CN114929892A - 用于快速、灵敏的多重免疫测定的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于使用预平衡数字免疫测定检测样品中的分子的方法、系统和试剂盒。所述方法和系统提供了用于在短时间长度内量化极小体积的生物样品中的分子的手段。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月15日提交的美国临时申请号62/936,147和2020年4月28日提交的美国临时申请号63/016,758的权益,所述申请中每一者的内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开提供了用于使用预平衡数字结合测定检测分子的系统和方法。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在政府的支持下根据国家科学基金会(National Science Foundation)授予的ECCS1708706和CBET1931905进行的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
免疫测定是生物标志物分析的强大技术,这些技术利用抗体识别和结合存在于复杂大分子混合物中的特定蛋白质的能力。酶联免疫吸附测定(ELISA)由于其高灵敏度和高选择性,是临床诊断中广泛使用的金标准生物标志物检测方法,但它通常缺乏为急性疾病的诊断和治疗提供及时数据的速度。
数字免疫测定是对低丰度分析物进行生化分析的新兴技术。它们的单分子灵敏度源于在各种类型的小子体积分区内放大的开/关(On/Off)信号的二进制计数。现有的数字免疫测定方法还存在其他阻碍,包括有限的多重度、较长的测定孵育时间、无法提供近床边结果、以及由于庞大的光学器件和流体处理系统而导致的复杂性和成本增加。很少有研究使用适合即时(POC)诊断的平台实施用于蛋白质检测的数字ELISA(dELISA)测定。最近开发的用于小型化dELISA检测的智能手机连接微流体平台实现了0.004-0.007pg/mL的极低检测限(LOD)。然而,此平台仍需要大于90分钟的相对较长的样品孵育时间,因此导致样品到答案的总时间超过2小时。总体而言,无论是使用庞大的商业仪器还是POC平台,常规的数字测定都面临着类似的问题。这些限制一起对实现生物标志物引导的即时(POC)精准医疗在重症监护中的承诺构成了重大障碍。
发明内容
本文公开了用于检测样品中的分子的方法,其包括:使样品与对分子特异的捕获剂和检测剂接触;将样品用捕获剂和检测剂孵育以形成捕获剂-分子-检测剂复合物,其中孵育的时间小于形成复合物达到平衡条件所需的时间;以及检测所述分子。
所述方法还可包括将捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物与剩余样品和未结合的检测剂分离,以及将每个捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物分离到固体支持物内的个别位置中。
本文公开了用于检测样品中的分子的系统,其包括以下中的一者或多者或每一者:捕获剂,其包含用第一探针包被的粒子,所述第一探针被配置为结合所述分子;检测剂,其包含被配置为结合所述分子的第二探针;孵育箱,其被配置为将样品用所述捕获剂和检测剂孵育以形成捕获剂-分子-检测剂复合物,持续时间小于在所述捕获剂、所述检测剂与所述分子之间形成复合物达到平衡条件所需的时间;固体支持物;检测器;软件,其被配置为根据检测器的输出确定所述捕获剂和所述检测剂是否存在;以及样品。
本文还公开了反应混合物,其包含:包含分子的样品的停止孵育混合物;捕获剂;检测剂;以及多个捕获剂-分子-检测剂复合物,其中所述停止混合物在小于形成捕获剂-分子-检测剂复合物达到平衡条件所需的时间的时间停止。
还公开了试剂盒,其包含以下中的一者或多者或每一者:至少一个捕获剂,所述捕获剂包含用第一探针包被的粒子,所述第一探针被配置为结合感兴趣的分子;至少一个检测剂,其包含被配置为与所述捕获剂结合相同的感兴趣的分子的第二探针;检测部分,其选自由染料、放射性标记、酶和酶底物组成的组;标记剂;固体支持物;检测器;软件,其被配置为根据检测器的输出确定捕获剂和检测剂是否存在。
本公开的其他方面和实施方案根据以下详细描述和附图将是显而易见的。
附图说明
图1A和图1B是用于双重预平衡淬灭数字ELISA(PEdELISA)测定的捕获剂的某些实施方案的图解,所述测定使用首先用Alexa Fluor(AF)488染色然后、与针对TNF-α或MCP-1的捕获抗体缀合的2.8μm直径的超顺磁珠(图1A)以及与针对IL-6或Il-2的捕获抗体缀合的2.8μm直径的非彩色超顺磁珠(图1B)。
图1C-图1F是在明场(图1C)、AF 488通道(图1D)、QuantaRed(Qred)通道(图1E)和三通道(明场+AF 488+Qred)叠加模式(图1F)中用于双重PEdELISA测定的阵列微孔的图像。
图1G是MATLAB代码处理的明场图像,用于确定填充(+)孔和空(-)孔的整体珠粒填充率。
图1H是排序的微孔强度直方图。
图1I是整个100个微孔阵列的珠粒和微孔计数的图表。
图1J是用于双色数字计数的MATLAB代码处理的双通道(AF488+Qred)叠加图像(深绿色正方形:AF488染色珠粒,蓝色圆圈:具有Qred发射的非彩色珠粒,浅绿色菱形:具有Qred发射的AF488染色珠粒)。
图1K-图1L是示出活性Qred“开”微孔点的图像,其中存在珠粒结合的分析物分子(例如,TNF-α和IL-2)(100pg/mL(图1K)、20pg/mL(图1I)和4pg/mL(图1M))。
图2A和图2B是预平衡蛋白结合事件的瞬时单分子二元计数的PEdELISA概念(图2A)和用于预平衡测定系统的两步超快双重PEdELISA过程(图2B)的实施方案的示意图。PEdELISA可包括短时间(15-300秒)双色磁珠孵育以形成抗体-抗原-抗体免疫复合物(步骤1)、缓冲液更换、快速(30秒)抗生物素蛋白-HRP标记(步骤2)以及在96孔低保留管内重复冲洗6次。数字化过程涉及将磁珠诱捕到芯片上微孔阵列中、装载HRP荧光底物(QuantaRed)以及用氟碳油密封珠粒。通过对荧光激活的“开”状态微孔进行自动图像扫描和计数来读取数字信号。两层(微孔层、微腔层)基于PDMS的微流体检测芯片(共包含537.6万个d=3.8μm的微孔)每次扫描可处理16个样品。CapAb:捕获抗体。DeAb:检测抗体。
图3是适合与本文公开的方法和系统一起使用的自动广域荧光扫描单元的一个实施方案的图解。在一些实施方案中,可以通过MATLAB读取数字信号,所述MATLAB经预编程以扫描图像并对荧光激活的“开”状态微孔和荧光编码磁珠进行计数。
图4A-图4C是2步PEdELISA过程中生物分子相互作用的有限元分析的图解。图4A是用于建模工作的理论球体(即“反应体积”)的示意图,所述理论球体的量等于总样品体积除以珠粒的数量。由于对称性,在单个磁珠的表面考虑了试剂质量传输和结合动力学,所述磁珠放置在其一半几何形状的中心。图4B是PEdELISA过程的步骤1:复合物形成涉及靶抗原分子、固定在珠粒表面的捕获抗体与在反应体积中自由浮动的检测抗体之间的缀合。图4C是PEdELISA过程的步骤2:抗生物素蛋白-HRP标记过程涉及抗生物素蛋白-HRP与生物素化检测抗体的缀合。
图4D和图4E是示出每个珠粒形成的靶标(即,捕获抗体-抗原检测抗体免疫复合物)的平均数量的图表,其中PEdELISA过程中λ作为步骤1孵育时间和分析物浓度的函数来计算(Kd=10-10M(图4D)和Kd=10-9M(图4E))。模型预测,当λ较小(<0.1)时,PEdELISA读数随分析物浓度线性增加。通过考虑实验获得的本底噪声,可以确定步骤1孵育时间的给定值的检测限(LOD)值。
图4F是示出PEdELISA过程的第二步骤的预测动力学的图表。针对1pM、10pM和100pM三种代表性HRP浓度呈现了HRP酶标记抗体-抗原-抗体免疫复合物的形成分数。
图5A-图5D是示出检测抗体(DeAb)浓度、每个样品的磁珠数量、捕获抗体结合位点密度(Bd)和质量传输对PEdELISA测定的免疫复合物形成动力学的影响的图表。测定信号输出由针对以下不同的抗体对抗原缔合速率缔合常数值,作为步骤1孵育时间的函数,每个珠粒形成的靶标(捕获抗体-抗原-检测抗体免疫复合物)的平均数量确定:kon=104M-1s-1(图5A)、kon=105M-1s-1(图5B)、kon=106M-1s-1(图5C)和kon=107M-1s-1(图5D)。
图6A-图6E是针对加标有100pg/mL的IL-6(图6A)、TNF-α(图6B)、MCP-1(图6C)和IL-2(图6D)的1x ELISA缓冲液、10%、25%和50%胎牛血清(FBS)的PEdELISA测定培养基测试。图6E是不同培养基中IL-6、TNF-α、MCP-1和IL-2测量的信噪比(SNR)的图表。所有测试均以5分钟+30秒的总测定孵育时间进行。SNR值表示加标信号与背景(阴性对照)信号的比率。(P>0.05n=5-8,单因素方差分析(one-way ANOVA))。
图7A-图7G是PEdELISA测定的一个实施方案的表征和优化的图表。图7A-图7D是四种细胞因子中每一种的PEdELISA标准曲线:IL-6(图7A)、MCP-1(图7B)、TNF-α(图7C)和IL-2(图7D),其中步骤1孵育时间如所示变化并且步骤2孵育时间固定为30秒。由于测定的极端标记不足的性质,通过混合所有所需试剂将步骤1和步骤2过程合并为单个步骤来进行15秒测定和30秒测定。LOD由来自试剂空白信号+3σ的浓度(虚线)来确定。图7E和图7F是示出针对四种细胞因子使用25%胎牛血清中的加标重组蛋白的PEdELISA与常规夹心ELISA测试之间的相关性的图表:15秒PEdELISA孵育时间(图7E)和300秒PEdELISA孵育时间(图7F)。真实值用分散的预定加标浓度以虚线绘制。图7G是示出针对四种细胞因子,PEdELISA的理论(线)和实验(散点)LOD作为步骤1孵育时间的函数的图表。
图8A和图8B是针对TNF和IL-2(图8A)以及IL-6和MCP-1(图8B)的组合在300秒的孵育过程中确定的双重PEdELISA特异性的图表。每种培养基中仅加标一种类型的细胞因子,并且在双重PEdELISA测定中测量两种探针的信号。考虑到MCP-1相对较弱的抗体-抗原亲和力,将MCP-1的加标浓度设定为其他三种细胞因子的加标浓度的5倍。
图9A-图9C示出了用盲肠结扎穿刺(CLP)实时监测活小鼠(M1-4)上的CitH3。图9A是CLP和小鼠血液收集程序的图解。图9B是使用加标有重组肽的10%假小鼠血清的CitH3测定的PEdELISA与常规夹心ELISA之间的相关性的图表。图9C是四只小鼠在其一生中的纵向CitH3谱的图表:100%、75%、50%结扎和假结扎。
图10A-图10E示出了CAR-T细胞疗法下血液癌症患者的多细胞因子的近实时分子监测。图10A是接受CAR-T细胞疗法的血液癌症患者的时间线。图10B是示出在不同时间点测量所选未知CAR-T患者样品的四种细胞因子的300秒PEdELISA与ELISA之间的良好一致性(R2=0.96)的图表。图10C-图10E是CRS和CRES等级的时间序列谱,针对患者A(图10C 4级重度CRS)、患者B(图10D,2级轻度CRS)和患者C(图10E,0-1级非常轻度-CRS)的IL-6、MCP-1、TNF-α和IL-2。第0天表示CAR-T细胞输注日。第0天之前的数据表示基线。虚线表示如所指示,施用抗细胞因子药物托珠单抗(tocilizumab)(抗IL-6R)、英夫利昔单抗(infliximab)(抗TNF-α)的时间点。阴影区域标示患者接受地塞米松(dexamethasone)(皮质类固醇)的时期。这些数据不考虑CRS等级记录点与抽血点之间的几个小时(或偶尔为8-12小时)的时间滞后。
图11A-图11D是三名CAR-T细胞疗法患者针对IL-6(图11A)、MCP-1(图11B)、TNF-α(图11C)和IL-2(图11D)的组比较(非CRS与CRS)。使用Tukey检验比较均值的单因素方差分析:CRS条件下的(IL-6(P<0.001)、MCP-1(P<0.001)和IL-2(P=0.0059)水平)显著高于非CRS条件的水平;TNF-α水平不显著(P=0.142)。包括在患有CRS的患者使用类固醇或免疫抑制剂(托珠单抗、英夫利昔单抗)的时间点获得的数据。
图12A-图12E示出了用于超快高度多重PEdELISA的方法的一个实施方案。图12A是微流体空间光谱编码的概念:具有不同捕获抗体的多色磁珠被预先图案化成物理分离的微阵列,以创建N颜色×N阵列重。通过15-600秒的淬灭反应时间,在飞升大小的微孔中进行预平衡单分子计数。图12B是24重CAR-T细胞因子组设计的一个实施方案。图12C是PEdELISA微流体芯片的一个实施方案,所述芯片包括图案化层和检测层(24重测定版本)。图12D是使用多通道移液器(样品装载)和注射泵(芯片上洗涤)的平行流体处理系统的一个实施方案。图12E是检测器的一个实施方案:使用廉价CMOS照相机的双色荧光光学扫描单元。
图13A和图13B是由CNC加工对准夹具引导的低成本PDMS薄膜(图13A)到玻璃(图13B)转移技术的一个实施方案的图像。
图14是双色双向卷积神经网络(CNN)引导的信号处理的架构的一个实施方案的示意图。多图像处理包括AF488通道、Qred通道和明场。双向CNN含有两个神经网络,可同时检测靶标与缺陷,以实现高效准确的数字计数识别。
图15A和图15B是Qred通道(图15A)和AF488通道(图15B)上CNN与常规全局阈值法图像处理之间的性能比较的图表。计数误差定义为:误差(%)=(NTP-NCNN或阈值)/NTP×100%。
图16是使用双色IL-1α和IL-1β检测,通过在25%胎牛血清缓冲液中加标IL-1α:1ng/mL IL-1β:1ng/mL、IL-1α:1ng/mL IL-1β:1pg/mL、IL-1α:1pg/mL IL-1β:1ng/mL和IL-1α:1pg/mL IL-1β:1pg/mL来测试CNN光学串扰准确度的图表。
图17是通过在25%FBS中一起(顶部,左侧图)或单独加标100pg/mL各种细胞因子以及不含任何细胞因子的FBS空白(底部,右侧图)的测定特异性测试的图表。
图18是25%胎牛血清中0.16pg/mL至2500pg/mL细胞因子的标准曲线,如所指示,抗原检测抗体孵育5分钟和2分钟,并且酶标记1分钟。
图19是珠粒表面吸附过程的理论结合动力学的图表。预平衡状态基于朗缪尔模型由时间常数τ确定。
图20是示例性CNN处理的PEdELISA微阵列分析的示意图。顶部示出了用于多重数字免疫测定的微流体空间光谱编码方法。用不同捕获抗体包被的荧光彩色编码磁珠预沉积到微流体检测通道中的六角形生物传感图案阵列中。生物传感图案的位置在物理上彼此分离。这种排列产生N颜色×N阵列个测量组合,从而确定测定多重度N重,其中N颜色是用于编码每个生物传感图案中沉积的珠粒的颜色总数,而N阵列是每个检测通道中阵列生物传感图案的总数。在此实例中,N颜色=2(非荧光和Alexa 488:Af488)并且N阵列=8。底部示出了卷积神经网络引导的图像处理算法,用于高通量和准确的单分子计数。两个神经网络并行运行,读取多色荧光图像数据,识别靶标特征与缺陷,并生成用于后期数据处理的输出掩码。使用索贝尔边缘检测算法分析明场图像。最后将图像叠加以确定发射QuantaRedTM信号的酶活性珠粒(Qred+珠粒)相对于每种颜色标记的总珠粒的分数。未标记的比例尺为25μm。
图21A-图21C示出了PEdELISA免疫测定系统,其采用用附着至珠粒图案化层(左)和样品装载层(右)的多阵列生物传感器层制备的PEdELISA微阵列芯片(图21A)、使用多通道移液器进行样品装载和注射泵进行芯片上洗涤的平行流体处理单元(图21B)、以及程序化的双色荧光光学扫描设置(图21C)。
图22示出了通过基于微流体空间光谱编码概念构建PEdELISA微阵列芯片进行的示例性多重数字免疫测定。(顶部)将珠粒诱捕到多阵列生物传感器层上的阵列生物传感图案的微孔中。将N颜色种颜色的荧光编码珠粒的混合物装载到珠粒沉降层上的微流体通道中。(底部)从多阵列生物传感器层剥离珠粒沉降层,并将样品装载层附着至多阵列生物传感器层上。样品装载通道的90°定向允许每个通道含有N阵列种类型的生物传感图案阵列。用移液器将血清样品装载到样品检测层的通道中。芯片排列产生总共N颜色×N阵列重,用于分析每个样品。
图23是在珠粒冲刷测试测定之前和之后入侵待装载非彩色编码珠粒的通道的AF-488编码珠粒的分数的图表(P=0.550)。在这两种情况下,平均只有0.087%的诱捕的珠粒在通道中错位。结果得自160个独立微孔位点的荧光图像。40uL/分钟的洗涤缓冲液流速和15分钟的持续时间的苛刻测定条件导致可忽略不计的珠粒之间的物理串扰。
图24A和图24B是全局阈值和分割GTS(图24A)算法与卷积神经网络CNN(图24B)算法之间的比较的示意图。在GTS中,根据待处理图像的强度直方图预先确定优化的全局阈值(黑色虚线所示)。CNN方法不需要预先确定阈值。
图25示出了具有语义分割的双路径卷积神经网络的示例性训练过程。基于3000张代表性图像(32×32像素)仔细预选数据库以预训练CNN(左)。所述图像首先基于GTS进行标记,然后根据人工监督进行人工修改。然后使用预训练的CNN标记含有大约200张较大图像(256×256像素)的新数据库以进一步提高特征提取和分类准确度(右)。
