JPH06509417A

JPH06509417A - 多重検体の同時分析の方法と構成

Info

Publication number: JPH06509417A
Application number: JP5502870A
Authority: JP
Inventors: レーネン　ブライアン　シー; クロザース　ステファン　デー
Original assignee: トランスメッド　バイオテック　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-07-16
Filing date: 1992-07-10
Publication date: 1994-10-20
Also published as: WO1993002360A1; EP0594763A1; AU2348092A; CA2113350A1; DE69227112D1; EP0594763B1; ATE171543T1; US5567627A; CA2113350C; EP0594763A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】多重検体の同時分析の方法と購成謝辞本発明は一部、ナショナル・ハート・ラング・ブランド・インスティテユートからの研究助成金、契約番号−ＨＩ３−６−７０２０によって助成された。米国政府は本発明に権利を保（ｆする。

関連申請に対する相互参照本出願は、１９９１年７月１６［１に提出したＵＳＳＮ番号０７／７３１．０３９の一部継続出願であり、その開示は本願に編入、参照されている。

木を明は多重相補的結合部分を用いて生物学的試料中の多重検体の後続的検出に使用する方法と装置に関する。本発明はヒトＩｇＧ、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、及び組換えＨＩＶｇｐ４１、組換えＨＩＶｐ２４、Ｂ型肝炎コア・タンパク質ならびに組換えＨＴＬＶｒｅ−５に対する抗体の後続的検出によって例示される。

発明の背策インビトロ診断用薬業界は多重検体の後続的個別検出を提供する技術をめてきている。本願で用いられているように、“後続的−（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ）という語は、同し場所で同時に遂行される検定を指すもので、同時に行われるが必すし７も同一場所で行われない検定を指す″同時（ご　（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕＳ）という語に対立するものである。例えば、クラミジアと淋菌の感染はしばしば女性に同時におこる。試す、１採集が問題となることがあるので、２つの病原体を後続的に検出てきる単一検定であることが望ましい。別の例は、血中のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２抗体の同時検出に対する現今の関心である。後続的検定を用いる場合、陽性の結果は、そのウィルスのどちら１つ、あるいは両方に対する抗体のｒｊ在を示唆するが、どちらの抗体が特異的に存在するかの決定を許容するものではない。このような検定技法は、その診断有効性が同時、個別的検定よりも幾分低いが、便利で費用効果のある手段となる。

多重検体の後続的、個別検定に対するもう一つの関心は、この様な技法を所謂パネル検定及びスクリーニング検定に用いることにある。パネル検定においては、診断調査ドの！４えられた１つの試料に対して診断解釈のために多数の異なった検定を同時に指令する。スクリーニング検定では、検査室は、試料がスクリーニング中の検体の１つ、あるいはそれ以上に対１．て陽性か否かを決定しようと努力してすべての試料に対して同一セットの同時検定を行う。

後者の応用の一例は、血液銀行における血液のスクリーニングであり、そこでは、すべてのユニットの献血はＨＩＶ、ＨＢＶ、）ＩＴＬＶ及びＨＣＶに対してスクリーニングされる。これらのいずれの状況においても、単一試薬で多重検体の後続的、個別り）折を可能にする試薬技法は、費用と便宜の点で明らかに効果がある。目ド、効果的なスクリーンあるいはパネルに対する必要性は、同時多重であるが個別的な検定を予めプログラムされた試薬と試料操作系によって遂行するロボットを用いてまかなオつれている。このような系は高価であり、信頼出来ないことかある。現在の出願に係る発明の後続的検定によって提供され得る潜在的に有用なパネルの例は、血液銀行スクリーン、肝炎パネル、ＡＩＤＳスクリーニング、受精（受胎）カバネル、甲状腺パネル、腫瘍マーカー、感染病、アレルギーパネル、貧血パネル、自家抗体パネル、微生物抗原あるいは抗体、殺虫剤検体、免疫検定にかかる麻薬あるいは有毒化学検体を含む。

従って、医療診断家が多くの検体の後続的検定を行えるようにする能力を開発することは興味あることである。また、多重後続的分析を施行するための安価な装置を開発することも興味がある。

