JP3651912B2 - 細胞の固定剤および細胞表面を破壊しないで細胞を染色する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、細胞の性質、例えば、細胞の表面のマーカー、形態学、および光散乱の性質を実質的に破壊しないで、細胞を固定することができる、細胞の固定剤に関する。ある種の好ましい実施態様において、このような固定用組成物を使用すると、細胞の内容物を解放しないで、細胞膜を抗体または問題の他の成分に対して透過性とすることによって、これらの比較的大きい成分を細胞の中に入れることができる。ここに記載する固定剤および細胞の分析法は、細胞を染色して、細胞がウイルスに感染しているか否か、このような感染の程度、ウイルスの感染のある種のパラメーターについて患者の血球をモニターすることによってウイルスの感染のための処置に患者が応答しているか否かを決定するときとくに有用である。
【０００２】
エイズおよび他のウイルスに関係する病気の状態の発生以来、ウイルスの病因論および病理学を研究する新規なかつよりすぐれた方法、ならびにこれらのウイルスが細胞に対して、究極的に患者に対してもつ作用をある方法において阻止または変更するための処置の養生法の治療的に監視する方法に対する要求が増加した。例えば、感染した細胞の百分率をアッセイすることはしばしば望ましい。高いウイルスの負担（ｖｉｒｕｓ ｂｗｄｌｎ）は、通常、病気が激しいことを意味するが、低いウイルスの負担は特定の病気がその初期の段階であるか、あるいは治療的処置に対して応答していることなどを意味する。ウイルスの負担を測定する普通のアッセイは今日まで性質が単に推定的であった。例えば、細胞を分析のために培養しそして滴定することができる。これらのアッセイにおいて、存在するＤＮＡ（プロウイルスの形態）またはＲＮＡのコピーを定量する試みで、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅技術を使用することが普通であり、百分率はＲＮＡがより多いとき、ウイルスはより多い。しかしながら、この種類の技術を使用して得られる結果は、区別なしに、細胞当たり高い量のウイルスの負担を有する少量の感染した細胞または低いウイルスの負担をもつ大きい量の細胞を示すことができるだけである。他の欠点は、「どれだけ多くの」または「どの」細胞が感染したかが知らていないので、ウイルスの感染が反復性または頓挫性であるかについての情報をこの技術に従う決定が提供しないことである。それゆえ、この技術を使用して真のウイルスの負担の評価、ならびにウイルス活性を得ることができない。さらに、感度が許容される結果を与えないすべてを実施することは困難であり、面倒でありそして経費がかかる。
【０００３】
ウイルスの感染は、また、患者の血清の中に存在するウイルスの成分、例えば、ｐ２４（ＨＩＶ−１の場合において）の量を監視することによって監視することができる。しかしながら、この技術はほとんど推定的でありそしてしばしば誤った陰性の結果を与える。例えば、患者は感染の開始において、ウイルスが複製するときであるが、患者の抗体がこのウイルスに対して応答する前に、ｐ２４濃度において短いスパイクを示すことがある。５日から約２〜３週の期間以内に、患者はｐ２４に対する抗体をつくりはじめるであろう。これらの抗体は血漿中のｐ２４に結合し、そしてそれを循環から除去し、そしてイムノアッセイにおいてその検出をブロックする。したがって、患者がいったんｐ２４に対する抗体をつくりつつあるとき、患者は陰性と試験されるので、ｐ２４抗原の成分を検出するための非常に短い窓が存在する。患者が非常に衰弱してｐ２４成分に対する抗体をもはや生産することができるなくなった後、試験は再びｐ２４抗原について陽性の結果を示す。不都合なことには、病気は治療的処置に対する応答の段階を過ぎて進行してしまっているので、患者の予後はこの時点において非常に厳しい。
【０００４】
それゆえ、細胞中のウイルスの負担、およびそれらの細胞中のウイルスの生存能力および複製能力を測定するよりすぐれた道具および技術が絶えず要求されている。この情報はウイルスの感染の進行および処置に対するその応答の決定において評価できない。さらに、病気の進行の非常に初期の段階においてこれらのパラメーターを監視し、そして感染通路を通して妨害されないこの監視を続けることが明確に必要とされている。
【０００５】
とくに、好ましくはウイルスを不活性化し、こうしてこの致死的なウイルスを含有する試料を取り扱う安全性を増加する固定剤を使用することによって、ＨＩＶ感染した個体の中のウイルスの負荷を日常的に監視することが特別に要求されている。医師はこの情報を使用して、ＨＩＶの病気の状態をカテゴリー化し、進行を監視しそして記載し、予後を評価し、そして可能ならば個体の基準で有効な治療的養生法をよりよく調整する。さらに、提案した治療剤がウイルスの負荷を制御するとき安全かつ有効であるかどうかを容易に決定するために、臨床的試験において使用するちょうどこのようなアッセイを製剤の会社および研究者は必要とする。患者を監視するとき有用である細胞分析技術における背景によると、普通のフローサイトメトリーはこのような仕事に非常に適当な技術であることに注意されたい。フローサイトメトリーの基本的概念は、水性懸濁液中の細胞または細胞下の成分を感知領域を通して高い速度で流し、ここで重要な生物学的性質を示す光学的または電気的信号を発生させることである。これらの信号を分析しそして評価のために蓄積する。細胞を蛍光的に染色するが、他の色素系を使用することができ（参照、米国特許第４，９３３，２９３号）そして光散乱の測定または電気的サイジングのためには染色は不必要である。一般に、流体力学的方法を使用して、細胞を強制的にほとんど同一の軌道において均一な速度で強い照明の焦点を通して動かし、この照明は使用する蛍光色素からの蛍光放射を励起する。レーザーは典型的な光源である。細胞は均一な照明を非常に短い期間の間受け取り、そしてすべての角度でこの期間の蛍光および散乱した光のバーストを放射する。光の放射／細胞の分画は光学的配置および光学的信号に対して比例する電気的信号を発生する１または２以上のフォトセンサーにより捕捉される。蛍光の放射は入射光より長い波長において起こるが、散乱した光は波長の変化を経験しないので、これらの２つの信号をフィルターで分離し、そして各細胞について独立にかつ同時に測定することができる。電気パルスを造形し、増幅し、測定し、そして表示するか、あるいは後の分析のために貯蔵することができる。流れの分類は、また、達成して、試料から異なる細胞の集団を分類することができる。典型的には、細胞の懸濁液を小さいオリフィスの中から強制的に出し、そして空気中で高速の液体噴射を形成する。光学的感知は通常オリフィスの出口に密接して噴射の中で実施し、そしてちょうど記載したフローサイトメーターにおいて使用する方法と基本的には同一である。適用した超音波の振動は噴射を均一な滴に破壊し、これらの滴は高い（かつ一定の）電場強度の領域を横切る。決定を行いかつ帯電回路は選択した細胞を含有する滴のみを電気的に帯電させる；不必要な細胞を含有する滴および空の滴は未変化のままである。電場は所望の細胞の下位集団を含有する帯電した滴を１つの容器の中に偏向させるが、すべての他の滴は他の容器へ行く。このようにして高い純度の特定の下位集団をそれ以上の生物学的研究、例えば、形態学または生化学的分析のために得ることができる（上の節は、フローサイトメトリーおよび分類（Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｔｉｎｇ）、Ｍｅｌａｍｅｄら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ、１９７９、ｐｐ．１１−１４、から取った）。
【０００６】
前述の技術を患者の細胞とともに使用して、ウイルスの抗原の存在について分析することができる。このフローサイトメトリーの分析の前に、このこのような患者の中に存在する妨害性抗体を血清で単に洗浄する。しかしながら、ヴィリオン粒子は、存在する場合、細胞の細胞質の中に存在し、そして時には核の中に存在する。細胞の内側ウイルスの抗原をみるために、細胞膜は透過性であって、ウイルスに対する抗体を細胞の中に入れさせなくてはならない。過去の先行技術の技術を使用して、細胞表面のすべてまたは一部分をストリッピング除去して大きい抗体を入れさせる。典型的には、これは試薬、例えば、メタノールまたは脂質を抽出しそしてタンパク質を沈澱させる傾向がある他のアルコールを使用して実施する。このような試薬は基本的には細胞をタンパク質のビーズに変え、このようにして存在することができるタンパク質へのアクセスを提供する。しかしながら、そのように実施するとき、細胞表面の特性は破壊される。
【０００７】
本発明は、細胞の細胞表面の特性を実質的に破壊しないと同時に大きい分子、例えば、抗体を細胞の中に入れさせる、細胞を固定する細胞固定剤および固定技術を提供する。これは内側の細胞からヴィリオン粒子を同時に放出しないで達成される。こうして、細胞を透過しかつそれを固定すると同時に、このような細胞の免疫反応性および光散乱の両者を保存することができる、単一の治療の試薬がここにおいて提供される。ここに記載する固定剤および細胞の分析法はフローサイトメトリーの分析における使用にとくによく適する。
【０００８】
本発明は、
Ｉ、一般構造式
【０００９】
【化２】
Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ
式中、
ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、ＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣＯＮＨ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡｒ、ＯＣＯＮＡｒ₂であり、
ＲはＨまたは１〜６個の炭素原子を含有するアルキルであり、
Ａｒは融合または非融合の、同一であるか、あるいは異なる１〜３個の芳香族環であり、ベンゼン環、ヘテロサイクル環または同一であるか、あるいは異なりそしてＯ、ＮまたはＳである異種原子を含有する環であり、前記環はＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅で置換されており、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、ＲまたはＣＦ₃である、
の化合物、
少なくとも１種を含んでなる、新規な細胞の固定用組成物および細胞分析法を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様において、固定用組成物は、さらに、
ＩＩ、アルコール不含の細胞の固定剤、
ＩＩＩ、細胞膜の透過性を増加するために適当な少なくとも１種の化合物、および／または
ＩＶ、細胞膜を横切る成分の輸送を促進する少なくとも１種の化合物、
を含む。
【００１１】
ある種の最も好ましい実施態様において、４つの前述のカテゴリーの各々から選択される１または２以上の成分からなる固定用組成物が、ことにアルコール不含の固定用組成物の成分が高い等級のホルムアルデヒドであるとき、提供され、そして細胞膜の成分を横切る輸送を促進する化合物はジメチルスルホキシドである。また、細胞の試料をここに記載するように固定用組成物で固定し、次いでそのように固定された細胞を標識した結合性リガンドで検索して、種々の細胞表面のマーカーおよび／または細胞内の成分存在または不存在を検出し、ことに細胞の分析をフローサイトメトリーの使用により達成する、細胞の分析法が提供される。前述の細胞分析を使用して得られた結果を、病気の診断および監視に応用することができる。
【００１２】
本発明は、新規な細胞固定用組成物、細胞の固定用組成物および細胞の分析の方法、ウイルスの負担の監視および患者における病気の進行の監視の方法、ならびにそのために有用な試薬を提供する。それ以上の分析のために、細胞の細胞の性質、例えば、表面のマーカー、細胞の形態学、および細胞の光散乱性質を実質的に破壊しないで、細胞を固定することができる。ここに記載するように固定剤で細胞を処置すると、また、細胞の内容物の実質的な量を逃がさないで、細胞膜を通して細胞の中に抗体または他の所望の成分を入れることができる。本発明の組成物で固定した細胞は、死亡しているが、「生きている細胞」により証明される性質に非常に類似する性質を細胞分析の間に証明する。例えば、細胞の光散乱性質に基づく細胞の型の弁別はなお完全である。さらに、形態学は生きている細胞のそれに非常に類似し、膨潤および収縮は固定された細胞により典型的に表示されたより非常に少ない。総合すると、生きている細胞の集団を分析するのと非常に同一の方法で本発明に従い固定された細胞をしばしば分析することができる。
【００１３】
その最も広い面において、現在特許請求する固定用組成物は、細胞の細胞質を急速に固定して、主要な崩壊なしに、細胞の内容物の完全性をそれらの正常位置に維持する働きをする、少なくとも１種の成分を含んでなる。これはほとんど細胞質を所定位置に「凍結すること」に類似する。この目的に適当な１または２以上の化合物は、次の芳香族化合物のクラスから選択することができる：
一般構造式
【００１４】
【化３】
Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ
式中、
ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、ＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣＯＮＨ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡｒ、ＯＣＯＮＡｒ₂であり、
ＲはＨまたは１〜６個の炭素原子を含有するアルキルであり、
Ａｒは融合または非融合の、同一であるか、あるいは異なる１〜３個の芳香族環であり、ベンゼン環、ヘテロサイクル環または同一であるか、あるいは異なりそしてＯ、ＮまたはＳである異種原子を含有する環であり、前記環はＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ₅で置換されており、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、ＲまたはＣＦ₃である、
の化合物。
【００１５】
固定用組成物はこの一般構造式を有するものから選択される化合物の１つまたは組み合わせを含んでなることができる。
【００１６】
固定用組成物のより好ましい実施態様において、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＨＡｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＣＦ₃またはＲである、
一般構造式を有するものから選択される化合物の１つまたは組み合わせを含んでなることができる。
【００１７】
ある種の他の好ましい実施態様において、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、ＣＯＮＨＲ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨ、ＸまたはＲであり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない。爆発性および他の望ましくない性質は３置換のＮＯ₂化合物において固有であり、したがって、望ましくない性質がある方法で中性されないかぎり、ある種の場合においてこの置換を回避することが好ましい。
【００１８】
とくに好ましい実施態様において、ＸはＳＯ₃Ｈ、ＣＯＯＨまたはＯＨであり、そしてＲ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨまたはＲであり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない。
【００１９】
この一般的クラスに属するとくに好ましい化合物は、２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド、２，４−ジニトロフェノール、３，５−ジニトロサリチル酸、２，４−ジニトロ安息香酸、５−スルホサリチル酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジスルホン酸、３，５−ジニトロ安息香酸、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸、４−ニトロフェノール、３，５−ジニトロサリシルアルデヒド，３，５−ジニトロアニリン、パラトルエンスルホン酸、２−メシチレンスルホン酸、２−（トリフルオロメチル）安息香酸、３，５−ジニトロベンゾニトリル、および２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸である。ジニトロベンズアルデヒド、ジニトロベンゼンスルホン酸、ジニトロ安息香酸、ことに３，５−ジニトロ安息香酸、２，４−ジニトロ安息香酸、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，６−ジニトロベンゼンスルホン酸ベンゼンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスルホン酸、および２，４−ジニトロフェノールはよりとくに好ましい。
【００２０】
本発明の固定用組成物の好ましい実施態様は、賦形剤の中に溶解またはそうでなければ分散した、前述の化合物の１つまたは任意の組み合わせを含んでなることができ、前記賦形剤は化合物および細胞と適合性であり、そしてこのような１または２以上の化合物を含有する均質な液状組成物の調製に適する。
【００２１】
化合物のこの一般的クラスに属する実質的な数の種を、例えば、アルドリッヒ・ケミカルス（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウイスコンシン州ミルウォーキー）、フルカ（Ｆｌｕｋａ）（スイス国）、ジャンセ（Ｊａｎｓｓｅｎ）（ニュージャージイ州およびベルギー国）、イーストマン−コダック（Ｅａｓｔｍａｎ−Ｋｏｄａｋ）（ニューヨーク州ロチェスター）、ランチェスター・ケミカルス（Ｌａｎｃｈｅｓｔｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ニューハンプシャイヤー州ウィンドハム）のような化学物質の供給会社および他のこのようなファインケミカルの供給会社から商業的に入手可能である。有機合成の当業者は、また、理解するように、これらの化合物は新規に、あるいは一部分この化合物に対する中間体はまず前述したように供給会社から商業的に入手される場合、化学的に合成することができる。これらのタイプの化学合成に適当な技術は、次のような論文に記載されているが、これに限定されない：「合成有機化学（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、ＷａｇｎｅｒおよびＺｏｏｋ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９５３；「炭素化合物の化学（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｒｂｏｎ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）」、Ｒｏｄｄ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｎｇ Ｃｏ．、アムステルダム、１９５４（ｖｏｌ．ＩＩＩ、部Ａ）；硫黄の有機化学（Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｓｕｌｆｕｒ）、ＣｈｅｓｔｅｒＭ．Ｓｕｔｅｒ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９４４；「有機合成（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．。当業者は理解するように、多くの場合において、合成しようとする化合物の化学名はこのような論文または実験室のその化合物を合成を詳述する巻の正しいページについてのマニュアルの内容またはインデックスの表をみることができる。ほとんどの場合において、種々の合成を記載するもとの論文はこのような研究の引用文献の節に含められており、そしてまた必要に応じて相談することができる。
