JPH07500906A - 標識試薬を使用した結合検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 標識試薬を使用した結合検定法 発明の分野 本発明は、標識試薬を使用した結合検定法に関する。結合検定法は、液体サンプ ル中の抗原の濃度を測定するためのイムノアッセイを含み、そしてＤＮＡ配列を 含む液体サンプル中の他の分析物の測定又は検出のために、本発明を使用するこ とも可能である。

本発明は、非競合的なサンドイッチ検定法、すなわち、検定されるべき抗原又は 他の分析物、例えば、ホルモンを含む液体サンプルが、その分析物に特異的なそ の分子上の結合部位をもつ第一結合剤（例えば、抗体）により接触され、これに より、その液体サンプル中の分析物の濃度を表す第一結合剤上の結合部位のフラ クションが、その分析物により占有されるような検定法と特定の関係をもつ。

この結合部位のフラクションの占有率を、次に、結合された分析物と又は結合さ れた分析物により占有された結合部位と結合することができるが非占有結合部位 とは結合することができない第二結合材料の使用を含むバック−タイトレージョ ン技術により測定する。便利には、この第一結合剤を、以降、捕獲結合剤（ｃａ ｐｔｕｒｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）といい、そしてこの第二結合材料を 、以降、顕色結合材料（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍａｔｅｒｉ ａｌ）という。

非競合的検定法は、上記のバック−タイトレージョン技術が、捕獲結合剤上の結 合部位についてその分析物と競合する顕色結合材料、例えば、捕獲結合剤上の非 占有結合部位と結合することかできる分析物又は他の材料の標識変異体の使用を 含むような競合的検定法から区別されるべきである。但し、本発明を、このよう な検定において使用することもできる。それぞれの場合においては、顕色結合材 料の結合の程度は、顕色結合材料（又はその材料及び捕獲結合剤の両方）を、例 えば、蛍光標識により標識付けすることにより、そして、捕獲結合剤に結合した 分析物の結合された標識生成物及び未知サンプルの場合には顕色結合材料により 放射されるシグナル強度と、既知の分析物濃度の対応サンプルにより達成される シグナル強度であって一緒に投与量一応答曲線を提供するものとを比較すること により測定される。非競合的サンドイッチ検定法の１つのタイプは、標識された 顕色結合材料及び標識されてもよく又は標識されなくてもよい固定化された捕獲 結合剤の使用を含む。

背景技術 非競合的サンドイッチ・イムノアッセイが、一般的に、より慣用の競合的イムノ アッセイよりも高い感度を示すことは、目下、よく認識されている。このより高 い感度についての広く受け入れられた説明は、固定化捕獲結合前（普通には固体 支持体上に配置された抗体）の、そして標識された顕色結合材料（これもしばし ば抗体）の両方の比較的大量の使用にある。大量の抗体、特に捕獲抗体の使用に より、分析物と捕獲抗体との間の反応速度が増加し、質量作用の法則に従って、 より大量の分析物が、いずれかの特定の時間間隔内で固相捕獲抗体上に捕獲され るということを意味している。したがって、大量の捕獲抗体の使用は、非常に高 い感度と比較的短いインキュベーション時間とを組み合わせる非競合的イムノア ッセイの顕色に不可欠なものとして一般的に了解されている。（例えば、Ｍａｙ ｅｔ　ａｌ、”Ａｍｅｒｉｃａロ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　 Ａｓｓｅｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｆｒｅｅ　Ｔｈｙｒｏｉｄ　Ｈｏ ｒｍｏｎｅ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓ５ａｙｓ”　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉｃ ａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ　３７．　Ｎｏ、１１．　（１９９１）　 ａｔ　ｐａｇｅｓ　２００２−２００８を参照のこと。）このアプローチは、し かしながら、欠点を担持している。例えば、それは、不足することができ、そし て製造にコストがかかる抗体のかなりの消費を意味する。また、それは、捕獲抗 体がその上に沈着するところの固体支持体の全表面積を最大化するための様々な 戦略の使用を含んでいる。例えば、細孔性ガラス微小球であって、その細孔が抗 体付着のために利用されることができる表面積をがなり増加させるようなものが 、サンドイッチ検定装置内の固体支持体として使用されてきた。

Ｒｏｇｅｒ　Ｅｋｉｎｓは、先に、例えば、ＷＯ−８４１０１０３１、ＷＯ−８ ８１０１０５８及びＷＯ−８９１０１１５７中で、この一般的な理解が誤りであ り、そして特定の状況においては、未知サンプル及び分析物を含む標準サンプル が、その分析物の有意でないフラクションのみが捕獲結合剤に結合するようにな るような少量の捕獲結合剤によりそれぞれ接触されるとき、先に述べた条件下で 達成されるよりもさらに高い感度をもつ検定法が開発されることができるという ことを論じていた。（この有意でないフラクションは、そのサンプル中の分析物 の全量の、普通には５％未満、そして理想的には１−２％以下であり、サンプル 及び試薬操作の精度における限界、シグナル測定、標準化、温度変化等により、 その測定手順の他の場所の中に不可避なものとして導入された分析物の測定にお ける誤差が、一般的には、そのサンプル中の分析物の１０％のオーダーを有する が、ときどき、１０％はどまでの分析物のより高いフラクションの結合が正確な 測定があまり重要でないときには許容されることができる、というこに留意のこ と。）分析物の全量の存意でないフラクションが結合されるようになるときにだ け、捕獲結合剤上の結合部位のフラクション占有率Ｆは、以下の式Ｐ＝Ｋ［Ａ］ （式中、Ｋは、平衡において測定した分析物についての捕獲結合剤のアフィニテ ィ一定数であり、そして所定の温度及び他の所定の条件において一定である。） により、（熱力学平衡において）そのサンプル中の分析物の濃度［Ａ］と関係す る。熱力学的平衡に達する前も、上記の式は、だいたい適用でき（但し、そのサ ンプル中の分析物の有意でないフラクションがフラクション占有率の測定の時に おいて捕獲結合剤に結合するようになっており、その後に、より高い、有意な量 が結合されるようになるかどうかにかかわらず、例えば、その時までに、平衡が 達成されるような場合に限る。）、このような状況において、式中のＫが測定時 における分析物についての捕獲結合剤の明らかなアフィニティ一定数であるとい う変更にのみ従属している。

また、Ｒｏｇｅｒ　Ｅｋｉｎｓ　ｉｎ　ＷＯ−８９１０１１５７等により、１以 上のマイクロスポットであって例えば、１ｍｍ　”未満の直径をもつものの形態 において固体支持体上にスポットされた捕獲結合剤を使用し、１ｍｌ以下のオー ダーのサンプル容量を使用するような技術を行うことが提案されている。

しかしながら、上記のような装置により、十分に強力であるが感度のあるシグナ ルを与えることができる標識を提供するための問題が生じることができる。また 、非常に少量の固相捕獲結合剤の使用が内因的に長いインキュベーション時間を 必要としなけらばならず、そして低い感度の検定を生じさせるという理由で、マ イクロスポット（ｍｉｃｒｏｓｐｏｔ）検定フォーマットを使用して達成可能な 感度に関して、疑いが表明された。

発明の要約 我々は、今般、上記のような系において、その標識付は系として、マーカー、好 ましくは蛍光標識を担持するミクロン又は好ましくはサブ−ミクロン・サイズの 微小球を使用するこにより、非常に良好な結果が得られることができるというこ とを発見した。顕色結合材料単独のための又は顕色結合材料と捕獲結合剤の両方 のための上記のような標識の使用と、マイクロスポットの形態における固体支持 体上の高い表面密度において配置された非常に少量の捕獲結合剤とを組み合わせ ることにより、比較的多量の捕獲結合剤に頼っている従来のサンドイッチ装置の ものよりも、同程度に速く行え又はさらに速く行え、そしてこれに匹敵する感度 を又は事実上さらに優れている、非競合的検定装置を、改良することができる。

高感度検定法の設計に対する最近骨は入れられている見解に反し、そして全体と して予測されていない、この決定時な発見は、異例の高い感度を存し一方はんの 比較的短いインキュベーション及び測定時間を必要とする、様々な優れた小型化 された診断装置の開発の基礎を潜在的に作り出す。

もちろん、非常に少量の捕獲結合剤を同様に使用する競合的検定装置内での標識 付は目的のために微小球を使用することもできるが、のような装置内では、感度 についての限界が、事実上、その標識の比活性であることができず、そしてその 微小球の使用を原因とする感度における対応した又は実質的な増加は、それ故に 、必ずしも、達成され又はさらに期待されないであろう。但し、速さにおける増 加は、期待されることかできる。

本発明に従えば、液体サンプル中の分析物の濃度が標準サンプルから計算された 投与量一応答曲線による比較により測定され、分析物に特異的な部位をもつ捕獲 結合剤及び結合された分析物と又はその結合された分析物により占有された捕獲 結合剤上の結合部位と又はその捕獲結合剤上の占有されていない残りの結合部位 と結合することができる顕色結合材料を使用し、この捕獲結合剤が、そのサンプ ル中の分析物の有意でないフラクションのみがその捕獲結合剤に結合されるよう になるような量で使用され、そして標識が顕色結合材料に関連した検定中で使用 され、これによりその標識と関連したシグナル強度がその分析物による捕獲結合 剤上の結合部位のフラクション占有率を表すような、結合検定方法が提供され、 この方法においては、５μｍ未満のサイズをもち、そしてマーカー、好ましくは 蛍光標識を担持する微小球がその標識として使用される。

