JP6311707B2

JP6311707B2 - 細胞染色方法及びその方法に使用する検体採取管

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Application number: JP2015516978A
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Inventors: 恒子千代田; 淳吾荒木
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Description

本発明は、細胞の染色方法及びその方法に使用する検体採取管に関する。更に詳しくは、細胞染色における細胞の細胞固定化、浸透化及び／又は標識化の方法、並びに、その細胞の固定化、浸透化及び／又は標識化の方法に使用する検体採取管に関する。

ヒトや動物の体から採取した細胞を観察して病変の有無を判断する細胞診が行われている。例えば、血液には血液細胞が含まれており、臓器の粘膜や粘液、痰、腹水、胃液、尿等には、臓器の剥がれた細胞が混じっている。細胞診ではこれらの細胞を採取・染色して顕微鏡等で観察する。この場合、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、各種幹細胞等（以下、「稀少細胞」という）は、病態に応じて末梢血中に極めて稀に存在する細胞であるが、これら稀少細胞の検出は臨床的に有用である。しかし、稀少細胞は検体中に含まれる量が非常に少ないことから、血液由来検体から稀少細胞を検出することは未だに困難である場合が多い。

一方、細胞診では、一般に、採取した細胞を固定化、浸透化した後に染色し、顕微鏡等で観察する。通常、この手順は、検体の採取、細胞懸濁液の調製（主に、血液、尿等の液状の検体の場合（目的細胞画分の分離を含む））、細胞の固定化、洗浄、細胞の浸透化、細胞の染色、洗浄等の複数の工程を順に実施して、染色された細胞を顕微鏡等で観察する。そして、特定の細胞を検出するための染色方法としては、例えば、色素染色法や検出対象細胞に発現している特定の物質と特異的に反応する抗原抗体法等が用いられている。

このような手順の例として、特許文献１では、血液中の細胞を検出する目的で、抗凝固剤と血液を反応させた後、赤血球溶解を行い、残りの細胞懸濁液を接着性支持体に３７℃４０分インキュベートし、細胞を付着させ、その後、パラホルムアルデヒドで細胞固定化を行い、２回洗浄後、細胞浸透化処理、洗浄を行った後、抗体と反応させている（特許文献１の段落番号0075）。しかし、このような手順は煩雑であり、また、複数回の遠心分離、洗浄等を含むことから、検体中の稀少細胞が損傷を受けたり、流出してしまう可能性がある。

また、特許文献２では、サンプル中（血液サンプル中を含む）の規定の型の細胞（赤血球を含む）の溶解、細胞内核酸の染色、及び有核細胞の固定を単一の段階で行い、分析の経費及び時間等を削減することが記載されている（特許文献２の請求項等）。しかし、この方法では、細胞溶解剤で溶解するのは検出対象細胞以外の細胞である赤血球であり、染色するのは細胞内の核酸全体を核酸染色色素で染色するものであり、検出対象細胞に発現している特定の物質を特異的に染色するものではない。

従って、検体中に含まれる量の少ない検出対象細胞、特に稀少細胞を確実に検出するために、採取した検体中の細胞の損傷及び流出を防ぎ、検出対象細胞に発現している特定の物質を特異的に染色する方法が望まれている。

また、上記の通り、従来の細胞染色の手順は煩雑であることから、手順の簡便化及び時間短縮を図ることが望まれている。

特表2009-525468号公報特開2008-256713号公報

本発明は、液体検体中の検出対象細胞に発現している特定の物質を特異的に染色する場合において、採取した検体中の細胞の損傷及び損失（流出）を防ぎ、かつ、液体検体中の細胞の染色手順において、時間が短縮された簡便な細胞染色方法を提供することを課題とする。更に、本発明は、上記の細胞染色方法に用いるのに適した検体採取管を提供することを課題とする。

