JPH07504089A - ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞障害性Ｔ細胞の活性化 - Google Patents

ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞障害性Ｔ細胞の活性化

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４、前記遺伝子が誘発可能プロモーターの制御下に存在する請求項３記載の細胞 系。
５、発現可能ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子をさらに含む請求項３記載の細胞 系。
Ｇ、ヒトクラスＴ　ＭＨＣ分子モノタイプを発現する請求項１記載の細胞系。
７、前記ＭＨＣ分子が空である請求項６記載の細胞系。
８、前記昆虫細胞が、表面発現されたヒトクラスＭＩＩＣ分子を有するドロソフ ィラ細胞を含んで成る請求項３記載の細胞系。
９、前記表面−発現されたＭＨＣ分子の数が、ＣＤ８細胞を活性化するのに十分 な量である請求項８記載の細胞。
１０、少なくとも１種の発現可能ヒトクラスＩ　Ｍ）ＩＣ遺伝子を含む真核細胞 系を生成するための方法であって：真核細胞の培養物を確立し；そして 誘発性プロモーター及び発現可能ヒトクラスＩ　ＭＨＣ遺伝子を含んで成る誘発 性発現ベクターにより前記培養物をトランスフェクトすることを含んで成る方法 。
Ｉｌ、前記ベクターが、発現可能ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子をさらに含ん で成る請求項１０記載の方法。
１２、前記ベクターが、転写可能ポリアデニル化部位をコードするヌクレオチド 配列をさらに含んで成る請求項１０記載の方法。
１３、前記細胞がドロソフイラ細胞である請求項１０記載の方法。
１４、前記ベクターがｐＲｍｌＩａ　−３を含んで成る請求項１３記載の方法。
１５、活性化されたＣＤ８細胞をインビトロで生成するための方法であって、Ｃ Ｄ８細胞とドロソフイラ細胞上に表面発現された抗原−負荷ヒトクラスＩ　ＭＨ Ｃ分子とを、前記ＣＤ８細胞を抗原特異的態様で活性化するのに十分な時間、イ ンビトロで接触せしめることを含んで成る方法。
１６、前記抗原−負荷クラス１分子から前記活性化されたＣＤ８細胞を分離し： 前記活性化されたＣＤ８細胞を許容できるキャリヤー又は賦形剤に懸濁し；そし て 前記懸濁液を処置の必要な個人に投与することをさらに含んで成る請求項１５記 載の方法。
１７、ヒト患者における標的細胞を特異的に殺害するための方法であって： 前記患者から前駆体ＣＤ８細胞を含む流体サンプルを得；前記ＣＤ８細胞とドロ ソフイラ細胞上で表面−発現された抗原−負荷ヒトクラスＩ　ＭＨＣ分子とを、 抗原特異的態様で前記ＣＤ８細胞を活性化するのに十分な時間、インビトロで接 触し；そして前記活性化されたＣＤ８細胞を前記患者に投与することを含んで成 る方法。
１８、移植された組織の拒絶を阻止するための方法であって：ドロソフィラ細胞 上で表面−発現された空のヒトクラス１分子を毒素にインビトロで接合し： 前記接合されたクラス１分子と前記移植された組織に由来する抗原性ペプチドと を、前記接合体に前記ペプチドを負荷するのに十分な時間、インビトロで接触し ： 前記ペプチド−負荷された接合体を分離し；そして前記ペプチド−負荷された接 合体を、移植処置を受けた個人に投与することを含んで成る方法。
１９、誘発性プロモーターに操作的に結合される発現性ヒトクラスＩ　Ｍ）ＩＣ 遺伝子を含んで成る組換えＤＮＡ配列。
２０、ベクターにおける請求項１９記載の配列。
明細書 ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞障害性Ｔ細胞の活性化本発明は米国政府の援助を 受けて成されたものであり、米国政府は本発明において一定の権限を有する。
技術分野 本発明は、特定の抗原ペプチドに対する特異性を有するＣＤ８細胞をｉｎ　ｖｉ ｔｒｏにおいて活性化する方法と、活性化されたＣＤ８細胞を、ｉｎ　ｖｉｖｏ において、ある種の病状の治療に使用すること、およびこれらの使用に適した組 成物に関する。
背景 感染症から個体を救護または防護する免疫系の効力は、科学者ｉことって常に興 味深いものとなってきたが、それは免疫系を活性化して他のタイプの疾患と戦わ せることが可能であると信じられてきたからである。そのような疾患にはエイズ 、肝炎、および免疫抑制された患者の感染症が含まれる。それらのタイプの疾患 には、抗体の使用を含む種々の方法が用いられてきたが、細胞障害性Ｔ細胞を用 いて成功した試みはあるとしてもごくわずかしか記録されて（１なし）。
理論的には、細胞障害性Ｔ細胞は上記のタイプの疾患の好まい１治療法であろう 。しかしながら細胞障害性Ｔ細胞を特異的に活性化させるためのｔｎ　ｖｉｔｒ ｏにおける方法はまだ得られていない。
細胞障害性Ｔ細胞、または現在ＣＤ８細胞として知られている細胞は、ウィルス 感染に対する主要な防御線を代表するものである。
ＣＤ８リンパ球はウィルスに感染された細胞を特異的に認識して殺す。
従って、ウィルス感染を排除することの代償は、感染された細胞の損失を伴うこ とである。ＣＤ８細胞の表面上にあるＴ細胞受容体は外来抗原を直接認識するこ とはできない。抗体と対照的に抗原はまず受容体に提示されなければならない。
Ｔ細胞への抗原の提示はクラス■タイプの主要組織適合性複合体（Ｍ）ＩＣ）分 子により成就される。主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は免疫応答において重要 な役割を果たす糖タンパク質の広大なファミリーをコードしている大きな遺伝子 座に関係する。ＭＨＣ遺伝子はまた、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体とも呼ば れ、ヒトでは第６染色体上に座している。ＭＨＣ遺伝子によってコードされてい る分子は細胞表面上に存在しており、移植組織を「非自己」として認識すること に大きく関与している。従って、膜に結合したＭＨＣ分子は、Ｔ細胞による抗原 の認識に密接に関与している。
ＭＨＣ産物は■、■、および■と呼ばれる三つの主要なりラスに分類される。主 にヘルパー細胞として働くＴ細胞はＣＤ４を発現し、主としてクラス■分子によ って制限されるのに対し、ＣＤ８を発現している細胞はほとんどが細胞障害性エ フェクター細胞であり、クラス■分子と相互作用をする。
クラス１分子は膜糖タンパク質であり、主として内在タンパク質の細胞内分解に 由来するペプチドを結合する能力をもつ。ＭＨＣ分子と、ウィルス、細菌、およ び他の外来タンパク質に由来するペプチドとの複合体は、Ｔ細胞の抗原反応性を 引き起こすリガンドを構成する。これに対し、ＭＨＣ分子と正常細胞の産物に由 来するペプチドとの複合体は、胸腺においてＴ細胞に自己のペプチドに対する寛 容性を「教える」ことに重要な役割を果たす。クラス１分子は完全でそのままの 抗原を提示するのではなく、むしろそれらのペプチド断片を「ペプチド結合溝」 の上に「充填し」提示する。
長年にわたり免疫学者はウィルス、レトロウィルス、およびがん細胞を特徴とす る特異的な細胞障害性細胞を増やすことを望んできた。ウィルス疾患を標的とす ることは、一般に生きているがまたは弱毒化したワクチンを用いた予防接種によ り　ｉｎ　ｖｉｖｏで成就されているが、レトロウィルスまたはがん細胞を用い た場合には同様な成功をおさめていない。さらに、免疫抑制された患者ではワク チン法は期待通りの効力を生じていない。この困難を迂回する一つの方法は健康 な個体を免疫し、この個体からｃｏｇｍａｔを革猷乙、これらのＣＤ８細胞を疾 病に苦しんでいる人に注射することであろう。この実験上のプロトコルは近交系 マウスではいまくいくようであるが、ヒトでは成功していない。いくつかの説明 が可能である。まず第一に、ある与えられたＭＨＣに対してペプチドが特異的で あるということであり、言い換えればある抗原ペプチドが特定の種類のＭＨＣと 選択的に結合し、他の種類とは、「好ましいＪ　ＭＨＣ分子がない場合はなおさ ら、うまく結合しないということである。さらには、ＭＨＣ分子が非常に冬型性 であり、このことは少なくとも２つの問題を生じる。
第一に、ある個体のＣＤ８細胞は、その個体に存在している３ないし６個のクラ ス１分子に正確に結合しているペプチドとしが相互作用ができない。第二に、Ｃ Ｄ８細胞は、クラス１分子がどのようなペプチドを含んでいるかに無関係に、Ｃ Ｄ８細胞を採取した個体に発現されているものと異なるすべてのクラス１分子と 激しく反応する。この反応性は相当長い間観察されており、アロ反応性と呼ばれ ている。
このことは、移植器官の免疫拒絶の根元的な原因である。
従って、ある個体が別の個体に対して活性化したＣＤ８細胞の供与者として使わ れるというやや大胆な実験プロトコルを別とすると、全く同一のクラス１分子構 成をもつ血縁ではない２人の人を探すことはむずかしい。この理由から、少なく ともひとりの研究者は、現在あるＣＤ８細胞をＴ細胞成長因子であるルー２と共 にｉｎ　ｖＨｒｏで培養することにより「増幅」するという、やや非特異的な方 法をとってきた。しかしながらこのプロトコル（ＬＡＫ細胞療法として知られる ）は、すでに活性化されたＣＤ８細胞の発育を許すにすぎない。免疫系は常に一 つまたはもう一つの原因に対して活性があるため、ＩＬ−２に刺激された細胞の ほとんどは、疾病と戦うという目的にはそぐわないであろう。事実、このタイプ の治療が、希望した特異性をもついかなる細胞をも活性化するという報告はまだ ない。従って、ＬＡＫ細胞療法の利点は、一番良くみても論議の的となり、さら に副作用が典型的に重いため多くの研究が中断されてきた。
ペプチドを充填するプロセスに関与していると考えられるいくつかの新規な分子 が最近同定された。また、結合したペプチドをもたないクラス１分子（「空の」 分子）の、ある制限された情況下での産生が可能であることもわかってきた。し かしながら、結合したペプチドをもたないクラス１分子は極めて熱に不安定であ るため、これらの「空の」分子はしばしば細胞表面に到達することができない。
従って、「空の」クラス１分子は、細胞内部から細胞表面への輸送の間に分解す る。このことは、ウィルスタンパク質を活発に合成している細胞だけが破壊され ることを免疫系が保証できる気のきいた手段である。たとえば、ウィルス感染し たある種の細胞が殺されるとウィルスのペプチドが放出されるであろう。もし隣 接する細胞が「空のｊクラス１分子（結合したペプチドのないもの）を発現して いたとすると、これらの細胞は放出されたウィルスのペプチドで被われてしまう であろう。細胞障害性Ｔ細胞（またはＣＤ８細胞）は、ペプチドがどのようにし て、または何故クラス１分子に結合することになったかを確かめる手段をもたな いので、ウィルスペプチドの被覆物を受動的に得た細胞も、ウィルスタンパク質 を活発に合成している細胞と同様に殺されてしまうであろう。
ｉｎ　ｖｉｖｏでは、ウィルスペプチドはプロテアソームとして知られている大 きな粒子によって分解される。この酵素複合体は、正常かつ細胞由来のタンパク 質をも分解し、そのことから我々自身の細胞のタンパク質に由来するペプチドが クラス１分子上の結合部位をめぐってウィルス由来のペプチドと競合することが 示唆される。従って、クラス１分子の大部分が我々自身の細胞のタンパク質に由 来するペプチドを含んでいるのに対して、ウィルス感染細胞の表面上にあるいく つかのクラス１分子のみが実際にウィルスペプチドを含んでいるにすぎない。一 つの細胞の表面には何方ものクラス１分子があり、さらにＣＤ８細胞はある与え られたウィルスペプチドを充填しているわずか２００個のクラス１分子を認識で きるにすぎないためウィルスタンパク質由来のペプチドと、細胞タンパク質由来 のペプチドとの間の競合は、ＣＤ８細胞がウィルス感染細胞を破壊する能力を完 全におびやかすものではない。それにもかかわらず、もし細胞を「操作して」た だ一種類だけの抗原ペプチドを提示しているクラス１分子を発現させることがで きれば、すなわち、すべてのクラス１分子が同一のペプチドを結合しているとす れば、ＣＤ８細胞の活性化の効率は論証上増加するはずである。
クラス１分子は特異的な方法でペプチドを結合する。ペプチドはすべて、およそ ８〜９アミノ酸の長さでなければならず、それらの配列はクラス１分子のペプチ ドを結合するくぼみにぴったり合うものでなければならない。この点ではクラス １分子は抗体との類似性を示している。しかしながら、ある与えられた抗体がた だ一つの抗原とのみ結合する傾向があるのに対し、ある与えられたクラス１分子 は何間もの異なるペプチドと結合することができる。ウィルスおよび他の病原体 の数は非常に多いため、もし単一のクラス１分子しかないとすれば、たとえそれ が多くの異なるペプチドを結合腰変化させることができたとしても、我々の免疫 防御が不十分であ・ることは明らかである。この理由からすべてのヒトは３〜６ の異なる２５２１分子をもち、それらは各々多数の異なるタイプのペプチドと結 合することができる。従って、ＣＤ８細胞は一つまたはもう一つのクラス１分子 に結合している何千ものペプチドを認識することができる。
進化において選択が支配的な力になっていると考えられるように、免疫系によっ て効率的に認識されない病原体が出現する。従っである種の２５２１分子に効率 的に結合するペプチドを生じるウィルスの配列は、一つの個体に存在する３〜６ の２５２１分子のいずれによっても認識されないよう突然変異するであろう。従 ってこのウィルスは免疫系によって認識されず、結果として感染した個体を殺す であろう。もしすべての個体が同じ２５２１分子のセットをもっていたなら、そ のようなウィルスはおそらくその種全体を排除したであろう。しかしながら、そ の集団には数百の異なる２５２１分子の型があるため、個体ごとの変異がその可 能性に対する防御手段となっている。このように、異なる個体には異なる２５２ １分子のセットがあるため、突然変異したウィルスがある個体をそこなうことが あっても、集団全体の絶滅という結果になることはありそうもない。
もしクラス１分子が我々自身の細胞タンパク質に由来するペプチドを含めて種々 のペプチドを結合することができるとすれば、免疫系のＣＤ８細胞が何故我々自 身の組織を認識し破壊しないのかという疑問が生じる。この疑問に対する答えは 完全に明らかではないが、現在量つの別々の機構が作動していると信じられてい る。まず第一に、自己のペプチドと反応することのできるＣＤ８細胞は、胸腺に おいて排除される。第二に、ＣＤ８細胞は免疫系の末梢器官において自己のペプ チドに対して非反応性（アネルギー状）となる。細胞タンパク質のすべてのタイ プまたはエピトープが胸腺内で合成されるわけではないので、第二の機構の方が より可能性の高い説明であると考えられる。この機構は、通常出会う自己ペプチ ドのレベルに関して作動すると考えられる。もしこのレベルが何らかの方法で上 昇すると、自己のペプチドを発現している細胞を認識し破壊することのできるＣ Ｄ８細胞を実際に個体がもっていることが示されるであろう。
この後者の観察は、腫瘍細胞を排除するために免疫系を用いるという考え方に対 して重要な意味をもつ。
発明の簡単な要約 先に論じた問題を解決するためのより直接的な方法は、疾病との戦いに関係のあ るＣＤ８細胞のみを直接に特異的に刺激することであろう。クラス１分子へのペ プチドの充填を支配している機構についての最近の洞察は、今やこれを可能にし た。かくして、２５２１分子はドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈ ｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ショウジヨウバエの一種）の細胞におい て発現されるようになった。
ドロソフィラは免疫系をもたないため、その細胞にはペプチドを充填する装置に 関与するいくつかのタンパク質が欠けているはずである。ペプチド充填装置がな いことが、２５２１分子が細胞表面上に「空の」分子として発現されることを可 能にしたことが現在量らかになっている。
ドロソフィラの系を用いるもう一つの利点は、ドロソフイラの細胞が３７℃より も２８℃の温度を好むことである。このことは、「空の」２５２１分子が熱に不 安定でああり３７℃では分解する傾向があるため、非常に重要である。クラスＩ を発現しているドロソフイラ細胞をクラス１分子に結合することができるペプチ ドと共にインキュベートすることにより、各２５２１分子ごとに全く同一のペプ チドを含ませるごとが可能である。それ故、それらの細胞は、２５２１分子が多 くの異なるタイプのペプチドを含んでおりそれらのほとんどが我々自身の無害な 細胞タンパク質であるという哺乳類細胞とは非常に異なっている。
ｉｎ　ｖｉＬｒｏにおいてＣＤ８細胞を特異的に活性化させるための何間という 研究室における長年にわたる数多くの失敗に終わった努力にもかかわらず、単一 のペプチドを含んでいる２５２１分子の高いレベルの発現は、　ｉｎ　ｖｉｖｏ で免疫系を刺激する必要性をなくすはずであるということはもっともらしい。適 切に処理したドロソフイラ細胞を未起動のマウス（使用するペプチドにいまだか つて出会ったことのないマウス）に由来するひ臓またはリンパ節の細胞と共にイ ンキュベートすることにより、すべてがその抗原ペプチドに特異的である細胞障 害性Ｔ細胞を生み出すことが今や可能である。その細胞障害性の応答は、以前か ら知られている方法で得られるものより通常３〜５倍強い。
いくつかの実施例はこの文章の中においてマウスの２５２１分子を用いたモデル を提示しているが、他の実施例はヒトのクラス１分子またはヒトの分子を発現し ているトランスジェニックマウスを用いて開示されている。一つの実施例では、 ＨＩＶ（エイズウィルス）のｇａｇタンパク質に由来するペプチドが使われてい る。この分子の組合せは非常によく作動し、実際に純粋なマウスのモデルを用い た実験と同じようにうまくいついた。さらに、ここに開示されている系は、ドロ ソフィラの系においてヒトの分子をここに開示したように使用するものであり、 ＤｅＢｒｕｉｊｎらによる最近の論文（Ｅｕｒ、　Ｊ、　１ｍｍｕｎｏｆ。
２１、、２９６３−７０．１９９１）に記載されているマウスの系よりもはるか に用途が広い。特に、後者の系は確実に殺すために大量のエフェクター細胞を必 要とし、ここに開示した系より用途がせまい。さらに重要なことには、ここに開 示した系はマウスの系と異なり、ヒトの分子に対する反応を効率よく使いかつ活 性化させる。
現在まで行われ、ここに開示されている実験のほとんどは、そのままのドロソフ ィラ細胞を用いてきた。しかしながら、空の、先を切りとった分子がドロソフィ ラ細胞から高い収量（約１ｍｇ／Ｌ）で得られることが今証明された。このよう な分子は、移植を受けた患者における免疫抑制の成就およびリウマチ様関節炎の ような自己免疫疾患の患者の治療に有用であろう。
要約すれば、　ｉｎ　ｖｉｖｏでペプチドがどのようにして生じ、クラス１分子 上に充填されるのかを詳しく理解することを自衛した、本発明者らの長期にわた る言明が、本発明者らの選んだペプチドに対してＣＤ８細胞を活性化させる合理 的かつ非常に効率のよい方法の開発を刺激したということである。そのような活 性化された細胞の使用が幅広い種類の病状の治療に役立つであろうことが、本発 明者らの信じるところである。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＣＤ８細胞を特異的に活性化させるために、２５２１分子を 産生じ充填し利用する、合理的かつ気のきいた方法が今この文章の中で開示され る。さらに、この新しい技術の、ウィルス疾患、レトロウィルス疾患、自己免疫 疾患、および自己免疫型の疾患と同様に、がん、腫瘍、または新生物の治療への 応用が開示されている。
従って、本発明は、少なくとも一つの発現可能な、ヒトクラスＩＭＨＣのヌクレ オチド配列、好ましくは誘導可能なプロモーターの支配下にあるｃＤＮＡ配列を 含んでいる真核細胞系を意図するものである。
さらに好ましくは、その細胞系はまた発現可能なヒトβ２ミクログロブリンのヌ クレオチド配列も含んでいる。もう一つの態様においては、本発明は少なくとも 一つの発現可能なヒトクラスＩ　ＭＨＣｃＤＮＡ配列を含んでいる昆虫細胞系を 意図している。その配列は誘導可能なプロモーターの支配下にあることができ、 その細胞系はさらに発現可能なヒトβ２ミクログロブリン遺伝子を含むことがで きる。
本発明はまた、ヒトのクラスＴ　ＭＨＣ分子の単−型を発現している真核細胞系 をも意図している。一つの態様においては、ＭＨＣ分子は空である。もう一つの 態様においては、真核細胞は昆虫細胞であり、より好ましくはその昆虫細胞はそ の表面上にヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子を発現することが可能である。もう一つ の見地では、本発明の昆虫細胞は、ＣＤ８細胞を活性化するために十分な数の、 表面に発現されたヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子を含んでいる。この文章中に開示 されている昆虫細胞は、さらに平均およそ２００の、表面に発現されたヒトのク ラスＩ　ＭＨＣ分子を含むことができる。また、その細胞が表面に発現されたヒ トのクラスＩ　ＭｌＩＣ分子を有するドロソフィラ細胞であることも意図されて おり、より好ましくは、その細胞はＣＤ８細胞を活性化するために十分な数の、 表面に発現されたヒトクラスＩ　ＭＨＣ分子を含んでいる。もう一つの態様にお いては、細胞は表面に発現されたヒトのクラスＩＭｌ＋Ｃ分子を有するドロソフ ィラ細胞であり、更なる変形においては、ドロソフィラ細胞はおよそ２００〜５ ００．０００の表面に発現されたヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子を含んでいる。さ らにもう一つの態様においては、その分子の数が細胞あたり２００〜１，０００ の範囲である。本発明はさらに、細胞がこの文章の中に述べられている特徴を有 している、いろいろな細胞の培養も意図している。
本発明によって意図されているもう一つのことは、細胞株を作るための種々の方 法である。一つの態様においては、少なくとも一つの発現可能なヒトのクラスＩ 　ＭＨＣ遺伝子を含んでいる真核細胞の細胞株を作る方法が開示されており、こ の方法は真核細胞の培養の確立と、その培養物への誘導可能なプロモーターと発 現可能なヒトのクラスＩ　ＭＨＣ遺伝子とを含んでいる誘導可能な発現ベクター のトランスフェクションとを含む。もう一つの変形においては、ベクターはさら に、発現可能なヒトβ２ミクログロブリン遺伝子を含んでおり、さらに別の見地 においては、ベクターはさらに、転写可能なポリＡ部位をコードしているヌクレ オチド配列を含んでいる。好ましい態様においては、ベクターはｐＲｍ）ｌａ　 −３を含む。本発明はまた、開示された方法に従って使用される細胞が、ドロソ フィラ細胞でよいということを期待している。他の変形においては、培養物は安 定でもよいし一時的でもよい。開示された方法によれば、クラスＩ　ＭＨＣ分子 は好ましくはヒトの分子であり、ＨＬＡ−Ａ、　ＨＬＡ−Ｂ、　ＨＬＡ−Ｃ，Ｈ ＬＡ−Ｅ。
１１ＬＡ−Ｆ　、およびＨＬＡ−Ｇを含む群から選び、さらに好ましくは、ＨＬ Ａ−Ａ、　ＨＬＡ−８、および（ルＡ−Ｃを含む群から選ぶ。
本発明はさらに、ＣＤ８細胞活性化のための固体マトリックスも意図しており、 好ましい態様においては、マトリックスはヒトのクラスＩ　ＭＨＣ単−型である ことが特徴づけられる。もう一つの変形においては、マトリックスは単一抗原性 である。もう一つの態様は、マトリックスがヒトのクラスＩ　Ｍ）ＩＣ単−型で あることが特徴づけられる、抗原に特異的な方法でＣＤ８細胞を活性化するため の固体マトリックスを開示している。もう一つの変形においては、マトリックス がＣＤ８細胞を活性化するに十分な量の、抗原を充填したヒトのクラスＩＭｌ＋ Ｃを含んでいるヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子と抗原との複合体を含んでおり、そ の複合体が単−型であるという特徴を有する、ＣＤ８細胞を活性化するための固 体マトリックスを意図している。もう一つの態様においては、その複合体は単一 抗原性である。
本発明はまた一つの方法として、ｉｎ　ｖｉけ０でＣＤ８細胞をドロソフィラ細 胞の表面上に発現されている、抗原を充填したヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子と、 抗原特異的な様式で、ＣＤ８細胞を活性化するに十分な時間接触させる方法を含 んでいる、活性化したＣＤ８細胞をｉｎ　ＶｉｔｒＯ産生するための方法も意図 している。一つの変形においては、表面に発現された分子は単−型であり、もう 一つの変形においては、表面に発現された分子は単一抗原性である。この文章の 中で意図した方法はさらに、（１）抗原を充填したクラス１分子からの活性化し たＣＤ８細胞の単離および、（２）受は入れられる担体または賦形剤に、活性化 されたＣＤ８細胞を浮遊させることと、（３）浮遊物の治療を必要としている個 体への投与を含んでいる。開示された方法によれば、抗原は生来の、または分解 されていない、タンパク質またはペプチドを含むことができ、あるいはまたヒト クラス１分子とのインキュベーションに先だち、少なくとも８個のアミノ酸残基 を含んでいるペプチド断片に分割された抗原ポリペプチドを含むことができる。
もう一つの変形において本発明は、（１）患者から休止中のＣＤ８細胞またはＣ Ｄ８の先駆細胞を含んでいる液体試料を得る方法および、（２）　ｉｎ　ｖｉｔ ｒｏでＣＤ８細胞を、ドロソフィラ細胞の表面上に発現されている、抗原を充填 したヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子と、抗原特異的な様式でＣＤ８細胞を活性化す るに十分な時間接触させる方法および、（３）活性化したＣＤ８細胞を患者に投 与する方法を含んでいる、患者の体内の標的細胞を特異的に殺す方法を意図して いる。本発明はまた、（１）治療を必要とする個体から休止中のＣＤ８細胞また はＣＤ８の先駆細胞を含んでいる液体試料を得る方法および、（２）ｉｎｖｉｔ ｒｏてＣＤ８細胞を、ドロソフィラ細胞の表面上に発現されている、抗原を充填 したヒトのクラスＩ　ＭＩＩＣ分子と、抗原特異的な様式でＣＤ８細胞を活性化 するに十分な時間接触させる方法および、（３）活性化したＣＤ８細胞を患者に 投与する方法を含んでいる、医学的な状態を治療する方法を意図している。この 状態とは、種々の態様において、がん、腫瘍、新生物、ウィルスまたはレトロウ ィルス感染、自己免疫、または自己免疫型の状態を含むことができる。一つの態 様においては、細胞を投与する方法は静脈注射を含む。
本発明はさらに、（１）　ドロソフィラ細胞の表面上に発現されている空のヒト のクラス１分子をｉｎ　ｖｉｔｒｏで毒素に接合させる方法および、（２）接合 したクラス１分子を、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、移植組織由来の抗原ペプチドと、接 合体にペプチドを充填するに十分な時間接触させる方法および、（３）ペプチド を充填した接合体の単離法および、（４）ペプチドを充填している接合体のすで に移植処置を受けた個体への投与法を含んでいる、移植組織の拒絶を阻害する方 法を意図している。他の見地においては、その方法はさらに、投与を通じた監視 と、拒絶のきざしが実質的に減少または排除されるまで投与を継続することを含 んでいる。
本発明のさらにもう一つの変形は、誘導可能なプロモーターに効果的に連結させ た発現可能なヒトのクラスＩ　ＭＨＣ遺伝子を含んでいる組換えヌクレオチド配 列、好ましくはＤＮＡ配列を意図している。
一つの態様においては、その配列はベクター内に存在する。もう一つの変形にお いては、ヌクレオチド配列はさらに、発現可能なヒトβ２ミクログロブリン遺伝 子を含んでいる。ベクターはさらに転写可能なポリアデニル化部位を含むことが できる。
本発明はまた、この文章の中に開示した細胞株によって産生される、安定かつ空 のヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子を意図している。一つの態様においては、クラス Ｉ　ＭＨＣ分子はヒトの分子であり、ＨＬＡ−Ａ。
ＨＬＡ−Ｂ、　ＨＬＡ−Ｃ，）ＩＬＡ−Ｅ、　ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇを 含んでいる群から選択し、さらに好ましくは、）ＩＬＡ−Ａ、　ＨＬＡ−８、お よびＨＬＡ−Ｃを含んでいる群から選択する。もう一つの変形においては、この 分子は可溶性の状態になっている。さらにもう一つの態様においては、クラスＩ ＭＨＣ分子は抗原ペプチドと複合体を作ることができ、より好ましくは、複合体 は単一抗原性である。
図の簡単な説明 図１は、発現プラスミドｐＲ＋＋＋Ｈａ　−２およびｐＲｍＨａ　−３の構築を 図示している。図ＩＡにはｐＲｍＨａ　−２の構築が示されおり、図ＩＢにはｐ ＲｍＨａ　−３の構築が示されており、図１ＣにはｐＲｍＨａ　−３ベクターが 図解されており、発現させるためヌクレオチド配列を挿入することのできる部位 の他に、制限部位、ポリリンカ一部位、プロモータ一部位、およびポリアデニル 化部位を示している。
図２Ａは、ドロソフィラ細胞に発現されたマウスＭＨＣクラスＩＫ１／マウスβ ２（＋ｎβ２）およびＤｂ／ｍβ２がペプチドのない、または「空の」クラス１ 分子の特徴を有していることを示している。
Ｋｂ／β２．Ｌ’／β２、およびＤｂ／β２を発現しているドロソフィラ細胞を ！′Ｓメチオニンで４５分間標識しライゼートを調製した。
それぞれのライゼートを４つのアリコートに分け、各々にＯＶＡ、　ＮＰ、また はＧＰ２ペプチドのいずれかを加えるか、または全くペプチドを加えなかった。
４℃で１時間インキュベートした後、一方は３０分で１時間インキュベートした 。次にクラス１分子をライゼートから免疫沈降させ、ＳＯＳポリアクリルアミド ゲル電気泳動により分析した。
図２Ｂは、マウスまたはヒトのいずれかのβ２ミクログロブリンと共にに１′／ β２．Ｌ’／β２およびＤ’／β２を発現しているドロソフィラ細胞から調製し た放射活性のある細胞ライゼートの分析結果を説明している。インキュベーショ ンの温度（℃）を免疫沈降可能な■（鎖（％）に対してプロットしたものである 。Ｋｂ／ｍβ２（白ぬきの正方形）、Ｋｂ／ｍβ２＋０ＶＡ−８（黒い正方形） 、Ｌ６／ｍβ２（白ぬきの三角形）、Ｌ’／ｍβ２＋ＮＰ（黒い三角形）、Ｄ’ ／ｍβ２（白ぬきの丸）、およびＤ’／ｍβ２　＋　ＩＮＦ（黒い丸）を示しで ある。
図３　（ＡおよびＢ）は、Ｋ’／ｍβ２をＹ３抗体で、かつＤ’　７ｍβ２を８ ２２．２４９抗体で染めた後に、細胞蛍光定量法により測定した、無血清培地中 で培養したドロソフィラ細胞の蛍光の平均値である。図中に示したように染色に 先立ち、細胞をペプチド中（２５μｇ／ｍｌ）で２７℃で１時間インキュベート した後、３７℃で２時間インキュベートした。処理した細胞集団の各々の蛍光の 平均値を、インキュベーションの条件に対してプロットして示しである。図３Ａ は、ドロソフィラ細胞の表面上に発現されているマウスのクラス１分子が３７℃ ですばやく変性されるため、それらはもはや抗りラスＩ抗体では認識することが できないことを示している。図３Ｂは、ドロソフィラ細胞に発現されたクラスＩ 　ＭＨＣ分子が、クラスＩに特異的に結合することがわかっているペプチドの存 在下であらかじめインキュベートしない限り、トリトンＸ１００によるライゼー トの中では熱に不安定であることを示している。
図４は、昆虫細胞が抗原を処理しかつクラ２１分子上にそれを載せることができ るかどうか、およびクラス１分子が内在性または外来性のいずれかの抗原を、Ｔ 細胞に提示することができるかどうかを示している。Ｋｂ／β２でトランスフェ クトしたシュナイダ−２（ＳＣ）細胞または３Ｔ３細胞を、浸透圧が等しい（Ｉ ｓｏ）かまたは高い（Ｈｙｐ）培養液中において、オボアルブミンタンパク質（ ＯｖＰｒｏ）又はオボアルブミンペプチド（ＯｖＰｅｐ）とインキュベートした 。（マウスの細胞株であるＢＡＬＢ／　３　＋　３は、ＡＴＣＣより取得番号Ｃ ＣＬ１６３により入手できる。）処理の後、細胞をＴ細胞のハイブリドーマであ るＢ３／ＣＤ８と共に培養した。Ｂ３／ＣＤ８は、Ｈ−２に’クラス■分子によ り提示されるオボアルブミンペプチド２５３−２７６に特異的な細胞障害性Ｔ細 胞であるｆ３３　（Ｃａｒｂｏｎｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、　１６９．６０３ −１２　（１９８９））と、ＣＤ８を持っているＩＬ−２を分泌する細胞株との 間のＴ細胞ハイブリドーマである。ＩＬ−２依存性細胞株であるＣＴＬＬにおけ る３Ｈチミジンの取りこみで測定すると、Ｂ３／ＣＤ８は抗原刺激に対してＩＬ −２を産生ずる（Ｇｉ　１ｌｉｓら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１２０．２０２７ ．９１９７８））　。従って、産生されたＩＬ−２の量を測定することにより、 Ｔ細胞の認識を分析することができる。
共培養した培養物から上清をとり、ＩＬ−２依存性細胞株であるＣＴＬＬ　（Ａ ＴＣＣＮｏ、ＴＩＢ　２１４）による”Ｈチミジンの取りこみによってＩＬ−２ を分析した。取りこまれた３Ｈチミジンの量を、細胞の最初の処理に対してプロ ットした。
図５Ａ−１および５Ａ−２は、ＨＩＶペプチドによってドロソフイラ細胞の表面 上に発現されるＨＬＡ　Ｂ２７およびＨＬＡ　Ａ２．１の、ペプチドに誘導され る熱安定性を示している。各々の細胞集団の蛍光の平均値をインキュベーション の条件に対してプロットして示した。
図５Ｂは、ドロソフイラ細胞に発現されたＨＬＡ　Ｂ７が、トリトンＸ１００に よるライゼートの中において空のクラス１分子の特徴を有することを示している 。
図５０は、ドロソフイラ細胞に発現されたＨＬＡ　Ａ２．２Ｙが、トリトンｘ１ ００によるライゼートの中において空のクラス１分子の特徴を有することを示し ている。
図６Ａおよび６Ｂは、ペプチド存在下または非存在下に、ｉｎ　ｖｉｔｒ。
でＣＤ８を刺激した後の、最初のＣＤ８の反応の誘導を図解している。
反応者はＢ６マウスのひ臓細胞であり、刺激をするものはＨＭＡ−Ｓ（白ぬきの 三角形）であり、ＲＭＡ−Ｓ　＋　０ＶＡ（黒い三角形）、ドロソフィラ＋ＯＶ Ａ　（白ぬきの正方形）、およびドロソフィラに１′＋０ｖＡ（黒い正方形）が 示されている。図６Ａにおいては、標的はＨＭＡ−３細胞とオボアルブミンペプ チドであり、６Ｂにおいては、標的はＨＭＡ−８細胞である。どちらの図におい ても、エフェクター／標的比に対してパーセント溶解をプロットしである。
図７はペプチドの存在下または非存在下に、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいてＣＤ８を ドロソフィラ細胞で刺激した後の、反応の誘導を図解している。図７において、 反応者であるＣ５７Ｂ１／６ひ臓細胞を、ドロソフィラ細胞に’ＯＶＡで刺激す る。標的細胞は、ＥＬ４．（中心の点にある白ぬきの正方形、ＥＬ４０ＶＡ（黒 イヒし形）、ＥＬ４＋ＯＶＡ　ペプチド（中心に白点のある黒い正方形）、Ｒ） ＪＡ−Ｓ　＋　ＯＶＡペプチド（中心に白点のある黒いひし形）、およびＨＭＡ −３（黒い正方形）を含む。パーセント溶解を、エフェクター／標的比に対して プロットしである。
図８　（ＡおよびＢ）は、トランスフェクトされたドロソフイラ細胞を用いたｉ ｎ　ｖｉｖｏでのブライミングを図解しており、反応者はＣ５７Ｂ１／６マウス のひ臓細胞である。８Ａでは細胞のいくつかは固定しており、８Ｂではドロソフ ィラ細胞はすべて生きている。８Ａでは刺激を与えるドロソフィラ細胞は、Ｋゝ 　（中心に点のある白ぬきの正方形）、固定したに’０ＶＡ（黒いひし形）、固 定したに’ＯＶＡ＋Ｓ／Ｎ（中心に白点のある黒い正方形）、および固定してい ないＫｂＯＶＡ（中心に白点のある黒いひし形）である。８Ｂでは、刺激を与え るハエの細胞は、Ｋ’　（中心に点のある白ぬきの正方形）、ＫｂｌｏＶＡ（黒 いひし形）　、ＫｂｌｏＶＡ　ｉｎ　ｖｉｖｏ／に’１０ＶＡ　ｉｎ　ｖｉｔｒ 。
（中心に白点のある黒い正方形）　、Ｋ　’　１０ＶＡ　ｉｎ　ｖｉｖｏ／　Ｄ 　’１０ＶＡｉｎ　ｖｉｔｒｏ　（中心に白点のある黒いひし形）、およびＤゝ ／　ＯＶＡ　（黒い正方形）のように図解されている。ＡとＢの両者において、 パーセント溶解をエフェクター／標的比に対してプロットしている。
図９　ハｃ５７　ＢＬ／　６　？ウスｉ、：　３ＭＭ　ＥＬ４０ＶＡを注射し、 続イテドロソフィラ細胞を注射するか、または細胞を注入しない実験の結果を説 明している。３つのマウス集団の各々のパーセント生存を生存日数に対してプロ ットしである。グループ■　（黒い丸）はＥＬ４を注入した５日後にＫ“１０Ｖ Ａを発現している５０ＭＩＪの生きたドロソフィラ細胞を皮下注射したものであ り、グループ■（白ぬきの正方形）はＨＬ４を注射した５日後にＫｂｌｏＶＡを 発現している５０ＭＭの生きたドロソフィラ細胞を皮下注射したものであり、グ ループ■（黒いひし形）は対照群であり、何も追加注射を受けていない。グルー プＨのマウスは２０日目に、グループ■のマウスは２３日目に見切りをつけた。
図１．ＯＡ、Ｂ、およびＣは、トランスフェクトされたドロソフィラ細胞を用い たｉｎ　ｖｉｔｒｏでの活性化を図解している。ＡおよびＢにおいて、反応細胞 はトランスジェニックマウスＢ７／ヒトβ２ミクログロブリンのひ臓細胞である 。ＡおよびＢに図解されているように、標的細胞はジャーカット細胞（中心に点 のある白ぬきの正方形）およびＨＩＶ　ＧＡＧペプチドＡでコートしたジャーカ ット細胞（黒いひし形）である。１．ＯＡにおいては、刺激細胞はＢ７　ＨＩＶ 　ＧＡＧ　（Ａ）をもつドロソフィラ細胞であり、ＩＯＨにおいては、それらは Ｂ７をもつドロソフィラ細胞である。ＩＯＣにおいては反応細胞はドロソフィラ Ｂ７ＶＦＲで刺激したトランスジェニックマウスＢ７のひ臓細胞である。