图26A-图26E示出了通过卷积神经网络(CNN)和全局阈值和分割(GTS)方法进行的图像处理。图26A是证明错误信号计数的代表性图像(红点:Qred+微孔,绿点:AF-488彩色珠粒,黄点:识别的待计数点)。(i)圆圈表示由水性试剂溶液覆盖的区域,由于油密封过程期间的限制性差,所述水性试剂溶液遍布多个微孔位点。对来自所述区域的潜在错误和不可靠的信号点进行GTS计数。从CNN计数中去除所述区域。(ii)图像散焦导致GTS合并来自圆圈中一对相邻Qred+微孔的两个信号点,并将其计为单个信号点。(iii)由于圆圈中的光学串扰而对微孔位点进行二次照明导致这些位点的GTS错误计数。(iv)GTS未能标记并计数保持有黯淡AF-488彩色珠粒的微孔位点。CNN和GTS方法在Qred通道(图26B)、AF488通道(图26C)和明场图像(图26D)上的误差分析。图26E示出了使用双色IL-1α和IL-1β检测,通过在单重验证中加标(i)IL-1α:1ng/mL IL-1β:1ng/mL(ii)IL-1α:1ng/mL IL-1β:1pg/mL(iii)IL-1α:1pg/mL IL-1β:1ng/mL(iv)IL-1α:1pg/mL IL-1β:1pg/mL(v)IL-1α:1pg/mL IL-1β:1pg/mL测定来评估光学串扰对CNN和GTS的准确度的影响的测试。所有测定均在25%胎牛血清缓冲液中进行。
图27A示出了用于CAR-T细胞因子释放综合征检测测试的一组14种细胞因子的示例性排列。在每行上用黑色和绿色字体标记的两种细胞因子在垂直于所述行的样品检测通道(1、2、3和4)中检测,其中分别使用非彩色(黑色)和AF-488(绿色)编码珠粒。图27B示出了60个随机选择的阵列生物传感图案(每张图案43561个微孔)的填充有珠粒的微孔和用明场图像识别的微孔的计数。生物传感图案的平均珠粒填充率为55.1%。
图28A和图28B示出了PEdELISA 14重微阵列分析。图28A示出了在25%胎牛血清(FBS)中0.16pg/mL到2500pg/mL的14种细胞因子的测定标准曲线。图28B示出了用25%FBS“全加标”、“单加标”和“非加标”(阴性)样品的测定特异性测试。用于加标FBS的500pg/mL分析物浓度是评估假阳性和阴性信号的最佳值。
图29A和图29B示出了来自被诊断为1-2级CRS(图29A)或无CRS(图29B)的CAR-T患者的纵向血清样品中的14重细胞因子测量的图表。第0天表示CAR-T细胞输注日。第0天之前的数据表示基线。阴影区域标示患者被诊断为1-2级CRS的时期。为了更好地可视化,根据从高到低的细胞因子水平组织和单独绘制数据。
图30A-图30C示出了用于监测CAR-T疗法相关CRS的PEdELISA测定平台的一个实施方案。图30A是概述预平衡蛋白结合事件的瞬时单分子二元计数概念的图解。预平衡反应淬灭与单分子计数的组合理论上可以实现具有接近零孵育时间的测定,而不会失去线性度。图30B是PEdELISA系统的一个实施方案的示意图和照片图像,所述系统包括一次性微流体芯片(插图)、自动流体分配和混合模块(左)和2D倒置荧光扫描模块(右)。图30C示出了用于预平衡的测定系统的两步超快、多重PEdELISA过程,包括用于形成抗体-抗原-抗体免疫复合物的5分钟磁珠孵育(步骤1)、缓冲液更换、1分钟抗生物素蛋白-HRP标记(步骤2)以及使用自动流体分配模块进行5分钟连续洗涤。PEdELISA芯片具有8个圆形生物传感器图案,由一组66,724个阵列微孔形成。用不同捕获抗体(非荧光和Alexa 488:AF488)包被的荧光彩色编码磁珠预沉积到每个物理分离的生物传感器图案中。这种排列可以允许以2种颜色×8种图案=16重进行多重分析物检测。每个芯片可以在每批运行中同时量化多达16个样品。数字读出过程涉及装载HRP荧光底物(QuantaRed),以及用氟碳油密封珠粒,以及基于自动荧光扫描的信号读取以对荧光激活的“开”状态微孔进行计数。然后通过卷积神经网络引导的图像处理算法进行数据分析,以实现高通量和准确的单分子计数。
图31A-图31N示出了CAR-T细胞疗法下血液癌症患者的快速纵向细胞因子谱监测。图31A是示出PEdELISA和LEGENDplexTM测定之间的良好一致性(R2=0.915)的图表,所述一致性见于对于六种细胞因子,在随机选取的时间点处的20个CAR-T患者样品的测量结果。图31B是10名CAR-T患者的临床总结表,包括最大CRS分数/CRES等级和测量时间点的数量。图31C是10名CAR-T患者在整个住院持续期间的CRS和非CRS时期(天数)的分布图表。图31D是CAR-T患者在CAR-T细胞输注之前的基线细胞因子水平的图表。图31E-图31N是示出对于10名CAR-T患者,通过CRS和CRES分级量化的临床严重程度、CRP和铁蛋白水平的标准分数(Z分数)以及通过PEdELISA获得的血清细胞因子谱的标准分数(Z分数)的热图。CRS、CRES、低血压和缺氧的分级是基于美国移植和细胞治疗学会(American Society forTransplantation and Cellular Therapy)(ASTCT)共识分级。基于每个分析物浓度值的三次测量计算每个标准分数(Z分数)。第0天表示CAR-T细胞输注日。第0天之前的数据表示基线。根据CRS或神经毒性的严重程度对患者进行分组。患者06(4级重度CRS)的数据(图31E),患者02、08和34(2级中度CRS)的数据(图31D和图31F-图31H),患者05(3级神经毒性)的数据(图31I),患者12、14、17、25和33(0-1级轻度或无CRS)的数据(图31J-图31N)。此外还示出了IL-6和TNF-α的浓度时间图,以提供有关托珠单抗(抗IL-6R)和英夫利昔单抗(抗TNF-α)的治疗结果的信息。绿色/黄色虚垂线表示托珠单抗/英夫利昔单抗给药的时间点。(图31E)和(图31I)中的阴影区域表示患者接受地塞米松的时期。
图32A-图32M是生物标志物数据的统计分析图表。就CRS天数(即,等级>=1)与无CRS天数(即,等级0)比较所有CAR-T患者中的平均细胞因子水平:IL-1β(图32A)、TNF-α(图32B)、IL-10(图32C)、IL-6(图32D)、IL-12(图32E)、MCP-1(图32F)、INF-γ(图32G)、IL-2(图32H)、IL-8(图32I)、IL-17A(图32J)、CRP(图32K)和铁蛋白(图32L)(****P<0.0001,***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05以及非显著P≥0.05)。每个误差带表示SD的均值。“基线”表示来自CAR-T细胞输注之前的测量时间点的数据。这些数据包括从经历CRS的患者使用类固醇或免疫抑制剂(托珠单抗、英夫利昔单抗)(这可能会影响细胞因子生物标志物浓度)的时间点获得的数据。对于接受治疗的三名CAR-T患者,组合了托珠单抗治疗的4个不同阶段中的IL-6变化(图32M)。“使用托珠单抗”表示托珠单抗施用之后0-3天,而“托珠单抗之后”表示托珠单抗施用之后>3天。在“使用托珠单抗”阶段暂时观察到血清中IL-6的统计学显著升高(P<0.01)。
图33A-图33H是生物标志物对患者06(4级CRS)的CRS分数变化的响应性的图表。(i)黑色的生物标志物浓度的时间变化率(Δc/Δl),(ii)浅红色的CRS分数,(iii)浅蓝色的CRS分数的时间变化率的纵向图:ΔCRS/Δt IL-6(图33A)、MCP-1(图33B)、INF-γ(图33C)、IL-10(图33D)、IL-8(图33E)、IL-2和TNF-α(图33F)、CRP(图33G)和铁蛋白(图33H)。通常,时间间隔设置为Δt=1天。Δc使用给定时间点的浓度减去前一个时间点的浓度来计算。竖直虚线表示观察到患者CRS症状“发作”或突然恶化的时间点。
具体实施方式
本公开提供了一种用于使用超快测定(例如,夹心结合测定)检测样品中分子的方法,所述测定法以检测早期预平衡状态期间的复合物形成为目标。与传统的结合测定不同,此测定允许将总孵育时间从几小时减少到几分钟,同时在临床相关浓度范围内仍能实现高灵敏度。
2步PEdELISA测定格式成功地用于测量血清体积小至5μL的活体脓毒症小鼠模型的CitH3,以及对在CAR-T细胞疗法之后表现出重度和中度CRS症状的三名血液癌症患者的CRS相关循环细胞因子(IL-6、TNF-α、IL-2和MCP-1)进行快速、高灵敏度、近实时多重监测。使用常规ELISA或Luminex方法进行的时程生物标志物测量仅可通过使用入库样品的回顾性测试来实现。相比之下,PEdELISA在大多数测试过程中(小鼠为1-5小时,而人类为24小时)以高时间分辨率连续提供从小鼠和人类患者新鲜收集的血液样品的实时数据。
PEdELISA微阵列测定同时在pM-nM的临床相关动态范围下检测每个样品的14种细胞因子生物标志物,并且从样品装载到数据递送的整个测定过程在30分钟内完成。在疗法的过程期间的不同时间点以较短的测定周转时间测试从CAR-T患者获得的血液样品。纵向测量证明了测定平台能够连续监测大量细胞因子谱,这些细胞因子谱在表现出CRS的患者的循环系统中迅速演变。
凭借其速度、灵敏度、多重能力和样品保留(sample-sparing)能力,PEdELISA微阵列不仅可用于重症监护医学,有望使及时治疗由新兴疾病(例如,COVID-19)引起的危及生命的疾病成为可能并根据个人的综合生物标志物谱进行定制,而且可用于临床研究人员诊断急性疾病、确定待施用药物的最佳剂量、频率和时机,从而提供全身性免疫疾病和其他时间敏感的危重疾病的个体化重症监护的新范式。
本节中使用的节标题和本文的整个公开内容仅用于组织目的,并不意图进行限制。
1.定义
如本文所用,术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”及其变体意图是不排除另外动作或结构的可能性的开放式过渡性短语、术语或词。除非上下文另外清楚地说明,否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“基本由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其他实施方案,无论是否明确地提出。
对于本文数值范围的叙述而言,明确涵盖在其之间的具有相同精确度的每个中间数字。例如,对于6-9的范围,除了6和9外还涵盖数字7和8,并且对于6.0-7.0的范围,明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
除非本文另有定义,否则与本公开结合使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。例如,本文描述的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交及其技术结合使用的任何命名法是本领域熟知和常用的那些。术语的含义和范围应是清楚的;然而如果存在任何潜在的歧义,本文提供的定义优先于任何字典或外部定义。此外,除非上下文另有要求,否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。
如本文所用,“生物分子”包括大的大分子(或聚阴离子)诸如蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸,以及小分子诸如初级代谢物、次级代谢物和核苷酸。
如本文所用,“生物标志物”是指其中其存在、不存在或相对量可指示受试者中特定疾病状态的任何物质。生物标志物包括但不限于蛋白质、多肽、核酸、小分子等。
如本文所用,“生物样品”包括生物流体,包括但不限于全血、血清、血浆、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水、骨髓抽吸液、胸腔积液、尿液,以及可能含有感兴趣的分子的肿瘤组织或任何其他身体成分或任何组织培养上清液。
如本文所用,“分离(Isolating)”意指导致混合物的每种个别组分(诸如单一捕获剂或单一捕获剂-生物分子-检测剂复合物)被分离使得任一个位置中仅有一种组分;所述位置在视觉上与任何其他位置不同。可以通过使用如本文所述的固体支持物来完成分离。
如本文所用,“标记剂”是指通过与检测部分反应以产生可检测的反应产物来促进检测的任何分子或化合物。
如本文所用,“磁珠”是指所谓的磁珠、磁性微珠、顺磁性粒子、可磁性吸引粒子、磁性球体和磁响应粒子。这些术语在整个领域中经常可互换使用。因此,“磁珠”包括在施加磁场的情况下能够在液体中被操纵的任何粒子。珠粒的磁性可以包括顺磁性、超顺磁性、铁磁性、反铁磁性和亚铁磁性。
如本文所用的“多核苷酸”或“寡核苷酸”或“核酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。多核苷酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体,其中所述多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及碱基的组合,所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可以通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。多核苷酸可以是单链或双链的,或者可以含有双链序列和单链序列两者的部分。单链的描述还定义了互补链的序列。因此,核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此,核酸还涵盖了基本上相同的核酸及其互补体。
“肽”或“多肽”是通过肽键连接的两个或更多个氨基酸的相连接序列。多肽可以是天然的、合成的或天然和合成的修饰或组合。肽和多肽包括蛋白质,诸如结合蛋白、受体和抗体。可以通过添加不包括在氨基酸链中的糖、脂质或其他部分来修饰蛋白质。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”在本文中可互换使用。
如本文所用,“探针”是指特异性地或选择性地结合分子的分子。探针可以是核酸、适体、高亲合性多聚体(avimer)、受体结合配体、结合肽、蛋白质、有机小分子或金属配体。探针可以是抗体、抗体片段、双特异性抗体或其他基于抗体的分子或经设计以结合特定生物分子的化合物。探针可以是与生物分子类型相同的分子,例如蛋白质生物分子可以由基于肽的探针结合。互补序列的单链多核苷酸可以杂交以形成双链多核苷酸。探针可以是与生物分子类型不同的分子,例如多核苷酸探针可以与蛋白质生物分子结合。
如本文所用,“分离(Separating)”意指一个或多个组分与其余部分的任何空间上的分开。因此,分离包括但不限于样品中包含的某些级分或分析物的分级分离以及特异性和选择性富集、耗尽、浓缩和/或分离。
如本文所用,“固体支持物”是指能够分离混合物的个别组分的任何固体装置。例如,固体支持物可以是具有空间限定区域的阵列,其中个别组分通过表面处理或磁化层得以分离。固体支持物可以具有分离组分的不同结构(例如,室、段、孔或通道),例如微流体装置或微量滴定板。
以下描述了优选的方法和材料,但是在本公开的实践或测试中可使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其整体并入本文。本文公开的材料、方法和实施例仅是例示性的,并且不意图为限制性的。
2.用于检测分子的方法
本公开提供了用于检测样品中的分子的方法,所述方法包括以下步骤中的一者或多者或每一者:a)提供捕获剂和检测剂的混合物;其中所述捕获剂包含用被配置为结合所述分子的第一靶标包被的粒子(例如,磁珠),并且其中所述检测剂包含被配置为结合所述分子的第二靶标;b)将所述混合物添加到所述样品中;c)用所述混合物孵育所述样品以形成捕获剂-分子-检测剂复合物,其中孵育时间长度小于形成复合物达到平衡条件所需的时间;d)将所述捕获剂和所述捕获剂-分子-检测剂复合物与所述样品和未结合的检测剂分离;e)将每个捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物分离到固体支持物内的个别位置中;以及f)确定所述个别位置中每一者内是否存在所述捕获剂和检测剂。
样品包括包含感兴趣的分子的任何组合物。样品可以从任何来源获得,包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器,以及高等生物诸如植物或动物,包括人类。样品可以从其他来源获得,包括但不限于环境来源、食品和法医样品。
在一些实施方案中,样品是生物样品,包括但不限于通过多种标准技术中的任一种从细胞、体液(例如,血液、血液组分、尿液等)或组织样品中获得的样品。样品可以是例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口腔液和皮肤的外部切片;来自呼吸道、肠道、生殖道和泌尿道的样品;泪液、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样品。样品也可以从活的或死的生物体或从体外培养物中获得。包含细胞的样品在用于本文公开的系统和方法之前可能需要细胞裂解。
样品的总体积可以根据样品的类型和感兴趣的分子而变化。在一些实施方案中,样品的体积小于100uL、小于90uL、小于80uL、小于70uL、小于60uL、小于50uL、小于40uL、小于30uL、小于20uL。在某些实施方案中,样品体积在1与25uL之间。样品体积可以在1与20uL之间、1与15uL之间、1与10uL之间、1与5uL之间、5与25uL之间、10与25uL之间、15与25uL之间、20与25uL之间、5与20uL之间、10与20uL之间、15与20uL之间、5与15uL之间、5与10uL之间或10与15uL之间。
样品可以在用于本文公开的系统和方法之前被稀释。在使用之前,样品可以稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍或更多倍。
可以使用本发明的方法和系统检测和任选地量化许多潜在的靶分子。可通过本文所述的方法检测可以由捕获和检测探针结合的任何靶分子。例如,分子可以包括:激素、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白、免疫球蛋白、生长因子、细胞因子、代谢物、小分子或小分子药物。在一些实施方案中,分子是多肽、多糖、多核苷酸、脂质、代谢物、药物或其组合。