【００２２】
より好ましい実施態様において、本発明の固定用組成物は第２成分を含む。本発明の固定用組成物の第２成分は、アルコール不含化合物の１つまたは組み合わせであり、それらの各々はこの分野において一般に「固定剤」として記載されており、そしてタンパク質に取り付けかつそれらの構造を接着することによって作用する。これらのアルコール不含化合物に従う作用の接着メカニズムは変化することがあり、そして遊離アミンの反応、脂質との反応、またはタンパク質の架橋を包含する。これらの固定剤のうちで、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、グリオキサル、マロンアルデヒド、ジアセチル、ポリアルデヒド、カーボジイミド、ジイソシアネート、ジアゾニウム化合物、ジイミドエステル、マレイミド、ベンゾキノン、および他の錯体、例えば、クロム、水銀、オスミウムの三酸化物、塩化パラジウム、ウランなどの１つまたは組み合わせを述べることができる。本発明の固定用組成物の中に含める化合物として、１または２以上のアミン反応性アルデヒド、例えば、グルタルアルデヒド、アクロレイン、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどは好ましい。高い等級のアルコール不含ホルムアルデヒドはことに好ましい。当業者は理解するように、前述の成分は、供給会社、なかでも、シグマ・ケミカルス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミゾリー州）、ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）（ペンシルバニア州ワリントン）、アルドリッヒ・ケミカルス（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ウイスコンシン州ミルウォーキー）などから商業的に入手可能である。これらおよび他の普通に知られている固定剤の化学について有用な論文は、固定の化学および実施（Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｆｉｘａｔｉｏｎ）、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ，Ａ．Ｇ．Ｅｖｅｒｓｏｎ Ｐｅａｒｓｅ、Ｖｏｌ．１、第４版、Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、ロンドン、エディンバーグおよびニューヨーク、１９８０、ｐｐ．９７−１５８、の中に見いだすことができる。主題の成分の濃度は組織の固定において一般に使用されている濃度であり、そして好ましくは、より「おだやかな」固定を与えるために、一般に使用されているより低い濃度である。例えば、反応性アルデヒドの場合において、重量／体積により測定して好ましい濃度（％）は一般に約０．１％（ｗ／ｖ）〜約４％（ｗ／ｖ）である。より好ましい濃度は約０．２％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）であり、そしてとくに好ましい濃度は約０．５％（ｗ／ｖ）〜約１．６％（ｗ／ｖ）の範囲である。
【００２３】
本発明の固定用組成物の最も好ましい実施態様において、第３またはなお第４の成分を添加する。本発明の固定用組成物の第３成分は、化合物の２つの群の１つから選択される化合物または化合物の組み合わせである。第１群は細胞膜を横切る成分の輸送を促進する化合物として機能的に記載することができる。第２群は洗浄剤または界面活性剤、例えば、非イオン性洗浄剤として記載することができる。最もとくに好ましい実施態様において、固定用組成物はこれらの２つのカテゴリーからの少なくとも１種の成分、すべての合計４つの別々の成分からなる。
【００２４】
細胞膜を横切る成分の輸送を促進する化合物のうちで、脂質の単一層の表面のポテンシャルを減少する化合物を述べることのできる。これらのうちで水溶性または水不溶性の「フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）」化合物、例えば、ジメチルスルホキシド、スルホラン、１−メチル−２−ピロリドン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコールなどを述べることのできる。この成分は一般に細胞膜を低分子量の化合物に対していっそう透過性とし、そして細胞の細胞質の中にこのような化合物が入るのを促進すると同時に、細胞の膨潤を防止する。前述の成分、すなわち、固定剤の成分および一般式Ｉの成分は次いで急速に細胞の中に入りそして細胞の内容物を固定した後、任意の実質的にこぼれ出ることができるであろう。細胞膜を横切る成分の輸送を促進する化合物のうちでジメチルスルホキシドは好ましい。なぜなら、ジメチルスルホキシドは細胞膜を横切る成分の輸送を促進するいくつかの化合物よりフソゲン性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）でなく、光散乱への作用が低く、安定であり、そして固定剤の他の成分といかなる程度においても反応しないからである。適当な濃度は実質的な膜の融合を引き起こさない濃度である。好ましい濃度は約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）の範囲であり、約５％（ｖ／ｖ）〜約１５％（ｖ／ｖ）はことに好ましい。
【００２５】
固定用組成物の第３または第４の成分として働くために適当な洗浄剤は、約２００ｋＤ〜約１０００ｋＤの大きい分子、ことに細胞表面のマーカーまたは細胞内の成分などに結合し、こうしてそれらを検出するとき有用な結合性リガンドとして一般に記載した大きい分子に対して細胞膜を透過性とする、洗浄剤または洗浄剤の組み合わせである。このような結合性リガンドのすぐれた例は、標識された抗体、標識されたＤＮＡおよびＲＮＡのプローブ、特定の基質、コファクターなどである。このような結合性リガンドのための典型的な標識は、蛍光性化合物、例えば、フィコビリタンパク質（フィコエリトリンを包含する）、およびフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、放射性標識、酵素のビオチン−アビジンの標識などであり、それらのすべては当業者によく知られている。したがって、洗浄剤または洗浄剤の組み合わせはこの大きさの分子の侵入を収容するために必要な程度に細胞表面を透過することができるべきである。しかしながら、この成分は固定用組成物の他の成分と同調して作用して、脂質または他の成分が細胞内部から抽出されるのを回避することができる濃度で透過を達成すべきである。細胞内部の多すぎる細胞成分が抽出される場合、細胞の光散乱性質は悪影響を受けるであろう。
【００２６】
この第３または第４成分としてここにおいて使用するために好ましいものは、両性イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤、例えば、葉酸ナトリウム、デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ、サポニン、およびエチレンオキシドのポリマー、例えば、エトキシル化アルコール、エトキシル化アルキルフェノール、エトキシル化アミンおよびアミド、「ツイーン（Ｔｗｅｅｎ^R）」系列のポリオキシエチレンソルビタン、例えば、モノラウレート（ツイーン２０）、モノパルミテート（ツイーン４０）、モノオレエート（ツイーン８０）、およびポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ^R）、ポリオキシエチレンエーテルＷ−１（Ｐｏｌｙｏｘ）などである。当業者は理解するように、上の分類に属する化合物のすぐれた記載およびこのような化合物が商業的に入手可能な供給会社は、次の文献に記載されている：「化学的分類、乳化剤および洗浄剤（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）」、マクカチオンの乳化剤および洗浄剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、１９８６、Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎｓ、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、ＭＣ Ｐｕｂｌｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、米国ニュージャージイ州グレンロック、およびＪｕｄｉｔｈ Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ、生物学および生化学における洗浄剤の性質および使用へのガイド（Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ^R）、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌａｎｅｓｅ Ｃｏｒｐ．、１９８７。これらのうちで好ましいものは、シグマ・ケミカルス（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手可能である「ツイーン（Ｔｗｅｅｎ^R）」系列、またはローム・アンド・ハース（Ｒｏｈｍａｎｄ Ｈａａｓ）（ペンシルバニア州フィラデルフィア）から入手可能である「トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ^R）」系列、ことに多数の供給会社から入手可能であるトリトンＸ−７０５、トリトンＸ−１００およびトリトンＸ−１１４のポリオキシエチレンソルビタン類である。これらの好ましい濃度は約０．００１〜約０．２％（ｗ／ｖ）の範囲であり、約０．０５〜約０．１％（ｗ／ｖ）はとくに好ましい。
【００２７】
本発明の固定用組成物は、ここに記載する１または２以上の成分を選択し、次いで所望の１または２以上の成分を適当な緩衝液または他の液体の賦形剤、例えば、等張媒質の中に物理的に分散させることによって調製される。このような適当な賦形剤の例は、リン酸塩緩衝液、生理食塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＥＳ、ハンク均衡塩溶液、ＲＰＭＩを包含する。細胞の変性または変形は回避すべきであり、そして賦形剤中の化合物の濃度は、ここに記載する技術に従い細胞を固定するために適当な濃度であるべきである。成分を液体の賦形剤の中に均質に分散させるか、あるいは実際に可溶化すべきである。上に詳述したように選択した、量の固定用組成物の種々の成分を、混合条件下に適当な容器の中で組み合わせる。当業者は、各成分を混合物に添加する順序を日常的に選択することができる。例えば、最もとくに好ましい実施態様において、リン酸塩緩衝液をまず容器に連続的に混合する条件下に添加し、次いでＤＭＳＯ、ＤＮＢＳ（固体として）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ^R）、およびホルムアルデヒドを添加する。固定用組成物を調製する成分のこの添加順はとくに適当であることが発見された。この混合法は典型的には室温において実施するが、当業者はこの温度を日常的に変化させることができる。
【００２８】
本発明の固定用組成物は、任意の型の原核生物または真核生物の生きている細胞、ことにバクテリアおよび哺乳動物の細胞を固定するために使用できる。細胞を適当な量の固定用組成物と接触させ、そして少なくとも約１分間このような接触を維持し、約２０分〜約２時間のインキュベーションは好ましい。このようなインキュベーションの間維持する温度は一般に０℃〜約３７℃であり、室温は好ましい。適当に使用される固定用組成物の量は（試料の細胞／固定用組成物の相対量（体積／体積））約１：１〜約１：１００（ｖ／ｖ）の間で変化し、約１：１０〜約１：３０（ｖ／ｖ）はとくに適当である。過剰の細胞固定用組成物は、遠心分離を包含する任意の普通の手段により除去することができ、そして必要に応じて細胞分析の前に、細胞を適当な細胞懸濁媒質、例えば、緩衝液の中に再懸濁させる。細胞の固定の当業者はこれらの前述の細胞処理のパラメーターを日常的に変化させて、細胞の性質を実質的に破壊しないで、所望の細胞の固定を得ることができる。好ましい実施態様において、本発明の固定用組成物は骨髄細胞および血球、ことに白血球の固定において使用される。次いでそのように固定された細胞を当業者に知られている任意の適当な技術により検査することができる。このような細胞分析の例は、電子顕微鏡、光学顕微鏡を包含する顕微鏡、免疫蛍光、フローサイトメトリーなどの使用による。
【００２９】
本発明の固定用組成物を利用する細胞分析の好ましい方法はフローサイトメトリー使用による。背景によると、フローサイトメトリーはそれらの意図する用途に依存して種々の立体配置で存在する。しかしながら、それらのすべては４つの本質的な特徴を含有する。各々は入射光源、試料を入射光が収束される点に運ぶ流体の流れ、反射した光または試料から放射された光を電気信号に変換する光学系、および最後に、情報をユーザーに出力する手段を有する。レーザーは非常に高い強度の単一の波長を供給するので、最も普通の光源である。フローサイトメーターはバクテリアの細胞、染色体、腫瘍細胞および例示の目的で他のものを包含する広範な種類の試料について使用されてきているが、この論考は白血球の単一の試料懸濁液からなる試料の分析を強調する。
【００３０】
一般に、細胞の懸濁液を分析するために、試料を狭い注射口を通して流体流の中心の中に導入する。この流れは２つの目的をはたす；第１に細胞を入射光および光学系が収束される点にもっていくこと、そして第２に単一の列で細胞を方向づけること。細胞は単一の列で移動するので、細胞は光線で一度に１回調べられ、そして各細胞により反射または放射された光を測定し、そして試料中の他の細胞に対して独立に記録される。細胞がレーザー光の中に運ばれるとき、細胞はビームを破壊し、それをすべての方向に散乱させる。細胞は光を散乱するが、光の波長を変化させない。したがって、散乱した光は異なる通路に沿って移動するが、入射光のビームと同一の波長を維持する。典型的には、細胞の懸濁液は蛍光色素または蛍光色素にカップリングした抗体で処理されてきている。これらの蛍光化合物は１つの波長の光を吸収し、そしてより大きい波長の光を放射する。こうして、細胞が蛍光色素を含有するか、あるいは抗体−色素の複合体と反応した場合、散乱する光に加えて、細胞は蛍光色素の特徴を示す波長の光を放射する。放射された光の量は存在する蛍光分子の量に対して比例する。各細胞が放射した光の量を測定し、そしてその「蛍光強度」と呼び、これをユーザーが表示する目盛りで数値、例えば、１〜１０，０００として描写する。
【００３１】
フローサイトメーターは、典型的には、フォトンを電気的インパルス変換するためにいくつかの光電子増倍管を含有する。各光電子増倍管の前に配置されたフィルターは、光電子増倍管がそれに対して応答する波長を選択する。入射ビームは光電子増倍管を含有する検出系に入るのを妨げられる；したがって、細胞が散乱するか、あるいは細胞から蛍光として放射される光のみは光電子増倍管に到達することができる。散乱した光は２つの場所で集められる；入射ビームの軸からほんのわずかに偏向した低い角度で、およびビームに対して直角で。前者を低い角度または前方の散乱と呼ぶ；これに対して、後者は直角または側面の散乱と呼ぶ。２つの異なる角度で散乱した光を測定する理由は、前方および側面の散乱が細胞について異なる情報を提供するからである。どれだけ多くの光が前方の方向に散乱するかは、細胞の大きさおよびその屈折率に依存する。細胞が大きくなればなるほど、細胞はより多くの光を前方の方向に散乱する。ビームに対して直角で散乱する光は、細胞内のオルガネラの複雑さおよび数より細胞の大きさに依存する程度が少ない。
【００３２】
リンパ球は小さい細胞であり、したがって低い前方の散乱を有する。リンパ球は、また、非常にわずかの細胞質および規則的な形状の核を有するので、低い側面の散乱を示す。単球はリンパ球より大きく、それらの細胞質は顆粒性であり、そしてそれらの核は複雑である。予測するように、単球は前方および側面の方向の両者においてリンパ球より多くの光を散乱する。顆粒球は大きさをリンパ球程度に小から単球より大きくまで変化することができる。顆粒球が示す広い範囲の前方の散乱はこの大きさの不均質性を反映する。しかしながら、それらの細胞質の顆粒および不規則な形状の核のために、顆粒球は血液の中の３つの主な細胞の型の大部分の側面の散乱を示す。各細胞がビームと通過するときの各細胞の光散乱を測定し、そして前方の散乱（ＦＳＣ）／側面の散乱（ＳＳＣ）のグラフにプロットすることができる。オペレーターはこのようなプロットを使用して、細胞の型を分離および同定し、計装を細胞の型の１つ、２つ、または任意の組み合わせからのデータを表示しそして保存することができる。
【００３３】
光散乱の使用は図１および図２に示されており、そしてそれらの図はベクト・ディケンソ・コーポレーション（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能であるＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで測定した、光散乱性質を有する細胞の数の３次元の表示である。前方の光散乱を横座標（Ｘ−軸）１０にプロットし／ＳＳＣを縦座標（Ｙ−軸）１２にプロットした。細胞の数をＺ−軸１４に表す。各細胞についてＦＳＣおよびＳＳＣの強度を測定し、そして１〜１０００の目盛りで相対値を得た。図１は生きている未固定の細胞を使用する結果を示し、それぞれ、１００はリンパ球のクラスターを表し、１０２は単球のクラスターを表し、そして１０４は顆粒球のクラスターを表す。図２は本発明の固定用組成物で固定した後の細胞を使用する結果を示す。固定しそして透過性としたが、細胞のクラスターはよく定められままであることが明らかであった。光散乱は因子、例えば、細胞の大きさ、細胞質の複雑さおよび細胞の屈折率に依存するので、固定された細胞の光散乱が未固定の細胞のとほとんど変化しないことは驚くべきことではでなかった。しかしながら、固定後、細胞の３つの集団は光散乱単独で分割さればかりでなく、かつまたリンパ球、単球および顆粒球の分離は改良することができたことは驚くべきことであった。
