DE3824936A1

DE3824936A1 - Schnellfixierung

Info

Publication number: DE3824936A1
Application number: DE19883824936
Authority: DE
Inventors: Werner Dr Med Schubert
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1988-06-28
Filing date: 1988-07-22
Publication date: 1990-03-22

Description

Die Erfindung betrifft eine Schnellfixierung für zu fixierende Objekte der Pathologie, Anatomie, Biologie, Bakteriologie, Parasitologie, Mykologie, Botanik und andere Disziplinen.

Formalin ist fast ein Jahrhundert bei Erwärmung der toxischen Flüssigkeit für Schnellschnitte eingesetzt worden. In den letzten Jahren wurde von mehreren Unter suchern auf die Hitzedenaturierung der Eiweißkörper des Gewebes im heißen Wasser hingewiesen, wozu auch die Mikro wellenfixierung gehört (DE-P 34 33 133.6-52 Verfahren zur Schnellfixierung von Organen und Geweben, DE-P 38 21 678.7 Substanzzusatz für die Heißwasserfixierung). Gerbsäure wie Tannin, auch anorganische Gerbstoffe können als Fixierungs mittel benutzt werden; Gerbstoffe wirken antibakteriell und verhindern Verleimung bei höherer Wassertemperatur. Mathilde E. Boon und Kok verwenden zur Zellfixierung wie auch für kleine Gewebsblöcke desgleichen ohne Formalin mit dem von ihnen aufgefundenen und patentierten Kryofix eine Mischung von Äthylalkohol mit Glykol, wobei es sich bekanntlich bei dem Glykol um einen zweiwertigen Alkohol handelt. Kryofix wird vor allem im Mikrowellenofen eingesetzt.

Gewebestücke in der Größe 5 × 5 × 5 mm können im Kryofix bei Raumtemperatur in 8 Stunden vollständig denaturiert/fixiert werden (Boon and Kok, Mikrowave Cockbook of Pathology, Coulomb Press Leyden, 1987). In der Pathologie und anderen Arbeitsbereichen der Biologie sind aber auch wesentlich größere Gewebsstücke und Organe möglichst rasch und dennoch mit guter Struktur erhaltung zu fixieren.

Näheres zum Stand der Technik ist der Fig. 1 zu entnehmen. Man sieht die einengenden Verhältnisse im während des Betriebes geschlossenen Raum des Mikrowellenofens zur Hitzedenaturierung von relativ kleinen Gewebsstücken/Probeexcisionen. Größere Organe können durch Mikrowellen nicht ausreichend oder vollständig fixiert werden. Der von Boon und Kok zur Fixierung benutzte Äthylalkohol, bei höheren im Mikrowellenofen üblichen Temperaturen kommt ab 78°C nicht mehr zur Wirkung, da die Alkoholmoleküle im außerdem vorhandenen Wasser abgeraucht werden. Der Schrumpfung durch Äthylalkoholeinwirkung wird desgleichen auch nach Angaben von Boon durch die Zugabe von einem niedermolekularen Glykol bzw. Polyaethylenglykol = PEG entgegengewirkt, ohne nähere Angaben über den wichtigen Siedepunkt wie andere chemische Eigenschaften.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das toxische Formalin zumindest aus dem Schnellfixierungsbereich zu verdrängen und dennoch strukturmäßig an Zellen und Kernen/Geweben morpho logisch Verhältnisse zu haben, die es erlauben, in kurzer Zeit an Hand von geeigneten Gewebsschnitten Diagnosen den einsendenden Ärzten zur Verfügung zu stellen.

Diese Aufgabe, die histologische Technik in Teilgebieten für Schnellfixierungen zu verbessern, wird durch Angaben im Patentanspruch 1 wie in den nachfolgenden Patentansprüchen gelöst.

Ein großer Teil der mit der Erfindung erzielten Vorteile ist in der Fig. 2 dargestellt. Es sind die drei Siedepunkte für das toxische Formaldehyd minus 16°C, der Siedepunkt des von Boon zur Fixierung verwendeten Methylalkohols 78°C, der unerwartet hohe Siedepunkt des Polyaethylenglykols 300 (PEG genannt), der erst im Bereich von 197°C vorhanden ist und der bekannt und oft genutzte Siedepunkt 100°C des Wasser. Polyaethylenglykol ist also bei Hitzedenaturierungen im Wasser stets present, kann nicht bei 90 oder 100°C abgeraucht werden und hat zudem noch - was Boon desgleichen nicht er kannte oder darlegte - die Wirkung eines einwertigen Alkohols. Im Lehrbuch der organischen Chemie 37.-41. Auflage, Holleman- Richter, Walter de Gruyter und Co/Berlin 1961 auf Seite 161: "Die Glykole gleichen in ihrem Reaktionvermögen den einwertigen Alkoholen". Gerbsäure/Tannin wirken schon in geringer Menge im Wasser/heißen Wasser antibakteriell und im heißen Wasser schützt Gerbsäure gegen Verleimung collagener Fasern. Die Zellkerndarstellung allein nach Tanninzugabe zum heißen Wasser war mikroskopisch gut. Boon und Kok verwendeten Tannin für ihre Mikrowellenfixierungen nicht. Ihr Hauptfixativum war Äthylalkohol.