標的細胞はジャーカッ（・（中心に点のある白ぬきの正方形）、ジャーカット／ ＶＰＲＣ黒いひし形）、ＨＭＡ−Ｓ（黒い正方形）、およびＲＭＡ−Ｓ　／ＶＰ Ｒ（中心に点がある白ぬきのひし形）である。Ａ、Ｂ、およびＣにおいて、パー セント溶解をエフェクター／標的比に対してプロットしである。
図１１Ａ、Ｂ、およびＣは、トランスフェクトしたドロソフィラ細胞を用いたｉ ｎ　ｖｉｔｒｏでの活性化を図解している。Ｉ】Ａにおいては反応細胞は、ドロ ソフィラ細胞Ｂ７　ＶＦＲで刺激したヒトＰＢＬ　ＨＬＡ　Ｂ７である。パーセ ント溶解を、エフェクター／標的比に対してプロットしである。標的細胞はジャ ーカットＶＦＲ（中心に点のある白ぬきの正方形）　、ＥＬ４　Ｂ７　（黒いひ し形）、ジャーカット（黒い正方形）、およびＥＬ４　Ｂ７　ＶＰＲ（中心に点 のある白ぬきのひし形）である。ＩＩＢにおいては、反応細胞はドロソフィラ細 胞Ａ２　ＧＡＧ　（Ａ）　（ＨＩＶ）で刺激したヒトＨＬＡ２　ＰＢＬである。
パーセント溶解を、エフェクター／標的比に対してプロットしである。標的細胞 はジャーカットＡ２（中心に点のある白ぬきの正方形）およびジャーカットＡ２ 　ＧＡＧ　（Ａ）　（黒いひし形）である。ＩＩＣにおいては、反応細胞はドロ ソフィラ細胞、Ｂ２７ＶＰＲ（ＨＩＶ）　テ刺激したヒトＢ２７　ＰＢＬテある 。標的細胞は３１０　Ｂ２７（中心に点のある白ぬきの正方形）または３１０　 （Ｂ２７）　ＶＰＲ（黒いひし形）である。パーセント溶解を、エフェクター／ 標的比に対してプロットしである。
図１２はトランスフェクトされたドロソフィラ細胞を用いたｉｎ　ｖｉけ〇での 活性化を図解している。反応細胞は、ＨＩＶ　ＰＯＬペプチドでコートしたドロ ソフィラ細胞Ａ２．１で刺激した、ヒトＰＢＬ　ＨＬＡ　Ａ２．１である。
パーセント溶解を、エフェクター／標的比に対してプロットしである。標的細胞 はジャーカットＡ２．１旧Ｖ（中心に点のある白ぬきの正方形）およびジャーカ ットＡ２．Ｉ（黒いひし形）である。
発明の詳細な説明 Ａ、定義 アミノ酸：この文章の中で定義されているすべてのアミノ酸は天然のＬ−型の立 体配置にある。標準的なポリペプチドの命名法（Ｊ。
１１ｉｏ１．　Ｃｈｅｕ＋、、　２４３．３５５７−５９　（１９６９））に従 い、アミノ酸残基の略号は以下の対応表に示した通りとする。
対応表 Ｆ　Ｐｈｅ　Ｌ−フェニルアラニン Ｍ　Ｍｅｔ　Ｌ−メチオニン ＨＨｉｓ　Ｌ−ヒスチジン Ｑ　Ｇｌｎ　Ｉ、−グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸 Ｄ　Ａｓｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　Ｌ−アスパラギン 注目すべきことは、この文章の中ではアミノ酸残基の配列はすべて、式の左から 右＼向がう方向を従来のアミノ末端がらカルボキシル末端へ向かう方向とする式 で表わしであることである。
塩基対（ｂｐ）　：　ＤＮＡ二重らせん中の、アデニン（Ａ）とチミジン（Ｔ） との、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）との定まった組合わせ。
クローン；一つの祖先細胞または分子をもつ多類の同等な細胞または分子をいう 。
相補的塩基：　ＤＮＡまたはＲＮＡが二本鎖構造をとる際に自然に対を作るヌク レオチド。
相補的ヌクレオチド配列：　ＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖分子のヌクレオチド配 列がもう一つの一本鎖に、結果として生じる水素結合によって特異的にハイブリ ダイズするほど十分に、その塩基配列に対して相補的である配列。
保存された：ある、あらかじめ選択した（対照）配列について、もし、その配列 が、選択した配列の正確な相補体に、非ランダムにハイブリダイズするなら、そ の配列は保存される。
下流：発現の進行方向をさらに進んだ配列を定義する。たとえば、ある遺伝子の ペプチドをコードしている部位は、開始コドンより下流にある。
発現：構造遺伝子によってポリペプチドを産生ずるために行なわれる工程。転写 と翻訳とを組合わせたもの。
遺伝子（シストロン）：核酸であってそのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリ ペプチドをコードしているもの。遺伝子はＲＮＡでもＤＮＡでもよい。情報をコ ードしている個々の部分（エキソン）の間に介在する配列（イントロン）の他に 、情報をコードしている領域に先行する、および後に続く領域（リーダーおよび トレーラ−）も含まれる。
ハイブリッド形成二十分に相補的なヌクレオチド配列（核酸の鎖）が対合し、相 補的な塩基対の間の水素結合の確立によって二本鎖またはヘテロ二本鎖を形成す ること。２つの相補的なポリヌクレオチドの間の特異的、すなわちランダムでは ない相互作用であり、拮抗的に阻害することができる。
リガンド：リガンドは、特定の受容体タンパク質との特異的な相互作用によって 結合される構造部分を含んでいる分子に属する。
ヌクレオチド：糖部分（ペントース）、リン酸基、および含窒素複素環式塩基を 含んでいる、ＤＮＡまたはＲＮＡのモノマー単位。塩基はグリコシドの炭素（ペ ントースの１′炭素）を経て糖部分に結合しており、この塩基と糖との化合物が ヌクレオシドである。ヌクレオシドがペントースの３′または５′位にリン酸基 を含んでいる時それをヌクレオチドという。操作によって結合させたヌクレオチ ドの配列をこの文章の中では代表的には「塩基配列Ｊまたは「ヌクレオチド配列 」、およびそれらの文法的に同等なものとよび、この文章の中では式の左から右 へ向かう方向を従来の５′末端から３′末端へ向かう方向とする式で表わしてい る。
オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド：ヌクレオチドの単鎖または二本鎖 のポリマー。この文章の中で使われているように、［オリゴヌクレオチドＪおよ びその文法的に同等であるものは、あらゆる範囲の核酸を含むであろう。オリゴ ヌクレオチドは典型的には、直鎖のリボヌクレオチドを含む核酸分子に属するも のであろう。
正確な大きさは多くの因子に依存するが、本技術分野において周知のように使用 の最終的な条件に依存している。
読み取り枠：タンパク質に翻訳され得る（可能性のある）ヌクレオチド配列で、 通常はＤＮＡ配列。
ポリペプチドおよびペプチド：隣接したα−アミノ基とカルボキシル基との間の ペプチド結合により互いに結合している一連のアミノ酸残基を示すために、この 文章の中で互換性をもって使用されている用語。
受容体：受容体および受容体タンパク質は、他の分子に（又は分子と）特異的に 結合する、生物学的に活性のあるタンパク質を含んでいる分子を示すために、こ の文章の中で用いた用語である。
組換えＤＮＡ　（ｒＤＮＡ）分子：遺伝子のような核酸の配列を、本発明のＤＮ Ａ分子配列に対して操作して結合させることにより産生されるＤＮＡ分子。従っ て組換えＤＮＡ分子は、普通自然にはいっしょに見つかることのない少なくとも ２つのヌクレオチド配列を含んでいる、ハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の 生物学的起源をもたない、すなわち進化的に異なるｒＤＮＡを「非相同」である という。
事実上相同：ある特定の試料としての配列または分子、たとえば突然変異した配 列が、一つまたはそれ以上の置換、欠失、または付加によって対照配列から変化 していても、その正味の効果は、対照と試料との間で、逆に機能するような相違 性を生じる結果には終わらないことを意味する。本発明の目的のためには、９０ パ一セント以上のアミノ酸配列の類似性を有し、同等の生物学的活性を有し、か つ同等の発現の特徴を有するアミノ酸配列を、事実上相同とみなす。
４０パ一セント以上の類似性を有するアミノ酸配列は、事実上類似しているとみ なす。相同性かまたは類似性かを決定する目的のためには、対照となる配列の切 端または内部の欠失は、続いて起こる分子の修飾、たとえば糖鎖形成のように、 無視すべきである。より低い相同性を有し、かつ匹敵する生物活性を有する配列 は、対等とみなす。
トランスフェクション：真核細胞において、加えたＤＮＡの取りこみにより新た な遺伝マーカーを獲得することである。
ベクター：核酸であり、好ましくはＤＮＡ分子であって、細胞内で自律複製がで き、そこに、核酸の一部分、たとえば遺伝子またはポリヌクレオチド（好ましく はＤＮＡ）を効果的に結合させて、結合した部分の複製をもたらすことができる もの。
一つ以上のタンパク質をコードしている核酸（好ましくはＤＮＡ）部分（遺伝子 ）の発現を導くことができるベクターを、この文章の中では「発現ベクターＪと いう。他の種類の重要なベクターは、逆転写酵素を用いて作られたｍＲＮＡ由来 のｃＤＮＡ　（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能にする。
クローニングベクター：外来性ヌクレオチド配列（好ましくはＤＮＡ）をその中 に挿入させてクローン化させることのできるプラスミドまたはウィルス。
発現ベクター：外来性ヌクレオチド配列（好ましくはＤＮＡ）をその中に挿入さ せて発現させることのできるプラスミドまたはウィルス。
Ｂ、詳細な説明 ｌ、ヒトのクラスｌ　ＭＩＩＣ分子 本発明のヒトの７９７１Ｍ００分子は、ＨＬＡ−Ａ、　ＨＬＡ−Ｂ、　Ｈｌ、Ａ −Ｃ，ＨＬＡ−Ｅ、　ＨＬＡ−Ｆ　、および）ｉＬＡ−Ｇを含むグループから選 択し、より好ましくは、ＨＬＡ−Ａ、　ＩＩＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含む グループから選択した。
この分子は可溶性または不溶性のいずれの形状でも使用することができる。可溶 型（ｒ　５ｏｉｌ　）においては、トランスメンブランドメインに先行している 、選択した１（ＬＡ分子をコードしているヌクレオチド配列中に停止コドンが入 るように操作する。
ヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子をコードしているヌクレオチド配列は、たとえばＪ Ｙ、　８Ｍ９２．　ＷＩＮ、　Ｎ０Ｃ１およびＭＧのような形質転換した細胞株 のように、適当な変異体をもっている既知の確立された細胞株から単離すること ができるが、適当なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によっ て、その遺伝子部分からヌクレオチドを合成する方がより実用的である。この方 法を用いて完全な長さのＨＬＡのｃＤＮＡをクローン化することに成功しており 、たとえばＨＬＡ−Ａ２５゜１１ＬＡ−Ａ２．　ＩＩＬＡ−８７，１（ＬＡ−１ ３５７，肛Ａ−Ｂ５１、およびＨＬＡ−Ｂ３７の配列は各々、受託番号Ｍ３２３ ２１．　Ｍ３２３２２．　Ｍ３２３１７．　Ｍ３２３１８．　Ｍ３２３１９、お よびＭ３２３２０により、ジエンバンクデータベースに寄託されている。共通配 列を含めて、既知の、部分的で推定上のＨＬＡのアミノ酸配列およびヌクレオチ ド配列が公表されており（たとえば、Ｚｅｍｍｏｕｒ、　Ｐａｒｈａｍ共著、Ｉ ｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３３．３１０−３２０　（１９９１）参照）、） ＩＬＡの変異体を発現している細胞株も知られており、広く一般に、多くはアメ リカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｒＡＴｃｃＪ　）から入手するこ ともできる。従って、　ＰＣＲを用いてヒトのクラスＩ　ＭＨＣをコードしてい るヌクレオチド配列を合成することが可能であり、次にそれをベクターに効果的 に結合させ、適当な細胞を形質転換させ、そこで発現させることができる。
本発明の、ヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子およびヒトのβ２ミクログロブリンを産 生ずるための特に好ましい方法は、この文章の中に記したＰＣＲ反応産物を作る ためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における、プライマーとしてあらかじめ 選択したオリゴヌクレオチドの使用に依存している。ＭＨＣおよびβ２ミクログ ロブリン遺伝子の調製は、典型的にはプライマーの伸長によって、好ましくはポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＢ）の一つの型におけるプライマーの伸長により成就 される。
もし遺伝子が（ＰＣＲ）増幅により産生されるためのものであれば、情報をコー ドしている核酸のそれぞれの鎖が増幅されるように２つのプライマー、すなわち ＰＣＲプライマーのペアーを用いなければならない。（簡単のために、典型的な ）ＩＬＡの変異体の配列が論議されるだろうが、記載されているＰＣＲ増幅法は 、現在完全な配列が知られていないものを含めて、β２ミクログロブリンおよび すべての）ＩＬＡ変異体の合成に対して同様に適用することができる。第一のプ ライマーはナンセンス（マイナスまたは相補的な）鎖の一部となり、ＨＬＡ（プ ラスまたは情報をコードしている）鎖の中に保存されているヌクレオチド配列に ハイブリダイズする。情報をコードしているＤＮＡの同族体を作るためには、従 って第一のプライマーは、Ｍｌ（Ｃ遺伝子内の保存されている領域、好ましくは 各ＨＬＡグループ内の共通配列部分又は同様に保存されている領域、すなわちＨ ＬＡ−Ａ、　ＨＬＡ−Ｂ、　ＩＩＬＡ−Ｃ１および冬型性の低いグループである ＨＬＡ−Ｅ、　ＨＬＡ−Ｆ、およびＨＬＡ−Ｇ内の保存領域にハイブリダイズす る（すなわち相補的となる）よう選択する。第二のプライマーは情報をコードし ている（プラス）鎖の一部となり、マイナス鎖に保存されているヌクレオチド鎖 とハイブリダイズする。ＨＬＡをコードしているＤＮＡの同族体を作るためには 、第二のプライマーは従って、リーダー領域または最初の枠組み領域をコードし ている範囲内にあるような、ＨＬＡをコードしている遺伝子の５′末端にある、 保存されているヌクレオチド配列とハイブリダイズするように選択する。注目す べきことは、情報をコードしているＤＮＡ同族体の増幅においては、第二のプラ イマーの保存された５′のヌクレオチド配列が、Ｌｏｈらによって記載されてい るように（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３．２１７−２２０　（１９８９））、ターミ ナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて、外から加えた配列に 対して相補的になり得ることである。第一プライマーと第ニプライマーの片方ま たは両方は、制限酵素認識部位を限定するヌクレオチド配列を含むことができる 。その部位は増幅された免疫グロブリン遺伝子に対して非相同であることが可能 であり、典型的にはプライマーの５′末端またはその付近にある。
ＰＣＲプライマーベアーの第一プライマーは、情報をコードしているかまたは意 味のある核酸の鎖にハイブリダイズするという理由から、この文章の中ではしば しば「センスプライマー」とよぶ。さらにＰＣＲプライマーペアーの第ニプライ マーは、情報をコードしていないかまたはアンチセンスである核酸の鎖、すなわ ち情報をコードしている鎖に相補的な鎖とハイブリダイズするという理由から、 この文章の中ではしばしば「アンチセンプライマー」とよぶ。多数の第一プライ マーおよび（または）多数の第ニプライマーは、たとえば一つの種類の第一ブラ イマ・−が多数の異なる第ニプライマーと対合して多数の異なるプライマーベア ーが形成されるように、各々の増幅ごとに利用することができる。そのかわりと して、第一および第ニプライマーの個々のペアーを用いることもできる。いずれ にせよ、第一および第ニプライマーの、同じかまたは異なる組合わせを用いた増 幅による増幅産物は、遺伝子ライブラリーの多様性の増加に結びつく。
制限部位を限定する部分が存在する場合には、それは典型的にはプライマーの５ ′末端にある、非ブライミング部位に局在している。
第一プライマーに限定される制限部位は、典型的には第ニプライマーに限定され る制限部位を認識しない制限酵素によって認識される部位であるが、その目的は 互いに非相補的な付着末端を有し、ベクター内への方向性のある挿入ができるＤ ＮＡ分子の産生を可能にすることである。
一つの態様において、本発明はプライマーの３′末端に局在するブライミング領 域を有するプライマーを形成する、ポリヌクレオチドのセットを利用している。
ブライミング領域は、典型的には最も３′よりの（３′末端）１５から３０ヌク レオチド塩基である。各プライマーの３′末端のブライミング部位は、核酸の合 成を触媒するプライマーとして作用すること、すなわち３′末端からプライマー 伸長反応を開始することができる。プライマーの片方または両方は５′末端（最 も５′より）の非ブライミング部位、すなわち鋳型ＨＬＡとハイブリダイズしな い領域を、付加的に含むことができる。
ＰＣＨにおいては、各プライマーは第ニプライマーと組合って作用し、標的とな る核酸の配列を増幅する。ＰＣＲに用いるＰＣＲプライマーの選択は、この文章 の中でヒトのクラスＩ　Ｍ）ＩＣ分子およびβ２ミクログロブリンの産生に関し て論議したような考慮により決定する。
すなわちプライマーは、選択した遺伝子に保存されている配列に相補的なヌクレ オチド配列を有する。有用なブライミング配列を以下に開示する。
ＨＬＡ遺伝子のクローニングに用いる戦術は、本技術分野において周知のように 、種々のＨＬＡ遺伝子を構成している核酸のタイプ、複雑さ、および純度に依存 するであろう。他の因子は、遺伝子が増幅および（または）突然変異するための ものであるかどうかを含む。
一般にＨＬＡ遺伝子は、ｍＲＮＡおよび（または）ゲノムＤＮＡのセンスストラ ンドのように、ポリペプチドをコードしている鎖に含まれる。
もしＨＬＡが二重鎖のゲノムＤＮＡの形をとっていれば、通常ではまず融解によ り変性して単鎖とする。ＨＬＡ鎖はその配列を、ベアーの各々の構成員があらか じめ選択したヌクレオチド配列を有しているＰＣＲプライマーベアーで処理（接 触）することによりＰＣＲ反応を受ける。
ＰＣＲプライマーベアーは、）ＩＬＡ配列内に保持されている、好ましくは少な くとも約１０ヌクレオチドの長さの、さらに好ましくは少なくとも約２０ヌクレ オチドの長さのヌクレオチド配列にハイブリダイズすることにより、プライマー 伸長反応を開始することができる。
ＰＣＲ反応は、ＰＣＲ緩衝液中で、ＰＣＲプライマーペアー、好ましくはあらか じめ決められた量のＰＣＲプライマーペアーを、ＨＬＡ遺伝子の核酸、好ましく はあらかじめ決められた量のＨＬＡ遺伝子の核酸と混合し、ＰＣＲ反応混合物を 作ることにより行う。反応混合物を、ポリヌクレオチドを合成する条件の下に、 あらかじめ代表的に決めた、ＰＣＲ反応産物の形成に十分な時間をかけて維持し 、それにより多数の異なるＨＬＡをコードししているＤＮＡ同族体を産生ずる。
もう一つの戦術においては、その目的はゲノムニ重鎖ＤＮＡのアンチセンス鎖、 またはｍＲＮＡが逆転写酵素反応を受けることによって産生ずるポリヌクレオチ ドのような、）ＩＬＡのポリヌクレオチド相補体を供することにより、ＨＬＡ変 異体から、ＨＬＡ変異体をコードしている遺伝子をクローン化することである。
そのような相補体を産生ずるための方法は、本技術分野において周知である。
ＰＣＲ反応は、いかなる適切な方法を用いても行うことができる。
一般には、それは緩衝水溶液、すなわちＰＣＲ緩衝液中において、好ましくはｐ Ｈ７〜９において、最も好ましくは約８において行う。好ましくはモル過剰（ゲ ノム核酸では一般にプライマー二鋳型は１０６：１）のプライマーを、鋳型鎖を 含んでいる緩衝液に混ぜ合わせる。
この方法の効率を高めるため、大きなモル過剰が好ましい。
ＰＣＲ緩衝液は好ましくはまたデオキシリボヌクレオチド三リン酸であるｄＡＴ Ｐ、　ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰと、典型的には耐熱性のポリメラ ーゼを、すべてプライマー伸長（ポリヌクレオチド合成）反応に適した量で含ん でいる。結果として得られる溶液（ＰＣＲ混合物）を約９０℃〜１００℃で、約 １〜ＩＯ分間、好ましくは１〜４分間加熱する。
この加熱期間の後、溶液を冷却してブライマーハイブリダイゼーションに好まし い温度である５４℃にする。合成反応は室温から、それ以上ではポリメラーゼ（ 誘導剤）がもはや十分に機能しない温度になるまで行うことができる。従って、 たとえばもし誘導剤としてＤＮＡポリメラーゼを用いるとすると、温度は一般に 約４０℃より高くはない。代表的なＰＣＲ緩衝液は以下のものを含む：　５０＋ ｎＭ　ＫＣＩ、　１０＋ｏＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８，３，１，５ｍＭ　Ｍ ｇＣＩｔ、　０．００１％（ｗＬ／ｖｏｌ）ゼラチン、　２００ｕＭｄＡＴＰ、 ２００μＭ　ｄＴＴＰ、　２００μＭ　ｄＣＴＰ、　２００μＭ　ｄＧＴＰ　、 および緩衝液１００μｌに対し２．５単位のサーマス・アクアティクス（Ｔｈｅ ｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）　ＤＮＡポリメラーゼＩ（米国特許Ｎｏ、　４． ８８９．８１８）。
誘導剤は、酵素を含めて、プライマー伸長産物の合成を成就すべく機能するいか なる化合物または系でもよい。この目的に適した酵素はたとえば、大腸菌ＤＮＡ ポリメラーゼ１１大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレグノウフラグメント、Ｔ４ ．　ＤＮＡポリメラーゼ、他の利用可能なりＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、お よび熱安定性酵素を含めて、適切な方法でのヌクレオチドの組合せを促進させて 、各々の核酸鎖に相補的な、プライマー伸長産物を形成することのできる他の酵 素を含む。一般的に、合成は各々のプライマーの３′末端で始まり、鋳型績に沿 って５′方向に、合成が終結するまで進み、異なる長さの分子を産生ずる。しか しながら上記の方法と同じ方法を用いて、５′末端から合成を開始し、上流方向 へ進ませる誘導剤もあり得る。
誘導剤は、酵素を含めて、ＲＮＡプライマー伸長産物の合成を成就すべく機能す る化合物または系でもよい。好ましい態様においては、誘導剤はＴ７　ＲＮＡポ リメラーゼ、Ｔ３　ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼの ようなりＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを含んでいる。これらのポリメラーゼは相 補的なＲＮＡポリヌクレオチドを産生ずる。
ＲＮＡポリメラーゼの高い代謝回転速度は、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎらによって記 載されているように、出発物質であるポリヌクレオチドを増幅させる（酵素（Ｔ ｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ）、Ｐ、　Ｂｏｙｅｒ編、Ｐ、　８７−１０８、アカデミ ツク・プレス、ニューヨーク　（１９８２））。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼのも う一つの利点は、ｃＤＮＡの一部を、一つあるいはそれ以上の変異原性オリゴデ オキシヌクレオチド（ポリヌクレオチド）で置き換え、この部分的にミス対合し た鋳型をＪｏｙｃｅら（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ、Ｒｅｓ、　１７．７１１−７１２　 （１９８９））によって記載されているように、直接転写することにより、ポリ ヌクレオチド合成に突然変異を導入することができることである。転写に基づく 増幅システムは、Ｇｉｎｇｅｒａｓらにより記載されている（ＰＣＲプロトコル ・方法および応用への入門書（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ、　Ａ　Ｇｕｉｄｅｔ ｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、ｐ２４５−２５２ 、アカデミツクブレス社。
サンディエゴ、カリフォルニア、　（１９９０））。
もし誘導剤がＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼであって、リボヌクレオチド三リン 酸を取りこむならば、プライマー伸長反応混合物には十分な量のＡＴＰ、　ＣＴ Ｐ、　ＧＴＰ、およびｕＴＰを加え、結果として生じる反応液を上述のように処 理する。
新たに合成された鎖、およびその相補的核酸鎖は、二重鎖分子を形成し、それを 、この工程の次に続く段階で使用することができる。
ＨＬＡ系の一つの遺伝子または、多数の異なる遺伝子についての）ＩＬＡ変異体 をコードしているＤＮＡ同族体の産生の後は、ＤＮＡ分子は典型的にさらに増幅 している。ＤＮＡ分子は、自律的に複製するベクターへのとり込みのような古典 的技法によって増殖させることができるが、ベクターへの挿入に先立ち、まずポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって増幅させる方が好まれる。Ｐ ＣＲは典型的にはサーモサイクリングにより、すなわち、ＰＣＲ反応混合物の温 度を、約１．０℃〜約４０℃を下限とし、上限を約り０℃〜約１００℃とする温 度範囲の間で、くり返し上げ下げすることにより行う。温度の上げ下げは連続的 であってもよいが、好ましくは、ポリペプチド合成、変性、およびハイブリダイ ゼーションに有利な各々の温度において、相補的な温度安定性のある区切りをも った段階的なものである。
ＰＣＲ増幅法は米国特許Ｎｏ、　４．６８３．１９２．４．６８３．２０２．４ ．８００．１５９、および４．９６５．１８８ならびに、ｒ　ＰＣＲテクノロジ ー・　ＤＮＡ増幅の原理と応用Ｊ　（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　：　Ｐｒｔ ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡＡｍｐｌ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、１１．Ｅｒｌｉｃｈ編、ストックトン出版、ニューヨー ク（１，９８９）、およびｒ　ＰＣＲプロトコル、方法および応用への入門書」 （ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ　：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａ ｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　Ｉｎｎ１ｓ共著、アカデミツクプレス、サ ンディエゴ、カリフォルニア、（１９９０）を含めて、少なくともいくつのテキ ストに記載されている。この文章の中で用いた、種々の好ましい方法およびプラ イマーを以下に記載しているが、たとえばＮｉ１ｓｏｎら、Ｃｅ１１５８．７０ ７　（１９８９）、　Ｅｎｎｉｓら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７．２８３３−７　 （１９９０）、およびＺｅ＋ｎ＋ｎｏｕｒら、１ｕｏｎｔ＋ｎｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓ３３、３１０−２０　（１９９１）にも記載されている。特にプライマーの設 計は、保存配列の選択と共に、ＨＬＡ対立遺伝子（たとえば−Ａ、　−Ｂ。
−Ｃ，−Ｅ、−Ｆ、または−Ｇ対立遺伝子）の５′および３′の非翻訳領域の比 較から設計することが好ましい。５′および３′プライマーに制限部位を取り込 ませて、増殖産物を配列決定ベクターまたは発現ベクターにサブクローンするこ ともできる。４塩基のスペーサー配列を制限部位の近くに置いて、増幅産物の酵 素による切断の効率を高めることも役に立つ。
以下のプライマーは、好ましくは別々の反応における、ＨＬＡ−Ａ。
−Ｂ、−Ｃ，−Ｅ、　−Ｆ、および−Ｇ　ｃＤＮＡの増幅に好ましい。結果とし て得られるｃＤＮＡは、この文章の中に記載したように、クローン化して配列を 決定することができる。これらのプライマーは、すべての既知の、および現在は 未知の、すべてのタイプのＨＬＡの増幅への使用に適している。
ＨＬＡ　Ａ ５′プライマー：　５’　ＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＣＣＧＴＣＡＴＧ　ＧＣＧ　Ｃ ＣＣ３’（配列番号１） ３′プライマー：　５’　ＧＧ　ＴＣＡ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＧＣＴＣＴ 　ＧＡＧ　３’（配列番号２） １＋ＬＡ　Ｂ ５′プライマー：　５’　ＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣＡＴＧ　ＧＣＧ　 ＣＣＣ３’（配列番号３） ３′プライマー＋　５’　ＧＧ　ＡＣＴ　ＣＧＡ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　Ｃ ＡＣＡＴＣ３’（配列番号４） ＨＬＡ　Ｃ ５′プライマー：　５’　ＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＣＧＧ　ＧＴＣＡＴＧ　ＧＣＧ　 ＣＣＣ３’（配列番号５） ３′プライマー：　５’　ＧＧ　ＴＣＡ　ＧＧＣＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＧＣＧＡＴ 　ＧＡＧ　３’（配列番号６） ＨＬＡ　Ｅ ５′プライマー：　５’　ＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＧＡＴ　ＧＣＣ ＣＴＣＣ３’（配列番号７） ３′プライマー：　５’　ＧＧ　ＴＴＡ　ＣＡＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＡＧＡ　Ｃ ＴＣＡＧＡ　３’（配列番号８） ＨＬＡ　Ｆ ５′プライマー：　５’　ＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＣＧ　ＣＣＣＣＧＡ　ＡＧＣＣ ＴＣ３’（配列番号９） ３′プライマー：　５’　ＧＧ　ＴＣＡ　ＣＡＣＴＴＴ　ＡＴＴ　ＡＧＣＴＧＴ 　ＧＡＧ　Ａ　３’（配列番号１０） ＨＬＡ　Ｇ ５′プライマー＋　５’　ＣＣＡＣＣＡＴＧ　ＧＣＧ　ＣＣＣＣＧＡ　ＡＣＣＣ ＴＣ３’（配列番号］１） ３′プライマー：　５’　ＧＧ　ＴＣＡ　ＣＡＡ　ＴＴＴ　ＡＣＡ　ＡＧＣＣＧ Ａ　ＧＡＧ　３’（配列番号１．２） 好ましい態様においては、第一プライマーと第ニプライマーとのただ一つのペア ーを、増幅反応のたびに使用する。各々が、多数の異なるプライマーベアーを用 いている、多数の異なる増幅から得た増幅反応産物はそこで組合わせる。しかし ながら、本発明はまた、共増幅（２組のプライマーを使用）、および複合増幅（ およそ８゜９、または１０組までのプライマーを使用）を経たＤＮＡ同族体の産 生も意図している。
好ましい態様においては、ＰＣＲ法は、単にヒトのクラスＩをコードしているＤ ＮＡ分子の一種を産生ずるためだけでなく、高度に多量であるＨＬＡ座にみられ るものを模倣することができる突然変異を誘導するため、または、単一の親クロ ーンから多様性を作り出し、それによってクラスＩ　ＭＨＣ分子をコードしてい るＤＮＡの「ライブラリー」に、より大きな異質性をもたらすために使用される 。第一に、ＰＣＲ法自体が、本技術分野において周知の因子の一種のために、固 有の特性として変異原性であるということに注目すべきである。第二に、先に引 用した米国特許Ｎｏ、　４．６８３．１９５に記載されているように、突然変異 を誘導する変形に加えて、他の、突然変異を誘導するＰＣＲの変形も用いること ができる。たとえば、ＰＣＲ反応混合物は、伸長産物に取り込まれるべき一つ以 上のヌクレオチドの量を変えて作ることができる。そのよううな条件下ではＰＣ Ｒ反応の進行は、特定の塩基の不足の結果として、伸長産物内にヌクレオチドの 置換をもたらしめる。同様に、はぼ等しいモル量のヌクレオチドを、サイクルを Ｘ回能率的に回転させる量だけ、最初のＰＣＲ反応混合物に取り込ませることが でき、そこで反応混合物をＸ回より多く、たとえば２Ｘ回だけ回転させる。その かわりとして、反応混合物の中にイノシンのような、通常では増幅されたＨＬＡ 変異体の核酸には見られないヌクレオチド誘導体を取り込ませることにより、Ｐ ＣＲ反応の間に突然変異を誘導することができる。次に続（ｉｎｖｉｖｏでの増 幅の間に、ヌクレオチド誘導体はかわりのヌクレオチドに置き換わり、それによ り点突然変異が誘導される。
ヒトのクラスＩ　ＭＨＣをコードしている発現可能なヌクレオチド鎖をクローン 化するために利用できる好ましい方法は以下の通りである。選択した遺伝子（ま たは複数の遺伝子）を含んでいる細胞は、必要に応じて追加した（たとえば、牛 胎児血清および（または）抗生物質）、適当な培地（たとえばＲＰＭＩ　１６４ ０）中で生長させることができる。選択した培養物から全細胞ＲＮＡを調製し、 次いでｃＤＮＡの最初の鎖を作る。ｃＤＮＡは、たとえば、オリゴ（ｄＴ）およ びトリのミニロブラストシスウィルスの逆転写酵素を用いて合成することができ る。クローン化した産物の単離および回収の助けとして放射線標識物を利用する こともできる。次に産物を、好ましくは抽出し、沈殿させ、この文章の中に示し たように、適当なＰＣＲプライマーペアーを用いてＰＣＲの標的として使用する 。増幅は、有効な方法としキット、たとえばシーンアンプ（Ｇｅｎｅ　Ａｍｐ） キットおよびＤＮＡサーマルサイクラ−（パーキン・エルマー／シーラス）を用 いて行うこともできる。種々のプロトコルが有効であり、一つの増幅プロトコル は３０サイクル回転し、各々のサイクルは９４℃で６０秒、６５℃で６０秒、お よび７２℃で９０秒から成り、さらに７２℃で１０分が続く。もう一つのプロト コルは２０サイクル回転し、９４℃で６０分、６５℃で１秒、さらに７２℃でい ろいろな長さの時間（すなわち出発時には５０秒であり、１サイクルごとに１秒 ずつ増えていく）から成る。さらに７２℃で１０分後に増幅は終了する。
典型的には、次にＰＣＲ産物をサブクローンし、既知の方法で配列を決定する。
たとえば、産物を抽出し、さらに逆抽出しくたとえばフェノール／クロロフォル ムで）、沈殿させ、適当な酵素で、たとえば旧ｎｄｌｎで、適当な時間をかけて 消化する。２本鎖切断した産物を単離し、精製しくたとえば、ガラスピーズで） 、同様に切断したベクターに連結させる。）ｌ！ＨＣ分子の発現のために選択し た細胞株の特徴に基づき、次いで適したベクターを選択する。たとえば、Ｍ）Ｉ Ｃの配列分析のための回収を目的として、大腸菌の中でＭＨＣを発現させること ができる。そのかわりとして、ＣＤ８細胞の活性化を目的として、本発明の形質 転換細胞の中でＭＨＣを発現させることができる。
適したベクターの選択については、本章の他の場所に、さらに詳しく論じである 。
２、ＤＮＡ発現ベクタ一 本発明のベクターは細胞内で自律的に複製することの可能な核酸（好ましくはＤ ＮＡ）分子であり、そこにＤＮＡセグメント、たとえば遺伝子またはポリヌクレ オチドを効果的に結合させて、結合した部分の復製をもたらすようにすることが できる。本発明においては、ベクターの配列に効果的に結合されるためのヌクレ オチドセグメントは、哺乳類のクラスＩ　ＭＨＣ分子の少なくとも一部をコード している。
好ましくは、ＭＨＣ遺伝子の、ペプチドをコードしている配列全体を、ベクター に挿入して発現させるが、しかしＭＨＣの非コード配列のいくつかも同様に含ん でいるベクターを構築することもあり得る。好ましくは、ＭＨＣの非コード配列 は排除する。かわりに、可溶（ｒ　５ＯＩＪ　）型のクラスＩ　ＭＨＣ分子のヌ クレオチド配列を使用することができる。ｒ　５ＯＩＪ型は、α３ドメインの末 端が、またはトランスメンブランドメインの前に「停止」コドンを含む点におい て不溶型と異なる。もう一つの好ましいベクターは、発現のためベクターに効果 的に結合している哺乳類のβ２ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコード しているヌクレオチド配列を含む。クラスＩＭＨＣ分子およびβ２ミクログロブ リンの両方をコードしているヌクレオチド配列を含んでいるベクターを構築する ことも可能である。
好ましいベクターは、方向性のある連結に適したヌクレオチド配列によって、発 現のため効果的に結合している一つ以上の翻訳可能なりＮＡ配列を含むカセット を含んでいる。カセットは好ましくは、翻訳可能なりＮＡ配列が、方向性のある 連結に適したヌクレオチド配列により、直接カセット内に挿入された時に産生さ れるペプチドまたはタンパク質を発現するための、ＤＮＡ発現調節配列を含んで いる。
カセットはまた、好ましくは翻訳可能なりＮＡ配列から上流にプロモーター配列 を含み、さらに哺乳類のＭＨＣ配列より下流に、ポリアデニル化配列を含んでい る。カセットは選択マーカーを含むこともできるが、しかしそのようなマーカー は、別の発現ベクターの配列に効果的に結合しているヌクレオチド配列にコード する方が好ましい。
発現ベクターは、適合する宿主内において、哺乳類のクラスＩ　ＭＨＣポリペプ チド、又はβ２ミクログロブリン、またはその両方のような構造遺伝子の産物を 発現することができるという特徴を有する。
特に、この文章の中で開示した発現ベクターは、ヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子お よび（または）ヒトβ２ミクログロブリンを発現することができる。