関連文献最近の総説が多重同時免疫検定に対する概念の技術的展開の歴史のあとをたどり、　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａ　５：　Ｎｏ、　１、　１９９１）、これらの罰ｆｆ、ｉｉＦ　ｕ　ｌ　ｗ　ｙ　ｌ　ｅ　ｒによって１９７６年にＣｏｕｌｔｅｒ　Ｉｎｃに：＊渡７？・　１１５−１９８は蛍光フローサイトメーターで測定出来る種々のパラメターを論しＣいる。Ｇｏｓｌｉｎｇ、”Ａ　Ｄｅｃａｄｅ　ｏｆ　Ｄｅｖｅｌ。

般を論（、゛〔いる。こねらの７υ法のあるものは、フローサイトメタ−で検出出来る個別に確：、：！、　ｉ＋Ｊ能な免疫反応性のある微小球のサブ集団の使用を含んでいる。関連米国特許にはＵＳＰＮ４，４９９，０５２、ＵＳＰＮ４．５２６，２７６、ＵＳｒＮ４．７１７．６５５が含まれる。フローサ−（１−メタ−を用いる細抱の検出は、以下の本国特許、ＩＪＳＰＮ４．９８８，６１９、ＵＳＰＮ４，９８７．０８６、ＵＳｒ’Ｎ４．８５９，５８４、ＵＳＰＮ４，７８３．４０１、及びＵＳｒ’Ｎ４゜７６２．７ｎ＋に開示されている。

多重免疫反応性検体の同時確定は、捕捉マトリックスあるいは固［１が一般的に既知の直径をｔ、１ｊ一つ１ａ１１小球である蛍光免疫検定（ＦＩＡ）の使用を採用する。例えば、直径１０ミクロシの微小球を抗原Ａて被覆することがてきる。この被覆微小球を抗原Ａに対する抗体を含む溶液にさらすと、これらの抗体は彼■微小球に特異的に結合するであろう。次に、抗体Ａに特異的に結合する蛍光色素を含むわ（薬を如える。この様にして、抗体Ａが試料中に存在する場合、蛍光色素が今や特異的１〆Ｌ体抗ハ；紋１を介して微小球に結合しているような抗体“サンドイッチ”が出来上がる。これは“抗体捕捉”ＦＴへの１例である。このかわりに、微小球をある抗体でＫｉＬ、このようにして”抗原捕捉′免疫検定において試料中にｒｒ在する可能性のある抗原を選択的に捕捉することか出来る。この様にして、直径１０ミクロンの微小球のｆイ効Ｊ光度か、とれたけ多くの特異的抗１６あるいは抗体か捕捉されるか、即ち、試Ｈｌ：　（７（Ｅするかによって決定される。

フローサイトメタ−は、拉ｒす・ｒズと蛍光強度を同時に決定するので、異なったサイズの微・Ｊ＼球を異なった検体で袖覆し、即ち、１つの微小トドサイズ当たり１つの免疫検定として、いくつかの異なった免疫検定を同−試ｔ１につい一〇後続的に行うことが出来る（前記Ｆｕ１ｗｙｌｅｒ参照）。前記のＭ　ｃ　Ｈｕ　ｇ　ｈは、“連間（ゲーティング：ｇａｔｉｎｇ）”を採用した多重微小球サイズの使用について諭し、二の方法による４種の検体の確認を証明している。

さらに、ＭｃＨｕｇｈは、市販の微小球の各サイズ範鴫における変動次第で９つのゲートまで使用出来る可能性があると仮定している。前記Ｆｕ１ｗｙｌｅｒは、非干渉の蛍光色素を含む微小球の採用して確認出来る検体数を倍増するのに用いることができると仮定している。多重検体の後続個別的検出に対するこの技法の適用は全て、採用した微小球のサイズの違いに基づいて１つの検体を他と区別するフローサイトメトリーの使用に依ｒ７シている。このようにして、分別される異なった検体の数は、ＦＡＣ３技術の粒子サイズ分離能力によって、及び、区別出来る非干渉蛍光色素の数のみならず、正確なサイズに信頼出来るように調製され得る異なったサイズの微小球の数によって決定される。

