細胞および標的細胞で満たした。他の3個のウェルもまた、抗CD3の存在下で総溶解量を測定するために、2μg/mlの抗CD3 Mabを含有した。プレートを200Xgで10分間遠心分離し、そして37℃で4時間インキュベートした。その後、各ウェルの上清液100μlをガンマカウンターでカウントした。結果を、P815標的細胞に対する抗CD3依存性特異性放出の百分率、すなわちARC標的細胞に対するアロ抗原特異性放出の百分率として表す。
平底96ウェルマイクロタイタープレートにおいて、10%ウシ胎児血清を補足した200μlのIMDM中で、B細胞(1ウェル当り4X104個)を培養した。固定化した抗−(IgM)抗体(イムノビーズ;5μg/ml;BioRad,Richmond,CA)を加えることによりB細胞を刺激した。指示されたところに100 U/mlの組換えIL−2を加えた。さまざまな濃度のmAbを微量培養の開始時に加え、そして18時間のパルシング後、3日目の[3H]−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を評価した。
Banchereauらによって、Science(1989)251:70に記載されたのと類似の培養系において、抗CD40 mAbがB細胞増殖を刺激する能力を試験するために、ヒトFcγ RIIのHR対立遺伝子形を発現するマウス3T6トランスフェクタント細胞を用いた。B細胞(1ウェル当り2X104個)を、平底マイクロウェルにおいて(5000ラドで放射線照射された)1X104個のトランスフェクタント細胞の存在下、10%ウシ胎児血清および100 U/mlの組換えIL−4を補足した200μlのIMDM中で培養した。そのB細胞を加える前に、3T6細胞を培養プラスチックに少なくとも5時間固着させた。抗CD40m Abを15ng/mlから2000ng/mlまでのさまざまな濃度で加え、そして[3H]−チミジンで18時間パルシングして7日目にチミジンの取り込みを測定することにより、B細胞の増殖を評価した。
B細胞(1ウェル当り1000個)を、放射線照射(5000ラド)されたEL4B5細胞(1ウェル当り5X104個)と共に、平底マイクロタイタープレートおいて、熱処理により不活性化した10%ウシ胎児血清、5ng/mlのホルボール−12−ミリステート 13−アセテート(Sigma)および5%ヒトT細胞上清液を補足した200μlのIMDM中で培養した。さまざまな濃度のmAbを培養の開始時に加え、そして[3H]−チミジンで18時間のパルシング後6日目にチミジンの取り込みを評価した。T細胞上清液を調製するために、1μg/mlのPHAおよび10ng/mlのPMAの存在下、精製T細胞を106個/mlの密度で36時間培養した。Wenら、上述。その細胞を遠心分離することによりT細胞上清液を得て、そしてそれを−20℃で貯蔵した。T細胞上清液がEL4B5−B細胞培養液中でヒトB細胞の増殖を高める効力を試験し、そして最も効力のある上清液をプールし、そして実験に用いた。
96ウェル組織培養プレートを、抗CD3 mAb CLB−T3/3(CLB,Amsterdam,The Netherlands)の腹水液の1:500希釈液でコートした。示されるように、共刺激性mAbを加えた:抗CD2
mAb CLB−T11.1/1およびCLB−T11.2/1(CLB,Amsterdam,The Netherlands)、共に腹水1:1000および抗CD28
mAb CLB−28/1(CLB,Amsterdam,The Netherlands)。次いで、扁桃(tonsillar)のT細胞(3000ラド放射線照射;1ウェル当り105個)、扁桃のB細胞(1ウェル当り104個)およびrIL−2(20U/ml)を加えた。各細胞培養の最終容量は200μlであった。8日後、細胞を遠心し、そして細胞を含まない上清液を集めた。(希釈された)試料中のヒトIgMおよびIgGの濃度を以下のようにELISAにより算出した。