この文章の中で用いているように、「ベクター」という用語は、異なる遺伝環境 の間で、すでに効果的に結合されている他の核酸を輸送することのできる核酸分 子に属する。好ましいベクターは、自律的複製が可能であって、ベクターに効果 的に結合している核酸（ＤＮＡ）セグメントに存在している構造遺伝子産物の発 現が可能である。
ＤＮＡ配列又はセグメントについてこの文章の中で用いているように、「効果的 に結合している」という句は、配列またはセグメントが一片のＤＮＡに、単鎖状 でも二重鎮状ででも、共有結合によって結合していることを意味する。
本発明のカセットが効果的に結合するベクターの選択は、本技術分野において周 知のように、たとえばベクターの複製とタンパク質の発現、および形質転換され るべき宿主細胞のような、希望する機能特性に直接的に依存しており、これらの ことが組換えＤＮＡを構築するという本技術分野における固有の限界となってい る。
種々の態様においては、ＭＩＩＣ変異体および抗原ペプチドを含めて、本発明に おいて有用なポリペプチドを産生ずるためにベクターを利用している。そのよう なベクターは、好ましくは、有用な量のタンパク質またはポリペプチドの産生に 適した「宿主」細菌細胞と共に利用される。そのようなベクターは、原核細胞の レプリコン、すなわち、それによって形質転換した宿主細菌細胞のような原核生 物の宿主細胞内において、組換えＤＮＡ分子の染色体外における自律的複製およ び維持を指示する能力を有するヌクレオチド配列を含むことができる。そのよう なレプリコンは、本技術分野において周知である。さらに、原核生物のレプリコ ンを含むそれらの態様はまた、その発現が、それによって形質転換する宿主細菌 細胞に対して薬剤耐性のような選択的利益を与える遺伝子も含むことができる。
細菌の典型的な薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対す る耐性を与える遺伝子である。ベクターはまた典型的には、翻訳可能なヌクレオ チド配列の挿入に便利な制限部位を含む。典型的なベクターは、バイオラッド・ ラボラドリース（カリフォルニア州、リッチモンド）から入手されるプラスミド ｐｕｃａ、　ｐＵＣ９，ｐＵｃ１８゜ｐＢＲ３２２、およびｐＢＲ３２９、ファ ルマシアにュージャージー州、ビス力夕ウエイ）から入手されるｐＰＬおよびｐ ＫＫ２２３、およびｐＢｓとＭ１３＋ｎｐ１９（ストラタジーン、カリフォルニ ア州、ラジョラ）を含む。
他の典型的なベクターはｐＣＭυ（Ｎｉｌｓｏｎら、Ｃｅ１ｌ、　５８．７０７ 　（１９８９））を含む。他の適切なベクターも既知の方法により合成すること ができ、たとえばこの文章の中で種々の適用に用いたベクターであるｐＣＭＵ／ 　Ｋ　ｂおよびｐｃＭＵ　Ｉ　１は、ｐｃＭＵＩＶ　（Ｎｉｌｓｏｎら、上記） の変形である。
方向性のある連結のために採用したヌクレオチド配列、すなわちポリリンカーは 、発現ベクターの領域であり、（１）複製およびヌクレオチド配列の上流および 下流への輸送のために効果的に結合しており、（２）あるヌクレオチド配列の、 ベクターへの方向性のある連結のための場所または手段を供する。典型的には、 方向性ポリリンカーは二つ以上の制限酵素認識配列または制限部位を限定するヌ クレオチド配列である。制限切断時には、二つの部位は、翻訳可能なヌクレオチ ド配列が発現ベクターに結合できる、付着末端を生じる。
好ましくは、それら二つの制限部位は、制限切断に際し、非相補的であり、翻訳 可能なヌクレオチド配列の、カセットへの方向性のある挿入がそれによって可能 になる付着末端を供する。ある態様においては、方向性のある連結法は、上流の ヌクレオチド配列か下流のヌクレオチド配列、またはその両方に存在するヌクレ オチドにより供される。もう一つの態様においては、方向性のある連結に適応し たヌクレオチド配列は、多数の方向性のあるクローニング法を限定するヌクレオ チド配列を含む。方向性のある連結に適したヌクレオチド配列が、多数の制限部 位を限定しているところを、多クローニング部位とよぶ。
翻訳可能なヌクレオチド配列は、直線的に連続したヌクレオチドであり、一つの 読みとり枠内に一つのポリペプチドをコードしている、中断のない連続した少な くとも８コドンを備えたものである。
好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。さらに好ましくは、翻訳可 能なヌクレオチド鎖の上流に、プロモーター配列がある。
好ましくは、プロモーターは条件プロモーター（たとえば、誘導可能な）である 。この文章の中で用いられる好ましい条件プロモーターは、メタロチオネインプ ロモーターまたは、熱シヨツクプロモーターである。
ベクターは、いかなる周知のベクター構築技術を利用しても構築することができ る。しかしながらこれらの技術は、宿主細胞のゲノムに挿入されるべき翻訳可能 なヌクレオチド配列が、その上流を適当なプロモーターと接しておりさらに、本 発明のいくつかの変形においては、翻訳可能なヌクレオチド配列はその下流をポ リアデニル化部位に接しているという程度には変形しである。このことは、「宿 主」細胞が昆虫細胞であり、ヌクレオチド配列がトランスフェクションにより伝 達される場合には特に好ましい。トランスフェクションは、カルシウムリン酸法 、ＤＥＡＥデキストラン法、安定伝達法、電気穿孔法、またはリポソーム仲介法 を含む多くの方法により行うことができる。周知のトランスフェクション法、お よび、細胞内にヌクレオチドを導入するための他の方法を述べている多くのテキ ストを利用することができる（「分子生物学における現在のプロトコルＪ　（Ｃ ｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ ｙ）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ。
５ｏｎｓ、−ニーヨーク　（１９９１）などを参照）。
ベクター自体は、ウィルスベクター（ＲＮＡまたはＤＮＡ）、むきだしの直鎖ま たは環状ＤＮＡ、核酸物質と、細胞内に挿入されるべき何らかのポリペプチドと を含んでいる小胞またはエンベロープのような、いかなる適したタイプのもので もよい。小胞については、リポソームのような脂質小胞を構築するための技術が 周知である。そのようなリポソームは、リポソームの外面に、抗体または他の特 異的に結合する分子を供給するような、他の従来通りの技術を用いて、特定の細 胞を標的とすることができる。Ａ、　Ｈｕａｎｇら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 　２５５゜８０１５−８０１８　（１９８０）などを参照のこと。
最も有用なベクターは、［宿主ｊ細胞、すなわち形質転換されるべき細胞の性質 により、次にあげるもののうち１つ以上を含めた複数の要素をもつ＝　（１）高 いコピー数への増幅のための、ＳＶ４０の複製起点、（２）高レベルの転写開始 のための効果的なプロモーター要素、（３）ｍＲＮＡ切断およびポリアデニル化 配列のような、ｍＲＮＡをプロセシングするシグナル（さらに、しばしば介在配 も同様）、（４）「外来Ｊ　ＤＮＡの挿入のための、複数の制限酵素部位を含ん でいるポリリンカー、（５）プラスミドＤＮＡを安定に取りこんだ細胞の選択に 用いることのできる選択マーカー、（６）細菌細胞における増殖を可能にする、 プラスミド複製調節配列。上記のものに加えて、多くのベクターも、外部刺激に より調節されている誘導可能な発現システムを含んでいる。誘導された転写に必 要な、多数のプロモーターからの配列が同定され、誘導可能な発現を得るための 発現ベクター内に操作により挿入されている。いくつかの有用なベクターは、β −インターフェロン、熱ショック、重金属イオン、およびステロイド（たとえば グルココルチコイド）による誘導に基づくものである。（Ｋａｕｆ＋ｎａｎ、　 Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１８５．４８７−５１１　（１９９０）などを参 照。） 好ましい態様においては、ベクターはまた選択マーカーを含んでいる。発現の後 、翻訳可能なヌクレオチド配列の産物は、次にその配列に対する抗体を用いて精 製することができる。選択マーカーの一例は、ネオマイシン耐性である。ｐｈｓ ｈｓｎｅｏ、　ｐｈｓｎｅｏ、又はｐｃｏｐｎｅ。
のような、ネオマイシン耐性をコードしているプラスミドは、トランスフェクト したものを選択培地中で増殖させることにより、選択した遺伝子（または複数の 遺伝子）を発現している細胞集団を確かめることができるように、各々のトラン スフェクションに含ませていくことが可能である。
好ましい態様においては、翻訳可能なヌクレオチド配列は、調節可能な適当な転 写プロモーター、翻訳調節配列、および翻訳可能なヌクレオチド配列の、正しい 方向への挿入を平易にするためのポリリンカーと共にプラスミド中に取り込ませ ることができ、ドロソフィラのような真核細胞、または大腸菌のような原核細胞 の中で、従来通りの技法を用いて発現させることができる。好ましくは、転写開 始のためのプロモーターを限定する５′の調節配列、転写可能なりＮＡ配列の上 流の５′末端に効果的に結合している、リポソーム結合部位がある。たとえば大 腸菌などのような、形質転換した、またはトランスフェクトした細胞において、 高いレベルの遺伝子発現を行うためには、大量のｍＲＮＡを生じる強力なプロモ ーターだけでなく、ｍＲＮＡの効率のよい翻訳を確実にするための、リポソーム 結合部位も用いることが必要である。たとえば大腸菌においては、リポソーム結 合部位は開始コドン（ＡＶＧ）　、および開始コドンの３〜１１ヌクレオチド上 流に局在する３〜９ヌクレオチドの長さの配列を含む（Ｓｈｉｎｅら、Ｎａｔｕ ｒｅ、　２５４．３４　（１９７５））　ｏシャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列 と呼ばれる、ＡＧＧＡＧＧＵ配列は、大腸菌の１６８ｔｎＲＮＡの３′末端に相 補的である。リポソームの、ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡの３′末端の配列への結合 は、（１）ＳＤ配列と１６ｓｔＲＮＡの３′末端との間の相補性の度合い、およ び（２）ＳＤ配列とＡＵＧとの間におかれている間隔およびおそらくはＤＮＡ配 列、を含んでいるいくつかの因子により影響をうけることが可能である。（Ｒｏ ｂｅｒｔら、ＰＮＡＳ　７６、７６０　（１９７９ａ）、　Ｒｏｂｅｒｓら、Ｐ ＮＡＳ　７６、　５５９６　（１９７９ｂ）　、Ｇｕａｒｅｎｔｅら、５ｃｉｅ ｎｃｅ、２０９．　１４２８（１９８０）。
およびＧｕａｒｅｎｔｅら、Ｃｅ１ｌ、　２０．５４３　（１９８０）などを参 照のこと。）この間隔を系統だてて変えたプラスミドにおける、遺伝子発現のレ ベルを測定することにより、一般的には最適化を行うことができる。
異なる＋ｎＲＮＡの比較は、統計学的に、−２０から＋１３の位置（ＡＵＧのＡ を０位とする、Ｇｏｌｄら、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３５．３ ６５　（１９１８）参照）に、好ましい配列があることを示した。リーダー配列 も、翻訳に対して劇的な影響をもつことが示されてきた（Ｒｏｂｅｒｔｓら、１ ９７９、上記）。
リポソームの結合も、リポソームの結合に影響を与えるＡＵＧに続く、ヌクレオ チド配列によって影響を受けることがある（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、　１１８．５３３　（１９７８）参照）。
本発明に従って用いることのできるベクターは、熱シヨツクプロモーターを含ん でいる。このようなプロモーターは、本技術分野において周知である（Ｓｔｅｌ ｌａｒら、ＥＭＢＯＪ、　４．１６７−１７１　（１９８５）参照）。
もしこのプロモーターを使うのであれば、ポリアデニル化部位を加えることも好 ましい。
本発明に従って用いるための好ましいベクターは、プラスミドであり、さらに好 ましくは、コピー数の高いプラスミドである。ベクターが誘導可能なプロモータ ー配列を含んでいることもまた好ましいが、それは、そのようなベクター（しば しば生来のものではない、またはキメラ状のヌクレオチド鎖を運ぶように構築さ れている）が導入される細胞に対して、選択圧を制限する傾向があるからである 。
選択したベクターが、選択した宿主における発現に最も適していることも好まし い。もし宿主細胞集団がドロソフィラ細胞の培養物であれば、適合するベクター は、ｐ２５−１ａｃＺ　（Ｂｅｌｌｏ、　Ｃｏｕｂｌｅ共著Ｎａｔｕｒｅ　３４ ６．４８０　（１９９０）参照）、またはｐＲｍＨａ　−１、−２、又は−３（ Ｂｕｎｃｈら、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１６．１０４３−１０６１　（ １９８８）参照）のようなベクターと機能的に等しいベクターを含む。好ましい 態様においては、ベクターはｐＲｍＨａ　−３であり、図１に示した。このベク ターは、好ましくはＭＨＣ配列が挿入されている部位の上流にある、メタロチオ ネインプロモーターを含み、ポリアデニル化部位は、好ましくは前記ＭＨＣ配列 の下流にある。ドロソフィラ細胞は、本発明によれば好ましい宿主であり、特に シュナイダー２細胞のようなドロソフィラ細胞は、プロモーターの活性化に必要 とされる、必須なトランス作用因子を有し、従ってさらになお好ましい。
発現ベクターｐＲｍＨａ　−３は、細菌のプラスミドｐＲｍＨａ−１に基づくも のであり、後者はプラスミドｐＵｃ１８に基づくものであり、アメリカン・タイ プ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，ロックビル。
メリーランド州）に、受託番号３７２５３を以って寄託されている。
ｐＲｍＨａ　−３ベクターは、プロモーターである、メタロチオネイン遺伝子（ 配列１〜４２１．　ＳＥＱ　１０　ＮＯ１３）の、Ｒ１およびＳｔｕ部位を除去 した、翻訳されない５′リーダー配列を含んでいる（図ＩＣ参照）。
それはまた、ポリアデニル化部位を含んでいるドロソフィラのＡＤＨ遺伝子（配 列６４３５〜７２７０．　ＳＥＱ　１０　ＮＯ１４）の３′部分も含んでいる。
従って、クローン化されたＤＮＡは、メタロチオネインプロモーターにより転写 の制御を受け、さらにポリアデニル化されるであろう。
プラスミドｐＲｗ＋）Ｉａ　−１の構築は、Ｂｕｎｃｈらにより記載されている （Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１６．１０４３−１０６１　（１９８８）） 　、プラスミドｐＲｍＨａ−３およびｐＲｍＨａ　−２の構築（後者はＥｃｏＲ Ｉフラグメントとして除去することのできる、メタロチオネインプロモーター配 列を有する）を、図ＩＡ、Ｂ、およびＣに示した。本発明に従って使用するため の好ましいプラスミドであるｐＲｍＨａ　−３に関しては、ＰｓｔＩ、５ｐｈｌ 、および）ＩｉｎｄＩ［［がプロモーターフラグメント内にあり、従って単一で はない。ＸｂａはＡＤＨフラグメント（３′末端から４塩基）にあり、単一では ない。しかし、次の制限部位は、ｐＲｍＨａ　−３においては単一である：Ｅｃ ｏＲ１，５ａｃＩ、Ｋｐｎｌ、ＳｍａＩ、　Ｂａｍ１ｌＩ、５ａｌＩ。
Ｈｉｎｃ２　、およびＡｃｃＩ。
本発明のＤＮＡ発現ベクターにおけるカセットは、翻訳可能なりＮＡ配列の挿入 に際し、適当な宿主において本発明の融合タンパク質を発現することのできるヌ クレオチド配列を形成している、ベクターの領域である。発現に適したヌクレオ チド配列をシストロンと呼ぶ。
従って、カセットは、好ましくは一つ以上の翻訳可能なりＮＡ配列に効果的に結 合している、ＤＮＡ発現調節要素を含んでいる。シストロンは、翻訳可能なりＮ Ａ配列が、調節要素の間に目的に合ったヌクレオチド配列を介し、方向性をもっ て挿入（方向性をもって連結）される時に形成される。結果として得られるＤＮ Ａ配列、すなわち挿入されたＤＮＡは、好ましくは、適当な読み取り枠の中に効 果的に結合している。
ＤＮＡ発現調節配列は、構造遺伝子産物を発現させるための、ＤＮＡ発現シグナ ルのセットを含んでり、周知のように、シストロンが構造遺伝子産物を発現する ことができるように、シストロンに効果的に結合している５′および３′の要素 を含む。
５′調節配列は、転写開始のためのプロモーター、および翻訳可能なりＮＡ配列 の上流の５′末端に効果的に結合した、リポソーム結合部位を定義する。
従って、本発明のＤＮＡ発現ベクターは、転写可能なりＮＡ配列のベクターのカ セット部分にクローニングして、本発明の融合タンパク質の発現が可能なシスト ロンを生じるためのシステムを供する。
３、細胞株 本発明の好ましい細胞系は、培養において連続的に増殖することができ、その細 胞表面上に哺乳類クラスＩ　ＭＨＣ分子を発現することの可能な細胞株である。
細菌、酵母、昆虫、および哺乳類の細胞株を含めて、いかなる種類の形質転換お よび非形質転換細胞または細胞株もこの目的にかなっている。（培養法および、 大腸菌および酵母菌などのような各種細胞株の使用法についての要約および方法 については、「分子生物学における今日のプロトコルＪ　（Ｃｕｒｒｅｎｔｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｒ＋　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌｅｙ、　５ｏｎｓ、　＝ニーヨーク、を参照のこと。） 好ましくは、細胞株は真核細胞の株である。さらに好ましくは、細胞株は変温性 （すなわち哺乳類の細胞株よりも温度変化に対する感受性が低い）であり、より 好ましくは昆虫細胞の株である。ガ（ＡＴＣＣＣＣＬ　８０）、ヨトウＬシ（Ａ ＴＣＣＣＲＬ　１７１１）、力の幼虫（ＡＴＣＣ行ＣＣＬ　１２５．　ＣＣＬ　 １２６．　ＣＲＬ　１６６０．　ＣＲＬ　１５９１．、　ＣＲＬ　６５８５．　 ＣＲＬ　６５８８）およびカイコ（ＡＴＣＣＣＲＬ　８８５１）を含めて、種々 の昆虫の細胞株が、本発明による使用に役立つ。好ましい態様においては、細胞 株はシュナイダー細胞株（Ｊ、ｆｌｎｂｒｙｏｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈ、　２７ ．３５３〜３６５　（１９７２））のようなドロソフィラ細胞株であり、好まし くは細胞株はＭ３培地での増殖に適したシュナイダー２細胞株（Ｓ２／Ｍ３）　 （Ｌｔｎｄｇｕｉｓｔら、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　５ ｅｒｖｉｃｅ　５ｇ、　１６３　（１９８２）参照）である。
ンユナイダー細胞は、本質的には以下のようにして調製することができる。ドロ ソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａ−ｓｔ ｅｒＸオレゴンーＲ）の卵を、およそ４時間ごとに集め、２．５％次亜塩素酸ナ トリウム水溶液中で卵膜を除去し、７０％エタノールに２０分間、さらに０．０ ５％ＨｇＣＩｔを含む７０％エタノールに２０分間浸して表面を殺菌する。滅菌 した蒸留水中で完全にすすいだ後、あらがしめ培養液で湿らせておいた、ミリポ アフィルタ−で裏打ちした滅菌ずみのメトリセル黒色フィルターを含んでいるベ トリ皿に、卵を移した。２２℃のインキュベータ内に卵を一晩静置し、２０〜２ ４時間令の時点で培養に移した。胚を各々二分の−または三分の−に切り、次い で０．２％トリプシン（１：２５０、ディフコ）を含むリナルディニ塩類溶液（ Ｒｉｎａｌｄｉｎｉ、　Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）　１７３．　１１３４〜１１ ３５　（１９５４））中に、室温で、２０〜４５分間静置した。］、００〜３０ ０の胚を用いて各々の培養を開始した。
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えた後、断片を１１００Ｘで２〜３分間遠心し、培 養液１．２５ｍ１に再び浮遊させ、Ｔ−９ガラスフラスコに播種した。培養物は 、周囲の空気を気相として、約２２〜２７℃±０．５℃に維持した。好ましくは 、シュナイダーの培養液（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｊ、ＥＸｐ。
Ｚｏｏｌ、　１５６．９１−１０４　（１９６４）、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、　Ｊ 、Ｅｒｎｂｒｙａｌ、Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐｈ、　１５゜２７１〜２７９　（１９６ ６））に、培養液１００ｍ１あたり５００ｍｇの細菌学用ペプトンおよび不活性 化したＦＢＳを１５％加えたものを用いた。ｐＨ（好ましくは６．７〜６．８） は、０．Ｏ１％フェノール赤を用いて検査した。細胞株は、好ましくは３〜７日 ごとに継代培養して維持した。細胞は容易にガラスに接着するが、トリプシン処 理を必要とする程には強固に接着しておらず、典型的には単なるピペッティング によりほとんどの細胞をフラスコの底から流し出すことができる。細胞の形態学 的な外観は、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ　（Ｊ、Ｅｔ＋ｂｒｙｏ１．Ｅｘｐ、Ｍｏｒｐ ｈ、　２７．３５３〜３６５（１９７２））により記載されている。それらは基 本的には外観上は上皮性であり、直径では５〜１１μｍ１長さでは１１〜３５μ ｍの変動がある。
小さなくぼみのある円形細胞は、他の細胞全体にランダムに分散させることがで きる。
好ましくは、シュナイダー２細胞は、ペニシリン（１００単位／＋ｏｌ）および ストレプトマイシン（１００ａ＋ｇ／ｍｌ）を含めて、１０％のＦＢＳを加えた シュナイダーのドロソフイラ培地中で維持する。細胞は０．５×１０’　／ｍ１ 以上の密度に維持り、２４〜３０℃の温度範囲で増殖させることが好ましい。細 胞は２４時間より早く２倍になる傾向があり、高い細胞濃度、すなわち約２Ｘ１ ０”／＋ｎｌまたはそれより高い濃度になるまで増殖する。細胞は、後で使用ま たは分析するため、９０％ＦＢＳおよびびｌＯ％ＤＭＳＯ中に凍結することがで きる。細胞を一７０℃に置き、次いで液体窒素中に貯蔵することができる。
シュナイダー２細胞と同定される、本発明による好ましい細胞株は、ベダペスト 条約の要求に従い、１９９２年２月１８日、アメリカン・タイプ・カルチャー・ コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、受託番号ＣＲＬ−１０９７４を得た。
好ましい態様においては、細胞は哺乳類クラスＩ　ＭＨＣ遺伝子を発現すること のできる形質転換した細胞株であり、すなわち好ましくは、ヒトのクラスＩ　Ｍ ＨＣ遺伝子は、この細胞株により発現が可能である。細胞系が哺乳類β２ミクロ グロブリンを発現できることも好ましく、さらに好ましくはβ２ミクログロブリ ンはヒトβ２である。
さらになお好ましい細胞株は、安定な、または一時的な発現が可能である。
ベクターは、本発明による細胞株を形質転換またはトランスフェクトするために 用いることができる。細胞株の形質転換またはトランスフェクションに使用でき る多くのベクターが入手でき、これらのベクターについては前文に、さらに詳し く述べられている。しかしながら簡単に言えば、好ましい態様においては、本発 明の細胞は、発現ベクターに各々挿入されている（すなわち効果的に結合してい る）（ヒト）ＭＨＣのＨ鎖およびβ２ミクログロブリンをコードしているｃＤＮ Ａでトランスフェクトしている。さらに好ましい態様においては、ベクターは、 ヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子またはβ２ミクログロブリンをコードしている発現 可能なヌクレオチド配列が、この文章の中に開示した技術を用いて挿入されてい る、ドロソフィラの発現プラスミドｐＲｍ１１ａ−３を含む。好ましくはｌ＋ｌ ＨｃをコードしているｃＤＮＡ、およびβ２ミクログロブリンをコードしている ｃＤＮＡは、別々の発現プラスミドに効果的に結合しており、さらに培養細胞内 へ同時にトランスフェクトする。そのかわりに、ＭＨＣおよびβ２ミクログロブ リンをコードしているｃＤＮＡは同一の発現ベクターに効果的に結合しており、 同じプラスミドによって同時にトランスフェクトする。もう一つの変形において は、ＭＨＣ，β２ミクログロブリン、およびル２のようなサイトカインをコード しているｃＤＮＡは、発現プラスミドに効果的に結合しており、本発明の細胞株 内へ同時にトランスフェクトする。ＨＬＡ遺伝子の選択、適当なベクターの構築 、およびプライマーの選択については前文のＢ・】およびＢ・２章においてさら に詳しく記載した。
形質転換に成功した細胞、すなわち、本発明によって、発現可能なヒトのヌクレ オチド配列を含んでいる細胞は、周知の技法により同定される。たとえば、本発 明のｃＤＮＡおよびｒＤＮＡの導入の結果得られた細胞は、クローン化してモノ クローナルコロニーを産生ずることができる。これらのコロニーから細胞を集め 、溶解し、それらのＤＮＡ含量を、ｒＤＮＡの存在に関して、５ｏｕｔｈｅｒｎ 　（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　９８．５０３（１９７５））により記載されてい るような方法を用いて測定することができる。ｒＤＮＡの存在についての直接的 な分析に加え、ｒＤＮＡが、主題であるキメラ状ポリペプチドの発現を指示する ことができるなら、周知の免疫学的方法により、形質転換またはトランスフェク トの成功を確認することができる。たとえば、ある発現ベクターで形質転換に成 功した細胞は、適当な抗体を用いて容易に測定される特定の抗原性を示すタンパ ク質を産生ずることができる。さらに、形質転換またはトランスフェクションの 成功は、主文に記載したように、ネオマイシン耐性のようなマーカー配列を運ん でいる付加的なベクターを用いて確認することができる。
温度を下げても増殖を続けることのできる培養物もまた好ましい。
たとえば、培養物はおよその室温、たとえば約２４〜２７℃に維持することが好 ましい。他の態様においては、特にＣＤ８細胞の活性化の工程においては、培養 物をより高い温度に維持する。従って、本発明による培養物は、約３０℃から約 ３７℃の温度の挑戦に耐え得ることが好ましい。培養物へのβ２ミクログロブリ ンの添加は、少なくとも３０℃の挑戦に対して安定化させ、β２ミクログロブリ ンおよびペプチドの添加は、より高い温度、すなわち３７℃における、さらに大 きな熱安定性をもたらす。
従って、本発明の細胞株は、以下のことが可能な細胞系、すなわち（１）低温で も予定した期間は増殖を続けること、（２）発現ベクターによる形質転換、（３ ）β２ミクログロブリンの発現、（４）一つ以上の型のクラスＩ　ＭＨＣ分子の 発現、（５）クラス１分子上へのペプチドの充填、および（６）空の、またはペ プチドを充填したクラスＩ　ＭＨＣ分子の、細胞表面上での発現、が可能である ことがさらになお好ましい。
本発明の好ましい態様においては、ドロソフィラ細胞の培養を確立し、（１）ヒ トのクラスＩＭＩＩＣ分子をコードしている一つ以上のヌクレオチド配列および 、（２）ヒトβ２ミクログロブリンをコードしている少なくとも一つのヌクレオ チド配列、に効果的に結合しているベクターでトランスフェクトする。これらの 配列は同一のベクターに、効果的に結合することもできるが、好ましくはβ２ミ クログロブリンのための配列と、ヒトＭＨＣのための配列は、別々のベクター内 にある。選択を目的とするためには、たとえばネオマイシン耐性のような選択マ ーカーを効果的に結合しているベクターで、細胞をトランスフェクトすることも 有利である。その後、ヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子およびβ２ミクログロブリン を発現している細胞を選び出し、培養中に維持する。
空のＭＨＣｌまたはペプチドを充填したＭＨＣの発現のための培養物を用意する ためにはまず、たとえばＣｕ５Ｏｔ誘導のように、あらがじめ決めた時間の誘導 が必要である。適当な培養時間の後、たとえば、およそ１２〜４８時間後、あら カルめ決めた濃度（たとえば約１００μｇ／ｍ１）でペプチドを加える。ペプチ ドは、下文Ｂ・５章において論議したように調製することができる。さらにイン キュベートした後（たとえば、２７℃で約１２時間）の培養物は、ＣＤ８細胞の 活性化に使用する用意ができている。この追加した培養時間は、短縮してもよい し、さもなければ入れてもよいのだが、もしそれが休止期のＣＤ８細胞かまたは ＣＤ８の先駆細胞の添加に先立ってインキュベートするためのものであれば、培 養物は温度の挑戦に対して次第に安定していく傾向があるということが、本発明 者らの観察である。たとえば、本発明による培養物でペプチドを加えてあった培 養物は、たとえ３７℃での培養時間を延長したとしても、有意な量の、ペプチド を充填したクラスＩ　ＭＩＩＣ分子を発現することができる。
形質転換した宿主細胞の培養に有用な栄養培地は、本技術分野において周知であ り、多くの販売元から入手できる。宿主細胞が哺乳類細胞である態様においては 、好ましくは無血清培地を使用する。
４、ヒトβ２ミクログロブリン 治療上実用的な量の、表面に発現されたヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子の産生が可 能な細胞株を確立するためには、本発明の細胞株を、β２ミクログロブリンをコ ードしているヌクレオチド配列に操作しやすいように結合させたベクターと、同 時にトランスフェクトさせて、細胞株の中でヒトのクラスＩ　ＭＩＣ分子の発現 が適切なレベルで達成されるようにすることが好ましい。マウスβ２ミクログロ ブリンのような哺乳類のβ２ミクログロブリンをコードしているヌクレオチド配 列は、本発明の細胞株に発現される、ヒトのクラスＩ　ＭＩＣ分子の安定性を高 めるが、その細胞株を、ヒトβ２ミクログロブリンをコードしている発現可能な ヌクレオチド配列を、操作しやすいように結合したベクターを用いて同時にトラ ンスフェクトすることが好ましい。前文において、Ｂ・２章に論議したように、 本発明による好ましいベクターは、発現のため効果的にベクターに結合している 、哺乳類β２ミクログロブリン分子の少なくとも一部をコードしているヌクレオ チド配列を含む。クラスＩ　ＭＨＣ分子とβ２ミクログロブリンの両方をコード しているヌクレオチド配列を含んでいるベクターを構築することも可能である。
ヒトβ２ミクログロブリンのｃＤＮＡの配列は公表されており（Ｓｕｇｇｓら、 ＰＮＡＳ　７８．６６１３−１７．１９８１参照）、その配列を、以下のプライ マーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に鋳型として使用すること５’　 ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣ ＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣ３’ （配列番号１５） ３′プライマー ５’　ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴ ＡＡＣ３’（配列番号１６） プライマーを、標準的なＰＣＲ反応（前文のＢ・１章、および、そこに引用した 文献を参照）に使用した。反応産物をフェノールで抽出し、シーンクリーン・キ ット　（バイ第１０１．　サンディエゴ、カリフォルニア州）で精製し、Ｂａｍ ｔ（Ｉで消化し、ｐＢＳ（ストラタジーン。
ラジョラ、カリフォルニア州）のＢａｍ８１部位にクローン化する。配列を確認 した後、このＢａｍＨＩフラグメントを適当な発現ベクターのＢａｍＨＩ部位に クローン化する。好ましい態様においては、ヒトβ２ミクログロブリンｃＤＮＡ を合成し、発現ベクターｐＲｍＨａ　−３に操作しやすいように結合する。
４、ペプチド 実質的には、ウィルス抗原に加えて、すべての細胞タンパク質を用いて、クラス Ｉ　ＭＨＣの強力なリガンドとして働く、関連したペプチドフラグメントを生じ ることができる。はとんどの哺乳類細胞においては、従っていかなる特定のＭＨ Ｃペプチド複合体も、細胞表面上に見られるＭＨＣをコードしている分子のごく 一部を表わしているにすぎない。従って、ＣＤ８細胞を特異的に活性化するため の増加した能力をもつ、表面に発現されたヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子を産生ず るためには、適当な大きさと抗原性のあるペプチドフラグメントを単離し、クラ ス１分子の上に充填することが好ましい。
本発明のペプチドはクラスＩ　ＭＨＣ分子に結合する。結合は、１ｎｖｉｔｒｏ と同様にｉｎ　ｖｉｖｏでも作り出すことのできる生物学的条件下に起こる。ペ プチドの結合の厳密な性質は、本発明の実行にとって知る必要はない。
好ましい態様においては、クラスＩ　ＭＨＣ分子分子光填されるべきペプチドは 抗原性がある。ペプチドは均一の大きさで、好ましくはオクタマーまたはノナマ ーがら成り、最も好ましくはオクタマーである。ＭＨＣ分子分子光填するため調 製したペプチドが一種類のものであること、すなわち、ＭＨＣ上に充填されるす べてのペプチドが、大きさおよび配列において同一であることも好ましい。この 方法により、単一抗原性のある、ペプチドを充填したＭＨＣ分子を産生ずること ができる。
ペプチドは種々の手段により細胞に提示することができる。好ましくは、ペプチ ドを、細胞内のペプチドのプールにそれらを取り込ませることのできる方法によ り提示することができる。たとえば、浸透圧的充填によりペプチドを提示するこ とができる。典型的には、ペプチドは培養液に加える。培養物に加えるペプチド はそのままのペプチドまたはタンパク質の形で加えることができるが、その後細 胞内の作用、たとえば酵素的分解により分解される。そのかわりとして、細胞培 養物に加える前に、化学的分解（たとえば臭化シアン分解）またはプロテアーゼ （たとえばキモトリプシン）のような、他の何らかの方法で、そのままのポリペ プチドまたはタンパク質を分解することもできる。他の態様においては、ペプチ ドを、エピトープとなるアミノ酸配列を含んでもよいし含まなくてもよい、より 小さなセグメントとして提示する。
好ましい態様においては、十分な量のタンパク質（または複数のタンパク質）ま たはペプチド（または複数のペプチド）を細胞の培養物に加えて、クラスＩＭＩ ＩＣ分子に結合させ、続いて高濃度のペプチド（好ましくは各々のＭＨＣには同 じ種類のペプチドが結合する）を、本発明のヒトのクラスＩＭＩＩＣを発現して いる細胞の表面上に提示する。細胞内でペプチドをＭＨＣ分子に提示する前に、 ヒトのクラスＩ　ＭＨＣとヒトβ２ミクログロブリンを結合させて、すなわちヘ テロダイマーを形成することも好ましい。
本発明の他の態様においては、本発明の形質転換細胞にペプチドを加えて、細胞 によって発現されているＭＨＣ分子の熱安定性を高めるようにした。上述のよう に、ペプチドは好ましくは培養液に加える。２５２１分子に結合する抗原性ペプ チドは、ＭＨＣ分子の熱安定性を保つために役立ち、また細胞表面での発現を増 加させる。ＭＨＣ分子に結合するペプチドを加えた培養物は、従って、ペプチド を添加しない培養物より、温度の挑戦に対して有意に低い感受性を示した。
本発明の一つの態様においては、抗原ペプチドを、形質転換した、またはトラン スフェクトした細胞株に対し、種々の形で提示する。
たとえば、完全なタンパク質または他の抗原ポリペプチドを、たとえば化学的ま たは酵素的に分解し、この形で細胞に加えることができる。たとえば、興味の対 象となるタンパク質をキモトリプシンで分解し、結果として得られるペプチドの 「フラグメンｌ−Ｊの混合物を、、形質転換した、またはトランスフェクトした 細胞の培養物に加える。これらの細胞は、そこで、適当なペプチド（しばしば、 より小さなペプチドであり、好ましくは、オクタマーまたはノナマーから成る） を「選び」、クラスＩ　ＭＨＣ分子の上に充填することができる。そのかわりと して、タンパク質またはポリペプチドの全配列を適当なベクターにクローン化し て原核細胞に挿入し、それにより、細胞は有意な量の抗原ポリペプチドを産生じ 、それを集め、精製し、ペプチドに消化し、そこで形質転換したまたはトランス フェクトした原核細胞の培養物に加えることができ、細胞は発現されたＭＢＣの 上に充填すべきペプチドを、ここでもまた「選ぶ」ことができる。
６、休止しているＣＤ８細胞または、ＣＤ８先駆細胞体止しているＣＤ８細胞（ またはＣＤ８先駆細胞）すなわち、標的となる特異抗原に対してまだ活性化され ていないＴ細胞は、好ましくはＣＤ８細胞の、本発明の形質転換した培養物との インキュベートに先立ち、患者から抽出する。患者からのＣＤ８先駆細胞の採集 は、ＣＤ８細胞の特異的に活性化されるべき能力を妨げる可能性のある他の処置 または治療の開始に先立って行うことが好ましい。たとえば、もし新生物または 腫瘍のある個体を治療しようとするのであれば、化学療法および放射線処理の開 始に先立って細胞試料を入手し、それを培養することが好ましい。
リンパ球の抽出法および培養法は周知である。たとえば、Ｒｏｓｅｎ−ｂｅｒｇ の、米国特許Ｎｏ、　４．６９０．９１５は、リンホサイトフェレシス（Ｉｙｎ −ｐｈｏｃｙｔｏ　ｐｈｅｒｅｓｉｓ）により多数のリンパ球を得る方法を記載 している。使用された適切な培養条件は哺乳類細胞のためのものであり、典型的 には３７℃で行なった。
ＣＤ８先駆細胞の分離および（または）その培養物の濃縮にはまた、種々な方法 を用いることができる。細胞の分離のための一般的な方法の例は、特異的にコー トした表面への、細胞の直接的な結合を含む。他の例では、ＣＤ８細胞を含んで いる、ヒト末梢血リンノく球（ＰＢＬ）を、フィコール・ハイバック（Ｆｉｃｏ ｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心法により単離した。ＰＢＬリンパ芽球は、その 後ただちに使用してもよいが、ＦＢＳを含むｌＯ％ＤＭＳＯ（シグマ・ケミカル 社　モンタナ州、セントルイス）中で凍結した後、液体窒素中に保存することも でき、それにより細胞の生存率およびリンパ球としての機能を保つことができる 。
