CN114022465B

CN114022465B - 基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法及其试剂盒

Info

Publication number: CN114022465B
Application number: CN202111330295.5A
Authority: CN
Inventors: 张佳; 任立辉; 朱鹏飞; 徐腾; 张磊; 陈荣泽; 马波; 徐健
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2024-03-08
Anticipated expiration: 2041-11-11
Also published as: CN114022465A

Abstract

本发明公开了单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法及其试剂盒。该测量方法包括(1)将样品稀释10‑100倍获得稀释后的样品；(2)将稀释后的样品接种至含100％重水的培养基孵育4小时后回收并稀释菌体；(3)使用单细胞拉曼光谱仪采集稀释后菌体的样方区域的图像，和单细胞拉曼光谱；(4)使用全卷积神经网络对样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像，对掩膜图像进行连通区域分析获得样品总菌数量，根据对单细胞拉曼光谱的重水峰分析获得样品活菌数量；(5)根据样品总菌数量和样品活菌数量获得样品活菌比例。该测量方法耗时短，误差小，操作方便。

Description

基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法及其试剂盒。

背景技术

益生菌行业公认的益生菌定义，是2001年联合国粮食及农业组织/世界卫生组织联合工作组提出的：益生菌是指当摄入足够数量时，会对宿主产生健康益处的活性微生物。因此，根据定义，“活性”是益生菌的一个重要特性。我国2005年发布的《益生菌类保健食品申报与审评规定(试行)》中第十二条也明确规定了，活菌类益生菌保健食品在其保质期内活菌数目不得少于10⁶CFU/mL(g)。因此，准确测定益生菌产品中的活菌数量，对生产商和消费者，以及监管部门来说，都意义重大。

目前，我国益生菌行业主要依据《食品安全国家标准-食品微生物学检验-乳酸菌检验GB4789.35-2016》对活菌数进行检测。该标准采用了培养法来检测食品中的活菌数。该技术方案适用于含活性乳酸菌的食品中乳酸菌(主要为乳杆菌属、双歧杆菌属和嗜热链球菌属)的鉴定、计数。但此方案耗时数天，且无法准确鉴定至物种甚至亚种，无法大规模推广。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种益生菌活菌测量方法。

本发明提供了基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法，包括

(1)将样品稀释10-100倍获得稀释后的样品；

(2)将所述稀释后的样品接种至含100％重水的培养基孵育4小时后回收并稀释菌体，可根据菌体实际情况选择合适的稀释倍数以使菌体均匀分散，例如按1∶1稀释；

(3)使用单细胞拉曼光谱仪采集稀释后菌体的样方区域的图像，和单细胞拉曼光谱；

(4)使用全卷积神经网络对所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像，再对所述掩膜图像进行连通区域分析获得所述样方区域的图像的连通区域，再对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数，根据所述重心的数量获得样品总菌数量，

根据对所述单细胞拉曼光谱的重水峰分析，获得含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数，再根据所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数获得样品活菌数量；

(5)根据所述样品总菌数量和所述样品活菌数量获得样品活菌比例。

可选地，根据上述的测量方法，所述使用全卷积神经网络对所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像包括使用全卷积网络对训练数据集进行训练获得h5模型；再使用全卷积神经网络和所述h5模型对样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像。训练数据集包括细菌原图像(来源于本发明实验室的单细胞拉曼光谱仪采集获得)和使用labelme标注细菌后产生的掩膜图像。

可选地，根据上述的测量方法，所述根据所述重心的数量获得样品总菌数量为根据如下公式计算：

N＝C×n×d

N为样品总菌数量；C为所述重心的数量；n为终稀释倍数样品体积/样方中样品体积；d为样品稀释倍数。

可选地，根据上述的测量方法，所述根据所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数获得样品活菌数量为根据如下公式计算：

N1＝C1×n1×d1

N1为样品活菌数量；C1为所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数；n1为终稀释倍数样品体积/样方中样品体积；d1为样品稀释倍数。

可选地，根据上述的测量方法，所述益生菌为植物乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌。

可选地，根据上述的测量方法，步骤(2)为将稀释后的样品接种至含100％重水的MRS液体培养基，36℃±1℃厌氧孵育4h后回收并稀释菌体。

可选地，根据上述的测量方法，所述益生菌包括植物乳杆菌，为将样品稀释100倍获得稀释后的样品；所述益生菌包括嗜酸乳杆菌，样品稀释50倍获得稀释后的样品。

本发明还提供了用于益生菌活菌测量的试剂盒，包括含100％重水的培养基、阵列拉曼检测基片和样品活菌计数系统。

本发明还提供了样品活菌计数系统，包括

接收模块，被配置为接收采用单细胞拉曼光谱仪采集的样品的样方区域的图像和单细胞拉曼光谱；

分割模块，被配置为使用全卷积神经网络对所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像；

连通区域分析模块，被配置为对所述掩膜图像进行连通区域分析获得所述样方区域的图像的连通区域；

重心提取模块，被配置为对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数；

重水峰分析模块，被配置为根据对所述单细胞拉曼光谱的重水峰进行分析获得含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数；