本発明者らは、液体検体中の細胞の染色手順を検討したところ、細胞の固定化処理の後に、固定化処理剤を除かなくても、その後の細胞の浸透化処理や細胞が有する特定の物質の標識処理に問題がないことを発見し、細胞の固定化処理工程及び細胞の浸透化処理工程を一つの工程で行うことができることを見出した。その結果、細胞の遠心分離及び洗浄の回数が減少し、検体中の細胞の損傷及び損失（流出）が防止され、また、細胞染色手順における時間短縮及び簡便化を図ることができ、本発明を完成させるに至った。更に、本発明者らは、上記工程に加えて細胞が有する特定の物質の標識処理工程を一つの工程で実施することにより、より簡便に細胞染色手順を実施することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、上記の課題のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面では、本発明は下記の事項を包含する。
[１]
検体中の細胞が有する特定の物質を特異的に染色する方法であって、
（Ａ）前記細胞の固定化処理をする工程、及び
（Ｂ）前記細胞の浸透化処理をする工程を
一つの工程で実施する方法。

[２]
採取した検体を保存し、該検体に含まれる細胞の固定化及び浸透化並びに該細胞が有する特定の物質の標識を同時に行うための、開閉可能な口を有する密封可能な検体採取管であって、
（１）可撓性板状体が、該検体採取管の中間部分の内壁に挟持された状態で収納され、
（２）該細胞の固定化剤、該細胞の浸透化剤及び該細胞が有する特定の物質を特異的に標識する物質が、それぞれ接触しないように該検体採取管に収納されている
検体採取管。

本発明の方法によれば、液体検体中の検出対象細胞に発現している特定の物質を特異的に染色する場合において、細胞の洗浄回数を低減させて採取した検体中の細胞の損傷及び損失（流出）を防ぎ、その結果、細胞診の検査精度が向上させることができる。更に、本発明の方法によれば、液体検体中の細胞の染色手順において、時間が短縮された簡便な細胞染色方法を提供することができる。

また、本発明の検体採取管によれば、検体に含まれる細胞の固定化及び浸透化並びに該細胞が有する特定の物質の標識を同時に短時間で簡便に行うことができ、採取した検体中の細胞の損傷及び損失（流出）も防ぐことができる。更に、本発明の好ましい一態様の検体採取管によれば、血液検体を対象として、更に血液の抗凝固処理も同時に行うことができる。

図１は、本発明の検体採取管の一態様を示す断面図である。図２は、比較例（従来法による細胞染色法）において、ＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞）を添加した血液中の細胞を蛍光染色し、顕微鏡下で蛍光観察を行った画像である。図３は、実施例１（抗凝固化処理、固定化処理、浸透化処理及び標識化処理を一工程で行う細胞染色法）において、ＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞）を添加した血液中の細胞を蛍光染色し、顕微鏡下で蛍光観察を行った画像である。図４は、実施例２（密度勾配遠心法を組み合わせた実施例）において、ＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞）を添加した血液中の細胞を蛍光染色し、顕微鏡下で蛍光観察を行った画像である。

１．本発明の細胞染色方法
本発明の細胞染色方法は、
『検体中の細胞が有する特定の物質を特異的に染色する方法であって、
（Ａ）前記細胞の固定化処理をする工程、及び
（Ｂ）前記細胞の浸透化処理をする工程を
一つの工程で実施する方法。』
である。

（検体）
本発明が対象とする検体は、ヒトや動物から採取された、細胞を含む検体である。本発明の効果の点から、本発明が対象とする好ましい検体は、液状の検体である。このような検体の例として代表的なものは、血液（血清、血漿を含む）及び尿である。また、生体から剥離した細胞を対象とする場合も、所定の方法に従って細胞懸濁液を作製して、液状の検体とすることもできる。

採取された検体は、本発明の細胞染色方法の実施にあたり、必要に応じて、検体から検出対象の細胞を含む画分を取得するための操作（「検出対象細胞画分の取得操作」という）を行ってもよい。検出対象細胞画分の取得操作としては、血液検体の場合には、例えば、抗凝固処理を行った後、密度勾配遠心分離によって、検出対象細胞画分、例えば、赤血球を含まない画分、を取得すること等が挙げられる。なお、検出対象細胞画分の取得操作は、細胞の固定化処理の前に実施することが一般的であるが、必要に応じて、細胞の固定化処理と細胞の浸透化処理の間に実施することも可能である。

（細胞が有する特定の物質）
本発明の染色方法は、検出対象細胞が有する特定の物質を特異的に染色する方法であり、例えば、検体に検出対象細胞が含まれているかの判定や検体に含まれている細胞を観察するために実施することができる。この場合、染色する特定の物質は、通常行われているように、検出対象細胞に応じて合目的的に選定すればよい。例えば、前立腺癌細胞を検出するためには前立腺特異抗原（prostate specific antigen、ＰＳＡ）を特異的に染色することができ、また、癌細胞を対象として観察するためにはその癌細胞での発現に応じて選定した特定のサイトケラチンを特異的に染色することができる。