在某些实施方案中,分子是生物标志物。生物标志物可以是其中其在受试者中的存在、不存在或相对量可以指示特定疾病或疾病阶段的任何物质。生物标志物与许多疾病有联系,诸如癌症、糖尿病、多发性硬化症、神经退行性疾病、中风等。人类中通常测量的生物标志物的实例包括蛋白质(例如,细胞因子、代谢酶、细胞周期酶、细胞骨架蛋白、自身抗体、生长因子和神经肽)、激素(例如,类固醇激素、脱氢表雄酮(DHEA)、雌激素、加压素、胆固醇、肾上腺素、皮质醇和可的松(cortisone))、代谢物(例如,酒精、乳酸、乳酸盐(lactate)、尿素和肌酐)和小分子(例如,维生素、葡萄糖、青霉素和过氧化氢)。在示例性实施方案中,生物标志物是蛋白质生物标志物,例如细胞因子。
a.将捕获剂和检测剂的混合物添加到样品中
所述方法包括提供捕获剂和检测剂的混合物并将混合物添加到样品中。
捕获剂可以包含用第一探针包被的磁珠或其他粒子或固体表面,所述第一探针被配置为结合所述分子。磁珠可以包含不同的标记或检测化学物质,包括例如荧光、化学发光、生物发光或同位素标记。在一些实施方案中,磁珠是荧光磁珠。在一些实施方案中,磁珠用第一探针致密地包被。每个粒子的平均探针数可以在1.0-6.0x105个探针/粒子的范围内。
检测剂可以包含被配置为与捕获剂结合相同的分子的第二探针。
第一和第二探针的性质将取决于靶分子的类型。例如,当靶分子是蛋白质时,第一和第二探针可以包括蛋白质,特别是抗体或其片段、其他蛋白质、肽或小分子。如果靶分子是核酸,则探针可以是核酸结合蛋白或互补核酸(如果靶分子是单链核酸)。当靶分子是碳水化合物时,第一和第二探针可以包括例如抗体、适体、凝集素和选择素。合适的靶分子/探针对可以包括但不限于抗体/抗原、受体/配体、蛋白质/核酸、核酸/核酸、酶/底物或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素或选择素、蛋白质/蛋白质以及蛋白质/小分子。在一些实施方案中,第一探针和第二探针独立地选自蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、小分子和配体。在示例性实施方案中,第一探针是抗体。在示例性实施方案中,第二探针是抗体。
第一和第二探针被配置为结合相同的靶分子。在一些实施方案中,第一探针和第二探针被配置为结合靶分子内的不同位置。
检测剂还可包含选自由染料、放射性标记、酶和酶底物组成的组的检测部分。在一些实施方案中,检测部分是荧光染料。在一些实施方案中,检测部分是酶或酶底物。在某些实施方案中,酶是β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
本文所述的方法和系统可以用于检测两种或更多种靶分子。对于两种或更多种靶分子的检测,每种靶分子唯一地结合捕获剂/检测剂对,使得捕获剂/检测剂对不结合样品中其他两种或更多种靶分子中的任一者。当使用多个捕获剂/检测剂对时,重要的是选择有利于对不同组分进行个别测量的捕获剂、检测剂和检测部分,以便能够准确地确定检测剂和捕获剂是否存在。
b.用混合物孵育样品
在一些实施方案中,所述方法还包括将样品用混合物孵育以形成捕获剂-分子-检测剂复合物。孵育的时间长度小于形成捕获剂-分子-检测剂复合物达到平衡条件所需的时间。当缔合反应被解离反应平衡,使得结合复合物的总数保持不变时,结合反应的平衡条件存在。然而,在开始孵育两种结合组分时或在预平衡条件下,缔合反应非常有利,因为不存在或存在很少的结合复合物。因此,孵育的时间长度是在其中分子与捕获剂的缔合反应有利并支配结合相互作用的时间段期间内。当前的方法利用更长的孵育时间来靶向测量平衡条件下的结合相互作用。预平衡条件的测量是出乎意料和令人惊讶的。
可以使用基于理想朗缪尔(Langmuir)结合曲线的简单时间常数来确定结合反应的预平衡条件的时间长度。朗缪尔吸附模型为:
其中[L]是体积配体浓度,[Ab]0是初始表面抗体浓度,[AbL]是配体-抗体复合物的表面浓度,以及kon和koff分别是缔合速率和解离速率常数。
假设溶液配体浓度[L]=c0=常数(不随时间变化,完美质量传递),(1)可解为:
在预平衡时:t<τ。
例如,抗体对抗原的典型解离常数Kd为1nM,其中kon≈106M-1s-1且koff≤10-3s-1并且临床相关细胞因子检测浓度c0通常为10fM至0.1nM。因此,时间常数τ将估计为大约1000秒(16.7分钟)。
实际上,溶液配体浓度[L]不是常数,而是随着生物反应的进行,随时间降低c(t),并且靶分子扩散需要时间。因此,结合曲线将看起来像图19中所示的扩散线(由数值求解器COMSOL求解)或在对流和扩散线的中间某处,而不是朗缪尔线。尽管如此,由基于理想朗缪尔结合曲线的简单时间常数确定的预平衡区也将适用于扩散和对流线。
在一些实施方案中,孵育的时间长度在15秒与45分钟之间。孵育的时间长度可以大于15秒、30秒、45秒、60秒、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟或40分钟。孵育的时间长度可以小于45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、2分钟、60秒、45秒或30秒。在某些实施方案中,孵育的时间长度在15秒与600秒之间。在示例性实施方案中,孵育的时间长度在15秒与300秒之间。
添加到样品中的捕获剂和检测剂的总量将根据样品中感兴趣的分子的丰度和样品的体积而变化。在一些实施方案中,用样品孵育的捕获剂(例如,磁珠+第一探针)的总数为105-106。在一些实施方案中,检测剂的总浓度在0.25-1μg/mL之间。
在一些实施方案中,可以在孵育期间通过搅拌、振荡、旋转、打旋、涡旋或基于孵育容器的其他适当手段来混合样品。
孵育之后,将捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物与样品的其余部分和任何未结合的检测剂分离。由于去除了反应的组分之一,分离在达到平衡条件之前基本上淬灭或停止了结合反应。
分离可以利用允许选择性去除样品和未结合的检测剂的任何必要或有用的手段。例如,在捕获剂包含磁珠的情况下,这可以使用磁铁将捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物与其他组分分开来完成。其他方法可以包括过滤、亲和分离和/或离心。
在分离之后可以进行至少一个洗涤步骤。优选的洗涤溶液是不改变捕获剂、分子或检测剂的构型并且不破坏捕获剂-分子-检测剂复合物中的结合相互作用的那些。
c.分离每个捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物
在一些实施方案中,所述方法还包括将每个捕获剂和每个捕获剂-分子-检测剂复合物或此类剂和复合物的子集分离到固体支持物内的个别位置中。分离可导致固体支持物中的个别位置被填充捕获剂、捕获剂-分子-检测剂复合物或两者都没有。
固体支持物可以是光滑的,具有基本上平坦的表面,或者它可以含有多种结构,诸如孔、凹槽、凹陷、通道、隆起、室等,每个捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物在其中被分离。固体支持物可以是包含一系列微通道的微流体装置,所述微通道将个别捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物分离。固体支持物可以是包含大量孔的多孔板,所述孔将个别捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物分离。固体表面可以是磁性阵列,使得个别磁性区域导致每个捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物在基本上平坦的表面上分离。在一些实施方案中,固体支持物是微板或微流体装置。
固体支持物可由多种材料中的任一种构成,所述材料例如聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或其任何组合。可以使用聚合物、化学物质对固体支持物材料进行处理、包被、改性、印制或衍生化,以赋予阵列支持物表面所需的性质或功能。优选的固体支持物材料可以与包括盐浓度和溶剂在内的测定期间遇到的条件范围相容,在磁场的施加下是稳定的,并且是光学透明的。
固体支持物可以是可商购获得或使用常用方法形成的那些,所述常用方法包括但不限于薄膜沉积工艺,诸如旋涂和化学气相沉积、激光制造(fabrication)或光刻技术、湿化学或等离子体蚀刻方法和/或模制或铸造。
可以在检测之前密封固体支持物,以防止在剩余的分析期间个别位置中的内容物蒸发或迁移。可在分离之后或在任选添加标记剂之后密封固体支持物。密封方法包括例如,用密封流体(例如非水流体,诸如油)覆盖固体支持物的顶表面或使用密封胶带分离每个个别位置。
d.确定捕获剂或检测剂是否存在
在一些实施方案中,所述方法还包括确定在每个个别位置内是否存在捕获剂和检测剂。
确定捕获剂是否存在可以包括检测磁珠。在一些实施方案中,这可以用明场检测器完成,从而识别每个位置处珠粒的存在。在磁珠包含可检测标签或标记诸如荧光标签的情况下,可以使用带有照相机或其他检测器的荧光显微镜。
检测剂的存在可以指示感兴趣的分子的存在,使得所述位置包含捕获剂-分子-检测剂复合物。可以直接或间接地确定检测剂是否存在。在直接检测的情况下,检测剂可以包含可以被直接测量的检测部分。例如,如果检测部分包含染料或放射性同位素,则检测剂的存在可以分别通过染料的光学检测,荧光或可见光检测,或者红外光谱或放射自显影来确定。在间接检测的情况下,检测剂可以包含与标记剂反应以形成可检测反应产物的检测部分。
在一些实施方案中,检测剂包含可以被直接检测的检测部分。在一些实施方案中,所述方法还可以包括将标记剂添加到分离的捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物中,使得标记剂与检测部分反应以产生反应产物。因此,在一些实施方案中,确定检测剂是否存在包括测量反应产物。标记剂可以在将捕获剂/捕获剂-分子-检测剂复合物分离到个别位置之前或之后(优选在分离之后)添加。
在一些实施方案中,标记剂是包含在捕获剂中的酶的底物,使得在与酶接触时将标记剂转化为可检测的显色、荧光或化学发光反应产物。在一些实施方案中,标记剂是酶并且底物包含在捕获剂中。可以选择任何已知的显色、荧光或化学发光标记剂以通过许多不同的酶进行转化。在示例性实施方案中,酶可以是β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。底物可以分别是本领域熟知的β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的底物(它们在酶促反应时被标记或产生可测量的信号),包括但不限于:3,3',5,5'-四甲基联苯胺、3,3'-二氨基联苯胺、2,2'-联氮(azino)-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、对硝基苯磷酸酯、2,2'-联氮双[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸]-二铵盐、邻苯二胺二盐酸盐或其其他增强的荧光或化学发光衍生物。
所采用的检测方法和检测器类型取决于捕获剂、检测剂或标记剂反应产物的性质。检测方法的非限制性实例包括光学成像(荧光和可见光)、拉曼(Raman)散射、光谱学(例如,红外、原子、荧光或可见光谱)、吸光度、圆二色性、电子显微镜(例如,扫描电子显微镜(SEM)、x射线光电子显微镜(XPS))、光散射、光学干涉法和本领域已知的其他基于测量折射率、衍射、吸收和荧光变化的技术的方法。
在一些实施方案中,检测器可以包含多于一个光源和/或多个滤光片以调节光源的波长和/或强度。在一些实施方案中,检测器还可以包含显微镜(光或荧光)和/或照相机以捕获检测方法的光学输出的检测。照相机可以是CCD(电荷耦合装置)或CMOS(互补金属-氧化物-半导体)照相机或本领域已知的类似照相机。通过使用带有电子图像转换器诸如CCD或CMOS芯片的照相机,可以实现高局部分辨率。检测器还可以包括用于控制光源、过滤器和/或执行任何成像处理软件的计算机或控制器。
检测器可以一次性捕获整个固体支持物的光学输出。或者,检测器可以在检测期间在整个固体支持物上移动,以探查整个固体支持物是否存在捕获剂和检测剂。
分子浓度的测量可以基于确定为含有捕获剂和检测剂的位置的数量和/或分数。浓度可以基于包含捕获剂和检测剂两者的位置相比于仅包含捕获剂的位置的分数。浓度可以基于包含捕获剂和检测剂两者的位置相比于总位置的分数。
在一些实施方案中,所述方法还包括基于包含捕获剂和检测剂两者的位置相对于仅包含捕获剂的位置的分数来量化分子的浓度。在确定每个位置是否存在捕获剂和检测剂之后,可以通过包括基于泊松分布的算法的软件分析位置的数据,以确定每个珠粒的结合复合物的平均数量。所述软件可以去除假阳性、成像缺陷的存在、捕获剂或检测剂在任何位置的污染和聚集。例如,所述算法可以分别基于仅存在捕获剂或存在检测剂将二进制“关”或“开”状态应用于每个位置。那么,“开”状态的分数可以与例如来自感兴趣的分子的标准曲线或校准曲线的分子浓度相关联。
3.用于检测分子的系统
本公开提供了用于检测样品中的至少一种分子的系统(例如,试剂、计算机软件、仪器等)。在一些实施方案中,所述系统包括至少一个捕获剂,所述捕获剂包含用第一探针包被的粒子(例如,磁珠),所述第一探针被配置为结合所述至少一种分子中的一种;以及至少一个检测剂,所述检测剂包含第二探针,所述第二探针被配置为结合所述至少一种分子中的所述一种。
捕获剂可以包含用第一探针包被的磁珠,所述第一探针被配置为结合所述分子。磁珠可以包含不同的标记或检测化学物质,包括例如荧光、化学发光、生物发光或同位素标记。在一些实施方案中,磁珠是荧光磁珠。检测剂可以包含被配置为与捕获剂结合相同的分子的第二探针。
第一和第二探针的性质将取决于靶分子的类型。例如,当靶分子是蛋白质时,第一和第二探针可以包括蛋白质,特别是抗体或其片段、其他蛋白质、肽或小分子。如果靶分子是核酸,则探针可以是核酸结合蛋白或互补核酸(如果靶分子是单链核酸)。当靶分子是碳水化合物时,第一和第二探针可以包括例如抗体、凝集素和选择素。合适的靶分子/探针对可以包括但不限于抗体/抗原、受体/配体、蛋白质/核酸、核酸/核酸、酶/底物或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素或选择素、蛋白质/蛋白质以及蛋白质/小分子。在一些实施方案中,第一探针和第二探针独立地选自蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、小分子和配体。在示例性实施方案中,第一探针是抗体。在示例性实施方案中,第二探针是抗体。
检测剂还可包含选自由染料、放射性标记、酶和酶底物组成的组的检测部分。在一些实施方案中,检测部分是荧光染料。在一些实施方案中,检测部分是酶或酶底物。在某些实施方案中,酶是β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
所述系统还可以包括标记剂。标记剂与检测部分反应以产生反应产物。
所述系统还可以包括样品(例如,阳性和/或阴性对照样品)、固体支持物、检测器和/或被配置为根据检测器的输出确定捕获剂和检测剂是否存在的软件。在一些实施方案中,提供了使本文所述方法的一个或多个步骤自动化的仪器。例如,在一些实施方案中,仪器包括控制孵育时间的软件以例如开始和停止反应,从而实现本文所述的预平衡孵育时间。
样品包括包含感兴趣的分子的任何组合物。样品可以从任何来源获得,包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器,以及高等生物诸如植物或动物,包括人类。样品可以从其他来源获得,包括但不限于环境来源、食品和法医样品。在一些实施方案中,样品为生物样品。
固体支持物可以是光滑的,具有基本上平坦的表面,或者它可以含有多种结构,诸如孔、凹槽、凹陷、通道、隆起、室等,其中每个捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物是分离的。固体支持物可以是包含一系列微通道的微流体装置,所述微通道将个别捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物分离。固体支持物可以是包含大量孔的多孔板,所述孔将个别捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物分离。固体表面可以是磁性阵列,使得个别磁性区域导致每个捕获剂或捕获剂-分子-检测剂复合物在基本上平坦的表面上分离。在一些实施方案中,固体支持物是微板或微流体装置。
采用的检测器类型取决于捕获剂、检测剂或标记剂反应产物的性质。检测方法的非限制性实例包括光学成像(荧光和可见光)、拉曼(Raman)散射、光谱学(例如,红外、原子、荧光或可见光谱)、吸光度、圆二色性、电子显微镜(例如,扫描电子显微镜(SEM)、x射线光电子显微镜(XPS))、光散射、光学干涉法和本领域已知的其他基于测量折射率、衍射、吸收和荧光变化的技术的方法。
检测器可以包括多于一个光源和/或多个滤光片以调节光源的波长和/或强度。检测器还可以包括显微镜(光或荧光)和/或照相机以捕获检测方法的光学输出的检测。照相机可以是CCD或CMOS照相机或本领域已知的类似照相机。通过使用带有电子图像转换器诸如CCD或CMOS芯片的照相机,可以实现高局部分辨率。检测器还可以包括用于控制光源、过滤器和/或执行任何成像处理软件的计算机或控制器。在一些实施方案中,检测器包括光学显微镜、荧光显微镜、荧光计、分光光度计、照相机或其组合。
所述软件可以任何电子形式随系统一起提供,诸如计算机可读装置、互联网下载或基于网络的门户。所述软件可以与检测器集成以不仅根据检测器的输出和/或样品确定捕获剂和检测剂是否存在,而且还控制检测器部件。所述软件可以允许用户实时查看结果、审查先前样品的结果以及查看报告。所述软件可以以图像、图表、曲线图或原始值的形式输出数据。所述软件还能够计算统计数据并在数据集之间进行比较。