ヒトIgMおよびIgGの濃度をELISAにより算出した。4μg/mlのマウス抗ヒトIgG mAb MH 16−01(CLB,Amsterdam,The Netherlands)または1.2μg/m1のマウス抗ヒトIgM mAb 4102(Tago,Burlingame,CA)の0.05M炭酸塩緩衝液(pH9.6)を用いて、4℃で16時間インキュベーションすることにより、96ウェルELISAプレートをコートした。プレートをPBS−0.05% Tween−20(PBS−Tween)で3回洗浄し、そしてBSAで1時間飽和させた。2回洗浄後、試験試料の種々の希釈液でプレートを37℃で1時間インキュベートした。3回の洗浄後、1μg/mlのベルオキシダーゼ標識のマウス抗ヒトIgG mAb MH 16−01(CLB)またはマウス抗ヒトIgM mAb MH 15−01(CLB)で37℃で1時間インキュベーションすることにより、結合したIgを検出した。プレートを4回洗浄し、そして基質としてO−フェニレンジアミンを加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を示した。各アッセイに対して標準曲線を作成するために、ヒトの標準血清(HOO,CLB)を用いた。
ARC細胞(106個/試料)を100μlの一次抗体(PBS−BSA、または、1%BSAおよび0.05%アジ化ナトリウムを補足したHanks平衡塩類溶液(HBSS)中10μg/ml)中で4℃で20分間インキュベートした。PBS−BSAまたはHBSS−BSAで3回洗浄後、ヤギ抗(マウスIgG)抗体(Jackson,West Grove,PA)のFITC標識F(ab’)2フラグメント100μl中で細胞を4℃で20分間インキュベートした。PBS−BSAまたはHBSS−BSAで3回洗浄し、そしてPBSで1回洗浄した後、細胞を0.5ml PBS中に再懸濁した。FACSCANV(Becton Dickinson,San Jose,CAにより分析を行った。
CD40およびB7のPCRクローニング
Chirgwinら(1979)により本質的に記載されるように、EBV−形質転換ヒト脾臓細胞集団からRNAを単離した。簡単に言えば、細胞を、リン酸塩緩衝化生理食塩水(PBS)で2回洗浄し、そして0.7 M 2−メルカプトエタノールの存在下で5Mグアニジウム チオシアネート中で溶解した。細胞溶解物を、不連続CsCl勾配(Chirgwinら)上で層化し、そしてBeckman SW28ローターを用いて26,000rpmで16時間遠心分離した。ペレットをDEPC処理H2Oに溶かすことによりRNAを回収した。RNAをエタノールで1回沈澱させ、DEPC処理H2Oに再懸濁し、そして−70℃で貯蔵した。
mM KCl、2.5m mM MgCl2および0.1mg/ml BSA(ウシ血清アルブミン)を含む反応緩衝液50μl中でランダムヘキサマープライミングを用いて、全RNA(10μg/反応)をcDNAに変換した。37℃で1時間インキュベーションした後、試料を3分間煮沸し、そして−70℃で貯蔵した。既知のCD40およびB7の配列に相同性を有する配列を含んだプライマーを用いて、CD40およびB7分子をコードするDNAをPCRにより生産し、そこでプライマーはまたクローニングに有用な制限部位をコードした(図2)。これらのプライマーは、B7およびCD40に対する公知のcDNAコード配列に基づいていた(Freemanら,1989;Stamenkovicら,1989)。すべてのプライマーは、5’末端で、続いてクローニングのための制限部位でC−Gクランプにより開始する(図2において太字で示される)。可溶形のB7およびCD40のクローニングのための、逆方向プライマーにおける下線の配列は、アフィニティ精製に用いられるモノクローナル抗体により認識されるエピトープを表す。括弧内の数字は、CD40およびB7に対する公知のcDNAに関するプライマーの位置を表す。
lら:Maniatisら;Sambrookら)。
ヒトCD40およびB7のバキュロウイルス発現
転移ベクターのpAcCD40(全長CD40分子をコードする)、pAcCD40−ED/Glu(CD40の細胞外ドメインをコードする)、pAcB7(全長B7分子をコードする)およびpCcB7−ED/Glu(B7分子の細胞ドメインをコードする)を用いて、ヒトCD40およびヒトB7をコードする配列をAutographa californicaバキュロウイルス(AcNPV)中に組換えした。