（細胞染色方法）
本発明における、検体中の細胞が有する特定の物質を特異的に染色する方法（以下、単に細胞染色方法という）は、採取した検体中の細胞の固定化処理と浸透化処理を一つの工程で実施する。具体的には、例えば検体が血液である場合、まず該血液の固定化処理と浸透化処理を一つの工程で行い、次いで、前記特定の物質を特異的に標識処理する工程を行い、好ましくは、その後洗浄し、顕微鏡等で観察することができる。この場合、検体採取後、最初に、血液の抗凝固処理を実施した上で、次に、上記の固定化処理と浸透化処理を一つの工程で行うこともでき、また、この場合の血液の抗凝固化処理、細胞の固定化処理及び細胞の浸透化処理を一つの工程で行うこともできる。更に、本発明の好ましい態様の一つとして、前記細胞の固定化処理、前記細胞の浸透化処理及び前記特定の物質を特異的に標識処理する工程を一つの工程で行うこともできる（更に、前記の血液の抗凝固化処理も一つの工程で行うこともできる）。

ここで、「一つの工程で行う」とは、「添加した固定化剤を除く洗浄を行うことなく、その工程内の一連の処理を実施すること」、又は、「添加した固定化剤及び浸透化剤を除く洗浄を行うことなく、その工程内の一連の処理を実施すること」を意味する。通常、細胞の染色においては、細胞の固定化処理を行った後に洗浄（固定化剤を除くための洗浄）を行い、続いて、細胞の浸透化処理へと進み、更に、必要に応じて洗浄（浸透化剤を除くための洗浄）を行った後、標識処理へと進む。そして、この場合の洗浄方法は、細胞を含む検体にリン酸緩衝食塩水その他の洗浄液を加えて遠心分離処理を行い、上清を取り除くことによるものである。しかし、本発明では、細胞の固定化処理及び細胞の浸透化処理を一つの工程で実施する態様の場合には、これらの処理の間で、上記のような固定化剤を除く洗浄は行わない。また、本発明では、細胞の固定化処理、細胞の浸透化処理及び特定の物質の標識処理を一つの工程で実施する態様の場合には、これらの処理の間で上記のような固定化剤及び浸透化剤を除く洗浄は行わない。なお、前記の検出対象細胞画分の取得操作は、必要に応じて、上記の一つの工程内、例えば、細胞の固定化処理と細胞の浸透化処理の間に実施してもよいことは、前記の通りである。

なお、本発明の好ましい態様の一つとして、細胞の固定化処理及び細胞の浸透化処理に加えて、特定物質の標識処理や血液の抗凝固化処理も同じ一つの工程で実施できることは前記の通りであるが、この場合、好ましくは、特定物質の標識処理後に、特定物質と結合していない未反応の標識体を除くための洗浄を行った後、顕微鏡等で観察すれば、バックグランドのノイズを低減できる。

上記の細胞の固定化処理及び細胞の浸透化処理は、検体に固定化剤及び浸透化剤を添加して、通常は１０分〜１時間室温で放置することにより行う。この場合、特定の物質の標識化処理及び血液の抗凝固化処理も合せて一つの工程で行う場合には、更に、特定の物質を特異的に捕捉する物質と標識体（例えば、標識体が結合した抗体）及び抗凝固剤も合せて添加することができ、この場合の処理も、通常は１０分〜1時間室温で放置することにより行う。

（抗凝固剤）
血液は体外に出すと液体がゲル状に変わり、血液凝固する。従って、検体が血液の場合は、検査の目的によって血液凝固を防ぐ必要がある場合は、検体採取後、抗凝固剤を検体に添加する。検体が血液である場合に本発明で使用する抗凝固剤は、特に制限はなく、通常用いられているもの、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＤＣＴＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ）やヘパリン、ヘパリン硫酸、低分子ヘパリン等のヘパリン種、クエン酸、シュウ酸等が挙げられる。これらの血液凝固剤の添加濃度も通常行われている通りでよい。