所述系统还可以包括使用系统部件的说明书。所述说明书是属于系统的相关材料或方法。所述材料可以包括以下的任何组合:背景信息、部件清单及其可用性信息(购买信息等)、使用系统的简单或详细的方案、排除故障的参考、技术支持以及任何其他相关文件。说明书可以与系统一起提供,或者作为单独的成员部件以纸张形式或电子形式(可以提供在计算机可读存储装置上或从互联网网站下载)来提供,或者作为录制的演示来提供。
所述系统还可以包括用于获得、处理或制备样品的试剂、计算机软件、仪器等。例如,所述系统可以包括用于从患者采集样品的仪器或装置(例如手指刺、针、注射器等)、样品分离或预处理装置(例如血浆分离(单采机)、过滤装置、离心机等)、或者提取或样品稳定或分离缓冲液。在一些实施方案中,用于获得、处理或制备样品的仪器可以集成到系统内的上述任何装置中。
应当理解,所公开的系统可以与所公开的方法结合使用。
4.反应混合物
本公开提供了反应混合物。反应混合物可以包含:包含分子的样品的停止孵育混合物;捕获剂;检测剂;以及多个捕获剂-分子-检测剂复合物,其中所述停止混合物在小于形成捕获剂-分子-检测剂复合物达到平衡条件所需的时间的时间停止。
样品包括包含感兴趣的分子的任何组合物。样品可以从任何来源获得,包括细菌、原生动物、真菌、病毒、细胞器,以及高等生物诸如植物或动物,包括人类。样品可以从其他来源获得,包括但不限于环境来源、食品和法医样品。
在一些实施方案中,样品是生物样品,包括但不限于通过多种标准技术中的任一种从细胞、体液(例如,血液、血液组分、尿液等)或组织样品中获得的样品。样品可以是例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、腹膜液、胸膜液、口腔液和皮肤的外部切片;来自呼吸道、肠道、生殖道和泌尿道的样品;泪液、唾液、血细胞、干细胞或肿瘤的样品。样品也可以从活的或死的生物体或从体外培养物中获得。包含细胞的样品在用于本文公开的系统和方法之前可能需要细胞裂解。
捕获剂可以包含用第一探针包被的磁珠或其他粒子或固体表面,所述第一探针被配置为结合所述分子。磁珠可以包含不同的标记或检测化学物质,包括例如荧光、化学发光、生物发光或同位素标记。在一些实施方案中,磁珠是荧光磁珠。在一些实施方案中,磁珠用第一探针致密地包被。每个粒子的平均探针数可以在1.0-6.0x105个探针/粒子的范围内。
检测剂可以包含被配置为与捕获剂结合相同的分子的第二探针。
第一和第二探针的性质将取决于靶分子的类型。例如,当靶分子是蛋白质时,第一和第二探针可以包括蛋白质,特别是抗体或其片段、其他蛋白质、肽或小分子。如果靶分子是核酸,则探针可以是核酸结合蛋白或互补核酸(如果靶分子是单链核酸)。当靶分子是碳水化合物时,第一和第二探针可以包括例如抗体、适体、凝集素和选择素。合适的靶分子/探针对可以包括但不限于抗体/抗原、受体/配体、蛋白质/核酸、核酸/核酸、酶/底物或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素或选择素、蛋白质/蛋白质以及蛋白质/小分子。在一些实施方案中,第一探针和第二探针独立地选自由以下组成的组:蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、小分子、配体及其任何组合。
5.用于检测分子的试剂盒
本公开提供了用于检测分子的试剂盒。
所述试剂盒可以包括以下中的一者或多者或每一者:至少一个捕获剂,所述捕获剂包含用第一探针包被的粒子,所述第一探针被配置为结合感兴趣的分子;至少一个检测剂,其包含被配置为与所述捕获剂结合相同的感兴趣的分子的第二探针;检测部分,其选自由染料、放射性标记、酶和酶底物组成的组;标记剂;固体支持物;检测器;软件,其被配置为根据检测器的输出确定捕获剂和检测剂是否存在。
试剂盒还可以包括用于获得、处理或制备样品的试剂、计算机软件、仪器等。例如,所述试剂盒可以包括用于从患者采集样品的仪器或装置(例如手指刺、针、注射器等)、样品分离或预处理装置(例如血浆分离(单采机)、过滤装置、离心机等)、或者提取或样品稳定或分离缓冲液。在一些实施方案中,用于获得、处理或制备样品的仪器可以集成到如上所述的试剂盒的任何其他部件中。
所述试剂盒的个别成员部件可以物理地包装在一起或单独包装。所述试剂盒还可以包含使用试剂盒的部件的说明书。所述说明书是属于试剂盒的相关材料或方法。所述材料可以包括以下的任何组合:背景信息、部件清单及其可用性信息(购买信息等)、使用系统的简单或详细的方案、排除故障的参考、技术支持以及任何其他相关文件。说明书可以与试剂盒一起提供,或者作为单独的成员部件以纸张形式或电子形式(可以提供在计算机可读存储装置上或从互联网网站下载)来提供,或者作为录制的演示来提供。
应当理解,所公开的试剂盒可以与所公开的方法结合使用。
6.空间光谱编码
本公开提供了用于空间光谱编码的装置、系统和方法。空间光谱编码是这样的过程:将多个捕获探针图案化成在单个可检测芯片或基板上物理分离的微阵列或用多色标记的固体支持物(例如磁珠)。
在一些实施方案中,装置和方法包括以下中的一者或多者或每一者:固体支持物、样品图案化部件和样品检测部件。在一些实施方案中,系统和方法还包括检测器、软件、捕获剂和检测剂。下面描述了这些部件中的每一者的例示性实施方案,以及它们在方法中的用途。
a.固体支持物
在一些实施方案中,装置和方法包括如本文所述的固体支持物。固体支持物可以包括被配置为分离感兴趣的分子的个别位置。固体支持物可以含有多种结构诸如孔、凹槽、凹陷、通道、隆起、室等以在其中分离感兴趣的分子。固体支持物可由多种材料中的任一种构成,所述材料例如聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或其任何组合。可以使用聚合物、化学物质对固体支持物材料进行处理、包被、改性、印制或衍生化,以赋予阵列支持物表面所需的性质或功能。优选的固体支持物材料可以与包括盐浓度和溶剂在内的测定期间遇到的条件范围相容,在磁场的施加下是稳定的,并且是光学透明的,具有极小的自发荧光背景。
固体支持物可以是可商购获得或使用常用方法形成的,所述常用方法包括但不限于薄膜沉积工艺,诸如旋涂和化学气相沉积、激光制造或光刻技术、湿化学或等离子体蚀刻方法和/或模制或铸造。
b.样品图案化部件和样品检测部件
在一些实施方案中,装置和方法可以包括样品图案化部件和样品检测部件。样品图案化部件和样品检测部件各自包括多个平行流体处理通道。在一些实施方案中,样品图案化部件和样品检测部件中的每个流体处理通道独立于相邻的流体处理通道。在一些实施方案中,每个流体处理通道被配置为接收不同的流体样品。在一些实施放案中,每个流体处理通道包括单独的入口和出口,使得单独的溶液或样品可以装载到每个流体处理通道中。在一些实施方案中,样品检测部件中的每个流体处理通道被配置为接收相同的样品。
每个流体处理通道与固体支持物中的个别位置的一部分流体连通。在一些实施方案中,样品图案化部件的流体处理通道垂直于样品检测部件的流体处理通道。在一些实施方案中,与样品图案化部件的单个流体处理通道流体连通的个别位置的一部分也与样品检测部件的每个流体处理通道流体连通。在一些实施方案中,暴露于第一平行流体处理通道的个别位置的部分暴露于装载到样品检测部件的每个流体处理通道中的每个样品。在一些实施方案中,暴露于第一平行流体处理通道的个别位置的部分仅暴露于装载到样品检测部件的流体处理通道中的选定样品。
样品图案化部件和样品检测部件可以由多种材料中任一种构成,所述材料例如聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或其任何组合。可以使用聚合物、化学物质对材料进行处理、包被、改性、印制或衍生化,以赋予阵列支持物表面所需的性质或功能。样品图案化部件和样品检测部件可以使用常用方法来形成,所述常用方法包括但不限于薄膜沉积工艺,诸如旋涂和化学气相沉积、激光制造或光刻技术、湿化学或等离子体蚀刻方法和/或模制或铸造。
在一些实施方案中,将捕获剂池装载到样品图案化部件的每个流体处理通道中,并且将每个捕获剂池分离到固体支持物中的个别位置的一部分中。捕获剂池包括至少一个如本文所定义的捕获剂。在一些实施方案中,捕获剂池包括至少一个、至少两个、至少三个或至少四个捕获剂。在一些实施方案中,来自每个捕获剂池的捕获剂可以相同或不同。在一些实施方案中,装载到每个流体处理通道中的至少两个、至少三个或至少四个捕获剂是相同的。在一些实施方案中,装载到每个流体处理通道中的至少两个、至少三个或至少四个捕获剂是不同的。在一些实施方案中,来自捕获剂池的每个捕获剂被分离在一个个别位置中。
在一些实施方案中,如本文所述,将样品装载到样品检测部件的每个流体处理通道中,并且每个样品被分离到固体支持物中的个别位置的一部分中。在一些实施方案中,装载到每个流体处理通道中的样品是相同的。在一些实施方案中,装载到每个流体处理通道中的样品是不同的。
在一些实施方案中,样品图案化部件和样品检测部件可互换地附着至固体支持物。在一些实施方案中,将样品图案化部件附着至固体支持物以有利于捕获剂池的装载。在一些实施方案中,将样品图案化部件从固体支持物去除,并将样品检测部件附着至支持物以有利于样品的装载。
在一些实施方案中,样品在每个个别位置用捕获剂孵育以形成捕获剂-分子复合物。
c.检测器
在一些实施方案中,装置和方法包括检测器。
所采用的检测方法和检测器类型取决于捕获剂、检测剂或标记剂反应产物的性质。检测方法的非限制性实例包括光学成像(荧光和可见光)、拉曼(Raman)散射、光谱学(例如,红外、原子、荧光或可见光谱)、吸光度、圆二色性、电子显微镜(例如,扫描电子显微镜(SEM)、x射线光电子显微镜(XPS))、光散射、光学干涉法和本领域已知的其他基于测量折射率、衍射、吸收和荧光变化的技术的方法。
在一些实施方案中,检测器可以包含多于一个光源和/或多个滤光片以调节光源的波长和/或强度。在一些实施方案中,检测器还可以包含显微镜(光或荧光)和/或照相机以捕获检测方法的光学输出的检测。照相机可以是CCD(电荷耦合装置)或CMOS(互补金属-氧化物-半导体)照相机或本领域已知的类似照相机。通过使用带有电子图像转换器诸如CCD或CMOS芯片的照相机,可以实现高局部分辨率。检测器还可以包括用于控制光源、过滤器和/或执行任何成像处理软件的计算机或控制器。
检测器可以一次性捕获整个固体支持物的光学输出。或者,检测器可以在检测期间在整个固体支持物上移动,以探查整个固体支持物是否存在捕获剂和检测剂。
在一些实施方案中,在检测之前,使捕获剂-分子复合物与检测剂接触,如本文所述。在一些实施方案中,检测器检测捕获剂、检测剂或其组合的存在。在一些实施方案中,所述检测器使用相同的检测器检测固体支持物中的每个个别位置处是否存在捕获剂和检测剂。
采用的检测器类型取决于捕获剂、检测剂或标记剂反应产物的性质。检测方法的非限制性实例包括光学成像(荧光和可见光)、拉曼(Raman)散射、光谱学(例如,红外、原子、荧光或可见光谱)、吸光度、圆二色性、电子显微镜(例如,扫描电子显微镜(SEM)、x射线光电子显微镜(XPS))、光散射、光学干涉法和本领域已知的其他基于测量折射率、衍射、吸收和荧光变化的技术的方法。
检测器可以包括多于一个光源和/或多个滤光片以调节光源的波长和/或强度。检测器还可以包括显微镜(光或荧光)和/或照相机以捕获检测方法的光学输出的检测。照相机可以是CCD或CMOS照相机或本领域已知的类似照相机。通过使用带有电子图像转换器诸如CCD或CMOS芯片的照相机,可以实现高局部分辨率。
d.软件
在一些实施方案中,装置和方法包括软件,所述软件被配置为在空间上分离固体支持物内的可识别的个别位置并且能够将检测器的输出与多个感兴趣的分子中的至少一个是否存在相关联。
在一些实施方案中,所述软件包括卷积神经网络(CNN)算法,所述算法获取输入图像,将各个方面/对象分类并彼此区分,以及对图像中的各个方面/对象分配重要性。例如,所述软件可以基于两种不同的荧光信号分析检测器图像以确定哪些个别位置包括荧光信号中的一者或两者。此外,所述软件还可以分析检测器明场图像,以计算具有和不具有捕获剂-复合物的个别位置的总数,然后基于荧光图像计算包含捕获剂-分子-检测剂复合物的那些位置中的每一者的百分比。
分子浓度的测量可以基于确定为含有捕获剂和检测剂的位置的数量和/或分数。浓度可以基于包含捕获剂和检测剂两者的位置相比于仅包含捕获剂的位置的分数。浓度可以基于包含捕获剂和检测剂两者的位置相比于总位置的分数。在一些实施方案中,所述方法还包括基于包含捕获剂和检测剂两者的位置相对于仅包含捕获剂的位置的分数来量化分子的浓度。
所述软件可以去除假阳性、成像缺陷的存在、捕获剂或检测剂在任何位置的污染和聚集。例如,所述算法可以分别基于仅存在捕获剂或存在检测剂将二进制“关”或“开”状态应用于每个位置。那么,“开”状态的分数可以与例如来自感兴趣的分子的标准曲线或校准曲线的分子浓度相关联。
在一些实施方案中,所述算法可以为两个检测路径并行运行两个神经网络。例如,一个神经网络可以用于测定靶标(例如微孔、珠粒和荧光信号),而另一个可以用于假阳性、成像缺陷、捕获剂或检测剂的污染和聚集。
所述软件可以以任何电子形式提供,诸如计算机可读装置、互联网下载或基于网络的门户。所述软件可以与检测器集成以不仅根据检测器的输出和/或样品确定捕获剂和检测剂是否存在,而且还控制检测器部件。所述软件可以允许用户实时查看结果、审查先前样品的结果以及查看报告。所述软件可以以图像、图表、曲线图或原始值的形式输出数据。所述软件还能够计算统计数据并在数据集之间进行比较。
7.实施例
材料和方法
材料。小鼠CitH3捕获抗体由ProMab Biotechnologies,Inc.(Richmond,CA,USA)产生。CitH3检测抗体和HRP缀合二抗购自Abcam and Jackson ImmunoResearch。人IL-6捕获抗体和生物素化检测抗体购自BioLegend。人TNF-α、IL-2和MCP-1测定是基于来自Invitrogen的未包被ELISA试剂盒(包括捕获抗体、生物素化检测抗体和抗生物素蛋白-HRP)开发的。Dynabead、2.7μm直径的羧酸和环氧树脂连接的超顺磁珠、抗生物素蛋白-HRP、QuantaRedTM、增强的化学荧光HRP底物、Alexa FluorTM 488酰肼、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)、磺基-NHS(磺基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺)、MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲盐水、牛血清白蛋白(BSA)、TBS StartingBlock T20封闭缓冲液和PBSSuperBlock封闭缓冲液得自Thermo Fisher Scientific。人IL-6、TNF-α、IL-2、IL-8、IL-13捕获抗体和生物素化检测抗体对得自InvitrogenTM,并且IL-1α、IL-1β、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17A、IFN-γ、GM-CSF和MCP-1得自BioLegend。磷酸盐缓冲盐水(PBS)得自GibcoTM,SylgardTM 184透明聚二甲基硅氧烷(PDMS)得自Dow Corning,并且氟碳油(NovecTM 7500)得自3MTM。
瞬态数字测定的有限元分析。使用商业FEA软件COMSOL 5.4MultiphVsics对涉及分子传输和珠粒表面反应的两步PEdELISA过程进行建模。基于实验条件做出了几个模型假设。首先,假设磁珠在孵育过程期间通过轨道振荡器混合均匀分布在缓冲溶液中。因此,所述模型仅考虑了“反应体积”内单个珠粒表面的一半,所述反应体积由样品体积除以使用的珠粒数量来衡量。使用瞬态质量对流和扩散方程评价细胞因子扩散曲线:
其中c是浓度,对流项省略,并且扩散系数的值D经调整以反映主动混合下的质量传输。PEdELISA过程的第一步是通过考虑捕获抗体(Ab1)、抗原配体(L)和检测抗体(Ab2)之间的同时反应来模拟的。使用朗缪尔等温线导出的动力学方程如下:
其中kon和koff是缔合/解离常数,并且[]表示三种剂的浓度或表面密度。为简单起见,假设Ab1对L的亲和力与Ab2对L的亲和力相同(kon1=kon2,koff1=koff2)。对于第二步的标记过程,抗生物素蛋白-HRP缀合物和免疫复合物Ab1LAb2分别被建模为“游离配体”和表面固定捕获剂。此过程的动力学方程如下:
最后,为了将分子结合事件转变为数字测定读数,使用了泊松分布方程(9),
λ=-ln(1-P阳性) (9)
其中P阳性是荧光激活的“开”珠粒相对于整体珠粒的分数,并且λ是平均期望值,它表示每个珠粒的平均免疫复合物数。
装置制造和组装。使用标准软光刻技术在聚二甲基硅氧烷(PDMS,Dow CorningSylgard 184)中制造微孔结构和微流体通道。首先,通过光刻法制造两个硅模具,一个(SU-8 2005,Micro-Chem)厚度为4μm,用于微孔结构,另一个(SU-8 2050,Micro-Chem)厚度大约100mm,用于微流体通道。其次,以10∶1的碱与固化剂质量比制备的PDMS前体旋涂到微孔硅模具上(300rpm,1分钟),并浇注在微流体通道模具上,厚度大约4mm。将两个模具放在平坦的表面上过夜,然后在60℃的烘箱中固化2小时。在硅模具晶片上固化的薄膜PDMS微孔层的表面通过氧等离子体来处理。使用定制加工的铝夹具将膜对准并结合到预先清洁的75×50mm载玻片上,最后从硅晶片上去除。将PDMS微流体通道层从其硅模具上切割并剥离,并且人工冲孔以形成其入口和出口。在第二次氧等离子体处理之后,将薄膜PDMS微孔层的顶表面与PDMS微流体通道层对准并结合。最后,将整个芯片在60℃下短暂烘烤,并在使用之前在室温下储存。
