JPH0678792A - 細胞の固定剤および細胞表面を破壊しないで細胞を染色する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 細胞表面のマーカー、細胞の形態、および細
胞の光散乱の性質を破壊しないで、細胞を更に分析する
ために固定することができる細胞の固定用組成物および
細胞の固定および細胞の分析の方法の提供。 【構成】 下記式 Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ （式中、Ｘは例えばＳＯ_３Ｈ，ＳＯ_２ＮＨ_２，ＣＯＯ
Ｈ，ＣＮ，ＯＨ，ＯＲ等、ＲはＨまたは１〜６個の炭素
原子を含有するアルキル、Ａｒは融合または非融合の１
〜３個の芳香族環、Ｒ_１〜Ｒ_５はＮＯ_２，ＣＯＲ，ＣＯ
ＮＨ_２，ＣＨＯ，Ｘ，ＯＨ，ＯＲ，Ａｒ等）の化合物を
含む固定用組成物、該固定用組成物により細胞を固定す
る方法、細胞を固定して、結合性リガンドと接触させ
て、細胞を分析する方法、生物学的試料を固定用組成物
と接触させて細胞を固定し、固定した細胞を抗体と接触
させて、フローサイトメーターで検査する細胞分析法、
ウイルス感染の進行を監視する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、細胞の性質、例えば、細胞の表
面のマーカー、形態学、および光散乱の性質を実質的に
破壊しないで、細胞を固定することができる、細胞の固
定剤に関する。ある種の好ましい実施態様において、こ
のような固定用組成物を使用すると、細胞の内容物を解
放しないで、細胞膜を抗体または問題の他の成分に対し
て透過性とすることによって、これらの比較的大きい成
分を細胞の中に入れることができる。ここに記載する固
定剤および細胞の分析法は、細胞を染色して、細胞がウ
イルスに感染しているか否か、このような感染の程度、
ウイルスの感染のある種のパラメーターについて患者の
血球をモニターすることによってウイルスの感染のため
の処置に患者が応答しているか否かを決定するときとく
に有用である。

【０００２】エイズおよび他のウイルスに関係する病気
の状態の発生以来、ウイルスの病因論および病理学を研
究する新規なかつよりすぐれた方法、ならびにこれらの
ウイルスが細胞に対して、究極的に患者に対してもつ作
用をある方法において阻止または変更するための処置の
養生法の治療的に監視する方法に対する要求が増加し
た。例えば、感染した細胞の百分率をアッセイすること
はしばしば望ましい。高いウイルスの負担（ｖｉｒｕｓ
ｂｗｄｌｎ）は、通常、病気が激しいことを意味する
が、低いウイルスの負担は特定の病気がその初期の段階
であるか、あるいは治療的処置に対して応答しているこ
となどを意味する。ウイルスの負担を測定する普通のア
ッセイは今日まで性質が単に推定的であった。例えば、
細胞を分析のために培養しそして滴定することができ
る。これらのアッセイにおいて、存在するＤＮＡ（プロ
ウイルスの形態）またはＲＮＡのコピーを定量する試み
で、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅技術を使用することが
普通であり、百分率はＲＮＡがより多いとき、ウイルス
はより多い。しかしながら、この種類の技術を使用して
得られる結果は、区別なしに、細胞当たり高い量のウイ
ルスの負担を有する少量の感染した細胞または低いウイ
ルスの負担をもつ大きい量の細胞を示すことができるだ
けである。他の欠点は、「どれだけ多くの」または「ど
の」細胞が感染したかが知らていないので、ウイルスの
感染が反復性または頓挫性であるかについての情報をこ
の技術に従う決定が提供しないことである。それゆえ、
この技術を使用して真のウイルスの負担の評価、ならび
にウイルス活性を得ることができない。さらに、感度が
許容される結果を与えないすべてを実施することは困難
であり、面倒でありそして経費がかかる。

【０００３】ウイルスの感染は、また、患者の血清の中
に存在するウイルスの成分、例えば、ｐ２４（ＨＩＶ−
１の場合において）の量を監視することによって監視す
ることができる。しかしながら、この技術はほとんど推
定的でありそしてしばしば誤った陰性の結果を与える。
例えば、患者は感染の開始において、ウイルスが複製す
るときであるが、患者の抗体がこのウイルスに対して応
答する前に、ｐ２４濃度において短いスパイクを示すこ
とがある。５日から約２〜３週の期間以内に、患者はｐ
２４に対する抗体をつくりはじめるであろう。これらの
抗体は血漿中のｐ２４に結合し、そしてそれを循環から
除去し、そしてイムノアッセイにおいてその検出をブロ
ックする。したがって、患者がいったんｐ２４に対する
抗体をつくりつつあるとき、患者は陰性と試験されるの
で、ｐ２４抗原の成分を検出するための非常に短い窓が
存在する。患者が非常に衰弱してｐ２４成分に対する抗
体をもはや生産することができるなくなった後、試験は
再びｐ２４抗原について陽性の結果を示す。不都合なこ
とには、病気は治療的処置に対する応答の段階を過ぎて
進行してしまっているので、患者の予後はこの時点にお
いて非常に厳しい。

【０００４】それゆえ、細胞中のウイルスの負担、およ
びそれらの細胞中のウイルスの生存能力および複製能力
を測定するよりすぐれた道具および技術が絶えず要求さ
れている。この情報はウイルスの感染の進行および処置
に対するその応答の決定において評価できない。さら
に、病気の進行の非常に初期の段階においてこれらのパ
ラメーターを監視し、そして感染通路を通して妨害され
ないこの監視を続けることが明確に必要とされている。

【０００５】とくに、好ましくはウイルスを不活性化
し、こうしてこの致死的なウイルスを含有する試料を取
り扱う安全性を増加する固定剤を使用することによっ
て、ＨＩＶ感染した個体の中のウイルスの負荷を日常的
に監視することが特別に要求されている。医師はこの情
報を使用して、ＨＩＶの病気の状態をカテゴリー化し、
進行を監視しそして記載し、予後を評価し、そして可能
ならば個体の基準で有効な治療的養生法をよりよく調整
する。さらに、提案した治療剤がウイルスの負荷を制御
するとき安全かつ有効であるかどうかを容易に決定する
ために、臨床的試験において使用するちょうどこのよう
なアッセイを製剤の会社および研究者は必要とする。患
者を監視するとき有用である細胞分析技術における背景
によると、普通のフローサイトメトリーはこのような仕
事に非常に適当な技術であることに注意されたい。フロ
ーサイトメトリーの基本的概念は、水性懸濁液中の細胞
または細胞下の成分を感知領域を通して高い速度で流
し、ここで重要な生物学的性質を示す光学的または電気
的信号を発生させることである。これらの信号を分析し
そして評価のために蓄積する。細胞を蛍光的に染色する
が、他の色素系を使用することができ（参照、米国特許
第４，９３３，２９３号）そして光散乱の測定または電
気的サイジングのためには染色は不必要である。一般
に、流体力学的方法を使用して、細胞を強制的にほとん
ど同一の軌道において均一な速度で強い照明の焦点を通
して動かし、この照明は使用する蛍光色素からの蛍光放
射を励起する。レーザーは典型的な光源である。細胞は
均一な照明を非常に短い期間の間受け取り、そしてすべ
ての角度でこの期間の蛍光および散乱した光のバースト
を放射する。光の放射／細胞の分画は光学的配置および
光学的信号に対して比例する電気的信号を発生する１ま
たは２以上のフォトセンサーにより捕捉される。蛍光の
放射は入射光より長い波長において起こるが、散乱した
光は波長の変化を経験しないので、これらの２つの信号
をフィルターで分離し、そして各細胞について独立にか
つ同時に測定することができる。電気パルスを造形し、
増幅し、測定し、そして表示するか、あるいは後の分析
のために貯蔵することができる。流れの分類は、また、
達成して、試料から異なる細胞の集団を分類することが
できる。典型的には、細胞の懸濁液を小さいオリフィス
の中から強制的に出し、そして空気中で高速の液体噴射
を形成する。光学的感知は通常オリフィスの出口に密接
して噴射の中で実施し、そしてちょうど記載したフロー
サイトメーターにおいて使用する方法と基本的には同一
である。適用した超音波の振動は噴射を均一な滴に破壊
し、これらの滴は高い（かつ一定の）電場強度の領域を
横切る。決定を行いかつ帯電回路は選択した細胞を含有
する滴のみを電気的に帯電させる；不必要な細胞を含有
する滴および空の滴は未変化のままである。電場は所望
の細胞の下位集団を含有する帯電した滴を１つの容器の
中に偏向させるが、すべての他の滴は他の容器へ行く。
このようにして高い純度の特定の下位集団をそれ以上の
生物学的研究、例えば、形態学または生化学的分析のた
めに得ることができる（上の節は、フローサイトメトリ
ーおよび分類（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ
Ｓｏｔｉｎｇ）、Ｍｅｌａｍｅｄら編、Ｊｏｈｎ Ｗ
ｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９７９、ｐｐ．１１−１
４、から取った）。

【０００６】前述の技術を患者の細胞とともに使用し
て、ウイルスの抗原の存在について分析することができ
る。このフローサイトメトリーの分析の前に、このこの
ような患者の中に存在する妨害性抗体を血清で単に洗浄
する。しかしながら、ヴィリオン粒子は、存在する場
合、細胞の細胞質の中に存在し、そして時には核の中に
存在する。細胞の内側ウイルスの抗原をみるために、細
胞膜は透過性であって、ウイルスに対する抗体を細胞の
中に入れさせなくてはならない。過去の先行技術の技術
を使用して、細胞表面のすべてまたは一部分をストリッ
ピング除去して大きい抗体を入れさせる。典型的には、
これは試薬、例えば、メタノールまたは脂質を抽出しそ
してタンパク質を沈澱させる傾向がある他のアルコール
を使用して実施する。このような試薬は基本的には細胞
をタンパク質のビーズに変え、このようにして存在する
ことができるタンパク質へのアクセスを提供する。しか
しながら、そのように実施するとき、細胞表面の特性は
破壊される。

【０００７】本発明は、細胞の細胞表面の特性を実質的
に破壊しないと同時に大きい分子、例えば、抗体を細胞
の中に入れさせる、細胞を固定する細胞固定剤および固
定技術を提供する。これは内側の細胞からヴィリオン粒
子を同時に放出しないで達成される。こうして、細胞を
透過しかつそれを固定すると同時に、このような細胞の
免疫反応性および光散乱の両者を保存することができ
る、単一の治療の試薬がここにおいて提供される。ここ
に記載する固定剤および細胞の分析法はフローサイトメ
トリーの分析における使用にとくによく適する。

【０００８】本発明は、 Ｉ、一般構造式

【０００９】

【化２】Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ 式中、ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂
ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、Ｓ
Ｏ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ
₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣ
ＯＮＨ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡ
ｒ、ＯＣＯＮＡｒ₂であり、ＲはＨまたは１〜６個の炭
素原子を含有するアルキルであり、Ａｒは融合または非
融合の、同一であるか、あるいは異なる１〜３個の芳香
族環であり、ベンゼン環、ヘテロサイクル環または同一
であるか、あるいは異なりそしてＯ、ＮまたはＳである
異種原子を含有する環であり、前記環はＲ₁、Ｒ₂、
Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅で置換されており、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、
Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ
₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨ
Ｏ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、ＲまたはＣＦ₃である、の
化合物、少なくとも１種を含んでなる、新規な細胞の固
定用組成物および細胞分析法を提供する。

【００１０】好ましい実施態様において、固定用組成物
は、さらに、 ＩＩ、アルコール不含の細胞の固定剤、 ＩＩＩ、細胞膜の透過性を増加するために適当な少なく
とも１種の化合物、および／または ＩＶ、細胞膜を横切る成分の輸送を促進する少なくとも
１種の化合物、を含む。

【００１１】ある種の最も好ましい実施態様において、
４つの前述のカテゴリーの各々から選択される１または
２以上の成分からなる固定用組成物が、ことにアルコー
ル不含の固定用組成物の成分が高い等級のホルムアルデ
ヒドであるとき、提供され、そして細胞膜の成分を横切
る輸送を促進する化合物はジメチルスルホキシドであ
る。また、細胞の試料をここに記載するように固定用組
成物で固定し、次いでそのように固定された細胞を標識
した結合性リガンドで検索して、種々の細胞表面のマー
カーおよび／または細胞内の成分存在または不存在を検
出し、ことに細胞の分析をフローサイトメトリーの使用
により達成する、細胞の分析法が提供される。前述の細
胞分析を使用して得られた結果を、病気の診断および監
視に応用することができる。

【００１２】本発明は、新規な細胞固定用組成物、細胞
の固定用組成物および細胞の分析の方法、ウイルスの負
担の監視および患者における病気の進行の監視の方法、
ならびにそのために有用な試薬を提供する。それ以上の
分析のために、細胞の細胞の性質、例えば、表面のマー
カー、細胞の形態学、および細胞の光散乱性質を実質的
に破壊しないで、細胞を固定することができる。ここに
記載するように固定剤で細胞を処置すると、また、細胞
の内容物の実質的な量を逃がさないで、細胞膜を通して
細胞の中に抗体または他の所望の成分を入れることがで
きる。本発明の組成物で固定した細胞は、死亡している
が、「生きている細胞」により証明される性質に非常に
類似する性質を細胞分析の間に証明する。例えば、細胞
の光散乱性質に基づく細胞の型の弁別はなお完全であ
る。さらに、形態学は生きている細胞のそれに非常に類
似し、膨潤および収縮は固定された細胞により典型的に
表示されたより非常に少ない。総合すると、生きている
細胞の集団を分析するのと非常に同一の方法で本発明に
従い固定された細胞をしばしば分析することができる。

【００１３】その最も広い面において、現在特許請求す
る固定用組成物は、細胞の細胞質を急速に固定して、主
要な崩壊なしに、細胞の内容物の完全性をそれらの正常
位置に維持する働きをする、少なくとも１種の成分を含
んでなる。これはほとんど細胞質を所定位置に「凍結す
ること」に類似する。この目的に適当な１または２以上
の化合物は、次の芳香族化合物のクラスから選択するこ
とができる：一般構造式

【００１４】

【化３】Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ 式中、ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂
ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、Ｓ
Ｏ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ
₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣ
ＯＮＨ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡ
ｒ、ＯＣＯＮＡｒ₂であり、ＲはＨまたは１〜６個の炭
素原子を含有するアルキルであり、Ａｒは融合または非
融合の、同一であるか、あるいは異なる１〜３個の芳香
族環であり、ベンゼン環、ヘテロサイクル環または同一
であるか、あるいは異なりそしてＯ、ＮまたはＳである
異種原子を含有する環であり、前記環はＲ₁、Ｒ₂、
Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅で置換されており、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、
Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ
₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨ
Ｏ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、ＲまたはＣＦ₃である、の
化合物。

【００１５】固定用組成物はこの一般構造式を有するも
のから選択される化合物の１つまたは組み合わせを含ん
でなることができる。

【００１６】固定用組成物のより好ましい実施態様にお
いて、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるか、あるいは異
なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、Ｃ
ＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、ＳＯ₃Ｈ、
ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＨＡｒ、ＯＨ、Ｏ
Ｒ、ＣＦ₃またはＲである、一般構造式を有するものか
ら選択される化合物の１つまたは組み合わせを含んでな
ることができる。

【００１７】ある種の他の好ましい実施態様において、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃は同一であるか、あるいは異なり、そし
てＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、Ｃ
ＨＯ、ＣＯＮＨＲ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂Ｎ
Ｒ₂、ＯＨ、ＸまたはＲであり、ただしＲ₁およびＲ₂が
ＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない。爆発性および
他の望ましくない性質は３置換のＮＯ₂化合物において
固有であり、したがって、望ましくない性質がある方法
で中性されないかぎり、ある種の場合においてこの置換
を回避することが好ましい。

【００１８】とくに好ましい実施態様において、ＸはＳ
Ｏ₃Ｈ、ＣＯＯＨまたはＯＨであり、そしてＲ₁、Ｒ₂お
よびＲ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮ
Ｏ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨ
Ｏ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨまたはＲであり、ただ
しＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではな
い。

【００１９】この一般的クラスに属するとくに好ましい
化合物は、２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド、
２，４−ジニトロフェノール、３，５−ジニトロサリチ
ル酸、２，４−ジニトロ安息香酸、５−スルホサリチル
酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジスルホ
ン酸、３，５−ジニトロ安息香酸、８−ヒドロキシキノ
リン−５−スルホン酸、４−ニトロフェノール、３，５
−ジニトロサリシルアルデヒド，３，５−ジニトロアニ
リン、パラトルエンスルホン酸、２−メシチレンスルホ
ン酸、２−（トリフルオロメチル）安息香酸、３，５−
ジニトロベンゾニトリル、および２，４−ジニトロベン
ゼンスルホン酸である。ジニトロベンズアルデヒド、ジ
ニトロベンゼンスルホン酸、ジニトロ安息香酸、ことに
３，５−ジニトロ安息香酸、２，４−ジニトロ安息香
酸、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，６−ジ
ニトロベンゼンスルホン酸ベンゼンスルホン酸、３，５
−ジニトロベンゼンスルホン酸、および２，４−ジニト
ロフェノールはよりとくに好ましい。

【００２０】本発明の固定用組成物の好ましい実施態様
は、賦形剤の中に溶解またはそうでなければ分散した、
前述の化合物の１つまたは任意の組み合わせを含んでな
ることができ、前記賦形剤は化合物および細胞と適合性
であり、そしてこのような１または２以上の化合物を含
有する均質な液状組成物の調製に適する。

【００２１】化合物のこの一般的クラスに属する実質的
な数の種を、例えば、アルドリッヒ・ケミカルス（Ａｌ
ｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウイスコンシン州
ミルウォーキー）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（スイス
国）、ジャンセ（Ｊａｎｓｓｅｎ）（ニュージャージイ
州およびベルギー国）、イーストマン−コダック（Ｅａ
ｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ）（ニューヨーク州ロチェスタ
ー）、ランチェスター・ケミカルス（Ｌａｎｃｈｅｓｔ
ｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ニューハンプシャイヤー
州ウィンドハム）のような化学物質の供給会社および他
のこのようなファインケミカルの供給会社から商業的に
入手可能である。有機合成の当業者は、また、理解する
ように、これらの化合物は新規に、あるいは一部分この
化合物に対する中間体はまず前述したように供給会社か
ら商業的に入手される場合、化学的に合成することがで
きる。これらのタイプの化学合成に適当な技術は、次の
ような論文に記載されているが、これに限定されない：
「合成有機化学（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ＷａｇｎｅｒおよびＺｏｏ
ｋ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、
ニューヨーク、１９５３；「炭素化合物の化学（Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ
ｓ）」、Ｒｏｄｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｎｇ Ｃｏ．、アムステルダム、１９５４（ｖｏｌ．Ｉ
ＩＩ、部Ａ）；硫黄の有機化学（ＴｈｅＯｒｇａｎｉｃ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｕｌｆｕｒ）、Ｃｈｅ
ｓｔｅｒＭ．Ｓｕｔｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９４４；「有機
合成（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ）」、Ｊｏ
ｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．。当業者は
理解するように、多くの場合において、合成しようとす
る化合物の化学名はこのような論文または実験室のその
化合物を合成を詳述する巻の正しいページについてのマ
ニュアルの内容またはインデックスの表をみることがで
きる。ほとんどの場合において、種々の合成を記載する
もとの論文はこのような研究の引用文献の節に含められ
ており、そしてまた必要に応じて相談することができ
る。