（以下に記載する）他の態様において、本発明は、結合検定法において使用され るキットを、また、液体サンプル中に一本鎖ＤＮＡ配列を含んで成る分析物の検 出又は測定のための結合検定法を提供する。

詳細な開示 ミクロン及びサブミクロン・サイズの蛍光微小球は、凡そ１９８２年以降に公知 であり、そして多くの源、例えば、５ｅｒａｄｙｎ　Ｉｎｃ、から、又はＭｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ、から、登録商標Ｆ１ｕｏＳｐｈｅｒｅｓ の下で、商業的に入手可能である。好適な微小球は、一般的に、５、μｍ未満の 、そして好ましくは、１μｍ以下の、より好ましくは、０．０１〜０．５μｍの オーダーの、直径をもっており、そしてすべてが同一の標準サイズを本質的に有 する球を使用することが好ましい。この微小球は、いずれかの好適な又は便利な 不活性材料、例えば、ポリマー・ラテックス、例えば、ポリスチレン・ラテック スから作られることができ、これは、所望により、その表面上に、負電荷の基、 例えば、スルフェート、カルボキシル若しくはカルボキシレート−修飾基又は正 電荷の基、例えば、アミジン基のいずれかを提供される。

その球の表面上の上記の電荷基の存在は、多種多様の蛋白、例えば、ＩｇＧ　、 アビジン／ストレプトアビジン及びＢＳＡが、必要なときに、様々な表面密度に おいてその球の表面に受動的に吸着され又は共有結合により結合されるこを可能 にする。

この微小球は、様々なタイプのマーカー、例えば、放射性、化学発光性又は酵素 の標識を担持することができるけれども、それらは、好ましくは、蛍光標識を担 持する。この蛍光及び放射性標識は、好ましくは、その微小球内に含まれ、そこ では、それらは、外側の影響力から遮蔽されるが、それらは（そして上記の酵素 及び化学発光標識が一般的であろう）、その球の表面上に存在することができる 。それぞれの微小球は、望ましくは、標識として多数の蛍光染料を、例えば、１ μｍ直径球においてはｌＯ百万まで、より小さな球（例えば、１００又は１．０ ００〜１００．０００又は１百万）においてはより少ない数で、非常に小さな球 においては約１０まで減少して、含む。この蛍光染料分子は、標準的なフィルタ ー・セットに匹敵する適当なカラー・レンジ（励起及び減衰波長）の蛍光　、例 えば、黄色／緑色、オレンジ色又は赤色を提供するために、選ばれることができ 、又は特注のフィルター・セットを使用することができる。蛍光染料は、クマリ ン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）、フルオレセイン（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）　、ロー ダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）及びテキサス・レッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）を 含む。この蛍光染料分子は、それにより放射されるシグナル強度が背景妨害が消 失した後に公知の時間−分解蛍光技術により測定されることができるような長い 蛍光時間をもつもの、例えば、ランタニド・キレート及びクリブタート（ｃｒｙ ｐｔａｔｅｓ）であることができる。非水性媒質中でのみ蛍光を発する染料を使 用することができる。この微小球における使用のために好ましい蛍光染料は、そ の微小球の内部へのそれらの取り込みを容易にするための油溶解性の染料である 。黄色／緑色、オレンジ色及び赤のＰｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓであって、それぞれ 、４８８．５６８及び６４７ｎｍにおけるクリプトン／アルゴン混合ガス・レー ザー線により非常に効率よく励起されるものが、目下、好ましい。

顕色結合材料のための又は捕獲結合剤及び顕色結合材料のための標識としての使 用において、本発明の検定装置内では、微小球は、発色結合材料、又は”ユニバ ーサル・マーカー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｍａｒｋｅｒ）″試薬として使用する ことができるアビジンをもち、そしてすべてのビオチン化された結合材料を結合 させることができ、又はこの場合のような捕獲結合剤は、その球の表面上に物理 的に吸着されることができる。しかしながら、より便利には、適当な表面−修飾 微小球を選択し、そしてその顕色結合材料（例えば、抗体）又は捕獲結合剤（例 えば、抗体）を、連結基を通してか又は直接にかのいずれかでそれらに共有結合 により結合させる。それは、例えば、カルボジイミド活性化により提供される。

したがって、例えば、微小球と結合材料とを結合させるために、結合材料は、疎 水性のスルフェート−修飾微小球上に吸着され、又はアルデヒド−修飾又はカル ボキシレート−修飾親水性微小球に共有結合により結合されることができる。後 者は、水溶性カルボジイミドを介してのものである。捕獲結合剤と顕色結合材料 の両方が、蛍光微小球により標識されるときは、もちろん、異なる染料が、２セ ツトの微小球において使用されるであろうし、そして次に、そのシグナル強度比 を、ＷＯ８８１０１０５８中のような比較のために、測定しそして使用すること ができる。

それ故、顕色結合材料の１分子又はユニットが多数の蛍光染料分子又はかなりの 数の他の標識分子を原因とするシグナルを生じさせるという意味において、蛍光 染料の多数の分子を含む微小球が、（他のタイプの標識、例えば、放射性又は化 学発光標識の幾つかの分子を含み又は担持する微小球がそうするように）増幅装 置を提供することは、明らかであろう。したがって、このような増幅装置は、例 えば、非常に少量の捕獲結合剤だけが使用され、そしてこれ故、顕色結合剤の量 も非常に少ないときに、検定感度における制御要素がシグナルの大きさであるよ うな、これらの検定手順の感度を、非常に増加させることができる。

この微小球は、固定化材料、普通には捕獲結合剤（捕獲抗体）が、１ｍｍ　”か ら１００μｍ２以下までの面積をもつ、例えば、直径０．０１−１ｍｍの、１以 上のマイクロスポットの形態の固体支持体上に吸着されるが、非常に小さいマイ クロスポットのためには、非常に小さな微小球又は少し大きな微小球を使用する ことが必要であるかもしれないような、検定装置と一緒になって、主に使用され る。このマイクロスポット上の捕獲結合剤の表面密度は、望ましくは、抗体の場 合においては、１．０００−１ｏ０．０００分子分子用！、好ましくは、１０． ０００〜５０．０００分子分子用！の範囲内にある。他の結合剤については、こ の表面密度は、この範囲内にあるか又はその上か下にあることができるが、好ま しくは、その分析物分子の結合を立体的に妨害することないように可能な限り高 （あるべきである。これらのマイクロスポットは、そのマイクロスポットを被覆 することを目的としながら、そのマイクロスポットのサイズに依存して、一般的 には、１ｍｌ以下の、例えば、５０又は１００μｌあるいはさらに少ないサンプ ル・サイズと一緒になって使用される。

このマイクロスポット技術は、異なるマイクロスポット、例えば、１０以上、例 えば、５０以上までのものの上に、同一の固体支持体上に異なる捕獲結合剤を固 定化し、そして異なる結合検定のための微小球により標識された異なる又は同一 の発色結合材料を使用することにより、単一操作において、同一の又は異なる液 体サンプル中の異なる分析物を測定するために、使用されることができる。異な る結合検定に関連した標識（例えば、蛍光染料）及び／又はシグナル強度を測定 するために使用される技術は、異なる検定からの結果が区別されることができる ように選ばれるであろう。このための技術は、例えば、ＷＯ〜８８１０１０５８ から、公知である。

本発明により達成される結果を最適化するために、多数の異なる特徴が、最適化 されるべきであり、これは、以下の事項を含んでいる； １）分析物による捕獲結合剤のフラクション占有率、Ｉｉ）測定が行われる時に おける、そして平衡が達成される前に測定が行われる場合には、平衡が達してい るところの速度における、その分析物についてのアフィニティ一定数のサイズ、 １ｉｉ）その支持体上の捕獲結合剤の表面密度、ｉｖ）そのマイクロスポットの サイズ、■）その支持体の性質、 ｖｉ）そのシグナルを測定するために使用する装置、ｖｉｉ）その微小球の処理 、例えば、未反応部位をブロックするため特徴１）については、非常に多くの捕 獲結合剤の使用が最適感度のために裂けられるへきであるということに留意すべ きである。最も高いシグナル／ノイズ比（Ｒ）が、捕獲結合剤の量が０．０１／ により下に低下し、そしてゼロに達するときに（その測定装置それ自体はゼロ・ ノイズを生じさせると仮定する）、Ｋが測定の時に捕獲結合剤と分析物との間の アフィニティ一定数でありながら、得られるということは、理論的に証明されて いる。このシグナル／ノイズ比をＲｏとじて定める（０．０１／にの捕獲結合剤 の量が、その捕獲結合剤が晒されるところの溶液中に存在するく１％の分析物分 子に結合するということに留意のこと。）。捕獲結合剤がその上に吸着されると ころの面積が増加する場合には（結合剤の方面密度が一定に残存している）、あ る量の結合剤が、付随して増加するであろう。また、結合した全分析物のパーセ ンテージも、（より少ない割合の程度にもかかわらず）増加するであろうが、こ のシグナル／ノイズ比は、減少するであろう。例えば、その面積が、結合剤の量 が１／Ｋに等しくなるように１００倍増加する場合には、結合剤の量は、５５０ ％に上昇し、そしてそのシグナル／ノイズ比は、Ｒ０／２のオーダーまで減少す るであろう。