【００３４】
細胞がリンパ球、単球または顆粒球であるという情報は有用であるが、それよりおおい情報は完全な分析のために要求されることがある。多数の異なる種類のリンパ球が存在し、そしてそれらは非常に明確な機能を有する。あるリンパ球は抗体（Ｂ−細胞）を生産するが、他のものは免疫系を調節するか、あるいはある種のエフェクター機能を実施する（Ｔ−細胞）。リンパ球の機能的サブセットを同定しかつ数えることができることは、免疫学的研究および免疫系の病気の診断および監視において必須である。しかも、リンパ球の機能的サブセットはそれらの光散乱でのみでは弁別することができない。幸いにも、機能が異なるリンパ球は、また、それらが発現する抗原において異なる。その結果、Ｔ−細胞の特定の機能的サブセットと反応する抗体が開発されてきている。例えば、Ｔ−細胞は免疫系の全体の機能に対して重要である。それらの名称が意味するように、それらの役割は外来物質、例えば、ウイルス、バクテリアおよび寄生生物に対して有効な応答を担うように免疫系を助けることである。ヘルパーＴ−細胞はそれらの表面にＣＤ４分子を発現し、そして抗ＣＤ４抗体はこれらのヘルパーＴ−細胞と反応する。フローサイトメーターはこの事実を利用して、個体のリンパ球のどれだけ多くがヘルパー型であるかを決定することができる。蛍光分子を抗ＣＤ４抗体にカップリングさせる。普通に使用される分子はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）である。この化合物は青色光を吸収し、そして緑色光を放射する。白血球の試料を抗ＣＤ４−ＦＩＴＣと反応させ、次いでフローサイトメーターで分析する。単一の例を移動する細胞を青色のレーザー光で照明し、そして前方および側面の方向に散乱した青色光の量を決定する。同時に、細胞が放射する緑色光の量を測定する。抗体と反応したＣＤ４陽性のリンパ球は、それらが散乱する青色光に加えて緑色光を放射する。非ヘルパーＴ−細胞と同一の方法で光を散乱するが、抗体が存在しないので、緑色光を放射しない。フローサイトメーターはその光散乱のプロフィルにより細胞をリンパ球として同定し、次いで緑色光を放射するリンパ球の数／放射しない数を計数するように作ることができる。このようにして、ヘルパー細胞であるリンパ球の比率を決定することができる。
【００３５】
抗ＣＤ４−ＦＩＴＣと反応するすべての細胞がヘルパーＴ−細胞であるわけではない。また、単球はそれらの表面上にＣＤ４を発現するが、その濃度はヘルパーＴ−細胞より低い。ＣＤ４の濃度が低いことは、単球の表面に結合する抗体が少なく、それゆえより少ない緑色光を放射する。これは単球をヘルパーＴ−細胞より暗くするが、ＣＤ４陰性細胞より輝くようにする。しかしながら、単球はリンパ球より大きい前方および側面の散乱を有するので、ユーザーは所望の光散乱のプロフィルを有する細胞からのデータを受け入れるか、あるいは無視するようにフローサイトメーターに指令することができる。光散乱のプロフィルを区別することができると、ＣＤ４陽性単球から干渉されないで、ＣＤ４陽性リンパ球を正確に計数することができる。これはある病気、例えば、後天性免疫欠損症候群（エイズ）においてとくに重要なである。ヘルパーＴ−細胞は健康な人々におけるより少ない蛍光であるか、あるいは暗く見えることがある。光散乱のプロフィルがある細胞をリンパ球と同定しなかった場合、暗いＣＤ４ヘルパーＴ−細胞はそうでなければ単球と解釈され、これはヘルパーＴ−細胞の数を低く評価することに導くであろう。
【００３６】
より複雑なアッセイは同時に添加された第２抗体を使用する。この場合において、第２抗体は第１抗体と異なる特異性を有し、そして異なる色の光を放射する色素とカップリングされる。典型的には、フィコエリトリン（ＰＥ）は青色光を吸収し過ぎるが、黄色の蛍光を発生するので、それをこの目的に使用する。このようにして、ある細胞がＦＩＴＣ標識された抗体、ＰＥ標識された抗体または両者のいずれと反応するかを決定することができる。例えば、ＤＲとして知られている抗原は、細胞が活性化されていないかぎり、Ｔ−細胞上で発現されない。対照的に、ＤＲ抗原は大部分のＢ−細胞上で発現される。白血球が抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ＤＲ−ＰＥ抗体と反応する場合、反応性のすべての４つの可能な組み合わせが期待されるであろう。あるリンパ球はいずれの抗体とも反応せず、そして光のみを散乱するであろう。非活性化Ｔ−細胞は抗ＣＤ３抗体と反応し、そして緑色光のみを放射するであろう。Ｂ−細胞は抗ＤＲ抗体と反応し、そして黄色光のみを放射するであろう。しかしながら、活性化されたＴ−細胞は両者の抗体と反応し、そして緑色および黄色の両者の光を放射するであろう。このような場合は図３に示されており、これはＦＡＣＳｃａｎを使用して得られたサイトグラムである。それゆえ白血球は抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ＤＲ−ＰＥと反応し、そして光散乱に基づいてリンパ球として選択した、リンパ球の蛍光を横座標１０の各細胞の緑色蛍光の強度および縦座標１２の細胞の黄色蛍光とともにプロットした。未反応の細胞のクラスターは起源１６に存在する。Ｂ−細胞は垂直にクラスター１８の中に変位し、これは未反応の細胞と区別されるが、その真上に存在する。未反応のＴ−細胞は横座標に沿ってクラスター２０の中に変位し、これは未反応の細胞と区別されるが、それらのちょうど側面に存在する。最後に、活性化されたＴ−細胞は同一量のＣＤ３を発現するので、非活性化Ｔ−細胞とちょうど同一の多さの緑色光を放射するが、それらはＤＲ抗原を同時に発現し、そして抗ＤＲ−ＰＥ抗体と反応しているので、黄色光を放射する。
【００３７】
この場合は第３抗体または青色光を吸収しそして赤色光を放射するＤＮＡ／ＲＮＡ染色を含めることによって、なおいっそう複雑とすることができる。試薬のこの配置は１つおよび２つの色試薬の分析の前の論考で既にカバーされているフローサイトメトリーの原理を例示しないので、詳細に説明しない；しかしながら、それは細胞の複雑かつ精巧なフローサイトメトリー分析がどのようになるかを例示する働きをする。１例として、第３試薬がＤＮＡ染色である場合、細胞中のＤＮＡの量を測定することができる。ＤＮＡの量は細胞が休止しているか、細胞分割のためにＤＮＡを合成しているか、あるいは分割しようとしているかどうかに依存する。ＤＮＡの量の定量により、ユーザーは細胞のサイクルの種々の段階において細胞を選択性に検査することができる。次いで、ある種の抗原が常にある細胞により発現されるか、あるいは細胞のサイクルの制限された部分の間に存在するかどうかを決定することが可能となる。このようなデータは本質的に１つおよび２つの色のアッセイを実施するように分析されるが、同時の反応の複雑さについてのより大きい認識をもって測定される。
【００３８】
本発明の細胞分析法に従い、細胞試料をまず任意の種々の細胞源から得る。このような試料は精製するか、あるいは精製しないことができるか、あるいはそうでなければ普通の細胞分析のプロトコルに従い予備処理することができる。好ましい実施態様において、血液試料を得る。下の実施例ＩＩは典型的な血液試料の収集手順を記載している。しかしながら、現在の方法は、固定前に、赤血球をフィコール処理しないで、あるいは全血試料からの白血球を溶解しないで実施することができる（参照、実施例ＩＶ）。本発明の細胞固定用組成物を、細胞表面の膜を実質的に破壊しないで、細胞を固定するために十分な量の固定剤を使用して、細胞と混合する。
【００３９】
１例としてのみ、患者の全血の試料は日常的静脈穿刺、抗凝固剤、例えば、ＥＤＴＡまたはヘパリンを含有する管の中への抜き出しにより得ることができる。次いでほぼ０．１ｍｌの全血をここにおける技術に従い調製した２ｍｌの固定剤溶液と混合し、そして室温に維持する。血液／固定剤混合物を室温において３０分間インキュベーションし、遠心して細胞を沈澱させ、次いで上澄み液を吸引により除去する。そのように固定された細胞を洗浄緩衝液の中に再懸濁させ、そして約１０分間放置する。次いで細胞をリン酸塩緩衝液および血清中で２回洗浄する。必要に応じて、残りの赤血球を標準の溶解手順を使用して溶解することができる。
【００４０】
この基本的手順を多数の方法で変化させることができる。例えば、固定法の工程を実施する前に、まず全血試料を等張希釈剤で希釈することが望ましいことがある。溶解した全血をまた試料として使用することができる。全血をまず標準の方法および手順により、例えば、塩化アンモニウム処理により処理して、赤血球を溶解することができる。次いで未溶解の全血球を洗浄しそして好ましくは１〜２×１０⁷細胞／ｍｌである濃度に、等張媒質の中に再懸濁させ、次いで上の手順に従い処理する。血液試料をまたまず標準の方法によりフィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）で処理して、赤血球および顆粒球を除去することができる。次いでリンパ球および単球を好ましくは約１×１０⁵〜約１×１０⁸細胞／ｍｌ、より好ましくは約１〜２×１０⁷細胞／ｍｌで懸濁させ、そして上のようにして固定する。血球分析の当業者は、血液試料の調製についてのこれらおよび他の技術を理解および認識するであろう。
【００４１】
次いで細胞分析を前述の技術および概念および次の実施例に従って実施し、ちょうど細胞が未固定の生きている細胞である場合も同様である。
【００４２】
本発明の固定用組成物およびフローサイトメトリーの技術を使用して、臨床医は患者の細胞集団、例えば、白血球の試料を感染するウイルスの負荷を研究することができる。ある種の好ましい実施態様においてＨＩＶ感染した個体の研究をここに記載する方法を使用して実施することができる。例えば、Ａ．ベネット（Ｖｅｎｅｔ）ら、「細胞のウイルス負荷の定量：ＣＤ４細胞の計数との相関関係（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄ：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ＣＤ４ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ）、ＨＩＶ感染におけるウイルスの定量（Ｖｉｒａｌ Ｑｕａｔｉｔａｔｉｏｎ ｉｎ ＨＩＶ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、Ｊ．−Ｍ．Ａｎｄｒｉｅｕ編、Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｒ Ｅｕｔｏｔｅｘｔ、パリ １９９１、ｐｐ．２７−３６、には、ウイルス負荷の監視の有用性が記載されている。しかしながら、彼は種々の患者の血球分析から要求された情報を引き出すことを試みるために、面倒な、危険な、経費がかかる細胞の培養技術を使用している。
【００４３】
図１、図２および図３に描写するデータを得たフローサイトメトリーの技術、およびここに記載する固定用組成物を使用して、臨床医は患者の血液試料を分析して細胞の表現型、どの細胞がウイルスで感染しているか、およびどれだけ多くの細胞がウイルスを増殖しているかを決定することができる。さらにある場合において「どれだけ多くの」ウイルスがある種の細胞の中に存在するかを決定することさえ可能である。この情報を使用して、臨床医は次いで診断、治療的監視、患者の予後などを決定することができる。例えば、同様なＣＤ４陽性の計数を有する２人は非常に異なる臨床的表現および進行を実証することがある。本発明の技術および組成物を使用すると、各患者のそれぞれのウイルスの負担を決定することができる。例えば、一方の患者は２００のＣＤ４の計数を有するが、実際にはウイルスを複製している０．１％より少ないＣＤ４陽性細胞を実証することがある。第２の患者は４％のウイルスを複製するＣＤ４陽性細胞を有することがある。この後者の場合において、病気の進行はさらに進行していることがあり、そして予後はいっそう悪い。あるいは、ウイルスは薬物耐性を獲得していることがあり、そして臨床医は処置の生活規制を変化することがある。
【００４４】
多数のウイルスを、同様な方法において、患者の試料の中でそれら自身のためにあるいはＨＩＶまたは問題のある他のウイルスと同時に監視することができる。興味あることには、それは無症候性であるＨＩＶ患者においてまず検出される他のウイルス、例えば、肝炎ウイルスの存在であることがある。１または２以上の他のウイルスのための無症状のウイルス血症は、また、患者の免疫系が破壊されていることを示すことがある。これはＨＩＶウイルスそれ自体がはびこる前に起こることがある。また、他のウイルスからの増加するウイルスの負担の存在下にＨＩＶは真の免疫抑制の徴候であることがある。こうして、ここに記載する技術および組成物は免疫系の競争または機能の急速な全体の評価を提供する。
【００４５】
また、研究者および臨床医のために便利な本発明の固定用組成物を適当な細胞マーカーと組み合わせてを含有する試験キットが提供される。１例として、有用な組み合わせ試薬キットは、本発明の固定用組成物を含有する容器、ならびにオルト・ダイグノスチック・システムス・インコーポレーテッド（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）（ニュージャージイ州ラリタン）から入手可能な抗体である、オルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＴ４、オルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＴ８、およびオルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＤＲを含有する容器からなる。次いで、このキットをここに記載する技術に従い利用して、種々の型のウイルスの感染を監視する。ユーザーは理解するように、このキットは問題のウイルスのすべてまたは一部分に対する１または２以上の抗体と組み合わせて使用する。このような組み合わせ試薬キットを使用して、患者の免疫系をパノラマ的に監視することができる。好ましい組み合わせキットの実施態様において、キットそれ自体は問題の種々のウイルスに対して抗体または抗体のパネルを含むことができる。例えば、ＨＩＶの検出において、ＨＩＶウイルスに対する１または２以上の抗体、例えば、抗ｐ２４、抗ｐ１７、抗ｇｐ４１、抗ｇｐ１２０などをまたキットの中に細胞表面のマーカーに対するある種の抗体、例えば、前述のオルトミューン（Ｏｒｔｈｏｍｕｎｅ^R）ＯＫＴ抗体と組み合わせて含める。
【００４６】
次は本発明のより特定の実施態様であるが、本発明を限定すると考慮すべきではない。
【００４７】
【実施例】
実施例１
光散乱性質を保存することの現在の技術の失敗および細胞表面の抗原の染色を示す比較例
比較例１：パラホルムアルデヒドの固定後の細胞集団の区別
４ｇのパラホルムアルデヒド（ＰＦ）を４００ｍｌのリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中に入れた。１％（ｗ／ｖ）のＰＦ懸濁液を、絶えず撹拌しながら、すべてのＰＦが溶解するまで、加熱した。
【００４８】
血液を単一のドナーからヘパリン添加した管の中に集め、次いで遠心（４５７×、１０分）した。２本の血液収集管からのバッフィコートを５０ｍｌの遠心管の中にプールし、そして５％（ｖ／ｖ）のウマ血清（ＨＢＳＰ）を補充したハンクス平衡塩溶液（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を使用して、合計の体積を３５ｍｌに調節した。１０ｍｌのフィコール−ハイパーク（ｆｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ）（Ｌｙｍｐｈｏ−ｐａｑｕｅ、Ｎｏｃｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａ Ａｓ）を、フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）バッフィコートの界面の混合を防止するように注意して、バッフィコートの下に層状にした。この管を１１７０×ｇで２２℃において２０分間回転した。フィコールの界面に存在する末梢血液のリンパ球および単球を集めた。赤血球および多形核白血球を含有する細胞のペレットを廃棄した。白血球および単球を氷冷ＨＢＳＰの中に希釈し、次いで遠心（４５７×ｇ、４℃、８分）により沈澱させた。細胞を再びＨＢＳＰの中で洗浄した。
【００４９】
細胞をＰＢＳの中で１回洗浄し、次いで４ｍｌのＰＢＳ（４×１０⁷細胞／ｍｌ）の中に再懸濁させた。細胞を４つの１ｍｌのアリコートに分割した。第１の管に１ｍｌのＰＢＳを入れ、そして管２〜４に１ｍｌの１％のパラホルムアルデヒドに入れた。すべての管を室温において３０分間インキュベーションした。すべての管をＰＢＳの中で２回洗浄した。管１および２を要求となるまで氷の中に再懸濁させた。管３に１ｍｌの０．５％（ｗ／ｖ）のノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ４０（ＮＰ４０；ＢＤＨ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を添加し、そしてそれを室温において３０分間インキュベーションした。管４に６．６ｍｌのメタノール（−７０℃）を添加し、そしてそれを０℃において３０分間インキュベーションした。
【００５０】
すべての細胞を、処理に無関係に、５ｍｌのＨＢＳＰ＋２％（ｖ／ｖ）ヒトＡＢ血清の中で２回洗浄した（４５７×ｇ、４℃、８分）。すべての細胞を１×１０⁷細胞／ｍｌの濃度でＨＢＳＰ＋２％のヒトＡＢ血清（ＨＢＳＰ−ＡＢ）の中に再懸濁させた。２００μｌの各細胞の懸濁液をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）接合モノクローナル抗体：対照、ＯＫＴ３、ＯＫＴ４およびＯＫＴ１１（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州ラリタン）とインキュベーションした。細胞の懸濁液を０℃において３０分間インキュベーションし、次いで氷冷ＨＢＳＰ−ＡＢの中で遠心（４５７×ｇ、４℃、８分）により２回洗浄した。
【００５１】
光散乱性質および蛍光抗体の結合レベルを日常的フローサイトメトリー技術によりＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメーターを使用して決定した。ＦＡＣＳｃａｎに４８８ｎＭの光を放射するアルゴンのレーザーを設置した。５３０／３０ｎＭのバンドパスフィルターを装備した蛍光検出器（ＦＬ１）をＦＩＴＣ蛍光の定量のために使用した。特記しない限り、光散乱の測定を０〜２５６単位の直線の目盛りで行い、そして蛍光を１〜１０⁴単位の対数目盛りで測定した。