【００２２】より好ましい実施態様において、本発明の
固定用組成物は第２成分を含む。本発明の固定用組成物
の第２成分は、アルコール不含化合物の１つまたは組み
合わせであり、それらの各々はこの分野において一般に
「固定剤」として記載されており、そしてタンパク質に
取り付けかつそれらの構造を接着することによって作用
する。これらのアルコール不含化合物に従う作用の接着
メカニズムは変化することがあり、そして遊離アミンの
反応、脂質との反応、またはタンパク質の架橋を包含す
る。これらの固定剤のうちで、ホルムアルデヒド、パラ
ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイ
ン、グリオキサル、マロンアルデヒド、ジアセチル、ポ
リアルデヒド、カーボジイミド、ジイソシアネート、ジ
アゾニウム化合物、ジイミドエステル、マレイミド、ベ
ンゾキノン、および他の錯体、例えば、クロム、水銀、
オスミウムの三酸化物、塩化パラジウム、ウランなどの
１つまたは組み合わせを述べることができる。本発明の
固定用組成物の中に含める化合物として、１または２以
上のアミン反応性アルデヒド、例えば、グルタルアルデ
ヒド、アクロレイン、ホルムアルデヒド、パラホルムア
ルデヒドなどは好ましい。高い等級のアルコール不含ホ
ルムアルデヒドはことに好ましい。当業者は理解するよ
うに、前述の成分は、供給会社、なかでも、シグマ・ケ
ミカルス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミゾリ
ー州）、ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）
（ペンシルバニア州ワリントン）、アルドリッヒ・ケミ
カルス（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウイ
スコンシン州ミルウォーキー）などから商業的に入手可
能である。これらおよび他の普通に知られている固定剤
の化学について有用な論文は、固定の化学および実施
（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃ
ｅ ｏｆ Ｆｉｘａｔｉｏｎ）、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌ
ｉｅｄ，Ａ．Ｇ．Ｅｖｅｒｓｏｎ Ｐｅａｒｓｅ、Ｖｏ
ｌ．１、第４版、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｃｈｕｒｃｈ
ｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、ロンドン、エディン
バーグおよびニューヨーク、１９８０、ｐｐ．９７−１
５８、の中に見いだすことができる。主題の成分の濃度
は組織の固定において一般に使用されている濃度であ
り、そして好ましくは、より「おだやかな」固定を与え
るために、一般に使用されているより低い濃度である。
例えば、反応性アルデヒドの場合において、重量／体積
により測定して好ましい濃度（％）は一般に約０．１％
（ｗ／ｖ）〜約４％（ｗ／ｖ）である。より好ましい濃
度は約０．２％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）であり、
そしてとくに好ましい濃度は約０．５％（ｗ／ｖ）〜約
１．６％（ｗ／ｖ）の範囲である。

【００２３】本発明の固定用組成物の最も好ましい実施
態様において、第３またはなお第４の成分を添加する。
本発明の固定用組成物の第３成分は、化合物の２つの群
の１つから選択される化合物または化合物の組み合わせ
である。第１群は細胞膜を横切る成分の輸送を促進する
化合物として機能的に記載することができる。第２群は
洗浄剤または界面活性剤、例えば、非イオン性洗浄剤と
して記載することができる。最もとくに好ましい実施態
様において、固定用組成物はこれらの２つのカテゴリー
からの少なくとも１種の成分、すべての合計４つの別々
の成分からなる。

【００２４】細胞膜を横切る成分の輸送を促進する化合
物のうちで、脂質の単一層の表面のポテンシャルを減少
する化合物を述べることのできる。これらのうちで水溶
性または水不溶性の「フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎｉ
ｃ）」化合物、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホ
ラン、１−メチル−２−ピロリドン、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）、エチレングリコールなどを述べるこ
とのできる。この成分は一般に細胞膜を低分子量の化合
物に対していっそう透過性とし、そして細胞の細胞質の
中にこのような化合物が入るのを促進すると同時に、細
胞の膨潤を防止する。前述の成分、すなわち、固定剤の
成分および一般式Ｉの成分は次いで急速に細胞の中に入
りそして細胞の内容物を固定した後、任意の実質的にこ
ぼれ出ることができるであろう。細胞膜を横切る成分の
輸送を促進する化合物のうちでジメチルスルホキシドは
好ましい。なぜなら、ジメチルスルホキシドは細胞膜を
横切る成分の輸送を促進するいくつかの化合物よりフソ
ゲン性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）でなく、光散乱への作用
が低く、安定であり、そして固定剤の他の成分といかな
る程度においても反応しないからである。適当な濃度は
実質的な膜の融合を引き起こさない濃度である。好まし
い濃度は約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲
であり、約５％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）はこと
に好ましい。

【００２５】固定用組成物の第３または第４の成分とし
て働くために適当な洗浄剤は、約２００ｋＤ〜約１００
０ｋＤの大きい分子、ことに細胞表面のマーカーまたは
細胞内の成分などに結合し、こうしてそれらを検出する
とき有用な結合性リガンドとして一般に記載した大きい
分子に対して細胞膜を透過性とする、洗浄剤または洗浄
剤の組み合わせである。このような結合性リガンドのす
ぐれた例は、標識された抗体、標識されたＤＮＡおよび
ＲＮＡのプローブ、特定の基質、コファクターなどであ
る。このような結合性リガンドのための典型的な標識
は、蛍光性化合物、例えば、フィコビリタンパク質（フ
ィコエリトリンを包含する）、およびフルオレセインイ
ソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、放射性標識、酵素のビ
オチン−アビジンの標識などであり、それらのすべては
当業者によく知られている。したがって、洗浄剤または
洗浄剤の組み合わせはこの大きさの分子の侵入を収容す
るために必要な程度に細胞表面を透過することができる
べきである。しかしながら、この成分は固定用組成物の
他の成分と同調して作用して、脂質または他の成分が細
胞内部から抽出されるのを回避することができる濃度で
透過を達成すべきである。細胞内部の多すぎる細胞成分
が抽出される場合、細胞の光散乱性質は悪影響を受ける
であろう。

【００２６】この第３または第４成分としてここにおい
て使用するために好ましいものは、両性イオン性界面活
性剤または非イオン性界面活性剤、例えば、葉酸ナトリ
ウム、デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ、サポニン、およ
びエチレンオキシドのポリマー、例えば、エトキシル化
アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキ
シル化アミンおよびアミド、「ツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ^R）」系列のポリオキシエチレンソルビタン、例え
ば、モノラウレート（ツイーン２０）、モノパルミテー
ト（ツイーン４０）、モノオレエート（ツイーン８
０）、およびポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル
（Ｂｒｉｊ^R）、ポリオキシエチレンエーテルＷ−１
（Ｐｏｌｙｏｘ）などである。当業者は理解するよう
に、上の分類に属する化合物のすぐれた記載およびこの
ような化合物が商業的に入手可能な供給会社は、次の文
献に記載されている：「化学的分類、乳化剤および洗浄
剤（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎ
ｔｓ）」、マクカチオンの乳化剤および洗浄剤（ＭｃＣ
ｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｅｒｓ ａｎｄ
Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、１９８６、Ｎｏｒｔｈ Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｅｄｉｔｉｏｎｓ、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓ
ｉｏｎ、ＭＣ Ｐｕｂｌｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、米国ニュ
ージャージイ州グレンロック、およびＪｕｄｉｔｈ Ｎ
ｅｕｇｅｂａｕｅｒ、生物学および生化学における洗浄
剤の性質および使用へのガイド（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ
ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、カルビオケム
（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ^R）、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌ
ａｎｅｓｅ Ｃｏｒｐ．、１９８７。これらのうちで好
ましいものは、シグマ・ケミカルス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ）から入手可能である「ツイーン（Ｔｗ
ｅｅｎ^R）」系列、またはローム・アンド・ハース（Ｒ
ｏｈｍａｎｄ Ｈａａｓ）（ペンシルバニア州フィラデ
ルフィア）から入手可能である「トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ^R）」系列、ことに多数の供給会社から入手可能であ
るトリトンＸ−７０５、トリトンＸ−１００およびトリ
トンＸ−１１４のポリオキシエチレンソルビタン類であ
る。これらの好ましい濃度は約０．００１〜約０．２％
（ｗ／ｖ）の範囲であり、約０．０５〜約０．１％（ｗ
／ｖ）はとくに好ましい。

【００２７】本発明の固定用組成物は、ここに記載する
１または２以上の成分を選択し、次いで所望の１または
２以上の成分を適当な緩衝液または他の液体の賦形剤、
例えば、等張媒質の中に物理的に分散させることによっ
て調製される。このような適当な賦形剤の例は、リン酸
塩緩衝液、生理食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰ
ＰＥＳ、ハンク均衡塩溶液、ＲＰＭＩを包含する。細胞
の変性または変形は回避すべきであり、そして賦形剤中
の化合物の濃度は、ここに記載する技術に従い細胞を固
定するために適当な濃度であるべきである。成分を液体
の賦形剤の中に均質に分散させるか、あるいは実際に可
溶化すべきである。上に詳述したように選択した、量の
固定用組成物の種々の成分を、混合条件下に適当な容器
の中で組み合わせる。当業者は、各成分を混合物に添加
する順序を日常的に選択することができる。例えば、最
もとくに好ましい実施態様において、リン酸塩緩衝液を
まず容器に連続的に混合する条件下に添加し、次いでＤ
ＭＳＯ、ＤＮＢＳ（固体として）、ツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ^R）、およびホルムアルデヒドを添加する。固定用組
成物を調製する成分のこの添加順はとくに適当であるこ
とが発見された。この混合法は典型的には室温において
実施するが、当業者はこの温度を日常的に変化させるこ
とができる。

【００２８】本発明の固定用組成物は、任意の型の原核
生物または真核生物の生きている細胞、ことにバクテリ
アおよび哺乳動物の細胞を固定するために使用できる。
細胞を適当な量の固定用組成物と接触させ、そして少な
くとも約１分間このような接触を維持し、約２０分〜約
２時間のインキュベーションは好ましい。このようなイ
ンキュベーションの間維持する温度は一般に０℃〜約３
７℃であり、室温は好ましい。適当に使用される固定用
組成物の量は（試料の細胞／固定用組成物の相対量（体
積／体積））約１：１〜約１：１００（ｖ／ｖ）の間で
変化し、約１：１０〜約１：３０（ｖ／ｖ）はとくに適
当である。過剰の細胞固定用組成物は、遠心分離を包含
する任意の普通の手段により除去することができ、そし
て必要に応じて細胞分析の前に、細胞を適当な細胞懸濁
媒質、例えば、緩衝液の中に再懸濁させる。細胞の固定
の当業者はこれらの前述の細胞処理のパラメーターを日
常的に変化させて、細胞の性質を実質的に破壊しない
で、所望の細胞の固定を得ることができる。好ましい実
施態様において、本発明の固定用組成物は骨髄細胞およ
び血球、ことに白血球の固定において使用される。次い
でそのように固定された細胞を当業者に知られている任
意の適当な技術により検査することができる。このよう
な細胞分析の例は、電子顕微鏡、光学顕微鏡を包含する
顕微鏡、免疫蛍光、フローサイトメトリーなどの使用に
よる。

【００２９】本発明の固定用組成物を利用する細胞分析
の好ましい方法はフローサイトメトリー使用による。背
景によると、フローサイトメトリーはそれらの意図する
用途に依存して種々の立体配置で存在する。しかしなが
ら、それらのすべては４つの本質的な特徴を含有する。
各々は入射光源、試料を入射光が収束される点に運ぶ流
体の流れ、反射した光または試料から放射された光を電
気信号に変換する光学系、および最後に、情報をユーザ
ーに出力する手段を有する。レーザーは非常に高い強度
の単一の波長を供給するので、最も普通の光源である。
フローサイトメーターはバクテリアの細胞、染色体、腫
瘍細胞および例示の目的で他のものを包含する広範な種
類の試料について使用されてきているが、この論考は白
血球の単一の試料懸濁液からなる試料の分析を強調す
る。

【００３０】一般に、細胞の懸濁液を分析するために、
試料を狭い注射口を通して流体流の中心の中に導入す
る。この流れは２つの目的をはたす；第１に細胞を入射
光および光学系が収束される点にもっていくこと、そし
て第２に単一の列で細胞を方向づけること。細胞は単一
の列で移動するので、細胞は光線で一度に１回調べら
れ、そして各細胞により反射または放射された光を測定
し、そして試料中の他の細胞に対して独立に記録され
る。細胞がレーザー光の中に運ばれるとき、細胞はビー
ムを破壊し、それをすべての方向に散乱させる。細胞は
光を散乱するが、光の波長を変化させない。したがっ
て、散乱した光は異なる通路に沿って移動するが、入射
光のビームと同一の波長を維持する。典型的には、細胞
の懸濁液は蛍光色素または蛍光色素にカップリングした
抗体で処理されてきている。これらの蛍光化合物は１つ
の波長の光を吸収し、そしてより大きい波長の光を放射
する。こうして、細胞が蛍光色素を含有するか、あるい
は抗体−色素の複合体と反応した場合、散乱する光に加
えて、細胞は蛍光色素の特徴を示す波長の光を放射す
る。放射された光の量は存在する蛍光分子の量に対して
比例する。各細胞が放射した光の量を測定し、そしてそ
の「蛍光強度」と呼び、これをユーザーが表示する目盛
りで数値、例えば、１〜１０，０００として描写する。

【００３１】フローサイトメーターは、典型的には、フ
ォトンを電気的インパルス変換するためにいくつかの光
電子増倍管を含有する。各光電子増倍管の前に配置され
たフィルターは、光電子増倍管がそれに対して応答する
波長を選択する。入射ビームは光電子増倍管を含有する
検出系に入るのを妨げられる；したがって、細胞が散乱
するか、あるいは細胞から蛍光として放射される光のみ
は光電子増倍管に到達することができる。散乱した光は
２つの場所で集められる；入射ビームの軸からほんのわ
ずかに偏向した低い角度で、およびビームに対して直角
で。前者を低い角度または前方の散乱と呼ぶ；これに対
して、後者は直角または側面の散乱と呼ぶ。２つの異な
る角度で散乱した光を測定する理由は、前方および側面
の散乱が細胞について異なる情報を提供するからであ
る。どれだけ多くの光が前方の方向に散乱するかは、細
胞の大きさおよびその屈折率に依存する。細胞が大きく
なればなるほど、細胞はより多くの光を前方の方向に散
乱する。ビームに対して直角で散乱する光は、細胞内の
オルガネラの複雑さおよび数より細胞の大きさに依存す
る程度が少ない。

【００３２】リンパ球は小さい細胞であり、したがって
低い前方の散乱を有する。リンパ球は、また、非常にわ
ずかの細胞質および規則的な形状の核を有するので、低
い側面の散乱を示す。単球はリンパ球より大きく、それ
らの細胞質は顆粒性であり、そしてそれらの核は複雑で
ある。予測するように、単球は前方および側面の方向の
両者においてリンパ球より多くの光を散乱する。顆粒球
は大きさをリンパ球程度に小から単球より大きくまで変
化することができる。顆粒球が示す広い範囲の前方の散
乱はこの大きさの不均質性を反映する。しかしながら、
それらの細胞質の顆粒および不規則な形状の核のため
に、顆粒球は血液の中の３つの主な細胞の型の大部分の
側面の散乱を示す。各細胞がビームと通過するときの各
細胞の光散乱を測定し、そして前方の散乱（ＦＳＣ）／
側面の散乱（ＳＳＣ）のグラフにプロットすることがで
きる。オペレーターはこのようなプロットを使用して、
細胞の型を分離および同定し、計装を細胞の型の１つ、
２つ、または任意の組み合わせからのデータを表示しそ
して保存することができる。

【００３３】光散乱の使用は図１および図２に示されて
おり、そしてそれらの図はベクト・ディケンソ・コーポ
レーション（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能であるＦＡＣＳｃａ
ｎフローサイトメーターで測定した、光散乱性質を有す
る細胞の数の３次元の表示である。前方の光散乱を横座
標（Ｘ−軸）１０にプロットし／ＳＳＣを縦座標（Ｙ−
軸）１２にプロットした。細胞の数をＺ−軸１４に表
す。各細胞についてＦＳＣおよびＳＳＣの強度を測定
し、そして１〜１０００の目盛りで相対値を得た。図１
は生きている未固定の細胞を使用する結果を示し、それ
ぞれ、１００はリンパ球のクラスターを表し、１０２は
単球のクラスターを表し、そして１０４は顆粒球のクラ
スターを表す。図２は本発明の固定用組成物で固定した
後の細胞を使用する結果を示す。固定しそして透過性と
したが、細胞のクラスターはよく定められままであるこ
とが明らかであった。光散乱は因子、例えば、細胞の大
きさ、細胞質の複雑さおよび細胞の屈折率に依存するの
で、固定された細胞の光散乱が未固定の細胞のとほとん
ど変化しないことは驚くべきことではでなかった。しか
しながら、固定後、細胞の３つの集団は光散乱単独で分
割さればかりでなく、かつまたリンパ球、単球および顆
粒球の分離は改良することができたことは驚くべきこと
であった。

【００３４】細胞がリンパ球、単球または顆粒球である
という情報は有用であるが、それよりおおい情報は完全
な分析のために要求されることがある。多数の異なる種
類のリンパ球が存在し、そしてそれらは非常に明確な機
能を有する。あるリンパ球は抗体（Ｂ−細胞）を生産す
るが、他のものは免疫系を調節するか、あるいはある種
のエフェクター機能を実施する（Ｔ−細胞）。リンパ球
の機能的サブセットを同定しかつ数えることができるこ
とは、免疫学的研究および免疫系の病気の診断および監
視において必須である。しかも、リンパ球の機能的サブ
セットはそれらの光散乱でのみでは弁別することができ
ない。幸いにも、機能が異なるリンパ球は、また、それ
らが発現する抗原において異なる。その結果、Ｔ−細胞
の特定の機能的サブセットと反応する抗体が開発されて
きている。例えば、Ｔ−細胞は免疫系の全体の機能に対
して重要である。それらの名称が意味するように、それ
らの役割は外来物質、例えば、ウイルス、バクテリアお
よび寄生生物に対して有効な応答を担うように免疫系を
助けることである。ヘルパーＴ−細胞はそれらの表面に
ＣＤ４分子を発現し、そして抗ＣＤ４抗体はこれらのヘ
ルパーＴ−細胞と反応する。フローサイトメーターはこ
の事実を利用して、個体のリンパ球のどれだけ多くがヘ
ルパー型であるかを決定することができる。蛍光分子を
抗ＣＤ４抗体にカップリングさせる。普通に使用される
分子はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）
である。この化合物は青色光を吸収し、そして緑色光を
放射する。白血球の試料を抗ＣＤ４−ＦＩＴＣと反応さ
せ、次いでフローサイトメーターで分析する。単一の例
を移動する細胞を青色のレーザー光で照明し、そして前
方および側面の方向に散乱した青色光の量を決定する。
同時に、細胞が放射する緑色光の量を測定する。抗体と
反応したＣＤ４陽性のリンパ球は、それらが散乱する青
色光に加えて緑色光を放射する。非ヘルパーＴ−細胞と
同一の方法で光を散乱するが、抗体が存在しないので、
緑色光を放射しない。フローサイトメーターはその光散
乱のプロフィルにより細胞をリンパ球として同定し、次
いで緑色光を放射するリンパ球の数／放射しない数を計
数するように作ることができる。このようにして、ヘル
パー細胞であるリンパ球の比率を決定することができ
る。