上記比Ｒと捕獲結合剤濃度（すなわち、結合剤により被覆された領域）との間の 関係を、添付図面の図Ｉ中に示す。この図は、（１／にの単位、Ｘ−軸における ）その被覆領域上の捕獲結合剤の全量の関数としての、シグナル／ノイズ比（連 続線は、ｙ−軸がその領域が結合剤により被覆された時の値の％であり、そして この故にその結合剤濃度である場合には、ゼロに近づく。）と、結合された分析 物の量（不連続線は、ｙ−軸が分析物の全量を装うその媒質中に存在する全分析 物の％である場合には、が非常に低く、すなわち、＜０．０００１／にである。

）のグラフである。明らかに、捕獲結合剤により被覆された領域（そしてこれ故 にその濃度）が増加するとき、結合された全分析物のパーセンテージは、増加す るが、そのシグナル／ノイズ比は、減少する。この効果は、添付図面の図２中に 絵として示した。

ここで、ｄは、捕獲結合剤により被覆された領域のｍｍにおける直径であり、［ Ａｂ］は、ｍｍ”当たり０．ｌ／にの表面密度を装う結合剤の濃度であり、そし てｓ／ｎは、その表面積がゼロに近づくときに観察される値のパーセンテージと して表されたシグナル／ノイズ比である。

この図は、なおその上に、その被覆面積が増加するとき、結合した分析物の量も 増加するが、そのシグナル／ノイズ比及びこれ故の感度が減少するということを 示す努力をしている。

しかしながら、シグナル／ノイズ比Ｒが、結合剤濃度が０．０１／に未満のとき 最も高いのであるが、この比は、使用された捕獲結合剤の量が１／Ｋに等しいか 又は超えるときでさえ、未だに許容できるほど高くなることができるということ は明らかである。マイクロスポット領域上に被覆された結合剤の量に対する上限 は、好ましくは１０／にである。このことは、１００〇−倍低い量の結合剤を使 用して達成されることができるものよりもｌ叶倍低い感度を意味し、そして本発 明は、非常に高感度を作り出すことができるけれども、達成されることができる 最大値よりも低い感度が許容される場合にも使用することができるということが 強調されるべきである。

要因ｉｌ）についいては、−見、Ｋの低い平衡値をもつ結合剤を使用することが よいようであるかもしれないが、実際には、高感度検定のためには、平衡におい てより高い値のに１例えば、ｔｏｌｌ−ｔｏ　＋！以上リッター１モルをもつ結 合剤を使用し、そして、たとえ測定が平衡に達するまで遅らされる場合に分析物 の実質的なフラクションが結合されるようになるにせよ、（必要又は要求される 場合には、）測定の時において、分析物の有意でないフラクションのみが結合さ れるようになり、そして測定の時においてＫの有効値がかなり小さくなる、例え ば、１０＠−１０”になることができるように、平衡に達する前に測定するのが よい。Ｋのより高い有効値が、その分析物の濃度が低い（例えば、１０’分子／ ｍｌ）場合には、より適切であることができ、そしてより低い有効値のＫが、そ の分析物の濃度が高い（例えば、１０１４分子／ｍｌ）の場合には、より適切で あることができる。望ましくは、有効値のＫは、サンプル中の測定されるべき分 析物濃度の逆数の次数を有する。使用される濃度において、平衡が１２時間又は いくぶん少ない時間以内に達成されるが、平衡に達する前にその測定が約２時間 以下以内に行われるように、捕獲結合剤を使用することが好ましい。この初期の 前平衡測定は、ＤＮＡプローブによる場合のように、捕獲剤が分析物についての 非常に高いアフィニティ一定数をもつ場合には、特に重要である。

要因ｉ目）については、非常に低い表面密度がシグナル／ノイズ比を減少させる ということに留意しなげればならない。なぜなら、捕獲結合剤により占有され且 つその比を測定するために走査された領域が増加するからである。他方において 、非常に高い表面密度は、分子のすべてが分析物を結合させるために利用できな いように、隣接捕獲結合剤分子の間で立体的な障害を引き起こす。立体的な障害 が問題であるかどうかを見る初歩的な実験は、変化する結合剤の表面密度のスポ ットを作り、標識、例えば、Ｉｌｌ　（によりそれらを標識付けし、そして最適 値を最も高いシグナルとしながら、そのシグナルが結合剤表面密度によりどのく らい変化するのかを測定することにより、行われることができる。過去において は、慣用の手順が、ｍ１当たりｌＯμｇのオーダーの捕獲結合剤（抗体）の被覆 が使用されてきたが、本発明については、ｍ１当たり１００−２００μｇの数字 が、より適切であることができる。また、より高い表面密度の使用は、より小さ な表面が、非特異的結合であって他方においてそのノイズを増加させ、そしてそ のシグナル／ノイズ比を減少させるものに利用されることができるという、利点 をもっている。

要因ｖｉ）については、シグナル／ノイズ比を最大化することが好ましい。従っ て、そこからシグナルが測定されるところの領域は、望ましくは小さく、好まし くは、マイクロスポット又はその部分の領域に限定される。そのマイクロスポッ トより先のより広い領域からのシグナルを測定することは、そのシグナル・レベ ルを増加することなくそのノイズ・レベルを増加させ、そしてそれ故、そのシグ ナル／ノイズ比を減少させる。これ故に、共焦点顕微鏡又は非常に精密な顕色を 達成することができる他の装置により、顕色を集中させ、そして測定を行うこと が要求されることができる。

要因ｖｉｉ）については、顕色結合材料又は捕獲結合剤の微小球への吸着又は共 有結合後、その微小球の未反応部位は、それらが捕獲結合剤のための他の生体分 子又は固体支持体へ非特異的に結合することを避けるために遮蔽される。遮蔽は 、非妨害蛋白材料のいずれかにより行われることができる。アルブミン、特にウ シ血清アルブミンが好ましい。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）又は等偽物によっ てだけではなく、洗剤、例えば、ＴＷＥＥＮ−２０又は他の非イオン洗剤によっ ても遮蔽することが必要であることが見つかった。ＢＳＡ又は他の蛋白材料単独 により遮蔽されない微小球上の幾つかの結合部位が在ると信じられている。ＢＳ Ａ単独により遮蔽された微小球は、さらに、固一体支持体、例えば、検定が行わ れるところのマイクロタイターｗｅｌｌのプラスチック壁に、又は例えば、その 系（例えば、液体サンプル）の他の成分中に存在する他の生体若しくは非生体分 子に、結合することができる結合部位を、捕獲結合剤への非特異的結合を可能に しながら、もつようである。追加の遮蔽剤としての洗剤の使用は、このような結 合部位の数を減少させ、又はそれらを全体に取り除く。

また、この洗剤は、ゆるく結合した結合剤又は材料あるいは他の蛋白であって保 存バッファー及び／又は検定バッファー中に吸着されることができるものを除去 することを助け、そして検定を妨害する。

非妨害反応体は、微小球の表面上の活性化された基、例えば、不活性アミン、例 えば、活性化カルボキシル基を遮蔽するためのエタノールアミン、グリシン又は リジンを、遮蔽するために使用されることができるが、いずれの特定の化合物も 、検定適合性についてチェックされるべきである。

要因ｖｉｉｉ）については、検定バッファー及び洗浄バッファーのための成分の 選択は、その結果の感度に影響を及ぼすことができるということに留意すべきで ある。ＴＳＨにより、例えば、ＴＲｌ５が、リン酸塩よりも良好なバッファーを 与える。また、そのバッファー中に洗剤、例えば、ＴＷＥＥＮ　４０を含み非特 異的結合を減少させることが必要であるかもしれない。

他の態様においては、免疫検定は、公知の方法、例えば、先に述べたようなＲｏ ｇｅｒ　Ｅｋｉｎｓの先の特許出願（これを引用により本明細書中に取り込む） 中に、又は他の文献中に、記載されるようなもの、において行われることができ る。イムノアッセイを行うとき、捕獲結合剤及び発色結合材料の両方が抗体であ ることが好ましいが本質的ではない。モノクロナール又はポリクロナールの抗体 を使用することができ、そしてその手順を、分析物、例えば、ホルモン、核酸、 蛋白、ビタミン、薬、ウィルス、バクテリア、農薬、腫瘍マーカー又は生体サン プル、例えば、体液の他の成分を検定するために、その捕獲結合剤及び間色結合 剤を問題の分析物に結合するように適当に選択しながら、使用することができる 。結合検定における分析物は、ヌクレオチド配列、例えば、ＤＮＡオリゴヌクレ オチド配列であることができ、この場合においては、捕獲結合剤及び顕色結合材 料が、両方、他のヌクレオチド配列であって互いに異なるものであろうものであ ることができる。この分析物は、その捕獲結合剤のためのたった１つのエピトー プを含むことができ、又はそのエピトープは、その分析物分子上で複製されるこ とができる。ポリクロナールの発色結合材料（抗体）は、その分析物又はその分 析物捕獲結合剤複合体上の様々なエピトープと反応するおとができ、又は異なる エピトープと反応する２以上のモノクロナール抗体顕色結合材料（抗体）を使用 することができる。