计算模块，被配置为根据所述重心的数量获得样品总菌数量，根据所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数获得样品活菌数量，根据所述样品总菌数量和所述样品活菌数量获得样品活菌比例。

本发明还提供了一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现样品活菌计数方法，所述方法包括如下步骤：

(30)接收采用单细胞拉曼光谱仪采集的样品的样方区域的图像和单细胞拉曼光谱；

(41)使用全卷积神经网络对所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像；

(42)对所述掩膜图像进行连通区域分析获得所述样方区域的图像的连通区域；

(43)对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数；

(44)根据所述重心的数量获得样品总菌数量；

(51)通过对所述单细胞拉曼光谱的重水峰分析获得含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数；

(52)通过所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数获得样品活菌数量；

(61)根据所述样品总菌数量和所述样品活菌数量获得样品活菌比例。

本发明还提供了一种计算机处理设备，包括处理器及上述的计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序。

由于连通区域分析是对二值化图像进行处理，因此对前景图像和背景图像的像素差值要求较高，为了降低前景图像和背景图像像素值差距较小带来的计数误差，本发明提供的测量方法先使用全卷积神经网络对细菌图像进行语义分割获得图像的掩膜图像，再对掩膜图像进行连通区域分析。连通区域一般是指图像中具有相同像素值且位置相邻的像素点组成的图像区域。获得图像的连通区域后，对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数，从而完成细菌计数工作。

本发明提供的测量方法通过全卷积网络产生了掩膜图像，再对掩膜图像进行计数，避免了图像模糊造成的计数误差，采用重水标记拉曼技术检测活菌数量，进而获得样品活菌比例，耗时短，误差小，操作方便。

附图说明

图1为实施例110006R嗜酸乳杆菌和10024R植物乳杆菌分别稀释不同浓度后的图片采集图。

图2为实施例2重水标记的10024R植物乳杆菌的拉曼光谱。

图3为实施例3重水标记的10024R植物乳杆菌的拉曼光谱。

图4为实施例410006R嗜酸乳杆菌和10024R植物乳杆菌利用拉曼的自动化计数结果。

图5为实施例6检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

嗜酸乳杆菌10006R(CICC 6074)、植物乳杆菌10024R(CICC 6009)来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

MRS液体培养基的具体成分和制备方法如下(％为质量百分含量)：

蛋白胨1％

牛肉粉0.5％

酵母粉0.4％

葡萄糖2％

吐温800.1％

K2HPO4·7H2O 0.2％

醋酸钠·3H2O 0.5％

柠檬酸三铵0.2％

MgSO4·7H2O 0.02％

MnSO4·4H2O 0.005％

琼脂粉1.5％

将上述成分按比例加入到蒸馏水中溶解后，121℃高压灭菌15min。

含100％(体积百分比)重水的MRS液体培养基是将上述MRS液体培养基成分按比例加入到重水中溶解后，用0.22um滤膜过滤除菌，避光4℃保存。

含50％(体积百分比)重水的MRS液体培养基是将上述MRS液体培养基成分按比例加入到重水中溶解后，使重水终浓度为50％，用0.22um滤膜过滤除菌，避光4℃保存。

含100％(体积百分比)重水的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基具体制备方法如下：

莫匹罗星锂盐储备液的制备：称取50mg莫匹罗星锂盐加入到50mL蒸馏水中，用0.22um滤膜过滤除菌。

半胱氨酸盐酸盐储备液的制各：称取250mg半胱氨酸盐酸盐加入到50mL蒸馏水中，用0.22um滤膜过滤除菌。

将过滤除菌后的莫匹罗星锂盐储备液及半胱氨酸盐酸盐储备液制备加入到含100％重水的MRS液体培养基中，使培养基中莫匹罗星锂盐的浓度为50ug/mL，半胱氨酸盐酸盐的浓度为500ug/m[，即为含100％重水的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基。