抗体与磁珠缀合。非彩色编码磁珠通过以6μg(抗体):1mg(珠粒)的质量比将环氧树脂连接的Dynabead与捕获抗体分子缀合来制备。Alexa FluorTM488(AF488)编码磁珠的制备方法如下:首先用AF 488酰肼染料标记羧酸连接的Dynabead,然后使用标准EDC/磺基-NHS化学使磁珠与捕获抗体以12μg(抗体):1mg(磁珠)的质量比缀合。简而言之,羧酸连接的Dynabead首先用AF 488染料标记,然后与捕获抗体分子缀合,过程如下:将100μL的珠粒原液(30mg珠粒/mL)用pH=5的25mM MES缓冲液洗涤两次,与100μL的1mg/mL EDC溶液和100μL的1.13mg/mL磺基-NHS溶液(25mM MES缓冲液)混合,然后在轨道振荡器上以1000rpm在室温下孵育30分钟。然后,将珠粒用MES缓冲液洗涤两次,并与1μg/mL Af488酰肼溶液混合30分钟。然后,将珠粒用0.5mL PBS-T(0.1%Tween20)溶液洗涤5次,重悬于300μL的PBS-T(0.05%Tween20)溶液中,并转移到新的聚丙烯管中。AF488编码珠粒用MES缓冲液洗涤两次,用100μL的50mg/mL EDC溶液和100μL的50mg/mL磺基-NHS溶液重新激活30分钟,然后用MES缓冲液冲洗两次。制备100μL捕获抗体溶液并将其与激活的珠粒在室温下以12μg(抗体):1mg(珠粒)的质量比混合2小时。然后将珠粒分离并用0.5mL PBS-T(0.1%Tween20)溶液洗涤4次,并在PBS-T(0.05%T20+0.1%BSA+0.01%叠氮化钠)溶液中以10mg珠粒/mL在4℃下用铝箔包裹着储存。在3个月的使用内没有观察到显著的降解。
小鼠CLP准备和样品收集。在年龄处于8-12周龄之间的雄性小鼠中通过盲肠结扎穿刺(CLP)诱导脓毒症。在吸入异氟醚麻醉下打开腹腔。取出盲肠,在三个不同点(50%、75%和100%)处使用5-0缝合丝线在回盲瓣下方结扎,并用21号针刺穿(两个孔)。挤压穿刺的盲肠以排出少量粪便,并将盲肠返回腹腔。腹部切口用4-0缝合丝线以两层闭合。假小鼠以相同方式处理,除了盲肠未结扎和穿刺。CLP之后每4-5小时通过尾静脉抽取大约15μL血液。通过在室温下静置30分钟使血液凝结。然后通过在冷冻离心机中以2000×g离心15分钟去除凝块。上层血清用于以下PEdELISA测定。此方案已被University of Michigan批准。所有手术均在麻醉下进行,并尽一切努力最大限度减小痛苦。
患者血液样品收集和制备。招募经受CAR-T疗法的受试者,并在每位受试者知情同意的情况下收集样品。对照样品从知情同意的健康志愿者获得。所有血液样品均在University of Michigan Medical School Hospital现场收集。为获得血清将静脉血收集到不含抗凝剂的真空采血管中。然后将血液样品运送到实验室,使其在室温下凝结至少30分钟,并且进行处理以用于血清分离。样品在室温下以1,200×g离心15分钟。然后通过移液器去除血清并分装到2mL螺旋盖管中。然后将血清等分试样在湿冰上新鲜运送用于PEdELISA测定或在-80℃下入库。
PEdELISA测定。捕获抗体珠粒首先用TBS StartingBlock缓冲液(0.05%Tween20)孵育30分钟以封闭珠粒表面并淬灭所有未反应的基团。然后将珠粒用PBS-T缓冲液洗涤一次并分到96孔反应管中,使得每管具有大约8×105个珠粒。样品通过ELISA稀释缓冲液(1%BSA,0.05%Tween20)稀释。CitH3的稀释比为1:4。IL-2和TNF-α的稀释比为1:2,因为它们在血清中的丰度较低,而IL-6和MCP-1的稀释比为1:4或1:8,这是基于重度CRS条件下的潜在高水平。通过加标有25%胎牛血清的ELISA稀释缓冲液稀释重组标准品。稀释的样品暂时保存在湿冰上直至使用。在两步测定方案中,将10μL的样品或标准品和10μL的生物素化检测抗体(0.25μg/mL)溶液的混合物装载到管中,并用磁珠孵育60秒至300秒的时段。快速更换缓冲液(1×PBS-T,0.1%Tween20)之后,接着将珠粒用40μL的抗生物素蛋白-HRP溶液孵育30秒。在2×PBS-T(0.1%Tween20)缓冲溶液中洗涤6次之后,将它们重悬浮于11μL的1×PBS-T(0.1%Tween20)缓冲溶液中。将10μL的珠粒溶液装载到预制的微流体芯片中,所述芯片含有16个用于不同样品的独立通道。然后每个通道装载20μL的增强的化学荧光HRP底物QuantaRed溶液,随后用20μL的氟化油(HFE-7500,3M)密封。
对于14重PEdELISA测定,所有测定试剂均在96孔板低保留管中制备并保存在冰上直至使用。试剂制备涉及制备生物素化检测抗体(多达14种用于CAR-T研究的细胞因子)在载剂蛋白缓冲液(0.1%BSA,0.02%叠氮化钠)中的混合物并将其储存在4℃下,并且涉及制备100pM的超级封闭(superblock)缓冲液中的抗生物素蛋白-HRP溶液。对于PEdELISA芯片校准,制备重组蛋白在25%胎牛血清中的混合物(标准溶液),将所述混合物从2.5ng/mL连续稀释5次至0.16pg/mL。在测定之前,将患者血清样品(5uL)用PBS(5uL)稀释两次以制备样品溶液。作为测定的第一步,将样品溶液(10μL)和生物素化检测抗体溶液(10μL)混合以形成样品混合物。将5种经滴定的标准溶液(10μL)和生物素化检测抗体溶液(10μL)混合以形成标准混合物。将样品和标准混合物平行装载到检测通道中,并孵育芯片300秒。从标准混合物获得的信号用于校准芯片的生物传感器。然后通过注射泵以20uL/分钟用PBS-T(0.1%Tween20)洗涤微流体通道2分钟。然后将40μL的抗生物素蛋白-HRP溶液装载到通道中并孵育1分钟。再次以20uL/分钟用PBS-T(0.1%Tween20)洗涤芯片10分钟。将30μL的增强的化学荧光HRP底物QuantaRed溶液装载到通道中,随后用35μL的氟化油(HFE-7500,3M)密封。
用油密封之后,将通道的入口和出口通过玻璃盖玻片覆盖,以防止成像过程期间的蒸发。使用可编程电动荧光光学显微镜系统扫描微流体芯片上的珠粒场(bead-filed)微孔阵列的图像,识别珠粒类型(非彩色与AF488染色),并检测酶-底物反应活性。此系统由以下构成:Nikon Ti-S荧光显微镜、可编程电动载物台(ProScan III)、卤素灯荧光照明源、SONY全帧CMOS照相机(α7iii)和定制加工载物台支架。电动载物台经预编程以按照指定路径扫描整个芯片。成像过程花费约20秒来扫描每个通道(1个样品/通道,总共16个通道),按照3个连续步骤:1.扫描QuantaRed通道(532nm/585nm,激发/发射)2.扫描AF488通道(495nm/519nm,激发/发射)3.扫描明场。
数据分析和图像处理。在数字免疫测定中,对每个通道的336,000个飞升大小的微孔中荧光激活的“开”珠粒相对于整体珠粒的分数的统计分析确定了分析物浓度值。在与或不与卷积神经网络耦合的情况下,使用定制图像处理MATLAB代码以高速度和准确度的方式自动分析扫描的微孔阵列图像(图1)。
简而言之,所述代码同时捕获来自全部的AF488(珠粒编码染料)、QuantaRed(标记染料)和明场通道的图像并将它们叠加。然后,它对叠加图像中诱捕在微孔中的两种类型的珠粒(AF488编码类型和非彩色类型)的“开”和“关”状态的数量进行计数。所述代码包括避免对聚集的珠粒进行计数的算法以及消除来自假阳性、成像缺陷和较大荧光污染的信号的算法。“开”状态的分数与标准曲线中的分析物浓度相关联。
使用以下4步算法,使用无耦合的MATLAB代码分析扫描的图像。步骤1:所述代码同时读取全部的明场(图1C)、Alexa Fluor(AF)488(图1D)和QuantaRed(Qred)(图1E)图像,并基于荧光强度阈值法(通过创建二进制图像进行图像分割的方法)首先识别AF488染色珠粒的位置。识别珠粒的区域和信号强度的子算法用于去除缺陷计数,如聚集珠粒簇。如果通过预定义的聚集严重性值识别出缺陷,则将其从Qred和明场图像的计数中去除(在步骤2和步骤3中类似)。
步骤2:基于荧光强度阈值法、基于大小的圆检测以及形态膨胀和腐蚀分析Qred图像,以识别所有酶活性“开”(或Qred“开”)微孔的位置。识别阵列微孔的总数、区域、信号强度、间距(inter-distance)和图像边界的子算法用于消除所有假阳性、图像缺陷和较大荧光污染。信号串扰是Qred图像分析中唯一发现的问题。这是一种假阳性计数,通常发生于一个微孔太亮以至于六边形阵列排列中的一些其最近的相邻微孔也被照亮从而超过阈值强度时。在这种情况下,这些相邻的微孔被错误地计数为“开”信号,即使它们实际上没有酶活性。为了减轻这个问题,应用了距离模式识别算法,所述算法首先识别所有亮点及其6个最近的邻点,然后进行第二轮强度检查(高阈值)以确定它们的相邻微孔是真阳性还是假阳性。
步骤3:分析明场图像,使用基于索贝尔(Sobel)边缘检测方法的边缘和模式识别算法识别微孔区域。然后,将微孔亮度强度在已识别区域上进行平均,并针对明场图像中的整个阵列微孔对其值进行排序(图1H)。这种微孔强度排序有效地帮助将微孔分为两个不同的组:含有(+)或不含有(-)珠粒的组。分离线由排序的强度值的最大强度斜率(一阶导数)确定。随后使用子算法来消除具有较差珠粒与孔对比度、气泡和较大灰尘的局部图像区域。由于图像扫描过程期间焦点调整的图像质量变化,步骤3具有内在的不确定性。为了抑制由于这些不确定性导致的误差,重复计数过程并对这些重复取平均值。例如,在图1中,每个微孔阵列的初始设计含有2,100个微孔位置,但MATLAB程序显示识别出的微孔数量为2,071。其中,1114个孔被识别为内部具有珠粒。获得计数的珠粒和微孔的数量,并对100个微孔阵列取平均值,以确定用于计数的总体珠粒填充率(图1I)。
步骤4:最后,所述代码将识别的AF488阳性珠粒的局部图像叠加在Qred图像之上,以确定内部有和没有AF488染色珠粒的Qred“开”微孔的数量(图1J)。考虑到图像叠加过程中的潜在错位,每个Qred“开”微孔都标有是其初始大小1.4倍的蓝色圆圈。最后,通过针对AF488染色和非彩色珠粒类型确定酶活性Qred“开”微孔相对于珠粒填充(+)微孔的分数种群来实现双重细胞因子检测。图1K-图1M示出了浓度范围均为4pg/mL至100pg/mL的TNF-α和IL-2的混合物样品的Qred图像快照。
此外,还使用了与卷积神经网络耦合的MATLAB代码。简而言之,收集了三种类型的原始图像:1.红色荧光通道(Qred)2.绿色荧光通道(AF488)3.明场通道。将前两个通道直接发送到双向CNN以对Qred+微孔、AF488+珠粒、图像缺陷和背景进行分类。然后将Qred+和AF488+靶标分割出来作为输出掩码,并去除缺陷。使用索贝尔边缘检测方法分析明场图像以确定整体珠粒填充率。图像后处理之后,所述代码将三个图像叠加起来,以确定内部有和没有AF488染色珠粒的Qred“开”微孔的数量。针对AF488染色(AF+Qred+%)和非彩色珠粒类型(AF-Qred+%)两者的酶活性Qred“开”微孔相对于珠粒填充微孔的分数种群与待确定的两种不同的生物标志物浓度成正比。
统计数据。实验进行了3次(在独立测试中)以获得误差线。由于在每个时间点从CLP小鼠获得的样品体积极低(<7μL),因此不重复进行CitH3 PEdELISA测定。在近实时细胞因子谱监测测试的单个时间点,对CAR-T患者样品进行两次重复或三次重复的PEdELISA测量。常规ELISA和LEGENDPlex多重测定针对几个选定时间点的入库血清样品不重复地进行或针对在20个选定时间点收集的入库血清样品两次重复地进行。皮尔逊(Pearson’s)R值用于量化PEdELISA与ELISA/LEGENDPlex的相关性。使用用Tukey检验比较均值的单因素方差分析或具有相等方差的非配对双尾t检验来测试组差异。<0.05的p值被认为是统计学上显著的。参数x的标准分数(Z分数)给定为Z=(x–μ)/SD,其中μ是均值,而SD是标准差。
实施例1
PEdELISA平台的原理和设计
示出了对预平衡蛋白结合事件的瞬时单分子二元计数的PEdELISA概念的示例性概述(图2A)。此实施例提供了预平衡反应淬灭与单分子计数的组合,以实现具有近零孵育时间而不损失线性度的测定。
此实施例中的PEdELISA过程采用2步半均相格式,因此它仅涉及(1)将捕获抗体包被的磁珠与分析物和检测抗体溶液混合,以形成捕获抗体-抗原-检测抗体复合物(步骤1)以及(2)用酶HRP进行标记(步骤2)(图2B)。为了确保在与临床诊断相关的宽范围(10fM-1nM)内进行准确的单分子计数,尽管每个样品分区中的分析物分子的初始丰度不同,但希望将完全标记的免疫复合物分子的种群保持在每个珠粒少于一个。在PEdELISA中,单分子计数条件是通过在其早期非平衡状态下有意停止免疫反应来实现的。这种方法将步骤1的孵育时间缩短至15至300秒,并且将步骤2的孵育时间缩短至30秒。对于实际操作,设计了流体操纵系统,其具有96孔低保留管板、带有永久钕磁铁的板支架和轨道振荡器。所述系统能够将总样品体积减少到10μL,以有效地将磁珠拉到板支架侧壁以进行缓冲液交换,并在每个反应管中主动混合试剂。使用与不同捕获抗体缀合的荧光彩色编码珠粒以实现高通量的多重测量(图1)。
反应过程之后是数字信号检测过程(图2),其中使用定制设计的微流体检测芯片将个别珠粒分离到336,000个飞升大小的分区孔的子阵列中。HRP与荧光底物的反应用于指示哪些珠粒与抗原复合物结合。将HRP催化的荧光团限制在微小的飞升大小的体积中显著放大了读出信号,达到免疫复合物形成检测的单分子灵敏度。通过廉价的全帧CMOS照相机对具有激活荧光的孔进行成像,并通过定制的MATLAB代码进行计数(图1和图3)。珠粒的彩色编码确定了对每个孔检测到的分析物类型。试剂和芯片制造的平均成本估计为每次测试0.69美元(表1)。2步测定格式结合了使用生物素-抗生物素蛋白键联的常规酶标记策略,这使得PEdELISA与任何可商购获得的试剂兼容。PEdELISA测定费用预计将通过系统的扩大生产而显著降低。这将实现PEdELISA相对于当前商业ELISA(2-5美元/测试)或Luminex技术(30美元/测试)的竞争成本优势。
表1.PEdELISA测定的成本估算
总计 0.69
实施例2
快照单分子计数
为了验证“淬灭和快照”方法,在数字免疫测定中对生物分子相互作用进行了有限元分析(FEA),然后进行了参数分析以优化测定条件。所述分析解释了珠粒放置在其中心的理论“反应体积”的质量传输和表面反应(图4A)。假设珠粒均匀分布在缓冲液/样品溶液中,反应体积的量取为总缓冲液/样品体积除以用于测定的珠粒数量。使用质量传输和朗缪尔吸附方程对分析物分子、固定在珠粒表面上的捕获抗体和自由漂浮在反应体积中的检测抗体之间的同时分子相互作用进行建模(图4B)。为简单起见,假设捕获和检测抗体分子的亲和力相同。然后,对具有亲和力(34)(kon=5.5×108M-1s-1和koff=3.1x10-5 s-1)的生物素-抗生物素蛋白键联的酶标记过程建模(图4C)。
使用表2中列出的关键模型参数,针对典型可商购获得的抗体的亲和力值(Kd=10-10-10-9M)预测了PEdELISA步骤1中抗体-抗原-抗体免疫复合物形成过程的动力学。将单个珠粒表面上形成的免疫复合物的平均数量λ作为免疫复合物形成过程的孵育时间(步骤1孵育时间)和分析物浓度的函数作图(图4D和图4E)。所述模型显示,由于目标分析物与捕获和检测抗体分子的同时相互作用,珠粒表面上免疫复合物形成的动力学与时间不成线性。尽管如此,所述模型预测所形成的免疫复合物的量随着分析物浓度线性增加而与时间、分析物质量传递类型(强制平流或被动扩散)和珠粒数量无关。这种线性关系允许PEdELISA的数字读数随着分析物浓度线性增加,即使是对于非常短的测定孵育时间。此发现为在这种预平衡淬灭方法中确保高灵敏度和较大线性动态范围两者提供了理论基础。
表2.理论研究的关键参数
为了优化测定条件,评价了几个其他关键因素的影响,所述因素诸如每次测定的珠粒总数、检测抗体浓度,以及样品-试剂混合对增强试剂质量传输的影响。对于具有较大抗体亲和力值(Kd=10-10M,图4D)的系统,珠粒的总数和质量传输两者都在确定测定动力学中起关键作用。相比之下,对于具有弱亲和力值(Kd=10-9M,图4E)的系统,步骤1孵育时间是确定测定速度的唯一主要因素。PEdELISA测定独特地提供了缩短反应速率限制的弱亲和力系统的测定时间的手段,在所述系统中,主要由通过主动混合进行的质量传输增强或表面与体积比增强来驱动的其他现有超快免疫测定方法未能实现。图4F示出了三个代表性抗生物素蛋白-HRP浓度的标记过程动力学,并且表明100pM的浓度足够大以在30秒的孵育时间(步骤2孵育时间)下完成所述过程。
测定结果的参数分析和优化。评价了几个其他关键测定参数对步骤1反应中的结合动力学的影响(图5)以获得最佳测定性能。这些参数包括检测抗体(DeAb)浓度、每个样品使用的磁珠数量和捕获抗体结合位点密度(Bd)。参数分析是以104至107M-1s-1范围内的不同缔合速率缔合常数(kon)值在有和没有主动混合(仅扩散)的情况下针对不同的质量传输条件进行的,所述常数值表示抗体-抗原对的不同亲和力。在计算中检测抗体浓度限于<1μg/mL。这使得所述测定在实践中避免经历高背景非特异性吸附。每个反应器(例如,PCR管)的磁珠量保持在105个以上,以确保统计学上显著的数字计数。根据由抗体偶联试剂盒手册(目录号:14311D)提供的实验数据估计每个磁珠缀合的捕获抗体数量。
对于其中抗体具有非常弱的亲和力(kon=104,图5A)的情况,免疫复合物形成动力学受到抗原与捕获抗体分子之间的表面反应速率的限制。计算表明,混合驱动的质量传输增强和珠粒数量(相当于样品体积)都不会提高这种“反应限制”状态下的测定性能。尽管增加结合位点密度(Bd)或检测抗体浓度有助于增加测定信号,但大幅提高这两个参数是不切实际或成本高昂的。在珠粒表面积上,每个珠粒缀合的捕获抗体的平均数量几乎不变。同时,由于非特异性表面吸附,盲目增加检测抗体浓度会产生高水平的背景假阳性。
对于其中抗体对分析物具有非常强的亲和力的另一种极端情况(kon=107,图5D),免疫复合物形成动力学受到初始未结合抗原和检测抗体分子的质量扩散的限制。与孵育时间相比,质量传输条件、珠粒数量和反应体积大小是影响“扩散限制”状态下测定读数的更主要因素。例如,在小样品体积(20μL)中存在大量珠粒(106)的情况下,由于反应速率快且每个珠粒的靶分子数量少,显示反应在2分钟内迅速达到平衡状态。这正是数字免疫测定中希望避免的情况。在“扩散限制”状态下,随着时间的推移,在珠粒表面附近生长的耗尽区是限制靶分子从远场传输到捕获位点的主要因素。通过主动混合增强这些分子的质量传输将有助于减少耗尽区生长。