先駆細胞の分離および（または）培養物の濃縮についてのその他の方法は、以下 の例を含む。全血からリンパ球に富むＰＢＬ集団を調製した後、そこからＣＤ８ リンパ球の亜集団を、ＣＤ８受容体抗原の存在に向けた、親和性（アフィニティ ー）に基づく分離技術により単離する。これらのアフィニティーに基づく技法は 、蛍光で活性化した細胞選別法（ＦＡＣ３）を含む、フローサイトメトリー、細 胞接着および類似の方法を含む。（Ｓｃｈｅｒ、　Ｍａｇｅ共著、「基礎免疫学 Ｊ　（Ｆｕｎｄａ−ｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）Ｗ、Ｅ、Ｐａ、ｕ１ 編、Ｐ、　７６７−７８０．　リバープレス、ニューヨーク　（１９８４）など を参照のこと。）アフィニティー法は、アフィニティー試薬の源として、抗ＣＤ ８受容体抗体を使用することができる。そのかわりとして、ＣＤ８受容体の天然 のリガンドまたはリガンド類似体を、アフィニティー試薬として用いることもで きる。これらの方法に用いるための様々な抗Ｔ細胞モノクローナル抗体、および 抗ＣＤ８モノクローナル抗体は、一般的にアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション（ロックビル、メリーランド州）、およびファルマシア（サンディエ ゴ、カリフォルニア州）を含めた種々の販売元から入手することができる。抗原 の選択により、適する抗体が異なることがある。（Ｔ細胞を含めたヒト白血球の 命名法、抗原の名称、および、あてがわれる抗体についての議論および総説は、 Ｋｎａｌｌｐらの「現代免疫学Ｊ　（１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　１０ ．２５３−２５８　（１９８９）を参照のこと。）たとえば、モノクローナル抗 体０ＫＴ４　（抗−ＣＤ４゜ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ　８００２）　、０ＫＴ５　 （ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ　８０１３および８０１６）　、０ＫＴ８（抗ＣＤ８　 、　ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ　８０１４）　、および０ＫＴ９　（ＡＴＣＣＮｏ、 ＣＲＬ　８０２１）は、［細胞株およびハイブリドーマのＡＴＣＣカタログＪ　 （ＡＴＣＣＣａｔａｌｏ−ｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙ ｂｒｉｄｏｍａｓ　（ＡＴＣＣ，ｏ　ツクビル、メリーランド州）には、ヒトＴ リンパ球、ヒトＴ細胞サブ上・ソト、および活性化Ｔ細胞のそれぞれに反応性が あると定義されている。Ｔ細胞種の同定および単離のための、他の様々な抗体を 入手することができる。
好ましくは、ＰＢＬを次いで精製する。たとえば、フィコール勾配をこの目的の ために利用することができる。精製したＰＢＬを次いで、あらかじめ適当な抗原 ペプチドとインキュベートしておいた同系のドロソフィラ細胞と混合する。
７、ＣＤ８細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの活性化特異的な細胞障害性Ｔ細胞の産生 のためのｉｎ　ｖｔｔｒｏでの条件を最適化するために、刺激細胞の培養を、あ る適した培地に維持した。
好ましい態様においては、刺激細胞はドロソフイラ細胞であり、それらは無血清 培地（たとえば、エックスセ（Ｅｘｃｅｌｌ）　４００）に維持することが好ま しい。
刺激細胞を、活性化されるべき細胞、たとえばＣＤ８先駆細胞と共にインキュベ ートするに先立ち、ヒトのクラスＩ　ＭＨＣ分子上に充填し、刺激細胞の表面上 に発現するに十分な量の抗原ペプチドを、刺激細胞の培養物に加える。本発明に よれば、ペプチドの十分な量とは、約２００、および好ましくは２００以上のヒ トのクラスＩＭｌ＋Ｃ分子に、ペプチドを充填して、個々の刺激細胞の表面上に 発現させることのできる量である。好ましくは、刺激細胞を、２０μｇ／ｍｌよ り高濃度のペプチドとインキュベートする。
休止しているＣＤ８細胞、またはＣＤ８先駆細胞は、次いで適当な量の刺激細胞 と共に、ＣＤ８細胞を活性化するに十分な期間、培養によりインキュベートする 。好ましくは、ＣＤ８細胞は、抗原特異的方法で活性化する。刺激細胞に対する 休止しているＣＤ細胞、またはＣＤ８先駆細胞（エフェクター）の割合は、個々 に異なり、さらにはある個体のもつリンパ球の、培養条件に対する順応性、およ び、本文中に記載した治療様式が使用される、疾病の状態またはその他の状態の 、性質およびきびしさのような変数に依存している。しかしながら、好ましくは 、リンパ球対刺激細胞（たとえばドロソフィラ細胞）の比は、およそ３０：１〜 ３００：Ｉの範囲である。たとえば、一つの態様においては、３ＸｌＯ’個のヒ トＰＢＬと１×１０″個のドロソフィラ細胞を混合し、ＲＰＭｌ、　１６４０培 地２０ｎ＋Ｉ中に維持した。
エフェクター／刺激細胞培養は、治療上実用的な、または効果的な数のＣＤ８細 胞を刺激するために必要な期間維持することができる。
一般的な条件下においては、最適期間はおよそ１日と５日の間であり、「プラト ー」、すなわち特異的ＣＤ８活性化レベルの「最大値」は、一般的には培養５日 後に見られる。本発明の一つの態様においては、ｉｎ　ｖｉけ０でのＣＤ８細胞 の活性化は、細胞株の感染の後、短い期間内に検出される。一つの態様において は、ＣＤ８細胞の活性化が可能なトランスフェクトした細胞においての、一時的 な発現を、トランスフェクト後４８時間以内に検出できた。このことは、ヒトの クラスＩ　ＭＨＣ分子を発現している形質転換細胞の安定な、または一時的な培 養が、ＣＤ８細胞の活性化に効果的であることを明らかに示している。
８、ＣＤ８細胞の、ドロソフイラ細胞からの分離活性化したＣＤ細胞は、刺激を 与える（たとえばドロソフイラ）細胞から、周知の方法の一種を用いて効果的に 分離することができる。
たとえば、刺激細胞に対して、または刺激細胞上に充填されているペプチドに対 して、またはＣＤ８細胞（またはそれらの断片）に対して特異的なモノクローナ ル抗体を用いて、これらの適切な相補性のあるリガンドを結合することができる 。抗体をつけた分子は、適当な方法、たとえば周知の免疫沈降または、免疫検定 法により、刺激細胞−エフェクター細胞混合物から抽出することができる。
９、活性化したＣＤ８細胞の投与 活性化したＣＤ８細胞の、効果的な細胞障害性のある量は、これらのキラー細胞 の最終的な標的である細胞の量およびタイプによって変わるように、ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏと　ｉｎ　ｖｉｖｏでの使用によっても変わり得る。
その量は、患者の状態によっても変わり、従事者により、すべての適切な因子の 考慮を経て決定すべきである。しかしながら、マウスでは約５Ｘ１０＠〜５Ｘ１ ０’個の細胞を用いるのに対し、成人では好ましくは約ｌＸ１０’〜約ｌＸｌ０ ”個を、さらに好ましくは約ｌＸｌ０＠〜約ｌＸ１０”個を、さらになお好まし くは、約ｌＸｌ０’〜ｌＸｌ０”個の活性化したＣＤ８細胞を利用する。
前文に論議したように、好ましくは治療を受ける個体への投与に先立ち、活性化 したＣＤ８細胞を、ドロソフイラ細胞の培養物から回収する。しかしながら、今 日存在する、および提案されている他の方法と異なり、本発明の方法が腫瘍原性 のない細胞培養系（すなわちドロソフィラ細胞）を用いていることに注目するこ とは重要である。従って、もしドロソフィラ細胞と、活性化したＣＤ８細胞との 完全な分離が行われないとしても、少数のドロソフイラ細胞の投与に伴う固有の 危険は、哺乳類の、発がんを促進する細胞の投与が極めて危険であるのに対し、 何も知られていない。
細胞成分の再導入の方法は、本技術分野では周知であり、Ｈｏｎ５ｉｋらによる 米国特許Ｎｏ、　４．８４４．８９３ならびにＲＯ５ｅｎｂｅｒｇによる米国特 許Ｎｏ、　４．６９０．９１５に例示されている方法を含む。たとえば、ＣＤ８ 細胞の静脈内注入による投与が適している。
１０、ＨＬＡのタイピング 先に述べたように、）ＩＬＡのハブロタイブ／アロタイプは個体ごとに異なり、 本発明の実施に対しては本質的なことではないが、個体の１（ＬＡを決定するこ とは、しばしば有用である。）１１．Ａタイプは、標準的なタイピング方により 、フィコール勾配で精製したＰＢＬを用いて決定することができる。精製したＰ ＢＬを、適当な抗原ペプチド（たとえば、ウィルス感染、がん、または悪性腫瘍 に関する治療用の適用には、ウィルスに特異的または、がんに特異的なタンノく り質に由来するペプチド）と共にあらかじめインキュベートしておいた同系のド ロソフィラ細胞と混ぜる。
特定のウィルスまたはがんに特異的な抗原の性質が明らかになっているような場 合には、例のようなウィルスの、または悪性な条件を使い続けるには、これらの エピトープをコードしている合成したペプチドを使うことが好ましい。好ましい 抗原ペプチドが正確に決定されていない場合には、ウィルスまたはがんに特異的 なタンパク質のプロテアーゼ分解物を使うことができる。それらの抗原の源とし て、ウィルスまたはがんに特異的なタンパク質をコードしているｃＤＮＡを、た とえばこの文章の中に開示した方法により、細菌の発現ベクターにクローン化し 、細菌を形質転換することができる。
ＨＬＡのタイピングの後、もし好ましいＨＬＡを発現しているドロソフィラ細胞 が得られない場合には、ポリメラーゼ連鎖反応により、好ましいＨＬＡをコード しているｃＤＮＡをクローン化することができる。
前文において、Ｂ・１章に開示したプライマー（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　ｌからＳ ＥＱ　１０　Ｎｏ　１２まで）を用いて適切なＨＬＡ−Ａ、　−Ｂ、　−Ｃ，− Ｅ。
−Ｆ、またはＧのｃＤＮＡを、別々の反応において増幅することができ、下文の Ａ２・１において、ＨＬＡについて開示した方法で、クローン化し、配列を決定 することができる。クローン化したＨＬＡを発現している安定な細胞株をここで 、ドロソフィラ細胞において確立することができる。かわりの方法として、ＰＣ Ｒ反応からのクローン化した組換え体の大部分の集団を一時的に発現している昆 虫細胞の集団を、１ｎｖｉｔｒｏでのＣＤ８の活性化に用いることができる。
１１、ドロソフィラの分裂促進因子 本発明に従って培養した細胞の上清が、特異的な活性化されたＣＤ８細胞を産生 ずるという、細胞株の能力を増進または回復させることが今わかった。約１０％ のドロソフィラの培養物上清を、リンパ球の培養物、または固定した細胞に加え るとＣＤ８を効率よく活性化する。同系クラスＩ抗原を発現しており、初代培養 では、ＣＤ８を活性化することができなかった培養細胞は、ドロソフィラ細胞の 培養物上清を加えた後、特異的なＣＤ８を産生ずることができた。ドロソフィラ の培養物から単離される因子であり、ドロソフィラの細胞培養において、ＣＤ８ の活性化に重要なインパクトを持つと思われる因子は、ドロソフィラの分裂促進 因子である。分裂促進因子は、安定性の高い、可溶性な分泌物質として特徴づけ られ、４℃で４か月保存した後でもその活性を維持している。分裂促進因子は比 較的大きな分子量、すなわちスペロース６（ファルマシア、ビッカタウエイ。
ニューシャーシー州）ゲルろ適法によれば５００ｋＤａを有する。それはまたモ ノＱセファロース（ファルマシア、ピッカタウエイ、ニューシャーシー州）に強 く結合する。ドロソフィラ細胞の分裂促進因子は、明らかにＢ細胞の増殖を誘導 し、マクロファージを活性化する。
ドロソフィラ中に発見された分裂促進因子は、他の昆虫の分裂促進因子の代表的 なものであって、効果的な治療用アジュバントを供する可能性がある。たとえば 、感染した動物から細胞をとり、それを用いてドロソフィラ細胞を刺激し、続い て血中リンパ球の初代培養物、およびドロソフィラの分裂促進因子と混合する。
次いで、この混合物をその動物の治療に用いることができる。
実施例 下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限 定しない。
実施例１ ｓｐｈ　Ｉ線状化ｐＲｍＨａ　−Ｉ　ＤＮＡ発現ベクターを後述するようにｐＲ ｍＨａ−２発現ベクターのｓｐｈ　Ｉ制限消化から生ずるＤＮＡ断片と結合する ことによって、本発明において記載するドロソフィラ・シュネイダ−（Ｄｒｏｓ ｏｐｈｉｌａ　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）　２細胞中でＭＨＣタンパク質を発現する とき使用するｐＲｍＨａ−３発現ベクターを構成した。この方法におけるｐＲｍ Ｈａ　−１とｐＲｍｔ（ａ　−２断片との結合を実施して、ｐＲｒｒＩＨａ−１ の中に存在する２つのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼクローニング部位の１ つを除去した。こうして、生ずるｐＲｍＨａ　−３発現ベクターは、種々のＭＨ ＣをエンコードするＤＮＡ断片が実施例に記載するように挿入された多数のクロ ーニング部位（ポリリンカー）の中にただ１つのＥｃｏＲＩ制限部位を含有した 。
１、ｐＲｍＨａ−１発現ベクターの調製ｐＲｍ）Ｉａ　−１発現ベクターは、メ タロチオネインプロモーター、金属応答コンセンサス配列（ＭＴと表示する）お よびドロソフィラ・メラノガスタ−（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ＩＩｌｅｌａｎｏ ｇａｓｔｅｒ）から単離されたポリアデニル化シグナルを含有するアルコールデ ヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を含有腰Ｂｕｎｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、　１６　：　１０４３−６１　（１９８８）に記載されているように して構成した。最終のｐＲｍＨａ−１構成体の概略を第１Ｂ図に示す。ＡＴＣＣ 受は入れ番号３７２５３を有するプラスミド発現ベクターｐＵｃ１８を源ベクタ ーとして使用し、これから引き続いてここに記載するベクターを誘導した。ｐ！ ＪＣ１８プラスミドは多数のクローニング部位の中に５′から３′に次の制限部 位を含有し、それらのすべては第１図にｐＵｃｌ、８誘導ベクターの概略的表示 の中に示されていない：　ＥｃｏＲＩ　；　５ａｃＩ　；　Ｋｐｎｌ　；同一位 置に位置するＳｍａ　ＩおよびＳｍａＩ　；ＢａｍＨＩ　；　ＸｂａＩ　；　５ ａｌＩ　；同一位置に位置するＡｃｅ　Ｉおよび旧ｎｃＩＩ　；　Ｐｓｔｌ　； 　５ｐｈＩおよび旧ｎｄｌＨ０ｐｕｃｔｓベクターをまずＨｉｎｃｌｌＩｒで消 化して線状化ｐｕｃ１ｓを形成した。次いで、ＭａｎｉｉＬｔｉｓら、Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　 、編、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　、ニュー ヨーク（１０８２）に記載するように、ＨｉｎｄＩ［［末端にＤＮＡポリメラー ゼＩの大きい断片をフィルインすることによって、平滑末端をつくった。
生ずる線状化平滑末端ｐＵｃ１８ベクターを、ポリアデニル化シグナルを含有す るドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈ目ａｍｅｌａｎｏｇａｓＬｅ ｒ）　ＡＤＨ遺伝子からの７４０塩基対（ｂｐ）の旧ｎｆＩ断片と結合した。プ ラスミドｐＳＡＣＩから、まず、Ｇｏｌｄｂｅｒｇら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ７７　 ：　５７９４−５７９８　（１９８０）に記載されているように、旧ｎｆＩ断片 で消化し、次いでクレノーで平滑末端として配列識別番号】４に記載するヌクレ オチド配列を生成することによって、結合したＡＤＨアレレを単離した。ランダ ムの高分子量の（１５ｋｂより大きい）を含有するバクテリオファージラムダの ライブラリーから選択したドロソフイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　ＤＮＡの４ ．７キロ塩基（ｋｂ）のＥｃｏＲＩ断片を、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ受は入れ番 号３１３４４）の中にサブクローニングすることによって、ＡＤＨアレレを含有 するｐｓＡｃ　Ｉベクターを構成した。Ｋｒｅｉ　ｔｍａｎ。
Ｎａｔｕｒｅ　３０４　：　４１２−４１７　（１９８３）に記載されているよ うに、５　’　Ｈｉｎｆ　Ｉ制限部位はＡＤＨ遺伝子の中の１７７０位置にの自 然に見出された。３′旧ｒ＋４１部位は、ＡＤＩ（遺伝子がクローニングされて いるｐ（ＩＣ１８ベクターから誘導された。この位置はＡＤＨ遺伝子バンクの位 置２５００におけるＸｈｏ　Ｉ部位に対して４塩基３′であった。ＡＤＨ断片は 、ＡＤＨｍＲＮＡの３′非翻訳部分中のポリアデニル化／切断配列の３５ｂｐ上 流からポリアデニル化シグナルの７００ｂｐ下流まで延長した。ＡＤ）ｌ遺伝子 断片を含有する生ずるｐＵｃ１８誘導ベクターを、第１Ａ図に示すようにｐＨＡ −１と表示する。
４２１ｂｐのＥｃｏＲＩ　／　Ｓｔｕ　Ｉ　ＭＴ遺伝子断片は、ドロソフィラ・ メラノガスタ−（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ　）ゲノム ＤＮＡライブラリーの中においてほぼ１５．３ｋｂのＤＮＡを含有するクローン から得られた。成虫ＤＮＡのＭｂｏ　１部分的消化で調製されたライブラリーを ラムダ誘導ＥＭＢＬ　４の中でクローニングした。この断片はＭＴプロモーター およびドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　ＭＴ遺伝子の金属応答コンセン サス要素を含有した（Ｍａｒｏｎｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１２：４９３−５ ０４　（１９８６））。この領域は、プロモーターおよびヌクレオチド１＋に転 写開始部位を含有し、ＭＴ遺伝子の位置−３７０からヌクレオチド位置＋５４に 相当した（配列識別番号１３）。次いで、生ずる断片を、前以てＥｃｏＲＩおよ びＳｍａ　Ｉで線状化した上で調製したｐＨＡ−］の中に結合した。５ｔｕＩ消 化によりつくられたＭＴ中の３′平滑末端は、Ｓ＋ｎａ　Ｉ消化によりつくられ たｐＨＡ　−１中の平滑末端と適合した。５′　ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ ｉｌａ）　ＭＴ遺伝子および３　’　ＡＤＨ遺伝子断片を含有する生ずるＩ）Ｕ Ｃｌ、８誘導ベクターをｐＲｍＨａ、　−１と表示した。ｐＲｍＨａ−１発現ベ クターは、第１Ｂ図に示されており、複製起点（ａｒｔ）およびｐＵｃｌ８から のアンピシリンに対する耐性（Ａ＋ｎｐ’　）を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子 を第１Ａ図に示すようにｐＨａ　−１ベクター上に含有した。
ｐＲｍｔ（ａ−１の線図は、また、ＭＴ遺伝子断片の５’−３’隣接位置、多数 のクローニング部位およびＡＤＨ遺伝子断片を示す。ｐＲｍｌｌａ　−１ベクタ ーは、下のＣ８に記載するように、ｐＲｍＨａ　−３発現ベクターの構成におい て使用した。
２、ｐＲｍＨａ−２発現ベクターの調製ｐＲ＋ｎｔｌａ　−２の構成を第１Ａ図 に示す。ｐＲｍＨａ　−２発現ベクターを構成するために、ｐＲｍＨａ　−１の 構成について前述したようにわずかの変更を加えて、上で調製したＭＴ断片をｐ Ｕｃ１８誘導ベクターｐＨＡ　−１の中に挿入しｔ二。上で調製したＥｃｏＲＴ 。５ｔｕＩ単離ＭＴ遺伝子断片のＳｔｕ　！部位に［！ｃｏＲＩリンカ−を加え て、両末端にＥｃｏＲＩ制限部位を有するメタロチオネイン断片を形成した。次 いで前以てＥｃｏＲＩで線状化したＡＤＨ断片含有ｐＵｃ１８発現ベクターの中 に、生ずる断片を結合した。生ずるｐＵｃ１８誘導ベクターは、５′　ドロソフ ィラ（ＤｒｏｓｏｐｈｊＪａ）　ＭＴ遺伝子断片および多数のクローニング部位 に対して５′に２つのＥｃｏＲＩ制限部位を有する３　’　ＡＤＨ遺伝子断片を 含有し、　ｐＲｍＨａ　−２と表示する。ｐＲｍＨａ　−２発現ベクターは、第 １Ａ図に示されており、複製起点（ｏｒｉ）およびｐｌＪｃＩ８からのアンピシ リンに対する耐性（Ａｍｐ’　）を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有した。
ｐＲｍＨａ　−２の線図は、また、ＭＴ遺伝子断片の５’−３’隣接位置、多数 のクローニング部位およびＡＤＨ遺伝子断片を示す。ｐＲｍＨａ−２ベクターは 、下のＣ１に記載するように、ｐＲｍＨａ　−３発現ベクターの構成においてｐ ＲｍＨａ　−１と一緒に使用した。
３、ｐＲｍＨａ−３発現ベクターの調製ただ１つのＥｃｏＲＩ制限部位を有する ｐＲｌｌｌｌＨａ−３発現ベクターを調製するために、ｐＲｍＨａ　−２からの 断片をｐＲＩＩＩＨａ　−１の中に結合した。
この構成のために、上のす、において調製したｐＲｉｌｌａ−２をまずＳｐｈ　 ｒで消化した。生ずる５ｐｈＩ断片はＭＴ遺伝子の中央において開始しそして多 数のクローニング部位中のｓｐｈ　Ｉ部位に延長し、これをまずｐＲｍＨａ　− ２ベクターから単離し、次いで上のＡ、Ｉ。において調製したｐＲｍＨａ　−１ の中に結合した。ｐＲｍＨａ　−１ベクターを前以て修飾してＭＴ遺伝子断片に 対して５′のＥｃｏＲＩ制限部位を除去し、次いでＳｐｈ　ｒで線状化した。こ の方法は第１Ｂ図に概略的に示されている。ｐＲｍＨａ−１中のＦ！ｃｏＲＩ部 位を除去するために、このベクターをまずＥｃｏＲＩで消化して線状化ベクター を形成し、次いでヤエナリヌクレアーゼで平滑末端とし、そして再結合した。
次いでＥｃｏＲ１部位を欠如するｐＲｍＨａ　−１ベクターをｓｐｈ　Ｉで消化 して、ｐＲｍＨａ　−２からｓｐｈ　Ｉ断片のインサートに相当する領域を除去 し、そして線状化ｐＲｍＨａ　−１ベクターを形成する。次いでｐＲｍＨａ−２ からのｓｐｈ　Ｉ断片をＳｐｈ　Ｉ線状化ｐＲｍＨａ　−１の中に結合して、ｐ ＲｍＨａ　−３発現ベクターを形成した。ｐＲｍＨａ　−３ベクターの概略は第 １Ｃ図に示されている。ｐＲｍＨａ　−３を誘導したｐＵｃ１８ベクターからの 種々の制限部位の相対位置は、この図面上に示されている。さらに、問題のＭＨ Ｃ遺伝子をその中にクローニングした多数のクローニング部位（ポリリンカー） により分離されたＭＴおよびＡＤＨ遺伝子断片の相対位置および長さは、この図 面上に示されている。ｐＵｃｌＢから誘導されたｐＲｍＨａ　−３ベクターは、 ｐＵｃ１８複製起点およびアンピシリン耐性を与えるβ−ラクタマーゼ遺伝子を 含有する。こうして、本発明において調製されそしてｐＲｍｌ（ａ−３の多数の クローニング部位の中にクローニングされたＭＨＣをエンコードするＤＮＡ断片 は、ＭＴプロモーターにより転写的に調節され、そしてこれをＡＤＩ（遺伝子を 介してポリアデニル化した。
Ｂ、ｃＤＮＡの合成 ！１ＬＡ　Ａ、２．２を合成するために、完全なＡ２．２をエンコードするｃＤ ＮＡ（参照、Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ、　Ｉ＋ｎ＋ｎｕｎｏ１．１３９　：　９３６ −４１　（１９８７）　、発表された配列について）を、Ｍ１３ｎ＋ｐ１９プラ スミド、すなわち、商業的に入手可能なバクテリオファージのベクター（ストラ タジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ラジョラ、カリフォルニア州）の中にクロ ーニングする。Ａ２の発表された配列から誘導されたプライマーを使用するＰＣ Ｂにより、ｃＤＮＡを合成する。ｃＤＮＡをＭ１３＋ｎｐ１９クローンからＮｏ ｔＩ（クレノーでフィリングされたオーバーハング）／ＥｃｏＲＩ断片として解 放する。
（クレノー断片は、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ　１）ＤＮＡ　ｐｏｌ　Ｉをスブチリ シンで処理して生産された、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＮＡポリメラーゼ１分 子の一部分である。それらを使用して、制限ヌクレアーゼにより生産されたＤＮ Ａ分子の末端において５′または３′のオーバーハングを「フィル・アウト（ｆ ｉｌｌ　ｏｕＤ　Ｊする。）　Ｂｇｌ［Ｉ　（末端がクレノーでフィリングされ ている）およびＢｃｏＲＩで消化されたｐｓＰ６４Ｔの中に、Ｎｏ　ｔ　Ｉ　／ 　ＥｃｏＲＩ断片を挿入する。ｐＳＰ６４Ｔは、それ自身の開始コドンを含有す るｃＤＮＡに効率よく翻訳されるｍＲＮＡ　（β−プロピン）から５′および３ ′フランキング領域を提供するようにデザインされたＳＰ６クローニングベクタ ーである。この翻訳ＳＰ６ベクターは、ｐＳＰ６４−Ｘ３ｍをＢａｌ　Ｉおよび Ｂｓ　ｔＥ　ＩＩで消化し、互い違い末端を７４ＤＮＡポリメラーゼでフィルイ ンし、そして結合によりＢｇｌ　ＩＩクリンカを加えることによって構成された 。Ｂａ１Ｉはβ−グロビンｃＤＮＡをＡＴＧ　（開始コドン）の２塩基上流で切 断し、そしてＢｓｔＥＩＩはＴＡＡ　（停止コドン）の８塩基上流で切断する。
ｐｓＰ６４Ｔの中にただ１つのＢｇｌ　ＩＩが存在するので、ポリリンカー断片 において、ＰａｔＩがらＥｃｏＲＩまでを切断する制限酵素をなお使用して転写 のためにプラスミドを線状化Ｒｅｓ、　１２　：　７０５７−７０７０．　（１ ９８４）　、これは、また、プラスミドｐｓＰ６４−Ｘ３ｍの構成を記載してい る）。生ずるプラスミドをＥｃｏＲＩ　（クレノーで末端をフィリングした）お よび旧ｎｄｎＩで切断し、ｐｃＭＵ　ＩＩの中に旧ｎｄＩｎ（５’）と５ｔｕＩ （３’）との間においてクローニングする。（参照、Ｐａａｂｏら、ＥＭＢＯＪ 、５　：　１９２１−１９２７　（１９８６）。）全体のｃＤＮＡを旧ｎｄｌｎ 　（クレノーで末端をフィリングした）Ｂａｍ）ＩＩ断片として除去し、Ｓｍａ 　ＩおよびＢａｍｔ（Ｉで切断したｐＲｍＨａ　−３の中にクローニングする。
トランスメンブレンドメインの直前に前述のＡ２．２　ｃＤＮＡの中に停止コド ンを操作することによって、ＨＬＡＡ２．２を調製した。真核生物の発現ベクタ ーｐｃＭＬＩ　ＩＩの中の旧ｎｄＩＩＩ　５　’と５ｔｕＩ３’（上を参照）と の間にクローニングしたＡ２，２　ｃＤＮＡをＭｂｏＩＩおよびＢａｍＨＩで切 断し、次のオリゴヌクレオチドを挿入することによって突然変異を達成する： ５′プライマー：　５’　ＧＧＡＧＣＣＧＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧ　３　’（ 配列識別番号１７） ３′プライマー：　５’　ＣＣＣＴＣＧＧＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＣＴＡＧ 　３’（配列識別番号１８） 生ずる組換えプラスミドを旧ｎｄ■で切断し、オーバーハング末端をクレノーで フィリングし、次いでＢａｍＨＩで切断して制限断片を解放し、これをＡ２．２ 全長と同一方法でｐＲｍＨａ　−３の中にクローニングする。
ＨＬＡ　Ａ２．１　ｃＤＮＡを次のようにして調製する。Ａ２．１の発表された （１９８９）に記載された反応条件を使用するＰＣＨにより、切頭ＨＬ＾Ａ　２ ．１．　ｃＤＮＡ配列を合成する。
５′プライマー：　５’　ＧＣＧＧ八ＴＣへＡＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＧＧＣＧＣ ＣＣ３’（配列識別番号１９） ３′プライマー：　５’　ＣＧＧＡＡＴＴＣＴ（：ＡＴＣＡＧＧＧＣＴＴＣＧＧ ＣＡＧＣＣＣ３’（配列識別番号２０） 生ずるＰＣＲ断片をｐＢＳ　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、ラ ジョラ、カリフォルニア州）の中にクローニングし、そして配列をジデオキシ配 列決定により評価する。ＨＬＡＡ２．ｌのコーディング配列の大部分をエンコー ドするａｏｏｂｐの断片をこのプラスミドからＡｖａ　ＩおよびＳｔｕ　Ｉで切 除し、そして前以てｐＲｍｌｌａ　−３の中にクローニングされたＨＬＡ　Ａ２ ．２　トランスメンブレン配列において同一断片と置換するために使用する（上 を参照）。
ＨＬＡ　Ｅ　７をＢ７の発表された配列（参照、例えば、Ｚｅ＋＋ｏｎｏｕｒお よびＰａｒｈａｍ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３３　：　３１０−３２０ 　（１９９１））から誘導されたプライマーを使用するＰＣＨにより合成し、Ｂ ａｍＨＩ部位によりフランキングし、ｐＲｍＨａ　−３のＢａ１ｎＨ１部位の中 に直接クローニングする。
（参照、５ｏｏｄら、Ｉ＋＋ｕｎｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　２２　：　１０ｆ− １２１（１９８８））。
Ｂ２７の発表された配列（参照、例えば、ＺｅｍｍｏｕｒおよびＰａｒｈａｍ、 Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　３３　：　３１０−３２０　（１９９１））か ら誘導されたプライマーを使用するＰＣＲにより、ＨＬＡ　８２７　ｃＤＮＡを 合成する。それ以上の詳細はすぐ下に記載されている。
ＨＬＡ　Ｂ２７　ｓｏｌ　ｃＤＮＡを上のＢ２７　ｃＤＮＡのように調製するが 、クローンｐＢｌのアルファ３ドメインの末端に停止コドンを組み込む（参照、 ５ｚｏｔｚら、ＰＮＡＳ　８３　：　１４２８　（１９８６））。切頭および全 長の両者の８２７ｃＤＮＡは、５′末端を修飾したベクターｐＤＳ５において得 られる（参照、５ｔｕｅｂｅｒら、［！ＭＢＯＪ、３　：　３１４３−３１４８ ）　（１９８６））。部位特異的突然変異誘発を実施してｃＤＮ／、の５′末端 を伸長する。次の配列（大文字）を発表された８２７　ｃＤＮＡクローンに付加 する；スラッシュマーク（１）後の配列は発表された配列の開始である：ＧＧＡ 、ＴＣＣＴＣＴＣＡＧＡＣＧＣＣＧＡＧＡＴＧＣＧＧＧＴＣ／　ａｃｇｇｃｇｃ ｃｃ、　、　。
（配列識別番号２１） 完全なり２７およびＢ２７　ｓｏｌ　ｃＤＮＡをｐＤ５５から、まずＡｐａＬＩ 　（クレノーで末端をフィリングした）およびＢａｍＨＩで切断することによっ て切り出す。生ずる断片を５ａｌｌ（末端をクレノーでフィリングした）および Ｂａｇ）ｌ　Ｔで切断したｐＲｉ）ｌａ　−３の中に方向的にクローニングする 。
任意の好ましいＨＬＡをエンコードするｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により クローニングすることができる。上の節Ｂ、　１．の開示プライマー（配列識別 番号１〜配列識別番号１２）を使用して適当なＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、　−Ｃ，−Ｅ 、−Ｆ、または−Ｇ　ｃＤＮＡを別々の反応において増幅することができ、次い でこれらを上にＨＬＡＡ２．１について開示した方法に記載されているようにク ローニングし、そして配列決定することができる。ヒト細胞からのｃＤＮＡの調 製は、Ｅｎｎｉｓら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７　：　２８３３−２８３７　（１ ９９０）に開示されているように実施する。
簡単に述べると、血液試料を個体から獲得し、そして細胞を遠心後に集め、そし て全体のＲＮＡの調製に使用する。第１鎖ｃＤＮＡをオリゴ（ｄＴ）および鳥類 骨髄芽球ウィルス逆転写酵素使用することによって合成する。生ずるｃＤＮＡを 、上の節Ｂ、１．において記載するように１または２以上の適当なプライマーお よびシーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）キットおよびサーマルサイクラ−（パーキ ン−エルマー／セッス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　／Ｃｅｔｕｓ　）　）を使 用するＰＣＲ増幅反応において使用する。反応条件は好ましくは次の通りである 。１１００ｎのｃＤＮＡ鋳型および５０ピコモルの各オリゴヌクレオチドのプラ イマーを使用する。
３０サイクルＷＯ次のようにして実施する：（ａ）９４℃において１分；（ｂ） ６０℃において１分；および（ｃ）７２℃において１分３０秒。次いでＰＣＲ反 応を１００℃に１０分間加熱してＴａｑポリメラーゼを殺し、そしてＤＮＡの末 端をＴ４ポリメラーゼ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｒａｇｅｎｅ）、カリフォル ニア州すンディエゴ）により平滑末端とする。
ヒトβ２ミクログロブリンｃＤＮＡを発表された部分的ｃＤＮＡ水性（参照、Ｓ ｕｇｇｓら、ＰＮＡＳ　７８　：　６６１３−１７．１９８１）を使用して調製 し、次のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のための鋳型と して使用する： ５′プライマー： ５’　ＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴ ＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣ３’ （配列識別番号１５） ３′プライマー： ５’　ＧＧＡＴＣＣＧＧＡＴＧＧＴＴＡＣＡＴＧＴＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＣＴＴ ＡＡＣ３’（配列識別番号１６） プライマーを標準のＰＣＲ反応において使用する（参照、Ｎｉ１ｓｓｏｎら、Ｃ ｅ１ｌ　５８　：　７０７　（ｉ９８９））　。反応生成物をフェノールで抽出 し、シーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ）キット（Ｂｉｏ　１０１　、カリフ ォルニア州すンディエゴ）で精製し、Ｂａｍ１ｌ　Ｉで消化し、そしてｐＢＳの ＢａｍＨＩ部位（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、カリフォルニア 州うジョラ）の中にクローニングする。配列の評価後、このＢａｍＨＩ断片をｐ ＲｍＨａ−３のＢａｍＨＩ部位の中にクローニングする。
実施例に記載するように、ネズミクラスＩ　ｃＤＮＡを種々の場合において使用 した。ネズミクラスＩ　ｃＤＮＡを次のようにして調製した。
Ｈ−２Ｋｂ　：完全なＫｂ分子をエンコードするｃＤＮＡを次のようにして構成 した発現プラスミド匹ＭＵ／に″から得る。リーダー配列およびアルファニドメ インの大部分を欠如する部分的Ｈ−２にゝｃＤＮＡｐＨ２０２を生成する。この ｃＤＮＡを使用して全長の分子を発生する。
Ｎｏｔ　Ｉ部位によりフランキングされた５′プライマーを使用するＰＣＲ反応 において鋳型としてＨ−２Ｋｂをエンコードするゲノムのクローン（Ｃａｌｉｇ ａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　２９１　：　３５−３９．１９８１）を使用して、次１ ．Ｓでリーダー配列の最後の７アミノ酸をエンコードする２１ヌクレオチドおよ びアルファニドメインの開始に対して相補的な１８ヌクレオチドおよび５ｔｙＩ 部位を含む領域に対して相補的な３′プライマーを使用して、前記欠如した配列 を得る。生ずる断片をｐＨ２０２と５ｔｙｘ部位において結合する。シグナル配 列の残部をエンコードする５′配列を、Ｄ’　ｃＤＮＡ　（下を参照）からＢａ ｍＨＩ　／　Ｎｏｔ　Ｉ断片として得られる。全体のコーディング配列を発現プ ラスミドからＢａｍＨＩ断片として切断し、そしてＢａｗｌ（Ｉで切断したｐＲ ｍｆ（ａ−３の中にクローニングする。
Ｈ−２Ｌ’　：完全なし４分子をエンコードするｃＤＮＡを発現プラスミドｐｃ ＭＵＩＶ　／しから得る（参照、Ｊｏｌｙおよび０１ｄｓｔｏｎｅ、　Ｇｅｎｅ 　９７　：２１３、１．９９１）。完全なｃＤＮＡを真核生物の発現ベクターｐ ｃＭＵＩＶ　／　Ｌ　’からＢａｍＨＩ断片として切断し、そしてＫｂとしてｐ ＲｍＨａ　−３の中にクローニングする。
Ｈ−２Ｄｂ　＋完全なりｂ分子をエンコードするｃＤＮＡをｐｃＭＵＩＶ　／　 Ｄ　ｂから得る（参照、Ｊｏｌｙおよび０１ｄｓｔｏｎｅ、　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２５３　：　１２８３−８５゜１９９１）。完全なｃＤＮＡを真核生物の発現ベ クターｐｃＭＵＩＶ／　Ｄ　’からＢａｍ旧断片として切断し、そしてに５とし てｐＲｍ）ｌａ−３の中にクローニングする。
ネズミβ２ミクログロブリン：全長のネズミβ２ミクログロブリンｃＤＮＡを旧 ｎｄｎＩ（５’）（クレノーでフィリングした）　／　［１ｇ１ＩＩ（３′）断 片をｐｓＶ２ｎｅｏ　（ＡＴＣＣＮｏ、３７１４９）ネズミβ２ミクログロブリ ンｃＤＮＡから形成し、そしてＳｍａ　ＩおよびＢａｍ）Ｉ　Ｉで切断したｐＲ ｍＨａ　−３の中にクローニングする。
前述したように、ｐｃＭＵベクター（ｐｃＭＵ■）を真核生物の発現ベクターｐ ｃ８１ＧからＮｉ　ｌ５ｓｏｎら、前掲、に記載されているように誘導する。引 き続いて、ベクターｐｃ８１ＧをｐＡ８１Ｇ　（Ｐａａｂｏら、Ｃｅ１ｌ　３３ 　：４４５−４５３　（１９８３））から、Ｐａａｂｏら、ＥＭＢＯＪ、５　： 　１９２１−７　（１９８６）に開示されている方法に従い誘導する。簡単に述 べると、これらのベクターを次のようにして構成した。