含100％(体积百分比)重水的MC液体培养基的具体成分和制各方法如下(％为(w/v)质量体积比)：

大豆蛋白胨0.5％

牛肉粉0.3％

酵母粉0.3％

葡萄糖2％

乳糖2％

碳酸钙1％

琼脂1.5％

1％中性红溶液0.5％

将上述成分按比例加入到重水中溶解后，用0.22um滤膜过滤除菌，避光4℃保存。

实施例1、益生菌株在稀释不同浓度后的拉曼图片采集

该实施例用于寻找10006R嗜酸乳杆菌和10024R植物乳杆菌两株菌株的最佳稀释浓度，使其在拉曼视野下可以直接完成自动化计数。

具体实验方法如下：

1.菌株的活化：分别挑取10006R嗜酸乳杆菌和10024R植物乳杆菌两株菌株的单克隆，接种于5ml MRS液体培养基，37℃厌氧培养15h。

2.回收培养的菌株，并水洗3次。

3.将回收的10006R嗜酸乳杆菌菌株和10024R植物乳杆菌菌株采用超纯水重悬后检测OD₆₀₀分别为5.0和7.8，分别用超纯水稀释0倍、10倍、50倍、100倍，并分别完成在50倍镜和100倍镜下的视野采集，获得照片。

4.步骤3拍照所获得的照片如图1所示，10006R嗜酸乳杆菌稀释50倍后，与稀释0倍和10倍相比，细胞重叠数目少，背景清晰，且细胞数目在0-300之间，便于计数，在100倍镜下完成的图片采集用于拉曼自动化计数效果最佳；10024R植物乳杆菌稀释100倍后，与稀释0倍、10倍和50倍相比，细胞重叠数目少，背景清晰，且细胞数目在0-300之间，便于计数，在100倍镜下完成的图片采集用于拉曼自动化计数效果最佳。这两个数据可以用于后续的实验依据。

实施例2、不同重水浓度孵育益生菌株的拉曼光谱采集

该实施例以植物乳杆菌10024R菌株为例，分别用50％和100％重水MRS的进行厌氧培养20h，通过采集拉曼光谱的信号，根据拉曼图谱的质量以及重水峰的强度选择最佳重水浓度。

1.菌株的活化：植物乳杆菌10024R菌株的单克隆，接种于5ml MRS液体培养基，37℃厌氧培养15h。

2.检测过夜培养的植物乳杆菌10024R的OD₆₀₀值，分别取66ul菌液离心收集菌体(OD₆₀₀＝0.5)，分别用含1ml 50％和100％重水的MRS液体培养基重悬后，分别37℃厌氧50％和100％重水MRS孵育20h。

3.将50％和100％重水MRS重水孵育20h的菌液分别取1mL离心收集菌体，用超纯水清洗3次。

4.将清洗后的菌体依次滴在氟化钙片(0.5uL)风干后，于CAST-R拉曼仪器100倍镜下，100％激光功率，曝光时间为3s，采集拉曼图谱(图2)。结果显示100％重水浓度的拉曼图谱信噪比以及重水峰的强度均优于50％重水浓度的拉曼图谱，故选择基于100％重水浓度的培养基进行孵育。

实施例3、益生菌株重水孵育不同时间后的拉曼光谱采集

该实施例以10024R植物乳杆菌菌株为例，通过不同时间的重水标记，使其完成拉曼光谱的信号采集。

1.菌株的活化：10024R植物乳杆菌菌株的单克隆，接种于5ml MRS液体培养基，37℃厌氧培养15h。

2.检测过夜培养的10024R植物乳杆菌的OD₆₀₀值，并取337ul菌液离心收集菌体(OD₆₀₀＝0.5)，用含100％重水的MRS液体培养基重悬后，分别37℃厌氧重水孵育2h、4h、20h。

3.将重水孵育2h、4h、20h的菌液分别取1mL离心收集菌体，用超纯水清洗3次。

4.将清洗后的菌体依次滴在氟化钙片(0.5uL)风干后，于CAST-R拉曼仪器100倍镜下，100％激光功率，曝光时间为3s，采集50-100条拉曼图谱(图3)。检测结果如图3所示，与重水孵育2h、20h检测的重水峰相比，重水孵育4h检测的拉曼光谱峰值明显，因此10024R植物乳杆菌重水孵育4h的时间点为最佳时间点，可作为后续实验重水孵育的依据。

实施例4、益生菌完成自动化计数

该实施例用于寻找10006R嗜酸乳杆菌和10024R植物乳杆菌两株菌株在最佳稀释浓度下，如何在100倍镜下完成自动化计数。

1.对待检益生菌样品，取0.1mL实施例1中步骤3稀释50倍的10006R嗜酸乳杆菌和0.1mL实施例1中步骤4稀释100倍的10024R植物乳杆菌分别加入至0.9mL含100％重水的莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐改良MRS液体培养基，36℃±1℃厌氧孵育4h。