【００３５】抗ＣＤ４−ＦＩＴＣと反応するすべての細
胞がヘルパーＴ−細胞であるわけではない。また、単球
はそれらの表面上にＣＤ４を発現するが、その濃度はヘ
ルパーＴ−細胞より低い。ＣＤ４の濃度が低いことは、
単球の表面に結合する抗体が少なく、それゆえより少な
い緑色光を放射する。これは単球をヘルパーＴ−細胞よ
り暗くするが、ＣＤ４陰性細胞より輝くようにする。し
かしながら、単球はリンパ球より大きい前方および側面
の散乱を有するので、ユーザーは所望の光散乱のプロフ
ィルを有する細胞からのデータを受け入れるか、あるい
は無視するようにフローサイトメーターに指令すること
ができる。光散乱のプロフィルを区別することができる
と、ＣＤ４陽性単球から干渉されないで、ＣＤ４陽性リ
ンパ球を正確に計数することができる。これはある病
気、例えば、後天性免疫欠損症候群（エイズ）において
とくに重要なである。ヘルパーＴ−細胞は健康な人々に
おけるより少ない蛍光であるか、あるいは暗く見えるこ
とがある。光散乱のプロフィルがある細胞をリンパ球と
同定しなかった場合、暗いＣＤ４ヘルパーＴ−細胞はそ
うでなければ単球と解釈され、これはヘルパーＴ−細胞
の数を低く評価することに導くであろう。

【００３６】より複雑なアッセイは同時に添加された第
２抗体を使用する。この場合において、第２抗体は第１
抗体と異なる特異性を有し、そして異なる色の光を放射
する色素とカップリングされる。典型的には、フィコエ
リトリン（ＰＥ）は青色光を吸収し過ぎるが、黄色の蛍
光を発生するので、それをこの目的に使用する。このよ
うにして、ある細胞がＦＩＴＣ標識された抗体、ＰＥ標
識された抗体または両者のいずれと反応するかを決定す
ることができる。例えば、ＤＲとして知られている抗原
は、細胞が活性化されていないかぎり、Ｔ−細胞上で発
現されない。対照的に、ＤＲ抗原は大部分のＢ−細胞上
で発現される。白血球が抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗Ｄ
Ｒ−ＰＥ抗体と反応する場合、反応性のすべての４つの
可能な組み合わせが期待されるであろう。あるリンパ球
はいずれの抗体とも反応せず、そして光のみを散乱する
であろう。非活性化Ｔ−細胞は抗ＣＤ３抗体と反応し、
そして緑色光のみを放射するであろう。Ｂ−細胞は抗Ｄ
Ｒ抗体と反応し、そして黄色光のみを放射するであろ
う。しかしながら、活性化されたＴ−細胞は両者の抗体
と反応し、そして緑色および黄色の両者の光を放射する
であろう。このような場合は図３に示されており、これ
はＦＡＣＳｃａｎを使用して得られたサイトグラムであ
る。それゆえ白血球は抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ＤＲ
−ＰＥと反応し、そして光散乱に基づいてリンパ球とし
て選択した、リンパ球の蛍光を横座標１０の各細胞の緑
色蛍光の強度および縦座標１２の細胞の黄色蛍光ととも
にプロットした。未反応の細胞のクラスターは起源１６
に存在する。Ｂ−細胞は垂直にクラスター１８の中に変
位し、これは未反応の細胞と区別されるが、その真上に
存在する。未反応のＴ−細胞は横座標に沿ってクラスタ
ー２０の中に変位し、これは未反応の細胞と区別される
が、それらのちょうど側面に存在する。最後に、活性化
されたＴ−細胞は同一量のＣＤ３を発現するので、非活
性化Ｔ−細胞とちょうど同一の多さの緑色光を放射する
が、それらはＤＲ抗原を同時に発現し、そして抗ＤＲ−
ＰＥ抗体と反応しているので、黄色光を放射する。

【００３７】この場合は第３抗体または青色光を吸収し
そして赤色光を放射するＤＮＡ／ＲＮＡ染色を含めるこ
とによって、なおいっそう複雑とすることができる。試
薬のこの配置は１つおよび２つの色試薬の分析の前の論
考で既にカバーされているフローサイトメトリーの原理
を例示しないので、詳細に説明しない；しかしながら、
それは細胞の複雑かつ精巧なフローサイトメトリー分析
がどのようになるかを例示する働きをする。１例とし
て、第３試薬がＤＮＡ染色である場合、細胞中のＤＮＡ
の量を測定することができる。ＤＮＡの量は細胞が休止
しているか、細胞分割のためにＤＮＡを合成している
か、あるいは分割しようとしているかどうかに依存す
る。ＤＮＡの量の定量により、ユーザーは細胞のサイク
ルの種々の段階において細胞を選択性に検査することが
できる。次いで、ある種の抗原が常にある細胞により発
現されるか、あるいは細胞のサイクルの制限された部分
の間に存在するかどうかを決定することが可能となる。
このようなデータは本質的に１つおよび２つの色のアッ
セイを実施するように分析されるが、同時の反応の複雑
さについてのより大きい認識をもって測定される。

【００３８】本発明の細胞分析法に従い、細胞試料をま
ず任意の種々の細胞源から得る。このような試料は精製
するか、あるいは精製しないことができるか、あるいは
そうでなければ普通の細胞分析のプロトコルに従い予備
処理することができる。好ましい実施態様において、血
液試料を得る。下の実施例ＩＩは典型的な血液試料の収
集手順を記載している。しかしながら、現在の方法は、
固定前に、赤血球をフィコール処理しないで、あるいは
全血試料からの白血球を溶解しないで実施することがで
きる（参照、実施例ＩＶ）。本発明の細胞固定用組成物
を、細胞表面の膜を実質的に破壊しないで、細胞を固定
するために十分な量の固定剤を使用して、細胞と混合す
る。

【００３９】１例としてのみ、患者の全血の試料は日常
的静脈穿刺、抗凝固剤、例えば、ＥＤＴＡまたはヘパリ
ンを含有する管の中への抜き出しにより得ることができ
る。次いでほぼ０．１ｍｌの全血をここにおける技術に
従い調製した２ｍｌの固定剤溶液と混合し、そして室温
に維持する。血液／固定剤混合物を室温において３０分
間インキュベーションし、遠心して細胞を沈澱させ、次
いで上澄み液を吸引により除去する。そのように固定さ
れた細胞を洗浄緩衝液の中に再懸濁させ、そして約１０
分間放置する。次いで細胞をリン酸塩緩衝液および血清
中で２回洗浄する。必要に応じて、残りの赤血球を標準
の溶解手順を使用して溶解することができる。

【００４０】この基本的手順を多数の方法で変化させる
ことができる。例えば、固定法の工程を実施する前に、
まず全血試料を等張希釈剤で希釈することが望ましいこ
とがある。溶解した全血をまた試料として使用すること
ができる。全血をまず標準の方法および手順により、例
えば、塩化アンモニウム処理により処理して、赤血球を
溶解することができる。次いで未溶解の全血球を洗浄し
そして好ましくは１〜２×１０⁷細胞／ｍｌである濃度
に、等張媒質の中に再懸濁させ、次いで上の手順に従い
処理する。血液試料をまたまず標準の方法によりフィコ
ール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）で
処理して、赤血球および顆粒球を除去することができ
る。次いでリンパ球および単球を好ましくは約１×１０
⁵〜約１×１０⁸細胞／ｍｌ、より好ましくは約１〜２×
１０⁷細胞／ｍｌで懸濁させ、そして上のようにして固
定する。血球分析の当業者は、血液試料の調製について
のこれらおよび他の技術を理解および認識するであろ
う。

【００４１】次いで細胞分析を前述の技術および概念お
よび次の実施例に従って実施し、ちょうど細胞が未固定
の生きている細胞である場合も同様である。

【００４２】本発明の固定用組成物およびフローサイト
メトリーの技術を使用して、臨床医は患者の細胞集団、
例えば、白血球の試料を感染するウイルスの負荷を研究
することができる。ある種の好ましい実施態様において
ＨＩＶ感染した個体の研究をここに記載する方法を使用
して実施することができる。例えば、Ａ．ベネット（Ｖ
ｅｎｅｔ）ら、「細胞のウイルス負荷の定量：ＣＤ４細
胞の計数との相関関係（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏ
ｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄ：Ｃｏｒ
ｒｅｌａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ＣＤ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏ
ｕｎｔ）、ＨＩＶ感染におけるウイルスの定量（Ｖｉｒ
ａｌ Ｑｕａｔｉｔａｔｉｏｎ ｉｎＨＩＶ Ｉｎｆｅ
ｃｔｉｏｎ）、Ｊ．−Ｍ．Ａｎｄｒｉｅｕ編、Ｊｏｈｎ
Ｌｉｂｂｅｒ Ｅｕｔｏｔｅｘｔ、パリ １９９１、
ｐｐ．２７−３６、には、ウイルス負荷の監視の有用性
が記載されている。しかしながら、彼は種々の患者の血
球分析から要求された情報を引き出すことを試みるため
に、面倒な、危険な、経費がかかる細胞の培養技術を使
用している。

【００４３】図１、図２および図３に描写するデータを
得たフローサイトメトリーの技術、およびここに記載す
る固定用組成物を使用して、臨床医は患者の血液試料を
分析して細胞の表現型、どの細胞がウイルスで感染して
いるか、およびどれだけ多くの細胞がウイルスを増殖し
ているかを決定することができる。さらにある場合にお
いて「どれだけ多くの」ウイルスがある種の細胞の中に
存在するかを決定することさえ可能である。この情報を
使用して、臨床医は次いで診断、治療的監視、患者の予
後などを決定することができる。例えば、同様なＣＤ４
陽性の計数を有する２人は非常に異なる臨床的表現およ
び進行を実証することがある。本発明の技術および組成
物を使用すると、各患者のそれぞれのウイルスの負担を
決定することができる。例えば、一方の患者は２００の
ＣＤ４の計数を有するが、実際にはウイルスを複製して
いる０．１％より少ないＣＤ４陽性細胞を実証すること
がある。第２の患者は４％のウイルスを複製するＣＤ４
陽性細胞を有することがある。この後者の場合におい
て、病気の進行はさらに進行していることがあり、そし
て予後はいっそう悪い。あるいは、ウイルスは薬物耐性
を獲得していることがあり、そして臨床医は処置の生活
規制を変化することがある。

【００４４】多数のウイルスを、同様な方法において、
患者の試料の中でそれら自身のためにあるいはＨＩＶま
たは問題のある他のウイルスと同時に監視することがで
きる。興味あることには、それは無症候性であるＨＩＶ
患者においてまず検出される他のウイルス、例えば、肝
炎ウイルスの存在であることがある。１または２以上の
他のウイルスのための無症状のウイルス血症は、また、
患者の免疫系が破壊されていることを示すことがある。
これはＨＩＶウイルスそれ自体がはびこる前に起こるこ
とがある。また、他のウイルスからの増加するウイルス
の負担の存在下にＨＩＶは真の免疫抑制の徴候であるこ
とがある。こうして、ここに記載する技術および組成物
は免疫系の競争または機能の急速な全体の評価を提供す
る。

【００４５】また、研究者および臨床医のために便利な
本発明の固定用組成物を適当な細胞マーカーと組み合わ
せてを含有する試験キットが提供される。１例として、
有用な組み合わせ試薬キットは、本発明の固定用組成物
を含有する容器、ならびにオルト・ダイグノスチック・
システムス・インコーポレーテッド（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）（ニュ
ージャージイ州ラリタン）から入手可能な抗体である、
オルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＴ４、オ
ルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＴ８、およ
びオルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＤＲを
含有する容器からなる。次いで、このキットをここに記
載する技術に従い利用して、種々の型のウイルスの感染
を監視する。ユーザーは理解するように、このキットは
問題のウイルスのすべてまたは一部分に対する１または
２以上の抗体と組み合わせて使用する。このような組み
合わせ試薬キットを使用して、患者の免疫系をパノラマ
的に監視することができる。好ましい組み合わせキット
の実施態様において、キットそれ自体は問題の種々のウ
イルスに対して抗体または抗体のパネルを含むことがで
きる。例えば、ＨＩＶの検出において、ＨＩＶウイルス
に対する１または２以上の抗体、例えば、抗ｐ２４、抗
ｐ１７、抗ｇｐ４１、抗ｇｐ１２０などをまたキットの
中に細胞表面のマーカーに対するある種の抗体、例え
ば、前述のオルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）Ｏ
ＫＴ抗体と組み合わせて含める。

【００４６】次は本発明のより特定の実施態様である
が、本発明を限定すると考慮すべきではない。

【００４７】

【実施例】

実施例１ 光散乱性質を保存することの現在の技術の失敗および細
胞表面の抗原の染色を示す比較例 比較例１：パラホルムアルデヒドの固定後の細胞集団の
区別 ４ｇのパラホルムアルデヒド（ＰＦ）を４００ｍｌのリ
ン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中に入れた。１％（ｗ／ｖ）
のＰＦ懸濁液を、絶えず撹拌しながら、すべてのＰＦが
溶解するまで、加熱した。

【００４８】血液を単一のドナーからヘパリン添加した
管の中に集め、次いで遠心（４５７×、１０分）した。
２本の血液収集管からのバッフィコートを５０ｍｌの遠
心管の中にプールし、そして５％（ｖ／ｖ）のウマ血清
（ＨＢＳＰ）を補充したハンクス平衡塩溶液（Ｍｅｄｉ
ａｔｅｃｈ）を使用して、合計の体積を３５ｍｌに調節
した。１０ｍｌのフィコール−ハイパーク（ｆｉｃｏｌ
ｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｌｙｍｐｈｏ−ｐａｑｕｅ、Ｎ
ｏｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ Ａｓ）を、フィコール
（Ｆｉｃｏｌｌ）バッフィコートの界面の混合を防止す
るように注意して、バッフィコートの下に層状にした。
この管を１１７０×ｇで２２℃において２０分間回転し
た。フィコールの界面に存在する末梢血液のリンパ球お
よび単球を集めた。赤血球および多形核白血球を含有す
る細胞のペレットを廃棄した。白血球および単球を氷冷
ＨＢＳＰの中に希釈し、次いで遠心（４５７×ｇ、４
℃、８分）により沈澱させた。細胞を再びＨＢＳＰの中
で洗浄した。

【００４９】細胞をＰＢＳの中で１回洗浄し、次いで４
ｍｌのＰＢＳ（４×１０⁷細胞／ｍｌ）の中に再懸濁さ
せた。細胞を４つの１ｍｌのアリコートに分割した。第
１の管に１ｍｌのＰＢＳを入れ、そして管２〜４に１ｍ
ｌの１％のパラホルムアルデヒドに入れた。すべての管
を室温において３０分間インキュベーションした。すべ
ての管をＰＢＳの中で２回洗浄した。管１および２を要
求となるまで氷の中に再懸濁させた。管３に１ｍｌの
０．５％（ｗ／ｖ）のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ
４０（ＮＰ４０；ＢＤＨ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を添加し、
そしてそれを室温において３０分間インキュベーション
した。管４に６．６ｍｌのメタノール（−７０℃）を添
加し、そしてそれを０℃において３０分間インキュベー
ションした。

【００５０】すべての細胞を、処理に無関係に、５ｍｌ
のＨＢＳＰ＋２％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清の中で２回洗
浄した（４５７×ｇ、４℃、８分）。すべての細胞を１
×１０⁷細胞／ｍｌの濃度でＨＢＳＰ＋２％のヒトＡＢ
血清（ＨＢＳＰ−ＡＢ）の中に再懸濁させた。２００μ
ｌの各細胞の懸濁液をフルオレセインイソチオシアネー
ト（ＦＩＴＣ）接合モノクローナル抗体：対照、ＯＫＴ
３、ＯＫＴ４およびＯＫＴ１１（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇ
ｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ニュージャ
ージイ州ラリタン）とインキュベーションした。細胞の
懸濁液を０℃において３０分間インキュベーションし、
次いで氷冷ＨＢＳＰ−ＡＢの中で遠心（４５７×ｇ、４
℃、８分）により２回洗浄した。

【００５１】光散乱性質および蛍光抗体の結合レベルを
日常的フローサイトメトリー技術によりＦＡＣＳｃａｎ
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメ
ーターを使用して決定した。ＦＡＣＳｃａｎに４８８ｎ
Ｍの光を放射するアルゴンのレーザーを設置した。５３
０／３０ｎＭのバンドパスフィルターを装備した蛍光検
出器（ＦＬ１）をＦＩＴＣ蛍光の定量のために使用し
た。特記しない限り、光散乱の測定を０〜２５６単位の
直線の目盛りで行い、そして蛍光を１〜１０⁴単位の対
数目盛りで測定した。

【００５２】対照−ＦＩＴＣ抗体で処理した未固定の生
きている細胞についての前方の光散乱（ＦＳＣ）および
ＦＩＴＣ蛍光のレベルを測定した。１％のパラホルムア
ルデヒド（ＰＦ）で予備処理した細胞を、また、同一方
法において分析した。

【００５３】細胞を１％のＰＦで処理したが、２つの明
確な細胞の集団はＦＳＣにより区別された。リンパ球を
１０５付近のＦＳＣ（１〜２５６の目盛りで）で見られ
るが、これに対して単球は１８０付近のＦＳＣを有し
た。１％のＰＦで処理した細胞は、生きている、未固定
の細胞より多くの、対照−ＦＩＴＣ抗体の非特異的結合
を表示した。

【００５４】細胞をＯＫＴ３抗体で処理し、そして同様
な方法において測定する実験を実施した。ＯＫＴ３はＴ
細胞の表面上の分子ＣＤ３と反応する。ＣＤ３はＢ細胞
または単球上に存在せず、それゆえこれらの細胞はＯＫ
Ｔ３と反応しない。ＯＫＴ３と結合するリンパ球はＰＦ
処理した細胞において明らかであった。ＰＦ処理した細
胞の平均の蛍光は未処理の細胞より低かった；そして陽
性および陰性の集団はＰＦ処理後によく分離されなかっ
た。ＯＫＴ３のより低い結合の強度が示唆するように、
ＣＤ３はＰＦ処理により損傷されることがあるが、ＯＫ
Ｔ３がもはや結合しない点まで変更されることがない。
リンパ球および単球がそれらのＦＳＣに基づいて区別さ
れたという追加の証拠は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞が単球の細
胞のクラスターの中に存在しないという発見であった
（ＦＳＣほぼ１８０、１〜２５６の目盛りで）。