（固定化剤）
細胞の固定化処理とは、細胞の自己分解や腐敗を遅延させるとともに、形態及び抗原性を保持する目的で行われる処理である。本発明で用いる固定化剤は、特に制限はなく、通常用いられている、例えば、アルデヒド類（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール等）やアルコール類（例えば、エタノール、メタノール等）を用いることができる。また、それ自体が固定化剤として直接作用するものではないが、それ自体が加水分解等を受けることによって、例えばホルムアルデヒド等の固定化剤を遊離するような、例えばホルムアルデヒド供与体（ホルムアルデヒドドナー又はＦＡドナーともいう。）等も固定化剤として使用可能である。

アルデヒド類は、アルデヒド基と特定アミノ酸との間で共有結合を形成させる架橋剤で、タンパク質構造を安定化するとともに細胞原形質をゲル化して酵素活性を抑えることができる。アルコール類は、タンパク質を変性させて沈殿させることができる。

これらの固定化剤の添加濃度も通常行われている通りでよいが、検体が血液であり、固定化剤としてホルムアルデヒドを使用する場合は、血液の性状が変化することを防ぐために、検体の容量に対して０．０１〜１．０容量％となるようにホルムアルデヒドを検体に添加して、固定化処理を行うことが好ましい。

（浸透化剤）
細胞の浸透化処理とは、例えば、細胞が有する特定の物質（例えば、細胞内の抗原）とこの特定の物質を捕捉する物質（例えば、抗体）とを接触させるために、細胞膜の透過性を上げる処理である。本発明で使用する浸透化剤は、特に制限はない。通常用いられているＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓａｐｏｎｉｎ、Ｄｉgｉｔｏｎｉ、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ、ＮＰ−４０等の界面活性剤を、通常行われている濃度で、例えば、検体の容量に対して０．０１〜０．５容量％となるように、検体に添加して、浸透化処理を行うことができる。

（標識処理）
本発明における細胞が有する特定の物質の標識処理の方法は、細胞及び標識する特定の物質に応じた合目的的な方法であれば特に制限はなく、通常、特定の物質を特異的に捕捉する物質と標識体を用いて行う。この場合の特定物質の捕捉方法としては、例えば、細胞が有する特定の物質を抗原として、これと特異的に結合する抗体を用いる抗原抗体法や、特定の物質が糖鎖を有する物質の場合、その糖鎖と特異的に結合するレクチンを用いる方法等が挙げられる。

標識処理は、例えば、標識体が結合した抗体を用いて特定の物質を標識する方法（一次抗体法）や、まず特定の物質と一次抗体とを結合させ、次いで一次抗体に標識体と結合した二次抗体を結合させる方法（サンドイッチ法）等を用いることができる。

標識体についても、その検査に応じた合目的的なものであれば特に制限はなく、通常用いられている、蛍光色素、酵素・補酵素、化学発光物質等を用いることができる。この場合、細胞が有する微量の特定物質を高感度で検出するためには、標識体として蛍光色素を用いることが好ましい。
上記の標識処理を行った後は、好ましくは、遠心洗浄等によって、上記の特定の物質と結合していない標識体を除いた後、顕微鏡等で観察する。

２．本発明の検体採取管
本発明の検体採取管は、
『採取した検体を保存し、該検体に含まれる細胞の固定化及び浸透化並びに該細胞が有する特定の物質の標識を同時に行うための、開閉可能な口を有する密封可能な検体採取管であって、
（１）可撓性板状体が、該検体採取管の中間部分の内壁に挟持された状態で収納され、
（２）該細胞の固定化剤、該細胞の浸透化剤及び該細胞が有する特定の物質を特異的に標識する物質が、それぞれ接触しないように該検体採取管に収納されている
検体採取管。』
である。

本発明の検体採取管には、固定化剤、浸透化剤及び特定の物質を特異的に標識する物質（特定の物質を特異的に捕捉する物質及び標識体）が、それぞれが混在した状態、すなわち混合状態で封入されているのではなく、別個に分離して収納されている。また、検体が血液である場合には、本発明の検体採取管の好ましい一態様として、上記に加えて、更に抗凝固剤が他の処理剤等と別個に分離して収納されている（本明細書で処理剤等とは、「固定化剤、浸透化剤、及び特定の物質を標識する物質」又は「抗凝固剤、固定化剤、浸透化剤、及び特定の物質を標識する物質」を意味する）。