【００５２】
対照−ＦＩＴＣ抗体で処理した未固定の生きている細胞についての前方の光散乱（ＦＳＣ）およびＦＩＴＣ蛍光のレベルを測定した。１％のパラホルムアルデヒド（ＰＦ）で予備処理した細胞を、また、同一方法において分析した。
【００５３】
細胞を１％のＰＦで処理したが、２つの明確な細胞の集団はＦＳＣにより区別された。リンパ球を１０５付近のＦＳＣ（１〜２５６の目盛りで）で見られるが、これに対して単球は１８０付近のＦＳＣを有した。１％のＰＦで処理した細胞は、生きている、未固定の細胞より多くの、対照−ＦＩＴＣ抗体の非特異的結合を表示した。
【００５４】
細胞をＯＫＴ３抗体で処理し、そして同様な方法において測定する実験を実施した。ＯＫＴ３はＴ細胞の表面上の分子ＣＤ３と反応する。ＣＤ３はＢ細胞または単球上に存在せず、それゆえこれらの細胞はＯＫＴ３と反応しない。ＯＫＴ３と結合するリンパ球はＰＦ処理した細胞において明らかであった。ＰＦ処理した細胞の平均の蛍光は未処理の細胞より低かった；そして陽性および陰性の集団はＰＦ処理後によく分離されなかった。ＯＫＴ３のより低い結合の強度が示唆するように、ＣＤ３はＰＦ処理により損傷されることがあるが、ＯＫＴ３がもはや結合しない点まで変更されることがない。リンパ球および単球がそれらのＦＳＣに基づいて区別されたという追加の証拠は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞が単球の細胞のクラスターの中に存在しないという発見であった（ＦＳＣほぼ１８０、１〜２５６の目盛りで）。
【００５５】
細胞をまた抗体ＯＫＴ４で処理した。ＯＫＴ４はＴ細胞のヘルパーのサブセットの表面上のＣＤ４に結合する。ＯＫＴ４はＰＦで処理したリンパ球に結合した。ＣＤ３と異なり、ＣＤ４は単球の表面上で低いレベルで発現される。こうして、生きている、未固定の単球はＯＫＴ４で暗い蛍光を示した。ＰＦで処理した単球はＯＫＴ４に結合するように思われなかった。しかしながら、ＣＤ４は単球上で低いレベルで発現されるので、ＣＤ４に対する少量の損傷さえこれらの細胞を陰性とするであろう。ＣＤ３を使用する場合のように、ＣＤ４はＰＦ処理により損傷されたように事実思われるが、破壊しなかった。
【００５６】
ＯＫＴ１１の染色をまた実施し、そして前述と同一の方法で測定を実施した。ＯＫＴ１１はＴ細胞の表面上のＣＤ２と結合する。生きている、未固定の細胞上で、ＯＫＴ１１陽性の集団は中程度のみの蛍光を表示した。ＯＫＴ１１の染色はＰＦ処理した細胞上で観察されなかった。ＰＦによる処理は、ＯＫＴ１１がそのエピトープに結合するのを防止する方法でＣＤ２を変更するように思われる。
【００５７】
比較例２：メタノール調製物
細胞内抗原を可視化するために、単に細胞を固定することは不十分である。細胞をまた抗体程度に大きい分子に対して透過性としなくてはならない。細胞を透過性とするために最も頻繁に使用されている方法は、固定された細胞のメタノールまたは洗浄剤の処理である（ジャコッベージャー（Ｊａｃｏｂｂｅｒｇｅｒ）、Ｊ．Ｗ．（１９８９）核のタンパク質の細胞サイクルの発現（Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）。Ａ．Ｙｅｎ（編）、フローサイトメトリー：アドバンスド・リサーチおよびクリニカル・アプリケイション（Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：ａｄｖａｃｅｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ Ｆｌ、に概観されている）。メタノールはさらにタンパク質を固定し、それらのコンフォメーションを不規則化し、そして膜の脂質を抽出する。洗浄剤の処理は膜の脂質を抽出し、孔をつくり、ここを通して抗体は細胞を自由に出入りすることができる。
【００５８】
１％のＰＦの中で固定した細胞／１％のＰＦの中で固定し、次いでメタノールで透過性化した細胞の免疫染色および光散乱性質を測定した。ＦＳＣに基づいてリンパ球と単球とを区別する能力は、メタノール処理により減少する。さらに、メタノール処理した細胞は対照−ＦＩＴＣ抗体の非特異的結合を増加した。しかしながら、最も重要な発見は、メタノール処理した細胞がＯＫＴ３、ＯＫＴ４ともはや反応せず、そしてなおＯＫＴ１１と反応しなかったことであった。
【００５９】
比較例３：洗浄剤の処理
１％のＰＦの中で固定した細胞／１％のＰＦの中で固定し、次いで洗浄剤（０．５％のＮＰ４０）で処理した細胞の免疫染色および光散乱性質を、また、比較の目的で測定した。リンパ球と単球とを区別する能力は、洗浄剤の処理により減少する。洗浄剤で処理した細胞は、また、１％のＰＦで処理した細胞を越えた非特異的対照−ＦＩＴＣの結合の顕著な増加を示した。ＯＫＴ３は洗浄剤処理した生きている細胞に事実結合したが、陽性の集団と陰性の集団との間の分離は非常に少なかった。リンパ球と単球との劣ったＦＳＣ分離は、光散乱によるこれらの集団の分離の信頼性を無くした。その結果、ＯＫＴ３陽性リンパ球の百分率は、洗浄剤の処理後に正確に決定されなかった。ＯＫＴ３はＣＤ３陽性リンパ球になお結合したが、どれだけ多くのＣＤ３陰性細胞が真にリンパ球であるか、および洗浄剤で変更されたＦＳＣをもつ単球がどれだけ多くかを確実に知ることは不可能であった。単球の光散乱性質への洗浄剤の処理への作用は、洗浄剤で処理した細胞をＯＫＴ４で処理したとき、明らかとなった。リンパ球および単球の両者はＣＤ４陽性細胞を含有するので、期待するように、ＯＫＴ４はリンパ球と結合し、そしてより少ない程度に単球に結合した。細胞のこれらの集団、およびそれらのＯＫＴ４の結合は首尾よく測定された。決定された３つの集団は、ＯＫＴ４結合性をもたないＣＤ４陰性リンパ球、中間の染色をもつＣＤ４の低い密度を有する単球、および輝いた蛍光をもつＣＤ４陽性リンパ球であった。しかしながら、洗浄剤処理した細胞において、多数の単球は８０〜１４０ＦＳＣの間の光散乱値を有した；同一範囲のＦＳＣ値はリンパ球について得られた。この結果から明らかなように、洗浄剤処理後、リンパ球の光散乱のクラスターは単球で高度に汚染されている。
【００６０】
実施例２
本発明の組成物で固定後の細胞の抗原の特異性の保存
構成成分を蒸留したＨ₂Ｏを次の最終濃度に添加することによって固定試薬を調製した：１４％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；０．１４％（ｗ／ｖ）のポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）；３９．２ｍＭの２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（ＤＮＢＳ、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）；１．５１％のホルムアルデヒド（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ １０％のＥＭ等級、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．）；１．４７ｍＭのＫＨ₂ＰＯ₄；２．６８３ｍＭのＫＣｌ；８．０５８ｍＭのＮａ₂ＨＰＯ₄および６７ｍＭのＮａＣｌ。固定溶液のｐＨを７．４に調節した；そしてこの溶液を室温において琥珀色のびんの中に一夜貯蔵した。
【００６１】
抗凝固剤としてＫ３−ＥＤＴＡを含有する管の中に血液を静脈穿刺により直接集めた。血液および抗凝固剤を混合し、そして必要となるまで（ほぼ１時間）室温に保持した。
【００６２】
１０ｍｌの全血を５０ｍｌの遠心管の中に入れた。全血を４０ｍｌの新しく調製した緩衝化塩化アンモニウム溶解試薬（Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）で希釈した。血液を時々混合しながら室温において２０分間インキュベーションした。白血球を遠心により沈澱させた（４５７×ｇ、２１℃、８分）。白血球を室温においてリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）の中で遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により２回洗浄した。洗浄した細胞をＰＢＳの中に２×１０⁷細胞／ｍｌで再懸濁させた。白血球のプールをアリコートに分割した。固定すべきでない細胞を等しい体積のＰＢＳ＋５％（ｖ／ｖ）のウマ血清（ＰＢＳ／Ｓ）で希釈し、そして必要となるまで氷上に配置した。固定すべき細胞を等しい体積の固定試薬で希釈した。細胞を混合し、そして室温において３０分間インキュベーションした。３０分後、固定した細胞を５０ｍｌのＰＢＳの中で２回洗浄した。生きている細胞および固定した細胞を「ブロック溶液」の中で１回洗浄した。ブロック溶液は２５％（ｖ／ｖ）のヤギ血清＋５％（ｖ／ｖ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から構成した。生きている細胞をブロック溶液の中に２×１０⁷細胞／ｍｌに再懸濁させ、そして氷上に１時間配置した。固定した細胞を、また、ブロック溶液の中に２×１０⁷細胞の形態学に再懸濁させたが、室温に１時間保持した。
【００６３】
直接免疫染色
細胞表面の抗原決定基を、ＦＩＴＣに直接接合した細胞表面のマーカーに対する抗体（ＯＫ−対照、ＯＫＴ３、ＯＫＴ４、ＯＫＴ１１およびＯＫＴ３／ＯＫＤＲ−ＰＥの組み合わせ、すべてはＯｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、ニュージャージイ州ラリタン、から入手可能である）を使用して染色した。１００μｌの生きている細胞または固定した細胞の懸濁液を反応管に入れ、そして１０μｌの適当な抗体または対照をこの管に添加した。細胞および抗体を６０分間インキュベーションした。生きている細胞を使用するすべてのインキュベーションおよび洗浄は０℃において実施したが、固定した細胞を使用するすべてのインキュベーションおよび洗浄は室温において実施した。６０分後、細胞をＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。
【００６４】
間接的免疫染色
固定が細胞を抗体に対して透過性とすると同時にそれらの細胞質の抗原を保持させたかどうかを決定するために、生きている細胞および固定した細胞を細胞質のタンパク質、ゲルゾリンおよびビメンチンに対して特異的なマウスモノクローナル抗体と反応させた。抗ゲルゾリン（クローンＮｏ．ＧＳ−２Ｃ４、シグマ・ケミカル・カンパニー）および抗ビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ９、シグマ・ケミカル・カンパニー）を蛍光色素に接合させなかった。したがって、これらの抗体の結合は「直接」決定しなかった。その代わり、細胞へのこれらの抗体の結合は、処理した細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣと反応させることによって「間接的に」決定した。細胞質抗原の免疫染色は、１０μｌの対照ＩｇＧ２ａマウス抗体（１０μｇ／ｍｌ）、または１０μｌの抗ゲルゾリン（ブロック溶液の中で１／１００に希釈した）または１０μｌの抗ビメンチン（ブロック溶液の中で１／６０に希釈した）を１００μｌの固定した細胞または生きている細胞の懸濁液に添加することによって、実施した。細胞および抗体を前述したように１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、上澄み液を吸引により除去し、そして細胞を１００μｌのブロック溶液の中に再懸濁させた。次いで各懸濁液に、ブロック溶液の中で１／７５に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）の２００μｌを添加した。細胞を再び６０分間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。
【００６５】
固定した細胞は通常自己蛍光、抗体の非特異的結合、または両者の実質的な増加を示すことはこの分野において知られている。また、抗体により非特異的結合の量は適当なブロッキング試薬および細胞の洗浄条件で最小にすることができることは知られている。この実施例において、すべての細胞をブロッキング溶液で処理し、そして同一の洗浄緩衝液の中で洗浄した。
【００６６】
保存空間、時間および不都合な反復を回避することの重要性から、リンパ球のクラスターからのデータのみをここにおいて論考する。リンパ球のクラスターをＦＳＣ／ＳＳＣにより同定し、そして規定された領域または「リンパ球のゲート」内の細胞に対するコンピューター分析の出力を狭くするために「ゲート」または領域を確立した。リンパ球の分析のみを論考するが、固定したリンパ球は固定した単球および顆粒球が抗ゲルゾリン、抗ビメンチン、およびそれぞれの細胞の型に対して適当な細胞表面のマーカーに対する抗体とどのように反応するかについての代表であった。
【００６７】
ＯＫ−対照−ＦＩＴＣは、任意の既知の細胞の抗原と反応しないマウスＩｇＧ２ａ抗体である。したがって、この抗体で処理した後の細胞が放射する緑色の蛍光は細胞の抗体の非特異的結合のためである。生きている細胞および固定した細胞による非特異的結合を決定した。ＯＫ−対照と反応したとき、生きている細胞の１００％は３．９２より小さい蛍光強度を有し（１〜１０⁴の目盛りで）、生きている細胞についての平均の強度は１．２０であった。固定した細胞に対する抗体の非特異的結合は生きている細胞のそれよりほんのわずかに高かった。固定した細胞の９９．５％は１３．８２より小さい蛍光を有したが、平均の蛍光強度は３．９９であった。したがって、データが証明するように、本発明の試薬および方法により固定しそして染色した細胞は抗体の有意な量を非特異的に結合しない。
【００６８】
ＯＫＴ３−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の分子ｄ３の染色を測定した。固定したリンパ球の７７．９％と比較して、生きているリンパ球の７７．４％はＣＤ３に対して陽性であった。ＣＤ３陽性の生きている細胞についての平均の蛍光強度は１８８．８３であった。ＣＤ３陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度は１４４．６８であった；生きている細胞の強度より２３％低かった。染色の強度は適度に低かったが、ここに記載する試薬および方法は固定した細胞上のＣＤ３へ結合するＯＫＴ３の能力を破壊しなかった；そして固定した細胞は十分なＯＫＴ３に結合し、ＣＤ３陽性リンパ球を蛍光強度に基づいてＣＤ３陰性リンパ球と明白に分離することができた。この結果はこの分野において実施されているパラホルムアルデヒドおよびメタノールの処理により固定されそして透過性とされた細胞と顕著な対照をなし、ここで後者の処理においてＣＤ３に結合するＯＫＴ３の能力は完全に破壊された（参照、上の比較例２）。
【００６９】
ＯＫＴ４−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の分子ＣＤ４の染色を、また、実施した。固定したリンパ球の５２．７％と比較して、生きているリンパ球の５５．１％はＣＤ４に対して陽性であった。ＣＤ４陽性の生きている細胞についての平均の蛍光強度は６９．５７であった。ＣＤ４陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度は６３．７４であった；生きている細胞の強度より８％低かった。染色の強度は適度に低かったが、ここに記載する試薬および方法は固定した細胞上のＣＤ４へ結合するＯＫＴ４の能力を破壊しなかった；そして固定した細胞は十分なＯＫＴ４に結合し、ＣＤ４陽性リンパ球を蛍光強度に基づいてＣＤ４陰性リンパ球と明白に分離することができた。この結果はこの分野において実施されているパラホルムアルデヒドおよびメタノールの処理により固定されそして透過性とされた細胞と顕著な対照をなし、ここで後者の処理においてＣＤ４に結合するＯＫＴ４の能力は完全に破壊された（参照、上の比較例２）。
【００７０】
ＯＫＴ１１−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の分子ＣＤ２の染色を、また、実施した。固定したリンパ球の８４．３％と比較して、生きているリンパ球の８５．３％はＣＤ２に対して陽性であった。ＣＤ２陽性の生きている細胞についての平均の蛍光強度は４９．９５であった。ＣＤ２陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度は４１．００であった；生きている細胞の強度より１８％低かった。染色の強度は適度に低かったが、ここに記載する試薬および方法は固定した細胞上のＣＤ２へ結合するＯＫＴ１１の能力を破壊しなかった；そして固定した細胞は十分なＯＫＴ１１に結合し、ＣＤ２陽性リンパ球を蛍光強度に基づいてＣＤ２陰性リンパ球と明白に分離することができた。この結果はこの分野において実施されているパラホルムアルデヒドおよびメタノールの処理により固定されそして透過性とされた細胞と顕著な対照をなし、ここで後者の処理においてＣＤ２に結合するＯＫＴ１１の能力は完全に破壊された（参照、上の比較例２）。さらに、リンパ球をパラホルムアルデヒドで処理し、次いで膜をＮＰ４０で可溶化するとき、いくつかのＣＤ３およびＣＤ４の染色が観察されたが、ＯＫＴ１１によるＣＤ２の染色は見られなかった。
【００７１】
細胞を、また、異なる放射スペクトルを有する蛍光分子に接合した２つの抗体の特異性とインキュベーションした。細胞を同時にＯＫＴ３−ＦＩＴＣおよびＯＫＤＲ−ＰＥとインキュベーションした。ドット・ブロット・サイトグラムがＦＡＣＳｃａｎから得られ、ここでＯＫＴ３−ＦＩＴＣ抗体による細胞表面の分子ＣＤ３の染色をＸ−軸に表示し、そしてＯＫＤＲ−ＰＥによる細胞表面の分子ＤＲの染色をＹ−軸に表示する。ドット・プロットは、図３に示すものに類似し、４つの１／４のものに分割した；上左（ＵＬ）、上右（ＵＲ）、下左（ＬＬ）および下右（ＬＲ）。固定したリンパ球の７９．７％と比較して、生きているリンパ球の７８．７％（ＵＲ＋ＬＲ）はＣＤ３に対して陽性であった。生きている細胞のＯＫＤＲの染色（上左）により決定して、Ｂ−細胞はリンパ球の集団の６．８％を表した。固定した細胞について、Ｂ−細胞はリンパ球の７．４％を表し、生きている細胞の集団とすぐれた一致を示した。また、ＤＲおよびＣＤ３抗原の同時発現により決定して、活性化したＴ−細胞の百分率は、生きている細胞および固定した細胞の集団の間できわめてすぐれた一致を示した。生きているＴ−細胞の４．４８％（上右）および固定したＴ−細胞の４．２２％は活性化されていると決定された。これらの結果は固定後にＤＲを含むと検出されうる細胞表面の抗原のリストを拡張するばかりでなく、かつまた、ここに記載する試薬および方法を使用して細胞を固定したとき、多数の抗原の特異性をプロービングすることができることを証明する。
【００７２】
