FI116225B - Menetelmä vesipohjaisen entsyymiliuoksen puhdistamiseksi - Google Patents

Description

116225

Menetelmä vesipohjaisen entsyymiliuoksen puhdistamiseksi -Förfarande för rengöring av en vattenhaltig enzymlösning 5 Tekniikan tasolla tunnetaan erilaisia puhdistusmenetelmiä vesipohjaisen entsyymiliuoksen, erityisesti entsymaattisen fermentointikasvatusliemen, puhdistamiseksi tai konsentroi-miseksi. Esimerkkejä ovat ulossuolaus ja käsittely aktiivi-hiilellä. Selektiivisyyttä, jolla nämä puhdistusmenetelmät 10 erottavat rntsyymejä hiilihydraateista, ei-entsyymiproteii-neista, värillisistä yhdisteistä ja muista epäpuhtauksista, voidaan kuitenkin parantaa.

Siten keksinnön tarkoituksena on aikaansaada menetelmä vesi-15 pohjaisen entsyymiliuoksen puhdistamiseksi tavalla, jolla entsyymit voidaan erottaa tehokkaasti hiilihydraateista, ei-entsymaattisista proteiineista, värillisistä yhdisteistä ja muista epäpuhtauksista. Tavallisia vesipohjaisten entsyymi-liuosten lähteitä ovat fermentointikasvatusliemet tai suoda-20 tetut kasvatusliemet.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle vesipohjaisen entsyymili-uoksen puhdistamiseksi on tunnusomaista, että vesipohjaiseen ::: entsyymiliuokseen lisätään liukoista aluminaattia, ja että 25 samanaikaisesti lisätään happoa sellainen määrä, että liuok-sen pH-arvo pysyy välillä 4 ja 10, ja että pH-arvo poikkeaa :ainakin yhden pH-yksikön puhdistettavan entsyymin isoelekt-risestä pisteestä, jolloin liukoista aluminaattia lisätään liuokseen määrä välillä maksimimäärä, joka ei saosta enempää , , 30 kuin mitättömän määrän entsyymiä, ja minimaalinen määrä, · joka jättää liuokseen vain mitättömän määrän epäpuhtauksia, *·’ pääasiassa hiilihydraatteja, ja että supernatantti erotetaan ·;··; seuraavaksi saostumasta, joka heitetään pois.

35 On keksitty, että saostusprosessi etenee tehokkaimmin alhai-’·’ seromissa pH-arvoissa. Useimmilla entsyymeillä on kuitenkin huono stabiilisuus alhaisemmissa pH-arvoissa. Siten on va- 2 116225 littava kompromissi-pH-arvo, jolla prosessi on kohtuullisen tehokas ja entsyymistabiilisuus on kohtuullisen hyvä.

Keksinnön mukaisesti on hämmästyttävällä tavalla keksitty, 5 että "ikkuna", ts. lisätyn aluminaatin väli, jossa ei käytännöllisesti katsoen saostu lainkaan entsyymiä ja käytännöllisesti katsoen kaikki epäpuhtaudet saostuvat, on suurempi kuin muilla saostusaineilla, jos saostus suoritetaan keksinnön mukaisella menetelmällä.

10

On ymmärrettävä, että liukoisen aluminaatin lisääminen pH-säädettyyn entsyymiliuokseen alumiinihydroksidin saostuessa seuraavaksi muuttaa pH-arvoa, mutta keksinnön mukaisesti pH-arvo säädetään uudelleen muurahaishapolla, mikäli muuttunut 15 pH-arvo ei täyttäisi yllä esitettyjä ehtoja, ts. mikäli muuttunut pH-arvo ei olisi välillä pH 4 ja 10, ja mikäli se ei poikkeaisi ainakin 1 pH-yksikköä puhdistettavan entsyymin isoelektrisestä pisteestä.

