KR100278329B1 - 효소 수용액의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명의 방법은 선택적으로 물-혼화성 용매의 존재하에서, 산과 알루민산염을 양을 조절하여 동시에 첨가한 후, 침전물로부터 상징액을 단리하는 것으로 이루어진다.

이것에 의하면 상징액속에 존재하는 효소로부터 불순물이 보다 더 효과적으로 단리된다.

Description

효소 수용액의 정제방법

효소 수용액, 특히 효소 발효액을 정제 또는 농축하기 위한 많은 정제방법들이 당업계에서 공지되었다. 실례는 염석(salting-out) 및 활성탄 처리이다.

그러나, 이러한 정제방법이 탄수화물, 비효소단백질, 착색화합물, 및 기타 불순물로부터 효소를 단리하는 선택성은 개선의 여지가 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 탄수화물, 비효소단백질, 착색화합물, 및 기타 불순물로부터 효소를 효과적으로 단리할 수 있는 효소 수용액의 정제방법을 제공하는 것이다.

효소 수용액의 보통의 공급원은 발효액 또는 여과된 발효액이다.

본 발명에 따른 효소 수용액의 정제방법은 가용성 알루민산염이 효소 수용액에 첨가되고, 동시에 용액의 pH-값이 4와 10사이에서 유지되고 pH-값이 정제되는 효소의 등전점으로부터 적어도 1pH 단위만큼 다르게 되는 양만큼 산이 첨가되고, 그로 인해서 단지 무시해도 좋은 양 이하의 효소를 침전시키는 최대량과 단지 무시해도 좋은 양 이하의 불순물, 주로 탄수화물을 용액중에 남기게 되는 최소량 사이의 양만큼 가용성 알루민산염이 용액에 첨가되고, 이후에 폐기되는 침전물로부터 상징액이 단리되는 것을 특징으로 한다.

침전공정은 보다 낮은 pH-값에서 가장 효율적인 방식으로 진행된다는 것이 발견되었다. 그러나, 대부분의 효소는 낮은 pH-값에서 낮은 안정성을 나타낸다.

따라서 합리적으로 효율적인 공정 및 합리적으로 양호한 효소 안정성을 갖는 절충 pH-값이 선택되어야 한다.

본 발명에 따라서 침전이 본 발명에 따른 방법에 의하여 수행되면, 실질적으로 어떤 효소도 침전되지 않고 실질적으로 모든 불순물이 침전되는 "윈도"(window), 즉 첨가 알루민산염의 인터벌이 다른 침전제에 대한 것보다 더 크다는 것이 놀랍게도 발견되었다.

pH-조정된 효소용액에 가용성 알루민산염을 첨가한 후 수산화알루미늄을 침전시키면 pH가 변할 것이지만, 그러나 변화된 pH-값이 상술한 조건을 충족시키지 않으면, 즉 변화된 pH-값이 4와 10 사이의 범위에 놓여있지 않으면, 그리고 그것이 정제되는 효소의 등전점으로부터 적어도 1pH 단위만큼 다르지 않으면, 본 발명에 따라서 pH-값이 포름산으로 재조정된다는 것이 이해되어야 한다.

본 명세서에서 "가용성 알루민산염" 은 수성매체에서의 용해도가 25℃의 온도에서 용액 ℓ당 100g 이상인 알루민산염을 의미한다. 하나의 실례는 알루민산 나트륨이다.

단지 무시해도 좋은 양 이하의 효소를 침전시키는 알루민산염의 최대량은 효소의 종류 및 농도에 좌우되며, 그것은 정상적으로는 용액에 대해서 약 5% w/w일 것이다.

단지 무시해도 좋은 양 이하의 불순물, 주로 탄수화물을 침전시키는 알루민산염의 최소량은 불순물의 종류 및 농도에 좌우되며, 그것은 정상적으로는 용액에 대해서 약 0.5% w/w일 것이다.

몇몇 효소는 용액에 대해서 0.8% 알루민산염의 양만큼 가용성 알루민산염의 첨가로 어느정도 침전되는 경향이 있으며, 그러한 효소는 본 발명에 아주 잘 적합하지는 않다.