【００５５】細胞をまた抗体ＯＫＴ４で処理した。ＯＫ
Ｔ４はＴ細胞のヘルパーのサブセットの表面上のＣＤ４
に結合する。ＯＫＴ４はＰＦで処理したリンパ球に結合
した。ＣＤ３と異なり、ＣＤ４は単球の表面上で低いレ
ベルで発現される。こうして、生きている、未固定の単
球はＯＫＴ４で暗い蛍光を示した。ＰＦで処理した単球
はＯＫＴ４に結合するように思われなかった。しかしな
がら、ＣＤ４は単球上で低いレベルで発現されるので、
ＣＤ４に対する少量の損傷さえこれらの細胞を陰性とす
るであろう。ＣＤ３を使用する場合のように、ＣＤ４は
ＰＦ処理により損傷されたように事実思われるが、破壊
しなかった。

【００５６】ＯＫＴ１１の染色をまた実施し、そして前
述と同一の方法で測定を実施した。ＯＫＴ１１はＴ細胞
の表面上のＣＤ２と結合する。生きている、未固定の細
胞上で、ＯＫＴ１１陽性の集団は中程度のみの蛍光を表
示した。ＯＫＴ１１の染色はＰＦ処理した細胞上で観察
されなかった。ＰＦによる処理は、ＯＫＴ１１がそのエ
ピトープに結合するのを防止する方法でＣＤ２を変更す
るように思われる。

【００５７】比較例２：メタノール調製物 細胞内抗原を可視化するために、単に細胞を固定するこ
とは不十分である。細胞をまた抗体程度に大きい分子に
対して透過性としなくてはならない。細胞を透過性とす
るために最も頻繁に使用されている方法は、固定された
細胞のメタノールまたは洗浄剤の処理である（ジャコッ
ベージャー（Ｊａｃｏｂｂｅｒｇｅｒ）、Ｊ．Ｗ．（１
９８９）核のタンパク質の細胞サイクルの発現（Ｃｅｌ
ｌ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃ
ｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ａ．Ｙｅｎ（編）、フ
ローサイトメトリー：アドバンスド・リサーチおよびク
リニカル・アプリケイション（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅ
ｔｒｙ：ａｄｖａｃｅｄｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃ
ｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。ＣＲＣ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ、
に概観されている）。メタノールはさらにタンパク質を
固定し、それらのコンフォメーションを不規則化し、そ
して膜の脂質を抽出する。洗浄剤の処理は膜の脂質を抽
出し、孔をつくり、ここを通して抗体は細胞を自由に出
入りすることができる。

【００５８】１％のＰＦの中で固定した細胞／１％のＰ
Ｆの中で固定し、次いでメタノールで透過性化した細胞
の免疫染色および光散乱性質を測定した。ＦＳＣに基づ
いてリンパ球と単球とを区別する能力は、メタノール処
理により減少する。さらに、メタノール処理した細胞は
対照−ＦＩＴＣ抗体の非特異的結合を増加した。しかし
ながら、最も重要な発見は、メタノール処理した細胞が
ＯＫＴ３、ＯＫＴ４ともはや反応せず、そしてなおＯＫ
Ｔ１１と反応しなかったことであった。

【００５９】比較例３：洗浄剤の処理 １％のＰＦの中で固定した細胞／１％のＰＦの中で固定
し、次いで洗浄剤（０．５％のＮＰ４０）で処理した細
胞の免疫染色および光散乱性質を、また、比較の目的で
測定した。リンパ球と単球とを区別する能力は、洗浄剤
の処理により減少する。洗浄剤で処理した細胞は、ま
た、１％のＰＦで処理した細胞を越えた非特異的対照−
ＦＩＴＣの結合の顕著な増加を示した。ＯＫＴ３は洗浄
剤処理した生きている細胞に事実結合したが、陽性の集
団と陰性の集団との間の分離は非常に少なかった。リン
パ球と単球との劣ったＦＳＣ分離は、光散乱によるこれ
らの集団の分離の信頼性を無くした。その結果、ＯＫＴ
３陽性リンパ球の百分率は、洗浄剤の処理後に正確に決
定されなかった。ＯＫＴ３はＣＤ３陽性リンパ球になお
結合したが、どれだけ多くのＣＤ３陰性細胞が真にリン
パ球であるか、および洗浄剤で変更されたＦＳＣをもつ
単球がどれだけ多くかを確実に知ることは不可能であっ
た。単球の光散乱性質への洗浄剤の処理への作用は、洗
浄剤で処理した細胞をＯＫＴ４で処理したとき、明らか
となった。リンパ球および単球の両者はＣＤ４陽性細胞
を含有するので、期待するように、ＯＫＴ４はリンパ球
と結合し、そしてより少ない程度に単球に結合した。細
胞のこれらの集団、およびそれらのＯＫＴ４の結合は首
尾よく測定された。決定された３つの集団は、ＯＫＴ４
結合性をもたないＣＤ４陰性リンパ球、中間の染色をも
つＣＤ４の低い密度を有する単球、および輝いた蛍光を
もつＣＤ４陽性リンパ球であった。しかしながら、洗浄
剤処理した細胞において、多数の単球は８０〜１４０Ｆ
ＳＣの間の光散乱値を有した；同一範囲のＦＳＣ値はリ
ンパ球について得られた。この結果から明らかなよう
に、洗浄剤処理後、リンパ球の光散乱のクラスターは単
球で高度に汚染されている。

【００６０】実施例２ 本発明の組成物で固定後の細胞の抗原の特異性の保存 構成成分を蒸留したＨ₂Ｏを次の最終濃度に添加するこ
とによって固定試薬を調製した：１４％（ｖ／ｖ）ジメ
チルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｃｏ．）；０．１４％（ｗ／ｖ）のポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０、Ａ
ｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）；
３９．２ｍＭの２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸ナ
トリウム塩（ＤＮＢＳ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｃｏ．）；１．５１％のホルムアルデヒド（Ｕｌ
ｔｒａｐｕｒｅ １０％のＥＭ等級、Ｐｏｌｙｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）；１．４７ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄；
２．６８３ｍＭのＫＣｌ；８．０５８ｍＭのＮａ₂ＨＰ
Ｏ₄および６７ｍＭのＮａＣｌ。固定溶液のｐＨを７．
４に調節した；そしてこの溶液を室温において琥珀色の
びんの中に一夜貯蔵した。

【００６１】抗凝固剤としてＫ３−ＥＤＴＡを含有する
管の中に血液を静脈穿刺により直接集めた。血液および
抗凝固剤を混合し、そして必要となるまで（ほぼ１時
間）室温に保持した。

【００６２】１０ｍｌの全血を５０ｍｌの遠心管の中に
入れた。全血を４０ｍｌの新しく調製した緩衝化塩化ア
ンモニウム溶解試薬（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で希釈した。血液を時々
混合しながら室温において２０分間インキュベーション
した。白血球を遠心により沈澱させた（４５７×ｇ、２
１℃、８分）。白血球を室温においてリン酸塩緩衝液
（ＰＢＳ）の中で遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）に
より２回洗浄した。洗浄した細胞をＰＢＳの中に２×１
０⁷細胞／ｍｌで再懸濁させた。白血球のプールをアリ
コートに分割した。固定すべきでない細胞を等しい体積
のＰＢＳ＋５％（ｖ／ｖ）のウマ血清（ＰＢＳ／Ｓ）で
希釈し、そして必要となるまで氷上に配置した。固定す
べき細胞を等しい体積の固定試薬で希釈した。細胞を混
合し、そして室温において３０分間インキュベーション
した。３０分後、固定した細胞を５０ｍｌのＰＢＳの中
で２回洗浄した。生きている細胞および固定した細胞を
「ブロック溶液」の中で１回洗浄した。ブロック溶液は
２５％（ｖ／ｖ）のヤギ血清＋５％（ｖ／ｖ）のウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）から構成した。生きている細胞
をブロック溶液の中に２×１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁さ
せ、そして氷上に１時間配置した。固定した細胞を、ま
た、ブロック溶液の中に２×１０⁷細胞の形態学に再懸
濁させたが、室温に１時間保持した。

【００６３】直接免疫染色 細胞表面の抗原決定基を、ＦＩＴＣに直接接合した細胞
表面のマーカーに対する抗体（ＯＫ−対照、ＯＫＴ３、
ＯＫＴ４、ＯＫＴ１１およびＯＫＴ３／ＯＫＤＲ−ＰＥ
の組み合わせ、すべてはＯｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔ
ｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州
ラリタン、から入手可能である）を使用して染色した。
１００μｌの生きている細胞または固定した細胞の懸濁
液を反応管に入れ、そして１０μｌの適当な抗体または
対照をこの管に添加した。細胞および抗体を６０分間イ
ンキュベーションした。生きている細胞を使用するすべ
てのインキュベーションおよび洗浄は０℃において実施
したが、固定した細胞を使用するすべてのインキュベー
ションおよび洗浄は室温において実施した。６０分後、
細胞をＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗
浄した。最後の洗浄後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓ
の中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメ
ーターで分析した。

【００６４】間接的免疫染色 固定が細胞を抗体に対して透過性とすると同時にそれら
の細胞質の抗原を保持させたかどうかを決定するため
に、生きている細胞および固定した細胞を細胞質のタン
パク質、ゲルゾリンおよびビメンチンに対して特異的な
マウスモノクローナル抗体と反応させた。抗ゲルゾリン
（クローンＮｏ．ＧＳ−２Ｃ４、シグマ・ケミカル・カ
ンパニー）および抗ビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ９、
シグマ・ケミカル・カンパニー）を蛍光色素に接合させ
なかった。したがって、これらの抗体の結合は「直接」
決定しなかった。その代わり、細胞へのこれらの抗体の
結合は、処理した細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ
と反応させることによって「間接的に」決定した。細胞
質抗原の免疫染色は、１０μｌの対照ＩｇＧ２ａマウス
抗体（１０μｇ／ｍｌ）、または１０μｌの抗ゲルゾリ
ン（ブロック溶液の中で１／１００に希釈した）または
１０μｌの抗ビメンチン（ブロック溶液の中で１／６０
に希釈した）を１００μｌの固定した細胞または生きて
いる細胞の懸濁液に添加することによって、実施した。
細胞および抗体を前述したように１時間インキュベーシ
ョンし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用し
て３回洗浄した。最後の洗浄後、上澄み液を吸引により
除去し、そして細胞を１００μｌのブロック溶液の中に
再懸濁させた。次いで各懸濁液に、ブロック溶液の中で
１／７５に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合
体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）
の２００μｌを添加した。細胞を再び６０分間インキュ
ベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を
使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．５ｍ
ｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてＦＡＣＳｃａ
ｎフローサイトメーターで分析した。

【００６５】固定した細胞は通常自己蛍光、抗体の非特
異的結合、または両者の実質的な増加を示すことはこの
分野において知られている。また、抗体により非特異的
結合の量は適当なブロッキング試薬および細胞の洗浄条
件で最小にすることができることは知られている。この
実施例において、すべての細胞をブロッキング溶液で処
理し、そして同一の洗浄緩衝液の中で洗浄した。

【００６６】保存空間、時間および不都合な反復を回避
することの重要性から、リンパ球のクラスターからのデ
ータのみをここにおいて論考する。リンパ球のクラスタ
ーをＦＳＣ／ＳＳＣにより同定し、そして規定された領
域または「リンパ球のゲート」内の細胞に対するコンピ
ューター分析の出力を狭くするために「ゲート」または
領域を確立した。リンパ球の分析のみを論考するが、固
定したリンパ球は固定した単球および顆粒球が抗ゲルゾ
リン、抗ビメンチン、およびそれぞれの細胞の型に対し
て適当な細胞表面のマーカーに対する抗体とどのように
反応するかについての代表であった。

【００６７】ＯＫ−対照−ＦＩＴＣは、任意の既知の細
胞の抗原と反応しないマウスＩｇＧ２ａ抗体である。し
たがって、この抗体で処理した後の細胞が放射する緑色
の蛍光は細胞の抗体の非特異的結合のためである。生き
ている細胞および固定した細胞による非特異的結合を決
定した。ＯＫ−対照と反応したとき、生きている細胞の
１００％は３．９２より小さい蛍光強度を有し（１〜１
０⁴の目盛りで）、生きている細胞についての平均の強
度は１．２０であった。固定した細胞に対する抗体の非
特異的結合は生きている細胞のそれよりほんのわずかに
高かった。固定した細胞の９９．５％は１３．８２より
小さい蛍光を有したが、平均の蛍光強度は３．９９であ
った。したがって、データが証明するように、本発明の
試薬および方法により固定しそして染色した細胞は抗体
の有意な量を非特異的に結合しない。

【００６８】ＯＫＴ３−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の
分子ｄ３の染色を測定した。固定したリンパ球の７７．
９％と比較して、生きているリンパ球の７７．４％はＣ
Ｄ３に対して陽性であった。ＣＤ３陽性の生きている細
胞についての平均の蛍光強度は１８８．８３であった。
ＣＤ３陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度は１４４．
６８であった；生きている細胞の強度より２３％低かっ
た。染色の強度は適度に低かったが、ここに記載する試
薬および方法は固定した細胞上のＣＤ３へ結合するＯＫ
Ｔ３の能力を破壊しなかった；そして固定した細胞は十
分なＯＫＴ３に結合し、ＣＤ３陽性リンパ球を蛍光強度
に基づいてＣＤ３陰性リンパ球と明白に分離することが
できた。この結果はこの分野において実施されているパ
ラホルムアルデヒドおよびメタノールの処理により固定
されそして透過性とされた細胞と顕著な対照をなし、こ
こで後者の処理においてＣＤ３に結合するＯＫＴ３の能
力は完全に破壊された（参照、上の比較例２）。

【００６９】ＯＫＴ４−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の
分子ＣＤ４の染色を、また、実施した。固定したリンパ
球の５２．７％と比較して、生きているリンパ球の５
５．１％はＣＤ４に対して陽性であった。ＣＤ４陽性の
生きている細胞についての平均の蛍光強度は６９．５７
であった。ＣＤ４陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度
は６３．７４であった；生きている細胞の強度より８％
低かった。染色の強度は適度に低かったが、ここに記載
する試薬および方法は固定した細胞上のＣＤ４へ結合す
るＯＫＴ４の能力を破壊しなかった；そして固定した細
胞は十分なＯＫＴ４に結合し、ＣＤ４陽性リンパ球を蛍
光強度に基づいてＣＤ４陰性リンパ球と明白に分離する
ことができた。この結果はこの分野において実施されて
いるパラホルムアルデヒドおよびメタノールの処理によ
り固定されそして透過性とされた細胞と顕著な対照をな
し、ここで後者の処理においてＣＤ４に結合するＯＫＴ
４の能力は完全に破壊された（参照、上の比較例２）。

【００７０】ＯＫＴ１１−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面
の分子ＣＤ２の染色を、また、実施した。固定したリン
パ球の８４．３％と比較して、生きているリンパ球の８
５．３％はＣＤ２に対して陽性であった。ＣＤ２陽性の
生きている細胞についての平均の蛍光強度は４９．９５
であった。ＣＤ２陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度
は４１．００であった；生きている細胞の強度より１８
％低かった。染色の強度は適度に低かったが、ここに記
載する試薬および方法は固定した細胞上のＣＤ２へ結合
するＯＫＴ１１の能力を破壊しなかった；そして固定し
た細胞は十分なＯＫＴ１１に結合し、ＣＤ２陽性リンパ
球を蛍光強度に基づいてＣＤ２陰性リンパ球と明白に分
離することができた。この結果はこの分野において実施
されているパラホルムアルデヒドおよびメタノールの処
理により固定されそして透過性とされた細胞と顕著な対
照をなし、ここで後者の処理においてＣＤ２に結合する
ＯＫＴ１１の能力は完全に破壊された（参照、上の比較
例２）。さらに、リンパ球をパラホルムアルデヒドで処
理し、次いで膜をＮＰ４０で可溶化するとき、いくつか
のＣＤ３およびＣＤ４の染色が観察されたが、ＯＫＴ１
１によるＣＤ２の染色は見られなかった。

【００７１】細胞を、また、異なる放射スペクトルを有
する蛍光分子に接合した２つの抗体の特異性とインキュ
ベーションした。細胞を同時にＯＫＴ３−ＦＩＴＣおよ
びＯＫＤＲ−ＰＥとインキュベーションした。ドット・
ブロット・サイトグラムがＦＡＣＳｃａｎから得られ、
ここでＯＫＴ３−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の分子Ｃ
Ｄ３の染色をＸ−軸に表示し、そしてＯＫＤＲ−ＰＥに
よる細胞表面の分子ＤＲの染色をＹ−軸に表示する。ド
ット・プロットは、図３に示すものに類似し、４つの１
／４のものに分割した；上左（ＵＬ）、上右（ＵＲ）、
下左（ＬＬ）および下右（ＬＲ）。固定したリンパ球の
７９．７％と比較して、生きているリンパ球の７８．７
％（ＵＲ＋ＬＲ）はＣＤ３に対して陽性であった。生き
ている細胞のＯＫＤＲの染色（上左）により決定して、
Ｂ−細胞はリンパ球の集団の６．８％を表した。固定し
た細胞について、Ｂ−細胞はリンパ球の７．４％を表
し、生きている細胞の集団とすぐれた一致を示した。ま
た、ＤＲおよびＣＤ３抗原の同時発現により決定して、
活性化したＴ−細胞の百分率は、生きている細胞および
固定した細胞の集団の間できわめてすぐれた一致を示し
た。生きているＴ−細胞の４．４８％（上右）および固
定したＴ−細胞の４．２２％は活性化されていると決定
された。これらの結果は固定後にＤＲを含むと検出され
うる細胞表面の抗原のリストを拡張するばかりでなく、
かつまた、ここに記載する試薬および方法を使用して細
胞を固定したとき、多数の抗原の特異性をプロービング
することができることを証明する。

【００７２】前述したように、間接的免疫染色手順を使
用して、細胞内抗原の染色を実施した。このために、Ｏ
Ｋ−対照−ＦＩＴＣは適当な陰性の対照ではなかった。
その代わり、細胞を非接合の対照ＩｇＧ２ａ抗体とイン
キュベーションし、洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧ
−ＦＩＴＣとインキュベーションした。生きている細胞
の９９．６％は３．９２以下の蛍光を有し、平均の蛍光
は１．２１であった。固定した細胞の９９．４％は１
２．８６以下の蛍光を有し、平均の蛍光は５．８４であ
った。直接の抗体接合体の対照を使用して見られるよう
に、本発明の試薬および方法により固定しかつ染色した
細胞は有意な量の抗体と非特異的に結合しなことをデー
タは証明する。