液状の検体を採取した後、開閉可能な口を開けて検体を本発明の検体採取管に入れ、口を閉じた後、検体採取管を数回転倒させることによって、検体と上記処理剤等が混合され、通常は１０分〜1時間室温で放置することにより、検体中の細胞の固定化、浸透化、及び特定の物質の標識を一つの工程で実施することができる。更に、上記の本発明の検体採取管の好ましい一態様では、検体が血液の場合、細胞の固定化、浸透化、及び特定の物質の標識に加えて、血液の抗凝固化も合せて一つの工程で実施することができる。

（検体採取管の材質）
本発明の検体採取管の材質としては、採取する検体に応じて、通常使用されているものを使用することができ、例えば、ポリエチレンテレフタレート、共重合ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタアクリレート、ポリメタアクリル酸等のアクリル樹脂、ポリプロピレン、ポリエチレン等のポリオレフィン、ポリ塩化ビニル、ナイロン等のポリアミド、ポリスチレン等の熱可塑性樹脂のほか、ガラス等の無機材質が使用可能である。

（可撓性板状体）
本発明の検体採取管は、振動等によって可撓性板状体が検体採取管内部で遊ぶことがないように、検体採取管の中間部分の内壁に挟持された状態で可撓性板状体が収納されている。この可撓性板状体によって、検体採取管の内部が２つの空間に分離されている。そして、本発明では、このような構造を有する検体採取管に、更に、処理剤等の少なくとも一部を後述するように可撓性板状体又は検体採取管の内壁に付着させて収納することによって、処理剤等の個々の固定化剤、浸透化剤、及び特定の物質を標識する物質を（好ましくは、更に抗凝固剤を）、混合状態ではなく、それぞれ分離して収納することができる。

可撓性板状体は、液状の検体を本発明の検体採取管に入れて検体採取管を数回転倒させることによって、検体と処理剤等を混合した際、可撓性板状体が検体中に沈むように、可撓性板状体の比重は検体の比重より大きいことが好ましい。

可撓性板状体は、プラスチック製フィルムであれば何でもよく、例えば、延伸ＰＥＴフィルム、ナイロンフィルム、フィラー充填ＰＰフィルム、フィラー充填ＰＥフィルム、プラスチックラミネートアルミ箔フィルム等が用いられ、更に、必要に応じて表面処理、例えばプラズマ処理やエンボス加工を施してもよい。可撓性板状体として、不織布を板状体に加工したものでもよく、不織布の材料としては、ポリエステル、ナイロン、レーヨン及びそれらを組み合わせたものが用いられる。更に、上記のフィルムに不織布を重ねあわせたものでもよい。可撓性板状体の形状は、検体採取管の形状に合せて、内壁に挟持させることができようにする。例えば、円筒形の検体採取管の場合は、内壁に挟持させることができるような径の円形にする。

可撓性板状体は、後述するように、内壁又は可撓性板状体に付着させること等によって処理剤等が検体採取管に収納されるようにした後、その可撓性利用して、容易に検体採取管に挿入することができる。この場合、例えば浸透化剤を内壁や可撓性板状体に付着させることなく、そのまま検体採取管に入れて収納させる場合は、浸透化剤から離れた所に可撓性板状体を挟持させ、浸透化剤と可撓性板状体が接触していない状態とする。

（処理剤等の内壁又は可撓性板状体への付着）
処理剤等は、それぞれ分離して収納するために、検体採取管の内壁又は可撓性板状体へ付着されていることが好ましい。処理剤等を内壁等へ付着させるには、接着性を示す水溶性高分子を混在させた後に付着させることが好ましい。また、付着部位としては、管口近傍を避けていれば、どの部位にどのように付着させてもかまわない。検体採取管の内壁又は可撓性板状体の全面でも一部でもかまわない。可撓性板状体に固定化剤と抗凝固剤等のように２種類を付着させる場合は、それぞれが離れた所に付着させる。付着方法としてはスプレーコート、ディッピング等の方法により塗布し、後に風乾、熱乾燥、減圧乾燥等の方法により乾燥させる。前記水溶性高分子としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール等の水溶性物質、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の水溶性セルロース誘導体、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシプロピルアクリレート等の水溶性アクリル酸誘導体、ゼラチン、でんぷん等の水溶性多種タンパク質の混合物質等が挙げられる。