発明の開示主題の発明は、多重個別リガンド１合体からなる試薬を用いて、１試料中の関口・のある多重検体を検出するための後続的検定遂行の必要を満たすものである。

各リガントｌ１体は、フローサイトメタ−において検出できる形状をした複数種の固りＯｍ体に（＝ｔ　ｆｉしたリガンドをａむ。各別個のリガンドが付着している固相の担体は各リガンドについて同しサイズのものか、あるいは異なったサイズのものでもよい。各検体及びそのリガンドあるいはｔ［］補的結合部位は、それぞれ、第一、第二の結合対メンバー（ｍｓｂｐ）からなる。この方法は、試薬を調製するために既知の比率の各リガンド複合体を結合し、一定時間、試薬を試料とを特異的結合対が固相担体上に形成されるような条件下に接触させ、予め選択した数の担体を検出し、関心のある特定の検体の存在を、個別のりガント＋Ｘ＝体の各々に連結する特異的結合対の形成に関連づける諸段階からなっている。特異的結合対は検出可能な標識によって見出だされる。主題の発明の方法は川 −試料について行われる可能性のある後続的分析の数を大いに拡張し、スクリーン、パネル及びすべてのタイプの検査の組み合わせに個々に適用される。一般的に、少なくとも５つの検体、さらに通常は３つから５つの個別の検体を、ビーズサイズの変更あるいは多重蛍光物質及び検出器の使用のような識別手段を用いることなく単一検定で確認することが出来る。

得られたデータの解析方法は、前もって選択した相補的結合部位の比率のそれぞれに対する標識の強度の関数として、予め決められた固相担体の数についてのデータを集める段階を含む。標識の相対的強度は試料中に関心のある検体の存在あるいは非存在を示唆するのに用いることができる。

主題の発明の装置は、流体通路を流れる固相担体を含む試料由来の蛍光を検出するためのものである。この装置は少なくとも１つの励起し得る蛍光色素を検出するための手段、及び粒子の総数及び／又は固相担体のいくつかのサブ集団の夫々に伴う総蛍光量を集計するための手段を有している。集積データを記録する手段が提供されており、そのため、予め決められている数の固相担体に対して集計された蛍光の相対強度は、前もって選ばれた結合部位の比率の各々に連携するものである。この装置は粒子分析のための従来のフローサイトメタ−の代わりとなるものであり、主題の応用と共に特異な適用も見出される。

図のｌＩ’ｔｌＱｔな説明図１は、直径２．４及び１０　ミクロンの３つの異なるサイズの微小球サブ集団の側方拡散と前方拡散の合併集合を示す２バラメメータ郭プロツトあるいはゲートのグラフ表示である。

図２は、図１に表示された３つの微小球集団の単一パラメータ前方光拡散のヒストグラム表示である。

図３Ａ（陰性ビーズ）及び３Ｂ（陽性ビーズ）は、フルオレセイン標識のヤギｆ（ａｂｌ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的）（以下”Ｆ　ＩＴＣ−ａ　Ｉ　ｇＧ’と表示）で染色した４ミクロン微小球のヒストグラムの表示である。

図４は、反応容器から流路に移動する個々の反応した粒子の組合わせにおける側ノｊ拡散、前方拡散、及び蛍光、あるいはこれらの特徴の２つかそれ以上を検出するためのサイトメーター装置の略図である。

図５は、反応容器から流路に移動する個々の反応した粒子の蛍光を検出して分析するための７０−装置の略図である。

図６は、ヒストグラム解析に対する段階的手段を示す工程経路である。

図７は、特定のヒストグラムの解析である。

具体的な実施例の概略説明主題の発明の構成に基づき、特に生物学的試料を始めとする試料の中で関心のある複数検体の後続的な個別の検定を遂行するための手法および装置が提供されている。検体は抗原、抗体、核酸、付着体、炭水化物あるいはそれらの組合せのポリペプチドであり得る。手法は、関心のある各検体に対する相補的結合部位の既知の混合比率の利用に依存している。つまり、各検体とその相補的結合部位はそれぞれ、特異的結合対（ｍ　ｓ　ｂ　ｐ）の第一および第二のメンバーで構成される。

各相補的結合部位は、試薬を生産するためのフローサイトメトリー技術により検出可能な通常はミクロスフェアである固ｔｎ担体に付着している。検体の確認は、を０補的結合部位が固定される固参〇担体のサイズやその他の物理的特長に依存しない。従って、あらゆるｔ０補的結合部位は、同じ平均サイズの固相担体に固定されることができる。ただし、希望に応じ、あるいは検出されるべき検体の数が特に大きい場合など複数のサイズが使用されることができる。