2.回收菌体，5000rpm离心清洗2min，使用超纯水清洗三次，使用1mL超纯水重悬获得准备好的样品。

3.分别将上述准备好的样品装载至阵列拉曼检测基片。

4.将步骤3装载好的阵列拉曼检测基片装载至单细胞拉曼光谱仪，在视野下随机采集3个样方区域的图像。

5.使用全卷积神经网络对样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像。

6.对掩膜图像进行连通区域分析获得样方区域的图像的连通区域。连通区域一般是指图像中具有相同像素值且位置相邻的像素点组成的图像区域。

7.获得样方区域的图像的连通区域后，对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数，重心的数量即为样方区域中细菌的数量，从而完成样方区域的细菌计数(图4)。

样方区域的细菌自动化计数结果如图4所示，10006R嗜酸乳杆菌稀释50倍后，在100倍镜下利用拉曼自动化计数结果为48，实际数值是49；10024R植物乳杆菌稀释100倍后，在100倍镜下利用拉曼自动化计数结果为49，实际数值是51。由结果可以看出，计数结果比较准确，可以实现基于单细胞拉曼光谱的益生菌自动化计数。

实施例5、基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法的建立

一、样品匀液制备

样品用生理盐水1∶100稀释后，取1ml 5000rpm，2min离心取沉淀。。

二、培养

沉淀用1mL含100％重水的MRS液体培养基重悬，36℃±1℃厌氧孵育4h；厌氧孵育4h后5000rpm离心清洗2min，使用超纯水清洗三次，使用1mL超纯水重悬，获得嗜酸乳杆菌待检样品。

沉淀用1mL含100％重水的MRS液体培养基重悬，36℃±1℃厌氧孵育4h；厌氧孵育4h后5000rpm离心清洗2min，使用超纯水清洗三次，使用1mL超纯水重悬，获得植物乳杆菌待检样品。

三、检测总菌和活菌数量

1.采集信息

1.1分别将上述制备的待检样品装载至阵列拉曼检测基片。

1.2将步骤1.1装载好的阵列拉曼检测基片装载至单细胞拉曼光谱仪，在视野下随机采集至少3个样方区域的图像和单细胞拉曼光谱。

2.检测待测样品总菌数量(以下内容可在PyCharm等编程软件中完成)

2.1先使用全卷积神经网络对训练数据集(训练数据集由细菌原图像和使用labelme标注细菌后产生的掩膜图像组成)进行训练获得h5模型(在全卷积神经网络第一次正向传播时会通过对像素点的计算获得初始权重，再通过训练对权重进行微调提高系统准确率，降低损失。本发明中，通过设置epoch的方式来控制训练时长，通常epoch会设置在30到50之间。在这个过程中，会生成一个用于存储权重、函数名称等信息的h5文件，即h5模型)，再使用全卷积神经网络对已训练好的h5模型进行测试，测试模型的准确度，判断其是否可以应用于实际工作中。使用全卷积神经网络和已训练好的h5模型对样方区域图像进行语义分割获得掩膜图像。在图像训练和测试过程中需要对感受野进行相同设置，感受野大小由细菌大小决定，一般比细菌直径(或对角线)大1到5个像素点。

2.2对掩膜图像进行连通区域分析获得样方区域图像的连通区域，通过对连通区域面积进行设置(设置的面积大小由细菌图像大小的先验信息决定)，这样做既可以把分割出来的杂质筛选出去，又可以防止由于多个细菌距离较近导致计数时记作一个而产生计数误差。连通区域一般是指图像中具有相同像素值且位置相邻的像素点组成的图像区域。

2.3对面积限制后的各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数，重心的数量即为样方区域中细菌的数量，从而完成样方区域的细菌计数。

3.活菌检测

通过对所述单细胞拉曼光谱的重水峰进行分析，获得含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数。所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数即为所述样方区域中的活菌数量。