核酸（ＤＮＡ）検定のために使用するとき、ＤＮＡプローブ、−重鎖ヌクレオチ ド配列、例えば、慣用の又は標準的なタイプのオリゴヌクレオチド配列が、捕獲 結合剤として、固体支持体に付着され、そしてこれが、液体サンプル中の分析物 を構成する対応する一本鎖ＤＮＡ配列を認識し、そしてこのような配列は、双子 ストランド配列（ｔｗｉｎ−ｓｔｒａ口ｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を形成するよう に結合されるようになる。オリゴヌクレオチド配列から成るＤＮＡプローブは、 多数の会社、例えば、Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、 から商業的に入手可能であり、又はそれらは、整列されるために合成されること ができ、及び／又は商業的な会社、例えば、Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｌｔｄ、により、（例えば、ビオチン又はジゴ キシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）により）修飾されることができる。この 顕色結合材料は、標識抗体であって一本鎖配列に対するものとしての双子ストラ ンド配列を認識するもの（添付図面の図３を参照のこと）、又は他のＤＮＡ配列 であってその分析物を構成する他のＤＮＡ配列の他の部分を認識し且つ標識され たもの（添付図面の図４を参照のこと）のいずれかであることができ、これらの 結合材料の両方が、非競合的検定を作り出す。競合的検定のためには、捕獲結合 剤の非占有部位、すなわち、分析物に結合していない残りのＤＮＡプローブ、を 認識する標識された顕色結合材料を使用することが可能である（添付図面の図５ を参照のこと）。それぞれの場合において、この標識は、本発明に従って、マー カー、好ましくは、その微小球内に含まれる蛍光染色の分子、を担持する微小球 により提供される。図３−５のそれぞれの中では、Ａは、マイクロスポットを表 し、Ｂは、捕獲結合剤を、そしてＭは、微小球を表している。図３中では、Ａｂ ＤＳＤは、２本鎖ＤＮＡに対する抗体であり、そして図４中では、ＡｂＤは、抗 −ジゴキシゲニン抗体であり、そしてＤは、ジゴキシゲニンである。これらの方 法論を使用するハイブリダイゼーション技術は、既に公知である。例えば、例： 　Ｇｕｅｓｄｏｎ　Ｊ−Ｌ　（１９９２）、　”Ｉｍｍｕｎｏｅｎｚｙｉ＋ｉｃ 　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　５ｐｅｅｉｆｉｃ　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ”、　Ｊｏｕｒｎａｌ 　ｏｆ　［ｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ　１５０．３３−４９；　 Ｍａｎｔｅｒｏ　Ｇ、　Ｚｏｎａｒｏ　Ａ、　Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ　Ａ、　Ｂｅ ｒｔｏｌｏ　Ｐ　＆　Ｐｒ１ｍ１　Ｄ、　（ｉ９９１）、　”ＤＮＡ　Ｅｎｚｙ ｍｅ　１ｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｄ ｅｔｅｃｔｉｎｇＰｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ 　Ｒｅａｃｔｉｏｎ”、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３７／３． ４２２−４２９：　Ｋｅｌｌｅｒ　Ｇ、Ｈ，、Ｈｕａｎｇ　Ｄ−Ｐ、　５ｈｉｈ Ｗ−Ｋ　＆　Ｍａｎａｋ　Ｍ、Ｍ、　（１９９０）、　”Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　 ｏｆ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　Ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ１ｎ　Ｓｅｒｕｍ　ｂｙ　 Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　Ｓａｎｄｗｉｔｃｈ　Ｈｙｂｒｉｄｉ ｚａｔｉｏｎ″、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ　２８／６．１４１１−１４１６；　Ｎ１ｃｋｅｒｓｏｎ　Ｄ、Ａ、、 　Ｋａｉｓｅｒ　Ｒ，、Ｌａｐｐｉｎ　Ｓ。

Ｓｔｅｗａｒｔ　Ｊ、　Ｈｏｏｄ　Ｌ　＄　Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　Ｕ　（１９９ ０）、　”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｕｓｉｎｇ 　ａｎ　ＥＬ［５Ａ−ｂａｓｅｄ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、Ｌｉｇａ ｔｉｏｎ　Ａｓ５ａｙ”。

Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　 ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　８７．８９２３−８９２７；　Ｗｏｌｆ　Ｓ、Ｆ、、 　Ｈａｉｎｅｓ　Ｌ、、　Ｆｉｓｃｈ　Ｊ、、　ｋｒｅｍｓｋｙ　Ｊ、Ｎ、、　 ＤｏｕｇｈｅｒｔｙＪ、Ｐ、　＆　Ｊａｃｏｂｓ　Ｋ、　（１９８７）、　”Ｒ ａｐｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ａ ｔｔａｃｈｅｄ　ｔｏ　Ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ　Ｌａｔｅｘ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ’、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｉ５／７．２９１１− ２９２６．を参照のこと。

それ故、本発明に記載のＤＮＡ検定は、ＤＮＡ配列を検定するためのよく知られ たポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に対する変法を提供する。

このＰＣＲ法は、最初の非常に低い濃度のＤＮＡ配列に対する増幅（２重化）の 反復サイクルにより導入される誤りを含む特定の欠点を受けている。本発明は、 顕色結合材料（抗体又は他のＤＮＡ配列）の分子が吸着又は直接的若しくは間接 的な化学結合により付着されるところの微小球内に含まれる多数の蛍光染料によ り、検出又は測定されるべきＤＮＡ配列の最初の非常に低い濃度が１段階におい て増幅されたシグナルを生じさせるような他の強化された手順を提供する。

本発明のさらなる態様に従えば、液体サンプル中に一本鎖ＤＮＡ配列を含んで成 る分析物の検出のための結合検定法であって、非競合的又は競合的手順において 、そのサンプルを、その液体サンプル中の分析物を認識し且つそれと結合するこ とができる一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブである固定化捕獲結合剤と 、そして標識顕色結合材料であって、そのプローブ及び分析物から形成された双 子ストランドＤＮＡ配列だけを認識しそしてそれと結合することができる抗体で あるか、又はその分析物の他の部分又はその残りのプローブのいずれかを認識し 且つこれと結合することができるオリゴヌクレオチドＤＮＡ配列であるかのいず れかであるものと接触させ、その顕色結合材料を、５μｍ未満のサイズをもちそ してマーカーを担持している微小球により標識し、そして、非付着の顕色結合材 料を除去した後、固定化された捕獲結合剤に直接的に又は間接的に結合されるよ うになっている顕色結合材料に付着したマーカーからのシグナルの存在又は強度 により、その分析物の存在を検出すること、を含んで成る方法を提供する。

好ましくは、このマーカーは、例えば、０．０１−１　μｍの、例えば、０．０ ５〜０．５μｍのサイズをもつ微小球内に含まれた多数（１００以上）の蛍光染 料分子の形態での、蛍光標識である。既に述べたマイクロスポット技術と一緒に 、捕獲結合剤が上記表面密度において固体支持体上に１以上のマイクロスポット として固定化され、そしてマイクロスポットのサイズが既に述べたものであり、 そして場合により異なる捕獲結合剤が同一支持体上の異なるマイクロスポット上 に固定化され、複数の異なるＤＮＡ配列が単一操作において、適切に差異を付け られた顕色結合材料及びシグナル検出又はシグナル測定技術を使用して、検出又 は測定されることができるようにしながら、上記の技術を使用することが好まし い。

−重鎖ＤＮＡプローブを形成し、そして固体支持体上にそれを固定化するための 手順は、よく知られており、そして文献、例えば、上記のＧｕｅｓｄｏｎ及び先 に記載した引用中に記載されており、そして標準的な技術を、このために、そし て例えば、沸騰による、検出されるべき分析物（存在してもしなくてもよい一本 鎖ＤＮＡ配列）を含む液体サンプルの形成のために、使用することができる。顕 色結合材料の微小球への結合を、マーカー不合固体支持体への固定化のための知 られた方法、例えば、Ｗｏｌｆ　ｅｔ　ａｌの先に記載した文献中に記載されて いるようなもの、により行うことができ、そして汚染等及び他の妨害影響力を避 けるための普通の予防措置状とられるべきである。

さらなる態様においては、本発明は、結合検定法における使用のためのキットで あって、液体サンプル中の分析物の濃度を、その分析物に特異的な結合部位を持 つ捕獲結合剤及び顕色結合材料であって結合された分析物と又はその結合された 分析物により占有された捕獲結合剤上の結合部位と又はその捕獲結合剤上に未占 有で残った結合部位と結合することができるものを使用して測定し、標識を、そ の顕色結合材料との関係において使用し、これにより、その標識と関連したシグ ナル強度がその分析物によるその捕獲結合剤上の結合部位のフラクション占有率 を表し、（ａ）その上に固定化された捕獲結合剤をもつ固体支持体、（ｂ）マー カーを担持している微小球の表面に、吸着されたか又は直接的に若しくは間接的 に化学結合された顕色結合材料を含んで成る間色試薬、及び（Ｃ）測定されるべ き分折物の既知の量又は濃度をもつ標準、を含んで成るようなキットを、提供す る。