前述したように、間接的免疫染色手順を使用して、細胞内抗原の染色を実施した。このために、ＯＫ−対照−ＦＩＴＣは適当な陰性の対照ではなかった。その代わり、細胞を非接合の対照ＩｇＧ２ａ抗体とインキュベーションし、洗浄し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣとインキュベーションした。生きている細胞の９９．６％は３．９２以下の蛍光を有し、平均の蛍光は１．２１であった。固定した細胞の９９．４％は１２．８６以下の蛍光を有し、平均の蛍光は５．８４であった。直接の抗体接合体の対照を使用して見られるように、本発明の試薬および方法により固定しかつ染色した細胞は有意な量の抗体と非特異的に結合しなことをデータは証明する。
【００７３】
抗ゲルゾリン抗体による細胞質の分子ゲルゾリンの染色は、固定したリンパ球の９１．４％と比較して、生きているリンパ球の０．４％が抗ゲルゾリンの蛍光に対して陽性であることを証明した。抗ゲルゾリン陰性の生きている細胞の平均の蛍光強度は１．２２であった。抗ゲルゾリン陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度は５０．４５であった。ゲルゾリンは細胞表面上で発現されない細胞質の抗原である。その結果、生きている細胞は、抗体がその細胞の中に入ることができないので、ゲルゾリンについて陽性に染色しない。対照的に、細胞を本発明の試薬および方法により固定したとき、細胞の内部は抗体に対してアクセス可能であった。抗ゲルゾリンが全ＩｇＧ分子であり、断片ではなかった；したがって、少なくとも１５０，０００ダルトン程度に大きい分子はこれらの固定した細胞の中に自由に入りかつ去ることができた。
【００７４】
抗ビメンチン抗体による細胞質の分子ビメンチンの染色は、固定したリンパ球の９２．０％と比較して、生きているリンパ球の０．６％が抗ビメンチンの蛍光に対して陽性であることを証明した。抗ビメンチン陰性の生きている細胞の平均の蛍光強度は１．２４であった。抗ビメンチン陽性の固定した細胞の平均の蛍光強度は５５５．０１であった。ビメンチンは細胞表面上で発現されない細胞質の抗原である。その結果、生きている細胞は、抗体がその細胞の中に入ることができないので、ビメンチンについて陽性に染色しない。対照的に、細胞を本発明の試薬および方法により固定したとき、細胞の内部は抗体に対してアクセス可能であった。ビメンチンは５８，０００ダルトンの分子量を有するが、抗ビメンチンは１５０，０００ダルトンの分子量を有することに注意することが重要である。したがって、これらの結果が示すように、固定の間に、小さい細胞質のタンパク質は細胞により保持され、そして細胞が完全な抗体の大きさの分子に対して透過性とされているにもかかわらず、所定位置に保持される。
【００７５】
本発明の試薬および方法により固定された細胞はリンパ球、単球および顆粒球を互いに区別可能するために十分な光散乱性質を維持ことが見られた。固定された細胞は内部の細胞の抗原への抗体の自由のアクセスを可能とし、しかもこれらの同一の抗原は所定位置に固定されており、そして抗原が抗体分子により小さいことがあってさえ、細胞の中から外に洗浄除去されない。最後に、固定された細胞上の細胞表面分子は無傷であり、そして１または２以上の抗体分子により免疫染色することができ、白血球の機能的サブタイプの同定および定量を提供する。
【００７６】
実施例３
細胞質の抗原への免疫染色への固定用組成物の作用
コンピューター補助された統計学的設計および分析を使用する研究−（「ＳＥＤＡ」）
細胞質の抗原の染色への固定用組成物の作用を検査するために、ヒト細胞系を白血球の代わりに使用した。細胞質の抗原の発現は均質であるので、細胞系を使用した。したがって、陽性と記録された細胞の百分率の差、あるいは個々の抗原の蛍光強度を、異種の細胞の型による抗原の発現の差よりむしろ固定剤の組成の差に帰属させることができた。
【００７７】
Ｔ−細胞はそれらの細胞表面上でＣＤ３を発現する。しかしながら、いくつかのＴ−細胞の組織培養系統は細胞質のＣＤ３を発現するが、細胞表面のＣＤ３をほとんどあるいはまったく発現しない（バ・ドンゲ（Ｖａｎ Ｄｏｎｇｅｎ）ら、血液（Ｂｌｏｏｄ）、７１：６０３、１９８８）。ＣＥＭのＴ−細胞系は１つのこのような細胞系である；これは細胞質のＣＤ３をもつが、細胞表面のＣＤ３をもたない。ＣＥＭ細胞を増殖し、種々の固定剤配合物で固定し、次いで抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）、抗ゲルゾリンおよび抗ビメンチンと反応した。
【００７８】
構成成分を蒸留したＨ₂Ｏに、コンピューター補助された統計学的実験の設計により要求される濃度に添加することによって、本発明の固定試薬を調製した（参照、表Ｅ３−１）。固定剤配合物は実験の前日に調製し、そして暗所で室温において貯蔵した。試験する固定剤に無関係に、固定の方法は次の通りであった：ＣＥＭ細胞を沈澱させ（４５７×ｇ、２１℃、８分）、次いでＰＢＳ／Ｓの中で室温において遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により２回洗浄した。洗浄した細胞をＰＢＳ／Ｓの中に２．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞のプールを１ｍｌのアリコートに分割し、次いで等しい体積の適当な固定試薬で希釈した。細胞を混合し、そして室温において３０分間インキュベーションした。３０分後、固定した細胞を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。すべての細胞をＰＢＳ／Ｓの中でさらに１回洗浄し、次いで３．３×１０⁶細胞／ｍｌの濃度再懸濁させた。
【００７９】
間接的免疫染色
細胞をＯＫＴ３およびマウスのモノクローナル抗体の抗ゲルゾリン（クローンＮｏ．ＧＳ−２Ｃ４、シグマ・ケミカル・カンパニー）および抗ビメンチン（クローン Ｎｏ．Ｖ９、シグマ・ケミカル・カンパニー）と反応させた。細胞質の抗原の免疫染色は、５μｌの対照ＩｇＧ２ａマウス抗体（１５μｇ／ｍｌ）、または５μｌのＯＫＴ３、または５μｌの抗ゲルゾリン（ＰＢＳ／Ｓの中で１／４０に希釈した）または５μｌの抗ビメンチン（ＰＢＳ／Ｓの中で１／３０に希釈した）を１００μｌの固定した細胞または生きている細胞の懸濁液に添加することによって、実施した。細胞および抗体を０℃において１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して２回洗浄した。最後の洗浄後、上澄み液を吸引により除去し、そして細胞をＰＢＳ／Ｓの中で１／７５に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）の２５０μｌを添加した。細胞を再び６０分間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。
【００８０】
統計学的実験の設計および分析（ＳＥＤＡ）：
コンピューター補助されたＳＥＤＡを使用して、本発明をさらに最適化した。ＳＥＤＡを使用して、より伝統的方法を使用して得るすることができるより多い情報を所定の組の実験から得ることができた。
【００８１】
ＳＥＤＡの理論的基礎は、１９６０年においてＧ．Ｅ．Ｐ．ボックス（Ｂｏｘ）およびＤ．Ｗ．ベンケン（Ｂｅｈｎｋｅｎ）により開発された［Ｂｏｘ、Ｇ．Ｅ．Ｐ．およびＤ．Ｗ．Ｂｅｈｎｋｅｎ（１９６０）。定量的変数の研究についての多少新規な３つのレベルの設計。テクノメトリクス（Ｔｅｃｈｎｏｍｅｔｒｉｃｓ ２：４５５−４７５。］ＳＥＤＡを使用するために要求される主要なフレームコンピューターを使用したが、それは現在ＰＣ互換性ソフトウェアのパッケージとして商業的に入手可能である。これらの研究において使用したソフトウェアのパッケージは次の通りであった：「Ｘ−スタト統計学的設計／データの分析／非線型最適化（Ｓ−Ｓｔａｔ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｄｅｓｉｇｎ／Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ／Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）」；ソフトパワー・インコーポレーテッド（Ｓｏｆｔｏｐｏｗｅｒ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ・インコーポレーテッド（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）から入手可能である。
【００８２】
ＳＥＤＡの本質は、「伝統的」実験の設計からの逸脱を表す。「伝統的」実験において、研究者はまず結果を蓄積することができる、すべての重要なメカニズムを同定する。次いで、研究すべき重要な変数および測定すべき性能のパラメーターからリストを作る。細胞の固定と同じように複雑な問題について、変数リストおよび測定した結果は長い。こうして、種々のパラメーターの包括的最適化はＳＥＤＡの使用によりいっそうよく達成される。例えば、３つの変数を研究すべきとき、伝統的な設計は２つの変数を保持すべきであるが、３つは変化する。変数の間に線型の関係が存在しかつ変数が完全に独立である場合、性能を予測できるようにするために、各変数について２点のみにおいて測定を行う必要がある。しかしながら、変数の間の関係が線型でなく、変数は互いに相互作用するか、あるいはそれらの関係は知られていない場合、各変数は３点の最小において評価しなくてはならない。各変数について３点が存在する場合にのみ、線型または非線型の関係が存在であるかどうかを決定することができる。３レベルで３つの変数を試験することは２７の別々の組み合わせを必要とする。このアプローチを「完全な３つレベルの要因配置実験（ｆｕｌｌ ｔｈｒｅｅ ｌｅｖｅｌ ｆａｃｔｏｒｄｅｓｉｇｎ）」と呼ばれる。完全な３つレベルの要因配置実験における組み合わせの数は、変数の数が増加するとき、指数的に増加する。４つの変数では、８１の組み合わせが要求され、そして５つの変数は２４３の組み合わせを必要とする。結局、研究者は典型的には研究の範囲を管理可能な数の変数に制限する。不都合なことには、変数のいくつかのみを研究するとき、最終結果は基本的には研究者が変数について研究することを決定したとき賢く選択するかどうかにより決定される。
【００８３】
ＳＥＤＡは実験の範囲内で要求される組み合わせの数を減少することによって、多数のより多くの変数を同時にに研究する可能性を研究者に提供する。３つの変数を有する実験の実施例において、３つの変数をＸ、ＹおよびＺと呼ぶ。実験の範囲内のＸ、ＹおよびＺについて低から高までの値の範囲は立方体の次元を定義するとして考えることができる；Ｘは幅を表し、Ｙは高さを表し、そしてＺは深さを表す。完全な３つレベルの要因配置実験において、立方体の各角およびすべての中点における試験を必要とする（すべてにおいて２７実験）。ボックス−ベンケン（Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ）の設計は、立方体の各へりの中点を表す組み合わせのみを試験すること、および立方体の中央を表す組み合わせの３重の決定を必要とする。これは２７〜１５の数の組み合わせを必要とする。ボックス−ベンケン（Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ）の設計は、変数の数が増加するにつれて、劇的となる。ボックス−ベンケン（Ｂｏｘ−Ｂｅｈｎｋｅｎ）の設計は４つの変数について２７の組み合わせおよび５つの変数について４６の組み合わせを必要とするだけである；これに対して３つレベルの要因配置実験についてそれぞれ８１および２４３の組み合わせを必要とする。さらに、データを集め、そしてコンピューターが観測された実験結果に相当する数学的モデルを選択した後、ＳＥＤＡを使用して、立方体の表面上または体積内の任意の点におけるアッセイの性能を予測することができる。
【００８４】
実験はＳＥＤＡを使用して設計した。ファイルをつくり、ここで研究すべき変数（例えば、ホルムアルデヒド、ＤＮＢＳ、ＤＭＳＯおよび洗浄剤の濃度）および測定すべき性能（すなわち、細胞質および表面の抗原の染色）をコンピューターに入れた。各変数の上限および下限を特定した後、ソフトウェアは実験内の各「試験」についての各変数の濃度を決定した（参照、表Ｅ３−１）。次いで試験を不規則の順序に配置した。実験の実験室の部分を完結した後、各試験に相当する測定した性能をコンピューターに入れた。コンピューターは性能について最大の作用を有する変数、作用をもたない変数、および相乗的に相互作用する変数を決定した。回帰腺を線型の相互作用の２次方程式を使用して実験データに適合させた。データに対して最良の適合を与える数学的モデルを選択し、そしてそれが実験結果をどうれだけよく予測するかを注意して検査した。
【００８５】
コンピューターのモデルを使用して、試験した各変数の範囲内の任意の濃度または濃度の任意の組み合わせにおけるアッセイの性能を予測することができた。この可能性を使用して、試薬の濃度の無数の組み合わせをコンピューターのシミュレーションにより試験した。これらの可能性は固定剤配合物をシミュレーションして細胞質の抗原の染色を可能としたか、あるいはある場合において細胞表面の抗原の染色に対してなされた損傷の程度を予測した。さらに、最小の性能の基準を設定し、そしてソフトウェアにおけるアルゴリズムを使用して試薬濃度の最適な組み合わせを計算して、任意の所定の所望の性能を達成した。いったん最適化されると、１つを除外してすべての変数をそれらの最適なレベルに保持することをコンピューターに指示した。次いで、１つの変数をその全体の範囲にわたって変化させ、そして性能についてのその作用をプロットした。
【００８６】
すべての３つの細胞質の抗原の染色は試験した試薬のすべての濃度において観察された；しかしながら、観測された実験結果のコンピューターの分析は、０．７５６％のホルムアルデヒド、２５．４ｍＭのＤＮＢＳ、６．９２％のＤＭＳＯおよび０．０８６％のツイーン２０洗浄剤からなる好ましい実施態様を予測した。このコンピューターが予測した好ましい実施態様は実験室の固定実験により示される好ましい実施態様に極めて類似し、ここで関係する成分の濃度は０．８５％のホルムアルデヒド、３０ｍＭのＤＮＢＳ、６．９％のＤＭＳＯおよび０．０９５％のツイーン２０洗浄剤である。後者の固定用組成物を全血について試験したが、コンピューターのモデル化はＣＥＭ細胞系に基づいた。好ましい実施態様に相当する各試薬の濃度をコンピューターのモデルに入れた。ホルムアルデヒドの濃度がＯＫＴ３による細胞質のＣＤ３の染色の蛍光強度にどのように影響を与えるかについてコンピューターが発生したプロットが証明したように、固定剤のすべての他の構成成分がそれらの最適な濃度にとどまっている場合でさえ、ホルムアルデヒドの濃度が０．８０％を越えるにつれて、蛍光強度は急速に減少する。他のプロットは、固定剤の中の３つの他の活性成分の作用を証明した。各グラフのＸ軸およびＹ軸が異なることに注意することが重要である。ホルムアルデヒドのプロットのＹ軸は５０単位の平均の蛍光強度の範囲をカバーするが、洗浄剤のプロットのＹ軸は４００単位の範囲をカバーする。試験した濃度範囲にわたって、洗浄剤は細胞質のＣＤ３の検出について最大の作用を有した；次いでＤＭＳＯ、ＤＮＢＳおよびホルムアルデヒドの順であった。洗浄剤、ＤＭＳＯおよびＤＮＢＳのすべてはＣＥＭ細胞におけるＣＤ３の検出を改良する働きをした。ホルムアルデヒドは０．８０％より大きい濃度においてＣＤ３の検出に悪影響を及ぼした。 ゲルゾリンの細胞質の染色に影響を及ぼす因子のコンピューター分析をまた実施した。ゲルゾリンの検出は、この実験において試験したホルムアルデヒドの濃度に対して不感受性であった。適度の増加はホルムアルデヒド濃度の増加で予測されたが、予測された増加は実験誤差の範囲内であった。同一の事柄がＤＮＢＳに当てはまることがある。したがって、試験したＤＮＢＳ濃度の範囲にわたって、ＤＮＢＳはＣＥＭ細胞の中のゲルゾリンの検出にほとんど効果をもたないことが発見された。ＤＭＳＯの濃度は最大の陽性の作用を有した；平均の蛍光を推定された１６０単位に増加した。洗浄剤の濃度は蛍光を推定された１１０単位に増加した。
【００８７】
ビメンチンの細胞質の染色に影響を及ぼす因子のコンピューター分析をまた実施した。ビメンチンの検出は、この実験において試験したホルムアルデヒドの濃度に対して非常に感受性であった。推定された２５０単位の平均の蛍光強度の減少が発見された。２５ｍＭより大きいＤＮＢＳの濃度は、２００単位程度に多くだけ平均の蛍光を増加すると推定された。ＤＭＳＯはまたビメンチンの検出を改良し、平均の蛍光を推定された１５０単位に増加した。４．５％以上のＤＭＳＯ濃度は、ＣＥＭ細胞の中のビメンチンの検出を有意に促進または害するように思われた。洗浄剤の濃度が０．０４％からほぼ０．０８％に増加したとき、４００単位の平均の蛍光の増加が推定された。ビメンチンの検出を改良するために、より高い濃度は予測されなかった。
【００８８】
コンピューターのモデルの予測を末梢血液のリンパ球について評価した。健康なドナーからの白血球をＰＢＳ／Ｓの中に洗浄するか、あるいは０．７５５％のホルムアルデヒド、７％のＤＭＳＯ、０．０８％のツイーン２０および０、１９．６または３８ｍＭのＤＮＢＳの最終試薬濃度において固定した。すべての細胞を室温において３０分間固定し、次いで洗浄した。固定した細胞または生きている細胞の集団からのすべての赤血球を塩化アンモニウムにより除去した。次いで、前述したように、間接的免疫染色および抗体、抗ゲルゾリンおよび抗ビメンチンを使用して、白血球を免疫染色した。
【００８９】
末梢血液のリンパ球の中の細胞質のゲルゾリンおよびビメンチンを検出する可能性についての固定の効果を、表Ｅ３−２に示す。抗ゲルゾリンまたは抗ビメンチンを使用して生きている細胞の０．５％より少なくが染色した。しかしながら、固定したリンパ球の８０〜９０％がこれらの抗原に対して陽性に染色された。固定の間のＤＮＢＳの濃度は、抗ゲルゾリンまたは抗ビメンチンに結合した細胞の百分率に影響を与えなかった。この実験において抗ゲルゾリンおよび抗ビメンチンについての蛍光のレベルはＣＥＭ細胞についてより非常に低かったが、コンピューターのシミュレーションの予測と良好に一致した。ＤＮＢＳはゲルゾリンの保持および検出に対する効果をほとんどあるいはまったくもたないが、ビメンチンの検出を改良した。ＤＮＢＳの存在下に固定が抗ビメンチン反応性細胞の平均の蛍光をどれだけ増加するかは知られていない。抗ビメンチンはモノクローナル抗体であるので、他の抗体の特異性の結合に導くのは、ＤＮＢＳによるエピトープのアンマスキングのためではない。その代わり、この結果が示唆するように、ＤＮＢＳが固定の間に存在しないとき、ＤＮＢＳは抗体にアクセス可能でない細胞の領域におけるビメンチンへのアクセスを改良することができるか、あるいはＤＮＢＳは固定された細胞内に保持されるビメンチンの量を増加する。それが抗体の改良されたアクセスまたは抗原の改良された保持であるかどうかにかかわらず、これらの結果はいくつかの抗原についてのＤＮＢＳの存在における固定の追加の利益を確証し、そして末梢の血球の中のこれらの抗原の挙動を包含するようにコンピューターのモデルの有効性を拡張した。
【００９０】