また、特定の物質を標識する物質（特定の物質を特異的に捕捉する物質及び標識体、例えば標識化抗体）を内壁へ付着させるには、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）を行う際に通常行われている、プラスチックプレートに抗体を疎水的な相互作用を利用して吸着させる方法を用いることができる。具体的には、例えば、重曹緩衝液（０．１Ｍ，ｐＨ９．６）で２〜５μｇ／ｍｌに希釈した標識化抗体を、コーティング領域（付着させる内壁の領域）に接触させ、室温で３時間（あるいは４℃で一晩）反応させる。吸着しなかった標識化抗体の溶液を回収し、０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むリン酸緩衝液食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、さらにＰＢＳで洗浄を行う。この場合、検体を検体採取管に入れた時に標識化抗体が内壁から離れて検体と混ざるよう促進するために、必要に応じて、検体を検体採取管に入れた後、更に塩化ナトリウム等を加えて塩濃度を上げてもよい。

なお、例えば、浸透化剤のように、液体で内壁等へ付着させることが難しい場合は、そのまま検体採取管に入れて、上記の通り、浸透化剤から離れた所に可撓性板状体を挟持させる。

以下、本発明について実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。
[比較例１]
（従来法による細胞染色法）
抗凝固剤としてＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含む採血管を用いた。採取した血液にＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞、ＡＴＣＣＨＴＢ−２２）を添加し、血液循環がん細胞のモデルとした。その血液を０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液で２倍希釈し、そのうち４ｍＬをあらかじめ密度勾配遠心用分離媒体（Ｆｉｃｏｌｌ、比重１．０７７）３ｍＬを入れたチューブに重層し、室温にて４００ｇで４０分遠心分離を行った。遠心後、赤血球層以外の全層を採取し、新たにＰＢＳを加えて遠心洗浄を３回行い、２０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬）を用いて固定化を行った。２０％中性緩衝ホルマリン液は４％ホルムアルデヒドとなるようにＰＢＳにて希釈を行い、１０分間室温で反応させた。反応後、ＰＢＳで３回遠心洗浄を行った後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と３％ＢＳＡを含むＰＢＳで浸透化処理とブロッキングをし、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識抗サイトケラチン抗体（ベクトンディッキンソン）、ＰＥ（フィコエリスリン）標識抗ＣＤ４５抗体（ベックマンコールター）を加えて１時間反応させた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回遠心洗浄後、Ｈｏｅｃｈｓｔ（ヘキスト３３３４２（同仁化学研究所））による核染色を５分行い、再び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで遠心洗浄を行った。この細胞懸濁液の一部を血球計算盤にて顕微鏡下で蛍光観察を行った。

その結果を図２に示す。血液にがん細胞をスパイク（添加）した血液を、密度勾配遠心法にて赤血球除去したサンプルは、通常の細胞免疫染色法で染色が可能であることを確認した。がん細胞は抗サイトケラチン抗体に、白血球は抗ＣＤ４５抗体にそれぞれ反応している。

[実施例１]
（抗凝固化処理、固定化処理、浸透化処理及び標識化処理を一工程で行う細胞染色法）
抗凝固剤（ＥＤＴＡ）と細胞固定化剤（分析結果から、ジアゾリジニル尿素やイミダゾリジニル尿素等のホルムアルデヒド供与体と推定される）を含む採血管としてＣｙｔｏ−ｃｈｅｘ採血管（Ｓｔｒｅｃｋ製）を用い、採取した血液にＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞）を添加し、血液循環がん細胞のモデルとした。その一部２００μＬに対し０．１％となるようにＴｗｅｅｎ２０を加え、続いて、ＦＩＴＣ標識抗サイトケラチン抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体、及びＨｏｅｃｈｓｔを加えて３０分間反応させた。その一部を血球計算盤にて顕微鏡下で蛍光観察を行った。

その結果を図３に示す。比較例と同様のスパイク血液を、遠心分離で血球分離したり、他のタンパク質等の血中夾雑物を分離することなく、固定化、浸透化、抗原抗体反応が同時に進行し、簡便な操作で、従来の通常染色法と同等の染色結果を得ることができた。