好ましくは、この発色試薬は、その微小球に付着した顕色結合材料を含むバッフ ァー溶液を含んで成るが、凍結乾燥形態の試薬を提供することもできる。同様に 、その標準は、既知濃度においてその分析物を含むバッファー溶液、又は溶液形 態で適当な再構築のための指示による凍結乾燥された形態として提供されること もできる。

この標準は、ホルモン不含血清中で調製されることができる。３以上の標準、例 えば、１２までの、未知サンプル中の予測値にわたる変化した既知の分析物の濃 度が、在ることができる。

好ましくは、上記の顕色試薬は、５μｍ未満のサイズをもち、そして蛍光染料の 分子を含む微小球に共有結合で結合されたか又吸着された顕色結合材料を含み、 そしてその固体支持体は、１ｍｍ　”未満のサイズの及び少な（とも１０００分 子／μｍ２表面密度の１以上のマイクロスポットの形態でその上に固定化された 捕獲結合剤をもつ。

異なる捕獲結合剤を、同一の固体支持体上の異なるマイクロスポット上に固定化 することができ、そして複数の異なる顕色試薬及び異なるセットの標準を、異な る分析物のための様々な異なる検定を単一操作において同一の固体支持体を使用 して同時に又は逐次的に行うことができるように、提供することができる。

本発明を、以下の例中にさらに記載するが、これは、標識された顕色結合材料の 調製（例１−４）並びに本発明に記載の方法及びキット（例５−１２）について 説明している。

例中においては、濃度のパーセンテージは、重量によるものである。

一 疎水性スルフェート−微小球上の抗体又はアビジンの吸着□ １）直径０．０８又は０．１２μｍをもつその微小球（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐ ｒｏｂｅｓ　ＩｎｃからのＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ　−ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓ は、登録商標である。）内の蛍光染料分子を含むポリマー・ラテックス材料の界 面活性剤−不含スルフェート−活性化微小球の純水中の２％固形分懸濁液の０． ５ｍｌを、１ｍｌの、ｐＨ７，４における０、　１Ｍリン酸塩バッファー中に溶 解した顕色結合材料（抗体又はアビジン）の２ｍｇに、滴下した。この懸濁液を ４°Ｃで一夜、振とうした。

２）この懸濁液を、１０″Ｃで３０分間、２０．００Ｏｒｐｍにおいて遠心分離 しく遠心分離の時間及び速度は、そのラテックス微小球のサイズにより変化する であろう。）、未反応抗体から抗体−結合ラテックス微小球を分離した。この上 澄の抗体又はアビジンを、蛋白の推定のために回収した。

３）遠心分離したペレットを、音波処理により１．０ｍｌの、０．１Ｍリン酸塩 バッファー中に分散させた。分散後、微小球上の未占有疎水性部位を、１ｍｌの 、２％（１％最終）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の添加により遮蔽し、そして 室温において２時間振とうした。この球を、さらに、２００μｌの５％Ｔｗｅｅ ｎ−２０（−０，５％最終）の添加により遮蔽し、そして室温において１時間振 とうした。この洗剤インキュベーション段階は、また、保存及び／又は検定バッ ファー中に吸収されるかもしれ、そして検定を妨害するかもしれない弱く結合さ れた抗体／アビジンを強固なものにするのに役立った。

４）上記調製物を、上記の如く遠心分離し、そしてその微小球を、２ｍｌの、０ ．１Ｍリン酸塩バッファー中に再懸濁させた。

５）段階４を２回繰り返した。最後の遠心分離の後、その微小球を、０．２％Ｂ ＳＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを含む２ｍｌのリン酸塩バッファー中に分 散させ、そして４℃で保存した。

ｌ）蛍光染料分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　ＩｎｃからのＦｌｕｏ Ｓｐｈｅｒｅｓ）を含み且つ直径０．０９μｍをもつカルボキシレート−修飾ポ リマー・ラテックス微小球の純粋な材料中の２％固形分懸濁液の０．５ｍｌを、 顕色結合材料として２ｍｇの抗体又はアビジンを含む、０．５ｍｌの、０．０１ ５Ｍ、　ｐＨ５の酢酸塩バッファーに滴下した。この懸濁液を室温で１５分間、 インキュベートした。

２）　４ｍｇのＨＤＡＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）− カルボジイミド］（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を、上記 混合物に添加し、そして攪拌した。このｐＨを、希ＮａＯＨにより６．５±０． ２に調整しくこのラテックス微小球の凝集がこの段階で観察されたが、それらは 、穏やかな音波処理により再分散されることができる。）、そしてこの反応混合 物を、４°Ｃで一夜混合した。

３）この反応混合物を、１０°Ｃで３０分間、２０．０００ｒｐｍにおいて遠心 分離した。この上澄液を、蛋白の推定のために回収した。

４）遠心分離したペレットを、音波処理により１．０ｍｌの、０．１Ｍリン酸塩 バッファー中に分散させた。分散後、微小球上の未占存部位を、１ｍｌの、２％ （１％最終）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の添加により遮蔽し、そして室温に おいて２時間振とうした。この球を、さらに、２００μｍの５％Ｔｗｅｅｎ−２ ０（−０，５％最終）の添加により遮蔽し、そして室温において１時間振とうし た。

５）上記調製物を、上記の如く遠心分離し、そしてその微小球を、２ｍｌの、０ ．１Ｍリン酸塩バッファー中に再懸濁させた。

６）段階５を２回繰り返した。最後の遠心分離の後、抗体−又はアビジン−結合 微小球を、０．２％ＢＳＡ及び０．０１％アジ化ナトリウムを含む２ｍｌのリン 酸塩バッファー中に分散させ、そして４℃で維持した。

例３ ２段階によるカルボキシレート−修飾ラテックス微小球への抗体又はアビジンの 共存結合 ■）例２中で使用したカルボキシレート−修飾ポリマー・ラテ・ソクス微小球の 懸濁液の０．５ｍｌを、１０ｍ１の遠心分離チューブに添加し、そして１０°Ｃ で３０分間、２０．０００ｒｐｍで遠心分離した。

２）遠心分離したペレットを、０．０２Ｍリン酸塩バッファー、ｐＨ４，５中に 再懸濁し、そして上記のように遠心分離した。

３）段階２を繰り返した。

４）０．５ｍｌの、ＥＤＡＣの２％溶液を、上記分散微小球に滴下しくこのラテ ックス微小球の凝集がこの段階で観察されたが、それらは、穏やかな音波処理に より再分散されることができる。）、そしてこの反応混合物を、室温において穏 やかに混合し、そして上記の如く３時間遠心分離した。

５）遠心分離したペレットを、０．２Ｍボレート・バッファー、ｐＨ８，５中に 再懸濁し、そして上記のように遠心分離した。

６）段階５を２回繰り返した。

７）この遠心分離したペレットを、０．５ｍｌのボレート・バッファー中に再懸 濁させ、０．５ｍｌの同一バッファー中に溶解させた２ｍｇの抗体又はアビジン に滴下し、そして室温において一夜穏やかに混合した。

８）この懸濁液を、上記の如く遠心分離し、この上澄液を、蛋白の推定のために 維持した。

９）遠心分離したペレットを、１ｍｌの、ボレート・バッファー中の０゜１Ｍエ タノール・アミン中に再懸濁し、室温において３０分分間中かに混合し、そして そして上記の如く遠心分離した。

１０）遠心分離したペレットを、１ｍｌの、１％ＢＳＡ中に再懸濁し、１時間緩 やかに混合し、そしてそして上記の如く遠心分離した。

１１）遠心分離したペレットを、１ｍｌの、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に再懸 濁し、１時間緩やかに混合し、そしてそして上記の如く遠心分離した。

１２）遠心分離したペレットを、１ｍｌの、０．０２Ｍリン酸塩バッファー、ｐ Ｈ７，４中に再懸濁し、そしてそして上記の如く遠心分離した。

１３）遠心分離したペレットを、１ｍｌの、０．２％ＢＳＡ及び０．０１％のア ジ化ナトリウムを含むリン酸塩バッファー中に再懸濁し、そしてそして４°Ｃで 維持した。

乳懸 吸着又は共有結合による抗体及びアビジンの混合物の微小球への結合 吸着又は共有結合による抗体及びアビジンの混合物の微小球への結合のための方 法論は、抗体又はアビジンの微小球への結合のために先に例１〜３中に記載した ものと本質的に同じである。但し、その反応のために使用する抗体溶液も、少量 のアビジンを含んでいた。

１）　１ｍｇのモノクロナール抗−ＴＳＨ抗体を、１ｍｌのカーボネート・ノ＜ ・ンファ−ｐＨ９中に溶解した。

２）　１ｍｇのＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎ ｃ、）を、２５０μｌのＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）中に溶解し、４μｇ／μｌの濃度を得る。

３）　１０　μｌの４μｇ／μｌのＴｅｘａｓ　Ｒｅｄを抗体溶液に添加し、攪 拌し、そして氷上に２時間放置した（染料対蛋白比（ｗ／ｗ）＝０．０４）。

４）　Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ−結合抗体を、Ｏ，１Ｍリン酸塩バッファー、ｐＨ７ ，４による溶出によりｐＤｌｏ　５ｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ ａ）上で未反応の及び加水分解された染料から、分離した。

