JPH07508175A - 水性酵素溶液の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水性酵素溶液の精製方法 水性酵素溶液、特に酵素的発酵ブロスを精製又は濃縮するため、精製方法は当業 者に公知である。

例は塩析および活性炭による処理である。しかし、炭水化物、非酵素タンパク質 、着色化合物および他の不純物から酵素を分離するこれらの精製方法に関する選 択性は改善の余地がある。従って、本発明の目的は、炭水化物、非酵素タンパク 質、着色物質および他の不純物から酵素を有効に分離できる方法によって、水性 酵素溶液の精製方法を提供する。

本発明に係る水性酵素溶液の精製の目的は、可溶性アルミン酸塩を水性酵素溶液 に添加することモして同時に酸を、溶液のｐＨ値が４〜１０の間に維持されモし てｐＨ値が精製されるべき酵素の等電点から少なくともＩｐＨ単位異なるそのよ うな量で添加し、その際、可溶性アルミン酸塩を、最大量（最大量の可溶性アル ミン酸塩は、極くわずかな量販下の酵素を沈殿させるであろう）および最小量（ 最小量の可溶性アルミン酸塩は、溶液中の極くわずかな量販下の不純物、主に炭 水化物を残すであろう）との間の量で溶液に添加し、次いで引き続き上澄みを沈 殿物（これは棄てられる）から分離することを特徴とする。

沈殿プロセスは、より低いｐＨ値で最も有効な方法で進行することか見出された 。しかし、大抵の酵素は低ｐＨ値で低安定性を示す。従って、合理的に有効なプ ロセスと合理的な酵素安定性を有する妥協のｐＨ値か、選ばれなければならない 。

本発明によれば、驚くべきことに以下の内容が見出された：すなわちもしも沈殿 が本発明方法によって行なわれる場合、ウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）（時間帯） 、すなわち添加されるアルミン酸塩の間隔（このアルミン酸塩中では実際は酵素 は沈殿せずそして実際全ての不純物は沈殿する）は、他の沈殿剤に対するよりも より長い。

次のように理解されるべきである；すなわち、ｐＨＫ１節された酵素溶液に可溶 性アルミン酸塩の添加、引き続き水酸化アルミニウムの沈殿は、ＩＩＨを変化さ せるであろうが、しかし、もしも変化せしめられたｐＨ値が前述の条件を満たす べきでない場合、すなわち、もしも変化せしめられたｐ［（値が４〜ｌＯの間隔 内に存在すべきでない場合、そしてもしもそれが精製されるべき酵素の等電点か ら少なくともｌｐＨ単位異なるべきでない場合、本発明によれば、ｐＨ値はギ酸 を用いて再調整されるであろう。

請求の範囲と共にこの明細書において、「可溶性アルミン酸塩Ｊとは、その水性 媒質中の溶解度が、２５℃の温度で１１の溶液当たり１００ｇを超えるアルミン 酸塩をいう。

最大量のアルミン酸塩（これは極くわずかな量販下の酵素を沈殿させるであろう ）は、酵素の種類と濃度に依存しそして該最大量のアルミン酸塩は、溶液に関し 通常は約５％Ｗ／Ｗアルミン酸塩であろう。

最小量のアルミン酸塩（これは極くわずかな量販下の不純物、主に炭水化物を沈 殿させるであろう）は、不純物の種類と濃度に依存しそしてその最小量のアルミ ン酸塩は、溶液に関し通常は、約０．５％ｗ／ｗであろう。

ユニの酵素は溶液に関して０．８％のアルミン酸塩の量の可溶性アルミン酸塩を それまでに添加しある程度沈殿する傾向にあるであろうし、そしてそのような酵 素は本発明に対して極めて良好に適してはいない。

米国特許３．７９５．５８６は、酵素の精製方法を記載しており、ここにおいて 水酸化アルミニウムおよび他の不溶性化合物は、同一系内で沈殿する。しかし、 水酸化アルミニウムが形成される全ての実施例において、硫酸アルミニウムが用 いられ、そして以下の内容が見出された。すなわち、不純物から酵素のはるかに より多くの作動な分離が、本発明に従い、酸と組合せたアルミン酸塩によって達 成できる。