主題の発明は、ミクロスフェア（微小球）サイズの区別に頼らずに複数検体の後続的な個別の分析の遂行を可能にする。さらに、それは、以後説明する通り、従来のＦＡＣ８の使用や、免疫反応性を持つミクロスフェアの使用などによって達成されるよりも大きな数の検定の後続的遂行を可能にする。少なくとも４個、普通は５〜６個、及びおそらく最大で１５個までの検体が単一のミクロスフェアサイズおよび（または）単一の蛍光色素を利用して、つまり検出器を利用することなく、後続的に検定されることができる。複数のミクロスフェアサイズまたはその他の物理的検出器を加えること、あるいは追加の蛍光色素の使用は、後続的に検定される検体の数を増やすために使用されることができる。このように、主題の発明の手法は、単−試料上で遂行され、スクリーン、パネルおよびあらゆるタイプの組合せのテストの中で特定のアプリケーションを発見することができる後続的分析の数を大いに拡大する。この分野の技術を熟知した人々が承知している技術と組合わされると、この申請されている方法は、最大１５個の検体、かける８サイズの検出器、かける３個の蛍光検出器、つまり３６０個の後続的検定を分析する能力をｑする。能力のより物理的な見積りは、８個の検体、かける５個のサイズの検出器、かける２個の蛍光検出器、つまり後続的に検定されるのは８０個の検体である。検体の最大数は、その装置に関連するコンピュータのソフトウェアによるデータの処理や保（ｊにより制限を受ける可能性がある。こうした制限はソープトウエア内部でパラメータを変更することにより、また、記載されているよりも大きなデータ処理や保（ｉ能力を備えるコンピュータを利用することにより克服されることができる。検体の最大数はまた、検体の試薬を最適化することにより克服されることができる交差反応、非特異結合及び干渉などの量によっても制限されるＩＴＪ能性がある。

通常の検定の中て、ＦＡＣ５または「フロー」′Ｊ５械の中のミクロスフェアに対する免疫学的検定法の遂ｆｉの結果は、以下の方法で解釈される。入射光の適切な角度の先の散乱が、前傾（１）度の入射光の散乱に対してプロットされ、その結果が、図１に示された通りのミクロスフェアサイズの一連の派生的な機能である。この二つのパラメータ光か散乱プロファイルの中で、それぞれのプロファイルの特定サイズのミクロスフェアの個体群を定義する。もう一つは、前傾傾斜の光の散乱（ＦＡＬＳ）が描かれる単独パラメータ・プロファイルの中でイベントの数、すなわち光の通路を通過してきたそのサイズのミクロスフェアの数は、図２に示される通り描かれる。これらのデータのコンピュータに補助された削減は、特定サイズ範囲のミクロスフェアからのデータだけが眺められるように、すなイ）も特定のＦ　Ａ　Ｌ　Ｓ　ｆｄｊｉ値でのイベントの数だけが示されるように、データをゲートするために使用されている。「ゲート」によって、データの分析において特定サイズ圏のサイズのミクロスフェアの集団のみが考慮されるように意図されている。前記ＮｌｃＨｕｇｈｅは、ミクロスフェア集団の十分な分離がＦＡＬＳのみを使い達成されていることを証明した。

６種サイズのミクロスフェアを使用して行われた検定からデータを分析する際、前記ゲーティングの技術は、１度に１種類のミクロスフェアサイズ固定群に集中するために使われる。この”連間（ゲーティング：ｇａｔｉｎｇ）”内て、そのサイズ圏のミクロスフェアの蛍光強度が免疫サンドイッチの中の検体の結合の度合いにより決定される。これらのデータは図３に示される通り、ヒストグラムの形態で出力される。ここで、イベントの数、すなわち光りの通路を通過するサイズ圏内のミクロスフェアの数は、ログスケール上のこれらのミクロスフェアの蛍光強度に対し、描かれる。

例えば、試料が血清試料である場合、陽性血清は陰性血清よりもＸ軸上の右方向に向けて比較的離れた位置にある「ピーク」を示す。ただし、ミクロスフェアに対する蛍光色素で標識された第二抗体の非特異的結合により、陰性血清も歴然としたピークを持つ。ログスケールのＸ軸（蛍光強度）上のピークの位置は、゛平均チャネル蛍光（ｍｃｆ）”として報告されている。このように、ヒストグラムピークのｍｃｆ値は反応度、すなわち検体の存在の尺度である。その中で検体は、ヒストグラムが横たわる「ゲートＪにより具体的に識別される。無論このゲートは図１および２に示される通り、ミクロスフェアのサイズにより決定する。