Die Kontrolle der Erhitzung im Mikrowellenofen ist schwierig, und örtliche Überhitzungen auch mit Wasserdampfkernbildungen und Zersprengungen von Zellsubstanz lassen sich nicht aus schließen. Im für die Fixierung wesentlich geräumigeren Wasserbad oder einem Elektrokocher (mit Thermostat und automatischer Sicherung gegen Überhitzung) können die Tempe raturen sehr genau kontrolliert und bei Verwendung eines Thermometers und Rührers gesteuert werden. Mit dem Siedepunkt des Wassers, ergibt sich automatisch die obere Begrenzung der Energieeinbringung. Der Schrumpfung von Kernsubstanz und Körperzellen wirken sowohl das Tannin wie vor allem das Polyaethylenglykol 300 entgegen. Größere Organe/ganze Körper können in entsprechend größeren beheizbaren Behältern in der relativ kurzen Zeit einer Stunde denaturiert/ für histologische Zwecke fixiert werden, was zudem einer weitgehenden Desinfektion entspricht.

Nach solchen Fixierungen ergeben sich besonders an Probe excisionen keine Gefrierpunkterniedrigungen auf dem Gefrier tisch, Wässerungen wie nach der Formalinfixierung entfallen und in den Gewebeschnitten befinden sich keine Formalin niederschläge.

Zur Schnellfixierung werden also benötigt: Wasser, Gerbstoffe wie Tannin, auch anorganische Gerbstoffe können verwendet werden, zudem das näher charakterisierte Polyaethylenglykol niederen Molekulargewichtes. Diese Substanzen sind selbst in der Apotheke preiswert zu erhalten. Ein Liter Polyaethylen glykol hätte den Preis von 26.-- DM. Bei dem Tannin handelt es sich um ein weißliches bis gelbes leicht hygrophiles Pulver. Das Polyaethylenglykol ist eine farblose visköse Flüssigkeit.

Tannin kann auch für Gewebe- und Organkonservierungen benutzt werden, wofür bisher vor allem Formalin eingesetzt wurde. Sämtliche zur Schnellfixierung verwendeten Stoffe sind un giftig, ganz im Gegensatz zum Formalin, dessen Formaldehyd bereits bei minus 16°C siedet.

Claims

1. Schnellfixierung für zu fixierende Objekte der Pathologie, Anatomie, Biologie, Bakteriologie, Parasitologie, Mykologie, Botanik und andere Disziplinen, dadurch gekennzeichnet, daß für Fixierungszwecke außer der Heißwasserwirkung zur Schnellfixierung nach DE-P 34 33 133.6-52 durch Adjuvans mit Wasser Fixierungsgemische als Fixativum hergestellt/ benutzt werden, daß

a) ein Adjuvans für das Fixativum aus Tannin bzw. Gerb säure, Gerbstoffe verschiedener Herkunft und/oder auch aus anorganischen Gerbstoffen wie Baychrom A besteht, daß
b) ein zweites Adjuvans diesem Fixativum beigemischt wird, welches in einem zweiwertigen Alkohol, somit einem Glykol insbesondere mit geringem Molekulargewicht wie dem Polyaethylenglycolum 300 (PEG) besteht,
daß das Fixativum somit besteht überwiegend aus Wasser,
Tannin in relativ geringer Menge,
Polyaethylenglycolum 300 oder aus einem anderen niedermole kularen Glykol.

2. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung dieser drei Substanzen, also des Wassers, der Gerbsäure und Glykols niederen Molekular gewichtes des histologischen Erfordernissen entspricht, somit daß die verschiedenen Gewebskomponenten, die Zellen und Kerne sich nach Einsatz des Fixativums mikroskopisch gut darstellen, wie auch andere Organismen wie Bakterien, Viren und anderes.

3. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem Hersteller des Fixativums aufgrund histologischer sowie mikroskopischer Untersuchungen ein Rezept über die Zusammensetzung des Fixativums gegeben wird, in genauer Dar legung der Mengenverhältnisse insbesondere wieviel Gewichts einheiten an Tannin dem Wasser/heißen Wasser und wieviel Gramm vom Glykol/Polyaethylenglykol dem Wasser außerdem zuge fügt werden muß, um optimierte Eigenschaften dem Fixativum, für die Herstellung von Gewebsschnitten oder die Fixierung anderer organischer Objekte der Biologie zu geben.

4. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein für den Handel und den Versand geeignetes Fixativum der obengenannten Art ohne Wasser hergestellt wird.

5. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Fixativum ohne Wasser als Zugabe für den Histologen oder Bakteriologen zum Wasser in Einzelpackungen jeweils die für die Denaturierung zu fixierender Objekte geeignete Mengen an Tannin bzw. Gerbstoffe sowie Glykol/Polyaethylen glykol niedrigen Molekulargewichtes vorhanden sind.

6. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Fixativum als solches sowie Abpackungen davon einen kennzeichnenden Namen tragen wie Fixativum 100 (in Andeutung, daß das Fixativum bei 100°C im Wasser zur Schnellfixierung eingesetzt werden kann).

7. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß Tabellen vorhanden sind, die Abweichungen von der Generalzusammensetzung des Fixativums in streng festgelegten Bestandteilen erlauben, beispielsweise wenn es um die Fixierung eines größeren Organes wie des Gehirns geht.

8. Schnellfixierung nach Patentanspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß dem Fixativum mit den bereits genannten drei Bestandteilen hauptsächlich Wasser, Gerbsäure und Polyaethylenglykol auch noch bei niederer Temperatur unter 78°C Äthylalkohol zugefügt werden kann, wie auch eine andere Substanz.