【００７３】抗ゲルゾリン抗体による細胞質の分子ゲル
ゾリンの染色は、固定したリンパ球の９１．４％と比較
して、生きているリンパ球の０．４％が抗ゲルゾリンの
蛍光に対して陽性であることを証明した。抗ゲルゾリン
陰性の生きている細胞の平均の蛍光強度は１．２２であ
った。抗ゲルゾリン陽性の固定した細胞の平均の蛍光強
度は５０．４５であった。ゲルゾリンは細胞表面上で発
現されない細胞質の抗原である。その結果、生きている
細胞は、抗体がその細胞の中に入ることができないの
で、ゲルゾリンについて陽性に染色しない。対照的に、
細胞を本発明の試薬および方法により固定したとき、細
胞の内部は抗体に対してアクセス可能であった。抗ゲル
ゾリンが全ＩｇＧ分子であり、断片ではなかった；した
がって、少なくとも１５０，０００ダルトン程度に大き
い分子はこれらの固定した細胞の中に自由に入りかつ去
ることができた。

【００７４】抗ビメンチン抗体による細胞質の分子ビメ
ンチンの染色は、固定したリンパ球の９２．０％と比較
して、生きているリンパ球の０．６％が抗ビメンチンの
蛍光に対して陽性であることを証明した。抗ビメンチン
陰性の生きている細胞の平均の蛍光強度は１．２４であ
った。抗ビメンチン陽性の固定した細胞の平均の蛍光強
度は５５５．０１であった。ビメンチンは細胞表面上で
発現されない細胞質の抗原である。その結果、生きてい
る細胞は、抗体がその細胞の中に入ることができないの
で、ビメンチンについて陽性に染色しない。対照的に、
細胞を本発明の試薬および方法により固定したとき、細
胞の内部は抗体に対してアクセス可能であった。ビメン
チンは５８，０００ダルトンの分子量を有するが、抗ビ
メンチンは１５０，０００ダルトンの分子量を有するこ
とに注意することが重要である。したがって、これらの
結果が示すように、固定の間に、小さい細胞質のタンパ
ク質は細胞により保持され、そして細胞が完全な抗体の
大きさの分子に対して透過性とされているにもかかわら
ず、所定位置に保持される。

【００７５】本発明の試薬および方法により固定された
細胞はリンパ球、単球および顆粒球を互いに区別可能す
るために十分な光散乱性質を維持ことが見られた。固定
された細胞は内部の細胞の抗原への抗体の自由のアクセ
スを可能とし、しかもこれらの同一の抗原は所定位置に
固定されており、そして抗原が抗体分子により小さいこ
とがあってさえ、細胞の中から外に洗浄除去されない。
最後に、固定された細胞上の細胞表面分子は無傷であ
り、そして１または２以上の抗体分子により免疫染色す
ることができ、白血球の機能的サブタイプの同定および
定量を提供する。

【００７６】実施例３ 細胞質の抗原への免疫染色への固定用組成物の作用 コンピューター補助された統計学的設計および分析を使
用する研究−（「ＳＥＤＡ」） 細胞質の抗原の染色への固定用組成物の作用を検査する
ために、ヒト細胞系を白血球の代わりに使用した。細胞
質の抗原の発現は均質であるので、細胞系を使用した。
したがって、陽性と記録された細胞の百分率の差、ある
いは個々の抗原の蛍光強度を、異種の細胞の型による抗
原の発現の差よりむしろ固定剤の組成の差に帰属させる
ことができた。

【００７７】Ｔ−細胞はそれらの細胞表面上でＣＤ３を
発現する。しかしながら、いくつかのＴ−細胞の組織培
養系統は細胞質のＣＤ３を発現するが、細胞表面のＣＤ
３をほとんどあるいはまったく発現しない（バ・ドンゲ
（Ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ）ら、血液（Ｂｌｏｏｄ）、７
１：６０３、１９８８）。ＣＥＭのＴ−細胞系は１つの
このような細胞系である；これは細胞質のＣＤ３をもつ
が、細胞表面のＣＤ３をもたない。ＣＥＭ細胞を増殖
し、種々の固定剤配合物で固定し、次いで抗ＣＤ３（Ｏ
ＫＴ３）、抗ゲルゾリンおよび抗ビメンチンと反応し
た。

【００７８】構成成分を蒸留したＨ₂Ｏに、コンピュー
ター補助された統計学的実験の設計により要求される濃
度に添加することによって、本発明の固定試薬を調製し
た（参照、表Ｅ３−１）。固定剤配合物は実験の前日に
調製し、そして暗所で室温において貯蔵した。試験する
固定剤に無関係に、固定の方法は次の通りであった：Ｃ
ＥＭ細胞を沈澱させ（４５７×ｇ、２１℃、８分）、次
いでＰＢＳ／Ｓの中で室温において遠心（４５７×ｇ、
２１℃、８分）により２回洗浄した。洗浄した細胞をＰ
ＢＳ／Ｓの中に２．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸
濁させた。細胞のプールを１ｍｌのアリコートに分割
し、次いで等しい体積の適当な固定試薬で希釈した。細
胞を混合し、そして室温において３０分間インキュベー
ションした。３０分後、固定した細胞を１０ｍｌの氷冷
ＰＢＳで２回洗浄した。すべての細胞をＰＢＳ／Ｓの中
でさらに１回洗浄し、次いで３．３×１０⁶細胞／ｍｌ
の濃度再懸濁させた。

【００７９】間接的免疫染色 細胞をＯＫＴ３およびマウスのモノクローナル抗体の抗
ゲルゾリン（クローンＮｏ．ＧＳ−２Ｃ４、シグマ・ケ
ミカル・カンパニー）および抗ビメンチン（クローン
Ｎｏ．Ｖ９、シグマ・ケミカル・カンパニー）と反応さ
せた。細胞質の抗原の免疫染色は、５μｌの対照ＩｇＧ
２ａマウス抗体（１５μｇ／ｍｌ）、または５μｌのＯ
ＫＴ３、または５μｌの抗ゲルゾリン（ＰＢＳ／Ｓの中
で１／４０に希釈した）または５μｌの抗ビメンチン
（ＰＢＳ／Ｓの中で１／３０に希釈した）を１００μｌ
の固定した細胞または生きている細胞の懸濁液に添加す
ることによって、実施した。細胞および抗体を０℃にお
いて１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの
中で２ｍｌ／洗浄を使用して２回洗浄した。最後の洗浄
後、上澄み液を吸引により除去し、そして細胞をＰＢＳ
／Ｓの中で１／７５に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−Ｆ
ＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カ
ンパニー）の２５０μｌを添加した。細胞を再び６０分
間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍ
ｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞
を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてＦ
ＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。

【００８０】統計学的実験の設計および分析（ＳＥＤ
Ａ）：コンピューター補助されたＳＥＤＡを使用して、
本発明をさらに最適化した。ＳＥＤＡを使用して、より
伝統的方法を使用して得るすることができるより多い情
報を所定の組の実験から得ることができた。

【００８１】ＳＥＤＡの理論的基礎は、１９６０年にお
いてＧ．Ｅ．Ｐ．ボックス（Ｂｏｘ）およびＤ．Ｗ．ベ
ンケン（Ｂｅｈｎｋｅｎ）により開発された［Ｂｏｘ、
Ｇ．Ｅ．Ｐ．およびＤ．Ｗ．Ｂｅｈｎｋｅｎ（１９６
０）。定量的変数の研究についての多少新規な３つのレ
ベルの設計。テクノメトリクス（Ｔｅｃｈｎｏｍｅｔｒ
ｉｃｓ ２：４５５−４７５。］ＳＥＤＡを使用するた
めに要求される主要なフレームコンピューターを使用し
たが、それは現在ＰＣ互換性ソフトウェアのパッケージ
として商業的に入手可能である。これらの研究において
使用したソフトウェアのパッケージは次の通りであっ
た：「Ｘ−スタト統計学的設計／データの分析／非線型
最適化（Ｓ−Ｓｔａｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｓｉｇｎ／Ｄａｔａ Ａｎ
ａｌｙｓｉｓ／ＮｏｎｌｉｎｅａｒＯｐｔｉｍｉｚａｔ
ｉｏｎ）」；ソフトパワー・インコーポレーテッド（Ｓ
ｏｆｔｏｐｏｗｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ジ
ョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーテッ
ド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）
から入手可能である。

【００８２】ＳＥＤＡの本質は、「伝統的」実験の設計
からの逸脱を表す。「伝統的」実験において、研究者は
まず結果を蓄積することができる、すべての重要なメカ
ニズムを同定する。次いで、研究すべき重要な変数およ
び測定すべき性能のパラメーターからリストを作る。細
胞の固定と同じように複雑な問題について、変数リスト
および測定した結果は長い。こうして、種々のパラメー
ターの包括的最適化はＳＥＤＡの使用によりいっそうよ
く達成される。例えば、３つの変数を研究すべきとき、
伝統的な設計は２つの変数を保持すべきであるが、３つ
は変化する。変数の間に線型の関係が存在しかつ変数が
完全に独立である場合、性能を予測できるようにするた
めに、各変数について２点のみにおいて測定を行う必要
がある。しかしながら、変数の間の関係が線型でなく、
変数は互いに相互作用するか、あるいはそれらの関係は
知られていない場合、各変数は３点の最小において評価
しなくてはならない。各変数について３点が存在する場
合にのみ、線型または非線型の関係が存在であるかどう
かを決定することができる。３レベルで３つの変数を試
験することは２７の別々の組み合わせを必要とする。こ
のアプローチを「完全な３つレベルの要因配置実験（ｆ
ｕｌｌ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌ ｆａｃｔｏｒｄｅｓ
ｉｇｎ）」と呼ばれる。完全な３つレベルの要因配置実
験における組み合わせの数は、変数の数が増加すると
き、指数的に増加する。４つの変数では、８１の組み合
わせが要求され、そして５つの変数は２４３の組み合わ
せを必要とする。結局、研究者は典型的には研究の範囲
を管理可能な数の変数に制限する。不都合なことには、
変数のいくつかのみを研究するとき、最終結果は基本的
には研究者が変数について研究することを決定したとき
賢く選択するかどうかにより決定される。

【００８３】ＳＥＤＡは実験の範囲内で要求される組み
合わせの数を減少することによって、多数のより多くの
変数を同時にに研究する可能性を研究者に提供する。３
つの変数を有する実験の実施例において、３つの変数を
Ｘ、ＹおよびＺと呼ぶ。実験の範囲内のＸ、ＹおよびＺ
について低から高までの値の範囲は立方体の次元を定義
するとして考えることができる；Ｘは幅を表し、Ｙは高
さを表し、そしてＺは深さを表す。完全な３つレベルの
要因配置実験において、立方体の各角およびすべての中
点における試験を必要とする（すべてにおいて２７実
験）。ボックス−ベンケン（Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ）
の設計は、立方体の各へりの中点を表す組み合わせのみ
を試験すること、および立方体の中央を表す組み合わせ
の３重の決定を必要とする。これは２７〜１５の数の組
み合わせを必要とする。ボックス−ベンケン（Ｂｏｘ−
Ｂｅｈｎｋｅｎ）の設計は、変数の数が増加するにつれ
て、劇的となる。ボックス−ベンケン（Ｂｏｘ−Ｂｅｈ
ｎｋｅｎ）の設計は４つの変数について２７の組み合わ
せおよび５つの変数について４６の組み合わせを必要と
するだけである；これに対して３つレベルの要因配置実
験についてそれぞれ８１および２４３の組み合わせを必
要とする。さらに、データを集め、そしてコンピュータ
ーが観測された実験結果に相当する数学的モデルを選択
した後、ＳＥＤＡを使用して、立方体の表面上または体
積内の任意の点におけるアッセイの性能を予測すること
ができる。

【００８４】実験はＳＥＤＡを使用して設計した。ファ
イルをつくり、ここで研究すべき変数（例えば、ホルム
アルデヒド、ＤＮＢＳ、ＤＭＳＯおよび洗浄剤の濃度）
および測定すべき性能（すなわち、細胞質および表面の
抗原の染色）をコンピューターに入れた。各変数の上限
および下限を特定した後、ソフトウェアは実験内の各
「試験」についての各変数の濃度を決定した（参照、表
Ｅ３−１）。次いで試験を不規則の順序に配置した。実
験の実験室の部分を完結した後、各試験に相当する測定
した性能をコンピューターに入れた。コンピューターは
性能について最大の作用を有する変数、作用をもたない
変数、および相乗的に相互作用する変数を決定した。回
帰腺を線型の相互作用の２次方程式を使用して実験デー
タに適合させた。データに対して最良の適合を与える数
学的モデルを選択し、そしてそれが実験結果をどうれだ
けよく予測するかを注意して検査した。

【００８５】コンピューターのモデルを使用して、試験
した各変数の範囲内の任意の濃度または濃度の任意の組
み合わせにおけるアッセイの性能を予測することができ
た。この可能性を使用して、試薬の濃度の無数の組み合
わせをコンピューターのシミュレーションにより試験し
た。これらの可能性は固定剤配合物をシミュレーション
して細胞質の抗原の染色を可能としたか、あるいはある
場合において細胞表面の抗原の染色に対してなされた損
傷の程度を予測した。さらに、最小の性能の基準を設定
し、そしてソフトウェアにおけるアルゴリズムを使用し
て試薬濃度の最適な組み合わせを計算して、任意の所定
の所望の性能を達成した。いったん最適化されると、１
つを除外してすべての変数をそれらの最適なレベルに保
持することをコンピューターに指示した。次いで、１つ
の変数をその全体の範囲にわたって変化させ、そして性
能についてのその作用をプロットした。

【００８６】すべての３つの細胞質の抗原の染色は試験
した試薬のすべての濃度において観察された；しかしな
がら、観測された実験結果のコンピューターの分析は、
０．７５６％のホルムアルデヒド、２５．４ｍＭのＤＮ
ＢＳ、６．９２％のＤＭＳＯおよび０．０８６％のツイ
ーン２０洗浄剤からなる好ましい実施態様を予測した。
このコンピューターが予測した好ましい実施態様は実験
室の固定実験により示される好ましい実施態様に極めて
類似し、ここで関係する成分の濃度は０．８５％のホル
ムアルデヒド、３０ｍＭのＤＮＢＳ、６．９％のＤＭＳ
Ｏおよび０．０９５％のツイーン２０洗浄剤である。後
者の固定用組成物を全血について試験したが、コンピュ
ーターのモデル化はＣＥＭ細胞系に基づいた。好ましい
実施態様に相当する各試薬の濃度をコンピューターのモ
デルに入れた。ホルムアルデヒドの濃度がＯＫＴ３によ
る細胞質のＣＤ３の染色の蛍光強度にどのように影響を
与えるかについてコンピューターが発生したプロットが
証明したように、固定剤のすべての他の構成成分がそれ
らの最適な濃度にとどまっている場合でさえ、ホルムア
ルデヒドの濃度が０．８０％を越えるにつれて、蛍光強
度は急速に減少する。他のプロットは、固定剤の中の３
つの他の活性成分の作用を証明した。各グラフのＸ軸お
よびＹ軸が異なることに注意することが重要である。ホ
ルムアルデヒドのプロットのＹ軸は５０単位の平均の蛍
光強度の範囲をカバーするが、洗浄剤のプロットのＹ軸
は４００単位の範囲をカバーする。試験した濃度範囲に
わたって、洗浄剤は細胞質のＣＤ３の検出について最大
の作用を有した；次いでＤＭＳＯ、ＤＮＢＳおよびホル
ムアルデヒドの順であった。洗浄剤、ＤＭＳＯおよびＤ
ＮＢＳのすべてはＣＥＭ細胞におけるＣＤ３の検出を改
良する働きをした。ホルムアルデヒドは０．８０％より
大きい濃度においてＣＤ３の検出に悪影響を及ぼした。
ゲルゾリンの細胞質の染色に影響を及ぼす因子のコン
ピューター分析をまた実施した。ゲルゾリンの検出は、
この実験において試験したホルムアルデヒドの濃度に対
して不感受性であった。適度の増加はホルムアルデヒド
濃度の増加で予測されたが、予測された増加は実験誤差
の範囲内であった。同一の事柄がＤＮＢＳに当てはまる
ことがある。したがって、試験したＤＮＢＳ濃度の範囲
にわたって、ＤＮＢＳはＣＥＭ細胞の中のゲルゾリンの
検出にほとんど効果をもたないことが発見された。ＤＭ
ＳＯの濃度は最大の陽性の作用を有した；平均の蛍光を
推定された１６０単位に増加した。洗浄剤の濃度は蛍光
を推定された１１０単位に増加した。

【００８７】ビメンチンの細胞質の染色に影響を及ぼす
因子のコンピューター分析をまた実施した。ビメンチン
の検出は、この実験において試験したホルムアルデヒド
の濃度に対して非常に感受性であった。推定された２５
０単位の平均の蛍光強度の減少が発見された。２５ｍＭ
より大きいＤＮＢＳの濃度は、２００単位程度に多くだ
け平均の蛍光を増加すると推定された。ＤＭＳＯはまた
ビメンチンの検出を改良し、平均の蛍光を推定された１
５０単位に増加した。４．５％以上のＤＭＳＯ濃度は、
ＣＥＭ細胞の中のビメンチンの検出を有意に促進または
害するように思われた。洗浄剤の濃度が０．０４％から
ほぼ０．０８％に増加したとき、４００単位の平均の蛍
光の増加が推定された。ビメンチンの検出を改良するた
めに、より高い濃度は予測されなかった。

【００８８】コンピューターのモデルの予測を末梢血液
のリンパ球について評価した。健康なドナーからの白血
球をＰＢＳ／Ｓの中に洗浄するか、あるいは０．７５５
％のホルムアルデヒド、７％のＤＭＳＯ、０．０８％の
ツイーン２０および０、１９．６または３８ｍＭのＤＮ
ＢＳの最終試薬濃度において固定した。すべての細胞を
室温において３０分間固定し、次いで洗浄した。固定し
た細胞または生きている細胞の集団からのすべての赤血
球を塩化アンモニウムにより除去した。次いで、前述し
たように、間接的免疫染色および抗体、抗ゲルゾリンお
よび抗ビメンチンを使用して、白血球を免疫染色した。

【００８９】末梢血液のリンパ球の中の細胞質のゲルゾ
リンおよびビメンチンを検出する可能性についての固定
の効果を、表Ｅ３−２に示す。抗ゲルゾリンまたは抗ビ
メンチンを使用して生きている細胞の０．５％より少な
くが染色した。しかしながら、固定したリンパ球の８０
〜９０％がこれらの抗原に対して陽性に染色された。固
定の間のＤＮＢＳの濃度は、抗ゲルゾリンまたは抗ビメ
ンチンに結合した細胞の百分率に影響を与えなかった。
この実験において抗ゲルゾリンおよび抗ビメンチンにつ
いての蛍光のレベルはＣＥＭ細胞についてより非常に低
かったが、コンピューターのシミュレーションの予測と
良好に一致した。ＤＮＢＳはゲルゾリンの保持および検
出に対する効果をほとんどあるいはまったくもたない
が、ビメンチンの検出を改良した。ＤＮＢＳの存在下に
固定が抗ビメンチン反応性細胞の平均の蛍光をどれだけ
増加するかは知られていない。抗ビメンチンはモノクロ
ーナル抗体であるので、他の抗体の特異性の結合に導く
のは、ＤＮＢＳによるエピトープのアンマスキングのた
めではない。その代わり、この結果が示唆するように、
ＤＮＢＳが固定の間に存在しないとき、ＤＮＢＳは抗体
にアクセス可能でない細胞の領域におけるビメンチンへ
のアクセスを改良することができるか、あるいはＤＮＢ
Ｓは固定された細胞内に保持されるビメンチンの量を増
加する。それが抗体の改良されたアクセスまたは抗原の
改良された保持であるかどうかにかかわらず、これらの
結果はいくつかの抗原についてのＤＮＢＳの存在におけ
る固定の追加の利益を確証し、そして末梢の血球の中の
これらの抗原の挙動を包含するようにコンピューターの
モデルの有効性を拡張した。