Sf9細胞ELISA
組換えウイルスで感染されたSf9昆虫細胞を24ウェルプレート内で48時間培養した。組織培養培地を除去後、抗体を含む1%BSA含有PBS(PBS−BSA)0.25mlを用いて、室温(RT)で45分間プレートをインキュベートした。PBS−BSAで3回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼに複合化したヤギ抗(マウス全Ig)免疫グロブリン(Zymed,South San Francisco,CA)のPBS−BSAによる1/250希釈液250μlを用いて、RTで35分間インキュベートした。PBS−BSAで5回洗浄することにより、未結合のペルオキシダーゼ活性を除去した。2mg/mlの3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジンのエタノール液0.5mlを、10mM酢酸ナトリウム、10mM EDTA緩衝液(pH5.0)で10mlまで希釈し、そして0.03(V/V)H2O2を加えることにより調製されたアッセイ混合物を加えることにより、結合したペルオキシダーゼ活性を表した。10分後に、1M H2SO4 100μlを加えることにより反応を停止した。
蛍光性細胞染色
A.傾向性細胞染色
10μlの一次抗体(PBS−BSA、または1%BSAおよび0.05%アジ化ナトリウムを補足したHBSS(Hanks’ Balanced Salt Solution,Gibco/BRL)中 10μg/ml)中で細胞(106個/試料)を4℃で
20分間インキュベートした。PBS−BSAまたはHBSS−BSAで3回洗浄後、ヤギ抗−(マウスIgG)抗体のFITC標識Fab’2フラグメント(Jackson,West Grove,PA)100μl中で、細胞を4℃で20分間インキュベートした。PBS−BSAまたはHBSS−BSAで3回洗浄して、PBSで1回洗浄した後、PBS 0.5ml中で細胞を再懸濁した。FACSSCAN V(Becton Dickinson,San Jose,CA)で分析を行った。
可溶性B7および可溶性CD40の存在下および非存在下で、抗−(B7)モノクローナル抗体および抗−(CD40)モノクローナル抗体で、ARC EBV−形質転換B細胞を染色した。ARC細胞を加える前に、抗体と、可溶性B7、可溶性CD40またはコントロールとをRTで20分間プレインキュベートした。
宿主動物免疫化
0日目および14日目に、AcCD40ウイルスAcB7ウイルスまたはAcCd3ウイルス(コントロールのウイルス)で感染された5X106個のSf9細胞を、雌のBALB/cマウスの腹腔内に注入した。21日目に、特異的抗体の存在を試験するために100μlの血清を得た。残りの期間が少なくとも2週間となった後、マウスに、AcCD40ウイルスまたはAcB7ウイルスで感染された5X106個の細胞による最終の注入を行った。この最終の注入後3日目に、細胞融合のために脾臓細胞を用いた。
ハイブリードマクローンの生産
Boerら(1988)により以前に記載されているように、50%ポリエチレングリ
コールを用いて、免疫化BALB/cマウスから得た脾細胞をSP2/0ネズミミエローマ細胞と10:1の割合で融合した。ヒポキサンチン(0.1mM)、アミノプテリン(0.01mM)、チミジン(0.016mM)および0.5ng/ml hIL−6(Genzyme,Cambridge,MA)を補足した完全IMDM培地中に、融合細胞を再懸濁した。次いで、各ウェルが平均1個の成長するハイブリッドを含むように、融合細胞を96ウェル組織培養プレートのウェル間に分配した。
扁桃B細胞の試験
deGrootら(1990)により記載のように、扁桃摘出を受けている子供から得た扁桃から、扁桃B細胞リンパ球を単離した。簡単に言えば、メスの刃身で組織を散らし、5mM L−ロイシンメチルエステルで処理することにより食細胞およびNK細胞を除去し、そして臭化2−アミノエチルイソチオウロニウムで処理されたヒツジ赤血球を用いて1サイクルのロゼット形成させることにより、T細胞を除去した。