ベクターｐＡ８１Ｇの２２０ｂｐの長さのリーダー配列を、Ｄｄｅ　ｒ断片に対 して８０ｂｐの旧ｎｄｌｌＩを欠失することによって短縮する（Ｈｅｒｉｓｓｅ ら、ＮＡＲ８：　２１７３−２１９２　（１９８０）により発表された配列のヌ クレオチド１２８６−１３６６）　；この構成体をｐＢ８１Ｇと呼ぶ。転写開始 の部位に対してそれぞれヌクレオチド−１１２から＋１９までの領域にわたる、 アルファーグロブリン遺伝子の旧ｎｆＩ断片を、ｐｕｃ　９のＰＳｔＩの部位の 中にサブクローニングし、ＳＶ４０の７２ｂｐの反復エンハンサ−をプロモータ ーから上流に挿入した。このプロモーター−エンハンサ−要素をまず５Ｖ４０Ｔ −抗原のコーディング配列の前でクローニングすることによって試験し、そして 生ずる構成体をＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ　１８５）の中にトランスフェク ションした。細胞を２日後に固定し、そしてＴ−抗原について間接的免疫蛍光に より染色する。多数の染色された核が見出され、アルファーグロビン断片の強い プロモーター活性を示す。次いでベクターｐＨ８１Ｇ中のＳＶ４０プロモーター をこの効率よいプロモーター要素で置換して構成体ｐＢ８１Ｇを得た。
ｐ［１８１Ｇを旧ｎｄＩ［ＩおよびＢａｍｆｌ　Ｉで消化し、そしてキセノプス ・ラエビス（Ｘｎｅｎｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）β−グロビンｃＤＮＡの５′非翻 訳配列をエンコードするオリゴヌクレオチドを挿入することによってｐｃＭＵＩ Ｖを構成し、ｐＳＰ６４Ｔの発生に使用した（Ｋｒｉｅｇら、ＮＡＲ１２：　７ ０５７−７０７０（１９８４））　、しかしながら、ＢａｍＨＩ部位をｐＳＰ６ ４Ｔにおいて使用したＢｇ１ｍ部位の代わりに選択した。ｐｃｓｌＧの旧ｎｄｌ ＩＩとＢａｍ１ｌ　Ｉとの間に挿入された配列は、次の通りであった。
５　’　ＡＧＣＴＴＧＡＧＣＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＣ ＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧ　３’ （配列識別番号２２） ベクターｐｈｓｈｓｎｅｏはネオマイシン（０４１８）耐性を与え、そして追加 の熱シヨツクプロモーター（ｈｓ）配列をもつｐｈｓｎｅＯの誘導体（ｐＵｃｃ ｈｓｎｅｏ）であり、これは５ｌｅｌｌｅｒら、ＥＭＢＯＪ、　４　：　１６７ （１９８５）に記載されているように商業的に入手可能なｐＵｃ　ａから合成で きる。
これらのベクターの中に含有される熱シヨツクプロモーターはｈｓｐ７０プロモ ーターである。ネオマイシン耐性（Ｇ４１８耐性）を与える他の有用なベクター は、コスミドｓｍａｒｔ　２　（ＡＴＣＣ３７５８８）　（これはドロソフィラ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　ｈｓｐ７０プロモーターのコントロール下に発現さ れる）、およびプラスミドベクターｐｃｏｐｎｅｏ　（ＡＴＣＣ３７４０９）を 包含する。
Ｃ１発現ベクターの中への遺伝子の挿入制限生成物を１％アガロースゲルの電気 泳動にかける（ＭａｎｉａｈＳら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　 Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２））。ｃＤＮＡをエンコードする制限 断片をゲルから切り出し、そして製造業者（バイオ（Ｂｉｏ）　１０１、カリフ ォルニア州すンディエゴ）の指示に従い「シーンクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ）Ｊを使用してアガロースから精製する。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ）発現プラスミドｐＲｍＨａ−３（参照、Ｂｕｎｃｈら、Ｎｕｃｌｅｔｃ　Ａｃ １ｄｓ　Ｒｅｓ。
１６　：　１０４３−６１．１９８８）を製造業者（ファーマシア（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）、ニュージャーシイ州ビス力タエイ）に指示に従いＯｎｅ　Ｐｈｏｒ 　Ａ１１緩衝液中で適当な制限酵素で切断し、そして製造業者の文献（ベーリン ガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インジアナ州 インディアナポリス）に記載されているようにアルカリ性ホスファターゼで処理 する。１．００ｎｇの切断しかつホスファターゼ処理したｐＲｍＨａ、−３ベク ターを３００ｎｇのアガロースゲル精製したクラスＩＭＨＣ重鎖ｃＤＮＡまたは β２ミクログロブリンｃＤＮＡと混合し、そして製造業者の文献に記載されてい るように７４ＤＮＡリガーゼおよびＯｎｅ　Ｐｈｏｒ　ａｌｌ緩衝液を使用して 結合する。１６℃において５時間インキュベーションした後、結合混合物を使用 して能力大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭ８３　（Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲（１ ９８２）　）を形質転換する。
Ｍａｎｉａｔｉｓら、前掲に開示されている方法を使用して必要なｃＤＮＡを調 製する：簡単に述べると、方法は次の通りである。アンピシリンを含有する寒天 プレートとで大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）をプレートすることによって、形質転換体 を選択する。アンピシリン耐性コロニーを個々に液体培養において増殖させ、そ してＤＮＡをアルカリ性溶解ミニプレプ法を使用して調製する。ベクター中のＭ ＨＣ重鎖ｃＤＮＡの存在およびその向きを制限マツピングにより決定する。メタ ロチオネインプロモーターに関して正しい向きでｃＤＮＡｃＤＮＡをもつベクタ ーを含有する細菌を、アルカリ性溶解法および塩化セシウム勾配精製を使用する ＤＮＡの大規模調製のために使用する。得られるＤＮＡの量を分光光度測定的に 決定する。
シュネイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）　ｎ細胞を、１０％胎児仔ウシ血清（５５ ℃において１時間加熱処理した）、１００単位／＋ｎｌのペニシリン、１００ｍ ｇ／ｍｉのストレプトマイシン、および１＋ｎＭグルタミン）を補充したシュネ イダー培地（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）／ＢＲＬ　、ニューヨーク州グランドアイラ ンド）中で増殖する。（便宜上、この補充した培地を以後シュネイダー培地と呼 ぶ。）細胞を２７℃において増殖し、そして典型的には新しい培地中で１＝１７ に希釈することによって７日毎に継代する。５０％シュネイダー１５０％エクス セル（Ｅｘｃｅｌｌ）　４０１で最初に希釈することによって、細胞を血清不含 培地（１００単位／ｍｌペニシリン、　１０ｈ＋ｇ／ストレプトマイシン、およ び１ｍＭグルタミン、および５００μｇ　／ｍｌ　Ｇ４１８を補充したエクスセ ル４００または４０１（ＪＲＩＩバイオサイエンス（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）　 、カンサス州レネクサ）中の増殖に変換する。１週後、細胞を１０％シュネイダ ー培地／９０％エクスセル４０１の中に継代し、そして１週後１００％エクスセ ル４０１の中に継代することができる。細胞をこの培地中で維持し、そして新し い培地中で２：１７に希釈することによって７日毎に継代する。
１５Ｘ１０’　シュネイダー細胞を１０６細胞／ｍｌの濃度で８５ｍｍのベトリ 皿中でプレートアウトする。１２時間後、リン酸カルシウム／　ＤＮＡ沈澱物を 、後述するように調製しく１＋ｎｌ）、細胞に滴々添加する。４８時間後、上澄 み液を注意して除去し、そして細胞を１７５ｃｍ２のフラスコに５００μｇ／＋ ＋＋１ジエネチシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）　（０４１８）　（ギブコ／ＢＲＩ 、ニューヨーク州グランドアイランド）を含有するシュネイダー培地中の５０ｍ １の合計の体積で移す。２１日後、２０ｍ１の培養物を５００μｇ／ｍ１の６４ １８を含有する３０ｍ１のシュネイダー培地を含有する新しいフラスコに取り出 す。１０日後、フラスコに弱く付着しかつほぼ２４時間の倍加時間で増殖した細 胞の安定な集団が得られ、引き続いてこれらの細胞を培養し、そして前述したよ うに選択した培地中で継代する。５〜２０ＸＩＯ’細胞を遠心により集め、そし てそれらを１ｍｌの細胞凍結培地（９３％胎児仔ウシ血清／７％ジメチルスルホ キシド）中に再懸濁させることによって、これらの細胞の凍結したアリコートを 調製する。次いでアリコートを一７０℃において１週間配置し、引き続いて液体 窒素貯蔵に移す。
に記載されているように調製し、ただし２５μｇのＤＮＡ／　ｌ−ランスフエク ションを使用する。次のＤＮＡの組み合わせを使用して示したトランスフェクシ ョン体を調製する： （ａ）ＭｔｌＣクラスＩ重鎖単独：２３μｇの重鎮発現ベクターＤＮＡ＋　２μ ｇのｐｈｓｈｓｎｅｏＤＮＡ　。
（ｂ）ＭＨＣクラスＩ重鎖単独＋β２ミクログロブリン：１１．５μｇの重鎮発 現ベクターＤＮＡ　＋１１．２μｇのβ２ミクログロブリン（ヒトまたはマウス ）発現ベクターＤＮＡ＋２μｇのｐｈｓｈｓｎｅｏＤＮＡ　。
代謝的標識化の２４時間前に、細胞を１ｍＭのＣｕＳＯ４を含有するシュネイダ ー培地中で３〜５Ｘ１０’細胞／ｍｌの細胞密度（１０ｍ１／　８５ｍｍペトリ 皿）でプレートアウトする。標識化の３０分前に、培地を皿から吸引し、そして 細胞を２ＸｌＯｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いでメチオニンおよびシスティンを含 有しないグレイセズ（Ｃｒａｃｅｓ）昆虫培地（ギブコ／ＢＲＩ　、ニューヨー ク州グランドアイランド、がらの特別の注文）中で２０分間インキュベーション し、次いで０．１＋ｎＣｉの３５８トランス（Ｔｒａｎｓ）標識（二ニー・イン グランド・ニュークリアー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　；デュ ポン（ｄｕＰｏｎ）、マサチュセッッ州ボストン）を含有する１ｍｌのこの培地 中でインキュベーションする。標識化期間後、標識化溶液を吸引し、そして細胞 を直ちに氷上で水冷ＰＢＳ／１％ト’）　）ンＸ　１００　（１ｍｌ）で溶解す るか、あるいはメチオニンを含有するシュネイダー培地またはエクスセル４００ 培地（ＪＲＨバイオサイエンス）の存在下にチェイス期間後に溶解する。可溶性 クラスＩ　ＭＨＣ分子を分析している場合、チェイス培地を集める。
次の操作のすべてはリゼイトを冷く　（８℃より低く）保持して実施する。リゼ イトをエッペンドルフ（Ｂｐｐｅｎｄｏｒｆ）管の中に集め、マイクロシーン（ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管中で１３．０００Ｘｇにおいて１５分間遠心し、１００ ＋ｎｌのプロティンＡセファローズの１０％のスラリーを含有する新鮮な管に移 し、そして転倒型回転装置上に２時間配置する。マイクロラージ中で１５分間さ らに遠心後、細胞リゼイトは分析することができる。
ネズミＭＨＣを利用する実験において、シュネイダー２細胞を前述のネズミＭＨ Ｃ組換え体でＣａＰＯｉ沈澱方法に従いトランスフェクションする；各重鎮を単 独で、あるいはβ２ミクログロブリンをエンコードするベクターとの５０　：　 ５０との混合物としてトランスフェクションする。ネオマイシン耐性をエンコー ドするプラスミドのｐｈｓｈｓｎｅ。
ＤＮＡを各トランスフェクションにおいて含め、こうしてＭＨＣクラス１を安定 に発現した細胞の集団を選択培地（Ｇｅｎｅｊｉｃｉｎ　Ｇ４１８−サルフェー ト、ギブコ／ＢＲＩ、ニューヨーク州グランドアイランド）中でトランスフェク ション体を増殖することによって得ることができるようにする。
Ｅ、ペプチドの発生 本発明による抗原性ペプチドは自然に見出される源から得ることができるか、あ るいは既知の方法により合成することができる。ここに開示する種々の実施例に おいて、ペプチドはアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓ ｙｓｔｅｔｎｓ）合成装置、ＡＢ　Ｉ　４３１Ａ　（カリフォルニア州フォスタ ーシティ−）で合成し、引き続いてＨＰＬＣにより精製する。ここに開示する種 々の実験において使用する抗原性ペプチドは、下に記載するものを包含する。
オバルミン（８）’　ｌ−文字コード：　５ＩＩＮＦＥＫＩ、。
３−文字コード：　５ｅｒｌｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕ（配列 番号　２３）（残基　５−１．２）、ｔハルミン（２４）’　１−文字コ−’ｒ ’：　ＨＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴ［！ＷＴＳＳＮＶＭ−ＥＥＲ。
３−文字コード：　ＧｌｕＧＩｎＬｅｕＧＩｕＳｅｒｌｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅ ＧＩｕＬｙｓＬｅｕＴｈｒ−ＧｌｕＴｒｐＴｈｒＳｃｒＳｅｒＡｓｎＶａｌＭｅ ｔＧｌｕＧｌｕＡｒｇ（配列番号　２３） ＶＳＶ　ＮＰ”　１−文字：ｌ−Ｆ　：　ＲＧＹＶＹＱＧＩ。
３−文字コード：　ＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧＩｙＬｅｕ（配列 番号　２４） インフルエンザＮＰ”　ｌ−文字コード＋　ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ３−文字コード ：　ＡＩａＳｅｒＡｓｎＧＩｕＡｓｎＭｅｔＧｌｕＴｈｒＭｅｔ（配列番号　２ ５） ＬＣＭＶＮＰ’　ｌ−文字コｌ’：　ＳＥＲＰＱＡＳＧＶＹＭＧＮＬ３−文字コ ード： ＳｅｒＧｌｕＡｒｇＰｒｏＧＩｎＡｌａＳｅｒＧｌｙＶａｌＴｙｒｌＪｅｔＧｌ ｙＡｓｎＬｅｕ（配列番号　２６） ＬＣＭＶ　ＧＰ２’　１−文字コード：　ＤＳＳＧＶＢＮＰＧＧＹＣＴＫ３−文 字コード： ＡｓｐＳｃｒＳｅｒＧＩｙＶａ［ＧｌｕＡｓｎＰｒｏＧｆｙＧＩｙＴｙｒＣｙｓ ＴｈｒＬｙｓ（配列番号　２７） ）１１Ｖ　ＧＡＧ　Ａ　（９）　’　ｌ−文字コード：　ＱＭＫＤＣＴＥＲＱ３ −文字コード：　ＧＩｎＭｅｔＬｙｓＡｓｐＣｙｓＴｈｒＧｌｕＡｒｇＧｌｎ（ 配列番号　２８） ＨＶ　ＧＡＧ　Ｂ　（９）　’　１−文字コード：　ＫＲＷ［ＩＬＧＬＮ３−文 字コード：　ＬｙｓＡｒｇＴｒｐＨｅＬＩｅＬｅｕＧＩｙＬｅｕＡｓｎ（配列番 号　２９） 旧■ｖｐｒ（９）’　ｌ−文字コード：　ＦＲＩＧＣＲＨ３Ｒ３−文字コード： 　ＰｈｅＡｒｇｌｌｅＧＩｙＣｙｓＡｒｇＨｉｓＳｅｒＡｒｇ（配列番号　３０ ） 旧ＶＰＯＬ（９）Ｓ　ｌ−文字コード：　ＩＬＫＩ！ＰＶＨＧＶ３−文字コード ：　ＩＩｅＬｅｕＬｙｓＧＩｕＰｒｏＶａｌＨｉｓＧＩｙＶａｌ（配列番号　３ １） ＩＮＦマトリックス（１０）’　１−文字コード：　ＩＬＧＦＶＦＴＬＴＶ３− 文字コード：　ｌ１ｅＬｅｕＧＩｙＰｈｅＶａｌＰｈｅＴｈｒＬｅｕＴｈｒＶａ ｌ（配列番号　３２） ’　Ｃａｒｂｏｎｅ　ら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６９　：　６０３−１２　（ １９８９）”　Ｖａｎ　Ｂｌｅｅｋ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８　：　２１３− ２１６　（１９９０）”　Ｗｈｉｔｔｏｎ　ら、ＪＪｉｒｏｌ、６３　：　４３ ０３−１０　（１９８９）’　０１ｄｓｔｏｎｅら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１６ ８　：　５５９−５７０　（１９８８）。
’　Ｎ１ｘｏｎおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ、ＡＩＤＳ　５　：　１０４９　（１ ９９１）　；参照また、Ｎ１ｘｏｎら、ＡＩＤＳ　４　：　８４１−５　（１９ ９０）。
＠Ｇｏｔｃｈ　ら、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、１６８　：　２０４５−５７　 （１９８８）。
「ランダムＪペプチドの単離または合成は、また、とくに前駆体ＣＤ８細胞を刺 激する可能性が最も強いペプチドを空のＭＨＣ分子を負荷するために特定のエピ トープを確認しようとするとき、適当であることがある。プロテアソーム（ｐｒ ｏ　ｔｅａｓｏｍｅｓ）を使用する（参照、例えば、実施例２．８．６）か、あ るいはタンパク質またはポリペプチドを分解する−一例えば、キモトリプシンに より消化する−一ことによって、「ランダム」ペプチドの混合物を生成すること ができるか、あるいはペプチドを合成することができる。本発明の細胞系をタン パク質およびポリペプチドをヒトクラスＩ　Ｍ）ＩＣ分子上に負荷できるより小 さいペプチドに分解することができることが観察されたが、より小さいベブチド ーー例えば、８マーまたは９マーー−を細胞培養物の中に直接導入していっそう 急速なおよび発現プロセスを促進することが好ましい。
ペプチド、例えば、８，９および１８７−のアミノ酸ペプチドを合成する場合、 すべての種々のアミノ酸は合成の各サイクルの間に組み込むことが好ましい。し かしながら、種々のパラメーター、例えば、ある種のアミノ酸の溶媒不混和性− 一はある種のアミノ酸を欠如するペプチドを含有する混合物を生ずることがある ことに注意すべきである。こうして、この方法を必要に応じて−一すなわち、溶 媒および反応条件を変更することによってｍ−調節して最大の種々のペプチドを 生成すべきである。
ＭＨＣ分子によるペプチドの選択における［好ましさＪを決定するために、異な る長さの１系列のペプチドを、したがって、表３に示すように合成した。異なる 長さのペプチドおよび異なるβ２ミクログロブリンにより付与される熱安定性の 量を定量するために、細胞リゼイトにおけるこれらの種々の分子の安定性を検査 した。放射性細胞リゼイトを、前述したようにネズミまたはヒトをもっに’／β ２．Ｌ’／β２およびＤｂ／β２を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ 　ｌａ）細胞から調製した。次いでリゼイトのアリコートを取り、そして記載す るように添加を行った。各処理のために、５本の管を調製した−次いでこれらを ４℃〜４７℃の異なる温度において１時間インキュベーションし、その後クラス １を免疫沈澱させ、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。次いでオートラジ オグラムをレーザーデンシトメーターを使用して走査し、そして試料をインキュ ベーションした温度に対してシグナルの量をプロットした。分子の５０％が安定 である温度をグラフから計算し、そして異なる種の相対的熱安定性の測度として 使用した。前述したように、ヒトβ２ミクログロブリンと複合化したネズミ重鎮 は、ネズミβ２と複合化する場合よりも、はぼ６〜８°高い温度において安定で あった。また、ペプチドおよび異種β２ミクログロブリンにより付与される安定 性は加法的であることが観察された。１２〜２５７−に比較して、８〜９７−を 使用する場合、クラス１分子の熱安定性の大きい増加が起こる：事実、より大き いペプチドと比較して８〜９７−により付与された安定化の間の差は従来観察さ れたものよりなお大きいことがあるが、ペプチドがＨＰＬＣにより精製されてい てさえ、より大きいペプチドの８〜９マーの多少の汚染が存在するようである。
今回、クラス１分子の熱安定性は、明らかに、（１）β２ミクログロブリンの由 来、（２）ペプチドの存在、および（３）このペプチドの長さおよび配列に依存 することが示された。
ヒトクラスＩ　ＭＨＣ分子を発現する細胞を使用する実験の前に、ネズミＭＨＣ を使用して種々のパラメーターの最適化を実施した。第１に、ドロソフィラ（Ｄ ｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞中で発現されたネズミＭｔＩＣクラス１分子はペプチ ド不含または「空のｊクラス１分子の特性を有することが評価された。
例えば、第２Ａ図および第２Ｂ図は、ネズミまたはヒトβ２ミクログロブリンを もっに’／β２．Ｌ’／β２およびＤ″′／β２を発現するドロソフィラ（Ｄｒ ｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞から調製したアッセイの結果を示す。Ｋ’／β２．Ｌ’ ／β２およびＤｂ／β２を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞 を３５Ｓメチオニンで４５分間標識化し、そして前述したようにリゼイトを調製 した。各リゼイトを４つのアリコートに分割し、これらにＯＶＡ、、　ＮＰまた はＧＰ２を添加したか、あるいはペプチドをまったく添加しなかった。４℃にお いて１時間インキュベーションした。次いてクラス１分子をリゼイトから免疫沈 澱させ、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＯＶＡまたはＮＰペプチドを リゼイトに添加したとき、温度の対抗に対するに’／β２の劇的な安定化が起こ った；同様に、Ｌ’／β２はＮＰペプチドの添加により安定化された。Ｄｂ／β ２は他の２つの分子のように温度不安定性であるように思われなかった：それに もかかわらず、ＣＰ２ペプチドをリゼイトに添加したとき、分子の安定性の増加 が見られるが、ＯＶＡまたはＮＰペプチドの添加はこれを達成しない。２つのバ ンドを各クラスｌについて免疫沈澱したことを見ることができ、処理された（下 ）または処理されない形態のゴルノを表し、両者の分子はりゼイトへのペプチド の添加により等しくよく安定化されるように思われる。未処理にゝ／β２または ＧＰ２リゼイトにおいて観察された少量の［３０℃耐性」タンパク質はバックグ ラウンドである。なぜなら、標識化Ｌ’／β２細胞のりゼイトへのＹ３の添加は このバンドの単離を生じたからである（示されていない）。
次に、ネズミ重鎮を熱安定化するとき、ヒトβ２ミクログロブリンがネズミβ２ ミクログロブリンより優れる可能性を研究した。エクスセル４００培地中で増殖 したドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞へのヒトβ２の添加はすべての ３つのネズミクラス１分子の定常状態のレベルを増加するばかりでなく、かつま た分子を３７℃において少なくとも３時間安定性とすることが発見された。ヒト β２を添加したときのネズミクラス１の安定性の増加は、培地中のβ２濃度を増 加する結果であった；この可能性は除外した。ヒトβ２ミクログロブリンをエン コードするｃＤＮＡをドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ）発現ベクターｐ ＲｍＨａ　−３の中にクローニングし、そして前述したように種々のネズミクラ ス１重鎖ｃＤＮＡおよび耐性マーカープラスミドを含有する発現プラスミドと共 トランスフェクションした。Ｇ　４１８選択後、細胞を適当な抗りラス１抗体で 表面発現について染色し、強く発現する細胞をＦＡＣ３を使用して選択した。細 胞の安定な集団が得られた（データは示されていない）。次いで細胞をエクスセ ル４ｏｏ中テ増殖するように条件づけ、そして３７℃において異なる長さの時間 の間インキュベーションした。ヒトβ２ミクログロブリンを使用して合成したマ ウスクラス１分子は、エクスセル培地に外因性β２を添加しないで３７℃におけ る３時間のインキュベーションに対して安定であった（データは示されていない ）。われわれの結果が示すように、ネズミクラス１分子の熱安定性はペプチドの 存在およびβ２ミクログロブリンの由来に依存する。（第３Ａ図および第３Ｂ図 参照。）さらに、今回、細胞表面で発現されたクラス１分子は適当なザイズのペ プチドの添加によりさらに安定化されることが決定された。
（第５Ａ図〜第５Ｃ図参照。）１系列の異なる長さのペプチドを、表３に示すよ うに、合成した（実施例５．２．参照）。これらは長さが８アミノ酸であるペプ チドを包含する；　ＲＧＹＶＹＱＧＬ　（配列識別番号２４）は小胞性口内炎ウ ィルスｃｖｓｖ）ｃタンパク質中のエピトープとして特徴づけられた。同様に、 ＯＶＡの８マーペプチド５ＩＩＮＦＲＫＬ　（配列識別番号２３、残基５−１２ ）はＩ＜５／β２により提示されるオバルブミン中のペプチドとして同定され、 そして９アミノ酸長さのペプチドＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（配列識別番号２５）はＤ ｂ／β２により提示されるインフルエンザウィルスの核タンパク質のエピトープ として特徴づけられた。これらの「親」ペプチドをエクスセル中で培養しそして ネズミクラス１を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）細胞に添 加すると、ＯＶＡペプチドによるに’／β２およびＮＰペプチドによるＤ’／β ２の３７℃における熱安定性を生じた。
異なる長さのペプチドおよび異なるβ２ミクログロブリンにより付与される熱安 定性の量を定量するために、細胞リゼイト中のこれらの種々の分子の安定性を検 査した。前述したようにヒトまたはネズミβ２ミクログロブリンをもつに’／β ２．Ｌ’／β２およびＤｂ／β２を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌ ａ）細胞から、放射性細胞リゼイトを調製した。次いで、実施例１．Ｄ、に記載 するようにリゼイトのアリコートを取り、そして添加を実施した。各処理のため に、５本の管を調製した：次いでこれらを４℃〜４７℃の異なる温度において１ 時間インキュベーションし、その後クラス１を免疫沈澱させ、そして５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより分析した。次いでオートラジオダラムをレーザーデンシトメーター を使用して走査し、そして試料をインキュベーションした温度に対してシグナル の量をプロットした。
分子の５０％が安定である温度をグラフから計算し、そして異なる種の相対的熱 安定性の測度として使用した。前述したように、ヒトβ２ミクログロブリンと複 合化したネズミ重鎮は、ネズミβ２と複合化する場合よりも、はぼ６〜８°高い 温度において安定であった。
興味あることには、ペプチドおよび異種β２ミクログロブリンにより付与される 安定性は加法的である。１２〜２５７−に比較して、８〜９マーを使用する場合 、クラス１分子の熱安定性の大きい増加が起こる；事実、より大きいペプチドと 比較して８〜９マーにより付与された安定化の間の差は従来観察されたものより なお大きいことがあるが、ペプチドがＨＰＬＣにより精製されていてさえ、より 大きいペプチドの８〜９マーの多少の汚染が存在するようである。
ペプチドの不存在下または存在下にネズミまたはヒトβ２と共発現されたとき、 クラスｌ　ＭＨＣ重鎮（示した）の５０％がＴＸ１００リゼイト中で安定である 温度（℃）を次の表に示す。
表１ ペプチドがβ２ミクログロブリンの不存在下に空のクラス１分子に結合すること ができるかどうかという問題を取り扱うために、３ＳＳメチオニンで１時間標識 化したに１またはＤ１クラス１重鎮を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ）細胞から洗浄剤リゼイトを調製し、そして処理した。Ｋ１分子をＹ３抗体 で、そしてＤｌをＢ２２．２４９抗体で免疫沈澱させた。低いレベルの免疫反応 性に１重鎖のみを未処理リゼイト中で検出することができた。クラス１またはヒ トβ２ミクログロブリンに結合するペプチドの添加は、免疫反応性物質の量を増 加する；両者の添加は非常に大きい量の免疫反応性重鎮を生じた。同様な結果が Ｄｌについて得られた。こうして、重鎮はβ２ミクログロブリンの不存在下にペ プチドに結合することができるように思われる；しかしながら、この結合は非常 に安定なコンフォメーションを生じないか、あるいは使用する抗体はこのコンフ ォメーションによく結合しない。β２ミクログロブリンの添加は、また、多分同 じ理由で免疫反応性分子の数を増加する。これらの２つの試薬の作用は加法的で あり、３成分の複合体が分子の最も安定な形態であることおよび／またはこの分 子が抗体により最もよく認識されることを示唆する。
これらの結果は、３０℃の温度処理後、リゼイトから重鎖／β２複合体を「再構 成」することができるかどうかという問題を発生する。
Ｋ”／β２を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　＋Ｉｆ１７胞か らのリゼイトを３０℃において１時間処理し、その後ＮＰペプチドおよびヒトβ ２ミクログロブリンを添加した。４℃において４時間インキュベーションした後 、クラス１重鎖をＹ３または抗細胞質テイル抗体に１９３で免疫沈澱させた。抗 血清の調製は実施例２．１に記載されている。
前に報告されているように、トリトンＸ　−１００リゼイト中の空のクラス１分 子の温度処理はそれらの分解を生じず（抗細胞質テイル抗体に１９３で３０℃に おいて処理した後、Ｋｂ分子を等しく免疫沈澱させることができる）、むしろそ れはそれらの変性を生ずることが発見された。さらに、これらの変性された分子 が取るコンフォメーションは、それらがちはやβ２ミクログロブリンと結合しな いか、あるいはＹ３によりまたはペプチドおよびヒトβ２ミクログロブリンの添 加により認識される分子に回復することができるようなものである。こうして、 クラス１重鎖は単独であるいはそれらをβ２ミクログロブリンと複合化したとき 、ペプチドと結合することができると結論することは合理的である。
しかしながら、ペプチド負荷したヒトクラスＩ　Ｍｌ（Ｃの表面の発現は、重鎮 がβ２ミクログロブリンと複合化した後、分子のペプチドの負荷を最もよく促進 するように思われる。
２、ヒトＭＨＣの発現 クラス１分子の熱安定性がβ２ミクログロブリンの起源、ペプチドの存在、およ びこのペプチドの長さおよび配列に依存すると、いったんわれわれが決定したと き、ペプチド負荷ヒトクラスＩ　ＭＨＣ分子の発現を介してＣＤ８細胞を特別に 活性化することができる細胞系をつくるとき、われわれはこの情報を利用した。
熱安定性はクラス１分子の固有の性質であるように思われる；それは多分進化し て、ペプチドを含有しないか、あるいは劣った結合性質のペプチド（はとんど熱 安定性を付与しない）を含有するクラス１分子が自己破壊することを保証する。
このようにして、細胞はその表面上の空のクラス１分子の数を最小にする。なぜ なら、外因的に誘導されたペプチドは結合しそして提示されうることにおいて、 このような場合は危険であるからである。ヒトβ２をもつ昆虫細胞中で発現され るヒトクラス１分子（Ｂ２７およびＡ２．１）は３７℃において延長したインキ ュベーションに対して安定ではない一クラス１分子上のペプチドの負荷に欠如す ることが示された突然変異の細胞系Ｔ２の中でヒトクラス１分子は発現されない （ＨｏｓｋｅｎおよびＢｅｖａｎ。
５ｃｉｅｎｃｅ　２４８　；　３６７−７０　（１９９０）；　Ｃｅｒｕｎｄｏ ｌｏ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３４５　；　４４９−４５２　（１９９０））。こう して、重鎮とβ２ミクログロブリンとの間の親和性は分子の共進化を通して注意 して保存され、こうして空のクラス１分子、あるいは結合性に劣るペプチドを有 する分子は「宿主」生物の体温において自己破壊するように思われる。
ヒトクラス１．　ＷＨＯ分子はシュネイダー細胞の中で発現された。ヒトβ２ミ クログロブリンおよびＨＬＡ　Ａ２．２　Ｙ、　ＨＬＡ　Ａ２．１　、　ＨＬＡ Ｂ７、またはＨＬＡ　Ｂ２７共発現する細胞系は、防上記載された方法により確 立された。簡単に述べると、上のタンパク質をエンコードするｃＤＮＡをドロソ フィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）発現ベクターｐＲｍＨａ　−３の中にクロ ーニングし、そしてヒトβ２ミクログロブリン含有プラスミドおよびｐｈｓｈｓ ｎｅｏプラスミドとここに開示する方法によりシュネイダー細胞の中に共トラン スフェクションした。３〜４週後、０４１８耐性細胞の集団を新鮮な選択培地で １＝５に希釈した。いったん細胞の健康に増殖する集団が得られると、Ｃｕ５（ Ｌを細胞のアリコートに添加しそして２４時間後、β２ミクログロブリンとアソ シエーションしたとき、ヒトクラス１重鎖の単形性決定基を認識するモノクロー ナル抗体Ｗ　６　／３２　（ＡＴＣＣＨＢ９５　、ベセスダ、マリイランド州） を使用するフローサイトメトリーにより細胞を分析した。（参照、ＢａｒｎＳｔ ａｂｌｅら、Ｃｅ１ｌ　１４　：　９　（１９７８乃。ヒトクラス１分子の各々 の高いレベルの表面発現はＣｕ５Ｏ＋の添加により誘発された（データは示され ていない）。これらの安定な集団を、後述するようにサイトフルオロメトリーに よる細胞の高い発現のために貯蔵した。すべての引き続く実験のために使用した のは、これらの選別した細胞の集団である。
ＦＡＣ５分析の２４時間前に、Ｃｕ５Ｏ＋を安定にトランスフェクションした細 胞（３〜４ＸｌＯ＠細胞／ｍｌ）に１ｍＭの最終濃度に添加し、これによりトラ ンスフェクションした遺伝子からの発現を「スイッチオン」する。細胞を２４ウ エルのクラスター皿（２ｍｌ／ウェル）中でプレートアウトする。ＦＡＣ５分析 の８時間前に、Ｃｕ５Ｏ＋培地を５０μｇ／ｍ１の濃度のペプチドを含むか、あ るいは含まない新鮮な培地（ｌ　ｏｆ）と置換する。皿を３７℃に室内で平の表 面上に種々の時間間隔で移して３７℃の温度の対抗を実施した後、分析のために 細胞を取運する。
シュネイダー細胞上のクラスＩ　ＭＨＣの表面発現を分析するために、細胞のア リコート（５Ｘ１０’）を氷上の管の中に移し、遠心（１，０００×ｇ、４分間 ）により集め、３ｍｌのＰＢＳ／　１％ＢＳＡ　、　０．０２％アジ化ナトリウ ムの中に再懸濁させ、遠心により集め、そしてＰＣＲ増幅反応−次抗体（腹水Ｙ ３．２８：１４：　ｓｓ、　３０．５．７　、　Ｗ６／３２、希釈１２００）を 含有するＰＢＳ／ＢＳＡ　（０，５１ｎｌ）の中に再懸濁させる。ウサギ抗血清 をｌ：５００に希釈し、モしてＢ２２．２９３ハイブリドーマ上澄み液を直接使 用する。氷上で１時間インキュベーションした後、細胞を３ｍｌのＰＢＳ／ｌｌ ５Ａ中で２回洗浄し、モしてＦＩＴＣ標識化二次抗体（Ｃａｐｐｅｌｌ、　Ｄｕ ｒｈａｍ、ノースカロライナ州）およびＩＩｆ１ｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム を含有する０、　５ｍｌのＰＢＳ／ＢＳＡの中に再懸濁させる。
氷上で３０分間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳ／ＢＳＡ中で１回洗浄 し、そしてこの緩衝液中にｌ　ＸＩＯ’　／ｍｌの濃度で再懸濁させる。次いで 試料をＦＡＣ３４４０（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により分析する。
ヨウ化プロピジウムで染色した死亡した細胞を、分析においてライブ・ゲート（ Ｉｔｖｅ　ｇａｔｅ）を含めることによって排除する。
細胞の選別のために、上に概説した同一手順を使用するが、ただしすべての染色 操作を無菌のフードの中で実施する。抗体を含む溶液を濾過滅菌し、そしてシュ ネイダー培地またはエクスセル４００をＰＢＳ／ＢＳＡの代わりに使用する。− 次抗体を特別に結合する細胞を、ベクトン・ディキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｔ ｃｋｉｎｓｏｎ）細胞ソーターにより選別する。選別した細胞（８Ｘ１０’）を 培地中で１回洗浄した後、２ＸｌＯ’細胞／ｍｌの濃度でプレートアウトする。
ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞の表面上で発現されたヒトクラ ス１分子が空であることを証明するために、細胞を３７℃において２時間インキ ュベーションし、そして細胞表面の発現をサイトフルオロメトリーにより分析し た。細胞を３７℃において２時間インキュベーションする場合、ＨＬＡ　Ｂ２７ およびＡ２．１の両者の表面発現は大きく減少する；しかしながら、クラス１分 子に結合することが知られている旧ソペプチド中で細胞を前インキュベーション すると、クラス１に対する有意な熱安定性が得られるが、結合しないペプチドは ほとんど効果をもたない（第５Ａ図参照）。（旧■のＰＯＬタンパク質からの９ アミノ酸のペプチドＩＬＫＥＰＶＨＧＶ（配列識別番号３１）は結合しそして！ 化ＡＡ２．ｌを安定化する。旧ＶのＶｐｒタンパク質からの９アミノ酸のペプチ ドは結合しそしてＢ２７　（ＦＲＩＧＣＲＨ３Ｒ、配列識別番号３０）を安定化 する。これらのデータが示すように、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細 胞の表面上でヒトクラス１分子は空であり、そして特定の旧■ペプチドを結合す ることによって安定化することができる。
第５Ａ図は、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ）細胞の表面上に発現され た）ＩＬＡＢ２７およびＨＬＡＡ２．ｌの旧■ペプチドによるペプチド誘発熱安 定性を示す。ＨＬＡ　Ｂ２７またはＡ２．１を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓ ｏｐｈ　ｉ　ｌａ）細胞を示すペプチドとインキュベーションし、次いで２８℃ に維持するか、あるいは３７℃において２時間インキュベーションした後、抗体 Ｗ　６　／３２　（ＡＴＣＣＨＢＯ２から）およびサイトフルオロメトリーの使 用によりクラス１分子の表面発現を分析する。各細胞の集団の平均蛍光をインキ ュベーション条件に対してプロットして示す。ＨＩＶ　ＰＯＬ　ペプチド（ＩＬ ＫＥＰＶＨＧＶ、配列識別番号３１）　Ｇ１Ａ２．１を安定化し、Ｂ２７を安定 化しないが、旧Ｖ　Ｖｐｒ　ペプチド（ＦＲＩＧＣＲＨ３Ｒ。