用于细胞因子检测的可商购获得的抗体通常具有落在上述两种极端情况下的那些值之间的亲和力值。基于这项研究,确定了制备用捕获抗体分子密集包被的珠粒、在相对较大的样品体积中使用少量这些珠粒、以及通过主动混合增强质量传输的策略将有助于实现超快PEdELISA测定但不牺牲其灵敏度。
实施例3
测定的分析验证和基准测试(Benchmarking)
为了通过实验表征PEdELISA测定的性能,选择了涉及细胞因子释放综合征(CRS)的进展的四种信号传导细胞因子生物标志物(IL-6;TNF-α;IL-2;和MCP-1),所述CRS是影响发病率和死亡率的CAR-T的重要并发症。为了检查不同水平的背景蛋白对与这些流体有关的数字免疫测定信号的影响,向四种不同类型的缓冲液中加标100pg/mL每种细胞因子:1xELISA稀释剂(1%BSA,0.05%Tween20)、10%、25%和50%胎牛血清(FBS)(图6A-图6D)。计算了信噪比(SNR),其定义为测量信号除以平均空白信号+3σ。一般来说,可能由于白蛋白的存在,观察到对血清培养基的更大表面封闭效应,这导致与ELISA缓冲液相比略微较低的加标信号和背景噪声。然而,不同培养基组之间的SNR值没有显著差异(P>0.1n=5-8,单因素方差分析,图6E)。
图7A-图7D示出了在25%胎牛血清(FBS)中的0.32pg/mL至5ng/mL范围内的四种细胞因子的标准曲线,其中步骤1孵育时间从15秒到300秒不等,而步骤2孵育时间固定为30秒。为了突破测量速度的极限,通过将所有三种试剂(检测抗体、抗生物素蛋白-HRP、抗原)与磁珠简单混合对测定进行了测试,并且在15秒(步骤1)和30秒(步骤2)孵育时间的情况下取得了成功(步骤1测定格式)。正如理论上预测的那样,数字读数(荧光激活的“开”珠粒相对于整体珠粒的分数)是高度时间依赖的,并且大体上与分析物浓度成线性比例。根据细胞因子种类的不同观察到信号输出的变化。这可能是由于不同细胞因子的抗体对亲和力不同。
值得注意的是,无论分析物类型如何,测定的线性度在三个数量级的浓度范围内得到证实,并且即使对于IL-6(CRS中的主要介体)的15秒超快PEdELISA测定也能很好地得以保持。因此,淬灭极度预平衡的反应不会损害测量分辨率,这表明PEdELISA将适用于实际临床诊断。
通过在15秒步骤1孵育时间(图7E)和300秒步骤1孵育时间(图7F)的情况下在常规3步夹心ELISA和PEdELISA之间比较加标FBS样品的测量结果,进一步验证了所述测定。对于15秒(300秒)测定,分析物浓度的真实(加标)值设置在40pg/mL(2pg/mL)至1000pg/mL之间。针对15秒(R2=0.92)和300秒(R2=0.96)测定两者,发现两种方法之间有很好的一致性。考虑到实验设置的本底噪声,理论上预测了使用所述模型的给定靶LOD值的最短孵育时间,并将其与实验数据进行比较(图7G)。在假设典型抗体亲和力范围为10-9-10-10M的情况下,在实验数据和理论曲线之间观察到了极好的匹配。此外,通过量化不同抗体对的交叉反应性来核实双重测定的特异性(图8)。四种细胞因子在滴定实验中累积的测定LOD和均方根方差系数(RMS CV%)在表3中总结。
表3. 15秒和5分钟PEdELISA的检测限(LOD)和标准均方根方差系数(RMS CV)。LOD由来自试剂空白的信号+3σ的浓度确定。
实施例4
脓毒症小鼠的纵向生物标志物谱测量
为了证明样品保留能力(5μL),将PEdELISA测定用于小鼠模型研究。现有ELISA测定无法连续监测活体小鼠的生物标志物谱,因为每个时间点需要约0.5mL的全血(用于重复测定),这超过了单只小鼠的可用量。结果,常规技术需要在每次测量时处死小鼠以收集足够量的血液。对于此测试,制备了CLP诱导的脓毒性休克的小鼠模型(反映多种微生物感染的更符合临床实际的模型),其中在所述小鼠的盲肠的总长度的50、75和100%处结扎(图9A)。然后,开发并验证了用于量化生物标志物瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)的PEdELISA测定版本(图9B)。在肽精氨酸脱亚胺酶(PAD)的催化下,CitH3最近被识别为响应于感染的中性粒细胞胞外诱捕网(NET)诱导免疫细胞死亡(NETosis)的早期步骤。在具有不同的CLP诱导脓毒性休克严重程度的四只小鼠中评价了其一生中CitH3的动态变化(图9C)。从0、1、5、10小时开始,每4-5小时通过尾静脉收集血液样品,直至动物死亡。为确保断尾不会影响疾病进展,每个时间点通过毛细管仅收集15μL的全血,并且按照相同的手术程序准备未进行CLP的假小鼠。处理血液样品以获得5-7μL血清,且接着随后通过PEdELISA进行量化。
对于100%CLP小鼠,在5小时时间点观察到CitH3显著增加(106.6pg/mL),并在12小时内发现小鼠死亡。对于75%CLP小鼠,与100%CLP小鼠相比,CitH3的增加相对延迟。但CitH3继续增加,并且在大约32小时,当75%CLP小鼠死亡时,达到峰值1149.2pg/mL。对于50%CLP小鼠,在前10小时内未观察到CitH3的显著增加,但接着CitH3在10与20小时之间开始增加,并在20-30小时达到其平台期(约300pg/mL)。50%CLP小鼠的身体状况在24-48小时恢复,并且CitH3水平在所述时段期间下降。然而,50%CLP小鼠的状况在70小时之后迅速恶化,并且在76小时发现小鼠死亡。对于假情况,CitH3保持在<21.5pg/mL的低水平,并且小鼠在整个实验期间保持存活。
实施例5
CAR-T细胞输注后CRS的近实时多重细胞因子监测
使用PEdELISA实时监测血液癌症患者的的IL-6、TNF-α、IL-2和MCP-1谱,按照预先批准的样品收集方案,所述患者在CAR-T细胞疗法之后表现出重度(患者A)、中度(患者B)和轻度(患者C)CRS症状。CRS是一种全身性炎症反应形式,伴随着由激活的白细胞释放到血流中的高水平炎症细胞因子。它可以迅速(即,在24-48小时内)从可控制的全身症状(1级)演变为更严重的形式(2-4级),为此快速和灵敏的血清细胞因子测量可以指导紧急干预。在此,PEdELISA允许根据图10A中所示的时间线对在ICU中抽取的血液样品进行实时细胞因子谱测量。一般来说,在输注之前五天开始每天抽血以供基线收集,直至患者出院。对于实时监测,首先在抽血45分钟内对样品进行处理以提取血清,然后在一小时内通过PEdELISA进行测试。这些数据通常在患者血液收集初始点后2-3小时内可供临床医生使用。沿着时间线标记三名患者的初始CRS发作和神经毒性发展。
为确保这些临床测量的最高准确度和灵敏度,在2步测定格式中,总孵育时间为300秒(步骤1)+30秒(步骤2)。首先通过2步PEdELISA分析具有未知分析物浓度的入库CAR-T患者血清样品(n=23)并通过ELISA进行验证(图10B)。这两种方法之间的数据显示出极好的线性相关性(R2=0.96),这证实了2步PEdELISA测定用于人生物标志物检测的准确度。然后,进行实时测量以捕获患者对免疫调节干预的复杂免疫反应,所述免疫反应表现为细胞因子谱的时程变化(图10C-图10E)。这些反应的动态行为因患者而异,并且治疗这些患者的CRS的决定仅基于不涉及任何血清细胞因子数据的临床标准(例如,CRS等级)做出。
对于肿瘤负荷高的患者A,初始CRS发作的时间短至13.5小时。MCP-1和IL-2水平迅速上升,并在CAR-T输注之后24小时内达到峰值(MCP-1 2947pg/mL;IL-2 39.72pg/mL),这与在第1天伴随发烧(39.3℃)的患者的2级CRS相关联(图10C)。在第一次托珠单抗施用(第1天)之后,瞬时观察到IL-6持续升高,从89.9pg/mL(第1天)到第2天的峰值水平1676pg/mL。对于患者B,也注意到了类似的趋势(图10D),患有1级CRS的患者B在第2天接受第一次给药,并在第3天检测到峰值(1546pg/mL)。患者A之后在第6-9天发展为3-4级危及生命的CRS,并且又被送进ICU。在此期间,IL-6水平接近4383pg/mL(第7天)和4189pg/mL(第8天)的极高水平,并且尽管事实上患者A被施用了多种免疫抑制剂,但MCP-1达到了其第二峰值2103pg/mL。有趣的是,在第二CRS峰值期间没有观察到TNF-α和IL-2的显著上升。所述患者在第11天被诊断患有3级CRES(CAR-T细胞相关脑病综合征)。对于患者B(图10D),在CAR-T细胞输注之后的前八天期间观察到所有四种细胞因子的一个峰值,这与此时段期间患者的临床症状(1-2级CRS)相关联。患者C直至CAR-T细胞输注之后6天才发展CRS,尽管在第1天观察到所有四种细胞因子的轻微升高(图10E)。然而,患者C从第8天开始发展出长期神经毒性,并从第9天至第33天使用类固醇。在此期间,所有四种细胞因子都保持在低水平。停止类固醇之后,患者C的IL-6和MCP-1水平从第35天至第50天出现回升,并且1级神经毒性复发。
针对三名CAR-T患者,将图10中的时间序列细胞因子数据进行排序并组合成非CRS组和CRS(1级或更高)组(图11)。IL-6和MCP-1均与CRS强相关(P<0.001)。数据还表明IL-2与CRS之间具有较低统计学显著性(P=0.0059)的类似相关性。然而,在非CRS组与CRS组之间未观察到TNF-α的显著统计学差异(P=0.142)。数据显示,在所有三名患者中,两组的TNF-α水平始终处于低水平。
实施例6
通过卷积神经网络处理的高度多重预平衡淬灭数字ELISA(PEdELISA)微阵列
现有的仅利用荧光染料编码磁珠的dELISA多重(4-6重)方法需要大量的珠粒和较大样品体积,受到严重的光学串扰的困扰,会牺牲灵敏度和准确度。此外,还缺乏高度准确且可靠的信号分析算法,所述算法可以在几分钟内处理数百万个微反应器的多色数字计数。下文描述的卷积神经网络(CNN)处理的PEdELISA平台通过扩展具有近实时测定周转时间的多重能力来解决这些挑战,这对于时间敏感的疾病诊断具有极大潜力,并有助于重症监护医生实施由实时生物标志物谱精确引导的及时的治疗干预。
PEdELISA被扩展为高度多重(24重,并且可能更多)微流体格式,如图12所示。PEdELISA芯片含有三层(图12A,从下到上):载玻片基板(1mm,光学透明);薄PDMS膜层(200-500μm),其中微孔(d=3.8μm)结构制造在表面上(软光刻);用于磁珠图案化或样品检测的顶部腔室层(3-5mm,可互换)。使用珠粒图案化层,将多种颜色的磁珠图案化(与不同捕获抗体缀合)成物理分离的微阵列,以产生等于N颜色×N阵列的高多重容量(例如,3颜色×8阵列=24重)。将图案化层剥离并附着至样品检测层(设计为垂直于图案化层),以用于蛋白质生物标志物检测。通过多通道移液器装载生物样品(例如,血清)。此外,PEdELISA系统还应用了单分子计数。如图12B所示设计了24重CAR-T细胞因子面板以用于如图12C-图12E所示的PEdELISA系统,所述系统由上述基于PDMS的微芯片、平行流体处理单元(14个样品/芯片)和双色荧光光学扫描单元构成。
与供临床转化的竞争方法相比,PEdELISA平台成本极低,且不牺牲性能(表4)。这种低成本的特征主要来自基于模制的芯片微制造。常规方法通常需要洁净室设施以使用例如光刻和反应性离子蚀刻直接在测定芯片上微制造所需的特征。因此,每个个别芯片可能非常昂贵,具有批次之间的差异,并且由于担心样品污染而不能重复使用。开发了夹具引导的较大PDMS薄膜转移技术(图13),所述技术导致微制造特征直接转移到玻璃基板(经过空气等离子体处理)上,而无需进入洁净室设施。制作硅模具,并使用所述模具通过PDMS模制和载玻片转移重复地制作所有微特征。此外,微流体设计允许消耗极少体积的试剂(对于24重细胞因子测定而言<5美元)。选择了具有成本效益的消费级设备诸如SONY全帧CMOS照相机,并且所述系统被设计为模块形式,以进一步降低总体成本并允许与见于典型临床实验室的标准落射荧光显微镜兼容。
表4.PEdELISA测定与竞争免疫测定诊断系统的成本估算
*总测定时间包括样品制备、分析物量化、数据采集和数据分析。
PEdELISA信号由新的基于MATLAB的双向CNN算法处理,所述算法使用5750个标记图像进行预训练以识别荧光“开”孔(红色通道,Qred)或珠粒(绿色通道,AF488)与缺陷和污染(图14)。在当前的PEdELISA检测中,收集了三种类型的原始图像:1.红色荧光通道(Qred)2.绿色荧光通道(AF488)3.明场通道。将前两个通道直接发送到双向CNN以对Qred+微孔、AF488+珠粒、图像缺陷和背景进行分类。然后将Qred+和AF488+靶标分割出来作为输出掩码,并去除缺陷。使用索贝尔边缘检测方法分析明场图像以确定整体珠粒填充率。图像后处理之后,所述代码将三个图像叠加起来,以确定内部有和没有AF488染色珠粒的Qred“开”微孔的数量。针对AF488染色(AF+Qred+%)和非彩色珠粒类型(AF-Qred+%)两者的酶活性Qred“开”微孔相对于珠粒填充微孔的分数种群与待确定的不同生物标志物浓度成正比。
所述网络的架构由10层组成,所述层包括带有三个线性修正单元(ReLU)层的三个2D卷积层(4-6个过滤器,3×3的内核)、一个2D最大池化层(步幅为2)、一个带有ReLU的转置卷积层、一个柔性最大值层以及一个像素分类层。为了加快训练过程,使用标记的32×32像素图像对网络进行预训练,然后使用经预训练的网络对256×256图像进行标记,以进行最终的网络构建。为了减轻每个微反应器之间的较大强度差异,使用相同的尺度来标记明亮和黯淡的孔或珠粒。由于在典型数字测定图像中大多数像素标签用于背景,因此使用类别权重是类别频率倒数的逆频率加权方法来减轻类别不平衡问题并增加给予代表性不足的类别的权重。与常规全局阈值法图像处理方法相比,本文所述的双向CNN网络显著提高了PEdELISA信号处理准确度,如图15所示。使用标准第6代i7处理器(或更高版本)处理含有43561个微反应器的6000×4000图像耗费不到10秒。
为了表征PEdELISA性能,从测定和信号处理方面确定多重串扰误差的可能性:光学串扰和抗体交叉反应性。为了检查开发的CNN网络的光学串扰抑制能力,制备了加标有浓度相差1000倍的两种不同细胞因子种类IL-1α(AF488编码)和IL-1β(非彩色编码)的血清样品。图16显示,CNN处理的1pg/mL IL-1α或β的原始信号即使在其他蛋白质达到1ng/mL时也不会受到干扰(双尾不等方差t检验,P>0.1)。通过在25%胎牛血清(FBS)中加标100pg/mL的每种个别细胞因子来检查测定的特异性,并且在开发的8重测定中未观察到显著的抗体交叉反应性(图17)。图18示出了在25%FBS中从0.16pg/mL到2.5ng/mL范围内的八种细胞因子在5分钟和2分钟测定孵育时间内获得的标准曲线。优化反应条件以匹配临床相关动态范围内的所有细胞因子,并且实现了近四个数量级的线性动态范围。对于所有8种细胞因子,5分钟测定时间的检测限低于1pg/mL,并且2分钟测定的检测限在1-10pg/mL之间。
实施例7
用于细胞因子分析的14重预平衡淬灭数字ELISA(PEdELISA)
用于14重分析的PEdELISA微阵列分析使用用基于聚二甲基硅氧烷(PDMS)的软光刻制造的微流体芯片。如上所述,芯片含有在玻璃基板上的平行样品检测通道(10-16),每个通道具有六边形生物传感图案阵列(图20)。六边形形状允许每个生物传感图案密集地堆积43,561个飞升大小的微孔,这些微孔通过10倍物镜适应全帧CMOS传感器的整个视野(图21)。
在测定之前,将用非荧光彩色(无彩色)和用Alexa 488(AF488)编码的磁珠(d=2.8μm)沉积到物理分离的微孔阵列中(图22)。根据珠粒各自的颜色和在芯片上的位置,珠粒与不同的捕获抗体缀合。在针对14重分析的设计中,每个检测通道中2种颜色和8个阵列生物传感图案的排列使PEdELISA微阵列芯片能够以其最大容量检测装载到检测通道中的每个样品的2×8=16个蛋白质种类(16重)(图27A)。与单一颜色编码方法相比,这种组合极大减少了信号读出过程期间潜在的光学串扰和荧光重叠。预沉积确保了靶向每个生物标志物的固定数量的珠粒,这允许针对每个生物标志物进行更准确的数字计数。它还消除了常规分区过程期间的珠粒损失,并在酶活性QuantaRedTM(Qred)发射珠粒(“开”珠粒或“Qred+”珠粒)的信号读数中实现了近100%的产率。微孔结构(直径:3.4μm且深度:3.6μm)被设计来产生足够的表面张力以将珠粒保持在微孔中。这将所诱捕的珠粒之间的物理串扰导致的错误信号保持在可忽略的水平(图23)。
用于评估物理串扰的珠粒冲刷测试。错误信号被认为是在制备PEdELISA芯片期间错位的珠粒造成的。如果一些靶向分析物A的珠粒被意外诱捕到生物传感图案的微孔阵列中以检测分析物B,则这些错位的珠粒会产生分析物B的假阳性或假阴性信号,从而搅乱了测定(珠粒之间的“物理串扰”)。先前的研究(Neelapu,S.S.等人,Nature ReviewsClinical Oncology 2018,15,47;Lee,D.W.,等人,Blood 2014,124,188;Kotch,C.,等人,Expert Rev Clin Immunol 2019,15,813,所有文献都通过引用并入本文)揭示:为PDMS微孔选择适当的设计允许表面张力牢固地保持被诱捕在其中的珠粒,即使当整个芯片在长时间的超声处理下被倒置时也是如此。在这些研究的指导下,微孔结构被设计为直径3.4μm且深度3.6μm,以产生足够的表面张力,从而将珠粒保持在微孔中(使用永磁体也可以促进珠粒的播种和保留)。