Mab B7−24によるT細胞増殖の遮断
T細胞増殖および上記のMLCアッセイを用いて、T細胞活性化におけるB7分子の役割を研究した。B7−24 Fabフラグメントの非存在下での増殖は、20,000〜60,000 cpmの範囲であった。図7は、このMabがT細胞増殖の抗−CD3誘導性B7介在性の誘導を完全に遮断し得るので、このMabがそのB7分子の機能的に重要なドメインに結合するということ、を示す。データは、別々のドナーのT細胞を用いた4名の各実験の±S.D.を示す。
シクロスポリンAおよび/またはMab B7−24を用いるT細胞増殖の遮断
上記T細胞増殖アッセイを使用して、B7によるT細胞の共刺激が、CsAを用いる阻害に対しても抵抗性があるかどうか測定した。図10は、T細胞が抗CD 3Mabにより増殖を誘導されると、B7による共刺激が、用量に依存するようにCsAよって阻害され得ることを示す。しかし、有毒でないCsA濃度でT細胞の活性化を完全に遮断することは不可能であった。一次MLC(結果は示さず)または二次MLC(表4を参照のこと)を遮断するためにCsAを使用しても、同様の結果が得られた。これらの実験は、B7−CD28/CTLA4介在T細胞増殖が、CsAの阻害作用に対し、部分的にのみ感受性であることを明確に示す。このように、インビトロでT細胞がB7と共刺激されるときに、完全に阻害されないことは、移植片拒絶または急性GVHDの際に、CsAによる治療にもかかわらずインビボで起こることに類似し得た。
Mab B7−24および他の免疫抑制剤でのT細胞増殖の遮断
他の免疫抑制剤と共にMab B7−24を用いてT細胞増殖の遮断を示すために、上記の実施例9のプロトコルを用いる。(A)FK506、(B)ラパマイシン、(C)メトトレキセート、(D)プレドニソロン、または(E)デキタメタゾンをCsAの代わりに用い、実施例9の増殖アッセイプロトコルと同様にして行った。
シクロスポリンAおよび/またはMab B7−24での細胞毒性Tリンパ球活性の遮断
CsAおよびB7−24がまた、T細胞のアロ抗原特異的活性化においても、CTL活性の誘導を遮断することに共に作用し得たかどうかを試験するために、上記の細胞毒性アッセイを用いた。精製T細胞を、EBV−形質転換B細胞系ARCで6日間刺激し、引続き培地のみで2日間培養した。培地のみの存在下で、EBV−形質転換B細胞系ARCと共に3日間の再刺激した後、図11に示すようにT細胞のCTL活性を分析した;400μg/mlのCsA;10μg/mlのMab B7−24;または400μg/mlのCsAおよび10μg/mlのMab B7−24。約50%のARC標的細胞が、4時間のアッセイで溶解され得たので、これらの培地中でアロ抗原により活性化されたT細胞は、効果的に誘導され細胞溶解性となった。二次MLCにおける、CTL活性のこの誘導は、400ng/mlのCsAでは若干阻害され得るのみであった。ニ次MLCの間の10μg/mlのMab B7−24の添加は、約40%の阻害を引き起こした。しかしながら、CsAとMab B7−24とを組み合わせると、CTL活性化のほとんど完全な
遮断をもたらした。
Mab B7−24および他の免疫抑制剤での細胞毒性Tリンパ球活生の遮断
他の免疫抑制剤と共にMab B7−24を用いて細胞毒性Tリンパ球活性の遮断を示すために、上記の実施例11のプロトコルを用いる。(A)FK506、(B)ラパマイシン、(C)メトトレキセート、(D)プレドニソロン、または(E)デキタメタゾンをCsAの代わりに用いて、実施例11の細胞毒性アッセイプロトコルと同様に行った。
アロ抗原特異的T細胞活性化の際のCsAとMab B7−24との組み合せ