配列識別番号３０）はＢ２７を安定化し、Ａ２．１を安定化しない。
第５Ｂ図が示すように、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞中で発現さ れたＨＬＡ　Ａ２．２　ＹはトリトンＸ−１００リゼイト中の空のクラス１分子 の特性を有する。Ａ２．２Ｙを発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ ）細胞から調製した放射性トリトンＸ−１００リゼイトのアリコートを取り、そ して次のようにペプチドを添加した：ＡおよびＢ：添加なし；　Ｃ：　ＨＩＭ　 ＧＡＧ（Ｂ）　ペプチドＫＲＷＩ　ＩＬＧＬＮ（配列識別番号２９）；Ｄ：イン フルエンザペプチドＩＬＧＦ’ｖ’ＦＴＬＴＶ　（配列識別番号３２）：Ｅ：ラ ンダム８マーペプチド；Ｆ：ランダム９マーペプチド。
アリコートＢ−Ｆを３７℃において１時間インキュベーションした後、Ｗ　６　 ／３２で免疫沈澱させそしてＳＤＳ　ＰＡＧＥにより分析する。
第５Ｃ図が示すように、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞中で発現さ れたＩＩＬＡＢ７はトリトンＸ−１００リゼイト中の空のクラス１分子の特性を 有する。リゼイトを第５Ｂ図におけるように、ＨＬＡ　Ｂ　７を発現するドロソ フィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞中で調製した。示すように、アリコートに ペプチドを与えない（−Ｐ）か、あるいはランダム１８マーまたは９マーのペプ チドを与えた。アリコートの半分を、Ｗ　６　／３２を使用する免疫沈澱および ＳＤＳ　ＰＡＧＥの前に、３９℃において１時間インキュベーションした。
ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞中で発現されたＨＬＡ　Ｂ　７およ びＡ２．２Ｙは、また、トリトンＴＸ１００細胞リゼイト中で熱安定性であるこ とが発見されたことにおいて、空のであることが示された（第５Ｂ図および第５ Ｃ図参照）ニジかしながら、それらは温度対抗前にリゼイトにペプチドを添加す ることによって安定化することができなかった。とくに、インフルエンザマトリ ックスがら誘導された月３８　：　２０４５−５７）は、ＨＬＡ　Ａ２．２を安 定化することを見ることができ、同様にランダム９マーはＨＬＡＡ２．２を安定 化し、また、ＨＬＡＢ７を安定化する。
ネズミクラス１について前述したように、トリトンＴＸ１００細胞リゼイトの温 度対抗アッセイを実施した。これらの研究からの結論は、ドロソフィラ（Ｄｒｏ ｓｏｐｈｉｌａ）細胞中で発現されたヒトクラス１分子が突然変異のヒト細胞系 下２中で発現された空の分子のすべての特性を有することである（Ｓａｌｔｅｒ ら、前掲（１９８５）　；　Ｈｏ５ｋｅｎおよびＢｅｖａｎ　、前掲（１９９０ ））。
実施例２ 最近のデータが証明しているように、クラス１分子はコンセンサス配列のモチー フを含有するペプチドに結合する。（参照、Ｆａｌｋら、形態に結合したペプチ ドのアミノ−およびカルボキシル−末端の残基はわずかの型のアミノ酸に限定さ れるように思われ、そしてｌまたは２以上の内部の残基は特定の位置を占有しな くてはならないことがある。さらに、クラス］結合ペプチドの全体の長さは８ま たは９アミノ酸残基に制限されるように思われる。Ｆａｌｋら、前掲（１９９１ ）　。
Ｖａ、ｎ　ＢｌｅｅｋおよびＮａｔｌ＋ｅｎｓｏｎ　、前掲（１９９０）　。ネ ズミに１分子へのペプチドの結合の検査において、オバルブミンのペプチド、す なわち、配列５ＩＩＮＦＥＫＬ　（配列識別番号２３、残基５〜１２）をもッ０ ＶＡ−８は、生体内でＫｂ分子に結合し、最適な結合のモチーフを含有し１、そ して生体外でに１′分子に強く結合する。オバルブミン分子中のこのペプチドの 配列は配列・・・ＱＬＥおよびＴＥＷ・・・によりフランキングされているので 、いくつかのプロテアーゼ、非常に広い基質特異性をもつプロテアーゼ、あるい は多数のタンパク質分解活性をもつ酵素複合体は完全なオバルブミンからの０Ｖ Ａ−８ペプチドの発生に関係するに違いないことが明らかである。
単離されたプロテアソームかに″′分子に結合する最適なペプチドを発生するか どうかを決定するために、「空の」クラスＩＫ’分子、すなわち、結合したペプ チドをもたないものが非常に熱安定性であるという発見を使用することは有用で あった（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、前掲（１９９０））。「空のＪＫ’分子を洗浄 剤中で３０℃における１時間インキュベーションは、Ｋ１分子と反応することが できないＫｂ特異的抗体Ｙ３をβ２Ｍ依存性とする。なぜなら、β２Ｍは重鎮か ら急速に解離するからである。適当なペプチド、例えば、０ＶＡ−８の結合はサ ブユニットの解離を防止して、Ｙ３をクラスｌ複合体に結合させる。生体内でに ’分子により提示されることができない０ＶＡ−８と同一長さのペプチド（例え ば、Ｄｂに結合するペプチドＳＮＥＮＭＥＴＭ（ＳｅｒＡｓｎＧＩｕＡｓｎＭｅ ｔＧＩｕＴｈｒＭｅｔ）　（配列識別番号２５、残基２−９）、Ｔｏｗｎｓｅｎ ｄら、Ｃｅ１ｌ　４４　：　９５９−９６８　（１９８６））は、Ｋ’クラス１ 分子の加熱誘発解離を防止することができなかった（第３図参照）。配列ＥＱＬ ＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＩＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥＲ（配列識別番号２３）　（、： れはｏｖ’−ａ　ｃｖ配列を包含する、下線で示す）はに１′分子に弱く結合す る。しかしながら、０ＶＡ−２４の弱い結合はにゝ−β２Ｍ複合体の３０’Ｃに おける解離を防止するために不十分であった。
使用した種々の抗血清を次のようにして調製した。Ｈ−２Ｋゝ（ＬＰＤＣＫＶＭ ＶＨＤＰＳＬＡまたはＬｅｕＰｒｏＡｓｐＣｙｓＬｙｓＶａｌＭｅｔＶａｌＨｉ ｓＡｓｐＰｒｏＳｅｒＬｅｕＡＩａ）　（配列識別番号３３）のＣ０ＯＨ末端の 配列に相当する合成ペプチドに接合されたキーホールリンペットリンホシアニン （カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）　、カリフォルニア州うジョラ）で ウサギを免痩化することによって、抗血清に１９３を発生させる。ハイブリドー マＨＢ１７６　（ＡＴＣＣ、マリイランド州ロックビレ）を使用してＹ３腹水を 調製する。（参照、また、Ｈａｍ＋ｎｅｒｌｉｎｇら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７９ 　：　４７３７−４７４１　（１９８２）。）腹水２８−１４−８３をハイブリ ドーマＨＢ２７　（ＡＴＣＣ。
マリイランド州ロックビレ）から調製する。（参照、０ｚａｔｏおよび５ａｃｈ ｓ、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１２６　：　３１７−３２１　（１９８０）；　Ｍｙ ｅｒｓ　ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ。
１４２　：　２７５１−５８　（１９８９）、）。腹水３０−５−７をハイブリ ドーマＢ２２．２４９からの培養上澄み液から調製する（参照、Ｈａｍｍｅｒｌ ｉｎｇら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　８：　４３３−４４５　（１９７９ ）；　Ａ１１ｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３０９：　２７９−８１　（１９８４）。
）精製したネズミＭＨＯに対するポリクローナル抗体をＫｖｉｓｔら、５ｃａｎ ｄ、　Ｊ、　Ｉｏｏｎｕｎｏｌ、　７：　２６５−７６　（１９７８）。ＦＩＴ Ｃ標識化二次抗体（親和精製したヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギＩｇＧ）はカ ッベル（Ｃａｐｐｅｌ＋）　（ノースカロライナ州ダーハム）から入手した。
このアッセイ系を使用して、クラス１分子上にペプチドを負荷できないＨＭＡ− ３細胞からの生合成的に標識化された「空の」Ｋ１′分子を、β２Ｍ依存性にゝ 特異的モノクローナル抗体Ｙ３とインキュベーションした。抗体結合分子を５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥにより分離し、そしてオートラジオグラフィーにより可視化する。
５ＤＳ−ＰＡＧＥは次のように実施する。プロティンＡセファローズビーズによ り集めた免疫沈澱物を１ｍｌの０．１％ＴＸ１００／ＰＢＳで５回洗浄し、そし てＳＤＳ　ＰＡＧＥ試料緩衝液中で直ちに沸騰させるか、あるいは示す場合試料 の半分をエンドグリコシダーゼＨで消化した後沸騰させた（参照、Ｊａｃｋｓｏ ｎら、［！ＭＢＯＪ、　９　：　３１３５−３１６２　（１９９０））。次いで 試料を１０〜１５％の勾配５０５　ＰＡＧＥゲル上で分析し、アンプリファイ（ Ａｍｐｌｉｆｙ）　（アマ−ジャム（Ａｇ＋ｅｒｓｈａｍ、イリノイ州アーリン トンハイツ）で処理した後、コダック（Ｋｏｄａｋ）　（−＝−ニーヨーク州ロ チェスター）　ＸＯｍａｔ　ＡＲフィルムを使用して一７０℃においてオートラ ジオグラフィーにかける。
Ｋ’鎖に相当するバンドをデンシトメトリーにより定量した。データ（示されて いない）を発生させるために、ＲＭＡ−８細胞の「空の」クラスＩＫ−分子含有 すゼイトをペプチドおよび／または精製したプロテアソームとインキュベーショ ンした後、４℃または３０℃において１時間インキュベーションした。Ｋ１′分 子をモノクローナル抗体Ｙ３で免疫沈澱させ、そし−７：　ＳＤＳ　ＰＡＧＨに より分析した。
「空の」に５分子を０ＶＡ−２４；プロテアソーム単独；０■＾−２４およびプ ロテアソーム；　０ＶＡ−２４、プロテアソーム、およびｐ−ヒドロキシ水銀ベ ンゾエート；および０ＶＡ−８とインキュベーションした。
「空の」Ｋ′′含有含有リドイト単独析した（データは示されていない）。免疫 沈澱の前に、試料を３０℃において１時間加熱対抗するか、あるいは４℃に同一 時間の間保持した（データは示されていない）。
０ＶＡ−８ペプチドを７５μＭの最終濃度で使用し、そして０ＶＡ−２４を７５ μＭの最終濃度で使用した。
４℃において一夜インキユベーションしたに１′分子は、抗体との反応性の欠如 により判定して、はとんど完全に解離したが、ＯＶＡ　−８ペプチドを含有する インキュベーション混合物から定量的に回収された。
偶数のレーンのデンシトメトリーの走査（示されていない）は、加熱対抗後に回 収されたにゝの量の決定を可能とした。データは加熱対抗後に回収にゝ／　０Ｖ Ａ−８複合体の量の百分率として表した。
０ＶＡ−８とインキュベーションしたに５分子の大部分は、３０℃の処理後に無 傷で残った。より長いペプチドの０ｖＡ−２４はＫｂ分子の安定化において０Ｖ Ａ−８と同じようには効率よくなく、モして０ＶＡ−２４の弱い結合についての 前のデータに従い、熱処理後にＫｂ分子の約３０％が残った。インキュベーショ ン混合物がＯＶＡ〜２４および精製したプロテアソームを含有したとき、増加量 のに１分子を免疫沈澱することができ、そしてＫｂ分子のほぼ８０％は３０℃へ の暴露後に生き残った。Ｋ５分子の安定性の増加は０ＶＡ−２４から誘導された １種または２種以上のペプチドのためであることは、プロテアソーム単独がリゼ イト中でに１−８２μ複合体の解離を防止できるペプチドを発生することができ なかったという事実から明らかであった。この結論は、また、開始剤ｐ−ヒドロ キシ水銀ベンゾエート（Ｒｉ　ｖｅ　ｔ　ｔ。
Ａｒｃｈ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２６８　＋　１−８　（１ ９８９））で処理したプロテアソームが、０ＶＡ−２４から、３０℃においてＫ ｂ分子を安定化することができないペプチドを発生することができないという事 実により支持される。
これらのデータが証明するように、単離されたプロテアソームは弱くＫｂ結合性 の前駆体ペプチドから１種または２種以上のペプチド発生することができ、こう してクラス１分子は内因性ペプチドによるのと同一・程度に安定化された。結局 、０ＶＡ−２４から誘導された１種または２種以上のペプチドは約８アミノ酸長 さであり、モして０ＶＡ−８ペプチドの配列を包含しなくてはならない。さらに 、変性した、還元した、およびアルキル化したオバルブミンをプロテアソームと インキュベーションした同様な実験は、また、熱安定性に５分子の回収を生じた （データは示されていない）。
８％胎児仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００μｇ／＋ｎｌ）、 およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したダルベツコ変性イー グル培地（ＤＭＥＭ、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）　、ニューヨーク州グランドアイラ イド）中でＨＬＡ細胞（ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＣＬ　１８５）。４種類の異なるＨ −２ハブロタイブの牌細胞（Ｈ−２’　、”　、’　、および９）、ＨＭＡ　− ８，ＴＩ、　Ｔ２およびネズミ星状細胞をＲＰＭＩ　１６４０（ギブコ（Ｇｉｂ ｃｏ）　、ニューヨーク州グランドアイランド）中で増殖させた。
ＨＭＡ−３、ネズミ突然変異Ｈ−２１リンパ腫細胞系（Ｌｊｕｎｇｒｅｎおよび Ｋａｒｒｅ、　Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１６２：　１７４５−５９（１９ ８５）　；Ｋａｒｒｅ呟Ｎａｔｔｌｒｅ３１９　：　６７５−８　（１９８６） ）は、内因性抗原を提示することができない（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｎａｔｕｒ ｅ　３４０：　４４３−８　（１９８９）　；　ＴｏｗｎｓｅｎｄおよびＢｏｄ ｍｅｒ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　７　：　６０１−２４　（ １９８９））　ｏ　Ｔ　ＩおよびＴ２はＴ細胞リンパ腫ＣＥＭに融合されたヒト 突然変異Ｂリンノ（芽球様細胞系ＬＢＬ　７２１．１７４　（０゜１７４）の誘 導体である（Ｓａｔ　ｔｅｒら、リッドは、０．１７４から誘導されたクラスｌ 　ＭＨＣを高いレベルで発現した。ヒト染色体６の両者のコピーの損失のために 選択したＴ２は、０、１７４の低いクラス１発現の表現型を有する（Ｈｏｓｋｅ ｎおよびＢｅｖａｎ＋細胞の代謝的標識化を、Ｊａｃｋｓｏｎら、ＥＭＢＯＪ、 　９　：　３１５３−３１６２（１９９０）に記載されているように、次の変更 を加えて実施した。特記しない限り、代謝的標識化の前に細胞をインターフェロ ンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ、ベーリンガーーＴンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ 　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インジアナ州インディアナポリス）　（２５００Ｕ／ｍ ｌ）で９６時間処理した。パルス培地は０．１５＋＋＋Ｃｉ／ｍｌのＬ　［３５ Ｓ］メチオニン欠如およびシスティン欠如ＤＭＥＭを含有した。細胞を日常的に ４時間標識化し、次いで通常の培地の存在下に異なる時間（３６時間まで）のチ ェイス期間を置いた。免疫沈澱、５ＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｌｏｂｅｌおよびＤｏｂ ｂｅｒｓｔｅｉｎ。
Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６７：　８３５−５１　（１９７５））およびフ ルオログラフィー（ＢａｎｎｅｒおよびＬａ５ｋｅｙ、　Ｂｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、　４６　：　８３−８８　（１９７４））を記載されているように 実施したＣＪａｃｋｓｏｎら、ＥＭＥＩＯＪ、　９　：　３１３５−３１６２　 （１，９９０））。第１次元の非平衡化ｐＨ勾配のゲル電気泳動（アンフォライ ンｐＨ３，５−１，０）を、Ｊｏｎｅｓ、５ｅｌｅｃｔｅｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒコ、１９８０．　ｐｐ、　３９８−４００　、に記載さ れているように実施した。タンパク質の中に組み込まれた放射能を定量するため に、ＬＫＢウルトロスキャン（Ｕｌ、ｔｒｏｓｃａｎ）　ＸＬ　（ブロク７　（ Ｂｒｏｕｍａ）　、スウェーデン国）を使用する走査デンシトメトリーにより、 フルオログラフ上のバンドの強度を決定した。放射性マーカーのタンパク質、ウ シ血清アルブミン（６７ｋＤ）　、オバルブミン（４６ｋＤ）　、炭酸脱水素酵 素（３０ｋＤ）およびラクトグロブリンＡ　（１８，４ｋＤ）をニュー・イング ランド・ニュークリアー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　（デュ ポン、ボストン、マサチュセッツ州）から購入した。
パルスチェイスの分析のために、輸送の分析に使用する抗体の数に依存して種々 の時点からのリゼイトのアリコートを管の中に取った。抗体（１μＩの腹水、Ｙ ３．３０．５．７．２８：１４：　８Ｓ　；Ｗ６／３２）、または抗血清（Ｋ　 １９３．　Ｋ　２７０）、１００ｍ１のハイブリドーマ培養上澄み液をリゼイト に添加する；次いでこの混合物を２〜１２時間放置した後、プロティンＡセファ ローズとの１時間のインキュベーションおよびマイクロラージ中の５秒の回転に より抗体を集める。
３、抗血清、モノクローナル抗体およびペプチドウサギ抗ヒトおよび抗ラットプ ロテアソーム血清は、Ａ、Ｉｃｈｉｈａｒａ博士により提供された（Ｔａｎａｋ ａら、Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｐｙｓｉｏｌ、　１３９：　３４−４１（１９８６） ）。Ｙ３腹水、マウスＨ２−に１′に対するモノクローナル抗体を、ＡＴＣＣか らのハイブリドーマｎｏ、　１１８１７６を使用して調製した（Ｈａｍｍｅｒｌ ｉｎｇら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７９　：　４７３７−４７４１　（１９８２）） 、ヒトＴリンパ球からのＩＦＮ−ガンマをベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈ ｒｔｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）　（インジアナ州インディアナポリス）から入 手した。マウスＩＦＮ−ガンマをジエネテク（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）　（カリフォ ルニア州すウスサンフランシスコ）およびアムゲン・バイオロジカルス（Ａｍｇ ｅｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）　（カリフォルニア州すウザンドオークス）から 入手した。ペプチドをアプライド・バイオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｗ＋５）４３０Ａペプチド合成装置で固相技術により合成し、そして さらにＣ１，逆相カラムクロマトグラフィーのカラム（ｖｙＤａｃ）で精製した 。
４、ＨＬＡ細胞ホモジネートの硫酸アンモニウムの分画未処理のおよびＩＦＮ− ガンマ処理した均質化ＨｅＬａ細胞を遠心して核および細胞破片を除去し、そし て生ずる上澄み液を記載されているように硫酸アンモニウムの分画にかけた（Ｒ ｉｖｅｔｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ、　２６０　：　１２６００−１２６１２　（１９８５））。上澄み液 の中に存在する２６Ｓプロテアソ一ム複合体を３８％の飽和において硫酸アンモ ニウムで選択的に沈澱させたが、上澄み液の中に存在する１９Ｓプロテアソ一ム 複合体は３８％の分画工程後に６０％の飽和において沈澱させた（Ｗａｘｍａｎ ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ＋、　２６２：　２４５１−５７　（１９８７）） 。
５、ミクロソームおよび細胞質ゾルの分画未処理のおよびＩＦＮ−ガンマ処理し たｌ１ｅＬａ細胞を４時間標識化し、均質化し、そして分画遠心分離にかけた。
ホモジネートをまず１５、０００ｒｐｍにおいて３０分間回転して核および細胞 破片を除去した。
生ずる上澄み液を次いで１００，０００ｘ　ｇで３０分間回転してミクロソーム を沈澱させた。上澄み液画分（細胞質ゾルの画分）およびベレット（粗製のミク ロソーム００画分）中のプロテアソームを別々に免疫沈澱させ、そして２次元の ゲル電気泳動により分析した。
６、プロテアソームの精製 ５ｋｉｌｔｏｎら（１９９１）に記載されている手順の変更を使用して、新鮮な ウシ肝臓からプロテアソームを精製した。簡単に述べると、新鮮なウシ肝臓をｌ ｏ＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，２）、　５０ｍＭ　ＫＣｌ、　０．１ ｍＭ　ＥＤＴＡ。
０、　Ｉｎ＋Ｍ　ＤＴＴ　、および２０％グリセロール（ｖ／ｖ）（ｒ緩衝液Ａ Ｊ）中で均質化した。ホモジネートを１０５，０００ｘ　ｇで１時間遠心した。
上澄み液をまず硫酸アンモニウムで３８％の飽和に処理して、大きいタンパク質 凝集物ならびにプロテアソームの２６８の形態を除去した（Ｗａｘｍａｎら、Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：　２４５１−５７　（１９８７））。次 いで生ずる上澄み液を硫酸アンモニウムで６０％の飽和に処理して、プロテアソ ームの１６３の形態を選択的に沈澱させた。ペレットを小さい体積の緩衝液Ａの 中に再懸濁させた。再懸濁させた６０％の硫酸アンモニウム画分を３つの順次の クロマトグラフィ一工程にかけた：　ＤＥＡＬ！−セファローズ（Ｓｅｐｈａｒ ｏｓｅ）、モノ（Ｍｏｎｏ）　ＱＩＯ／１０のアニオン交換クロマトグラフィー 、そして最後にスペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　６カラムのゲル濾過。各クロ マトグラフィー後、プロテアソーム含有画分を５ＤＳ−ＰＡＧＥによりおよびＨ Ｏｕｇｈら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：　８３０３−８３１３　 （１９８７）に記載されているようにペプチダーゼ活性の分析により同定した。
使用したペプチド基質は次の通りであった二Ｎ−スクシニル−ａｌａ　−ａｌａ 　−ｐｈｅ　−ＭＣＡ、Ｎ−スクシニル−１ｅｕ　−１ｅｕ　−ｖａｌ　−ｔｙ ｒ　−ＭＣＡ　、およびｔ−ブトキシカルボニル−ｐｈｅ　−５ｅｒ　−ａｒｇ 　ＭＣＡ　。
７、ペプチドの結合アッセイ ＲＭＡ−３細胞の「空の」クラスＩＫ’分子含有すゼイトを変更された手順（Ｌ 　ｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３４６　：　４７６−８０　（１９９０ ））　。簡単に述べると、ＲＭＡ−３細胞をＲＰＭＩ　１６４０中で２６℃にお いて８時間培養した。次いで細胞をＰＢＳ中で１回すすぎ、そして再び１０：１ の比のメチオニン欠如およびシスティン欠如ＲＰＭＩ　１６４０および通常のＲ ＰＭ１１６４０の中に０．２５ｒｎＣｔ／ｍｌのＬ−Ｅ”Ｓコメチオニンおよび ０．２５ｍＣ１／ｍｌのＬ−［”Ｓ］　システィンを含有する培地中で２６℃に おいて１６時間インキュベーションした。細胞をＰＢＳ中ですすぎそして前述し たように溶解した。次いで「空のｊクラスＩＫ’分子含有すゼイトをペプチドお よび／または精製したプロテアソームと２６℃において１時間インキュベーショ ンした後、３０℃においてさらに１時間インキュベーションした。次いでこの混 合物をモノクローナル抗体Ｙ３で免疫沈澱させ、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより 分析した。
実施例３ ＳＣ２および３Ｔ３細胞へのオバルブミンタンパク質の浸透圧的負荷を、Ｍｏｏ ｒｅら、Ｃｅ１ｌ　５４　：　７７７−７８５　（１９８８）に記載されている ように実施した。アッセイの手順は次の通りである。９６ウヱルの皿において、 ｌＸｌ０’のドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞（負荷したペプチド／ タンパク質を含むか、あるいは含まない）または３Ｔ３細胞を、１０％胎児ウシ 血清を補充した２００μｍのＲＰＭＩ培地中で、ｌＸｌ０ＬＢ　３　／ＣＤ８Ｔ 細胞ハイブリドーマ細胞と同時培養した。２４時間のインキュベーション後、こ れらの培養からの１００μｌの上澄み液を５、０ＯＯＣＴＬＬ細胞を含有する１ ００μｍのＲＰＭＩに添加した。ｌμＣｉの３Ｈ−チミジン（アマ−ジャム（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ））を添加したとき、細胞を３７℃において２４時時間待培養し た。３７℃においてさらに１５時間インキコベーションした後、ＣＴＬＬ細胞の 中への放射線標識の組み込みをシンチレーションカウンティングにより決定した 。
ネズミＭＨＣを使用して実施したアッセイは、また、昆虫細胞がクラス１分子上 にペプチドを負荷できることを評価した。特定の抗原を含有するＭＨＣ細胞を２ ００〜５００程度に少ない数で発現する細胞を、Ｔ細胞により検出することがで きる。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞はクロムを蓄積しないので、 Ｂ３／ＣＤ８．７細胞ハイブリドーマに基づく抗原提示アッセイを使用した。Ｂ ３／ＣＤ８は、Ｂ３．Ｈ−２に１クラス１分子により提示されるオバルブミンの ペプチド２５３−２７６に対して特異的な細胞障害性Ｔ細胞、およびＣＤ８を有 するＩＬ−２分泌細胞系の間のハイブリドーマである（参照。Ｃａｒｂｏｎｅら 、前掲、１９８９）　、抗原性刺激したとき、Ｂ３／ＣＤ８は、ＩＬ−２依存性 細胞系ＣＴＬＬ中の３Ｈ−チミジンの組み込みにより測定して、ＩＬ−２を生産 する（Ｇｉｌｌｉｓら、Ｊ、　ＩｎＩＩｎｕｎｏｌ、　１２０−：　２０２７９ １９７８））。こうして、ＩＬ−２の生産量を測定することによって、Ｔ細胞の 認識によりアッセイすることができる。
Ｏｖ＾ペプチドを誘導できるオバルブミンタンパク質の細胞内プールを得るため に、オバルブミン（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ！Ｉ＋ １ｃａｌ　Ｃｏ、）　、ミゾリー州）を、１Ｊｏｏｒｅら、前掲（１９８８）に 記載されているように、細胞の中に浸透圧的に負荷した。負荷直後に、細胞をＴ 細胞ハイブリドーマと混合した。２日のインキュベーション後、培地を除去し、 そしてＩＬ−２についてアッセイした。
ｒＬ−２依存性細胞系ＣＴＬｉ、の増殖を支持する培地の能力によりＩＬ−２の 量を決定しくＧ１１１ｉｓら、前掲、１９７８）　、そして細胞の中に組み込ま れた放射性チミジンの量により増殖を定量した。第４図において見ることができ るように、オバルブミンベブチドを培地に添加した場合、Ｔ細胞はドロソフィラ （Ｄｒｏｓｏｐｂ　ｉ　Ｉａ）細胞に対してよく応答したが、細胞にオバルブミ ンタンパク質を負荷した場合、認識は起こらなかった。昆虫細胞の細胞表面上で 発現されたＭＨＣクラス１分子は、ペプチドを培地に添加した場合ペプチドに結 合することができ、モしてＴ細胞により認識されるように正しい関係でペプチド を提示することができることにおいて、完全に機能的である。
Ｂ、生体外条件の最適化 特定の細胞障害性Ｔ細胞の発生のための生体外条件を最適化するために、ドロソ フィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞刺激因子の培養は好ましくは血清不含培地 （例えば、エクスセル４００）中で維持される。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ ｉｌａ）細胞の刺激因子の細胞を好ましくは＞２０ｕｇ／ｍｌのペプチドとイン キュベーションする。有効なエフェクター：刺激因子の比（リンパ球：ドロソフ ィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の比）は、好ましくは約ａＯ，：Ｘ〜３００ ：ｌの範囲である。一般に５日の培養後に、最大の特異性のＣＤ８は観察される 。死滅アッセイについての標的細胞の培養は、好ましくは、血清不含培地中で維 持する。
Ｃ，”Ｃｒ解放細胞障害アッセイ 細胞仲介細胞溶解活性をＣ，＆　ｌまたは解放アッセイで検出した。
２００μ】中の１０’の５ＩＣｒ標識化標的細胞の比溶解の百分率を種々のリン パ球／標的細胞の比について決定し、そして比細胞障害性／生存能力のあるエフ ェクターの数をプロットすることによって、各リンパ球の集団に・ついて線量一 応答曲線を決定した。自発的＠ｌに、解放値は合計の組み込まれた標識の５％〜 １５％であった。比″Ｃｒ解放の百分率を次式に従い計算した：　（ＥＲ−ＭＲ ）　（ＭＲ−３ｌｌ）　Ｘ１００　、ここでＥＲは観測された実験的６１（：、 解放であり、ＳＲは培地単独中でＴ細胞系をインキュベーションすることによっ て決定された自発的解放であり、モしてＭＲはアッセイの間にＨＣｌ中の２００ μｌ中でインキュベーション後に標的細胞から解放された最大放射能である。
Ｄ、ネズミクラス１およびペプチドを発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ）細胞を使用する一次生体外刺激による細胞障害性エフェクターの誘発 ペプチドＯＶＡ、　ＮＰ（インフルエンザ）およびＮＰ）　ＬｃＭＶ）をペプチ ド源として使用して、−次生体外ＣＤ８応答を発生ずるそれらの能力を評価した 。（第６Ａ図および第６Ｂ図参照。）それぞれ、）（２−に’十抗原およびＨ２ −Ｌ’十抗原を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）細胞で免疫 化したＣ５７ＢＬ／　６およびＢａ１ｂ／Ｃマウスからの牌細胞の５日間のイン キュベーションは、ペプチドの存在下に腫瘍ＥＬ４およびＰ８１５を効果的に溶 解するエフェクターを発生した。
Ｐ８１５（ＡＴＣＣＲＩＢ　６４）　（Ｈ−２’　）はＤＢＡ／　２マウスから の肥満細胞種である。ＩＬ４　（ＡＴＣＣＴＩＢ　３９）はＣ５７ＢＬ／６　（ Ｈ−２”　）から胸腺腫である。ＩＬ４をヒトβアクチンプロモーターをもつプ ラスミド構成体中でＯＶＡ　ｃＤＮＡでトランスフェクションして、ＯＶＡ生産 細胞系ＥＬ４−ＯＶＡを誘導する。これらの腫瘍はｌＯ％胎児ウシつ清ＦＢＳを 補充したＲＰＭＩ　１６４０中で静止懸濁培養物として維持する（参照、Ｍｏｏ ｒｅら、Ｃｅ１ｌ　５４　：　７７７−７８５　（１９８８））、　Ｊｕｒｋａ ｔ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　８１６３）はＨＬＡＢ７を発現するヒト細胞系である。
ＪｕｒｋａｔＡ　２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞をＨ［、ＡＡ２−１で、例えば、ここ に開示する方法によりトランスフェクションすることによって生産されたヒト細 胞系である。（参照、また、Ｉｒｗｒｎ　ら、Ｊ、Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、１７０： 　２０９１−１１０１　（１９８９乃。
合成ペプチドはＣＤ８の認識の間に内因的に合成されたウィルスのタンパク質と 置換することができる。発生した特異的ＣＤ８は、ＩＬ４（オバルブミンｃＤＮ Ａでトランスフェクションした）の表面においてクラスｌにより提示された内因 的に合成されたペプチドを認識することができた。（参照、Ｍｏｏｒｅら、Ｃｅ １ｌ　５４　：　７７７−７８５　（１９８８）、）同様に、インフルエンザＮ Ｐペプチドを負荷したＤｂに対して生体外で発生したＣＤ８は、インフルエンザ ウィルス株／Ａ／ＰＲ／８で感染したＥＬ４標的細胞を認識した（第７図参照） 。（参照、ＣａｒｂＯｎｅら１、Ｊ、　ＥＸＩ）、　Ｍｅｄ、　１６７：　１７ ６７−１７７９　（２９８８）　；株Ａ／ＰＲ／　８　／３４は、また、アメリ カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手可能であり、そして受け入れ番号ｎ ｏ、　ＡＴＣＣ’／Ｒ−９５）。
Ｅ、抗ペプチド細胞障害性細胞の特性決定ペプチド特異的認識がＴ細胞活性のた めであるかどうか決定するために、これらの系統を抗ＣＤ８　（ＯＫＴ８　、　 ＡＴＣＣＮｏ、　ＣＲＬ　８００１）または抗ＣＤ４　（ＯＫＴ４　、　ＡＴＣ ＣＮｏ、　ＣＲＬ　８００２）および／または相補体で処理した後、それらをア ッセイ培養物に添加した。抗ＣＤ８処理のみが細胞障害性を壊滅した。
これらの特異的ＣＤ８を、それぞれ、Ｄ５またはにゝでＢＡＬＢ　３Ｔ３（ＡＴ ＣＣ，ＣＣＬ　１６３）細胞をトランスフェクションすることによって生産され た３Ｔ３／　Ｄ　”および３Ｔ３／　Ｋ　’細胞上で試験した。（他の容易に入 手可能な３Ｔ３培養物は、また、使用のために入手可能であり、ＡＴＣＣＣＣＬ 　１６３．２を包含する。）好ましくは、安定なトランスフェクション体は３Ｔ ３をｐｃＭＵ／　Ｋ　ｂまたはｐＣＭυ／Ｄ＋′およびｐｓＶ２ｎｅｏにより共 トランスフェクションして調製され、そして６４１８で選択する。
（参照、また、Ｊｏｌｙおよび０１ｄｓｔｏｎｅ、前掲（１９９１））。抗０Ｖ ＡＣＤ８の応答はＤｂまたはに′制限され、これらの活性が古典的クラス１ＭＨ Ｃ制限を示すことを確証する。
ペプチドの刺激によりＣＤ８を誘発する能力は、クラスｌ制限された認識を研究 する、比較的簡単な技術を提供する。Ｔ細胞は自然の形態または外来抗原よりむ しろ変性された形態に対して特異的であるので、ペプチドは有効なワクチン接種 の潜在的手段を表す。
Ｆ、特異的ＣＤ８細胞の発生 ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）細胞のペプチドクラスＩ複合体をグ ルタルアルデヒド０．００１％で固定し、次いで洗浄しそしてリンパ球同時培養 において刺激因子として使用した。非常に弱い細胞障害活性は５日の同時培養後 に検出され、生きている（すなわち、固定されない）ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏ ｐｈｉｌａ）細胞が特異的ＣＤ８の発生において優れることを確証する。固定さ れた細胞に１０％のドロソフイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）培養物を添加す ると、特異的ＣＤ８の発生が回復する。
（第８Ａ図および第８Ｂ図参照。） シンジエネイッククラス１抗原を発現する培養した細胞は、通常−次培養におい てＣＤ８を活性化することができず、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ） 細胞の培養上澄み液の添加後、特異的ＣＤ８を発生することができた。
応答体の集団からＣＤＪ＋およびクラス■子細胞を除去すると、ドロソフィラ（ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞上に負荷されたペプチドで発生するＣＤ８活性を減 少する。こうして、ペプチド負荷ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞に より誘発された一次応答はＣＤｄ＋細胞およびクラス■依存性であるように思わ れる。
実施例４ この中に開示する方法を使用して、今回、本発明の特異的、活性化ＣＤ８細胞を 使用してヒトにおいて標的細胞を特異的に殺すことが可能である。本質的に、処 理方法は次の工程を包含する：　（１）処置すべき個体からＴ細胞を含有する試 料を得る；　（２）空のクラスＩ　ＭＨＣ細胞に抗原性ペプチドの少なくとも１ つの種を負荷し、ここでペプチドは標的細胞から誘導されたペプチドの少なくと も一部分に対して実質的に相同性である；（３）Ｔ細胞を生体外で活性化ＣＤ８ 細胞を生産するために十分な量のペプチド負荷クラスＩ　ＮＨＣ細胞と混合する ；　（４）活性化ＣＤ８を培養物から収穫する；そして（５）処置すべき個体に 活性化ＣＤ８細胞を投与する。
この方法はマウスのモデルにおいて有望な結果を既に示している。
例えば、１つの研究において、Ｃ５７ＢＬ／　６雌マウス（約６〜８週齢）のち ょうど耳の背後に、３　ＸＩＯ’　（３ＭＭ）　ＥＬ４１０ＶＡ腫瘍細胞を皮下 注射した。腫瘍細胞をＣ５７ＢＬ／　６マウスの中で単一の継代により腫瘍発生 性とした。ＥＬ　４１０ｖＡ腫瘍細胞を皮下接種する日に、マウスにドロソフィ ラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　／　Ｋ　’　１０ＶＡ刺激ＣＤ８細胞を腫瘍細胞 注射部位の隣に（近位に）注射するか、あるいは静脈内に注射した。