国際公開公報９１１０９９４３．８頁、１１〜１３行において、以下の内容が示 されている。すなわち、ＮａＡｌ０＝が、凝集工程中、発酵ブロスｌｌにつき４ ｇのＮａＡｌ０ｔの量で発酵ブロスに添加される。そのサイズの濃度のＮａＡｌ ０ｔの添加は、溶解せしめられた物質を沈殿させないで、すでに存在する粒子を ただ凝集させるだけであろう。従って、ＮａＡｌ０ｔのこの濃度は、請求の範囲 第１項に示されたアルミン酸塩の最小値よりもより小さい。

本発明に係る方法の好ましい態様は、可溶性アルミン酸塩、水性酵素溶液および 酸を含んでなる混合物がまた、水混和性溶剤、好ましくはアルコールを含有する 。以下の内容が見出された；すなわち、幾つかの場合において比較的高濃度のア ルミン酸塩（例えば、ＡＩとして計算された約０．８％超）の使用は、フロック を含有するアルミニウム上に酵素が吸着するため、初期凝集中に酵素の実質的損 失を生ぜしめ得る。しかし、本発明のこの態様は、これらの実質的損失を防止し 得る。アルコールは、通常凝集前に添加され、そしてこの添加はアルミン酸塩の 正の効果を変化させないであろうし、しかもそれは沈殿物からの上澄みの分離を 損わないであろう。

本発明に係る方法の好ましい態様は、アルコールがグリセロール又はグリコール であることを含んでなる。グリセロール又はグリコールは前記の酵素の実質的損 失を予防するため良好に適合したアルコールであることが見出された。

本発明に係る方法の好ましい態様は、アルコールが２０〜８０％Ｗ／Ｗの量で混 合物中に存在することを含んでなる。次の内容が見出された：すなわち２０〜８ ０％Ｗ／Ｗ範囲のアルコールは、酵素の実質的損失の最も在勤な予防に対し最適 範囲である。

本発明に係る方法の好ましい態様は、酸がギ酸であることを含んでなる。ギ酸は 他の酸よりもより選択的分離を提供することが見出された。

本発明に係る方法の好ましい態様は、溶液のｐＨ値が５〜８の間に維持されるこ とを含んでなる。このｐＨ値は大抵の酵素に対して最適である。

本発明に係る方法の好ましい態様は、可溶性アルミン酸塩がアルミン酸ナトリウ ムであることを含んでなる。アルミン酸ナトリウムは、最も安価なアルミン酸塩 でありそして商業的に入手可能である。

本発明に係る方法の好ましい態様は、アルミン酸塩の最大量が溶液の２〜３％ｗ ／ｗ　（ＡＩとして計算）でありそして最小量が溶液の０．３〜１％（ＡＩとし て計算）であることを含んでなる。アルミン酸塩の最大および最小の添加に対す るこれらの値は、大抵の酵素に対して能率的な分離を与える。

本発明に係る方法の好ましい態様は、遠心分離又は濾過により沈殿物から上澄み を分離することを含んでなる。

本発明に係る方法の好ましい醜様は、凝集剤を酸およびアルミン酸塩の添加後に 添加するが、しかし上澄みおよび沈殿物の分離前に添加すること、並びに凝集剤 がカチオンおよび／又はアニオン凝集剤であることを含んでなる。これらの凝集 剤を用いることにより、同等により良い分離が得られる。

本発明方法を次の実施例により説明する。

例　１ サビナーゼ（Ｓａｖｉｎａｓｅ）（商標）を、米国特許３．７２０．２５０に従 って発酵させる（ｉｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄ）。

ｌＩ！の発酵培地に以下の成分を添加する：水　１．５１！ 塩化カルシウムニ水和物　１０ｇ アルミン酸ナトリウム　４〇− ギ酸　約４Ｏ− ｐＨをギ酸の用量を制御することにより５．５〜６，０の範囲内に保持する。

ロバフロック（Ｒｏｈａ’ｆｌｏｃ）　ＫＦ　７８５　約３００ｍｇスーパーフ ロック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）　Ａ　Ｉ３０　１５０−上澄みを遠心分離により 沈殿物から分離する。ロバフロックＫＦ　７８５はローム社からのカチオン凝集 剤であり、そしてスーパーフロックＡ１３０はアメリカンサイアナミドからのア ニオン凝集剤である。

例　２ エスペラーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）（商標）を、米国特許３．７２３．２５０ｉ ：：従って発酵させる（ｉｓ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｅｄ）。