4.根据所述样品总菌数量和所述样品活菌数量获得样品活菌比例。

所述样品总菌数量(N)根据如下公式计算：

N＝C×n×d

N是样品中总菌数；

C样方区域中的细菌数量之和；

n为终稀释倍数样品体积/样方中样品体积；

d为样品稀释倍数。

所述样品活菌数量(N1)根据如下公式计算：

上述重水孵育拉曼扫描出有重水峰的即为样方区域中的活性细菌

N1＝C1×n1×d1

N1是样品中总活菌数；

C1样方区域中的拉曼扫描出有重水峰的细菌数量之和；

n1为终稀释倍数样品体积/样方中样品体积；

d1为样品稀释倍数。

因此，所述样品活菌比例为：N1/N×100％。

实施例6、基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法的应用

1.用10ml 0.85％生理盐水溶解1g商业化植物乳杆菌固体饮料产品，震荡10min，使其充分溶解获得预处理后样品；

2.制备1∶10稀释度：取1ml预处理后样品加入到9ml生理盐水中，充分混匀获得1：10稀释度的样品；

3.取1ml 1∶10稀释度样品，5000rpm，2min离心取沉淀。沉淀用1ml 100％重水MRS培养基重悬，37℃厌氧孵育4h。

4.将厌氧孵育4h的样品5000rpm离心清洗2min，用超纯水洗3次后，使用1mL超纯水重悬，装载至阵列拉曼检测基片，基于CAST-R仪器，100mw，曝光时间3s，采集单个细胞水平的拉曼图谱(图5)并采集图像进行自动化计数，该自动化计数的具体步骤与实施例5中三、3相同，完成活菌计数。与此同时，基于CAST-R仪器100倍镜下采集图像并进行总菌的自动化计数，该自动化计数的具体步骤与实施例5中三、2相同，完成总菌计数(图5)。根据实施例5中三、4计算样品活菌比例。

检测结果如图5所示，其中，A为商业化植物乳杆菌固体饮料产品自动化计数结果图；B为商业化植物乳杆菌固体饮料产品重水孵育4h的拉曼测量图。实验结果表明，商业化植物乳杆菌固体饮料产品菌体无需复苏培养就处于活性状态，而且活菌数目为3.15×10¹⁰CFU/g，活菌比例高达90％。

实施例7、样品活菌计数系统

样品活菌计数系统包括接收模块、分割模块、连通区域分析模块、重心提取模块、重水峰分析模块和计算模块。

接收模块接收采用单细胞拉曼光谱仪采集的样品的样方区域的图像和单细胞拉曼光谱。

分割模块使用全卷积神经网络对接收模块接收的所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像。

连通区域分析模块对所述掩膜图像进行连通区域分析获得所述样方区域的图像的连通区域。

重心提取模块对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数。

重水峰分析模块根据对接收模块接收的所述单细胞拉曼光谱的重水峰进行分析获得含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数。

计算模块根据所述重心的数量获得样品总菌数量，根据所述含有重水峰的单细胞拉曼光谱的条数获得样品活菌数量，根据所述样品总菌数量和所述样品活菌数量获得样品活菌比例。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims

1.基于单细胞拉曼技术的益生菌活菌测量方法，其特征在于：包括

(1)将样品稀释10-100倍获得稀释后的样品；

(2)将所述稀释后的样品接种至含100％重水的培养基孵育4小时后回收并稀释菌体；

(3)使用单细胞拉曼光谱仪采集稀释后的菌体的样方区域的图像，和单细胞拉曼光谱；

(4)使用全卷积神经网络对所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像，再对所述掩膜图像进行连通区域分析获得所述样方区域的图像的连通区域，再对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数，再根据所述重心的数量获得样品总菌数量，

2.根据权利要求1所述的测量方法，其特征在于：

所述使用全卷积神经网络对所述样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像包括使用全卷积网络对训练数据集进行训练获得h5模型；再使用全卷积神经网络和所述h5模型对样方区域的图像进行语义分割获得掩膜图像。

3.根据权利要求1或2所述的测量方法，其特征在于：

所述益生菌为植物乳杆菌和/或嗜酸乳杆菌。

4.根据权利要求1-3任一项所述的测量方法，其特征在于：

步骤(2)为将稀释后的样品接种至含100％重水的MRS液体培养基，36℃±1℃厌氧孵育4h后回收并稀释菌体。

5.根据权利要求4所述的测量方法，其特征在于：

所述益生菌包括植物乳杆菌，步骤(1)为将样品稀释100倍获得稀释后的样品；

所述益生菌包括嗜酸乳杆菌，步骤(1)为将样品稀释50倍获得稀释后的样品。

6.样品活菌计数系统，其特征在于：包括

7.用于益生菌活菌测量的试剂盒，其特征在于：包括含100％重水的培养基、阵列拉曼检测基片和权利要求6所述的样品活菌计数系统。

8.一种计算机可读存储介质，其上存储有计算机程序，所述计算机程序被处理器执行时实现样品活菌计数方法，所述方法包括如下步骤：

(43)对各个连通区域进行重心提取并对重心进行计数；

(44)根据所述重心的数量获得样品总菌数量；

9.一种计算机处理设备，其特征在于：包括处理器及权利要求8所述的计算机可读存储介质，所述处理器执行所述计算机可读存储介质上的计算机程序。