为了评估物理串扰的影响,运行了对照测试。测试首先将AF-488编码磁珠沉降到芯片的其中一个样品装载通道(AF-488珠粒通道)中,随后将非彩色编码磁珠沉降到它旁边的另一个通道(非彩色珠粒通道)中。然后将未诱捕的珠粒从这些通道中洗掉,将珠粒沉降层从多阵列生物传感器层剥离并替换为样品装载层,并且首先对AF-488珠粒通道、其次对非彩色通道施加40uL/分钟的洗涤缓冲液流速的剧烈冲刷持续15分钟。最后,在用油密封通道中的微孔之后,拍摄芯片的荧光显微镜图像并评价在冲刷过程之前和之后入侵非彩色珠粒通道的AF-488编码珠粒的数量。在160个独立的微孔位点中,在初始沉降在非彩色珠粒通道中的总珠粒中,观察到以平均珠粒错位百分比0.087%形式呈现的物理串扰,其中标准偏差为0.0012%(图23)。鉴于数字ELISA通常每个珠粒平均形成少于0.1个抗体-抗原-抗体免疫复合物,由于蛋白质的非特异性吸附,物理串扰产生的假阳性信号几乎比典型的阴性对照信号少一个数量级(平均每个珠粒0.0005-0.001个分子)。
高度多重的数字测定带来的独特挑战是对源自每个芯片约700万个微孔的荧光信号进行快速且准确的分析。此外,信号计数过程需要精确区分多色珠粒填充微孔和空微孔的图像,并在荧光强度变化较大、试剂处理不当导致偶发图像缺陷、和图像焦点偏移的情况下准确地识别信号。这些挑战使得使用阈值和分割(GTS)方案(图24A)的常规图像处理方法不准确,因此在处理数字测定图像时需要人工监督误差校正。
先前的研究表明,机器学习算法的使用将提供有希望的解决方案以显著提高数字测定图像处理的准确度。然而,这种方法仅适用于具有少量1080×1120像素的微反应器(几千个)的单色图像,不适用于高通量分析。
全局阈值和分割与卷积神经网络可视化
图24示出了PEdELISA图像处理中全局阈值和分割(GTS)方法与卷积神经网络(CNN)方法之间的并排比较。这两种方法都从预处理过程开始,所述预处理过程包括例如图像裁剪、对比度增强和噪声过滤。GTS方法涉及基于图像的灰度直方图找出和调整全局阈值(图24A,黑色虚线)。这种方法将显示高于阈值的荧光强度水平的微孔位点标记为阳性(“开”)像素。然后,它沿边缘应用2×2像素的图像腐蚀掩码,以去除强度高于阈值的随机出现的散粒噪声像素。如上所述,GTS方法的后处理过程包括图像膨胀和分割、“开”微孔/珠粒计数、误差校正和图像叠加。
然而,CNN方法并行运行两条信号识别路径,这些路径使用5,750个标记图像进行预训练以识别酶活性“开”微孔(红色通道,Qred)或珠粒(绿色通道,AF488)与缺陷和污染。因此,这种方法不需要预先确定GTS方法所需的强度阈值。CNN方法根据(1)红色荧光通道(Qred)、(2)绿色荧光通道(AF488)和(3)明场通道为每个具有43,561个微孔的生物传感图案收集三种类型的原始图像(4000×6000像素)。Qred和AF488通道图像首先被裁剪并预处理以进行噪声过滤和对比度增强,然后直接发送到双路径CNN以识别酶活性Qred荧光“开”(Qred+)微孔、AF488荧光发射(AF488+)珠粒、图像缺陷和背景图像特征。然后,Qred+和AF488+靶标被分割出来作为输出掩码,其中缺陷被去除。明场图像用于识别AF488+和非彩色珠粒两者,并使用索贝尔边缘检测方法进行分析以确定整体珠粒填充率。图像后处理之后,将三张图像叠加以确定Qred+微孔的数量和这些微孔内的珠粒颜色类型(AF488+或非彩色)。针对AF488+(AF+Qred+%)和非彩色珠粒类型(AF-Qred+%)确定Qred+微孔相对于总珠粒填充微孔的分数种群,并将其用于获得两种不同生物标志物的浓度。采用当前设计的PEdELISA微阵列芯片允许分析每个样品的多达16种不同的分析物,这是通过将基于CNN方法的成像处理应用于芯片上的8个物理上不同的生物传感图案进行的。
如上所述,为了应对这些挑战,开发了基于用于图像处理的卷积神经网络(CNN)可视化的新型双路径并行计算算法。基于CNN的分析程序(图20)包括多色荧光图像数据读入/预处理(图像裁剪、噪声过滤和对比度增强)、通过经预训练的双路径CNN进行微孔/珠粒图像分割、后处理和结果输出。关键部件双路径CNN被预训练以通过以下标记分类和分割图像像素:(I)荧光“开”(Qred通道)微孔、(II)Alexa488彩色编码珠粒(AF488通道)、(III)图像缺陷和(IV)背景。网络架构(图20)将用于类别分类的降采样过程与用于像素分割的升采样过程分离。降采样过程由3层组成,这些层包括带有线性修正单元(ReLU)的2个卷积层(4-6个过滤器,3×3的内核),以及一个介于之间的最大池化层(步幅为2)。升采样过程由带有ReLU的一个转置卷积层、一个柔性最大值层和一个像素分类层组成。为了加快训练过程,将图像用32×32像素划分并使用标记进行分类,然后使用经预训练的网络将图像像素大小扩展到256×256(图25)。
在来自不同微孔反应器中的珠粒的光信号之间发现了较大强度变化。因此,基于强度的微孔标记可导致识别错误,因为带有明亮珠粒的微孔被错误识别为比带有黯淡珠粒的微孔具有更大区域,带有更多像素。鉴于所有微孔都被光刻图案化成具有相同的大小,无论微孔的图像亮度如何,每个微孔都使用相同的预固定区域尺度(八边形,对于微孔、圆盘r=3像素,对于珠粒r=2像素)进行标记以实现正确的机器识别。在典型的数字测定图像中,大多数像素标记用于没有测定信息的背景(标记IV)。逆频率加权方法用于进一步提高分类准确度,从而给予由标记(I)、(II)和(III)识别的出现频率较低的类别更多的权重。
双路径卷积神经网络的训练细节。图25示出了双路径CNN算法的训练过程,这涉及数据集准备和2步神经网络训练。首先开发了使用3,000个代表性局部裁剪(32×32像素)图像的数据集训练的预阶段神经网络。对于这些图像中的每一个,通过阈值法和人工标记产生了仅显示标记信息的两种类型的图像(总共6,000),称为“掩码”(图25,已标记)。在路径1的预阶段掩码中,所有代表“开”(Qred+)微孔位点和其他位点(缺陷或背景)的靶像素分别标记为“1”和“0”。在路径2的预阶段掩码中,缺陷和其他位点分别标记为“1”和“0”。经预训练的网络能够以一定程度的准确度识别和分割经标记的对象(即,60-80%的“开”孔)。但他们仍然缺乏提取对象的更深入特征的准确度,所述特征诸如对象的形状和荧光强度变化,以及其他难以用小尺度图像识别的缺陷。
为了进一步提高准确度,构建了使用256×256大小的图像(每个网络大约200张图像)训练的三个第二阶段并行CNN网络来识别AF488+像素、Qred+像素和缺陷。被用于训练第二阶段网络的标记掩码由使用人工校正的预阶段神经网络产生(图25,ii)。考虑到光刻图案化微孔和珠粒的大小是预先确定的,第二阶段网络被训练来独立于这些对象的图像强度变化而准确地识别它们。此外,针对每个由光学串扰引起的误差源选择30个图像(图26A),仔细确定强度阈值以在这些图像的每一者的相邻微孔之间设置清晰的边界,并且产生无误差的第二阶段标记掩码。
至于缺陷识别网络的训练,首先增强图像亮度和对比度以识别强度更低的区域。然后对缺陷位置应用图像膨胀,以确保产生的掩码区域大到足以覆盖整个缺陷区域,如图25,iii所示。在此,仅缺陷位置被标记为“1”,而所有其他位置被标记为“0”。标记为“1”的区域最终从总分析区域中去除,以将其从荧光信号计数中消除。
神经网络含有5个类别:Qred+类、AF488+类、Qred缺陷类、Qred背景类和AF488背景类。在使用上述标记掩码训练神经网络之前,还对每个类别添加了权重信息,以进一步提高像素识别准确度。使用了逆频率加权方法,这给予出现频率较小的类别更多的权重。类别权重定义为
其中N图像总像素是256×256=65,536的总图像像素数,并且N类别像素是每个类别的像素数。这种类别加权策略被添加到神经网络训练过程中,因为Qred+或AF488+类别像素的数量显著小于其总背景像素的数量。
与先前报道的研究相比,大大减少了卷积层和过滤器的数量(网络深度)以进行高速处理。所述算法采用的图像处理所需的标记和特征比自动驱动等其他典型CNN应用所需的标记和特征要少得多。这里使用的算法的独有特征在于能够并行运行两个神经网络以实施两个检测路径:一个用于测定靶标(例如微孔、珠粒和荧光信号),而另一个用于缺陷。这使得成像处理能够在保持良好准确度的同时实现高速。结果,只耗费了约5秒(CPU:IntelCore i7-8700,GPU:NVIDIA Quadro P1000)来处理含有43561个微反应器的两张6000×4000像素图像的双色通道数据。
为了验证在这项工作中开发的双路径CNN方法的有效性,将其与基于全局阈值和分割(GTS)的标准方法的有效性进行了比较。图26A示出了给GTS方法的图像标记和信号计数造成误差的代表性双色通道图像。这些误差由CNN方法校正。例如,错误信号计数通常源于芯片缺陷或个别微孔反应器内由于局部油密封失效所致的标记试剂限制不佳。散焦会导致两个相邻的微孔彼此膨胀。来自“开”微孔的高亮Qred荧光可导致二次照明,照亮相邻的微孔。这会导致相邻微孔之间的“光学串扰”,所述串扰导致将二次照明的微孔错误计数为“开”位点。激发光的不均匀照明导致无法识别黯淡的AF-488编码珠粒(识别为非彩色珠粒)。
在CNN训练过程中,针对每个误差源收集大量图像,并且将其用于训练神经网络,以达到类似于用人眼进行人工计数的结果。应用以下等式根据与真实值的偏差评价误差(%):
其中NCNN或GTS是分别通过CNN或GTS方法计数的微孔或珠粒的数量,NTP是通过人工标记确定的真阳性的数量。基于
图像的灰度直方图调整全局阈值(图24)。人工标记过程包括使用GTS方法的预处理以及人工校正以获得真实值,如上所述,其通过常规夹心ELISA方法进行验证(图7F)。
在使用Qred通道计数酶活性微孔时,观察到与真实值的偏差百分比随计数的“开”(Qred+)微孔的数量而变化,所述数量与分析物浓度成正比。图26B-图26D中的每个数据点取自平均珠粒填充率为55.1%的、含有43561个微孔阵列的六边形生物传感图案(图20)。在这些数据中,Qred+微孔的数量范围为1至10000(图26B)。在较高的分析物浓度(NQred>100)下,两种方法都达到了相当高的准确度,与真实值的偏差为3.92%(CNN)和9.96%(GTS)。然而,在较低浓度(NQred<100)下,此偏差变得显著(CNN:5.14%GTS:71.6%)。GTS方案的较大误差归因于被荧光试剂污染的区域的错误计数和低荧光强度的Qred+微孔的错误计数。因此,双路径CNN极大地提高了PEdELISA图像处理的准确度,并且用CNN方法替换阈值方法消除了对进行人工监督以校正低浓度区域的显著误差的需求。
在使用AF-488通道对彩色编码磁珠进行计数时,发现偏差非常小(CNN:0.021%,GTS:0.161%)。AF488和Qred通道之间的少量光谱重叠以及在AF-488和非彩色编码珠粒之间有意产生的高图像对比度抑制了偏差(图26C)。在照明光强的空间分布不均匀和物镜在整个视场上的球面像差下的一些错误计数仍然是造成偏差的原因。CNN方法实现了近8倍的准确度提高。使用定制的索贝尔边缘检测算法计数具有明场图像的珠粒总数(无彩色和荧光彩色编码珠粒)产生0.256%的与真实值的平均偏差,如图26D所示。
为了核实在采用CNN方法的多重测定中抑制光学串扰的能力,制备了加标有浓度相差1000倍的两种不同的细胞因子种类IL-1α(AF488编码)和IL-1β(非彩色编码)的25%胎牛血清(FBS)样品。光学串扰可能会成为问题,特别是在多重分析中,其中一种生物标志物的量可能比同一样品中其他生物标志物的量高几个数量级。稍微错误的识别会给出比其真实生物标志物浓度值显著更高的值。图26E示出了常规GTS方法与CNN方法之间的比较。CNN方法极大减少了错误识别,并且经核实,1pg/mL的IL-1α或β即使在其他蛋白质达到1ng/mL时也不会干扰。此外,对1pg/mL的IL-1α和IL-1β进行了单重测量,这在消除光学串扰的同时给出了“真实”浓度值。使用CNN方法的单重和双重测量两者都产生了统计学上类似的结果(双尾不等方差t检验,IL-1αP=0.253;IL-1β=0.368),这证明了此方法即使在存在强光学串扰时的准确度。
使用具有8个物理分离的微阵列的2色编码(AF488,非彩色)磁珠,设计微流体芯片以同时检测14种细胞因子(最多16重)(参见图27中的芯片设计)。图28A示出了在25%FBS中针对0.16pg/mL至2.5ng/mL范围内的细胞因子从使用CNN图像处理的PEdELISA微阵列分析获得的标准曲线。在此,测量输出是酶活性(Qred+)珠粒数量相对于用于测定特定分析物的珠粒的总数量的分数。此分数与分析物浓度直接相关联。所述测定是针对处于瞬时夹心免疫复合物形成反应过程的早期状态的系统进行的,所述过程具有5分钟的孵育期,随后是1分钟的酶标记过程。优化了反应条件以匹配临床相关范围内的所有细胞因子生物标志物,并且总体上实现了三个数量级的线性动态范围。表5总结了针对每种细胞因子的测定的检测限(LOD)和定量限(LOQ)的值。抗体-抗原亲和力影响测定的LOD,并且其在检测的细胞因子种类之间有所不同。结果,即使捕获抗体缀合的珠粒是通过相同的方案制备,对这些细胞因子仍得到了不同的LOD值(无论何种分析物类型)。LOD值趋向于随着孵育期的增加而降低。尽管所述测定是在5分钟的短孵育期内进行,但在优化检测抗体混合比率和酶标记浓度之后,发现LOD仍低于5pg/mL(IL-1β达到最低,为0.188pg/mL)。
表5. 5分钟14重PEdELISA的检测限(LOD)、定量限(LOQ)和标准均方根系数方差(RMS CV)总结。
*LOQ为试剂空白信号+10σ。
进一步评估了25%FBS中14种细胞因子的抗体交叉反应性水平。图28B示出了加标有全部14种重组细胞因子、加标有其中之一或不加标的血清(即“全加标”、“单加标”和“无加标”样品)的测定结果。对于14种细胞因子,从无加标(阴性)样品中观察到的背景信号比从全加标样品中低超过100倍(IL-17A除外,由于其捕获抗体与检测抗体之间的结合更活跃,因此背景稍高)。来自全加标和单加标样品的相同浓度的14种细胞因子的信号水平变化可能源于这些细胞因子的不同水平的分析物-抗体亲和力。从图28A的曲线中,也观察到了细胞因子的LOD值的变化的类似趋势。来自14个单加标样品中的每一个的信号都对靶分析物表现出高水平的特异性。这核实了多重测定测量导致每种细胞因子分析物与不应与其偶联的其他捕获和检测抗体之间的交叉反应性可忽略不计。
最后,将14重PEdELISA微阵列分析应用于接受CAR-T细胞疗法的患者的纵向血清细胞因子测量。CAR-T疗法已证明对治疗难治性血液系统恶性肿瘤具有非凡的抗肿瘤效果。不幸的是,高达70%的接受CAR-T疗法的白血病和淋巴瘤患者会经历细胞因子释放综合征(CRS)。CRS是由炎症细胞因子(例如,IL-6、TNF-α等)的释放引起的潜在威胁生命的免疫激活病状。CRS最初会引起发烧和其他全身症状,这些症状可迅速(即,在24小时内)进展为需要重症监护的低血压和器官损伤。先前的研究表明,一组细胞因子的测量可以指示严重CRS的早期发作。因此,通过多重PEdELISA微阵列分析可以显著改善干预CRS的方式。
为了证明所述测定技术的临床实用性,对两名CAR-T患者进行了所述测定,其中一名经历了高达2级的CRS,而另一名在CAR-T输注后的前几天未经历CRS。整个14重测量实现了30分钟的总样品到答案时间,所述测量包括样品孵育(5分钟)、标记(1分钟)、洗涤/试剂限制(10分钟)和图像扫描/分析(14分钟)的过程。图29A显示,患者1在第4天出现CRS,持续直至第9天。与第2天和第9天的基线水平相比,在第0天发现所有测定的细胞因子显著升高。有趣的是,第0天的尖峰不是由于CAR-T细胞,因为血液样品是在CAR-T输注之前采集的。通常,CRS患者在其血液内表现出较高的IL-6浓度。然而,患者1表现出显著更高水平的TNF-α。这表明出现CRS的患者的致病性细胞因子谱的生物学异质性。对未出现CRS的患者也进行了类似的分析(图29B)。记录了此患者的IL-2增加和相对较高水平的IL-17A,而其他细胞因子在整个分析中没有显示出显著变化。据推测,患者体内正在发生正常的CAR-T细胞扩增。
高度多重数字免疫测定平台PEdELISA微阵列在微流体芯片上采用了空间光谱编码和基于机器学习的图像处理的独特组合。芯片上生物传感图案(每个都具有超过40,000个限制样品子体积的微孔反应器、荧光编码的分析物捕获珠粒和测定试剂)的位置配准使得能够以高样品处理效率、小试剂损失和可忽略的传感器串扰对10μL的血清进行14重细胞因子检测。14重PEdELISA微阵列分析的信号处理和分析采用基于并行计算CNN的机器学习算法。此算法以高通量(1分钟/分析物)实现了图像特征(例如微孔、珠粒、缺陷、背景)的自主分类和分割。值得注意的是,它的准确度是常规基于GTS的算法的8-10倍,而无需任何人工监督的误差校正。
微流体芯片制造和空间光谱编码。PEdELISA微阵列芯片制造的第一步涉及构建三个不同的PDMS层(图22)。第一PDMS层具有带有微孔(d=3.4μm)结构的六边形生物传感图案阵列(多阵列生物传感器层)。第二PDMS层具有2500μm宽、70μm高和65mm长的珠粒沉降流动通道(珠粒沉降层)。第三PDMS层具有用于检测装载样品中的分析物的4500um宽、90μm高和30mm长的通道(样品检测层)。首先通过标准光刻在单独的氧等离子体处理的硅晶片上构建三个PDMS层的SU-8模具。此过程涉及以不同的旋涂速度沉积负性光刻胶(SU-8 2005,SU-82050,MicroChem)层,以形成PDMS微结构图案的设计厚度。随后,以10:1的碱与固化剂比率制备PDMS的前体。为了构建多阵列生物传感器层,通过旋涂将薄PDMS前体膜(约300μm)沉积到微孔图案化的SU-8模具上,烘烤过夜(60℃),并通过氧等离子体处理附着至预先清洁的75×50mm玻璃基板。珠粒沉降层和样品检测层都是通过将PDMS前体倾倒在培养皿中的其他SU-8模具上、然后烘烤过夜(60℃)制成的。
第二步涉及珠粒在多阵列生物传感器层上每个六边形图案的微孔中的沉降。首先将珠粒沉降层对准并附着至玻璃基板上的多阵列生物传感器层。然后,在小瓶中制备7组25uL的浓度为1mg/m的AF488编码珠粒(抗细胞因子1)和非彩色编码珠粒(抗细胞因子2)的混合物,以用于14重检测。此后,将7种混合物中的每一者装载到珠粒沉降层中的微流体通道之一中(图22)。等待珠粒在微孔中沉降5分钟之后,用200uL PBS-T(0.1%Tween20)洗涤珠粒沉降通道以彻底去除未诱捕的珠粒。在此步骤,使用光学显微镜确保微孔以足够的比率(通常高于50%)填充珠粒。如果未被核实,则重新装载珠粒混合物溶液并再次洗涤。