発酵後、ブイヨンをＩＡの水道水／ｌブイヨン、３５ｇのＣａＣｌ　ｘ・２Ｈ， ０／　１ブイヨン、およびＩＯｇのＡｌ２（５０４）ｓ／　Ｉ！ブイヨンを添加 することにより予備処理する。Ａ１．（ＳＱ、）１の添加中、水性水酸化ナトリ ウムを用いｐＨを８．０に一定に調節する。次いで、懸濁液をカチオンおよびア ニオン凝集剤、スーパーフロック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）　Ｃ５２１（５ｇ／ｊ ７ブロス）およびスーパーフロック（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｃ）　Ａ　１３０（３０ ０ｍｇ／βブロス）を添加することにより凝集させる。

凝集した懸濁液の分離は、遠心分離により、次いて引き続き濾過を行い澄明な液 体を得る。濾液を蒸発させ約１２％のＲ１（ｒｅｆｌｅｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ） （反射指数）に相当する乾物含量まで蒸発させ次いで約３７°Ｃの温度に加熱す る。この温度で、２５０ｇのＮａ２ＳＯ４／　１コンセントレートを、急速混合 のもと段階的に加える。水酸化ナトリウムおよび２０％酢酸でｐｌを７．０に調 節し、次いで懸濁液を０．５時間混合する。

沈殿した酵素をフィルタープレス上に集め、次いで２５℃でモノプロピレングリ コール（２，５ｆ／ｋｇフィルターケーク）中に再溶解する。

未溶解物質を濾過により除去し、次いでフィルターケークをモノプロピレングリ コールと水との混合物でフラッシュする。

エスペラーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）（商標）を水で希釈し約３０％のモノプロピ レングリコール濃度とし、エスペラーゼ（ＥｓｐｅｒａｓｅＸ商標）の濃度は約 ２０ｇ／ｉである。

引き続きモノプロピレングリコールコンセントレートをｐＨ５，９（ギ酸で調節 された）でアルミン酸ナトリウム（５ｇ／Ｉりで処理し次いで濾過する。フィル ターケークを、モノプロピレングリコールおよび水の混合物でフラッシュする。

このアルミン酸塩反応におけるエスペラーゼ（Ｅｓｐｅｒａｓｅ）（商標）の収 率は、９５％超でありそして色彩の減少度は８０％超である。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．水性酵素溶液の精製方法であって、可溶性アルミン酸塩を水性酵素溶液に添 加することそして同時に酸を、溶液のＰＨ値が４〜１０の間に維持されそしてＰ Ｈ値が精製されるべき酵素の等電点から少なくとも１ＰＨ単位異なるそのような 量で添加し、その際、可溶性アルミン酸塩を、最大量（最大量の可溶性アルミン 酸塩は、極くわずかな量以下の酵素を沈殿させるであろう）および最小量（最小 量の可溶性アルミン酸塩は、溶液中の極くわずかな量以下の不純物、主に炭水化 物を残すであろう）との間の量で溶液に添加し、次いで引き続き上澄みを沈殿物 （これは棄てられる）から分離することを特徴とする、前記方法。
2. ２．可溶性アルミン酸塩、水性酸素溶液および酸を含んでなる混合物がまた、水 混和性溶剤、好ましくはアルコールを含有する、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．アルコールがグリセロール又はグリコールである、請求の範囲第２項記載の 方法。
4. ４．アルコールが２０〜８０％ｗ／ｗの量内で混合物中に存在する、請求の範囲 第２又は３項記載の方法。
5. ５．酸がギ酸である、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
6. ６．溶液のＰＨ値が５〜８の間に保持される、請求の範囲第１〜５項のいずれか １項に記載の方法。
7. ７．可溶性アルミン酸塩が、アルミン酸ナトリウムである、請求の範囲第１〜６ 項のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．アルミン酸塩の最大量が、Ａ１として計算して溶液の２〜３％ｗ／ｗであり 、そして最小量がＡ１として計算して０．３〜１％ｗ／ｗである、請求の範囲第 ５〜７項のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．上澄みを遠心分離又は濾過により沈殿物から分離する、請求の範囲第１〜８ 項のいずれか１項に記載の方法。
10. １０．凝集剤を、酸およびアルミン酸塩の添加後であるが、上澄みおよび沈殿物 の分離前に添加し、そして凝集剤がカチオンおよび／又はアニオン凝集剤である 、請求の範囲第１〜９項のいずれか１項に記載の方法。