第８日に、腫瘍の寸法を測定した。３ＭＭ腫瘍細胞のみを与えた５匹の対照マウ スは１２ｍ＋ｏＸ　１２＋ｎ＋ｎの大きさの腫瘍を有した。腫瘍細胞および２４ ＭＭＣＤ８細胞注射ｖ１を受けた３匹のマウスを検査した；腫瘍の大きさはそれ らのマウスにおいて（ａ）　２ｍ＋ｏｘ　２ｍｍ、（ｂ）　５ｔ＋ｍｘ　５　ｍ ｍ、および（ｃ　）　］、２ｏ＋ｍＸ　１２＋ｎｍであった。腫瘍細胞および腫 瘍注射部位の隣に２４ＭＭ　ＣＤＢ細胞を受けた５匹のマウスを検査した。結果 は次の通りであった：　（ｉ）３引きのマウスは第８日に検出可能な腫瘍を有し た；　（ｉｊ）　１匹のマウスは工ＩＩＩＩＯ×ＩＩＩＩＩ１１の大きさの腫瘍 を有した；そして（正）１匹のマウスは５ｍｍＸ５ｗ＋ｍの大きさの腫瘍を有し た。
第１１日に、腫瘍の大きさは次のように決定された：引き続く検査において、種 々の養生法を適用した後、マウスにおける腫瘍の体積を測定した。前述したよう に、マウスに３Ｘ１０’（３ＭＭ）　ＥＬ　４１０ＶＡ腫瘍細胞を注射した。Ｅ Ｌ　４１０ＶＡ腫瘍細胞を皮下接種した日に、下表２に記載するように、マウス をドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）　／Ｋｂ１０ＶＡ刺激ＣＤ８で腹腔内 、皮下または静脈内に注射した。第６．　８．１０．１２および２０日に腫瘍体 積を測定した。
５匹のマウスを各実験群および対照群に含めた。結果を下表２に記載する。
表２ １Ｐ＝腹腔内、　ｒｖ＝静脈内、ＳＣ＝皮下：＊−大きさ、または動物の死亡の ために測定困難 Ｂ、インフルエンザの処置 例えば、インフルエンザ特異的ＣＤ８集団はこの中に開示する技術に従い発生す ることができ、そして致死的インフルエンザ感染に対して個体を保護するとき有 効であることを証明することができる。
生体外のペプチドのプライミングから誘導されたウィルス反応性ＣＤ８は生体内 の保護を提供することができ、そして主として生体外のＣＤ８の刺激は広範な種 類の抗ウィルスおよび抗レトロウィルスのワクチンのデザインにおいて有用であ ることを証明することができる。
５０Ｘ１０’　ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　Ｉａ）細胞の腹腔内（ＩＰ） 注射は、特異的ＣＤ８の誘発に導いた。このプライミングの検出は制限希釈分析 を使用して実施した。ＯＶＡに対して特異的なＣＤ８の頻度は自然のマウスにお いて約１０’であった。ペプチドで被覆したドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ 　Ｉａ）細胞を注射した後、頻度は約１Ｏ−３である（データは示されていない ）。
第８Ａ図および第８Ｂ図はトランスフェクションしたドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏ ｐｈｉ　ｌａ）細胞を使用する生体内のプライミング図解しており、ここで応答 体はＣ５７ＢＬ／　６マウス胛細胞である。第８Ａ図において、細胞の一部分を 固定する；第８Ｂ図において、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞のす べては固定されていない。
二次的ＣＤ８応答のために、Ｃ５７ＢＬ／　６マウスをドロソフィラ（Ｄｒｏｓ ｏｐｈｉ　ｌａ）細胞（５ＸＩＯ’）の１回の腹腔内注射によりプライミングし 、そして免疫化後５〜１５日に試験した。（第８Ｂ図参照。）活性化ＣＤ８の生 体内誘発は腫瘍の拒絶を明らかに刺激する。
他の実験において、Ｃ５７ＢＬ／　６マウスを３　ＭＭ　ＥＬ４０ＶＡで皮下注 射した。５日後、群■のマウスにに’、１０ＶＡを発現する５０ＭＩＪ　（生き ている）ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞を皮下注射した；群■ マウスにに’１０ＶＡをもツ５０ＭＭ固定ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ）細胞を皮下注射した；群■マウスは対照群であり、そして第５日に追加の注射 を与えなかった。この実験の結果を第９図に図解されでおり、これは群■のマウ スが最も長い期間生存しかつより大きい数で生存したことを示す。
一次ＣＤ８をＢ６アンブライムドマウスにおいてドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ 　ｉ　ｌａ）細胞中のペプチド負荷クラス１により誘発した。
ＣＤ８細胞を生体外でドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＞細胞で１回刺激し 、２２℃において３６時間培養し、異なる濃度のＯＶＡペプチドとインキユベー シゴンした。ペプチドの最終の最小量は約２０μｇ／ｍｌであった。
エフェクターを収獲し、モしてＲＭＡ−Ｓ細胞上で５０μｇペプチドで試験した 。ＣＤ８細胞の集団はＨＭＡ−３０ＶＡ−８を認識することができた。（第６Ａ 図および第６Ｂ図参照）。
他の実験において、オバルブミンタンパク質をエンドプロテイナーゼＧｌｕ−ｃ （黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈ、　ａｕｒｅｕｓ）から、（ベーリンガー・マン ヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インジアナ州インディア ナポリス）で分解した。この混合物をネズミＭ）ＩＣをもつドロンフィラ（Ｄｒ ｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞培養物に添加した。約５日後、ＣＤ８細胞をエフェ クターに暴露した；ある数のＣＤ８細胞はＲＭＡ−５０ＶＡ−８を認識すること ができた。
Ｄ、Ｉ的細胞レベルにおけるペプチドの滴定最近の研究は、９アミノ酸の長さの ペプチドが合成ペプチドの調製物の中に少量の種として存在することを証明した 。９アミノ酸より長いものは低い親和性でＨ−２Ｋ”クラスｌ　ＭＨＣ分子に結 合する。
ペプチドの滴定実験において、１６７−のペプチドより５０倍低い濃度の９マー のペプチドはＴ細胞の応答の誘発のために十分であることが示された。同一ペプ チドの滴定を標的細胞の感作について実施した。結果は、標的細胞の感作が生体 外の応答の誘発に要求されるより約１０００倍低いペプチド濃度で達成されるこ とを示す。
Ｅ、トランスジェニックマウスにおけるＣＤ８の発生この研究において、ＨＬＡ 　Ａ２．１．　）ＩＬＡ　１１７、およびＨＬＡ　Ｂ２７を発現するトランスジ ェニックマウスを使用した。マウスの牌細胞をシンジエネイックＨＬＡ　（それ ぞれ、Ａ２．１．　Ｂ７　、およびＢ２７）を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓ ｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞と培養した。特異的ＣＤ８の応答はＨＩＶの３つのペプ チドに対して発生された。（第１０Ａ図、第１０Ｂ図および第１０Ｃ図参照。） 同系交配マウスＣ５７ＢＬ／　６　Ｖ　（Ｈ２ゝ）およびＢａ１ｂ／　Ｃ（Ｈ２ ’　）マウス、ならびに種々のトランスジェニックマウスをこれらの研究におい て使用する。トランスジェニックマウスは次のものを包含した。簡単に述べると 、ゲノム）ＩＬＡ−８７クローン（５′および３′フランキング領域の数１００ 塩基対を含む）をＢＯＸ　Ｓ几マウス胚の中にマイクロインジェクションする（ スクリップス・リサーチ・インスチチュート・トランスジェニック・ファシリテ ィ（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅ５−ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｔｒａｎｓｇ ｅｎｉｃ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、カリフォルニア州うジョラ）。Ｂ７）ランスジ ェニック系統はＣ５７ＢＬ／６　（Ｈ２”）に戻し交雑されている（スクリップ ス・リサーチ・インスチチュート・トランスジｚ　ニックｅファシリティ（Ｓｃ ｒｉｐｐｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＩｎｓＬｉｔｕｔｅＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｆ ａｃｉｌｉｔｙ）、カリフォルニア州うジョラ）。Ｂ７トランスジエニツクマウ スは既知の方法に従い生産することができる；われわれのものはゲノムクローン をＢ６Ｘ　Ｓ几胚の中に注入し、そしてそれらをＣ５７ＢＬ／　８に戻し交雑す ることによって生産された（スクリップス・リサーチ・インスチチュート・トラ ンスジェニック・ファシリティ（Ｓｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔ ｉｔｕｔｅ　Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、カリフォルニア州う ジョラ）。（参照、また、ＫｒｉｍｐｅｎｆＯｒｔら、する他の方法について。
）。β２ミクログロブリントランスジェニックマウスおよびトランスジェニック Ａ２−１マウスは、既知の技術を使用して同様な方法で生産する（参照、例えば 、　ｌｒｗｉｎら、血清反応陰性のドナーからのＰＢＬを、２つのＨＸｖペプチ ドに対して特異的なＣＤ８を発生するそれらの能力について試験した。これらの ドナーは）ＩＬＡ　Ａ２．　ＨＬＡ　Ｂ７またはＨＬＡ　８２７である。５日間 の培養後、非常に強いＣＤ８活性が培養物中に両者旧■ペプチドに対して検出す ることができた。（第１１Ａ図、第１１Ｂ図、および第１１ｃ図参照。）ヒトＰ ＢＬをフィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配遠心（フ ァーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャーシイ州ビスカタエイ）により 単離する。ＰＢＬリンパ球を１０％ＤＭＳＯを含有するＰＨ３中で凍結後、液体 窒素の中に貯蔵する。細胞の生存能力およびリンパ球の機能は保存される。
ペプチドに対して特異的なＣＤ８細胞を、シンジェネイックペプチドクラスｌ複 合体を発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞とのシンジェネ イックー次培養において発生させる。これらの培養は、７％ＣＯ，中で３７℃に おいて直立２５ｃｍ２フラスコ中の５ＸＩＯ−’Ｍ　β−メルカプトエタノール を補充した２０ｍ１のＲＰＭ　Ｉ　１６４０培地中においてヒトマウスまたはヒ トＰＢＬの３ＸＩＯ’応答性牌細胞および生きている】０６　ドロソフィラ（Ｄ ｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞を使用して確立される。
５日間の培養後、ＣＤＩＨ胞を収獲する。
他の実験において、ヒトＰＢＬを収獲し、そして５日の期間にわたってヒトＩＩ ＬＡ　Ａ２．　ｌを発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞で刺激 し、そして旧Ｖ　ＰＯＬペプチドを負荷した。次いで刺激したＰＢＬを旧■感染 したＪｕｒｋａｔ　Ａ２．１細胞上で試験した。この実験の結果を第１２図に示 す。生体外で刺激したヒトＰＢＬは明らかに感染し細胞上のＡ２．ＩＰＯＬを認 識し、そして前記細胞を殺すことができた。
実施例５ Ｈ−２に′　：実施例１．Ｂにおいて前述したように調製した。
Ｈ−２に′ｓｏｌ：に’　ｓｏｌ　ｃＤＮＡはＫｂの誘導体であり、そして既知 の方法、例えばＥｎｎｉｓら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７　：２８３３−７（１９ ９０）およびＺｅｍｍｏｕｒら、ＴｍｍｕｎｏｇｅｎｅＨｃｓ　３３　：　３１ ０−２０（１９９１）に記載されている方法に従うＰＣＲにより突然変異させる ことができる。詳しくは、−アミノ酸位置＋２７５におけるアルファドメインの 末端に停止コドンが挿入された切頭に１分子をエンコードするｃＤＮＡを、ｐｃ ＭＵ発現プラスミドからＢａｍＨＩ断片として切除し、そしてに’ｃＤＮＡとし てｐＲｍＨａ　−３の中にクローニングする。Ｋ’　ｓｏｌ　ｃＤＮＡは完全な に’　ｃＤＮＡ　（上を参照）の誘導体であり、５ｔｙｒに示すを包含する５′ オリゴヌクレオチド、および次の３′オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ反応 において鋳型として使用される： ５’　ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧＣ３ ’（配列識別番号３４） 生ずるＰＣＲ断片を平滑末端とし、ｐＢＳ（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅ ｎｅ）、カリフォルニア州うジョラ）のＳｍａ　ｒ部位の中にクローニングし、 配列決定し、そしてに１の残りの５′配列を５ｔｙ１部位の中にクローニングす る。完全なＫｂｓｏｌタンパク質をエンコードするｃＤＮＡは、Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ 制限断片として得ることができた。
Ｈ−２Ｄ’および１（−２Ｌ’は上の実施例１．Ｂ、に記載するように調製する 。
Ｋゝα］α２α３ドメイン（２７４残基）およびネズミβ２ミクログロブリン（ ９９残基）をエンコードするｃＤＮ＾を、それぞれ、メタロチオネインプロモー ターｐＲｍＨａ　−３を収容する発現ベクターの独特Ｂａｎ＋ｔ（Ｉ部位の中に クローニングした（Ｂｕｎｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。
１６　二１０４３−１０６１（１９８８））。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ）　Ｓ　２　／Ｍ　３細胞を、従来記載されたリン酸カルシウム沈澱法によ り、プラスミドｐｈｓｈｓｎｅｏ　（ネオマイシン耐性遺伝子を含有する）に加 えてこれらの組換えプラスミドで形質転換した。ネオマイシン類似体の抗生物質 Ｇ４１８に対して選択された形質転換した細胞を血清不含培地中の２７℃におい て増殖させ、そして可溶性重鎖にゝβ２ミクログロブリンＷＯＯ，７ｎＭ　Ｃｕ ５Ｏｔの添加により共発現した。Ｋ１の可溶性のアセンブリングされたヘテロダ イマーを、培養上澄み液から、アフィニティクロマトグラフィーにより抗Ｋｂモ ノクローナル抗体Ｙ３を使用して、次いでファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｔａ） モノ（Ｍｏｎｏ）　ＱＦＰＩ、Ｃカラムのイオン交換クロマトグラフィーにより 製造業者（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニュージャーシイ州ビス力タ エイ）の指示に従い精製した。Ｋ５調製の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電 気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）および引き続くクーマツシーブルーによる染色は、 約３２．０００における相対的分子量（Ｍｒ）の１つのバンドおよび検出可能な 不純物を含まない約１．２，０００におけるＭ「の１つのバンドのみを示した。
高度に精製したＫｂをリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）に対して透析し、濾過滅菌し、 そしてそれ以上の研究のために使用した。可溶性に’（ｒＫゝＳｏｌ　Ｊ　）タ ンパク質（４３，２ｋＤａ）の吸光係数は、２８Ｏｒ＋＋＋＋において６９．２ ００Ｍ　−’　ｃｒｎ−’である。
Ｉ％ＴＸ−１００を含むか、あるいは含まないＰＢＳ中の精製したＫｂ溶液（０ ，３μＭ）を変化する温度（すなわち、４℃、２３℃、３２℃、３７℃、４２℃ 、および４７℃）に１時間暴露した。次いでタンパク質をモノクローナル抗体Ｙ ３およびプロティンＡセファローズビーズ（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ）、ニュージャーシイ州ビス力タエイ）と４℃において、それぞれ、インキュベ ーションすることによって免疫沈澱した。試料を１２，５％５ＤＳ−ＰＡＧＥに より分析し、次いでクーマツシーブルーで染色した。ゲル上の２つの厚いバンド は抗体Ｙ３の重鎮および文字コードである。他の手順において、Ｋゝｓｏｌ　（ ０，３μＭ）をＰＢＳ中で２３℃において５０μＭのペプチドと２時間インキュ ベーションして、Ｋ’５ｏｌ−ペプチド複合体を形成させた。１％ＴＸ−１００ の添加後、試料を１２℃、３７℃、または４７℃の温度に１時間暴露した。
前述したように、複合体を免疫沈澱させ、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し た。第３手順において、Ｋｌ′ｓｏｌ　（２，７μＭ）を、それぞれ、５０ｕＭ （Ｄ　ＯＶＡ　−８、ｖｓｖ−ｓまたは５ＥＶ−８ペプチドと２３℃において２ 時間インキュベーションした。試料を５％ポリアクリルアミドＩＥＦゲル上の適 用した。　ＩＥＦをｐＨ５〜７から展開し、そしてゲルを銀で染色した。
次に、　ｖｓｖ−ｓペプチドをクロラミン−Ｔ法（Ｈｕｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒ ｅ１９４　：　４９５−６（１９６２）　）を使用して放射線標識化しそして遊 離１″ＩをＣＩＩカラム（ＯＰＣカートリッジ、アプライド・バイオシステムス （Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　、カリフォルニア州フォスターシ ティ−）により除去した。標識化ペプチドをＣ１逆相ＨＰＬＣによりさらに精製 した。溶離後、標識化ペプチドを凍結乾燥し、そしてＰＢＳの中に再懸濁させた 。２７４ｎｌＩＩにおいてチロシンの吸光係数（１４２０Ｍ−’ｃｒ’）を使用 して、［目Ｊ］ＶＳＶ−８（約２５０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）　Ｃ７）比活性を分光光 度測定的に決定した。第１に、Ｋ’　ｓｏｌ　（０，５μＭ’）を［”’　Ｉ　 ＥＶＳＶ−８（１，５μＭ）および非標識化ＶＳＶ　−８（５０ｎＭ）と２３℃ において１６時間混合して、複合体を形成した。試料の一部分をゲル濾過（スペ ロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ニ ュージャーシイ州ビス力タエイ）よりＰＢＳ中で分析した。溶離後、各画分（０ ，０５ｍ１）の中に含有される放射能を測定した。タンパク質を２８０ｎｍにお ける吸収によりモニターした。第２手順において、［’　”　Ｉ　］ＶＳＶ−８ （０，３９ｎＭ）を１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳ中のに ’ｓｏｌの種々の濃度と混合した。２３℃において２〜１６時間インキュベーシ ョンした後、Ｋ’５ｏｌ−ペプチド複合体を遊離ペプチドから小さいゲル濾過（ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　Ｐ２Ｏ、バイオラド（ＢｆｏＲａｄ）　、カリフォルニア州す ッチモンド）によりＰＢＳ中で分離した。Ｐ３０ゲル濾過は、５分以内で、結合 したペプチドおよび遊離のペプチド９５％を越える分離を可能とした。結合した ペプチドおよび遊離のペプチドの放射能を測定し、そしてデータを線形回帰によ り分析した。提供されたＫｂｓｏｌの最大レベルにおいて、合計の標識化ペプチ ドの約６５％が結合した。Ｋ’　ｓｏｌへの標識化ペプチドのこの最大の結合能 力は、多分ｖｓｖ−ａに結合した１２５Ｉにより放射能のために、経時的に劣化 した。第３手順において、各試料！１．３９ｎＭ（７）［＋２’　Ｉ　］ＶＳＶ 　−８（約１８．０００ｃｐｍ）、示した濃度の非標識化ペプチド、および非標 識化ペプチドの不存在下に約５０％の［＋２ｓｒコｖｓｖ−ａ結合性を与える３ ０ｎＭのＫｂｓｏｌを７２μｌの最終体積で含有した。すべての成分は溶解し、 そして１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中で希釈した。２３℃において２〜１６時間 インキュベーションした後、５０μｌの試料をＰ３０ゲル濾過により前述したよ うに分析した。非標識化ペプチドについての解離定数を、記載されているように Ｅ”’　Ｉ　］ＶＳｖ−８およびにゝｓｏｌに対する［１２Ｊ］ｖｓｖ−ｓの結 合の５０％阻止を与える非標識化ペプチドのモル濃度から決定した。（参照、！ Ｊｕｌｌｅｒら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、９２　：５８９−６０１（１９８ ３）。）次いでＫｌ′ｓｏｌ　（０，３１１Ｍ）および［’　２’　Ｉ　］ｖＳ Ｖ　−８（０，３９ｎｍ）を４℃、２３℃、および３７℃においてインキュベー ションし、そしてアソシエーションを種々の時間においてＰ３０ゲル濾過により 決定した。必要なとき、示した濃度におけるインキュベーションの前に、ネズミ β２ミクログロブリンを添加した。ネズミβ２ミクログロブリンは、組換えドロ ソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞の培養上澄み液からの抗β２ミクロ グロブリンポリクローナル抗体に３５５を使用して、アフィニティクロマトグラ フィーにより調製した。（参照、また、Ｌｏｇｄｂｅｒｇら、Ｍｏ１ｅｃ、　Ｉ ｍｍｎｏｌ、　１４　：　５７７−５８７（１９７９）　、　）他の実験におい て、Ｋｂｓｏｌ、　（０，３μＭまたは１．８ｕ　Ｍ）および［’　”　’　Ｉ 　］ＶＳＶ　−８（２，４μＭ）を２３℃において２時間インキュベーションし 、そしてペプチド−Ｋｂｓｏｌ複合体をＰ３０ゲル濾過により単離した。試料は 非常に少量の［１２ｓＩコｖＳｖ−８およびＫｂｓｏｌ複合体（最大において、 ２．４μＭ）および約５０〜３００ｒ＋ｍの最終濃度で空のに’ｓｏｌを含有し た。いくつかの試料に、３μＭのβ２ミクログロブリン、３μＭのβ２ミクログ ロブリン＋２０μＭの非標識化ｖｓｖ−ｓ、２０μＭの非標識化ＶＳＶ−８、ま たは１％ＴＸ−１００を添加した。試料を３７℃において種々の時間インキュベ ーションし、そして解離の程度をＰ３０カラムの通過により決定した。
Ｂ、論考 クラスＩ　ＭＩＣ分子は細胞障害性Ｔリンパ球に対して抗原性ペプチド提示する 。クラスＩ　ＭＨＣ分子への生体外のペプチドの直接結合は、結合部位における 前辺て結合したペプチドの存在（ＣｈｅｎおよびＰｅｒｈｍ。
Ｎａｔｕｒｅ　３３７　：　７４３−５（１９８９））または結合特異性の欠如 により妨害された。（参照、例えば、Ｆｒｅｌｉｎｇｅｒら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、　１７２　：８２７−３４（１９９０）　；Ｃｈｏｐｐｉｎ　ら、Ｊ、 　Ｅｘｐ、　Ｍｃｄ、　１７２　：　８８９−９９（Ｉ９９０）　；　Ｃｈｅｎ ら、Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ。
１７２　：　９３１−６（１９９０）　、　）切頭Ｈ−２に’ｓｏｌおよびネズ ミβ２ミクログロブリン遺伝子で形質転換したドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　 ｉ　Ｉａ）細胞から精製した、可溶性、空のクラスＩ　Ｍ）Ｉｃ分子へのペプチ ドの結合の生体外分析をここに開示する。結果が証明するように、ペプチドの結 合は非常に急速であり、そして自然にプロセシングされたペプチド（オクタペプ チド；参照、例えば、Ｖａｎ　Ｂｌｅｅｋら、Ｎａｔｕｒｅ３４８　：　２１３ −６（１９９０）　；　Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：　２９０−６（１ ９９１）　）はナノモル範囲のにゝｓｏｌに対して最高の親和性を有し、そして オクタペプチドと複合化したＫｂｓｏｌは安定であるが、わずかに短いか、ある いは長いペプチドと複合化したものは寿命が短いことを示す。遊離重鎮とβ２ミ クログロブリンとの間の相互作用は洗浄剤の不存在下において基本的には可逆的 である。ペプチドは、β２ミクログロブリンを解離しないで、空のクラスｌ　Ｍ ＨＣ分子に自発的に結合する。
しかしながら、過剰のβ２ミクログロブリンは、ヘテロダイマーが不安定である 条件下にβ２ミクログロブリンとの遊離重鎮の再アソシエーションの結果として 、空のクラス１へのペプチドの結合を明らかに促進する。
可溶性Ｈ−２Ｋ　ｂ分子（重鎮のαｌα２α３ドメインから構成されている）お よびネズミβ２ミクログロブリンを、切頭重鎖およびβ２ミクログロブリン遺伝 子で同時に形質転換したドロソフイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　Ｉａ）細胞の培養上 澄み液から調製した。予備的実験が示唆するように、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏ ｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞は細胞表面上の内因性ペプチドを欠くクラスｌ　ＭＨＣ分 子を発現する。空のクラスＩＭＩＣ分子の性質のいくつかは、それらが３７℃に おいて安定性に劣り、そしてそれらの構造はペプチドの結合により安定化される という観溶性に５がまた空であることを確証するために、洗浄剤不含溶液中のそ れらの安定性を検査した（データは示されていない）。驚くべきことには、４７ ℃に１時間加熱したタンパク質はコンフォメーションナル抗体Ｙ３を使用する免 疫沈澱によりよく回収された。この予期せざる結果により、われわれは１％トリ トトン、−１００（ポリオキシエチレン（９）オクチルフェニルエーテル）をタ ンＩくり質溶液に添加した。′なぜなら、クラスｌ細胞の安定性を試験する同様 な実験を洗浄剤リゼイト中で常に実施されたからである（参照、Ｓｃｈｕｍａｃ ｈｅｒら、前掲）。洗浄剤の存在下に得られた結果は、精製したに’　ｓｏｌが 今回３７℃において不安定であることを示す（データは示されて０ない）。この 証拠および他の証拠が示唆するように、Ｋ’ｓｏｌヘテロダ・イマーは高温にお いて重鎖およびβ２ミクログロブリンに解離し、そして洗浄剤はβ２ミクログロ ブリンが解離した遊離重鎮と再アソシエーションすることを防止することができ る（下を参照）。
第２に、精製したに’ｓｏｌをペプチドで可溶化する可能性を研究した。最初に 記載した実験の結果が証明したように、自然にプロセシングされたペプチドであ ることが示されたく参照、Ｖａｎ　Ｂｌｅｅｋら、前掲）オクタペプチド（小胞 性口内炎ウィルスのヌクレオキャプシドタンパク質［ＶＳＶ−８］　、下表３参 照）と混合したときのみ、タンパク質を安定化することができる。これらの観察 は、前述の空のクラス１分子の特性と一致する。
精製したにゝｓｏ１分子が空であるという独立の支持は、自然条件下の等電点電 気泳動（ＩＥＦ）により提供される（データは示されていない）。ドロソフィラ （Ｄｒｏｓｏｐｈｉ　ｌａ）細胞から精製された可溶性に１′は、ヒトリンパ芽 球様細胞系から精製したＨＬＡ−Ａ２分子より非常に簡単なパターンを示した。
（参照、５ｉｌｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３５０　：６１９−２２（１９９１） ）。ＩＥＦ上のＨＬＡ−ａ２の複雑なパターンは、多分分子に結合した不均質ペ プチドの存在の結果である。精製したＫｂｓｏｌの簡単なバンドは、内因性ペプ チドの不存在を示す。さらに、抗原性ペプチドとのにＳＯＩのインキュベーショ ンはＩＥＦゲル上のノ（ンドの明確なシフトを引き起こし、ペプチドの結合のた めのＫｌ′ｓｏｌの等電点の変化を反映した。前に結合した内因性ペプチドの除 去後、１（ＬＡ　−Ａ２をペプチドと「再構成条件」においてインキュベーショ ンしないかぎり、ＨＬＡ−Ａ２分子をペプチドと単に混合したとき、このような バンドのシフトはＨＬＡ−Ａ２分子において観察されな力）つたことに注意すべ きである。−緒にすると、自然ＩＥＦについてのこれらの観察は、また、ドロソ フイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞から精製した可溶性Ｋｂが空であるこ とを示す。
ＩＩＩ　ｌ標識化ｖｓｖ−ａとＫｂｓｏｌとのアソシエーションはゲル濾過によ り証明された（示されていない）。高分子量物質の放射能はペプチド−Ｋ”ｓｏ ｌ複合体に相当するが、低分子量物質のそれは遊離ペプチドを表す。非標識化ｖ Ｓｖおよびナノ（ルブミン（ＯＶＡ）ペプチドは標識化ｖｓｖ−ｓと競争するこ とができ（下を参照）　、［１２Ｊ］ｖｓｖ−ａかにゝｓｏ！分子に特異的に結 合することを示す。逆相ＨＰＬＣは、Ｋ１結合［”’　Ｉ　］ＶＳＶ−８がイン プットペプチドと同一の保持時間を有することを明らかにした。標識化ｖｓｖ− ａのに’　ｓｏｌへの結合は飽和可能であり、約３３ｎＭの解離定数（ＫＤ）を 示す。スキャ・ソチャードプロットのＸ軸から、標識化ｖｓｖ−ａの約６５％は に１′に結合することができることが認められた。
Ｋ゛に対する種々のペプチドの親和性を決定するために［Ｌ２Ｊ］ｖｓｖ−ｓを 使用する競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を実施した（データは示されてい ない）。ＲＩＡのために使用した阻害性ペプチドを表３に記載する。各ペプチド についてのに、を同様に要約する。
表３ ＶＳＶ　−７ＧＹＶＹＱＧＬ　５．３ｘ　ｔｏ−”ＶＳＶ　−８ＲＧＹＶＹＱＧ Ｌ　３．７ｘ　１０−’ＶＳＶ　−９Ｎ　ＬＲＧＹＶＹＱＧＬ　７．３ｘ　１０ −’ＶＳＶ　−１ＯＮ　ＤＬＲＧＹＶＹＱＧＬ　３．９Ｘ　１０−’ＶＳＶ　− ９ＣＲＧＹＶＹＱＧＬＫ　６．９ｘ　１０−”ＶＳＶ−１，Ｏｃ　ＲＧＹＶＹＱ ＧＬＫＳ　２．　ＩＸ　１０−”０ＶＡ−８３ＩＩＮＦＥにＬ　４．ｌＸ１Ｏ− ’ＯＶＡ　−９Ｎ　、　ＥＳＩＩＮＦＥＫＬ　８．９ｘ　ｔＯ−”ＯＶＡ　−Ｉ ＯＮ　ＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬ　２．８ｘ　ｔｏ−’ＯＶＡ　−９Ｃ５ＩＩＮＦＥ ）ＬＴ　１．　ＩＸ　ｔｏ−”　−０ＶＡ−１，ＯＣ５ＩＩＮＦＥＫＬＴＥ　１ ．４ｘｌＯ−”０ＶＡ−２４ＥＱＬＥＳＩＩＮＦＥＫＬＴＥＷＴＳＳＮＶＭＥＥ Ｒ７，１ｘｌＯ−’ＳＥＶ　−９ＦＡＰＧＮＹＰＡＬ　２．７ｘｌＯ−＠６０３ −１．２（１９８９））　； ５ＥＶ−９：センダイウィルスのヌクレオタンパク質３２４−３３２　（Ｓｃｈ ｕ−ｍａｃｈｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３５０　：　７０３−７０６（１９９１） ）＊すべでのペプチドはＣｐｓ逆相ＨＰＬＣにより精製して、異なる結合性質を もつ汚染する短いペプチドを排除する。各ペプチドについての３文字コードおよ び配列識別番号を下に記載する。
ＶＳｖ−７ＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎＧＩｙＬｅｕ　（配列番号２４、残 基Ｎｏ、　４−１０）ｖｓｖ−ａ　＾ｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧＩｎＧｌ ｙＬｅｕ　（配列番号２４、残基Ｎｏ、　３−１０）ＶＳＶ−９Ｎ　ＬｅｕＡｒ ｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧＩｎＧＩｙＬｅｕ　（配列番号２４、残基Ｎｏ。
２−１．０　） ＶＳＶ　−１ＯＮ　ＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧ４ｙＴｙｒｖａｌＴｙｒＧＩｎＧｌｙ Ｌｅｕ　（配列番号２４）ＶＳＶ−９ＣＡｒｇＧｌｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧｌｎ ＧｌｙＬｅｕＬｙｓ　（配列番号３５、残基Ｎｏ。
ＶＳＶ−１０ＣＡｒｇＧＩｙＴｙｒＶａｌＴｙｒＧＩｎＧｌｙＬｅｕＬｙｓＳｅ ｒ　（配列番号３５）ＯＶＡ−８５ｅｒＩｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓ Ｌｅｕ　（配列番号２３、残基Ｎｏ、　５−１２）ＯｖＡ−９Ｎ　ＧｌｕＳｅｒ ｌｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｃｕ　（配列番号２３、残基Ｎｏ。
ＯＶＡ−１ＯＮ　ＬｅｕＧＩｕＳｅｒｌｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬ ｅｕ　（配列番号２３、残基Ｎｏ、　３−１２） ０１／Ａ−９Ｃ５ｅｒｌｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕＬｙｓＬｅｕＴｈｒ　（ 配列番号２３、残基Ｎｏ。
５−１．３） ＯｖＡ−１０Ｃ５ｅｒｌｌｅｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧＩｕＬｙｓＬｅｕＴｈｒＧＩ ｕ　（配列番号２３、残基Ｎｏ、　５−１４） ＯＶＡ−２４ＧＩｕＧｌｎＬｅｕＧＩｕＳｅｒｌｌａｌｌｅＡｓｎＰｈｅＧｌｕ ＬｙｓＬｅｕＴｈｒＧｌｕＴｒｐＴｈｒ−３ｅｒＳｅｒＡｓｎＶａ１ＭｅｔＧｌ ｕＧＩｕＡｒｇ　（配列番号２３）ＳＥＶ−９ＰｈｅＡｌａＰｒｏＧｌｙＡｓｎ ＴｙｒＰｒｏＡＩａＬｅｕ（配列番号３６）自然にプロセシングされた大きさの ペプチド（ｖＳｖおよびＯＶＡについて８マー、およびセンダイウィルスのヌク レオタンパク質［ＳＥＶ］について９マー）は、２．７〜４．７μＭの範囲で最 高のかつ顕著に類似する親和性を有した。自然のペプチドのこの過度に高い親和 性は最７０３−６（１９９１）　；　Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　 ３５２　：　６Ｏ−７０（１９９１）　、　）　Ｌがしなか呟　Ｉまたは２程度 に少ない残基だけ短いが、あるいは長いペプチドは親和性を２〜１００ファルタ −だけ低下した。親和性のこの減少は非常に長いペプチドについてなおいっそう 激烈である；すなわち、２４マーのペプチド（ＯＶＡ−２４）の親和性は０ＶＡ −８のそれより１．０．０００倍低い。これらの結果は、より長いペプチドを使 用する初期の報告がマイクロモルの範囲の親和性を主張している理由を説明する ことを助ける。（参照、例えば、Ｆｒｅｌ　ｉｎｇｅｒらおよびＣｈｏｐｐｉｎ ら、両者共前掲。）カルボキシル末端におけるペプチドの延長はアミノ末端にお ける延長より親和性に対する崩壊性が非常に低いことは、とくに興味あることで ある。ＨＬＡ−Ａ２の３次元の構造に従い、ペプチド結合性みぞは逆平行β鎖上 の２つの長いαらせんにより形成され、そしてくぼみは約２５オングストローム の長さであり、これは約８残基の延長したペプチド鎖を収容することが提案され た（参照、例えば、ＢＪｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３２９　：　５０６− １２（１９８７））　。＜ぼみのｌ末端において、αＩおよびα２らせんは一緒 に緊密に閉じるようになるが、他方の末端において、くぼみはがなり開いている 。ここで、　ＶＳＶおよびＯＶＡの両者のペプチドはくぼみに同−向きで結合し 、そしてペプチドのカルボキシル末端はくぼみの比較的間いた末端と相互作用す ることができるので、カルボキシル末端におけるペプチドの延長は厳しい立体障 害を引き起こさないと推測される。
次いで実験を実施して、それぞれ、４℃および２３℃におけるに１へのペプチド の結合速度を検査した。結合はことに２３℃において非常に急速であり、標識化 ペプチドの極めて低い濃度（約０．４μＭ）においてさえ、約５分の半減期であ る。これは約２時間のアソシエーションの半減期を示す従来の観察と対照的であ る。（参照、例えば、Ｃｈｏｐｐｉｎら、前掲。）再び、合計の標識化ペプチド の６５％のみが結合することができた。過剰のβ２ミクログロブリンの添加は、 Ｋゝヘテロダイマーが安定である（集合体で止まる）ような低い温度においてペ プチドの結合の反応速度論に影響を与えなかった。これが意味するように、β２ ミクログロブリンの交換はペプチドの結合のための前提条件ではない；すなわち 、ペプチドはβ２ミクログロブリンの解離なしに空のクラス１分子に自発的に結 合することができる。対照的に、過剰の遊離β２ミクログロブリンは３７℃にお いてペプチドの結合を明らかに促進する（データは示されていない）。添加する β２ミクログロブリンの濃度を増加したとき、より多くのペプチドかに１分子に 結合した。空のに１′は３７℃において不安定であるので、ヘテロダイマーの小 部分は重鎖およびβ２ミクログロブリンに解離するに違いなく、これにより、ヘ テロダイマーは遊離重鎖および遊離β２ミクログロブリンと平衡にあるに違いな い。次いで、β２ミクログロブリンの添加はペプチドに結合できるヘテロダイマ ーの形成に向かって平衡をシフトするであろう。この見解は次の最近の観察によ り支持される。すなわち、通常の細胞表面上の実質的な数のクラスＩｉ！１離重 鎖が存在し、そして外因的に添加されたβ２ミクログロブリンは、β２ミクログ ロブリンと遊離重鎮との再アソシエーションの結果として、空のクラス１分子へ のペプチドの結合を促進する。（参照、例えば、Ｒｏｃｋら、Ｃｅ１ｌ　６５　 ：　６１１−６２０（１９９１）；Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３４ ９　：　７４−７７（１９９１）　；　Ｖｔｔｉｅｌｌｏら、５ｃｉｅｎｃｅ荷 ム：　１４２３−６（１９９０）。）３７℃においてペプチドの解離の反応速度 論を次いで観察した。