미국특허 제 3,795,586호는 수산화알루미늄 및 기타 불용성 화합물이 침전되는 효소의 정제 방법을 기술한다.

그러나, 수산화알루미늄이 형성되는 모든 실시예에서 황산 알루미늄이 사용되었고, 본 발명에 따르면, 산과 조합한 알루민산염에 의하여 불순물로부터 효소를 훨씬 더 효과적으로 단리할 수 있다는 것이 발견되었다.

WO 91/09943, 8페이지, 11째줄-13째줄에는, 응집(flocculation)단계동안 발효액 ℓ당 N a A ℓ0₂4g의 양만큼 N a A ℓ0₂가 발효액에 침가되는 것이 기재되어 있다.

그러한 크기의 농도로 N a A ℓ0₂를 첨가하는 것은 어떤 용해된 물질을 침전시키지 않고 단지 이미 존재하는 입자들을 응집시킬 것이다. 따라서 이러한 N a A ℓ0₂의 농도는 제 1항에서 기재된 알루민산염의 최소량보다 더 작다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 하나의 구체예는 가용성 알루민산염, 효소 수용액 및 산으로 구성된 혼합물이 또한 물-혼화성 용매 바람직하게는 알코올을 포함하는 것으로 이루어진다. 어떤 경우에는 비교적 높은 농도의 알루민산염 (가령, Aℓ으로서 계산된 약 0.8% 이상) 의 사용은 알루미늄 함유 면상침전물에의 효소흡착때문에 초기 응집동안 효소의 실질적인 손실을 일으킬 수 있다는 것이 발견되었다.

그러나 본 발명의 이 구체예는 이러한 실질적인 손실을 방지할 수 있다.

알코올은 대개 응집전에 첨가되고, 이러한 첨가는 알루민산염의 포지티브 효과를 변화시키지 않고, 침전물에서의 상징액의 단리를 해롭게 하지 않을 것이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 알코올이 글리세롤 또는 글리콜인 것을 포함한다. 상술한 효소의 실질적인 손실의 방지에는 글리세롤 또는 글리콜이 매우 적합한 알코올이라는 것이 발견되었다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 알코올이 20%와 80% w/w 사이의 양만큼 혼합물속에 존재하는 것을 포함한다. 알코올의 20-80% w/w 인터벌은 효소의 실질적인 손실의 가장 효율적인 방지를 위한 최적의 인터벌이라는 것이 발견되었다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 산이 포름산인 것을 포함한다.

포름산은 다른 산보다 더 선택적인 단리를 제공한다는 것이 발견되었다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 용액의 pH-값이 5와 8 사이에서 유지되는 것을 포함한다. 이 pH 인터벌은 대부분의 효소에 최적이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 가용성 알루민산염이 알루민산나트륨인 것을 포함한다. 알루민산나트륨은 가장 값싼 알루민산염이고 상업적으로 구입할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 알루민산염의 최대량은 Aℓ으로서 계산하여 용액의 2%와 3% w/w사이이고 최소량은 Aℓ으로서 계산하여 용액의 0.3%와 1% w/w사이인 것을 포함한다. 알루민산염의 최대 및 최소 첨가의 이러한 값은 대부분의 효소에 대해 효율적인 단리를 제공한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 원심분리 또는 여과에 의하여 상징액을 침전물로부터 단리시키는 것을 포함한다. 이것은 가장 효율적이고 간단한 단리방법이다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 구체예는 산과 알루민산염의 첨가 후, 그러나 상징액과 침전물의 단리 전 응집제가 첨가되고, 응집제가 양이온성 및/또는 음이온성 응집제인 것을 포함한다.

이러한 응집제의 사용에 의해 훨씬 더 양호한 단리가 이루어진다.

본 발명에 따른 방법을 하기의 실시예에 의해 기술한다.

Savinase은 US 3,723,250에 따라서 발효된다.