５）アジ化ナトリウムを保存剤として標識抗体に添加しく０．１％）、そしてそ の調製物を４°Ｃで保存した。

１）　２ｍｇの抗体又はＢＳＡを、１ｍｌのｐＨ８，５のビカーボネート・バッ ファー中に溶解した。

２）　２．２ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドイル６−（ビオチンアミド） 　、ヘキサノエート（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、５５μｍ のＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解し、４０μｇ／μｌの濃度を得る。

３）ｌＯμｌの４０μｇ／μｍのビオチンを抗体又はＢＳＡ溶液に添加し、室温 において２時間振とうした（ビオチン対蛋白比（ｗ／ｗ）＝０．２）。

４）上記反応を、１０ｍｇのグリシンの添加にいより終了させた。

５）ビオチン−結合１ｇＧ又はＢＳＡを、Ｏ，１Ｍリン酸塩バッファー、ｐＨ７ ゜４による溶出によりｐＤｌｏ　５ｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ ａ）上で未反応のビオチンから、分離した。

６）アジ化ナトリウムを上記結合調製物に添加しく０．１％）、そしてそれを４ °Ｃで保存した。

ｌ）白色のポリスチレン・マイクロタイターｗｅｌｌ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓからのＭｉｃｒｏｌｉｔｅ　１）を、０．１Ｍリン酸塩バッファー、ｐ Ｈ７，４中で１μｍ以下の、２００μｇ／ｍｌのモノクロナール抗−ＴＳＨ捕獲 抗体によりスポットした。この抗体小？ｍ　（ｄｒｏｐｌｅｔｓ）を、直ちに吸 引し、そしてそのｗｅｌｌを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより遮蔽（ｂｌｏｃｋｅ ｄ）　シ、そして同一バッファーにより広範に洗浄した。この抗体マイクロスポ ットを、使用までバッファー中に維持した。

２）ｐＨ７，７５における０、０５Ｍ／ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩバッファー（洗浄 バッファー）により濯いだ後、２００μｍの、検定バッファー中の標準又はサン プルのどちらかを、それぞれのｗｅｌｌに添加し、そして３０分から数時間まで の間、室温において（又は、最大検定感度が要求される場合には４°Ｃにおいて 一夜）振とうした。

３）上記のｗｅｌｌを、洗浄バッファーにより４回洗浄した。

第二段階 １）検定バッファー中の直径０．１μｍの蛍光染料含有微小球（〜０．０１Ｂ抗 体結合微小球を含む）に結合した２００μｌの顕色結合材料抗体のアリコツトを 、それぞれのｗｅｌｌに添加し、そして室温において０゜５〜１時間振とうした 。

２）このｗｅｌｌを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｗ／ｖ）を含む洗浄バッフ ァーにより７回洗浄し、完全に乾燥するまで吸引し、そしてＭＲＣ−６００レ一 ザー走査共焦点顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｉｃｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）により走 査した。それぞれのマイクロスポットから放射されるシグナルを、定量し、そし てその結果を、標準投与量−反応曲線と比較し、未知サンプル中のＴＳＨの濃度 を測定した。

投与量−反応曲線の調製のために使用した標準は、検定バッファー中に０．０１ ．０．０３．０．１，０．３．１．３．１０及び３０μＵ　ＴＳＨ／ｍｌを含Ｔ ｒｉｓ−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン　５０　ｍＭ／１塩化ナトリウム 　９．０　ｇ／ｌ ウシ血清アルブミン　５．０　ｇ／ｌ ウシ・グロブリン　０．５　ｇ／Ｉ Ｔｗｅｅｎ　４０　０．１　ｇ／ｌ アジ化ナトナトリウム　０．５　ｇ／ｌＨＣｌ　２５°Ｃにおいて７．７５のｐ Ｈになるまで例６ 甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）についての検定を、捕獲及び顕色抗体としてＴＳ Ｈ分子上の異なるエピトープに向けられている２つのモノクロナール抗体を、そ してＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 ５ｔａｎｄａｒｄｓ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｔにより供給されたＴＳＨ標準サン プルを、使用して行った。この捕獲抗体を、受動的吸着によりＤｙｎａｔｅｃｈ 　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　マイクロタイターｗｅｌｌｓ上に約０．５ｍｍのマイク ロスポットとして吸着させ、約４０．０００１ｇＧ分子／μｍ２の表面密度を得 た。この顕色抗体は、黄色／緑色の蛍光染料を含む直径０．０８μｍのカルボキ シレート−修飾ポリスチレン・ラテックスＰｌｕｏＳｐｈｅｒｅｓに共有結合さ れた。このＴＳＨサンプルを、約２００μｌの量でこのマイクロタイターｗｅｌ ｌに適用した。

一夜のインキュベーションの後、得られた結果は、添付図面の図６上にプロット したものと同じであり、この図は、ｍｔｌ／リッターにおけるＴＳＨ濃度（Ｘ− 軸）に対する任意単位における蛍光強度（ｙ−軸）のグラフである。検定の感度 （ゼロ投与量推定値の標準偏差の測定に基づく）は、０．００２ｍＵ／リッター であった。例５中で使用したものと同じ標準及び検定バッファーを使用した。

例７ 例６を、繰り返した。但し、全インキュベーション時間を、１時間まで減少させ （捕獲抗体によるサンプルの０．５時間のインキュベーション、その後の顕色抗 体による０、５時間のインキュベーション）、そしてその微小球のサイズを、０ ．１２μｍ直径まで増加させた。

この検定の感度は、それにより、ゼロ投与量推定値の標準偏差の測定に基づき０ ．０００２ｍＵ／リッターまで１０倍増加した。この結果を、添付図面の図７中 にプロットする。その図は、図６と同じ軸上のグラフである。

匹し 蛍光微少汚１旦易イＬ只右」」焦（１）」１企妻Ｊ」見Ｊリー障１１２頬１り東 竺二仝どイーッチＴＳＨマイクロスポット・イムノア・ソセイ■）白色のポリス チレン・マイクロタイターｗｅｌｌ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓからのＭｉｃｒｏｌｉｔｅ　１）を、０．１Ｍリン酸塩ノ＜・ソファ− １ｐＨ７，４中で１μｍ以下の、２００μｇ／ｍｌのモノクロナール抗−ＴＳＨ 捕獲抗体↓こよりスポットした。この抗体小滴を、直ちに吸引し、そしてそのｗ ｅｌｌを、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡにより遮蔽し、そして同一ノ＜・ソファ−（こ より広範（こ洗浄した。この抗体マイクロスボ・ノドを、使用まで〕＜・ソファ −中（こ維持した。

２）上記ｗｅｌｌを、例５中で使用した検定ノ＜・ソファ−（こより濯ぎ、次（ こ検定バッファー／サンプル中の１００μｌの標準及び１００μｌの輩貝色抗体 結合微小球をそれぞれのｗｅｌｌに添加し、そして、室温（こおＩ、ｚて、３０ 分間、又は、最大検定感度が要求される場合（こ（よそれより長Ｕ−間、振とう した。

３）上記ｗｅｌｌを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｗ／ｖ）を含む洗浄ノ＜・ ソファ−（こより７回洗浄し、完全に乾燥するまて吸引し、そして先の例５中の ものと同じ共焦点顕微鏡により走査した。その結果を、（ＦＩ５中（＝述べた標 準を使用して得られた標準投与量−反応曲線と比較し、未知サンプル中のＴＳＨ の濃度を測定した。

蛍光微小球に結合した顕色抗体を使用した二重標識超感度すンドイ二重標識１若 しくは２段階検定のための手順は、先に記載した１段階検定のためのものと本質 的に同じである。但し、未標識捕獲抗体が、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ、）により標識されいるか、又は白色のＭｉｃｒ ｏｌｉｔｅマイクロタイターｗｅｌｌｓ上に直接に吸着されているかのいずれか であり；又はそれが、赤色の蛍光染料を含むラテックス微小球（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ、）にアビジンと一緒に結合されることができ、そ して次に、先にそのマイクロタイターｗｅｌｌｓ上に吸着されているビオチン− 標識されたＢＳＡマイクロスポットに結合される。

例１〇 二重標識を行った。発色抗体を、例１．２及び３中に記載したような直径０，１ ２μｍの黄色／緑色ポリスチレン・ラテックス微小球に結合した。捕獲抗体を、 ビオチン／アビジンを介して約４０．０００１ｇＧ分子／μｍ２の表面密度にお いてＤｙｎａｔｅｃｈ　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　ｍｖイクロタイターｗｅｌｌｓ上 に間接的に吸着させた。この抗体を、アビジンと一緒に、赤色蛍光染料を含む直 径０．１μｍのポリスチレン・ラテックス微小球に第一結合させ、次にその結合 した球を、そのマイクロタイターｗｅ　ｌ　Ｉ　ｓ上に先に被覆されているビオ チン化ＢＳＡマイクロスポットに結合させる。この黄色／緑色及びオレンジ色／ 赤色の染料を、クリプトン／アルゴン混合ガス・レーザーの４８８及び５６８ｎ ｍ線を使用して走査した。これは、同時に又は連続的のいずれかで行うことがで きた。そのテスト・サンプル中の抗原（ＴＳＨ）の濃度は、この２つの染料から の蛍光シグナルの比を観察し、そして標準サンプルを使用してそのシグナルとそ れを関係付けることにより、得られた。