【００９０】これらの結果が示すように、固定および各
個々の抗原についての検出を最も改良した本発明の活性
成分の組み合わせは前以て予測することができなかっ
た。各個々の活性成分は同一の方法ですべての抗原に影
響を及ぼさなかった。ゲルゾリンの検出はＤＭＳＯ濃度
を増加することによって最も改良された；これに対し
て、細胞質のＣＤ３およびビメンチンの検出は洗浄剤濃
度を増加することによって最も改良された。ビメンチン
および細胞質のＣＤ３の検出はＤＮＢＳ濃度を増加する
ことによって改良されるが、ゲルゾリンの検出はＤＮＢ
Ｓにより有意に影響を受けなかった。これらの結果に基
づいて、他の抗原、すなわち、細胞質または細胞表面の
抗原が存在し、それらの固定は他のものを越えて活性成
分のあるものによりいっそう強く影響を受けることを推
測することは合理的である。しかしながら、固定された
後、抗原が保存または破壊されるかどうかを予測するこ
とはまだ不可能である。また、活性成分のどれが固定後
の抗原の構造の保存のために優性な成分であるかを予測
することは不可能である。さらに、このデータが確立す
るように、細胞質の抗原の染色は種々の成分の不存在ま
たは低い濃度においてさえ起こるが、染色は多くの場合
においてＤＮＢＳの使用および他の活性成分の１または
２以上の濃度の増加により改良される。

【００９１】

【表１】

【００９２】

【表２】

【００９３】実施例４ 本発明の固定用組成物の調製において、異なる洗浄剤を
使用した。洗浄剤は組成が異なるばかりでなく、かつま
た化合物の明確なクラスを表す。本発明の固定剤は従来
記載されてきているようにして調製したが、ただしこの
実験において、洗浄剤および洗浄剤の濃度を変化させ
た。使用した洗浄剤はポリオキシエチレンエーテルＷ−
１（ポリオックス）、ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノラウレート（ツイーン２０）、モノパルミテート（ツ
イーン４０）、モノオレエート（ツイーン８０）および
ポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３
５）であった。よく働く他の洗浄剤はノニデットｐ−４
０、トリトンＸ−１００、ナトリウムデオキシコレート
およびサポニンを包含する。

【００９４】この実施例において、健康なドナーからの
全血をＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させるか、あるいは等し
い体積の固定試薬で室温において３０分間固定した。固
定した細胞または生きている細胞の集団からのすべての
赤血球を塩化アンモニウム溶解により除去し、そして白
血球をＰＢＳ／Ｓの中で遠心（４５７×ｇ、２１℃、８
分）により２回洗浄した。次いで白血球を間接的免疫染
色手順および抗体の抗ビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ
９、シグマ・ケミカル・カンパニー）で免疫染色した。

【００９５】Ｔ−細胞の組織培養系統ＣＥＭを末梢血球
に加えて使用した。試験する固定剤に無関係に、固定方
法は次の通りであった。ＣＥＭ細胞を沈澱させ（４５７
×ｇ、２１℃、８分）、次いでＰＢＳ／Ｓの中で室温に
おいて遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により２回洗
浄した。洗浄した細胞をＰＢＳ／Ｓの中に２．５×１０
⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞のプールを１
ｍｌのアリコートに分割し、次いで等しい体積の適当な
固定試薬で希釈した。細胞を混合し、そして室温におい
て３０分間インキュベーションした。３０分後、固定し
た細胞を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いで
すべての細胞をＰＢＳ／Ｓの中に３．３×１０⁶細胞／
ｍｌの濃度に再懸濁させた。

【００９６】間接的免疫染色 細胞をマウスのモノクローナル抗体の抗ゲルゾリン（ク
ローンＮｏ．ＧＳ−２Ｃ４、シグマ・ケミカル・カンパ
ニー）および抗ビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ９、シグ
マ・ケミカル・カンパニー）と反応させた。５μｌの対
照ＩｇＧ２ａマウス抗体（１５μｇ／ｍｌ）、または５
μｌの抗ゲルゾリン（ＰＢＳ／Ｓの中で１／１００に希
釈した）または５μｌの抗ビメンチン（ＰＢＳ／Ｓの中
で１／６０に希釈した）を固定した細胞または生きてい
る細胞の懸濁液に添加することによって、細胞質の抗原
の免疫染色を実施した。細胞および抗体を０℃において
１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で
２ｍｌ／洗浄を使用して２回洗浄した。最後の洗浄後、
上澄み液を吸引により除去し、そして細胞をＰＢＳ／Ｓ
中で１／７５に希釈した２５０μｌのヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカ
ル・カンパニー）の中に再懸濁させた。細胞を再び氷上
で６０分間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓ中
で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄
後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、
そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析し
た。

【００９７】生きているおよび固定した両者の細胞の免
疫染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析し
た。生きているおよび固定した両者の細胞について、リ
ンパ球、単球および顆粒球をもっぱらそれらの光散乱性
質に基づいて同定した。

【００９８】ポリオキシエチレンエーテルまたはＢｒｉ
ｊ^R３５洗浄剤の添加は、抗ビメンチンに結合した固定
した細胞細胞の百分率の投与量依存性増加に導く。この
細胞質のアクセスの増加はすべての３つの細胞の型を使
用して見られた。よりおおくの対照の抗体は、リンパ球
に対してより、単球および顆粒球に非特異的に結合し
た。単球および顆粒球を使用して見られた増大した背景
の染色は、特異的結合と非特異的結合との間のカットオ
フをこれらの細胞の集団より高くに配置することを必要
とする。これは、同一に処理したリンパ球より、一般に
低い百分率の単球および顆粒球が抗体に結合するように
思われる理由を一部分説明している。ポリオックスは重
量基準でＢｒｉｊ^R３５おり活性であった。これらの洗
浄剤付近で固定試薬の配合物を最適化することを試みな
かった。ポリオックスは、細胞の透過性化試薬として非
常に活性であるが、顆粒球および単球のＦＳＣに対して
顕著な作用を有した。ツイーン系列のポリオキシエチレ
ンソルビタン洗浄剤を検査した。なぜなら、それらの構
造はポリオックスに類似するが、それらはおだやかな洗
浄剤である傾向があるからである。ＣＥＭ細胞を使用す
る実験の結果を表Ｅ４−２に示す。細胞質の抗原のゲル
ゾリンおよびビメンチンに対する抗体と反応した細胞の
百分率の投与量依存性増加は、すべての３つの洗浄剤で
見られた。細胞質の抗原を検出する可能性は固定してい
る細胞ばかりでなく、かつまた固定の時の洗浄剤の濃度
に依存した。ツイーン２０は最大の陽性の細胞の百分率
を与え、次いでツイーン８０および最後にツイーン４０
であった。

【００９９】これらのデータは確証するように、細胞質
の抗原の免疫学的検出は細胞を固定することを必要とす
る。固定単独は細胞質の抗原を免疫学的に検出する制限
した可能性のみを付与するであろう。細胞質の抗原の検
出は細胞の洗浄剤の処理により大きく改良される。そし
て固定および洗浄剤の処理は単一工程で同時に実施する
ことができる。固定、引き続く別々の透過性化工程は細
胞質の抗原の連続する保持および検出に要求されない。
これらのデータがさらに支持するように、広い範囲の洗
浄剤を細胞の透過性化の目的で使用することができる。
これらの結果から、好ましい実施態様の洗浄剤はその意
図する用途に依存して変化することができると推測する
ことは合理的である。意図する用途がすぐれた細胞の透
過性化を必要とするが、顆粒球のＦＳＣの保存を必要と
しない場合、ポリオックスは好ましい洗浄剤であること
がある。さらに、ある用途は所望の性能を達成するため
に１より多い洗浄剤の組み合わせを必要とすることがあ
ることが予測される。

【０１００】

【表３】

【０１０１】

【表４】

【０１０２】実施例５ 感染した細胞の中のヒト免疫欠損ウイルスの検出 ウイルスを細胞内で増殖させた。ウイルス粒子を構成す
る核酸およびタンパク質を感染した細胞により生産さ
れ、そして細胞の中に蓄積する。ウイルスが転写的に活
性である場合、感染した細胞の中のウイルスのタンパク
質の存在を検出できるであろう。ヒト免疫欠損ウイルス
（ＨＩＶ）は多数のタンパク質を生産する。タンパク質
のあるものはウイルスの遺伝子の発現を調節し、そして
あるものはウイルスのコアおよびエンベロープを構成す
る構造タンパク質である。タンパク質ｐ２４はＨＩＶ感
染した細胞が過剰に生産する構造タンパク質である。細
胞の中で複製するウイルスを検出する可能性は、ＨＩＶ
により引き起こされる病気、後天性免疫欠損症候群（エ
イズ）の検出および監視において臨床的意味を有するこ
とができる。ＨＩＶ感染した個体におけるウイルスの負
荷は病気の進行および予後に関係する。過去において、
そして本発明の背景において前述したように、ウイルス
の負荷は培養、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または
ｐ２４のイムノアッセイにより監視されてきている。Ｈ
ＩＶの培養およびＰＣＲは経費のかかる特殊化された試
験であり、ほとんどの臨床的実験室の環境に適用不可能
である。ｐ２４のアッセイはＨＩＶ感染した個体におい
てしばしば陰性である。なぜなら、ｐ２４と患者自身の
抗体との間の免疫複合体が商用アッセイキットにおいて
ｐ２４の捕捉を妨害するからである。

【０１０３】本発明の試薬および方法を使用して感染し
た細胞の中のウイルスのｐ２４を検出できるかどうかを
決定するために、ＨＩＶ感染した組織培養の細胞および
ＨＩＶ感染した個体からの末梢血液のリンパ球を検査し
た。ヒト組織培養の細胞系Ｈ９はＨＩＶの増殖を支持す
ることができる。非感染のＨ９細胞は、ナショナル・イ
ンスチチューツ・オブ・ヘルスズ・エイズ・リサーチ・
アンド・レファランス・リエイジェント・プログラム
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈ
ｅａｌｔｈ’ｓ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａ
ｍ）から入手した。ＨＩＶで持続的に感染したＨ９細胞
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ
ｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。非感染および持続的
に感染したＨ９細胞を、１０％の胎児子ウシ血清を補充
したＲＰＭＩ１６４０の中で増殖させた。培養物を少な
くとも１回／週継代した。ＨＩＶで感染したことが知ら
れている３人の個体からの血液を入手し、そして固定前
にＥＤＴＡの中で室温において２４以下の間貯蔵した。
固定後、細胞を−２０℃において貯蔵し、ＨＩＶのｐ２
４のアッセイのとき融解した。

【０１０４】固定試薬を２×濃縮物として調製し、固定
すべき細胞懸濁液の等しい体積で希釈することを意図し
た。２×固定試薬は１．４４％のホルムアルデヒド、７
３．０ｍＭのＤＮＢＳ、１５．０％のＤＭＳＯおよび５
０μＭ（０．００６％）のＮＰ４０洗浄剤をリン酸塩緩
衝液ｐＨ７．２の中に含有した。固定剤を琥珀色ガラス
びんの中に室温において必要となるまで貯蔵した；通常
５日以下。非感染および持続的に感染したＨ９細胞を沈
澱させ（４５７×ｇ、２１℃、８分）、次いでＰＢＳの
中で室温において遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）に
より１回洗浄した。洗浄した細胞をＰＢＳの中にほぼ１
×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次いで細胞
を等しい体積の固定試薬で希釈した。細胞を混合し、そ
して室温において６０分間インキュベーションした。６
０分後、固定した細胞を１０％の胎児子ウシ血清および
２％のヒトＡＢ血清（ＰＢＳ／Ｓ）を補充した１０ｍｌ
の氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで１×１０⁶細胞／ｍ
ｌの濃度に再懸濁させた。

【０１０５】非エイズ関係病院の患者およびＨＩＶで感
染していることが知られている３人のドナーの各からの
全血を、等しい体積の固定試薬と６０分間混合した。室
温において６０分後、固定した血液を氷冷ＰＢＳ／Ｓの
中で２回洗浄した。すべての赤血球を塩化アンモニウム
の溶解により除去した。次いで白血球を間接的免疫染色
手順を使用して免疫染色した。

【０１０６】間接的免疫染色 ２００μｌの細胞懸濁液を、ＰＢＳ／Ｓの中で１：４０
に希釈したＨＩＶのｐ２４に対するマウスのモノクロー
ナル抗体（９Ａ１Ｂ２、オルト・ダイアグノスチック・
システムス）、またはＰＢＳ／Ｓの中で１：４０に希釈
したウサギのポリクローナル抗ｐ２４抗体（Ｃｈｉｒｏ
ｎ、エメリビレ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニ
ア州）の２０μｌとインキュベーションした。細胞およ
び抗体を０℃において１時間インキュベーションし、次
いでＰＢＳ／Ｓの中で２回洗浄した。最後の洗浄後、上
澄み液を吸引により除去し、そして細胞をＰＢＳ／Ｓの
中で１／７５に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ
接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニ
ー）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ
（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）の２０
０μｌの中に再懸濁した。細胞を再び氷上で６０分間イ
ンキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で３回洗浄
した。陰性の対照として使用した細胞をＩｇＧ２ａ対照
マウス抗体、正常のウサギ血清、または抗体まったくな
しとインキュベーションした。次いで細胞をヤギ抗マウ
スＩｇＧ−ＦＩＴＣまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴ
Ｃとインキュベーションした。最後の洗浄後、細胞を１
ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてサイトフル
オログラフＣ５０フローサイトメーターで分析した。

【０１０７】感染した細胞の中でＨＩＶ ｐ２４を検出
する可能性は、非感染Ｈ９および持続的に感染したＨ９
の組織培養の細胞を使用して明白に証明された（図４
ａ、図４ｂ、図５ａおよび図５ｂ）。図４ａおよび図４
ｂは抗２４モノクローナル抗体と反応した非感染の細胞
である。図４ａにおいて、Ｘ軸はＦＳＣまたは細胞の大
きさであり、そしてＹ軸は抗ｐ２４染色の蛍光強度であ
る。データは等高線プロットとして表されている。等高
線プロットはこの明細書の中のどこかに表されている３
次元の表示に類似する。等高線プロットの場合におい
て、Ｚ軸または細胞の数は紙に対して垂直である。観察
者はデータを事象のクラスターによりつくられた「山」
をあたかも真下に見るように眺める。地質学的レリーフ
マップを使用するときのように、等高線は規則的な間隔
におけるピークを通したスライスを表す。図４ｂは細胞
の数／相対蛍光強度；最大強度の百分率として表されて
いる；をプロットするヒストグラムである。非感染のＨ
９細胞についての平均の蛍光強度の対数は０．７５であ
った。Ｈ９細胞の１．２％のみは１．０より大きい蛍光
強度を有した。しかしながら、図５ａおよび図５ｂに見
られるように、持続的にＨＩＶ感染した細胞を抗ｐ２４
で処理したとき、蛍光強度の顕著な増加が存在した。感
染したＨ９細胞についての平均の蛍光強度の対数は３．
２７であった；そしてＨ９細胞の８６．２％は１．０よ
り大きい蛍光強度を有した。感染した細胞内のｐ２４に
対する抗ｐ２４の結合は、また、図５ｂに示す、蛍光強
度のヒストグラムにより証明され、ここで感染した細胞
を使用したとき右にシフトする。

【０１０８】図６ａ、図６ｂ、図６ｃおよび図６ｄは、
ＨＩＶ感染した個体および非感染の対照の個体からの血
液を試験したときの結果を示す。側面の散乱をＸ軸にプ
ロットし、そして抗ｐ２４の蛍光強度をＹ軸にプロット
した。側面の散乱単独はこの実験において単球と顆粒球
とを分割することができなかった。これは細胞が凍結さ
れておりそしてアッセイ前に融解されたことにある可能
性が最も強い。患者の細胞を凍結せずそして使用前に融
解しなかったとき、光散乱はＨＩＶ感染した患者および
エイズの患者の固定したリンパ球、単球および顆粒球を
弁別することができ、ならびに非感染の個体についてそ
れは可能であった。図６ａは対照のＨＩＶ非感染の病院
の患者についての結果を示す。左のリンパ球のクラスタ
ーまたは右の単球−顆粒球のクラスターにおいて細胞へ
の抗ｐ２４抗体の結合の証拠は存在しない。図６ｂはＣ
ＤＣ段階ＩＩＩとして分類されそして薬物ジドブジン
（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）（ＡＺＴ）を取った個体から
の結果を示す。リンパ球のクラスターの分布は対照の細
胞と比較して上方にそれる。ある数のリンパ球はこの患
者において低いレベルの抗ｐ２４と結合した。さらに、
小さい数の鮮明に染色する単球のクラスターはこの患者
において明瞭に明らかである。図６ｃは病気がＣＤＣ段
階ＩＶに進行した個体の結果を示す。この個体は血液を
抜き出したとき口腔のカンジダ症に悩んでいた。この患
者において、リンパ球のクラスターは抗ｐ２４結合に対
して完全に陰性であった。顆粒球はまたウイルスのタン
パク質を含まないように思われたが、患者の単球の衝撃
的な包含が存在した。最後に、図６ｄは完全に頂点に達
したエイズの患者の結果を示す。この個体は薬物処置の
結果として末梢のニューロパシー発現し、そして抗レト
ロウイルスの化学療法から除去しなくてはならなかっ
た。多数のリンパ球、単球および顆粒球はこの患者にお
いて抗ｐ２４抗体に結合したことが明らかであった。多
数の細胞は抗ｐ２４と非常に多く結合したので、それら
の蛍光は目盛りを越えていた。

【０１０９】これらの結果が証明するように、本発明の
方法および試薬は感染した細胞内のウイルスのタンパク
質の免疫学的検出に使用することができる。細胞上の表
面の弁別マーカーは本発明の方法および試薬により保存
されるが、同時にまた内部の抗原への抗体のアクセスを
提供する。細胞表面の弁別マーカーに対する抗体および
内部の抗原、例えば、ＨＩＶ構造タンパク質に対して抗
体を含有する抗体の混合物を調製することができる。例
えば、抗ＣＤ４−ＰＥを抗ｐ２４−ＦＩＴＣと混合する
ことができる。このような抗体の混合物をＨＩＶ感染し
た個体からの細胞と反応させ、そしてフローサイトメー
ターで検査した場合、どれだけ多くのＣＤ４陽性細胞を
個体が有したかばかりでなく、かつまたＣＤ４陽性のど
れだけ多くがウイルスのｐ２４抗原を発現していたかを
決定することができるであろう。このような情報はＨＩ
Ｖ感染の臨床的管理において予後または治療の価値を有
することができる。当業者とって明らかなように、この
原理は他の固有または外因の細胞抗原に拡張することが
でき、そしてＨＩＶまたは外因の病原体に全く限定され
ない。