20 Tässä kuvauksessa patenttivaatimuksineen "liukoinen alumi-naatti" tarkoittaa aluminaattia, jonka liukoisuus vesipohjaiseen väliaineeseen on yli 100 g/1 liuosta lämpötilassa 25 °C. Eräs esimerkki on natriumaluminaatti.

25 Maksimaalinen aluminaattimäärä, joka ei saosta kuin mitättö-män määrän entsyymiä, riippuu entsyymin tyypistä ja konsetn-: .·. raatiosta, ja se on normaalisti noin 5 % paino/paino alumi- naattia liuoksen suhteen.

. . 30 Minimimäärä aluminaattia, joka saostaa vain mitättömiä mää- ;;/ riä epäpuhtauksia, pääasiassa hiilihydraatteja, riippuu epä- I · * ’ puhtauksien tyypistä ja konsetnraatiosta, ja se on normaa- ·;··: listi noin 0,5 % paino/paino suhteessa liuokseen.

a · a

• I

35 Muutamilla entsyymeillä on taipumus saostua määrätynastei-‘ sesti jo lisättäessä liukoista aluminaattia määrä 0,8 % I * aluminaattia suhteessa liuokseen, eivätkä sellaiset entsyy- 3 116225 mit ole kovin hyvin sopivia tähän keksintöön.

US-patenttijulkaisussa 3,795,586 kuvataan menetelmä entsyymien puhdistamiseksi, jossa menetelmässä saostetaan alumii-5 nihydroksidia ja muita liukenemattomia yhdisteitä in situ. Kaikissa esimerkeissä, joissa muodostuu alumiinihydroksidia, käytettiin kuitenkin alumiinisulfaattia, ja on keksitty, että paljon tehokkaampi entsyymin erotus epäpuhtauksista voidaan saavuttaa aluminaalilla yhdistelmänä hapon kanssa, 10 keksinnön mukaisesti.

Julkaisussa WO 91/09943, s. 8, riveillä 11 - 13 ilmoitetaan, että NaAl02:ta lisätään fermentointiliemeen määrä 4 g NaA102/l fermentointilientä flokkulointivaiheen aikana.

15 NaAl02:n lisäys tuon suuruisessa konsentraatiossa ei saosta mitään liuennutta materiaalia, vaan ainoastaan flokkuloi jo olemassa olevat partikkelit. Siten NaAl02:n konsentraatio on pienempi kuin patenttivaatimuksessa 1 ilmoitettu aluminaatin minimimäärä.

20

Eräässä keksinnön mukaisen menetelmän edullisessa suoritusmuodossa seos, joka sisältää liukoista aluminaattia, vesi-pohjaista entsyymiliuosta ja happoa, sisältää myös veteense-: : : koittuvaa liuotinta, edullisesti alkoholia. On keksitty, 25 että aluminaatin suhteellisen suurten konsentraatioiden (esimerkiksi yli noin 0,8 %, Al:ksi laskettuna) käyttö voi : .·. joissain tapauksissa aiheuttaa entsyymien oleelliset mene- tykset alkuflokkuloinnin aikana johtuen entsyymin adsorp-tiosta alumiinia sisältäviin hiutaleisiin. Keksinnön tämä 30 suoritusmuoto voi kuitenkin estää nämä oleelliset menetyk-’·* · set. Alkoholi lisätään tavallisesti ennen flollulointia, ‘ eikä tämä lisäys muuta aluminaatin positiivista vaikutusta ·;··· eikä se myöskään aiheuta haittaa supernatantin erotukselle .**. saostumasta.

,Γ. 35

Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritus-·...' muodossa alkoholi on glyserolia tai glykolia. On keksitty, 4 116225 että glyseroli tai glykolit ovat edellä ilmoitettujen entsyymin oleellisten menetysten estoon hyvin sopivia alkoholeja.