一次MLCアッセイ中に、CsAおよびMab B7−24の存在下で、アロ抗原により(上記のように)刺激されたT細胞が、二次抗原刺激に応答し得るかどうかを調べた。精製T細胞を、EBV−形質転換B細胞系ARCを用い、6日間、10μg/mlのMab B7−24および400μg/mlのCsAの存在下または非存在下で刺激し、引続き培地のみで2日間培養した。EBV−形質転換B細胞系ARCを用いて3日間の再刺激をした後、T細胞のCTL活性を分抗した。表6のデータは、代表的な実験のデータであり、CsAまたはMab B7−24単独の存在下ではなくて、CsAおよびMab B7−24の両方の存在下で、アロ抗原に6日間曝すことは、二次MLCにおけるアロ抗原によるその後の誘発に対する全体の非応答性を生じたことを示す。対照実験では、固定化抗CD3 Mabまたは無関係なアロ抗原を発現している細胞を用いて刺激した後でも、その細胞群が細胞毒性になるように誘導され得たことから、この非応答性は、一次MLC後における細胞の生存力の欠如によるものではなかった(結果は示さず)。
アロ抗原特異的T細胞活性化の際のMab B7−24と免疫抑制剤との組み合せ
他の免疫抑制剤と共にMab B7−24を用いて二次抗原刺激を遮断する能力を示すために、上記の実施例13のプロトコルを用いる。(A)FK506、(B)ラパマイシン、(C)メトトレキセート、(D)プレドニソロン、または(E)デキタメタゾンをC
sAの代わりに用いて、実施例13のCTLアッセイプロトコルと同様に行った。
抗CD40 mAbを用いるB細胞増殖の共刺激
ヒトCD40に対するモノクローナル抗体を産生している4種のハイブリドーマを、実施例1〜7に記載のようにして生産した。これらのmAbは、抗CD40 mAb G28.5が結合すると同様の割合の扁桃B細胞に結合することが示された。de Boerら、J.Immunol.Methods(1992)152:15。これらのモノクローナル抗体の内、IgG2bサブクラスである3種(5D12、3A8および3C6)を、上記のB細胞増殖アッセイにおいて、ヒトB細胞に対して活性化シグナルを発する能力について試験した。
抗CD40 mAbを用いるB細胞増殖の誘導
実施例15で試験したmAbを、ヒトB細胞の増殖を誘導するそれらの能力について、上記Banchereau様アッセイで、すなわち、FcγRIIを発現する接着細胞上の抗CD40 mAbを提示することにより試験した。抗体提示細胞として、ヒトFcγRIIのHR対立遺伝子形を発現するマウス3T6トランスフェクタント細胞を用いた。上記の系において、抗CD40 mAb S2C6は、IL−4と共に、扁桃ヒトB細胞の実質的な増殖を誘導することを観察し、それを[3H]チミジンの取り込みの測定により評価した。しかし、抗CD40 mAb 5D12、3C6または3A8は、上記の培養系において、ヒトB細胞の増殖を誘導しなかった(データは示さず)。
抗CD40 mAbをいるS2C6刺激B細胞増殖の阻害
抗CD40 mAbをまた、抗CD40 mAb S2C6によるヒトB細胞増殖の共刺激を阻害する能力について、上記のB細胞増殖アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃B細胞(4X104/ウェル)を、セファロースビーズ(5μg/ml)に結合した抗IgMおよび抗CD40 mAb S2C6(1.25μg/ml)の存在下で、マイクロウェル中において200μ1を培養した。濃度の異なる抗CD40 mAb 5D12、3C6または3A8を添加し、[3H]チミジンの取り込みを、3日後に評価した。コントロールとして、抗−(グルコセレブロシダーゼ)mAb 8E4を、同濃度で添加した。Barneveldら、Eur.J.Biochem.(1983)134;585。データは、デュプリケートインキュベーションした2つの異なるドナー由来のB細胞を用いた実験から導かれた平均値±標準偏差である。
EL4B5誘導ヒトB細胞増殖への抗CD40 mAbの効果
抗CD40 mAbのEL4B5誘導ヒトB細胞増殖に対する効果を、上記のB細胞活性化アッセイを用いて試験した。ヒト扁桃B細胞(1,000/ウェル)を、活性化ヒトT細胞の5%上清液および5ng/mlのPMAの存在下で、放射線照射EL4B5細胞(50,000/ウェル)と共に培養した。抗CD40 mAb 5D12、3C6または3A8を、種々の濃度で添加した。コントロールとして、mAb MOPC−141(IgG2b)を添加した。6日間の培養の後、[3H]チミジンの取り込みを評価した。
mAb 5D12、3C6および3A8は、ヒトB細胞増殖を、