これらの結果が示すように、固定および各個々の抗原についての検出を最も改良した本発明の活性成分の組み合わせは前以て予測することができなかった。各個々の活性成分は同一の方法ですべての抗原に影響を及ぼさなかった。ゲルゾリンの検出はＤＭＳＯ濃度を増加することによって最も改良された；これに対して、細胞質のＣＤ３およびビメンチンの検出は洗浄剤濃度を増加することによって最も改良された。ビメンチンおよび細胞質のＣＤ３の検出はＤＮＢＳ濃度を増加することによって改良されるが、ゲルゾリンの検出はＤＮＢＳにより有意に影響を受けなかった。これらの結果に基づいて、他の抗原、すなわち、細胞質または細胞表面の抗原が存在し、それらの固定は他のものを越えて活性成分のあるものによりいっそう強く影響を受けることを推測することは合理的である。しかしながら、固定された後、抗原が保存または破壊されるかどうかを予測することはまだ不可能である。また、活性成分のどれが固定後の抗原の構造の保存のために優性な成分であるかを予測することは不可能である。さらに、このデータが確立するように、細胞質の抗原の染色は種々の成分の不存在または低い濃度においてさえ起こるが、染色は多くの場合においてＤＮＢＳの使用および他の活性成分の１または２以上の濃度の増加により改良される。
【００９１】
【表１】

【００９２】
【表２】

【００９３】
実施例４
本発明の固定用組成物の調製において、異なる洗浄剤を使用した。洗浄剤は組成が異なるばかりでなく、かつまた化合物の明確なクラスを表す。本発明の固定剤は従来記載されてきているようにして調製したが、ただしこの実験において、洗浄剤および洗浄剤の濃度を変化させた。使用した洗浄剤はポリオキシエチレンエーテルＷ−１（ポリオックス）、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ツイーン２０）、モノパルミテート（ツイーン４０）、モノオレエート（ツイーン８０）およびポリオキシエチレン２３ラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３５）であった。よく働く他の洗浄剤はノニデットｐ−４０、トリトンＸ−１００、ナトリウムデオキシコレートおよびサポニンを包含する。
【００９４】
この実施例において、健康なドナーからの全血をＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させるか、あるいは等しい体積の固定試薬で室温において３０分間固定した。固定した細胞または生きている細胞の集団からのすべての赤血球を塩化アンモニウム溶解により除去し、そして白血球をＰＢＳ／Ｓの中で遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により２回洗浄した。次いで白血球を間接的免疫染色手順および抗体の抗ビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ９、シグマ・ケミカル・カンパニー）で免疫染色した。
【００９５】
Ｔ−細胞の組織培養系統ＣＥＭを末梢血球に加えて使用した。試験する固定剤に無関係に、固定方法は次の通りであった。ＣＥＭ細胞を沈澱させ（４５７×ｇ、２１℃、８分）、次いでＰＢＳ／Ｓの中で室温において遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により２回洗浄した。洗浄した細胞をＰＢＳ／Ｓの中に２．５×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞のプールを１ｍｌのアリコートに分割し、次いで等しい体積の適当な固定試薬で希釈した。細胞を混合し、そして室温において３０分間インキュベーションした。３０分後、固定した細胞を１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次いですべての細胞をＰＢＳ／Ｓの中に３．３×１０⁶細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。
【００９６】
間接的免疫染色
細胞をマウスのモノクローナル抗体の抗ゲルゾリン（クローンＮｏ．ＧＳ−２Ｃ４、シグマ・ケミカル・カンパニー）および抗ビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ９、シグマ・ケミカル・カンパニー）と反応させた。５μｌの対照ＩｇＧ２ａマウス抗体（１５μｇ／ｍｌ）、または５μｌの抗ゲルゾリン（ＰＢＳ／Ｓの中で１／１００に希釈した）または５μｌの抗ビメンチン（ＰＢＳ／Ｓの中で１／６０に希釈した）を固定した細胞または生きている細胞の懸濁液に添加することによって、細胞質の抗原の免疫染色を実施した。細胞および抗体を０℃において１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２ｍｌ／洗浄を使用して２回洗浄した。最後の洗浄後、上澄み液を吸引により除去し、そして細胞をＰＢＳ／Ｓ中で１／７５に希釈した２５０μｌのヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）の中に再懸濁させた。細胞を再び氷上で６０分間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓ中で２ｍｌ／洗浄を使用して３回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を０．５ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。
【００９７】
生きているおよび固定した両者の細胞の免疫染色した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。生きているおよび固定した両者の細胞について、リンパ球、単球および顆粒球をもっぱらそれらの光散乱性質に基づいて同定した。
【００９８】
ポリオキシエチレンエーテルまたはＢｒｉｊ^R３５洗浄剤の添加は、抗ビメンチンに結合した固定した細胞細胞の百分率の投与量依存性増加に導く。この細胞質のアクセスの増加はすべての３つの細胞の型を使用して見られた。よりおおくの対照の抗体は、リンパ球に対してより、単球および顆粒球に非特異的に結合した。単球および顆粒球を使用して見られた増大した背景の染色は、特異的結合と非特異的結合との間のカットオフをこれらの細胞の集団より高くに配置することを必要とする。これは、同一に処理したリンパ球より、一般に低い百分率の単球および顆粒球が抗体に結合するように思われる理由を一部分説明している。ポリオックスは重量基準でＢｒｉｊ^R３５おり活性であった。これらの洗浄剤付近で固定試薬の配合物を最適化することを試みなかった。ポリオックスは、細胞の透過性化試薬として非常に活性であるが、顆粒球および単球のＦＳＣに対して顕著な作用を有した。ツイーン系列のポリオキシエチレンソルビタン洗浄剤を検査した。なぜなら、それらの構造はポリオックスに類似するが、それらはおだやかな洗浄剤である傾向があるからである。ＣＥＭ細胞を使用する実験の結果を表Ｅ４−２に示す。細胞質の抗原のゲルゾリンおよびビメンチンに対する抗体と反応した細胞の百分率の投与量依存性増加は、すべての３つの洗浄剤で見られた。細胞質の抗原を検出する可能性は固定している細胞ばかりでなく、かつまた固定の時の洗浄剤の濃度に依存した。ツイーン２０は最大の陽性の細胞の百分率を与え、次いでツイーン８０および最後にツイーン４０であった。
【００９９】
これらのデータは確証するように、細胞質の抗原の免疫学的検出は細胞を固定することを必要とする。固定単独は細胞質の抗原を免疫学的に検出する制限した可能性のみを付与するであろう。細胞質の抗原の検出は細胞の洗浄剤の処理により大きく改良される。そして固定および洗浄剤の処理は単一工程で同時に実施することができる。固定、引き続く別々の透過性化工程は細胞質の抗原の連続する保持および検出に要求されない。これらのデータがさらに支持するように、広い範囲の洗浄剤を細胞の透過性化の目的で使用することができる。これらの結果から、好ましい実施態様の洗浄剤はその意図する用途に依存して変化することができると推測することは合理的である。意図する用途がすぐれた細胞の透過性化を必要とするが、顆粒球のＦＳＣの保存を必要としない場合、ポリオックスは好ましい洗浄剤であることがある。さらに、ある用途は所望の性能を達成するために１より多い洗浄剤の組み合わせを必要とすることがあることが予測される。
【０１００】
【表３】

【０１０１】
【表４】

【０１０２】
実施例５
感染した細胞の中のヒト免疫欠損ウイルスの検出
ウイルスを細胞内で増殖させた。ウイルス粒子を構成する核酸およびタンパク質を感染した細胞により生産され、そして細胞の中に蓄積する。ウイルスが転写的に活性である場合、感染した細胞の中のウイルスのタンパク質の存在を検出できるであろう。ヒト免疫欠損ウイルス（ＨＩＶ）は多数のタンパク質を生産する。タンパク質のあるものはウイルスの遺伝子の発現を調節し、そしてあるものはウイルスのコアおよびエンベロープを構成する構造タンパク質である。タンパク質ｐ２４はＨＩＶ感染した細胞が過剰に生産する構造タンパク質である。細胞の中で複製するウイルスを検出する可能性は、ＨＩＶにより引き起こされる病気、後天性免疫欠損症候群（エイズ）の検出および監視において臨床的意味を有することができる。ＨＩＶ感染した個体におけるウイルスの負荷は病気の進行および予後に関係する。過去において、そして本発明の背景において前述したように、ウイルスの負荷は培養、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはｐ２４のイムノアッセイにより監視されてきている。ＨＩＶの培養およびＰＣＲは経費のかかる特殊化された試験であり、ほとんどの臨床的実験室の環境に適用不可能である。ｐ２４のアッセイはＨＩＶ感染した個体においてしばしば陰性である。なぜなら、ｐ２４と患者自身の抗体との間の免疫複合体が商用アッセイキットにおいてｐ２４の捕捉を妨害するからである。
【０１０３】
本発明の試薬および方法を使用して感染した細胞の中のウイルスのｐ２４を検出できるかどうかを決定するために、ＨＩＶ感染した組織培養の細胞およびＨＩＶ感染した個体からの末梢血液のリンパ球を検査した。ヒト組織培養の細胞系Ｈ９はＨＩＶの増殖を支持することができる。非感染のＨ９細胞は、ナショナル・インスチチューツ・オブ・ヘルスズ・エイズ・リサーチ・アンド・レファランス・リエイジェント・プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ’ｓ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ）から入手した。ＨＩＶで持続的に感染したＨ９細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手した。非感染および持続的に感染したＨ９細胞を、１０％の胎児子ウシ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０の中で増殖させた。培養物を少なくとも１回／週継代した。ＨＩＶで感染したことが知られている３人の個体からの血液を入手し、そして固定前にＥＤＴＡの中で室温において２４以下の間貯蔵した。固定後、細胞を−２０℃において貯蔵し、ＨＩＶのｐ２４のアッセイのとき融解した。
【０１０４】
固定試薬を２×濃縮物として調製し、固定すべき細胞懸濁液の等しい体積で希釈することを意図した。２×固定試薬は１．４４％のホルムアルデヒド、７３．０ｍＭのＤＮＢＳ、１５．０％のＤＭＳＯおよび５０μＭ（０．００６％）のＮＰ４０洗浄剤をリン酸塩緩衝液ｐＨ７．２の中に含有した。固定剤を琥珀色ガラスびんの中に室温において必要となるまで貯蔵した；通常５日以下。非感染および持続的に感染したＨ９細胞を沈澱させ（４５７×ｇ、２１℃、８分）、次いでＰＢＳの中で室温において遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により１回洗浄した。洗浄した細胞をＰＢＳの中にほぼ１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次いで細胞を等しい体積の固定試薬で希釈した。細胞を混合し、そして室温において６０分間インキュベーションした。６０分後、固定した細胞を１０％の胎児子ウシ血清および２％のヒトＡＢ血清（ＰＢＳ／Ｓ）を補充した１０ｍｌの氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで１×１０⁶細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた。
【０１０５】
非エイズ関係病院の患者およびＨＩＶで感染していることが知られている３人のドナーの各からの全血を、等しい体積の固定試薬と６０分間混合した。室温において６０分後、固定した血液を氷冷ＰＢＳ／Ｓの中で２回洗浄した。すべての赤血球を塩化アンモニウムの溶解により除去した。次いで白血球を間接的免疫染色手順を使用して免疫染色した。
【０１０６】
間接的免疫染色
２００μｌの細胞懸濁液を、ＰＢＳ／Ｓの中で１：４０に希釈したＨＩＶのｐ２４に対するマウスのモノクローナル抗体（９Ａ１Ｂ２、オルト・ダイアグノスチック・システムス）、またはＰＢＳ／Ｓの中で１：４０に希釈したウサギのポリクローナル抗ｐ２４抗体（Ｃｈｉｒｏｎ、エメリビレ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア州）の２０μｌとインキュベーションした。細胞および抗体を０℃において１時間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で２回洗浄した。最後の洗浄後、上澄み液を吸引により除去し、そして細胞をＰＢＳ／Ｓの中で１／７５に希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）またはヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ接合体（Ｆ（ａｂ’）₂、シグマ・ケミカル・カンパニー）の２００μｌの中に再懸濁した。細胞を再び氷上で６０分間インキュベーションし、次いでＰＢＳ／Ｓの中で３回洗浄した。陰性の対照として使用した細胞をＩｇＧ２ａ対照マウス抗体、正常のウサギ血清、または抗体まったくなしとインキュベーションした。次いで細胞をヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣとインキュベーションした。最後の洗浄後、細胞を１ｍｌのＰＢＳ／Ｓの中に再懸濁させ、そしてサイトフルオログラフＣ５０フローサイトメーターで分析した。
【０１０７】
感染した細胞の中でＨＩＶ ｐ２４を検出する可能性は、非感染Ｈ９および持続的に感染したＨ９の組織培養の細胞を使用して明白に証明された（図４ａ、図４ｂ、図５ａおよび図５ｂ）。図４ａおよび図４ｂは抗２４モノクローナル抗体と反応した非感染の細胞である。図４ａにおいて、Ｘ軸はＦＳＣまたは細胞の大きさであり、そしてＹ軸は抗ｐ２４染色の蛍光強度である。データは等高線プロットとして表されている。等高線プロットはこの明細書の中のどこかに表されている３次元の表示に類似する。等高線プロットの場合において、Ｚ軸または細胞の数は紙に対して垂直である。観察者はデータを事象のクラスターによりつくられた「山」をあたかも真下に見るように眺める。地質学的レリーフマップを使用するときのように、等高線は規則的な間隔におけるピークを通したスライスを表す。図４ｂは細胞の数／相対蛍光強度；最大強度の百分率として表されている；をプロットするヒストグラムである。非感染のＨ９細胞についての平均の蛍光強度の対数は０．７５であった。Ｈ９細胞の１．２％のみは１．０より大きい蛍光強度を有した。しかしながら、図５ａおよび図５ｂに見られるように、持続的にＨＩＶ感染した細胞を抗ｐ２４で処理したとき、蛍光強度の顕著な増加が存在した。感染したＨ９細胞についての平均の蛍光強度の対数は３．２７であった；そしてＨ９細胞の８６．２％は１．０より大きい蛍光強度を有した。感染した細胞内のｐ２４に対する抗ｐ２４の結合は、また、図５ｂに示す、蛍光強度のヒストグラムにより証明され、ここで感染した細胞を使用したとき右にシフトする。
【０１０８】
図６ａ、図６ｂ、図６ｃおよび図６ｄは、ＨＩＶ感染した個体および非感染の対照の個体からの血液を試験したときの結果を示す。側面の散乱をＸ軸にプロットし、そして抗ｐ２４の蛍光強度をＹ軸にプロットした。側面の散乱単独はこの実験において単球と顆粒球とを分割することができなかった。これは細胞が凍結されておりそしてアッセイ前に融解されたことにある可能性が最も強い。患者の細胞を凍結せずそして使用前に融解しなかったとき、光散乱はＨＩＶ感染した患者およびエイズの患者の固定したリンパ球、単球および顆粒球を弁別することができ、ならびに非感染の個体についてそれは可能であった。図６ａは対照のＨＩＶ非感染の病院の患者についての結果を示す。左のリンパ球のクラスターまたは右の単球−顆粒球のクラスターにおいて細胞への抗ｐ２４抗体の結合の証拠は存在しない。図６ｂはＣＤＣ段階ＩＩＩとして分類されそして薬物ジドブジン（Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ）（ＡＺＴ）を取った個体からの結果を示す。リンパ球のクラスターの分布は対照の細胞と比較して上方にそれる。ある数のリンパ球はこの患者において低いレベルの抗ｐ２４と結合した。さらに、小さい数の鮮明に染色する単球のクラスターはこの患者において明瞭に明らかである。図６ｃは病気がＣＤＣ段階ＩＶに進行した個体の結果を示す。この個体は血液を抜き出したとき口腔のカンジダ症に悩んでいた。この患者において、リンパ球のクラスターは抗ｐ２４結合に対して完全に陰性であった。顆粒球はまたウイルスのタンパク質を含まないように思われたが、患者の単球の衝撃的な包含が存在した。最後に、図６ｄは完全に頂点に達したエイズの患者の結果を示す。この個体は薬物処置の結果として末梢のニューロパシー発現し、そして抗レトロウイルスの化学療法から除去しなくてはならなかった。多数のリンパ球、単球および顆粒球はこの患者において抗ｐ２４抗体に結合したことが明らかであった。多数の細胞は抗ｐ２４と非常に多く結合したので、それらの蛍光は目盛りを越えていた。
【０１０９】
これらの結果が証明するように、本発明の方法および試薬は感染した細胞内のウイルスのタンパク質の免疫学的検出に使用することができる。細胞上の表面の弁別マーカーは本発明の方法および試薬により保存されるが、同時にまた内部の抗原への抗体のアクセスを提供する。細胞表面の弁別マーカーに対する抗体および内部の抗原、例えば、ＨＩＶ構造タンパク質に対して抗体を含有する抗体の混合物を調製することができる。例えば、抗ＣＤ４−ＰＥを抗ｐ２４−ＦＩＴＣと混合することができる。このような抗体の混合物をＨＩＶ感染した個体からの細胞と反応させ、そしてフローサイトメーターで検査した場合、どれだけ多くのＣＤ４陽性細胞を個体が有したかばかりでなく、かつまたＣＤ４陽性のどれだけ多くがウイルスのｐ２４抗原を発現していたかを決定することができるであろう。このような情報はＨＩＶ感染の臨床的管理において予後または治療の価値を有することができる。当業者とって明らかなように、この原理は他の固有または外因の細胞抗原に拡張することができ、そしてＨＩＶまたは外因の病原体に全く限定されない。