5 Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritusmuodossa alkoholi on läsnä seoksessa määrä välillä 20 ja 80 % paino/paino. On keksitty, että väli 20 - 80 % paino/paino alkoholia on optimaalinen väli tehokkaimpaan entsyymien oleellisten menetysten estoon.

10

Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritusmuodossa happo on muurahaishappoa. On keksitty, että muurahaishappo aikaansaa muita happoja tehokkaamman erotuksen.

15 Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritusmuodossa liuoksen pH-arvo pidetään välillä 5 ja 8. Tämä pH-väli on useimmille entsyymeille ihanteellinen.

Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritus- 20 muodossa liukoinen aluminaatti on natriumaluminaattia. Nat-riumaluminaatti on halvinta aluminaattia, ja se on kaupallisesti saatavaa.

: : : Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritus- ,25 muodossa aluminaatin maksimimäärä on välillä 2 ja 3 % pai-no/paino liuoksesta, laskettuna Aliksi, ja minimimäärä on : .·. välillä 0,3 ja 1 % paino/paino liuoksesta, laskettuna ·;·, Aliksi. Nämä aluminaatin maksimi- ja minimilisäysten arvot aikaansaavat useimpia entsyymejä varten tehokkaan erotuksen.

. . 30 ·· · Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritus- ’ muodossa supernatantti erotetaan saostumasta sentrifugoimal- ·:··· la tai suodattamalla. Nämä ovat tehokkaimpia ja yksinkertai- simpia erotusmenetelmiä.

35 ’·' Keksinnön mukaisen menetelmän eräässä edullisessa suoritus- muodossa flokkulointiaine lisätään hapon ja aluminaatin 116225 5 lisäyksen jälkeen, mutta ennen supernatantin ja saostuman erotusta, ja flokkulointiaine on kationista ja/tai anionista flokkulointiainetta. Näitä flokkulointiaineita käyttämällä aikaansaadaan vielä parempi erottuminen.

5

Keksinnön mukaista menetelmää kuvataan seuraavilla esimerkeillä.

Esimerkki 1 10 Savinase®:ää fermentoidaan julkaisun US 3,723,250 mukaan.

1 Iraan fermentointilientä lisätään:

Vettä 1,5 1

Kalsiumklorididihydraattia 10 g

Natriumaluminaattia 40 - 15 Muurahaishappoa noin 40 - pH pidetään välillä 5,5 - 6,0 muurahaishapon annostelua kontrolloiden 20 Rohafloc KF 785 noin 300 mg

Superfloc A 130 - 150 -

Supernatantti erotetaan saostumasta sentrifugoimalla.

.!! 25 Rohafloc KF 785 on kationista flokkulointiainetta yhtiöstä

Rohm, ja Superfloc A 130 on anionista flokkulointiainetta • * · ·” · yhtiöstä American Cyanamid.

* » «

Esimerkki 2 ·,· · 30 Esperase®:ää fermentoidaan julkaisun US 3,723,250 mukaan.

' . Fermentoinnin jälkeen liemi esikäsitellään lisäämällä 1 1 ... vesijohtovettä/1 lientä, 35 g CaCl2· 2H20/1 lientä ja 10 g A12(S04)3/1 lientä. pH säädetään Al2(S04) 3-lisäyksen aikana : : : 35 jatkuvasti pH-arvoon 8,0 natriumhydroksidin vesiliuoksella.

: ": Sitten suspensio flokkuloidaan lisäämällä kationista ja 6 116225 anionista flokkuloimisainetta: Superfloe C 521 (5 g/1 lientä) ja Superfloe A 130 (300 mg/1 lientä).

Flokkuloidun suspension erotus suoritetaan sentrifugoimalla, 5 minkä jälkeen seuraa suodatus kirkkaan nesteen saamiseksi. Suodos haihdutetaan kuiva-ainepitoisuuteen, joka vastaa noin 12 % Rl (taitekerroin) ja kuumennetaan lämpötilaan noin 37 °C. Tässä lämpötilassa liuokseen lisätään vaiheittain nopeasti sekoittaen 250 g Na2S04/l tiivistettä. pH säädetään 10 natriumhydroksidilla ja 20-%:isella etikkahapolla pH-arvoon 7,0, ja suspensiota sekoitetaan 1/2 tunnin ajan.