발효액 1ℓ에 하기의 것들을 첨가한다:

물 1.5ℓ

염화칼슘 이수화물 10g

알루민산나트륨 40-

포름산 대략 40-

pH는 포름산의 투여량의 조절에 의하여 5.5-6.0의 범위에서 유지된다.

Rohafloc KF 785 대략 300mg

Superfloc A 130 대략 150-

상징액은 원심분리에 의하여 침전물로부터 단리된다. Rohafloc KF 785는 Rohm의 양이온성 응집제이고, Superfloc A 130은 American Cyanamid의 음이온성 응집제이다.

[실시예 2]

Esperase은 US 3,723,250에 따라서 발효된다.

발효후 1ℓ수도물/ ℓ배양액, 35g CaC ℓ₂ㆍ2H₂0/ℓ배양액, 1Og Aℓ₂(S0₄)₃/ℓ배양액 의 첨가에 의해 배양액을 예비처리한다. Aℓ₂(S0₄)₃첨가하는 동안 수성 수산화나트륨으로 pH를 8.0으로 일정하게 조정한다.

그다음 양이온성 및 음이온성 응집제: Superfloc C 521 (5g/ℓ배양액) 및 Superfloc A 130 ( 300mg/ℓ배양액 )의 첨가에 의하여 현탁액을 응집시킨다.

투명한 액체를 얻기 위해서는 응집된 현탁액의 단리를 원심분리후 여과에 의해 수행한다. 여과액을 대략 12% RI(굴절률) 에 해당하는 건조물질함량까지 증발시키고 대략 37℃의 온도까지 가열한다.

이 온도에서 용액에 250g Na₂S0₄/ℓ농축액 을 빨리 혼합하면서 적가한다.

수산화나트륨 및 20% 아세트산으로 pH를 7.0으로 조정하고, 현탁액을 1/2 시간동안 혼합한다.

침전된 효소를 필터 프레스상에 수거하고, 25℃에서 모노프로필렌 글리콜(2.5ℓ/kg 필터 케이크)에 재용해시킨다. 용해되지 않은 물질을 여과에 의해 제거하고, 모노프로필렌 글리콜과 물의 혼합물로 필터 케이크를 잠기게 한다.

Esperase여과액을 대략 30%의 모노프로필렌 글리콜 농도로 물로 희석시키는데, Esperase의 농도는 대략 20g/ℓ이다.

그 다음에는 모노프로필렌 글리콜 농축액을 pH 5.9(포름산으로 조정) 에서 알루민산 나트륨(5g/ℓ) 으로 처리하고 여과했다.

필터 케이크를 모노프로필렌 글리콜과 물의 혼합물로 잠기게 한다.

이 알루민산염 반응에서 Esperase의 수율은 95% 이상이고, 색깔 감소는 80% 이상이다.

Claims (9)

1. 효소 수용액의 정제방법에 있어서, 효소 수용액에 가용성 알루민산염과 산을 동시에 첨가하고, 여기서 용액의 pH 값이 4와 10 사이에서 유지되고 pH 값이 정제되는 효소의 등전점으로부터 적어도 1 pH 단위만큼 다르게 되는 양만큼 산을 첨가하며, Al으로서 계산하여 용액의 0.3 내지 3% (w/w)의 양만큼 가용성 알루민산염을 첨가하고, 이어서, 침전물로부터 상징액을 단리하고 침전물을 폐기하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 가용성 알루민산염, 효소 수용액 및 산으로 구성되는 혼합물이 또한 물-혼화성 용매, 알코올을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 알코올이 글리세롤 또는 글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 알코올이 혼합물에서 20%와 80% w/w 사이의 양만큼 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 산이 포름산인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 용액의 pH-값이 5와 8사이에서 유지되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 가용성 알루민산염이 알루민산 나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상징액은 원심분리 또는 여과에 의하여 침전물로부터 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 산과 알루민산염의 첨가 후, 그러나 상징액과 침전물의 단리 전에 응집제가 첨가되고, 응집제는 양이온성 및/또는 음이온성 응집제인 것을 특징으로 하는 방법.