【０１１０】
実施例６
ウイルスの不活性化の置換
家兎痘ウイルス
本発明の固定剤配合物および固定法を生きているウイルスを不活性化する能力ついて試験した。３つのウイルスを研究のために選択した；家兎痘ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）およびヒト免疫欠損ウイルス１型（ＨＩＶ−１）。これらの研究について、固定剤は次の成分を含有した：１．４４％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド、７３ｍＭのジニトロベンゼンスルホン酸、５０μＭのノニデットｐ−４０および１５％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド。
【０１１１】
家兎痘のウトレヒト（Ｕｔｒｅｃｈｔ）株（ＡＴＣＣ ＶＲ−１５７）をターゲットウイルスとして使用した。ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８１）をウイルスを増殖するための宿主細胞として使用した。ベロ細胞を家兎痘ウイルスで感染させ、そして２４時間インキュベーションした。ほぼ３×１０⁷の感染した細胞を洗浄し、次いで１．０ｍｌの細胞不含家兎痘ウイルスの中に再懸濁させた。次いでこの混合物を１．０ｍｌの胎児子ウシ血清で希釈して、５０％の血清の混合物を形成した。０．１ｍｌの試料を取り出して合計のウイルスの負担（ｖｉｒａｌ ｂｕｒｄｅｎ）を試験した；この試料を「ウイルスの負荷（Ｖｉｒａｌ Ｌｏａｄ）」と標識した。ウイルス／細胞の懸濁液の残部（１．９ｍｌ）を１．９ｍｌの固定剤と混合した。０．１ｍｌの試料を直ちに取り出し、そしてＥＭＥＭ＋５％のトリプトースホスファターゼブロス（ＴＳＢ）の中で１：３０に希釈した。これはＴ＝０を表した。この懸濁液の残部を室温において３０分間インキュベーションした。３０分において、０．１ｍｌの試料を再び取り、そしてＥＭＥＭ＋５％のＴＳＢの中で１：３０に希釈し、これはＴ＝３０の試料を表した。Ｔ＝０およびＴ＝３０の両者の試料を遠心して細胞を沈澱させた。上澄み液を取り出し、そして氷上に保持し、その間細胞の沈澱を２ラウンドの凍結および融解にかけて細胞を溶解し、そして細胞関連ウイルスを解放した。上澄み液を溶解した細胞沈澱と再び組み合わせ、そして遠心により清浄化して細胞の破片を除去した。遊離のおよび解放させたウイルスを含有する得られる上澄み液を系統的に希釈し、そしてコンフルエントに増殖した非感染のベロ細胞を含有する皿に０．１ｍｌの試料を接種した。ベロ細胞の培養物を３６℃において９０分間インキュベーションして、存在する生きているウイルスを細胞に感染させた。次いで培養物を洗浄してウイルスの接種物を除去し、アガロースを含有する媒質をオーバーレイし、そしてインキュベーションした。形成したプラーク数を計数することによって、ウイルスの増殖を定量した。すべての培養物を適当な陽性および陰性の対照で構成した；そして結果をプラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ／ｍｌ）の数として表す。
【０１１２】
【表５】

【０１１３】
固定剤で処理した試料の合計のウイルスの負担は４．９×１０⁷であった（表Ｅ６−１）。Ｔ＝０の試料において３．２×１０⁶ＰＦＵ／ｍｌへの減少により理解されるように、固定剤との接触のとき直ちに１対数より多くが不活性化された。固定剤の処理の３０分後、生活可能な家兎痘ウイルスを検出することができなかった。細胞関連ウイルスでさえ殺されたことは意味がある；殺ウイルス濃度の固定剤はベロ細胞を浸透することができたことを示唆する。
【０１１４】
ＳＶ４０ウイルスの不活性化
ＳＶ４０のＰＡ−５７株をターゲットウイルスとして使用した。ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）をウイルスを増殖するための宿主細胞として使用した。ＣＶ−１細胞をＳＶ４０ウイルスで感染させ、そして７２時間インキュベーションした。ほぼ２×１０⁷の感染した細胞を洗浄し、次いで１．０ｍｌの細胞不含ＳＶ４０ウイルスの中に再懸濁させた。次いでこの混合物を１．０ｍｌの胎児子ウシ血清で希釈して、５０％の血清の混合物を形成した。０．１ｍｌの試料を取り出して合計のウイルスの負担を試験した；この試料を「ウイルスの負荷」と標識した。ウイルス／細胞の懸濁液の残部（１．９ｍｌ）を１．９ｍｌの固定剤と混合した。０．１ｍｌの試料を直ちに取り出し、そしてＥＭＥＭ＋５％のＴＳＢの中で１：３０に希釈した。これはＴ＝０を表した。この懸濁液の残部を室温において３０分間インキュベーションした。３０分において、０．１ｍｌの試料を再び取り、そしてＥＭＥＭ＋５％のＴＳＢの中で１：３０に希釈し、これはＴ＝３０の試料を表した。Ｔ＝０およびＴ＝３０の両者の試料を遠心して細胞を沈澱させた。上澄み液を取り出し、そして氷上に保持し、その間細胞の沈澱を２ラウンドの凍結および融解にかけて細胞を溶解し、そして細胞関連ウイルスを解放した。上澄み液を溶解した細胞沈澱と再び組み合わせ、そして遠心により清浄化して細胞の破片を除去した。遊離のおよび解放させたウイルスを含有する得られる上澄み液を系統的に希釈し、そしてコンフルエントに増殖した非感染のＣＶ−１細胞を含有する皿に０．１ｍｌの試料を接種した。ＣＶ−１細胞の培養物を３６℃において９０分間インキュベーションして、存在する生きているウイルスを細胞に感染させた。次いで培養物を洗浄してウイルスの接種物を除去し、アガロースを含有する媒質をオーバーレイし、そしてインキュベーションした。形成したプラーク数を計数することによって、ウイルスの増殖を定量した。すべての培養物を適当な陽性および陰性の対照で構成した；そして結果をプラーク形成単位／ｍｌ（ＰＦＵ／ｍｌ）の数として表す。
【０１１５】
【表６】

【０１１６】
固定剤はＳＶ４０を不活性化したが、家兎痘ウイルスより低い程度であった。固定剤の成分の濃度、インキュベーション時間などを調節して、ウイルスの不活性化の能力を増大することができるであろう。試験した固定剤配合物による３０分の処理で、最大１ｌｏｇのウイルスが不活性化された。
【０１１７】
ＨＩＶ−１ウイルスの不活性化
ＨＩＶ−１のＨＴＬＶ−ＩＩＩ−Ｂ株をターゲットウイルスとして使用した。ＭＴ−４細胞をウイルスを増殖するための宿主細胞として使用した。ＭＴ−４細胞をＨＩＶ−１ウイルスで感染させ、そして４８時間インキュベーションした。ほぼ８×１０⁶の感染した細胞を洗浄し、次いで０．８ｍｌの細胞不含ＨＩＶ−１ウイルスの中に再懸濁させた。次いでこの混合物の０．４ｍｌを０．４ｍｌの胎児子ウシ血清で希釈して、５０％の血清の混合物を形成した。０．１ｍｌの試料を取り出して合計のウイルスの負担を試験した；この試料を「ウイルスの負荷」と標識した。ウイルス／細胞の懸濁液の残部（０．７ｍｌ）を０．７ｍｌの固定剤と混合した。０．１ｍｌの試料を直ちに取り出し、そしてＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳの中で１：３００に希釈した。これはＴ＝０を表した。この懸濁液の残部を室温において３０分間インキュベーションした。３０分において、０．１ｍｌの試料を再び取り、そしてＲＰＭＩ１６４０＋１０％のＦＢＳの中で１：３００に希釈し、これはＴ＝３０の試料を表した。Ｔ＝０およびＴ＝３０の両者を系統的に希釈し、そして非感染のＭＴ−４細胞を含有する皿に０．１ｍｌの試料を接種した。ＭＴ−４細胞の培養物を洗浄して接種物を除去しなかったが、１．０ｍｌの培地を除去し、それを新鮮な１．０ｍｌと置換することによって培養物に２回／週供給した。培養物を接種後第７、１４および２８日に細胞変性作用（ＣＰＥ）の存在について検査した。細胞変性作用は、ウイルスの増殖の結果として起こる感染した細胞に対する形態学的変化である。さらに、７、１４および２８日の培養物からの上澄み液を集め、そしてＨＩＶ−１特異的ウイルスのｐ２４タンパク質の存在についてアッセイした。
【０１１８】
すべての培養物を適当な陽性および対照の対照で構成した；そしてＣＰＥを含有する接種したウェルの百分率またはｐ２４タンパク質について陽性のウェルの百分率として表す。組織培養の感染投与量₅₀（ＴＣＩＤ₅₀）／ｍｌを、式ＴＣＩＤ₅₀＝Ａ−（Ｓ_I／１００−０．５）×Ｂを使用して計算した；ここでＡ＝接種した最高濃度のｌｏｇ₁₀、Ｓ_I＝各希釈において陽性の百分率の合計、そしてＢ＝希釈倍数のｌｏｇ₁₀である。
【０１１９】
【表７】

【０１２０】
【表８】

【０１２１】
室温において３０分間の固定剤による処理はＨＩＶ−１のＴＣＩＤ₅₀の４と５ｌｏｇとの間で不活性化した。この処理により不活性化しないウイルスはその増殖の反応速度論に関して有意に障害された。表Ｅ６−３から理解できるように、第２８日に、Ｔ＝３０試料において推定されたＴＣＩＤ₅₀＝１０^5.25／ｍｌが存在した；しかも第７日および第１４日にこの試料でＣＰＥは観察されなかった。対照的に、匹敵する量の感染性ウイルス（１０^-5または１０^-6）を含有するウイルスの負荷の希釈物およびＴ＝０試料は、第７日および第１４日に、事実ＣＰＥを示した。
【０１２２】
実施例７
固定の間の免疫染色
固定剤を次の処方で調製した：０．８９％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒド；７．２５％（ｗ／ｖ）のＤＭＳＯ；３２ｍＭのＤＮＢＳ；０．０９９８％（ｗ／ｖ）のツイーン２０；０．２ｇ／ｌのＫＨ₂ＰＯ₄；０．２ｇ／ｌのＫＣｌ；２．１６ｇ／ｌのＮａ₂ＨＰＯ₄・７Ｈ₂Ｏおよび４．２ｇ／ｌのＮａＣｌ。全血を静脈穿刺によりＫ３−ＥＤＴＡの中に集め、そして必要となるまで、通常２時間以内、室温に保持した。
【０１２３】
全血の１００μｌのアリコートを、細胞表面の抗原に対する抗体ＣＤ３（ＯＫＴ３）、ＣＤ２（ＯＫＴ１１）、ＣＤ１４（ＯＫＴ１４）および対照ＩｇＧ；または細胞質抗原のビメンチン（クローンＮｏ．Ｖ９、シグマ・ケミカル・カンパニー）に添加した。細胞および抗体を混合し、そして室温において２０分間インキュベーションし、次いで２ｍｌの前述の固定剤配合物を各管に添加し、混合し、そして細胞懸濁液を４０分間インキュベーションした。固定後、細胞を遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により沈澱させ、上澄み液を吸引により取り出し、そして３ｍｌの洗浄緩衝液（５％（ｖ／ｖ）の血清、１．５％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンおよび０．００５５％（ｗ／ｖ）のエチレンジアミン四酢酸）を各管に添加した。管を室温において１０分間インキュベーションした。この１０分のインキュベーションの間に、赤血球は溶解したが、白血球は溶解しなかった。次いで白血球を遠心（４５７×ｇ、２１℃、８分）により沈澱させ、そして３ｍｌの洗浄緩衝液の中でさらに１回洗浄した。洗浄後、細胞を直接標識した抗体（対照、ＯＫＴ３、ＯＫＴ１１およびＯＫＴ１４）で処理し、０．５ｍｌのＰＢＳ＋２％のホルムアルデヒドの中に再懸濁させ、そしてフローサイトメトリーにより分析した。抗ビメンチンとインキュベーションした細胞を室温において２００μｌのＦＩＴＣに接合したヤギ抗マウスＩｇＧで３０分間処理した。これらの細胞を３ｍｌの洗浄緩衝液で２回洗浄し、次いで０．５ｍｌのＰＢＳ＋２％のホルムアルデヒドの中に再懸濁させ、そしてフローサイトメトリーにより分析した。
【０１２４】
【表９】

【０１２５】
表Ｅ７−１に示すように、細胞表面の成分に対する抗体と反応性のリンパ球および単球の百分率において、固定した細胞と未固定の細胞との間にすぐれた一致が存在した。固定剤の添加前の２０分のインキュベーションの間にどれだけ多くの細胞表面の染色が起こるか、および固定剤の添加後にどれだけ多くが起こったかをこの実験から決定することは不可能である。しかしながら、固定剤の添加前に存在した細胞表面の反応性を仮定することは合理的である。対照的に、抗ビメンチンとの反応性は固定剤の存在下においてのみ起こった。未固定の細胞は抗ビメンチンと反応することができなかった。なぜなら、抗体は抗原の細胞質の位置へアクセスすることができなかったからである。しかしながら、固定試薬の添加は、細胞を固定しそして透過性とし、そして抗ビメンチンに細胞質の抗原へのアクセスを与えた。抗原抗体の相互作用は固定試薬の存在下に起こり、そして反応の特異性は対照の抗体が細胞を染色することができなかったことにより証明された。
【０１２６】
本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。
【０１２７】
１、一般構造式
【０１２８】
【化４】
Ｒ_１Ｒ_２Ｒ_３Ｒ_４Ｒ_５−Ａｒ−Ｘ
式中、
ＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、ＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂，ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒ、ＣＮ、ＯＨ、ＯＲ、ＯＣＯＲ、ＯＣＯＮＨ₂、ＯＣＯＮＨＲ、ＯＣＯＮＲ₂、ＯＣＯＮＨＡｒ、ＯＣＯＮＡｒ₂であり、
ＲはＨまたは１〜６個の炭素原子を含有するアルキルであり、
Ａｒは融合または非融合の、同一であるか、あるいは異なる１〜３個の芳香族環であり、ベンゼン環、ヘテロサイクル環または同一であるか、あるいは異なりそしてＯ、ＮまたはＳである異種原子を含有する環であり、前記環はＲ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄およびＲ_５で置換されており、
Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、Ｘ、ＯＨ、ＯＲ、Ａｒ、ＲまたはＣＦ₃であり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない、
の少なくとも１種の化合物を含んでなり、前記少なくとも１種の化合物は液体の賦形剤の中に分散されている固定用組成物。
【０１２９】
２、Ｒ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＯＮＨＲ、ＣＯＮＲ₂、ＣＨＯ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＨＡｒ、ＯＨ、ＯＲ、ＣＦ₃またはＲであり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない、上記第１項記載の固定用組成物。
【０１３０】
３、Ｒ₁、Ｒ₂、Ｒ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、ＣＯＮＨＲ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨ、ＸまたはＲであり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない、上記第２項記載の固定用組成物。
【０１３１】
４、ＸはＳＯ₃Ｈ、ＣＯＯＨまたはＯＨである、上記第３項記載の固定用組成物。
【０１３２】
５、タンパク質への取り付けおよびそれらの構造の接着するために適当な少なくとも１種のアルコール不含化合物をさらに含む、上記第１項記載の固定用組成物。
【０１３３】
６、前記少なくとも１種のアルコール不含化合物は、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、グリオキサル、マロンアルデヒド、ジアセチル、ポリアルデヒド、カーボジイミド、ジイソシアネート、ジアゾニウム化合物、ジイミドエステル、マレイミド、ベンゾキノン、および金属イオンから本質的に成る群より選択される、上記第５項記載の固定用組成物。
【０１３４】
７、前記少なくとも１種のアルコール不含化合物は、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、パラホルムアルデヒド、グリオキサルおよびマロンアルデヒドから本質的に成る群より選択される、上記第６項記載の固定用組成物。
【０１３５】
８、一般構造式の化合物中のＸはＳＯ₃Ｈ、ＣＯＯＨまたはＯＨであり、そしてＲ₁、Ｒ₂およびＲ₃は同一であるか、あるいは異なり、そしてＮＯ₂、ＣＯＲ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＨ、ＣＯＮＨ₂、ＣＨＯ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＯＨまたはＲであり、ただしＲ₁およびＲ₂がＮＯ₂であるとき、Ｒ₃はＮＯ₂ではない、上記第７項記載の固定用組成物。
【０１３６】
９、細胞膜を横切る成分の輸送を促進する少なくとも１種の成分をさらに含む、上記第６項記載の固定用組成物。
【０１３７】
１０、一般構造式中のＸはＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅、ＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂、ＣＯＯＨ、ＣＯＯＲ、ＣＯＯＣ₆Ｈ₅、ＣＯＯＡｒまたはＣＮである、上記第９項記載の固定用組成物。
【０１３８】
１１、ＸはＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＲ₂、ＳＯ₂ＯＲ、ＳＯ₂ＯＡｒ、ＳＯ₂ＮＨＣ₆Ｈ₅およびＳＯ₂Ｎ（Ｃ₆Ｈ₅）₂である、上記第１０項記載の固定用組成物。
【０１３９】
１２、ＸはＯＨ、ＣＯＯＨ、ＳＯ₃Ｈ、ＳＯ₂ＮＨ₂、ＳＯ₂ＮＨＲ、ＳＯ₂ＮＨＲ₂またはＳＯ₂ＯＲである、上記第１１項記載の固定用組成物。
【０１４０】
１３、ＸはＳＯ₃ＨまたはＳＯ₂ＮＨ₂である、上記第１２項記載の固定用組成物。
【０１４１】
１４、細胞膜を横切る成分を輸送を促進する前記化合物は、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ポリエチレングリコールおよびエチレングリコールから本質的に成る群より選択されるフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）化合物である、上記第９項記載の固定用組成物。
【０１４２】
１５、前記フソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）化合物はジメチルスルホキシドである、上記第１４項記載の固定用組成物。
【０１４３】
１６、両性イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤をさらに含む、上記第６項記載の固定用組成物。
【０１４４】
１７、両性イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤をさらに含む、上記第１４項記載の固定用組成物。
【０１４５】