完全に阻害した。最大の阻害の半分が、約1ng/mlで見出された。対照的に、アイソタイプ一致性IgG2bマウスミエローマタンパク質MOPC−141は、[3H]チミジンの取り込みに有意な効果を示さなかった。同様の阻害を、[3H]チミジンの取り込みを、6日目ではなく培養の4日目に評価した際に観察した。このように、観察された効果が、抗CD40 mAbの影響下での増殖の速度論的変化によるものであるという可能性は、排除された(データは示さず)。
EL4B5誘導ヒトB細胞増殖への、hCD40.Hμの効果
EL4B5細胞が、CD40に結合する膜構造を発現し得るかどうかを調べるために、CD40の細胞外ドメインおよびヒトIgMの定常ドメインCH2、CH3およびCH4(hCD40.Hμ)からなる融合タンパク質を、流動螢光定量分析に用いた。Lane
ら、上記。非活性化EL4B5細胞は、融合タンパク質に結合しなかった。しかし、EL4B5細胞を、ヒトB細胞の活性化に必要な条件であるPMA(5ng/ml)および5%のヒトT細胞上清液と共に培養すると、軽度のhCD40.Hμの結合が見出された(データは示さず)。この螢光の小さいシフトは、3回の独立した実験で常に見出された。CD40結合の誘導に必要な最短の活性化期間は、24時間であった。抗CD40 mAbが阻害したように、EL4B5細胞に対するhCD40.Hμの結合が、EL4B5誘導ヒトB細胞増殖を阻害するかどうかを決定するために、上記のB細胞活性化アッセイを用いて、融合タンパク質を、ヒトB細胞とEL4B5細胞との共培養物中で滴定した。図15は、融合タンパク質が、まさに全く、[3H]チミジンの取り込みを濃度依存的に阻害し、そして、図14に示される実験で使用された抗CD40 mAbと同様に、EL4B5細胞により誘導されたB細胞増殖を完全に阻害し得たことを示す。
ヒトB細胞による、ヒトT細胞誘導抗体産生への、抗CD40 mAbの効果
上記のT細胞ヘルパーアッセイを用いて、活性化T細胞により接触依存的に刺激されたB細胞による免疫グロブリン産生を阻害する能力についても、抗体を試験した。抗CD3
mAbでコートされ、かつT細胞を共刺激する異なったmAbでコートされるか、または、コートされない96ウェルプレートにおいて、ヒト扁桃B細胞(104/ウェル)を、放射線照射された精製T細胞(3,000ラド、105/ウェル)と共に培養した。培養8日後に、B細胞による免疫グロブリンの産生の測定のために、上清液を採取した。B細胞による免疫グロブリン産生は、上記のELISAアッセイにより評価した。抗CD40 mAb 5D12を、培養当初から種々の濃度で添加した。コントロールとして、mAb MOPC−141を添加した。図16Aは、T細胞が、固定化抗CD3 mAbにより刺激され、可溶性の抗CD2および抗CD28 mAbにより共刺激されると、抗CD40 mAb 5D12の添加が、ヒトB細胞によるIgG産生の阻害を濃度に依存して引き起こしたことを示す。B細胞によるIgM産生は、同程度に阻害された。同様の結果を、抗CD40 mAb 3C6および3A8で、ならびにhCD40.Hμ融合タンパク質で得た。
上記の実施例中で使用されたハイブリドーマは、ブダペスト条約の条項に基づき、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)、12301
Parklawn Drive、Rockville、Maryland、USAに寄託され、受理された。この寄託は、これらのハイブリドーマが、上記の発明または下記の
請求項に記載の発明を実施するのに必須であることを示すものではない。
B7−24 1993年5月6日 HB 11341
3C6 1993年5月6日 HB 11340
5D12 1993年5月6日 HB 11339
本発明は、特定の実施態様を参考にして記載した。しかし、本出願は、添付の請求の範囲の意図および範囲から離れることなく、当業者により行われ得る変更および置換を、包含することが意図される。
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- 本願明細書等に記載の抗体。
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