ヒストグラムピーク下にある領域は、これまでは分析情報の伝達に利用されていなかった。

その中で、あらかしめ選定された固Ｈのサイズのミクロスフェアに対し免疫学的検定法を通じて各検体が検出され、またその中で、蛍光強度が断定されることができる各ミクロスフェアサイズが電子的ゲートを決定するこの方法論を用い、複数検体用の後続個別的免疫学的検定が１９７４年以来遂行されてきた。この手法には、分解することができるゲートの数により、また、利用できるミクロスフェアの種類により限度がある。Ｓｃ　ｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ　ｅｎら（Ｂ　Ｌ　ＯＯＤ　７３　：　２０４１〜２０４ｇ、１９８９竿）は、４個の同時抗体捕獲検定を報告している。

二点を指摘する必要がある。一つは、それによりこの分野の研究者がこれらの複数ミクロスフェア試薬を適合させた標準的手法である。もう一つは、その中でゲートされたヒストグラムデータが報告される方法である。ゲートされたヒストグラムデータの場合（図３を参＠）、Ｙ軸は“相対的イベント数′と表示されることが多い。寅際のＹ軸の値の列挙は“絶対的イベント数°として表現されることができる。さらに、各す、イズのミクロスフェアの数が他の全てのサイズのものと同しであるように複合試薬を混合することは標準的慣行である。すなわち、それらはほぼ同等の比率で混合される。あるいは、それらが異なる比率で混合される場合は、有為性が実現しない。この慣行はまた、この技術の一定の特性を覆い隠すことができるヒストグラム中のピークのサイズおよび形態の内部的な一貫性を導く。

主題の１法において、ミクロスフェアの物理的特性や複数の蛍光色素使用に依存することなく、複数検体のために後続的にスクリーンすることが可能である。

代わりに試料の中に検体のγｊ在の有無を確認することは、リガンド複合体の各サブ個体群を既知の比率で含む混合体を調整することにより行われることができる。

リガンド？ｊｔ合体は、生物学的試料における関心のある単独検体に特に結合する能力を持つ相補的結合部位かそれに対して固定されているフローサイトメトリー技術により検出されることができる形態の固相担体の複数として定義されている。

つまり、この構成はフォトサイトメトリー技術による検出能力のある複数の個別の試薬のｉ１７合を構成する。全体の構成に占める各サブ個体群の比率が明らかでなければならない。なぜなら、後にそれが関心ある検体の識別に使用されるからである。

一部、全体の組成が調整されると、次に特異的結合対が形成可能となるよう適切な緩衝剤、温度、時間を用いる試料と統合される。特異的結合対は表示媒介物と接触させられ、その後、あらかしめ確認されていた固相担体の数がフォトサイトメトリー技術を使い検出される。固相担体と関連する表示の相対的強度が回復され、データが事象数対）Ｉ］対対表表示強度ヒストグラムとして描かれる。

次に、検定に使用されている試薬の各サブ集団の比率をベースとした試料中にγ ｆ在する検体を識別するため、データが分析される。

時には結合部位の二、二種類のサブ集団の組合せも固有であり得るよう、特性を利用することがａ益である場合もある。例えば、仮に関心ある検体が３個である場合、３個の固ＦＴの非添加の相補的結合部位の比率は１・２ニアであり得る。

しし、例えば５０　ＣＩ　Ｏなとの特定数の同相担体が数えられ、次に、元々の試薬に（Ｔ在する比率に基づく場合、３サブ集団と関連する固相担体の数は５００．１０００及び’３５０　Ｃ１てあろう。もし、これら全検体が試料に存在しない場合、次に５　＋〕（］０の固相担体の集団は、背景に蛍光を持つものとして定義される。もし検体のうちの２つが試料にｒＴ在する場合、また、元々の試薬の組成の１０９６および２１１０ｉｉてγｆ０：する結合部位により固定されている場合、２つの集団は１つが７０Ｏ６のいかなる検体も存在しないサブ集団を代表し、また、合わせてもう１つが残りの２つの混合体の３０％に相当するサブ集団を代表すると定義されることができる。２つの検体が異なる量で存在する場合は、その後検出された表示の相対的強度に基づき、３つの別個の識別可能なサブ集団が観察される。これはさらに次のようにも説明することができる。