得られた結果を添付図面の図８中に示した。この図は、ｍｕ／リッターにおける ＴＳＨ濃度（Ｘ−軸）に対する２つの蛍光シグナル（Ｙ−軸）の比のグラフであ る。の検定の感度（ゼロ投与量推定値の標準偏差の測定に基づく）は、Ｏ，ＯＯ ０２ｍＵ／リッターであった。

例５〜１０中に記載した検定系に反して、蛍光微小球に結合したアビジンのユニ バーサル・マーカー試薬っを、本例において使用し、ビオチンにより標識されて いる結合顕色抗体を間接的に標識を付ける（ｔａｇ）。

本検定系は、免疫応答の終了後にアビジン微小球の添加の追加の段階を必要とす るけれども、”ユニバーサル・マーカー（ｕｎｉｖｅｒｓａｌｍａｒｋｅｒ）” を使用することができるという利点は、このマイナーな欠点より重要である。こ の”ユニバーサル・マーカー”系は、Ｒｏｇｅｒ　ＥｋｉｎｓによりＷＯ−８９ １０１１５７中に記載されているマイクロスポット多分析物系（ｍｕｌｔｉａｎ ａｌｙｔｅ　ｓｙｓｔｅｍ）において特に有用であろう。なぜなら、検定感度に おけるかなりの改善があるからであり、この検定感度は、他のものが要求される であろう多数の（同時検定が行われるところの数に等しい）顕色抗体結合微小球 調製物よりも、単一のユニバーサル・アビジン微小球調製物を使用することから 、非特異的結合における減少の結果として予測されることができる。

例１２ 蛍光染料を含む微小球に結合したビオチン化固相補獲ＤＮＡプローブ及び抗−２ 本鎖ＤＮＡ抗体を使用したマイクロスポット・サンドイッチＤＮＡ配列検定。

１）　Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　１フイクロタイタ−ｗｅｌｌｓを、室温において１ 時間吸着により１μｍ以下の、１００μｇ／μｌアビジンＤＸ（Ｖｅｃｔｏｒ　 Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｉｅｓ）によりスポットし、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５％Ｔｗｅｅｎ　 ２０．０．５％ＢＳＡ及び１００　μｇ／＋ｎｌサケ精子ＤＮＡを含む２００μ ｍの０．ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７゜５により２０分間、遮蔽し、そして ０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣＩにより洗浄した。

２）　１００μｌのＴｒｉｓ　ＥＤＴＡ中の５〜１１００ｎの、Ｃ１ｏｎｔｅｃ ｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅＳから購入したビオチン化捕獲ＤＮＡプローブを、 アビジンＤＸ被覆ｗｅ１１ｓに添加し、室温において２時間振とうしながらイン キュベートし、そして０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣＩによ り洗浄した。

３）Ｍａｎｅｒｏ　ｅｔ　ａｌの文献（先を参照のこと。）中に記載された手順 を修正して、未知サンプルの０．５ｍｌアリコツトを１０分間沸騰させることに より調製し、次に氷上で急速に冷却し、ハイブリダイゼーション・バッフ７−： 　ＩＸ　ＳＳＣ（１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ及びリッター当たり１５［１１ ［１１ｏ１のクエン酸３ナトリウム）　、２Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’Ｓ溶液（リ ッター当たり０．４ｇのＢＳＡ　、　０．４ｇのＦｉｃｏｌ及び０．４ｇのポリ ビニルピロリドン）、１０ｍｍｏ１．／１のＴｒｉＳ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５、及 びＩｍｍｏｌ／Ｉ　ＥＤＴＡを含むもの、により希釈した。定量検定のために、 調製されたサンプル又は、場合により、既知量でそして同一のハイブリダイゼー ション・バッファー中に一本鎖標的ＤＮＡを含む標準を、上記ｗｅｌｌｓに添加 しくこの標準よりもむしろ陽性及び陰性対照を定量的テストのために他のｗｅｌ ｌｓに添加した）、５０℃で１時間振とうしながらインキュベートし、そして０ ．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳにより洗浄した。

４）例３中に記載した方法による、そして０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅ ｅｎ２０を含むＰＢＳ中の直径０．１μｍの蛍光微小球（Ｆ　１ｕｏｓｐｈｅｒ ｅｓ）に結合した２００μｍの、抗−２本鎖ＤＮＡ抗体を、添加し、室温におい て１時間振とうしながらインキュベートし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０により洗 浄し、そして例５中に記載したような共焦点！Ｊｌ微鏡により走査した。

例１２ｂ ビオチン化固相補獲ＤＮＡプローブ、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ ）により標識された相補的であるが非重複である顕色ＤＮＡプローブ及び蛍光染 料を含む微小球に結合した抗−ジゴキシゲニン抗体を使用したマイクロスポット ・サンドイッチＤＮＡ配列検定。

１）アビジン−ビオチン化捕獲ＤＮＡプローブ・マイクロスボ・ノドを、例１２ ａ中に記載したように調製した。

２）ハイブリダイゼーション段階を、例１２ａ中に記載したように調製した。

３）　１００μＩのハイブリダイゼーション・バッファー中の５〜ｌｏｎｇの、 ジゴキシゲニンにより標識された相補的であるが非重複である顕色ＤＮＡプロー ブ（Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌの先の文献中に記載されているようなもの ）を、添加し、室温において１時間振とうしなから５０’Ｃでインキュベートし 、そしてＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０により洗浄した。

４）０．５％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ中の直径約０ ．１μｍの、抗−ジオキシゲニン抗体−結合蛍光微小球（ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ ｓ）の２００μｌを添加し、室温において１時間振とうしながらインキュベート し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　２０により洗浄し、そして上記の共焦点顕微鏡により 走査した。

例１２ｃｍ１２ｅ 非標識固相捕獲ＤＮＡプローブ及び、蛍光染料を含む微小球に結合した抗−２本 鎖ＤＮＡ抗体又は相補的であるが非重複であるビオチン化発色ＤＮＡ　！！Ｕ色 プローブのいずれか並びに蛍光染料を含むアビジン−結合微小球又はジゴキシゲ ニンにより標識された相補的であるが非重複である顕色ＤＮＡプローブ及び蛍光 染料を含む微小球に結合した抗−ジゴキシゲニン抗体を使用したマイクロスポッ ト・サンドイッチＤＮＡ配列検定を、適当な変更を伴って類似のやり方で行うこ とができる。

ビオチン化固相補獲ＤＮＡプローブ及び蛍光染料を含む微小球により標識された 標的ＤＮＡ配列の競合的材料を使用したマイクロスポットＤＮＡ配列検定。

ｌ）アビジン−ビオチン化捕獲ＤＮＡプローブ・マイクロスポットを、例１２ａ 中に記載したように調製した。

２）未知サンプルの０．５ｍｌアリコツトを１０分間沸騰させることにより調製 し、次に氷上で急速に冷却し、ハイブリダイゼーション・バッフｙ−：　ＩＸ　 ＳＳＣ（１５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ及びリッター当たり１５ｍｍｏｌのクエ ン酸３ナトリウム）　、２Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液（リッター当たり０． ４ｇのＢＳＡ　、　０．４ｇのＦｉｃｏｌ及び０．４ｇのポリビニルピロリドン ）　、１０ｍｍｏｌ／１のＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７，５、及び１ｍｍｏｌ／ｌ　 ＥＤＴＡを含むもの、により希釈した。定量検定のために、調製されたサンプル に加えてポリメラーゼ連鎖反応により作られ、そしてラテックス粒子へのＤＮＡ の付着のために先に述べたＷｏｌｆ　ｅｔ　ａｌの文献中に記載されているもの から修正された技術を使用して調製された直径０．１μｍの蛍光微小球（Ｆｌｕ ｏＳｐｈｅｒｅｓ）により標識された、標的ＤＮＡ配列の競合的材料、又は−重 鎖標的ＤＮＡに加えて上記競合的材料を含み且つ同一のハイブリダイゼーション ・バッファー中の標準を、上記ｗｅｌｌｓに添加しく陽性及び陰性対照に加えて 、標準と競合的材料とを加えたものの代わりの競合的材料を、定量的テストのた めに添加した）、５０°Ｃで１時間振とうしながらインキュベートし、そして０ ．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０を含むＴｒｉｓ−ＨＣＩにより洗浄し、例５中に記載 したように走査した。

先に示したように、非競合的イムノアッセイのためのこれらの非常に高い感度は 、検定の設計についての最近認められている見解の視点において予想されるもの でない。一旦、本発明に従った微小球を使用した発想が受入れられれば、顕色結 合材料のそれぞれの分子に付着した標識の分子の増加した数により、感度におけ る幾つかの増加が、いずれかの検定フォーマットにおいて予測されるであろう。