【０１１０】実施例６ ウイルスの不活性化の置換 家兎痘ウイルス 本発明の固定剤配合物および固定法を生きているウイル
スを不活性化する能力ついて試験した。３つのウイルス
を研究のために選択した；家兎痘ウイルス、シミアンウ
イルス４０（ＳＶ４０）およびヒト免疫欠損ウイルス１
型（ＨＩＶ−１）。これらの研究について、固定剤は次
の成分を含有した：１．４４％（ｗ／ｖ）のホルムアル
デヒド、７３ｍＭのジニトロベンゼンスルホン酸、５０
μＭのノニデットｐ−４０および１５％（ｖ／ｖ）のジ
メチルスルホキシド。

【０１１１】家兎痘のウトレヒト（Ｕｔｒｅｃｈｔ）株
（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５７）をターゲットウイルスとし
て使用した。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ
８１）をウイルスを増殖するための宿主細胞として使
用した。ベロ細胞を家兎痘ウイルスで感染させ、そして
２４時間インキュベーションした。ほぼ３×１０⁷の感
染した細胞を洗浄し、次いで１．０ｍｌの細胞不含家兎
痘ウイルスの中に再懸濁させた。次いでこの混合物を
１．０ｍｌの胎児子ウシ血清で希釈して、５０％の血清
の混合物を形成した。０．１ｍｌの試料を取り出して合
計のウイルスの負担（ｖｉｒａｌ ｂｕｒｄｅｎ）を試
験した；この試料を「ウイルスの負荷（Ｖｉｒａｌ Ｌ
ｏａｄ）」と標識した。ウイルス／細胞の懸濁液の残部
（１．９ｍｌ）を１．９ｍｌの固定剤と混合した。０．
１ｍｌの試料を直ちに取り出し、そしてＥＭＥＭ＋５％
のトリプトースホスファターゼブロス（ＴＳＢ）の中で
１：３０に希釈した。これはＴ＝０を表した。この懸濁
液の残部を室温において３０分間インキュベーションし
た。３０分において、０．１ｍｌの試料を再び取り、そ
してＥＭＥＭ＋５％のＴＳＢの中で１：３０に希釈し、
これはＴ＝３０の試料を表した。Ｔ＝０およびＴ＝３０
の両者の試料を遠心して細胞を沈澱させた。上澄み液を
取り出し、そして氷上に保持し、その間細胞の沈澱を２
ラウンドの凍結および融解にかけて細胞を溶解し、そし
て細胞関連ウイルスを解放した。上澄み液を溶解した細
胞沈澱と再び組み合わせ、そして遠心により清浄化して
細胞の破片を除去した。遊離のおよび解放させたウイル
スを含有する得られる上澄み液を系統的に希釈し、そし
てコンフルエントに増殖した非感染のベロ細胞を含有す
る皿に０．１ｍｌの試料を接種した。ベロ細胞の培養物
を３６℃において９０分間インキュベーションして、存
在する生きているウイルスを細胞に感染させた。次いで
培養物を洗浄してウイルスの接種物を除去し、アガロー
スを含有する媒質をオーバーレイし、そしてインキュベ
ーションした。形成したプラーク数を計数することによ
って、ウイルスの増殖を定量した。すべての培養物を適
当な陽性および陰性の対照で構成した；そして結果をプ
ラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ／ｍｌ）の数として表
す。

【０１１２】

【表５】

【０１１３】固定剤で処理した試料の合計のウイルスの
負担は４．９×１０⁷であった（表Ｅ６−１）。Ｔ＝０
の試料において３．２×１０⁶ＰＦＵ／ｍｌへの減少に
より理解されるように、固定剤との接触のとき直ちに１
対数より多くが不活性化された。固定剤の処理の３０分
後、生活可能な家兎痘ウイルスを検出することができな
かった。細胞関連ウイルスでさえ殺されたことは意味が
ある；殺ウイルス濃度の固定剤はベロ細胞を浸透するこ
とができたことを示唆する。

【０１１４】ＳＶ４０ウイルスの不活性化 ＳＶ４０のＰＡ−５７株をターゲットウイルスとして使
用した。ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）をウ
イルスを増殖するための宿主細胞として使用した。ＣＶ
−１細胞をＳＶ４０ウイルスで感染させ、そして７２時
間インキュベーションした。ほぼ２×１０⁷の感染した
細胞を洗浄し、次いで１．０ｍｌの細胞不含ＳＶ４０ウ
イルスの中に再懸濁させた。次いでこの混合物を１．０
ｍｌの胎児子ウシ血清で希釈して、５０％の血清の混合
物を形成した。０．１ｍｌの試料を取り出して合計のウ
イルスの負担を試験した；この試料を「ウイルスの負
荷」と標識した。ウイルス／細胞の懸濁液の残部（１．
９ｍｌ）を１．９ｍｌの固定剤と混合した。０．１ｍｌ
の試料を直ちに取り出し、そしてＥＭＥＭ＋５％のＴＳ
Ｂの中で１：３０に希釈した。これはＴ＝０を表した。
この懸濁液の残部を室温において３０分間インキュベー
ションした。３０分において、０．１ｍｌの試料を再び
取り、そしてＥＭＥＭ＋５％のＴＳＢの中で１：３０に
希釈し、これはＴ＝３０の試料を表した。Ｔ＝０および
Ｔ＝３０の両者の試料を遠心して細胞を沈澱させた。上
澄み液を取り出し、そして氷上に保持し、その間細胞の
沈澱を２ラウンドの凍結および融解にかけて細胞を溶解
し、そして細胞関連ウイルスを解放した。上澄み液を溶
解した細胞沈澱と再び組み合わせ、そして遠心により清
浄化して細胞の破片を除去した。遊離のおよび解放させ
たウイルスを含有する得られる上澄み液を系統的に希釈
し、そしてコンフルエントに増殖した非感染のＣＶ−１
細胞を含有する皿に０．１ｍｌの試料を接種した。ＣＶ
−１細胞の培養物を３６℃において９０分間インキュベ
ーションして、存在する生きているウイルスを細胞に感
染させた。次いで培養物を洗浄してウイルスの接種物を
除去し、アガロースを含有する媒質をオーバーレイし、
そしてインキュベーションした。形成したプラーク数を
計数することによって、ウイルスの増殖を定量した。す
べての培養物を適当な陽性および陰性の対照で構成し
た；そして結果をプラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ／ｍ
ｌ）の数として表す。

【０１１５】

【表６】

【０１１６】固定剤はＳＶ４０を不活性化したが、家兎
痘ウイルスより低い程度であった。固定剤の成分の濃
度、インキュベーション時間などを調節して、ウイルス
の不活性化の能力を増大することができるであろう。試
験した固定剤配合物による３０分の処理で、最大１ｌｏ
ｇのウイルスが不活性化された。

【０１１７】ＨＩＶ−１ウイルスの不活性化 ＨＩＶ−１のＨＴＬＶ−ＩＩＩ−Ｂ株をターゲットウイ
ルスとして使用した。ＭＴ−４細胞をウイルスを増殖す
るための宿主細胞として使用した。ＭＴ−４細胞をＨＩ
Ｖ−１ウイルスで感染させ、そして４８時間インキュベ
ーションした。ほぼ８×１０⁶の感染した細胞を洗浄
し、次いで０．８ｍｌの細胞不含ＨＩＶ−１ウイルスの
中に再懸濁させた。次いでこの混合物の０．４ｍｌを
０．４ｍｌの胎児子ウシ血清で希釈して、５０％の血清
の混合物を形成した。０．１ｍｌの試料を取り出して合
計のウイルスの負担を試験した；この試料を「ウイルス
の負荷」と標識した。ウイルス／細胞の懸濁液の残部
（０．７ｍｌ）を０．７ｍｌの固定剤と混合した。０．
１ｍｌの試料を直ちに取り出し、そしてＲＰＭＩ１６４
０＋１０％のＦＢＳの中で１：３００に希釈した。これ
はＴ＝０を表した。この懸濁液の残部を室温において３
０分間インキュベーションした。３０分において、０．
１ｍｌの試料を再び取り、そしてＲＰＭＩ１６４０＋１
０％のＦＢＳの中で１：３００に希釈し、これはＴ＝３
０の試料を表した。Ｔ＝０およびＴ＝３０の両者を系統
的に希釈し、そして非感染のＭＴ−４細胞を含有する皿
に０．１ｍｌの試料を接種した。ＭＴ−４細胞の培養物
を洗浄して接種物を除去しなかったが、１．０ｍｌの培
地を除去し、それを新鮮な１．０ｍｌと置換することに
よって培養物に２回／週供給した。培養物を接種後第
７、１４および２８日に細胞変性作用（ＣＰＥ）の存在
について検査した。細胞変性作用は、ウイルスの増殖の
結果として起こる感染した細胞に対する形態学的変化で
ある。さらに、７、１４および２８日の培養物からの上
澄み液を集め、そしてＨＩＶ−１特異的ウイルスのｐ２
４タンパク質の存在についてアッセイした。

【０１１８】すべての培養物を適当な陽性および対照の
対照で構成した；そしてＣＰＥを含有する接種したウェ
ルの百分率またはｐ２４タンパク質について陽性のウェ
ルの百分率として表す。組織培養の感染投与量₅₀（ＴＣ
ＩＤ₅₀）／ｍｌを、式ＴＣＩＤ₅₀＝Ａ−（Ｓ_I／１００
−０．５）×Ｂを使用して計算した；ここでＡ＝接種し
た最高濃度のｌｏｇ₁₀、Ｓ_I＝各希釈において陽性の百
分率の合計、そしてＢ＝希釈倍数のｌｏｇ₁₀である。

【０１１９】

【表７】

【０１２０】

【表８】

【０１２１】室温において３０分間の固定剤による処理
はＨＩＶ−１のＴＣＩＤ₅₀の４と５ｌｏｇとの間で不活
性化した。この処理により不活性化しないウイルスはそ
の増殖の反応速度論に関して有意に障害された。表Ｅ６
−３から理解できるように、第２８日に、Ｔ＝３０試料
において推定されたＴＣＩＤ₅₀＝１０^5.25／ｍｌが存在
した；しかも第７日および第１４日にこの試料でＣＰＥ
は観察されなかった。対照的に、匹敵する量の感染性ウ
イルス（１０^-5または１０^-6）を含有するウイルスの負
荷の希釈物およびＴ＝０試料は、第７日および第１４日
に、事実ＣＰＥを示した。

【０１２２】実施例７ 固定の間の免疫染色 固定剤を次の処方で調製した：０．８９％（ｗ／ｖ）の
ホルムアルデヒド；７．２５％（ｗ／ｖ）のＤＭＳＯ；
３２ｍＭのＤＮＢＳ；０．０９９８％（ｗ／ｖ）のツイ
ーン２０；０．２ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄；０．２ｇ／ｌの
ＫＣｌ；２．１６ｇ／ｌのＮａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏおよ
び４．２ｇ／ｌのＮａＣｌ。全血を静脈穿刺によりＫ３
−ＥＤＴＡの中に集め、そして必要となるまで、通常２
時間以内、室温に保持した。

【０１２３】全血の１００μｌのアリコートを、細胞表
面の抗原に対する抗体ＣＤ３（ＯＫＴ３）、ＣＤ２（Ｏ
ＫＴ１１）、ＣＤ１４（ＯＫＴ１４）および対照Ｉｇ
Ｇ；または細胞質抗原のビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ
９、シグマ・ケミカル・カンパニー）に添加した。細胞
および抗体を混合し、そして室温において２０分間イン
キュベーションし、次いで２ｍｌの前述の固定剤配合物
を各管に添加し、混合し、そして細胞懸濁液を４０分間
インキュベーションした。固定後、細胞を遠心（４５７
×ｇ、２１℃、８分）により沈澱させ、上澄み液を吸引
により取り出し、そして３ｍｌの洗浄緩衝液（５％（ｖ
／ｖ）の血清、１．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミ
ンおよび０．００５５％（ｗ／ｖ）のエチレンジアミン
四酢酸）を各管に添加した。管を室温において１０分間
インキュベーションした。この１０分のインキュベーシ
ョンの間に、赤血球は溶解したが、白血球は溶解しなか
った。次いで白血球を遠心（４５７×ｇ、２１℃、８
分）により沈澱させ、そして３ｍｌの洗浄緩衝液の中で
さらに１回洗浄した。洗浄後、細胞を直接標識した抗体
（対照、ＯＫＴ３、ＯＫＴ１１およびＯＫＴ１４）で処
理し、０．５ｍｌのＰＢＳ＋２％のホルムアルデヒドの
中に再懸濁させ、そしてフローサイトメトリーにより分
析した。抗ビメンチンとインキュベーションした細胞を
室温において２００μｌのＦＩＴＣに接合したヤギ抗マ
ウスＩｇＧで３０分間処理した。これらの細胞を３ｍｌ
の洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで０．５ｍｌのＰＢＳ
＋２％のホルムアルデヒドの中に再懸濁させ、そしてフ
ローサイトメトリーにより分析した。

【０１２４】

【表９】

【０１２５】表Ｅ７−１に示すように、細胞表面の成分
に対する抗体と反応性のリンパ球および単球の百分率に
おいて、固定した細胞と未固定の細胞との間にすぐれた
一致が存在した。固定剤の添加前の２０分のインキュベ
ーションの間にどれだけ多くの細胞表面の染色が起こる
か、および固定剤の添加後にどれだけ多くが起こったか
をこの実験から決定することは不可能である。しかしな
がら、固定剤の添加前に存在した細胞表面の反応性を仮
定することは合理的である。対照的に、抗ビメンチンと
の反応性は固定剤の存在下においてのみ起こった。未固
定の細胞は抗ビメンチンと反応することができなかっ
た。なぜなら、抗体は抗原の細胞質の位置へアクセスす
ることができなかったからである。しかしながら、固定
試薬の添加は、細胞を固定しそして透過性とし、そして
抗ビメンチンに細胞質の抗原へのアクセスを与えた。抗
原抗体の相互作用は固定試薬の存在下に起こり、そして
反応の特異性は対照の抗体が細胞を染色することができ
なかったことにより証明された。

【０１２６】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。

【０１２７】１、一般構造式

【０１２８】

【化４】Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ 式中、ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂
ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、Ｓ
Ｏ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ
₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣ
ＯＮＨ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡ
ｒ、ＯＣＯＮＡｒ₂であり、ＲはＨまたは１〜６個の炭
素原子を含有するアルキルであり、Ａｒは融合または非
融合の、同一であるか、あるいは異なる１〜３個の芳香
族環であり、ベンゼン環、ヘテロサイクル環または同一
であるか、あるいは異なりそしてＯ、ＮまたはＳである
異種原子を含有する環であり、前記環はＲ₁、Ｒ₂、
Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ_５で置換されており、Ｒ₁、Ｒ₂、
Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異なり、そし
てＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮ
Ｒ₂、ＣＨＯ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、ＲまたはＣＦ₃で
あり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮ
Ｏ₂ではない、の少なくとも１種の化合物を含んでな
り、前記少なくとも１種の化合物は液体の賦形剤の中に
分散されている固定用組成物。

【０１２９】２、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるか、
あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、Ｃ
ＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、
ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＨＡｒ、
ＯＨ、ＯＲ、ＣＦ₃またはＲであり、ただしＲ₁およびＲ
₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない、上記第１項
記載の固定用組成物。

【０１３０】３、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃は同一であるか、ある
いは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯ
Ｈ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、ＣＯＮＨＲ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂
ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨ、ＸまたはＲであり、ただし
Ｒ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではな
い、上記第２項記載の固定用組成物。

【０１３１】４、ＸはＳＯ₃Ｈ、ＣＯＯＨまたはＯＨで
ある、上記第３項記載の固定用組成物。

【０１３２】５、タンパク質への取り付けおよびそれら
の構造の接着するために適当な少なくとも１種のアルコ
ール不含化合物をさらに含む、上記第１項記載の固定用
組成物。

【０１３３】６、前記少なくとも１種のアルコール不含
化合物は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、
グルタルアルデヒド、アクロレイン、グリオキサル、マ
ロンアルデヒド、ジアセチル、ポリアルデヒド、カーボ
ジイミド、ジイソシアネート、ジアゾニウム化合物、ジ
イミドエステル、マレイミド、ベンゾキノン、および金
属イオンから本質的に成る群より選択される、上記第５
項記載の固定用組成物。

【０１３４】７、前記少なくとも１種のアルコール不含
化合物は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ア
クロレイン、パラホルムアルデヒド、グリオキサルおよ
びマロンアルデヒドから本質的に成る群より選択され
る、上記第６項記載の固定用組成物。

【０１３５】８、一般構造式の化合物中のＸはＳＯ
₃Ｈ、ＣＯＯＨまたはＯＨであり、そしてＲ₁、Ｒ₂およ
びＲ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、
ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、Ｓ
Ｏ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨまたはＲであり、ただしＲ₁お
よびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない、上記
第７項記載の固定用組成物。

【０１３６】９、細胞膜を横切る成分の輸送を促進する
少なくとも１種の成分をさらに含む、上記第６項記載の
固定用組成物。

【０１３７】１０、一般構造式中のＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂
ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂
ＮＨＣ₆Ｈ₅、ＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ
Ｒ、ＣＯＯＣ₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒまたはＣＮである、上記
第９項記載の固定用組成物。

【０１３８】１１、ＸはＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、Ｓ
Ｏ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ
₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅およびＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂で
ある、上記第１０項記載の固定用組成物。

【０１３９】１２、ＸはＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、Ｓ
Ｏ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＨＲ₂またはＳＯ₂ＯＲ
である、上記第１１項記載の固定用組成物。

【０１４０】１３、ＸはＳＯ₃ＨまたはＳＯ₂ＮＨ₂であ
る、上記第１２項記載の固定用組成物。

【０１４１】１４、細胞膜を横切る成分を輸送を促進す
る前記化合物は、ジメチルスルホキシド、スルホラン、
ポリエチレングリコールおよびエチレングリコールから
本質的に成る群より選択されるフソゲン（ｆｕｓｏｇｅ
ｎｉｃ）化合物である、上記第９項記載の固定用組成
物。

【０１４２】１５、前記フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎｉ
ｃ）化合物はジメチルスルホキシドである、上記第１４
項記載の固定用組成物。

【０１４３】１６、両性イオン性界面活性剤または非イ
オン性界面活性剤をさらに含む、上記第６項記載の固定
用組成物。

【０１４４】１７、両性イオン性界面活性剤または非イ
オン性界面活性剤をさらに含む、上記第１４項記載の固
定用組成物。

【０１４５】１８、２，４−ジニトロベンゼンスルホン
アミド、２，４−ジニトロフェノール、３，５−ジニト
ロサリチル酸、２，４−ジニトロ安息香酸、５−スルホ
サリチル酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼン
ジスルホン酸、３，５−ジニトロ安息香酸、８−ヒドロ
キシキノリン−５−スルホン酸、４−ニトロフェノー
ル、３，５−ジニトロサリシルアルデヒド，３，５−ジ
ニトロアニリン、パラトルエンスルホン酸、２−メシチ
レンスルホン酸、２−（トリフルオロメチル）安息香
酸、３，５−ジニトロベンゾニトリル、または２，４−
ジニトロベンゼンスルホン酸、２，６−ジニトロベンゼ
ンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスルホン酸か
ら選択される一般構造式の少なくとも１種の化合物を含
んでなり、前記化合物は賦形剤の中に分散されている、
固定用組成物。