［１２’　Ｉ　］ＶＳＶ−８およびにゝ複合体をゲル濾過により単離した直後に 、５０または３００ｎＭのに５を含有する試料を３７℃の温度に暴露した。いく つかの試料に３μＭのβ２ミクログロブリンおよび／または２０μＭの非標識化 ｖｓｖ−ｓ、または１％のＴＸ−１００を補充した。Ｋ’からの標識化ペプチド の解離を種々の時間において測定した（示されていない）。大過剰の非標識化ペ プチドの存在において、ペプチドの解離速度は一次反応速度論に従い、解離の半 減期は約３６分であった（３．２Ｘ　１０−’／秒の解離速度定数）。標識化ペ プチドのこの予期せざる、比較的に急速な解離は安定なペプチド−クラス１複合 体のいくつかの現在の見解と一致しない。事実、確認された結果（示されていな い）は、Ｋ″′およびｖｓｖ−ａ複合体が安定であることを証明した。この解釈 は非標識化ｖｓｖ−ａのそれ（３，７μＭ）に比較して放射線標識化ｖｓｖ−ａ の１０倍低い親和性（３３ｎＭ）から発生するに違いない。
洗浄剤を非標識化ペプチドの代わりに添加したとき、−次反応速度論がまた観察 され、洗浄剤はペプチドの解離プロセスを可逆的とすることを示した。対照的に 、ペプチドの解離のプロフィルは非標識化ペプチドまたは洗浄剤の不存在下に一 次反応速度論に従わなかった。これが示唆するように、ペプチドのアソシエーシ ョン／解離は可逆的であり、そしてペプチドの結合はへテロダイマーの濃度に依 存する（Ｋ１′の５０ｎＭと３００ｎＭとの間の反応速度論を比較する）。
過剰のβ２ミクログロブリンを添加したとき、これはいっそう明らかとなった。
これらの結果は、完全でないにしても、洗浄剤の不存在下に、重鎮、β２ミクロ グロブリンおよびペプチドの間の相互作用は３７℃において基本的に可逆的であ るという従来の議論を支持する。洗浄剤、例えば、ＴＸ−１００はβ２ミクログ ロブリンが３７℃において遊離重鎮と再アソシエーションするのを防止すること ができるであろう。これは、Ｋ１が洗浄剤の不存在下に高温にいったん加熱され ると、コンフォメーションナル抗体により効率よく免疫沈澱することができる理 由を合理的に説明することができるであろう（示されていない）。興味あること は、β２ミクログロブリンの添加は過剰の非標識化ペプチドの存在下のペプチド の解離を抑制せず、標識化ペプチドがβ２ミクログロブリンの解離なしに複合体 から解放されることを示す。しかしながら［’　”　Ｉ　）ＶＳＶ−８の親和性 は自然ペプチドのそれより約１０倍低いことを推奨すべきである。したがって、 これは必ずしも自然ペプチドの場合ではない。
生体外のペプチド結合アッセイを使用して研究において、クラス１分子へのペプ チドの結合は簡単な質量作用およびリガンド−レセプターの相互作用であること が示唆される。ここにおいて使用したアプローチは、クラス１分子へのペプチド の結合の特異性およびペプチド−クラス１分子の複合体とＴ細胞レセプターとの 相互作用の特性決定を可能とする。
実施例６ ドロソフイラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞系の溜または「バンク」を確立しそ して維持することができ、各細胞系は５０〜１００の最も共通のクラス１分子の １つを発現する。これらのタンパク質をエンコードするタンパク質はそれらを含 有する細胞系からｍ−例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（参照、Ｅｎｎｉｓら、Ｐ ＮＡＳ　ＵＳＡ　８７　：２８３３−７（１９９０））により得られたＨＬＡ変 異型に基づいてクローニングし、そして適当なベクター、例えば、昆虫発現ベク ターの中に挿入して、各ＨＬＡ変異型を発現する細胞系を発生することができる 。例えば、次のプロトコールに従う試験を使用して、選択のウィルスから誘導さ れたどのペプチドが異なるクラス１分子に最もよく結合するかを決定することが できる。種々の培養物を適当に標識化するか、あるいはカタログ化して、特定の ペプチドとともにどのクラス１分子が最もよく使用されるかを示すことができる 。あるいは、必要に応じて一時的培養物を確立することができる。ここにおいて 論じたように、昆虫細胞の培養物をベクターとほぼ４８時間インキュベーション した後、培養物は明らかに空のＭＨＣ分子を発現することができ、これらの分子 はＣＤ８細胞を活性化する目的で選択の１または２以上のペプチドを負荷するこ とができる。
Ｂ、ｒ特別の」細胞系の調製 ）ＩＬＡの型別後、好ましいＨＬＡを発現するドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉ ｌａ）細胞が入手可能でない場合、好ましいＨＬＡをエンコードするｃＤＮＡを ポリメラーゼ連鎖反応の使用によりクローニングすることができる。
上の節Ｂ、１．に開示されているプライマー（配列識別番号工〜配列識別番号１ ２）を使用して適当なＨＬＡ−Ａ、　−Ｂ、　−Ｃ，−Ｅ。
−Ｆ、または−ＧｃＤＮＡを別々の反応において増幅し、次いでこれらを上の実 施例１１節ｌに開示されている方法に記載されているようにクローニングしそし て配列決定することができる。次いでＤＮＡをＰＣＲ反応からジーン・クリーン （Ｇｅｎｅ　Ｃ１ｅａｎ）キット（Ｂｉｏ　１０１　。
カリフォルニア州すンディエゴ）で精製し、そしてｐＲｍＨａ　−３のＳｍａ　 Ｘ部位に直接結合する。個々のクローンを単離し、配列を評価し、そしてＨＬＡ を発現する安定なドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｊａ）細胞を確立する。
あるいは、組換えプラスミドの大量の集団を大規模に増殖し、そしてＤＮＡを塩 化セシウム勾配により精製することができる。次いで精製したＤＮＡを使用して リン酸カルシウム沈澱技術によりシュネイダー細胞をトランスフェクションする 。２４時間後、沈澱を洗浄して細胞を除去し、そして１　ｍＭ　Ｃｕ５Ｏ＋を含 有する新鮮なシュネイダー培地と置換する。４８時間後、一時的にトランスフェ クションされた細胞の大量の集団を、シンジェネイックペプチドまたは特定のタ ンパク質のプロテアーゼ消化物とのインキュベーション後、ＣＤ８の生体外活性 のために使用する。
次いで、クローニングしたＨＬＡを発現する安定な細胞系をドロソフィラ（Ｄｒ ｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）細胞中で確立する。あるいは、ＰＣＲ反応からのクロー ニングされた組換え分子の大量の集団を一時的に発現する昆虫細胞の集団を生体 内のＣＤ８活性化に使用することができる。
また、細胞系が発現したＭ）ＩＣが生体内で発現された要素でない場合、ペプチ ドとインキュベーションしたクラスＩ　ＭＨＣを発現する昆虫細胞を使用して、 ハブロタイブ特異的ＣＤ８を生体外で活性化することができる。これは、アレ１ の制限のために生体内で不可能である、特定のＭＨＣとアソシエーションした特 定の抗原を認識するＣＤ８細胞を増殖する独特の機会を提供する。例えば、イン フルエンザウィルスの核タンパク質からのペプチド（ＮＰ）は通常Ｄｂ分子に限 定される；しかしながら、このようなペプチドはに’に結合することができ（Ｄ ’よりいっそう弱くであるカリモしてに’に対するある程度の熱安定性を発生す ることができる（第３図参照）。さらに、ＮＰペプチドと前インキュベーション し、モしてＢ６マウスからの牌細胞と同時培養したにゝ発現ドロソフィラ（Ｄｒ ｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞は、ＮＰペプチドとアソシエーションしたに″′分子を 特異的に認識するＣＤ８の生体外活性化を生ずる。さらに、オバルブミンから誘 導されたに５制限ペプチド（ＯＶＡ）およびＤ１発現ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏ ｐｈｉｌａ）細胞は、ＯＶＡペプチドを含有するＤｂを特異的に認識するＣＤ８ の増殖を生ずる。このようなＣＤ８はオバルブミンタンパク質エンコードするｃ ＤＮＡでトランスフェクションした細胞（Ｅｌ、４０ＶＡ）を殺すすることがで き、生体内で多少のＤｂ分子がＯＶＡペプチドを負荷されることを示す。
したがって、この系は、生体内ではペプチドのための制限要素ではない、クラス １分子により提示される特異的抗原に対してＣＤ８を増殖する機会を提供する。
ＣＤ８により認識されかつ殺されるべき細胞について十分な抗原が生体内で前記 クラス１により圧力されるが、抗原は生体内でこのようなＣＤ８を増殖するため に十分ではない。ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞により発現される 空のクラス１分子にペプチドを負荷することによって、過剰の抗原性ペプチドを クラス１分子に非競合的環境において提供し、こうしてこの複合体を認識する特 異的ＣＤ８を活性化するために十分な抗原をクラスｌにより圧力されるようにす ることによって、生体内の制限を無視することが多分可能である。
Ｃ，エイズの処置 生体外活性化された細胞を生体内治療のために患者に投与することができる。好 ましくは、個体のクラス１遺伝子型（ハブロタイブ）をまず決定する。普通の組 織の型別はこの目的に適当であり、そして処置センターにおいであるいはいくつ かの適当な商業的操作により実施することができる。個体の１または２以上のＨ ＬＡ型がいったん決定されると、個々の患者に適当なペプチドとクラス１分子と の最良の組み合わせが確認され、そして前述したように調製され、そして適当な ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）細胞およびペプチドが患者前駆体の ＣＤ８　（Ｔ）細胞を、ドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞の培養によ り生産された適当なペプチド負荷ＭＨＣで刺激する。活性化後、ＣＤ８細胞を患 者の血流の中に再導入し、そして患者の疾患のプロセスをモニターし続ける。細 胞成分を取り出しそして再導入する方法はこの分野において知られており、そし て米国特許第４．８４４．８９３号（Ｈｏｎｓｉｋら）および米国特許第４．６ ９０．９１５号（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）の中に例示されるような手順を包含する 。
疾患が十分に軽減されるまで、追加の処置を必要に応じて投与することができる 。同様な処置のプロトコールは、他の免疫抑制された個体、例えば、移植の患者 、中年過ぎの患者などとともに使用するために適当である。
Ｄ、癌の処置 癌の患者において、前述のものに類似する処置の手順を利用する。
しかしながら、このような患者において、腫瘍の塊を減少する普通の治療をここ に記載する免疫治療に先行するであろうことが予測される。したがって、免疫細 胞を破壊する傾向がある普通の治療、例えば、放射線または化学療法の開始前に 、推定上の患者からの血液試料を獲得しそ１−で貯蔵（例えば、凍結により）す ることが好ましい。存在する場合、わずかの形態の癌はウィルスの感染に直接応 答して発生するので、免疫処置のための標的ペプチドが容易に観察されることが 少ない。しかしながら、最近の研究が示すように、腫瘍遺伝子ｒａｓ、　ｎｅｕ 、およびｐ５３中の突然変異はすべての癌の場合の５０％程度に多さで癌に寄与 する。こうして、分子のこれらの突然変異した領域から誘導されたペプチドは、 現在の治療のための標的として主要な候補である。ここに開示するプロトコール に従い、個々の患者のために最良のペプチドとクラス１分子との組み合わせを決 定し、そして投与することができる。
例えば、多数の腫瘍は影響を受けた個体から誘導されたＣＤ８細胞により生体外 で認識される抗原を発現する。こうして、正常細胞中で発現されないこのような 抗原、ならびにＣＤ８細胞にそれらを提示するＨＬＡ型を、正確にターゲツティ ングされた免疫治療のために、本発明の方法により同定することができる。例え ば、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｂｒｕ−ｇｇｅｎらは、その発現が特定の遺伝子により指 令されそしてＨＬＡ　Ａｌにより提示されるように思われる抗原を記載した（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ　２５４　：１６４３−１６４７（１９９１））。種々のヒト腫瘍 抗原が単離されそして記載されているので、それらはここに記載するような免疫 治療の応用のためのすぐれた候補となる。
Ｅ１組み合わせた治療／接合体 望ましくない活性化されたＣＤ８細胞−一すなわち、移植片の拒絶を刺激するこ とができるものの処置または除去のために、「空の」クラス１分子をさらに毒性 のタンパク質（例えば、シュードモナス毒素）と接合することができる。接合体 を構成し、次いでクラス１分子の部分に適当なペプチドを負荷し、次いでこれは クラス１分子−ペプチドの組み合わせのためのレセプターをもつＴ細胞を「誘引 し」または「捜し出す」ので、抗原特異的ＣＤ８細胞を排除することができる。
このアプローチは、また、移植片拒絶の原因となるＴ細胞を排除することができ る。例えば、１つのこのような手順は次の工程を包含する：　（１）可溶性、空 の、ヒトクラスＩ　ＭＨＣ分子をドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａ）細 胞の培養物から単離する；　（２）空のヒトクラスＩ　ＭＨＣ分子を毒素に生体 外で結合する；　（３）生体外で空の結合されたクラスＩ　Ｍｌ＋Ｃ分子を抗原 性ペプチド（例えば、移植された組織から誘導されたペプチド）と、ＭＨＣ分子 にペプチドを負荷させるために十分な時間の間接触させる；　（４）ペプチドを 負荷された、結合した分子を単離する；そして（５）処置を必要とする個体、例 えば、移植を行った個体に前記ペプチド負荷分子を投与する。
同様に、ある種の明確なＴ細胞の集団は糖尿病、慢性関節リウマチおよび他の推 定上の自己免疫疾患の原因として関係づけられている。このような細胞は、また 、前述の手順により選択的に排除することができる。また、このプロトコールを アレルギー性患者の適用が考えられるであろう。
他の別の治療のモードにおいて、本発明の生体外で活性化されたＣＤ８細胞を他 の免疫原と組み合わせて投与することができる。例えば、米国特許第５．０４５ ．３２０号に開示されている大きい多価の免疫原を活性化されたＣＤ８細胞と組 み合わせて投与することができる。
また、Ｔ細胞の分化および活性化を仲介するサイトカイン、例えば、ｌＬ２およ びｌＬ４を同様によく投与することができることが考えられる。なぜなら、サイ トカインは生体内で腫瘍に対するＴ細胞の応答を刺激することができるからであ る。ＩＬ２は、ＣＴＬ（ＣＤ　８　）前駆体の増殖および分化においておよびＣ Ｄ８の増殖において、主要な役割を演すると信じられる。癌患者へのＩＬ２の投 与は、腫瘍特異的Ｔ細胞の誘発に関係するように思われる、改良された抗腫瘍の 応答にしばしば関連する。しかしながら、ｌＬ２の最良の治療効果はＩＬ２の全 身的投与よりむしろ連続的局所的投与により得ることができる。
こうして、ＩＬ２遺伝子構成体で腫瘍細胞をトランスフェクションすることによ って、局所的送り出しを達成することができることがここにおいて示唆される。
ＫａｒａｓｕｙａｍａおよびＭｅｌｃｈｅｒ、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏ ｌ、　１８　：　９７−１０４（１９８８）に記載されているように、ＩＬ２　 ｃＤＮＡを構成する。ＩＬ２の完全なｃＤＮＡ配列をプラスミドｐＢＭＧｎｅｏ 　ＩＬ２からＸｈｏ　Ｉ断片として獲得しく参照、Ｋａｒａｓｕｙａｍａおよび Ｍｅｌｃｈｅｒ　、前掲）そしてｐＲｍＨａ　−３の５ａｌＩ部位の中に直接結 合する。正しい向きでインサートをもつ組換えｐＲｍＨａ＝３プラスミド（Ｈｉ ｎｄｌＩ［を使用する制限マツピングにより決定する）をセシウム勾配により精 製し、そしてリン酸カルシウム技術によりンユネイダー２細胞を共トランスフェ クションするために使用する。
（プラスミドＤＮＡの混合物をこの目的のために調製した：１０μｇのＩＬ２　 ｃＤＮＡ含有ｐＲ＋ｎＨａ　−３，６μｇのＭＨＣクラス１重鎖またはβ２ミク ログロブリンを含有するｐＲａ＋ｔ（ａ　−３の各々および２μｇのｐｈｓｈｓ ｎｅ。
ＤＮＡ　、　’）重鎖、β２ミクログロブリンおよびＩＬ２を発現するようにＣ ｕ５Ｏ＋で誘発可能な、安定な細胞系を０４１８培地中でトランスフェクション 体を増殖することによって得た。これらの安定な細胞系をペプチドで被覆し、そ して前述したように生体外アッセイにおいて使用した。ＩＬ２でトランスフェク ションした腫瘍細胞は親の腫瘍細胞に対するＣＴＬ（ＣＤ　８　）活性を増強し 、そして生体内の抗腫瘍または細胞障害性の応答の誘発におけるＣＤ４およびＴ ヘルパーの機能をバイパスする。したがって、ＩＬ２遺伝子との共トランスフェ クションによりドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　Ｉａ）系の可能性を増加す ることが、ここにおいて示唆される。
以上の説明は本発明の例示を意図し、本発明を限定しない。本発明の精神および 範囲から逸脱しないで多数の変化および変更を実施することができる。
配列の列挙 （１）一般情報 （ｉ）出願者：　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｐｅｒ　ＡＪａｃｋｓｏｎ、　Ｍｉｃｈ ａｅｌ Ｌｅｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ、　Ｐｉｅｒｒｅ（１、発明の名称：細胞毒 性Ｔ細胞のインビトロ活性化（ｉｉ）配列の数＝３６ （１ｖ）通信住所； （Ａ）住所：　Ｔｈｅ　５ｃｒｉｐｐｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ（Ｂ）通り：　１０６６６　Ｎｏｒｔｈ　Ｔｏｒｒｅｙ　Ｐｉｎｅｓ　Ｒｏａ ｄ、　ＴＰＣ８（Ｃ）町：　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ （Ｄ）州：　ＣａＪｊｆｏｒｎｉａ （Ｅ）国：　ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号：　９２０３７ （Ｖ）：］ンビューター読取りフオーム（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システ ム：　ＰＣ−ＤＯＳ／　ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）’／７トウエアー：　Ｐａｔｅｎｔ ｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．０゜Ｖｅｒｓｔｏｎ　＃１．２５ （ｖｉ　）現出願データ （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ１０５９３／（Ｂ）出願日：　１８−ＦＥＢ−１９９ ３（Ｃ）分類： （ｖ′ｉ）従来の出願データ （Ａ）出願番号＋　０７／８４１．６６２（Ｂ）出願日：　１９−ＦＥＢ−１９ ９２（ｖｉ　）アトニー／エージェントの情報（Δ）名称：　Ｌｏｇａｎ、　Ａ ｐｒｉ＋（Ｂ）登録番号：　３３．９５０ （Ｃ）参照／ドケット番号：　５ＥＱＯＯＯ２Ｐ（ｉｘ　）電信情報 （Ａ）電話＋　（６１９）５５４−２９３７（Ｂ）テレファックス：　（６１９ ）５５４−６３１２（２）配列番号１についての情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ７２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号１： ＣＣＡ（：ＣＡＴＧＧＣｃｃｒｃａｒｃｃｃｃ　ＣＣＣ２３（２）配列番号２に ついての情報： （ｊ）配列の特徴： （Ａ）長さ７２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｎ）ハイボセティカル：Ｎ０ （ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号７： ＣＣＡＣＣＡＴＧＣＧ　ＧにＴＡＧＡＴＧＣＣＣＴＣ（２）配列番号８について の情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス＝Ｎ。
（ｘｉ）配列：配列番号８： ＧＧＴＴＡＣＭＧＣＴＧＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＡ（２）配列番号９についての情 報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｌ）配列：配列番号９： ＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣｃｃｃｃｃｃＭｃｃ　ｃ’ｒｃ（２）配列番号１０につい ての情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 ２１　（Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｎ）ハイポセティヵル：Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス＝Ｎ。
（ｘｉ）配列：配列番号１ｏ： （２）配列番号１１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 ２３（Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティヵル二Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ。
（ｘｉ）配列：配列番号ｌｌ。
ＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣ（：ＣＣＣＣＧＭＣＣＣＴＣ（２）配列番号１２について の情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２３個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号１２： ＧＣＴＣＡＣＡＡＴＴ　ＴＡＣＡＡにＣＣＣ；Ａ　にＡ（：　２３（２）配列番 号１３についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：４２７個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｊｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号１３： Ａ、’、ＴＴＣＧＴＴＧＣＡＧＧＡＣＡＧＧＡＴ　ＧＴＧにＴＧＣＣＣＧ　ＡＴ ＧＴＧＡＣＴＡＧ　ＣＴＣＴＴＴＣＣＴＧ　ＣＡＧ（：ＣＣ■sＣ（ ＴＡＴＣＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＧＡＴＡＡＧ　ＡＧＡＣＣＣＡＧＡＡ　ＣＴＣＣ ＧＧＣＣＣＣＣＣＡＣＣＧＣＣＣＡ　ＣＣＱ；ＣＣＡＣＣＣb Ｃ，’１ＴＡＣＡＴＡ丁Ｇ　ＴＧＣＴＡＣＣ：Ｃ酷　ＧＴＡＡＧ；Ａ（：ＴＧＣ ＣＴＣ；ＣＧＣＡＴにＣＣＣＣＡＴＣＴＣ；ＣＣＣＣＡＣＣ`ＡＧＡＧ；　１８ ０ ＴＴＴＴＧＣＡＴＣＣＣＡＴＡＣＡＡＣＴＣＣＣＣＡＡＡＧＴＣ；Ｇ　ＡにＡＡ ＣＣＧＡＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧ　ＣＧＧＧＣＡＧＡＡＣQ４０ ＡＡＡＡＧＣＴｒＣＴ　ＧＣＡＣＡＣＧＴＣＴ　ＣＣＡＣＴＣＧＡＡＴ　ＴＴＣ にＡＧＣＣＣ；に　ＣＣＣＧＣＣＴＣＴＧ　ＣＡＡＡＡＧＡfＧＴ　３００ ＣｋＡＴＣＣＡＡＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＣＴ　（１：ＴＧＴＡＡＡＧ：ＣＣＣＣ ＣＴＴ’ｒＣＣｋＡ　ＡＡＴＧＴＡＴＡＡＡ　ＡＣＣＧＡＧ`ＧＣＡ　３６０ ＴＣＴにＧＣＣＡＡＴ　ＧＴＧＣＡＴＣＡＣＴ　ＴＧＴＣ：にＴＣＡＧＣＡＧＣ ＡＡＡＡＴ（：Ａ　ＡＣＴＧ；ＡＡＴＣＡＴ　ＣＴＣＡＣＴbＣｋＡ　４２０ ＣＴＡＡＡＣＣ，４２７ （２）配列番号１４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ；７４０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス：Ｎｏ （ｘｉ）配列：配列番号１４： ＴＡＧＡＴＡＡＡＴＣＧＧＡＧＣ（：ＧＣＴに　（：ＡＡＴＧＧＣＧＧＡ　ＣＣ ＡＴＣＡＣＣＡＡ　にＴＴＣＣτＣＣＧＣＣＡＡＴＣＡ（：sＣに　１８０ ＴＣＣＡＧＣ（：ＡＧ丁　ＣＧＣＴＧＴＣＧＡＡ　ＡＣＴＡＡＴＴＡＡＧ　ＴＴ Ａ−ＡＴＧＡＧＴＴ　ＴＴＴＣＡＴＧＴＴＡ　（：ＴＴＴＣfＣＧＣＴ　４２０ にＡＡＡＴＴＣＡＧＧ　ＧＡＧＡＣににＧＧＡ　ＡＧＴＴＡＣＴＡＴＣＴＡＣＴ 入ＡＡＡＧｃ　ＣＡＡＡＣＡｆｉ、ＴＴＴ　ＣＴＴＡＣＡＧsＴＴ　７２０ ＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴ　ＡＣτＣＴＡＧＡＧＴ　７４０（２）配列番号１５につ いての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝６０個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（市）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｌ）配列：配列番号Ｉ５： ＧＣｎＧＧＡＴＣＣＡＧＡＴＣＴＡＣＣＡ　τＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＣにＣ ＣＴＴＡ　ＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧ　ＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣ６O （２）配列番号１６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）ｌ−ポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡＣゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号１６二 ＧＧＡ丁ＣＣＧＧＡＴ　ＧＣＴＴＡＣＡＴにＴ　（：ＧＣｃＡＴＣＣＣＡ　ＣＴ ＴＭＣ３６（２）配列番号１７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ５１９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （Ｘｌ）配列、配列番号１７コ （２）配列番号１８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ１２４個の塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｎ）ハイポセテイカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｘｉ）配列：配列番号１８： ＣＣＣＴＣＧＧにＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＣＣ丁ＡＣ２４（２）配列番号１９に ついての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２６個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｌ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列：配列番号１９： ＧＣＧＧＡＴＩ：Ｃ＝Ｔ　ＧにＣＣＣＴＣＡＴＧ　ＧＣＧＣＣＣ２６（２）配列 番号２０についての情報二 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：２９個の塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０ （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （伍）ハイボセテイカル＝ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス：１４０ （ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号２５： （２）配列番号２６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝１４個のアミノ酸 （Ｂ）型；アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイポセテイカル；ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （Ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号２６： （２）配列番号２７についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （Ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号２７： Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ（２）配列番号２８についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号２８： （２）配列番号２９についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （Ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号２９： Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ（ ２）配列番号３０についての情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ。
（ｖ）フラグメント型：中間部 （Ｘｌ）配列：配列番号３ｏ： Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　）ｌｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ （２）配列番号３１についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｊ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイボセティヵル：Ｎ。
（ｉｖ　）アンチセンス：Ｎ。
（ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号３１： （２）配列番号３２についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２１０個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号３２： （２）配列番号３３についての情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：１４個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉ）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列；配列番号３３： （２）配列番号３４についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝３２個の塩基対 （Ｂ）型；核酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉ）配列の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０ （ｘｉ）配列；配列番号３４： ＡＴＡＴＧＣ＾丁ＣＣＴＣＡＣＣＡＴＣＴ（：　ＡＣＧＧＴＧＡにＧＯＧＣ３２ （２）配列番号３５についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ２１０個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｌ）配列の種類：ペプチド （ｉｎ）ハイポセティカル＝ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号３５： （２）配列番号３６についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝９個のアミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニー末鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）配列の種類：ペプチド （ｉｉｉ　）ハイボセティカル：ＮＯ （ｉｖ　）アンチセンス＝ＮＯ （ｖ）フラグメント型：中間部 （ｘｉ）配列：配列番号３６： ム− ２８°Ｃ３７°Ｃ３７°Ｃ３７’Ｃ ２ｈｒｓ　２ｈｒｓ　２ｈｒｓ ”ＮＦ２　＋０ｖａ８ ２８°Ｃ３７°Ｃ３７°Ｃ３７’Ｃ ２ｈｒｓ　２ｈｒｓ　２ｈｒｓ ＋ＮＰ９　＋Ｏｖａ８ エ ステイミコレーターハエ細胞 一中−ＫＢ −啼−ＫＢＯＶＡ固定 ＫＢＯＶＡ固定＋Ｓ／Ｎ □ＫＢＯＶＡ スティミコレーターハエ細胞 □ＫＢ　−９ｍ　インビボでのＫＢＯＶＡ／インビトロでのＫＢ　０ＶＡ−ＫＢ ＯＶＡ　−−インビボでのＫ［３０ＶＡ／インビ）−口ｒノＤＢＯＶＡ−中−Ｄ ＢＯＶＡ ＦＩＧ、ｌ○Ｃ Ｅ／Ｔ比 ＦＩＧ、ＩＩＡ 、Ｉ　１　１０　１００ Ｅ／Ｔ比 ＦＩＧ、Ｉ旧 エフェクター／標的比 、１　１　１０　＋００ Ｅ／Ｔ比 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年８月　１１日

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. １．誘発性プロモーターの制御下で少なくとも１種の発現可能ヒトクラスＩＭＨ Ｃ遺伝子を含む真核細胞系。
  2. ２．発現可能ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子をさらに含む請求項１記載の細胞 系。
  3. ３．少なくとも１種の発現可能ヒトクラスＩＭＨＣ遺伝子を含む昆虫細胞系。
  4. ４．前記遺伝子が誘発可能プロモーターの制御下に存在する請求項３記載の細胞 系。
  5. ５．発現可能ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子をさらに含む請求項３記載の細胞 系。
  6. ６．ヒトクラスＩＭＨＣ分子モノタイプを発現する請求項１記載の細胞系。
  7. ７．前記ＨＨＣ分子が空である請求項６記載の細胞系。
  8. ８．前記昆虫細胞が、表面発現されたヒトクラスＭＨＣ分子を有するドロソフィ ラ細胞を含んで成る請求項３記載の細胞系。
  9. ９．前記表面一発現されたＭＨＣ分子の数が、ＣＤ８細胞を活性化するのに十分 な量である請求項８記載の細胞。
  10. １０．少なくとも１種の発現可能ヒトクラスＩＭＨＣ遺伝子を含む真核細胞系を 生成するための方法であって；真核細胞の培養物を確立し；そして 誘発性プロモーター及び発現可能ヒトクラスＩＭＨＣ遺伝子を含んで成る誘発性 発現ベクターにより前記培養物をトランスフェクトすることを含んで成る方法。
  11. １１．前記ベクターが、発現可能ヒトβ２ミクログロブリン遺伝子をさらに含ん で成る請求項１０記載の方法。
  12. １２．前記ベクターが、転写可能ポリアデニル化部位をコードするヌクレオチド 配列をさらに含んで成る請求項１０記載の方法。
  13. １３．前記細胞がドロソフィラ細胞である請求項１０記載の方法。
  14. １４．前記ベクターがｐＲｍＨａ−３を含んで成る請求項１３記載の方法。
  15. １５．活性化されたＣＤ８細胞をインビトロで生成するための方法であって、Ｃ Ｄ８細胞とドロソフィラ細胞上に表面発現された抗原一負荷ヒトクラスＩＭＨＣ 分子とを、前記ＣＤ８細胞を抗原特異的態様で活性化するのに十分な時間、イン ビトロで接触せしめることを含んで成る方法。
  16. １６．前記抗原一負荷クラス１分子から前記活性化されたＣＤ８細胞を分離し； 前記活性化されたＣＤ８細胞を許容できるキャリヤー又は賦形剤に懸濁し；そし て 前記懸濁液を処置の必要な個人に投与することをさらに含んで成る請求項１５記 載の方法。
  17. １７．ヒト患者における標的細胞を特異的に殺害するための方法であって： 前記患者から前駆体ＣＤ８細胞を含む流体サンプルを得；前記ＣＤ８細胞とドロ ソフィラ細胞上で表面一発現された抗原一負荷ヒトクラスＩＭＨＣ分子とを、抗 原特異的態様で前記ＣＤ８細胞を活性化するのに十分な時間、インビトロで接触 し；そして前記活性化されたＣＤ８細胞を前記患者に投与することを含んで成る 方法。
  18. １８．移植された組織の拒絶を阻止するための方法であって：ドロソフィラ細胞 上で表面一発現された空のヒトクラスＩ分子を毒素にインビトロで接合し； 前記接合されたクラスＩ分子と前記移植された粗織に由来する抗原性ペプチドと を、前記接合体に前記ペプチドを負荷するのに十分な時間、インビトロで接触し ； 前記ペプチドー負荷された接合体を分離し；そして前記ペプチドー負荷された接 合体を、移植処置を受けた個人に投与することを含んで成る方法。
  19. １９．誘発性プロモーターに操作的に結合される発現性ヒトクラスＩＨＨＣ遺伝 子を含んで成る組換えＤＮＡ配列。
  20. ２０．ベクターにおける請求項１９記載の配列。
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