このことは、標識された顕色剤分子の比活性における有効な増加をもたらす。し かしながら、この効果単独では、本分野における慣用の概念から顕著に離れ、そ して特に非常に少量の捕獲結合剤を必要とする検定設計をもたらすことが予測さ れないかもしれない。

これらの予測されない発見のためのさらなる可能性のある説明をたぶん前進させ ることができる。第一のものは、マイクロスポットの形態での非常に小さい領域 に高い表面密度における非常に少数の捕獲結合剤分子を限定することにより、測 定可能なインキュベーション時間内に得られたシグナル／ノイズ比が、非常に大 量の捕獲抗体がより大きな表面積にわたり分散している慣用の設計において得ら れたものと比較したとき、改善されたものであることができるとうちのである。

第二のものは、その上に捕獲結合剤と顕色結合材料分子とがそれぞれ配置されて いるところの２つの固体表面（すなわち、その検定が行われるところの微小球と マイクロタイターｗｅｌｌｓ）の間に分析物分子が配置されたとき、分析物分子 上の結合部位が、その分析物がその表面上に複製された同一のエピトープを含む 場合に、又はその顕色結合材料がポリクロナール抗体である場合に、又はその分 析物上の異なるエピトープに向けられた１を超えるモノクロナール抗体が発色材 料として使用された場合に、多数の顕色結合材料分子に結合するようになること ができ、それ故に、その顕色結合材料の有効なアフィニティーを増加させるとい うものである。このことは、微小球上の顕色結合材料分子の表面密度が、達成さ れる感度の重要な決定因子を表しているようであるということを暗示している。

ＦＩＧ、６ ［ＴＳＨ］　−（ｍｕバ）−− ＦＩＧ、Ｂ ＯＯＯＯ２０ｏＯ４ｏｏｏ６ｏｏｏ８ｏｏ１゜補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成６年４月１５日

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．液体サンプル中の分析物の濃度を、標準サンプルから計算された投与量−反 応曲線との比較により測定する結合検定法であって、分析物に特異的な結合部位 をもつ捕獲結合剤及び結合された分析物と又はその結合された分析物により占有 された捕獲結合剤上の結合部位と又はその捕獲結合剤上の占有されていない残り の結合部位と結合することができる顕色結合材料を使用し、この捕獲結合剤を、 そのサンプル中の分析物の有意でないフラクションのみがその捕獲結合剤に結合 されるようになるような量で使用し、そして、 標識をその顕色結合材料に関連した検定中で使用し、これによりその標識と関連 したシグナル強度がその分析物による捕獲結合剤上の結合部位のフラクション占 有率を表し、方法中、５μｍ未満のサイズをもち、そしてマーカーを担持する微 小球を、その標識として使用する、 ような検定法。
2. ２．微小球が、０．０１〜０．５μｍの均一サイズをもつ、請求項１に記載の方 法。
3. ３．微小球がポリマー・ラテックスから作られ、そしてそれらの表面上に負電荷 基又は正電荷基を提供されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
4. ４．マーカーが、微小球内に含まれた蛍光標識である、請求項１〜３のいずれか １項に記載の方法。
5. ５．微小球が、標準フィルター装置に匹敵するカラー・レンジ内の蛍光を提供す る油−可溶性蛍光染料の分子を含む、請求項４に記載の方法。
6. ６．微小球が、シグナル強度が時間−分解（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ）蛍光 技術により測定されることができるような長い蛍光時間をもつ蛍光染料の分子を 含む、請求項４に記載の方法。
7. ７．微小球が、それらに吸着されているか又は直接的に若しくは間接的に化学結 合されている顕色結合材料をもつ、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. ８．微小球いくつかが、それらに吸着されているか又は直接的に若しくは間接的 に化学結合されている顕色結合材料をもち、そして他の微小球が、それらに吸着 されているか又は直接的に若しくは間接的に化学結合されている捕獲結合剤をも ち、その顕色結合材料がそれに吸着又は化学結合されるところの微小球内に含ま れる標識が、その捕獲結合剤がそれに吸着又は化学結合されるところの微小球内 の標識と異なっているような、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
9. ９．顕色結合材料及び適当な場合には捕獲結合剤が吸着又は共有結合により微小 球に結合されてた後に、その微小球を、遮蔽（ｂｌｏｃｋｅｄ）し、他の材料に 対するそれらの非特異的結合を避けるような、請求項７又は８に記載の方法。
10. １０．微小球の遮蔽が、ウシ血清アルブミン又は他の非−妨害蛋白材料及び非イ オン洗剤により達成される、請求項９に記載の方法。
11. １１．捕獲結合剤が、１，０００〜１００，０００分子／μｍ２の範囲内の表面 密度において１ｍｍ２面積をもつ１以上のマイクロスポットの形態で固体支持体 上に固定化されており、そしてその液体サンプル・サイズが、１ｍｌ以下である 、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. １２．１又は複数のマイクロスポットが、０．０１〜１ｍｍの直径をもち、そし て１０，０００〜５０，０００分子／μｍ２の表面密度における固定化捕獲結合 剤を含み、そのサンプル・サイズが、５０μｌ〜１ｍｌである、請求項１１に記 載の方法。
13. １３．異なる捕獲結合剤が、同一固体支持体上の異なるマイクロスポット上に固 定化され、そして同一液体サンプル中の異なる分析物の測定のためのそれぞれの 結合検定が、同一操作において行われる、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. １４．捕獲結合剤及び顕色結合材料の両方が、抗体である、請求項１〜１３のい ずれか１項に記載の方法。
15. １５．捕獲結合剤が、液体サンプル中の対応ＤＮＡ配列を認識する一本鎖オリゴ ヌクレオチドＤＮＡプローブであり、そして顕色結合材料が、双子ストランドＤ ＮＡ配列だけを認識する抗体であるか、あるいは液体サンプル中の対応ＤＮＡ配 列の他の部分を認識するか又は捕獲結合剤を形成する残りの一本鎖オリゴヌクレ オチドＤＮＡプローブを認識するかのいずれかであるオリゴヌクレオチドＤＮＡ 配列であるか、のいずれかであり、その顕色結合材料が、微小球により標識され ているような、ＤＮＡ検定における使用のための、請求項１〜１３のいずれか１ 項に記載の方法。
16. １６．結合検定が、非競合的結合検定である、請求項１〜１５のいずれか１項に 記載の方法。
17. １７．液体サンプル中の一本鎖ＤＮＡ配列を含んで成る分析物の検出のための結 合検定法であって、 非競合的又は競合的手順において、そのサンプルを、その液体サンプル中の分析 物をミ認識し且つそれと結合することができる一本鎖オリゴヌクレオチドＤＮＡ プローブである固定化捕獲結合剤と、そして、 標識顕色結合材料であって、そのプローブ及び分析物から形成された双子ストラ ンドＤＮＡ配列だけを認識しそしてそれと結合することができる抗体であるか、 又はその分析物の他の部分若しくはその残りのプローブのいずれかを認識し且つ これと結合することができるオリゴヌクレオチドＤＮＡ配列であるかのいずれか であるものと、接触させ、 その顕色結合材料を、５μｍ未満のサイズをもちそしてマーカーを担持している 微小球により標識し、そして、非付着の顕色結合材料を除去した後、固定化され た捕獲結合剤に直接的に又は間接的に結合されるようになった顕色結合材料に付 着したマーカーからのシグナルの存在又は強度により、その分析物の存在を検出 すること、を含んで成る方法。
18. １８．マーカーが、０．０１〜１μｍのサイズをもつ微小球内に含まれた蛍光標 識である、請求項１７に記載の方法。
19. １９．顕色結合材料が、微小球に直接的に又は間接的に共有結合されている、請 求項１７又は１８に記載の方法。
20. ２０．結合検定法における使用のためのキットであって、液体サンプル中の分析 物の濃度を、その分析物に特異的な結合部位を持つ捕獲結合剤及び顕色結合材料 であって結合された分析物と又はその結合された分析物により占有された捕獲結 合剤上の結合部位と又はその捕獲結合剤上に未占有で残った結合部位と結合する ことができるものを使用して測定し、標識を、その顕色結合材料との関係におい て使用し、これにより、その標識と関係したシグナル強度がその分析物によるそ の捕獲結合剤上の結合部位のフラクション占有率を表し、（ａ）その上に固定化 された捕獲結合剤をもつ固体支持体、（ｂ）マーカーを担持している微小球の表 面に、吸着されたか又は直接的に若しくは間接的に化学結合された顕色結合材料 を含んで成る顕色試薬、及び（ｃ）測定されるべき分析物の既知の量又は濃度を もつ標準、を含んで成るようなキット。
21. ２１．試薬が、５μｍ未満のサイズをもち且つ蛍光染料の分子を含む微小球に吸 着されたか又は共有結合された顕色結合材料を含む、請求項２０に記載のキット 。
22. ２２．固体支持体が、１ｍｍ２未満のサイズ及び少なくとも１０００分子／μｍ ２の表面密度の１以上のマイクロスポットの形態でその上に固定化された捕獲結 合剤をもつ、請求項２０又は２１に記載のキット。
23. ２３．異なる捕獲結合剤を同一の固体支持体上の異なるマイクロスポット上に固 定化しており、そして異なる分析物のための複数の異なる顕色試薬及び異なる標 準を含んでいる、請求項２２に記載のキット。