【０１４６】１９、前記一般構造式の少なくとも１種の
化合物は、ジニトロベンズアルデヒド、３，５−ジニト
ロ安息香酸、２，４−ジニトロ安息香酸、２，６−ジニ
トロベンゼンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンス
ルホン酸、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，
４−ジニトロフェノール、４−ニトロフェノール、また
は３，５−ジニトロサリチル酸である、上記第１８項記
載の固定用組成物。

【０１４７】２０、少なくとも１種のアルコール不含細
胞固定剤をさらに含む、上記第１９項記載の固定用組成
物。

【０１４８】２１、前記少なくとも１種のアルコール不
含細胞固定剤はアミン反応性アルデヒドである、上記第
２０項記載の固定用組成物。

【０１４９】２２、前記少なくとも１種のアルコール不
含細胞固定剤は、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデ
ヒド、メタノール不含ホルムアルデヒド、グルタルアル
デヒドおよびアクロレインから本質的に成る群より選択
される、上記第２１項記載の固定用組成物。

【０１５０】２３、前記少なくとも１種のアルコール不
含細胞固定剤は前記組成物の中に約０．１％〜約４％の
範囲の濃度で存在する、上記第２２項記載の固定用組成
物。２４、前記一般構造式の少なくとも１種の化合物
は、２，４−ジニトロフェノール、２，４−ジニトロ安
息香酸、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸または４
−ニトロフェノールから本質的に成る群より選択され
る、上記第２３項記載の固定用組成物。

【０１５１】２５、前記少なくとも１種のアルコール不
含細胞固定剤はメタノール不含の、高い等級のホルムア
ルデヒドである、上記第２４項記載の固定用組成物。

【０１５２】２６、細胞膜を横切る成分の輸送を促進す
る少なくとも１種の成分をさらに含む、上記第２１項記
載の固定用組成物。

【０１５３】２７、細胞膜を横切る成分を輸送を促進す
る前記化合物は、ジメチルスルホキシド、スルホラン、
ポリエチレングリコールおよびエチレングリコールから
本質的に成る群より選択されるフソゲン化合物である、
上記第９項記載の固定用組成物。

【０１５４】２８、少なくとも１種の非イオン性界面活
性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記
第２７項記載の固定用組成物。

【０１５５】２９、前記界面活性剤の少なくとも１種は
ポリオキシエチレンソルビタンである、上記第２８項記
載の固定用組成物。

【０１５６】３０、少なくとも１種の非イオン性界面活
性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記
第２５項記載の固定用組成物。

【０１５７】３１、前記界面活性剤の少なくとも１種は
ポリオキシエチレンソルビタンである、上記第３０項記
載の固定用組成物。

【０１５８】３２、少なくとも１種の非イオン性界面活
性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記
第１項記載の固定用組成物。

【０１５９】３３、少なくとも１種の非イオン性界面活
性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記
第２１項記載の固定用組成物。

【０１６０】３４、ジメチルスルホキシドをさらに含
む、上記第３１項記載の固定用組成物。

【０１６１】３５、前記ジメチルスルホキシドの濃度は
約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）であり、そして
前記少なくとも１種の両性イオン性界面活性剤または非
イオン性界面活性剤は約０．００１〜約０．２％（ｖ／
ｖ）の濃度で存在する、上記第３４項記載の固定用組成
物。

【０１６２】３６、前記一般構造式の化合物は２，４−
ジニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジニトロ安息香
酸、２，４−ジニトロフェノール、またはこれらの２ま
たはそれ以上の組み合わせである、上記第３５項記載の
固定用組成物。

【０１６３】３７、細胞を上記第１項記載の固定用組成
物と、前記細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで、
前記細胞を固定するために有効な量でかつ期間の間、接
触させることからなる、細胞を固定する方法。

【０１６４】３８、細胞を上記第３６項記載の固定用組
成物と、前記細胞の細胞の性質を実質的に破壊しない
で、前記細胞を固定するために有効な量でかつ期間の
間、接触させることからなる、細胞を固定する方法。

【０１６５】３９、工程： ａ）分析しようとする１集団の細胞を含有する生物学的
試料を上記第１項記載の固定用組成物と、前記細胞の細
胞の性質を実質的に破壊しないで、前記細胞を固定する
ために有効な量でかつ期間の間、接触させ、 ｂ）前記細胞を、工程ａ）における前記固定用組成物と
同時にあるいはその後に、細胞表面のマーカーに対する
少なくとも１種の結合性リガンド、細胞内抗原に対する
少なくとも１種の結合性リガンド、または細胞表面のマ
ーカーに対する少なくとも１種の結合性リガンドと細胞
内抗原に対する少なくとも１種の結合性リガンドとの組
み合わせと、接触させ、そして ｃ）そのように固定された細胞の細胞の性質を検査す
る、からなる細胞を分析する方法。

【０１６６】４０、検査する細胞の性質は細胞表面のマ
ーカー、細胞の細胞内マーカー、細胞の形態学、および
細胞の光散乱性質であり、そして前記結合性リガンドは
抗体であり、そして前記検査をフローサイトメーターを
使用して実施する、上記第３５項記載の方法。

【０１６７】４１、固定された細胞の細胞の性質を同一
のタイプの正常の生きている細胞の集団の同一の細胞の
性質を証明するデータと比較する、上記第４０項記載の
方法。

【０１６８】４２、前記生物学的試料は全血である、上
記第４１項記載の方法。

【０１６９】４３、前記固定された細胞の集団は全血球
の集団である、上記第４２項記載の方法。

【０１７０】４４、前記固定された細胞の集団をＣＤ４
陽性Ｔ細胞、単球、および顆粒球の下位集団に分離す
る、上記第４３項記載の方法。

【０１７１】４５、また、前記同一のタイプの正常の生
きている細胞の集団をＣＤ４陽性Ｔ細胞、単球、および
顆粒球の下位集団に分離し、そしてこのような分離の結
果から得られたデータを固定された細胞の分離の結果か
ら得られたデータと比較することをさらに含む、上記第
４４項記載の方法。

【０１７２】４６、前記生物学的試料はフィコール処理
した血液である、上記第４１項記載の方法。

【０１７３】４７、工程： ａ）分析しようとする１集団の細胞を含有する生物学的
試料を、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、ホルム
アルデヒド、ジメチルスルホキシド、および非イオン性
界面活性剤または両性イオン性界面活性剤からなる固定
用組成物と、接触させ、前記固定用組成物は液体の賦形
剤の中に分散されておりそして前記細胞の細胞の性質を
実質的に破壊しないで前記細胞を固定するために有効な
量でかつ期間の間、前記固定用組成物を適用し、 ｂ）そのように固定された前記細胞を、前記固定用組成
物と同時にあるいはその後に、細胞表面のマーカーに対
する少なくとも１種の抗体、細胞内抗原に対する少なく
とも１種の抗体、または細胞表面のマーカーに対する少
なくとも１種の抗体と細胞内抗原に対する少なくとも１
種の抗体との組み合わせと、接触させ、そして ｃ）そのように固定された細胞の細胞の性質をフローサ
イトメーターで検査し、そして前記検査の結果を記録す
る、からなる細胞を分析する方法。

【０１７４】４８、前記生物学的試料を骨髄細胞、全
血、フィコール処理した血液から本質的に成る群より選
択される、上記第４７項記載の方法。

【０１７５】４９、検査する細胞の性質は、細胞表面の
マーカー、細胞の細胞内マーカー、細胞の形態学、およ
び細胞の光散乱性質である、上記第４７項記載の方法。

【０１７６】５０、固定された細胞の細胞の性質を同一
のタイプの正常の生きている細胞の集団の同一の細胞の
性質を証明するデータと比較する、上記第４９項記載の
方法。

【０１７７】５１、前記生物学的試料は全血である、上
記第５０項記載の方法。

【０１７８】５２、前記固定された細胞の集団は全血球
の集団である、上記第５１項記載の方法。

【０１７９】５３、前記固定された細胞の集団をＣＤ４
陽性Ｔ細胞、単球、および顆粒球の下位集団に分離す
る、上記第５２項記載の方法。

【０１８０】５４、また、前記同一のタイプの正常の生
きている細胞の集団をＣＤ４陽性Ｔ細胞、単球、および
顆粒球の下位集団に分離し、そしてこのような分離の結
果から得られたデータを固定された細胞の分離の結果か
ら得られたデータと比較することをさらに含む、上記第
５３項記載の方法。

【０１８１】５５、ウイルスの成分を前記固定された細
胞内で検出する、上記第３９項記載の方法。

【０１８２】５６、ウイルスの負荷を測定する、上記第
５５項記載の方法。

【０１８３】５７、前記ウイルスはＨＩＶである、上記
第５６項記載の方法。

【０１８４】５８、前記細胞内抗原のための抗ｐ２４抗
体である、上記第５７項記載の方法。

【０１８５】５９、ＤＮＡを前記固定された細胞内で検
出する、上記第３９項記載の方法。

【０１８６】６０、工程： ａ）患者の全血の試料を上記第３６項記載の固定用組成
物と、白血球の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前
記全血の中に存在する白血球を固定するために有効な量
でかつ期間の間、接触させ、 ｂ）前記試料の中に存在する赤血球を除去し、 ｃ）工程ａ）における接触工程と同時にあるいはその後
に、そのように固定された細胞を白血球のマーカーに対
する少なくとも１種の抗体および少なくとも１種のウイ
ルス成分に結合する少なくとも１種の結合性リガンドと
接触させ、 ｄ）そのように固定された細胞の細胞の性質をフローサ
イトメーターで検査し、そして ｅ）前記検査の結果を、ウイルスの感染の種々の段階に
おける患者から同一の方法で得られたヒストリーのデー
タと比較する、からなるそのように感染した患者におけ
るウイルスの感染の進行をモニターする方法。

【０１８７】６１、前記ウイルスはＨＩＶである、上記
第６０項記載の方法。

【０１８８】６２、前記少なくとも１種のウイルス成分
に結合する前記結合性リガンドは抗ｐ２４抗体である、
上記第６１項記載の方法。

【０１８９】６３、白血球のマーカーに対する少なくと
も１種の抗体は抗ＣＤ４モノクローナル抗体である、上
記第６２項記載の方法。

【０１９０】６４、前記抗ＣＤ４抗体はフィコエリトリ
ンで標識し、そして前記抗ｐ２４抗体をＦＩＴＣで標識
する、上記第６３項記載の方法。

【０１９１】６５、ａ）上記第３６項記載の固定用組成
物、および ｂ）血球表面のマーカーに対する少なくとも１種の抗
体、からなる、感染した血球の中のウイルスの負荷を検
出する試薬キット。

【０１９２】６６、細胞内抗体に対する結合性リガンド
をさらに含む、上記第６５項記載の試薬キット。

【０１９３】６７、血球表面のマーカーに対する前記抗
体の少なくとも１種はＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するモノク
ローナル抗体である、上記第６６項記載の方法。

【０１９４】６８、単球に対して少なくとも１種のモノ
クローナル抗体をさらに含む、上記第６７項記載の試薬
キット。

【０１９５】６９、前記細胞内抗原に対する前記結合性
リガンドはウイルス成分に対する抗体である、上記第６
８項記載の試薬キット。

【０１９６】７０、前記固定用組成物および抗体は１つ
の容器の中に含有されている、上記第６９項記載の試薬
キット。

【図面の簡単な説明】

【図１】生きている、未固定の細胞の集団の中の全血球
のクラスターの分布を証明する、ＦＡＣＳｃａｎフロー
サイトメーターを使用して得られた３次元のプロットで
ある。

【図２】本発明の固定用組成物で固定した細胞の集団の
中の全血球のクラスターの分布を証明する、ＦＡＣＳｃ
ａｎフローサイトメーターを使用して得られた３次元の
プロットである。

【図３】二重の抗体の染色アッセイの結果を証明する、
ＦＡＣＳｃａｎを使用して得られたサイトグラムであ
る。

【図４】ａは抗ｐ２４モノクローナル抗体と反応した未
感染の細胞の染色の結果を示す、ＦＡＣＳｃａｎを使用
して得られた輪郭プロットであり、ｂは細胞の数を相対
蛍光強度に対してプロットした、ａに描写したのと同一
のデータのヒストグラムである。

【図５】ａは抗ｐ２４モノクローナル抗体と反応した持
続的にＨＩＶ感染した細胞の染色の結果を示す、ＦＡＣ
Ｓｃａｎを使用して得られた輪郭プロットであり、ｂは
ＨＩＶ感染した細胞の数を相対蛍光強度に対してプロッ
トした、ａに表したのと同一のデータのヒストグラムで
ある。

【図６】ａは対照の非感染の病院の患者からの試料を使
用して得られた結果を示す、ＦＡＣＳｃａｎを使用して
得られた輪郭プロットであり、ｂ、ｃおよびｄは病気の
感染の３つの種々の段階における、３人のＨＩＶ感染し
た患者からの血液の染色結果を示す。

【符号の説明】

１０ 横座標（Ｘ−軸） １２ 縦座標（Ｙ−軸） １４ Ｚ−軸 １６ 起源 １８ クラスター ２０ クラスター ２２ 活性化されたＴ−細胞 １００ リンパ球のクラスター １０２ 単球のクラスター １０４ 顆粒球のクラスター

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｚ 9015−2Ｊ (72)発明者 ヒユーストン・ジー・ブルツクス・ジユニ ア アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08873 サマーセツト・オールドハミルトンストリ ート1505

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般構造式 【化１】Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ 式中、 ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、
   ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、ＳＯ₂Ｎ
   （Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ₆Ｈ₅、Ｃ
   ＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣＯＮ
   Ｈ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡｒ、Ｏ
   ＣＯＮＡｒ₂であり、 ＲはＨまたは１〜６個の炭素原子を含有するアルキルで
   あり、 Ａｒは融合または非融合の、同一であるか、あるいは異
   なる１〜３個の芳香族環であり、ベンゼン環、ヘテロサ
   イクル環または同一であるか、あるいは異なりそして
   Ｏ、ＮまたはＳである異種原子を含有する環であり、前
   記環はＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅で置換されてお
   り、 Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異
   なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、
   ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、Ｒまたは
   ＣＦ₃であり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、
   Ｒ₃はＮＯ₂ではない、の少なくとも１種の化合物を含ん
   でなり、前記少なくとも１種の化合物は液体の賦形剤の
   中に分散されている固定用組成物。
2. 【請求項２】 ２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミ
   ド、２，４−ジニトロフェノール、３，５−ジニトロサ
   リチル酸、２，４−ジニトロ安息香酸、５−スルホサリ
   チル酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジス
   ルホン酸、３，５−ジニトロ安息香酸、８−ヒドロキシ
   キノリン−５−スルホン酸、４−ニトロフェノール、
   ３，５−ジニトロサリシルアルデヒド，３，５−ジニト
   ロアニリン、パラトルエンスルホン酸、２−メシチレン
   スルホン酸、２−（トリフルオロメチル）安息香酸、
   ３，５−ジニトロベンゾニトリル、または２，４−ジニ
   トロベンゼンスルホン酸、２，６−ジニトロベンゼンス
   ルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスルホン酸から選
   択される一般構造式の少なくとも１種の化合物を含んで
   なり、前記化合物は賦形剤の中に分散されている、固定
   用組成物。
3. 【請求項３】 細胞を請求項１の固定用組成物と、前記
   細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記細胞を
   固定するために有効な量でかつ期間の間、接触させるこ
   とからなる、細胞を固定する方法。
4. 【請求項４】 細胞を請求項２の固定用組成物と、前記
   細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記細胞を
   固定するために有効な量でかつ期間の間、接触させるこ
   とからなる、細胞を固定する方法。
5. 【請求項５】 工程： ａ）分析しようとする１集団の細胞を含有する生物学的
   試料を請求項１の固定用組成物と、前記細胞の細胞の性
   質を実質的に破壊しないで、前記細胞を固定するために
   有効な量でかつ期間の間、接触させ、 ｂ）前記細胞を、工程ａ）における前記固定用組成物と
   同時にあるいはその後に、細胞表面のマーカーに対する
   少なくとも１種の結合性リガンド、細胞内抗原に対する
   少なくとも１種の結合性リガンド、または細胞表面のマ
   ーカーに対する少なくとも１種の結合性リガンドと細胞
   内抗原に対する少なくとも１種の結合性リガンドとの組
   み合わせと、接触させ、そして ｃ）そのように固定された細胞の細胞の性質を検査す
   る、からなる細胞を分析する方法。
6. 【請求項６】 工程： ａ）分析しようとする１集団の細胞を含有する生物学的
   試料を、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、ホルム
   アルデヒド、ジメチルスルホキシド、および非イオン性
   界面活性剤または両性イオン性界面活性剤からなる固定
   用組成物と、接触させ、前記固定用組成物は液体の賦形
   剤の中に分散されておりそして前記細胞の細胞の性質を
   実質的に破壊しないで前記細胞を固定するために有効な
   量でかつ期間の間、前記固定用組成物を適用し、 ｂ）そのように固定された前記細胞を、前記固定用組成
   物と同時にあるいはその後に、細胞表面のマーカーに対
   する少なくとも１種の抗体、細胞内抗原に対する少なく
   とも１種の抗体、または細胞表面のマーカーに対する少
   なくとも１種の抗体と細胞内抗原に対する少なくとも１
   種の抗体との組み合わせと、接触させ、そして ｃ）そのように固定された細胞の細胞の性質をフローサ
   イトメーターで検査し、そして前記検査の結果を記録す
   る、からなる細胞を分析する方法。
7. 【請求項７】 工程： ａ）患者の全血の試料を請求項２の固定用組成物と、白
   血球の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記全血の
   中に存在する白血球を固定するために有効な量でかつ期
   間の間、接触させ、 ｂ）前記試料の中に存在する赤血球を除去し、 ｃ）工程ａ）における接触工程と同時にあるいはその後
   に、そのように固定された細胞を白血球のマーカーに対
   する少なくとも１種の抗体および少なくとも１種のウイ
   ルス成分に結合する少なくとも１種の結合性リガンドと
   接触させ、 ｄ）そのように固定された細胞の細胞の性質をフローサ
   イトメーターで検査し、そして ｅ）前記検査の結果を、ウイルスの感染の種々の段階に
   おける患者から同一の方法で得られたヒストリーのデー
   タと比較する、からなるそのように感染した患者におけ
   るウイルスの感染の進行をモニターする方法。
8. 【請求項８】 ａ）請求項２の固定用組成物、および ｂ）血球表面のマーカーに対する少なくとも１種の抗
   体、からなる、感染した血球の中のウイルスの負荷を検
   出する試薬キット。