第三步涉及将芯片与多阵列生物传感器层和样品检测层组装在一起。在通过使用移液器吸出洗涤缓冲液来干燥珠粒沉降通道之后,将珠粒沉降层从多阵列生物传感器层去除并替换为样品检测层。在此,将样品检测层对准并附着至多阵列生物传感器层,使得其通道定向成垂直于珠粒沉降层的通道的方向。然后向样品检测通道中缓慢装载Superblock缓冲液(0.05%Tween20)以钝化PDMS表面并在测定之前将整个芯片孵育至少1小时以避免非特异性蛋白质吸附。对样品检测层冲孔以形成其通道的入口和出口。芯片在测定使用之前用胶带清洁并覆盖。最后,将血清样品从样品检测通道的入口装载到其中(图22)。
实施例8
CAR-T细胞疗法相关CRS的多重细胞因子监测
使用PEdELISA监测血液癌症患者的细胞因子谱,按照预先批准的样品收集方案,所述患者在CAR-T细胞疗法之后表现出不同水平的CRS症状。CRS或细胞因子风暴经常伴随各种疾病,包括癌症免疫治疗、自身免疫性疾病中的巨噬细胞活化综合征、严重脓毒症或最近全球爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)。它可以迅速(即,在24-48小时内)从可控制的全身症状(1级)演变为更严重的形式(2-4级),为此快速和灵敏的血清细胞因子测量可以指导紧急干预。对于最严重的CRS患者之一(患者06),在新鲜抽取血液样品之后2小时内进行了近实时细胞因子谱分析,样品到答案时间为约30分钟(图10A)。为确保这些临床测量的最高准确度和灵敏度,在2步测定格式中,总孵育时间选择为300秒(步骤1)+60秒(步骤2)。
除了如上述已知分析物的加标测试之外,还使用PEdELISA和商业多重测定LEGENDplexTM(BioLegend)两者对来自3名不同患者的20个入库血清样品进行了测定,这些患者的IL-1β、IL-8、IL-10、IL-12、IL-17A和IFN-γ浓度未知。这两种测定方法的结果显示出强线性相关性(R2=0.915),这为多重细胞因子检测的2步PEdELISA测定提供了另外的验证(图31A)。
所研究的患者在CAR-T细胞输注之后表现出一系列CRS严重程度,包括高级(患者06)、中级(患者02、08和34)和低级(患者05、14、17和25),以及无CRS(患者12和33)(图31B-图31C)。患者在即将CAR-T细胞输注之前表现出异质细胞因子谱(图31D)。为了捕获患者对CAR-T细胞疗法和免疫调节干预的动态免疫反应,除周末(周六和周日)外,每天收集血液样品并处理以得到血清。图31E-图31N展示了患者纵向细胞因子谱的热图以及临床指标(CRS、CAR-T细胞相关脑病综合征(CRES)等级、发热、低血压和缺氧)和临床炎症标志物(C-反应蛋白(CRP)和铁蛋白)。每个标志物的浓度值通过Z分数进行标准化,并且将数据根据患者的CRS病状的严重程度进行分组。对于接受免疫调节治疗的患者,图31E-图31I在热图旁边提供了与治疗相关性更高的选定细胞因子定量值的纵向图。这些图示出了抗炎药对细胞因子谱的影响,所述抗炎药包括托珠单抗(抗IL-6R)和英夫利昔单抗(抗TNF-α)以及皮质类固醇(地塞米松)。这些患者的治疗选择完全基于临床标准(例如,CRS等级),而不是基于血清细胞因子数据。
对于最初具有较高疾病负担的患者06,CRS的最初发作时间短至13.5小时。几种生物标志物诸如MCP-1、IL-1β、IL-2和IL-8的水平在CAR-T输注之后24小时内迅速上升并达到峰值:MCP-1=2947pg/mL、IL-1β=75.3pg/mL、IL-2=39.72pg/mL和IL-8=415pg/mL,这与患者的2级CRS相关联,在第1天伴有发热(39.3℃)(图31E)。在第一次托珠单抗施用(第1天)之后,还瞬时观察到IL-6持续升高,从89.9pg/mL(第1天)到第2天的峰值水平1676pg/mL。患者06之后在第6-9天发展为3-4级危及生命的CRS,并且又被送进ICU。在此时段期间,IL-6和IFN-γ接近极高水平(IL-6=4383pg/mL IFN-γ=224.7pg/mL),如热图上的红色所示。尽管施用了多种免疫抑制剂,几种其他细胞因子诸如MCP-1、IL-1β、IL-8、IL-10和IL-17A也显示出第二峰值。有趣的是,在第二CRS峰值期间没有观察到TNF-α和IL-2的显著上升。在第11天,患者被诊断患有3级CRES,并使用了类固醇(地塞米松)治疗。总体而言,这些治疗之后细胞因子水平显著降低。
关于2级CRS患者,患者02的IL-6在托珠单抗施用之后显示出暂时的大幅增加(图31F)。1级CRS患者在第2天接受了第一剂量,并在第3天检测到IL-6的峰值(1546pg/mL)。同样,2级CRS患者08(图4H)在第8天接受了托珠单抗,并在第9天检测到IL-6的峰值(228.5pg/mL)。患者34未接受托珠单抗并且IL-6水平始终保持在300与500pg/mL之间的窄范围内,在此患者的整个CRS时段内没有动态变化。
患者05在CAR-T细胞输注之后未出现CRS,尽管在第0天和第1天观察到所有四种细胞因子的轻微升高(图31I)。然而,患者05从第8天开始出现长期神经毒性,并且从第9天至第33天使用了类固醇治疗。在此时段期间,所有十种细胞因子都保持在低水平。停用类固醇之后,患者05的IL-6和MCP-1水平从第35天至第50天上升,并且1级神经毒性复发。
图31J-图31N总结了出现轻度CRS(1级)或无CRS症状的患者的数据。总体而言,细胞因子水平相对于其他组的患者的水平较低。这些患者的热图大体上显示细胞因子水平的小幅波动,尽管在CAR-T细胞输注之后的前几天观察到一些小峰值。值得注意的是,患者33的热图的红色尺度代表TNF-α和IL-2水平的绝对值分别小至23.6pg/mL和13.3pg/mL。
图32示出了图31中的纵向细胞因子数据,所有所述数据针对十名CAR-T患者进行组合,分为非CRS组和CRS(1级或更高)组。两组之间可见统计学显著差异:IL-6(P<0.0001)、IL-8(P<0.05)、IL-10(P<0.01)、MCP-1(P<0.001)、IFN-γ(P<0.01)和CRP(P<0.001),包括CRS患者使用类固醇或其他免疫抑制剂治疗时的数据。还分析了接受托珠单抗治疗的三名患者的IL-6数据(图32M)。“使用托珠单抗”表示托珠单抗施用之后0-3天,而“托珠单抗之后”表示托珠单抗施用之后>3天。用托珠单抗治疗之后不久观察到IL-6显著升高(P<0.01)。
每个生物标志物对CRS的时间演变的响应性在图31E中描绘。图33示出了患者06的生物标志物浓度变化的时间速率(Δc/Δt)、CRS分数变化的时间速率(ΔCRS/Δt)以及CRS分数(4级CRS)的纵向变化。对于图32中在CRS时显示显著升高的细胞因子(IL-6、MCP-1、IFN-γ、IL-10和IL-8),它们的Δc/Δt时间图遵循与ΔCRS/Δt时间图类似的趋势。此外,MCP-1、IFN-γ、IL-8和IL-10的Δc/Δt图的峰值与ΔCRS/Δt图中的峰值同步出现。值得注意的是,由IFN-γ的Δc/Δt图中的第二大峰值代表的IFN-γ的急剧增加伴随此患者的危及生命的并发症。另一方面,当前临床炎症替代标志物CRP和铁蛋白的Δc/Δt图未产生峰值或响应ΔCRS/Δt峰值的出现产生具有时间(约1天)延迟的峰值(图33G-图33H)。ΔCRS/Δt图中的峰值总是先于CRS病状的显著恶化,表示为CRS分数的增加。
无论快照采集时间如何,PEdELISA的2步瞬态测定格式都可以在分析物浓度与测定读数之间保持线性关系。此外,所述模型很好地预测了所需检测限的最短所需孵育时间,这指导了数字测定设计。对于CRS的主要介体IL-6,整个测定孵育时间可短至15秒,LOD为25.9pg/mL,同时保持高达10ng/mL的4级动态范围。PEdELISA可以以主要受血液采样频率限制的高时间分辨率连续提供从人类患者新鲜收集的血液样品的实时数据(在大多数研究过程中<24小时)。
应理解先前详细描述和随附实施例仅是说明性的,并且不应视为对本公开的范围的限制,所述范围仅由随附权利要求和它们的等效物限定。
对公开的实施方案的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的,并且可以在不背离其精神和范围的情况下进行。
Claims (56)
1.一种用于检测样品中分子的方法,其包括:
使样品与对所述分子特异的捕获剂和检测剂接触;
将所述样品用所述捕获剂和检测剂孵育以形成捕获剂-分子-检测剂复合物,其中所述孵育的时间小于形成所述复合物达到平衡条件所需的时间;以及
检测所述分子。
2.如权利要求1所述的方法,其还包括以下步骤:将所述捕获剂和所述捕获剂-分子-检测剂复合物与剩余的样品和未结合的检测剂分离。
3.如权利要求2所述的方法,其还包括以下步骤:将每个捕获剂和捕获剂-分子-检测剂复合物分离到固体支持物内的个别位置中。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述检测包括确定所述个别位置中的每一者内是否存在所述捕获剂和检测剂。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法,其中所述分子是多肽、多糖、多核苷酸、脂质、代谢物、药物或其组合。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法,其中所述分子是生物标志物。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法,其中所述捕获剂包含粒子,所述粒子包含被配置为结合所述分子的第一探针,并且所述检测剂包含被配置为结合所述分子的第二探针。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述粒子是磁珠。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述磁珠是荧光磁珠。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法,其中确定所述捕获剂是否存在包括检测所述磁珠。
11.如权利要求7-10中任一项所述的方法,其中所述第一探针和所述第二探针被配置为结合所述分子内的不同位置。
12.如权利要求7-11中任一项所述的方法,其中所述第一探针和所述第二探针独立地选自蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、小分子和配体。
13.如权利要求7-12中任一项所述的方法,其中所述第一探针是抗体。
14.如权利要求7-13中任一项所述的方法,其中所述第二探针是抗体。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法,其中所述孵育介于15秒与45分钟之间。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法,其中所述孵育介于15秒与600秒之间。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法,其中所述孵育介于15秒与300秒之间。
18.如权利要求3-17中任一项所述的方法,其中所述固体支持物是微板或微流体装置。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法,其中所述检测剂还包含选自由以下组成的组的检测部分:染料、放射性标记、酶和酶底物。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述检测部分是酶。
21.如权利要求19或20所述的方法,其中所述酶是β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法,其中所述方法还包括:
添加标记剂到所述分离的捕获剂和所述捕获剂-分子-检测剂复合物中;其中所述标记剂与所述检测部分反应以产生反应产物,
其中确定所述检测剂是否存在包括测量所述反应产物。
23.如权利要求19所述的方法,其中确定所述检测剂是否存在包括测量所述检测部分。
24.如权利要求4-23中任一项所述的方法,其还包括确定包含所述捕获剂和所述检测剂两者的位置相对于仅包含所述捕获剂的位置的分数。
25.如权利要求24所述的方法,其还包括基于包含所述捕获剂和所述检测剂两者的位置相对于仅包含所述捕获剂的位置的分数来量化所述分子的浓度。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法,其中用多对捕获剂和检测剂检测两种或更多种分子,每对捕获剂和检测剂被配置为唯一地结合所述两种或更多种分子中的一者。
27.如权利要求1-26中任一项所述的方法,其中所述样品是生物样品。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法,其中所述样品具有小于100uL的体积。
29.如权利要求1-28中任一项所述的方法,其中所述样品具有1与25uL之间的体积。
30.一种用于检测样品中分子的系统,其包括以下中的一者或多者或每一者:
捕获剂,其包含用第一探针包被的粒子,所述第一探针被配置为结合所述分子;
检测剂,其包含被配置为结合所述分子的第二探针;
孵育箱,其被配置为将样品用所述捕获剂和检测剂孵育以形成捕获剂-分子-检测剂复合物,持续时间小于在所述捕获剂、所述检测剂与所述分子之间形成复合物达到平衡条件所需的时间;
固体支持物;
检测器;
软件,其被配置为根据所述检测器的输出确定所述捕获剂和所述检测剂是否存在;以及
样品。
31.如权利要求30所述的系统,其中所述粒子是磁珠。
32.如权利要求31所述的系统,其中所述磁珠是荧光磁珠。
33.如权利要求30-32中任一项所述的系统,其中所述检测剂还包含选自由以下组成的组的检测部分:染料、放射性标记、酶和酶底物。
34.如权利要求30-33中任一项所述的系统,其还包括标记剂。
35.如权利要求30-34中任一项所述的系统,其中所述固体支持物是微板或微流体装置。
36.如权利要求30-35中任一项所述的系统,其中所述检测器包括光学显微镜、荧光显微镜、荧光计、分光光度计、照相机或其组合。
37.如权利要求30-36中任一项所述的系统,其还包括至少一对另外的捕获剂和检测剂。
38.一种反应混合物,其包含:
包含分子的样品的停止孵育混合物;
捕获剂;
检测剂;
以及多个捕获剂-分子-检测剂复合物,
其中所述停止混合物在小于形成所述捕获剂-分子-检测剂复合物达到平衡条件所需的时间的时间停止。
39.如权利要求38所述的反应混合物,其中所述样品是生物样品。
40.如权利要求38或权利要求39所述的反应混合物,其中所述捕获剂包含粒子,所述粒子包含被配置为结合所述分子的第一探针。
41.如权利要求40所述的反应混合物,其中所述粒子是磁珠。
42.如权利要求41所述的反应混合物,其中所述磁珠是荧光磁珠。
43.如权利要求40-42中任一项所述的反应混合物,其中所述第一探针选自由以下组成的组:蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、小分子、配体及其任何组合。
44.如权利要求38-43中任一项所述的反应混合物,其中所述检测剂包含被配置为结合所述分子的第二探针。
45.如权利要求44所述的反应混合物,其中所述第二探针选自由以下组成的组:蛋白质、肽、核酸、碳水化合物、小分子、配体及其任何组合。
46.一种用于空间光谱编码的装置,其包括:
固体支持物,其包括被配置为分离感兴趣的分子的个别位置;
样品图案化部件;以及
样品检测部件。
47.如权利要求46所述的装置,其中所述样品图案化部件和所述样品检测部件各自包括多个平行流体处理通道。
48.如权利要求47所述的装置,其中每个流体处理通道独立于相邻的流体处理通道。
49.如权利要求47或48所述的装置,其中每个流体处理通道被配置为接收不同的流体样品。
50.如权利要求47-49中任一项所述的装置,其中所述流体处理通道中的每一者都包括单独的入口和出口。
51.如权利要求47-50中任一项所述的装置,其中每个流体处理通道与所述固体支持物中的所述个别位置的一部分流体连通。
52.如权利要求47-51中任一项所述的装置,其中所述样品图案化部件的平行流体处理通道垂直于所述样品检测部件的平行流体处理通道。
53.如权利要求47-52中任一项所述的装置,其中所述样品图案化部件和样品检测部件可互换地附着至所述固体支持物。
54.一种用于空间光谱编码的系统,其包括
如权利要求46-53中任一项所述的装置;以及
检测器;以及
软件,其被配置为确定所述捕获剂是否存在并在空间上识别所述固体支持物中的所述个别位置。
55.如权利要求54所述的系统,其还包括捕获剂和检测剂。
56.一种对来自至少一个样品的多个感兴趣的分子进行空间光谱编码的方法:
提供用于空间光谱编码的装置,所述装置包括:
包括空间上可识别的个别位置的固体支持物;
样品图案化部件;以及
样品检测部件,
其中所述样品图案化部件和所述样品检测部件各自包括多个平行流体处理通道;
将捕获剂池装载到所述样品图案化部件的每个流体处理通道中,其中每个捕获剂池被分离到所述固体支持物中的所述个别位置的一部分中,并且来自所述捕获剂池的每个捕获剂被分离在一个个别位置中;
使每个样品与每个捕获剂接触,包括将每个样品装载到所述样品检测部件的个别流体处理通道中,其中每个样品被分离到所述固体支持物的所述个别位置的一部分中;
将每个样品用所述捕获剂孵育以形成捕获剂-分子复合物;
使所述捕获剂-分子复合物与检测剂接触以形成捕获剂-分子-检测剂复合物;
用检测器检测每个位置处是否存在捕获剂和检测剂;以及
使用被配置为在空间上识别所述固体支持物中的所述个别位置的软件将所述检测器的输出与所述多个感兴趣的分子中的至少一个是否存在相关联。
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