[実施例２]
（密度勾配遠心法を組み合わせた実施例）
抗凝固剤としてＥＤＴＡを含む採血管（テルモ製）を用いた。採取した血液にＭＣＦ−７細胞（乳癌細胞）を添加し、血液循環がん細胞のモデルとし、２０％中性緩衝ホルマリン液（和光純薬）を用いて固定化を行った。２０％中性緩衝ホルマリン液はＰＢＳにて希釈を行い、血液３ｍＬに対し、ホルムアルデヒドの終濃度が０．０８％になるように加え、１０回転倒して混和させた。この血液を、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳで２倍に希釈し、そのうち４ｍＬをあらかじめ密度勾配遠心用分離媒体（Ｆｉｃｏｌｌ、比重１．０７７）３ｍＬを入れたチューブに重層し、室温にて４００ｇで４０分遠心分離を行った。遠心後、赤血球層以外の全層を採取し、その一部に０．１％となるようにＴｗｅｅｎ２０を加え、続いて、ＦＩＴＣ標識抗サイトケラチン抗体、ＰＥ標識抗ＣＤ４５抗体、及びＨｏｅｃｈｓｔを加えて２０分間反応させ、一部を血球計算盤にて顕微鏡下で蛍光観察を行った。

その結果を図４に示す。比較例と同様のスパイク血液を用いて固定化、浸透化及び標識（抗原抗体反応）を一工程で実施した場合、固定化と浸透化の間に密度勾配遠心処理による検出対象細胞画分（赤血球層以外の全層）の取得を行っても、固定化処理剤及び浸透化処理剤を除く遠心洗浄を実施していないことから、実施例１と同等の染色結果を得ることができた。

１検体採取管
２開閉可能な口
３可撓性板状体
４固定化剤（可撓性板状体に付着）
５浸透化剤（液体）
６特定の物質を標識する物質（内壁に付着）
７抗凝固剤（可撓性板状体に付着）

Claims

検体中の細胞が有する特定の物質を特異的に染色する方法であって、
同一の検体採取管内に、前記細胞の固定化処理をする固定化剤と、前記細胞の浸透化処理をする浸透化剤と、前記細胞が有する前記特定の物質の標識処理をする物質と、をそれぞれ接触しないように収納し、
前記検体を、前記検体採取管に加えて混合することにより、前記固定化処理、前記浸透化処理、前記特定の物質の標識処理、
を一つの工程で実施する方法。
前記検体が血液である請求項１に記載の方法。
ホルムアルデヒドを前記固定化剤として用い、その濃度が前記検体の容量に対して０．０１〜１．０容量％で前記細胞を前記固定化処理する請求項１又は２に記載の方法。
界面活性剤を前記浸透化剤として用いて前記細胞を前記浸透化処理する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
前記界面活性剤が、Ｔｒｉｔｏｎ―１００、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｓａｐoｎｉｎ、Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ及びＮＰ−４０からなる群から選ばれる少なくとも一つを含み、かつ、その濃度が前記検体の容量に対して０．０１〜０．５容量％で処理する請求項４に記載の方法。
前記特定の物質を特異的に捕捉する物質及び蛍光標識体を用いて前記細胞が有する前記特定の物質の標識処理をする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
前記特定の物質を特異的に捕捉する物質が抗体である請求項６に記載の方法。
採取した検体を保存し、該検体に含まれる細胞の固定化及び浸透化並びに該細胞が有する特定の物質の標識を同時に行うための、開閉可能な口を有する密封可能な検体採取管であって、
該細胞の固定化剤、該細胞の浸透化剤及び該細胞が有する特定の物質を特異的に標識する物質が、それぞれ接触しないように該検体採取管に収納されている、
検体採取管。
可撓性板状体が、前記検体採取管の中間部分の内壁に挟持された状態で収納されている、
請求項８に記載の検体採取管。
前記固定化剤が前記可撓性板状体上の少なくとも一部に付着され、前記特定の物質を特異的に標識する物質が前記検体採取管の内壁の少なくとも一部に付着され、かつ前記浸透化剤が前記検体採取管内に収納されている請求項９に記載の検体採取管。
前記検体が血液であり、更に抗凝固剤が、前記可撓性板状体上の少なくとも一部に、前記固定化剤、前記浸透化剤及び前記特定の物質を特異的に標識する物質と接触しないように付着された請求項９又は１０に記載の検体採取管。