Saostettu entsyymi kerätään suodatinpuristimella, ja se liuotetaan uudelleen monopropyleeniglykoliin (2,5 1/kg suo-15 datinkakkua) 25 °C:ssa. Liukenematon materiaali poistetaan suodattamalla, ja suodatinkakku huuhdotaan monopropyleenig-lykolin ja veden seoksella.

Esperase®-suodos laimennetaan vedellä monopropyleeniglykoli-20 konsentraatioon noin 30 % Esperase®:n konsetnraation ollessa noin 20 g/1.

(<<*j· Seuraavaksi monopropyleeniglykolitiiviste käsitellään nat- riumaluminaatilla (5 g/1) pH-arvossa 5,9 (säädetään muura-25 haishapolla) ja suodatetaan. Suodatinkakku huuhdotaan mono- I · .··. propyleeniglykolin ja veden seoksella.

*!!/ Esperase®:n saanto tässä aluminaattireaktiossa on yli 95 %, ‘ ja värin väheneminen on yli 80 %.

30 t » *

Claims (10)

116225 Pat ent t ivaat imuks et

1. Menetelmä vesipohjaisen entsyymiliuoksen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että vesipohjaiseen entsyymiliuokseen 5 lisätään liukoista aluminaattia, ja että samanaikaisesti lisätään happoa sellainen määrä, että liuoksen pH-arvo pysyy välillä 4 ja 10, ja että pH-arvo eroaa ainakin yhden pH-yk-sikön puhdistettavan entsyymin isoelektrisestä pisteestä, jolloin liukoista aluminaattia lisätään liuokseen määrä, 10 joka on maksimimäärän ja minimimäärän välillä, joka maksimimäärä ei saosta kuin mitättömän määrän entsyymiä, ja joka minimimäärä jättää liuokseen vain mitättömän määrän epäpuhtauksia, pääasiassa hiilihydraatteja, ja että supernatantti erotetaan seuraavaksi saostumasta, joka heitetään pois. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että seos, joka sisältää liukoista aluminaattia, vesipohjaista entsyymiliuosta ja happoa, sisältää myös veteen-sekoittuvaa liuotinta, edullisesti alkoholia. 20

, 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu • « · siitä, että alkoholi on glyserolia tai glykolia.

* · · * · · '··.* 4. Patenttivaatimusten 2-3 mukainen menetelmä, tunnettu * < t 25 siitä, että alkoholia on seoksessa läsnä määrä välillä 20 ja ·,· | 80 % paino/paino.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu j siitä, että happo on muurahaishappoa. •‘''I 30

• 6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu » • · « siitä, että liuoksen pH-arvo pidetään välillä pH 5 ja 8. • · * • i

• · · : 7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu • ♦ I • I .·, : 35 siitä, että liukoinen aluminaatti on natriumaluminaattia. • »i • · 116225

8. Patenttivaatimuksen 1 tai 5-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että aluminaatin maksimimäärä on välillä 2 ja 3 % paino/paino liuoksesta, laskettuna Aliksi, ja että minimimäärä on välillä 0,3 ja 1 % paino/paino liuoksesta, 5 laskettuna Aliksi.

9. Patenttivaatimusten 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että supernatantti erotetaan saostumasta sentrifu-goimalla tai suodattamalla. 10

10. Patenttivaatimusten 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että flokkulointiainetta lisätään hapon ja aluminaatin lisäyksen jälkeen, mutta ennen supernatantin ja saostuman erotusta, ja että flokkulointiaine on kationista ja/tai 15 anionista flokkulointiainetta.