１８、２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド、２，４−ジニトロフェノール、３，５−ジニトロサリチル酸、２，４−ジニトロ安息香酸、５−スルホサリチル酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジスルホン酸、３，５−ジニトロ安息香酸、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸、４−ニトロフェノール、３，５−ジニトロサリシルアルデヒド，３，５−ジニトロアニリン、パラトルエンスルホン酸、２−メシチレンスルホン酸、２−（トリフルオロメチル）安息香酸、３，５−ジニトロベンゾニトリル、または２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，６−ジニトロベンゼンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスルホン酸から選択される一般構造式の少なくとも１種の化合物を含んでなり、前記化合物は賦形剤の中に分散されている、固定用組成物。
【０１４６】
１９、前記一般構造式の少なくとも１種の化合物は、ジニトロベンズアルデヒド、３，５−ジニトロ安息香酸、２，４−ジニトロ安息香酸、２，６−ジニトロベンゼンスルホン酸、３，５−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジニトロフェノール、４−ニトロフェノール、または３，５−ジニトロサリチル酸である、上記第１８項記載の固定用組成物。
【０１４７】
２０、少なくとも１種のアルコール不含細胞固定剤をさらに含む、上記第１９項記載の固定用組成物。
【０１４８】
２１、前記少なくとも１種のアルコール不含細胞固定剤はアミン反応性アルデヒドである、上記第２０項記載の固定用組成物。
【０１４９】
２２、前記少なくとも１種のアルコール不含細胞固定剤は、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、メタノール不含ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびアクロレインから本質的に成る群より選択される、上記第２１項記載の固定用組成物。
【０１５０】
２３、前記少なくとも１種のアルコール不含細胞固定剤は前記組成物の中に約０．１％〜約４％の範囲の濃度で存在する、上記第２２項記載の固定用組成物。２４、前記一般構造式の少なくとも１種の化合物は、２，４−ジニトロフェノール、２，４−ジニトロ安息香酸、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸または４−ニトロフェノールから本質的に成る群より選択される、上記第２３項記載の固定用組成物。
【０１５１】
２５、前記少なくとも１種のアルコール不含細胞固定剤はメタノール不含の、高い等級のホルムアルデヒドである、上記第２４項記載の固定用組成物。
【０１５２】
２６、細胞膜を横切る成分の輸送を促進する少なくとも１種の成分をさらに含む、上記第２１項記載の固定用組成物。
【０１５３】
２７、細胞膜を横切る成分を輸送を促進する前記化合物は、ジメチルスルホキシド、スルホラン、ポリエチレングリコールおよびエチレングリコールから本質的に成る群より選択されるフソゲン化合物である、上記第９項記載の固定用組成物。
【０１５４】
２８、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記第２７項記載の固定用組成物。
【０１５５】
２９、前記界面活性剤の少なくとも１種はポリオキシエチレンソルビタンである、上記第２８項記載の固定用組成物。
【０１５６】
３０、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記第２５項記載の固定用組成物。
【０１５７】
３１、前記界面活性剤の少なくとも１種はポリオキシエチレンソルビタンである、上記第３０項記載の固定用組成物。
【０１５８】
３２、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記第１項記載の固定用組成物。
【０１５９】
３３、少なくとも１種の非イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤をさらに含む、上記第２１項記載の固定用組成物。
【０１６０】
３４、ジメチルスルホキシドをさらに含む、上記第３１項記載の固定用組成物。
【０１６１】
３５、前記ジメチルスルホキシドの濃度は約１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）であり、そして前記少なくとも１種の両性イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤は約０．００１〜約０．２％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、上記第３４項記載の固定用組成物。
【０１６２】
３６、前記一般構造式の化合物は２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、２，４−ジニトロ安息香酸、２，４−ジニトロフェノール、またはこれらの２またはそれ以上の組み合わせである、上記第３５項記載の固定用組成物。
【０１６３】
３７、細胞を上記第１項記載の固定用組成物と、前記細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記細胞を固定するために有効な量でかつ期間の間、接触させることからなる、細胞を固定する方法。
【０１６４】
３８、細胞を上記第３６項記載の固定用組成物と、前記細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記細胞を固定するために有効な量でかつ期間の間、接触させることからなる、細胞を固定する方法。
【０１６５】
３９、工程：
ａ）分析しようとする１集団の細胞を含有する生物学的試料を上記第１項記載の固定用組成物と、前記細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記細胞を固定するために有効な量でかつ期間の間、接触させ、
ｂ）前記細胞を、工程ａ）における前記固定用組成物と同時にあるいはその後に、細胞表面のマーカーに対する少なくとも１種の結合性リガンド、細胞内抗原に対する少なくとも１種の結合性リガンド、または細胞表面のマーカーに対する少なくとも１種の結合性リガンドと細胞内抗原に対する少なくとも１種の結合性リガンドとの組み合わせと、接触させ、そして
ｃ）そのように固定された細胞の細胞の性質を検査する、
からなる細胞を分析する方法。
【０１６６】
４０、検査する細胞の性質は細胞表面のマーカー、細胞の細胞内マーカー、細胞の形態学、および細胞の光散乱性質であり、そして前記結合性リガンドは抗体であり、そして前記検査をフローサイトメーターを使用して実施する、上記第３５項記載の方法。
【０１６７】
４１、固定された細胞の細胞の性質を同一のタイプの正常の生きている細胞の集団の同一の細胞の性質を証明するデータと比較する、上記第４０項記載の方法。
【０１６８】
４２、前記生物学的試料は全血である、上記第４１項記載の方法。
【０１６９】
４３、前記固定された細胞の集団は全血球の集団である、上記第４２項記載の方法。
【０１７０】
４４、前記固定された細胞の集団をＣＤ４陽性Ｔ細胞、単球、および顆粒球の下位集団に分離する、上記第４３項記載の方法。
【０１７１】
４５、また、前記同一のタイプの正常の生きている細胞の集団をＣＤ４陽性Ｔ細胞、単球、および顆粒球の下位集団に分離し、そしてこのような分離の結果から得られたデータを固定された細胞の分離の結果から得られたデータと比較することをさらに含む、上記第４４項記載の方法。
【０１７２】
４６、前記生物学的試料はフィコール処理した血液である、上記第４１項記載の方法。
【０１７３】
４７、工程：
ａ）分析しようとする１集団の細胞を含有する生物学的試料を、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシド、および非イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤からなる固定用組成物と、接触させ、前記固定用組成物は液体の賦形剤の中に分散されておりそして前記細胞の細胞の性質を実質的に破壊しないで前記細胞を固定するために有効な量でかつ期間の間、前記固定用組成物を適用し、
ｂ）そのように固定された前記細胞を、前記固定用組成物と同時にあるいはその後に、細胞表面のマーカーに対する少なくとも１種の抗体、細胞内抗原に対する少なくとも１種の抗体、または細胞表面のマーカーに対する少なくとも１種の抗体と細胞内抗原に対する少なくとも１種の抗体との組み合わせと、接触させ、そして
ｃ）そのように固定された細胞の細胞の性質をフローサイトメーターで検査し、そして前記検査の結果を記録する、
からなる細胞を分析する方法。
【０１７４】
４８、前記生物学的試料を骨髄細胞、全血、フィコール処理した血液から本質的に成る群より選択される、上記第４７項記載の方法。
【０１７５】
４９、検査する細胞の性質は、細胞表面のマーカー、細胞の細胞内マーカー、細胞の形態学、および細胞の光散乱性質である、上記第４７項記載の方法。
【０１７６】
５０、固定された細胞の細胞の性質を同一のタイプの正常の生きている細胞の集団の同一の細胞の性質を証明するデータと比較する、上記第４９項記載の方法。
【０１７７】
５１、前記生物学的試料は全血である、上記第５０項記載の方法。
【０１７８】
５２、前記固定された細胞の集団は全血球の集団である、上記第５１項記載の方法。
【０１７９】
５３、前記固定された細胞の集団をＣＤ４陽性Ｔ細胞、単球、および顆粒球の下位集団に分離する、上記第５２項記載の方法。
【０１８０】
５４、また、前記同一のタイプの正常の生きている細胞の集団をＣＤ４陽性Ｔ細胞、単球、および顆粒球の下位集団に分離し、そしてこのような分離の結果から得られたデータを固定された細胞の分離の結果から得られたデータと比較することをさらに含む、上記第５３項記載の方法。
【０１８１】
５５、ウイルスの成分を前記固定された細胞内で検出する、上記第３９項記載の方法。
【０１８２】
５６、ウイルスの負荷を測定する、上記第５５項記載の方法。
【０１８３】
５７、前記ウイルスはＨＩＶである、上記第５６項記載の方法。
【０１８４】
５８、前記細胞内抗原のための抗ｐ２４抗体である、上記第５７項記載の方法。
【０１８５】
５９、ＤＮＡを前記固定された細胞内で検出する、上記第３９項記載の方法。
【０１８６】
６０、工程：
ａ）患者の全血の試料を上記第３６項記載の固定用組成物と、白血球の細胞の性質を実質的に破壊しないで、前記全血の中に存在する白血球を固定するために有効な量でかつ期間の間、接触させ、
ｂ）前記試料の中に存在する赤血球を除去し、
ｃ）工程ａ）における接触工程と同時にあるいはその後に、そのように固定された細胞を白血球のマーカーに対する少なくとも１種の抗体および少なくとも１種のウイルス成分に結合する少なくとも１種の結合性リガンドと接触させ、
ｄ）そのように固定された細胞の細胞の性質をフローサイトメーターで検査し、そして
ｅ）前記検査の結果を、ウイルスの感染の種々の段階における患者から同一の方法で得られたヒストリーのデータと比較する、
からなるそのように感染した患者におけるウイルスの感染の進行をモニターする方法。
【０１８７】
６１、前記ウイルスはＨＩＶである、上記第６０項記載の方法。
【０１８８】
６２、前記少なくとも１種のウイルス成分に結合する前記結合性リガンドは抗ｐ２４抗体である、上記第６１項記載の方法。
【０１８９】
６３、白血球のマーカーに対する少なくとも１種の抗体は抗ＣＤ４モノクローナル抗体である、上記第６２項記載の方法。
【０１９０】
６４、前記抗ＣＤ４抗体はフィコエリトリンで標識し、そして前記抗ｐ２４抗体をＦＩＴＣで標識する、上記第６３項記載の方法。
【０１９１】
６５、ａ）上記第３６項記載の固定用組成物、および
ｂ）血球表面のマーカーに対する少なくとも１種の抗体、
からなる、感染した血球の中のウイルスの負荷を検出する試薬キット。
【０１９２】
６６、細胞内抗体に対する結合性リガンドをさらに含む、上記第６５項記載の試薬キット。
【０１９３】
６７、血球表面のマーカーに対する前記抗体の少なくとも１種はＣＤ４陽性Ｔ細胞に対するモノクローナル抗体である、上記第６６項記載の方法。
【０１９４】
６８、単球に対して少なくとも１種のモノクローナル抗体をさらに含む、上記第６７項記載の試薬キット。
【０１９５】
６９、前記細胞内抗原に対する前記結合性リガンドはウイルス成分に対する抗体である、上記第６８項記載の試薬キット。
【０１９６】
７０、前記固定用組成物および抗体は１つの容器の中に含有されている、上記第６９項記載の試薬キット。
【図面の簡単な説明】
【図１】生きている、未固定の細胞の集団の中の全血球のクラスターの分布を証明する、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して得られた３次元のプロットである。
【図２】本発明の固定用組成物で固定した細胞の集団の中の全血球のクラスターの分布を証明する、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターを使用して得られた３次元のプロットである。
【図３】二重の抗体の染色アッセイの結果を証明する、ＦＡＣＳｃａｎを使用して得られたサイトグラムである。
【図４】ａは抗ｐ２４モノクローナル抗体と反応した未感染の細胞の染色の結果を示す、ＦＡＣＳｃａｎを使用して得られた輪郭プロットであり、ｂは細胞の数を相対蛍光強度に対してプロットした、ａに描写したのと同一のデータのヒストグラムである。
【図５】ａは抗ｐ２４モノクローナル抗体と反応した持続的にＨＩＶ感染した細胞の染色の結果を示す、ＦＡＣＳｃａｎを使用して得られた輪郭プロットであり、ｂはＨＩＶ感染した細胞の数を相対蛍光強度に対してプロットした、ａに表したのと同一のデータのヒストグラムである。
【図６】ａは対照の非感染の病院の患者からの試料を使用して得られた結果を示す、ＦＡＣＳｃａｎを使用して得られた輪郭プロットであり、ｂ、ｃおよびｄは病気の感染の３つの種々の段階における、３人のＨＩＶ感染した患者からの血液の染色結果を示す。
【符号の説明】
１０ 横座標（Ｘ−軸）
１２ 縦座標（Ｙ−軸）
１４ Ｚ−軸
１６ 起源
１８ クラスター
２０ クラスター
２２ 活性化されたＴ−細胞
１００ リンパ球のクラスター
１０２ 単球のクラスター
１０４ 顆粒球のクラスター

Claims (6)

1. （ｉ） ２，４−ジニトロベンゼンスルホンアミド、ジニトロフェノール、３，５−ジニトロサリチル酸、２，４−ジニトロ安息香酸、２，５−ジヒドロキシ−１，４−ベンゼンジスルホン酸、３，５−ジニトロ安息香酸、８−ヒドロキシキノリン−５−スルホン酸、４−ニトロフェノール、３，５−ジニトロサリシルアルデヒド，３，５−ジニトロアニリン、パラトルエンスルホン酸、２−メシチレンスルホン酸、２−（トリフルオロメチル）安息香酸、３，５−ジニトロベンゾニトリルおよび２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸よりなる群から選択される第１の固定用化合物；
   （ ii ） ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、アクロレイン、グリオキサール、マロンアルデヒド、ジアセチル、ポリアルデヒド、カルボジイミド、ジイソシアネート、ジアゾニウム化合物、ジイミドエステル、マレイミド、ジエチルピロカーボネート、ベンゾキノンおよび金属イオンよりなる群から選択されるアルコール不含の第２の固定用化合物；
   （ iii ） ジメチルスルホキシド、スルホラン、ポリエチレングリコールおよびエチレングリコールよりなる群から選択される、脂質単一層の表面ポテンシャルを減少することにより細胞膜を横切る成分の輸送を促進するフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）化合物；ならびに
   （ iv ） 両性イオン性または非イオン性界面活性剤
   を含んでなる固定用組成物。
2. 細胞を請求項１に記載の固定用組成物と、該細胞の細胞特性を実質的に破壊しないで、該細胞を固定するのに有効な量でかつ時間の間、接触させることからなる細胞の固定化方法。
3. 次の工程：
   ａ）分析しようとする細胞の集団を含有する生物学的試料を請求項１に記載の固定用組成物と、該細胞の細胞特性を実質的に破壊しないで、該細胞を固定するのに有効な量でかつ時間の間、接触させ；
   ｂ）該細胞を、工程ａ）における該固定用組成物と同時にあるいはその後に、細胞表面マーカーに対する少なくとも１種の結合性リガンド、細胞内抗原に対する少なくとも１種の結合性リガンド、または細胞表面マーカーに対する少なくとも１種の結合性リガンドと細胞内抗原に対する少なくとも１種の結合性リガンドとの組み合わせと、接触させ；そして
   ｃ）そのように固定された細胞の細胞特性を検査すること、
   を含んでなる細胞の分析方法。
4. 次の工程：
   ａ）分析しようとする細胞の集団を含有する生物学的試料を、２，４−ジニトロベンゼンスルホン酸、ホルムアルデヒド、ジメチルスルホキシドおよび非イオン性界面活性剤または両性イオン性界面活性剤を含んでなる固定用組成物と、接触させ、該固定用組成物は液体の賦形剤中に分散されておりそして該細胞の細胞特性を実質的に破壊しないで該細胞を固定するのに有効な量でかつ時間の間、該固定用組成物を適用し；
   ｂ）そのように固定された該細胞を、該固定用組成物と同時にあるいはその後に、細胞表面マーカーに対する少なくとも１種の抗体、細胞内抗原に対する少なくとも１種の抗体、または細胞表面のマーカーに対する少なくとも１種の抗体と細胞内抗原に対する少なくとも１種の抗体との組み合わせと、接触させ；そして
   ｃ）そのように固定された細胞の細胞特性をフローサイトメーターで検査し、そして該検査の結果を記録すること、
   を含んでなる細胞の分析方法。
5. 次の工程：
   ａ）患者から採取した全血試料を請求項１に記載の固定用組成物と、白血球の細胞特性を実質的に破壊しないで、該全血中に存在する白血球を固定するのに有効な量でかつ時間の間、接触させ；
   ｂ）該試料の中に存在する赤血球を除去し；
   ｃ）工程ａ）における接触工程と同時にあるいはその後に、固定された細胞を白血球マーカーに対する少なくとも１種の抗体および少なくとも１種のウイルス成分に結合する少なくとも１種の結合性リガンドと接触させ；
   ｄ）固定された細胞の細胞特性をフローサイトメーターで検査し；そして
   ｅ）該検査の結果を、ウイルス感染の種々の段階における患者から同一の方法で得られたヒストリーデータと比較すること、
   を含んでなる細胞のウイルス感染の検査方法。
6. ａ）請求項１に記載の固定用組成物、および
   ｂ）血球表面マーカーに対する少なくとも１種の抗体、
   を含んでなる感染した血球中のウイルス負荷を検出するための試薬キット。

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