当発明の検定法は、Ｉ［１補的結合部位に対し結合する能力を持ついがなる検体の検出にも使用することができる。

一般に、検体はポリペプチド、たんばく質、炭水化物、多糖類、核酸、濫用される麻薬やそうした麻薬の代謝物質、あるいはそれらの組合せなどになる。この分野に熟知した人々にとり、列挙された検体のタイプ用の検定法の方法論は既に知られている。例えば、次のような参考文献をあげることができる。前記Ｆｕ１ｗｙｌｅｒおよびＭｃＨｕｇｈ、５ｈａｐ　ｉ　ｒｏのＰｒａｃｔｉｃａｌ　Ｆｌｏｗ　ＣｙｔｏｍｅｔｒｙＣａｉａｒｏｇ　（Ｉｓｍｕｎｏｃｈｅｓｉｃａｌ　ｒｅａｇｅｎＤ　、Ｒｙ　ｌ　ａ　ｔ　ｔらの“全血液の免疫学的迅速検定システム”　、Ｔｈｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒＡｕｓｔｒａｌｌａｌ　５２　：　７５〜７７　（１９ｑｏ軍）＜交差結合フィブリン分解生成物、肝炎表面抗原、ＨＩＶ抗体、テオフィリンおよびジゴキシン）、Ｂｒｉｎｃｈｍａｎら、“血液中のリンパ球の部分集合の免疫磁気学的な直接量化”　、ＣｌＩｎ、ｅｘｐ、１ｍｍｕｎｏ１．．７１　：　１８２〜１８６（１９８０年）（ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９細胞全体にある検体）、前記ＧｏｓｌｉｎｇＳＳａｕｎｄｅｒｓらの“アクチノマイシンーＤの濃度判定用のフローサイトメトリックの競争的結合の検定“Ｃｙｔｏｍｅｔｏｒｙ　１１　：　３１１〜３１３（１９９０年）（麻薬、ＤＮＡ）　、Ｂａｎｇｓの“ラテックスの凝固試験“Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃ１１ｎｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｎｅｗｓ　Ｅｄ、、（１９８８年）（検体リスト）、ＣｕａｔｒｅｃａｓａｓのＰＮＡＳ６１　：　６３３　（１９６３年）（カップリングアフィニティ、アガロース）。

冶どの部分に関し当発明に基づき検出されたかまたは量が計られた検体は、できれば少なくとも約５０００を、より通常は少なくとも１０，０００の分子重量を持つことが望ましい。関心のある多糖類は一般に約５０００がら約５．　０００．０ｒ）Ｏの分Ｆ量になる。より通常は、１０．０００から１．　０００，０００の分子量を持つ。検体が核酸の分子である場合、分子は一般に約１２個のヌクレオチドから約２Ｘ１０６＠のヌクレオチドの間にある。核酸の試料は、染色体か細胞質、例えばプラスミド、ウィルス、合成物質およびそれらの類似物質、あるいはメツセンジャーＲＮＡ、ｌ−ランスファーＲＮＡ、あるいはリポソームＲＮＡのようなＲＮＡ、ウィルス、およびそれらの類似物質であり得るＤＮＡを含むことができる。ｔｌｉ酸のシーケンスは形質転換された領域、規制的な領域、イントロン、エキソン、および類似物などの上にある構造遺伝子を含むことができる。

本発明における検出もしくはｊｌ量用の検体はまた、約５０００未満の分子量を１１つこともてきる。５０００未満の分子量を持つ適した液体の例には、小型のポリクローナル、／ｊ１型のポリペプチドホルモン、ステロイドホルモン、コレステロール、医薬品、麻薬および各種毒素などが含まれる。１１１補的結合部位は、関心のある特定の検体に対する特異結合能力を持つ構成要素である。結合部位と関心のある検体間の結合は、非共有結合であることが望ましい。適した結合部位は、分析用の試寥１中の他の構成要素よりも検体の方により高い親和性と特異性を持つことが望ましい。適する結合部位は、特に検体の一部分に特に効力のあるモノクローナル抗体であることが望ましい抗体や、例えば炭水化物の一部から成る検体のためのレシチンのように検体に自然に結合する結合たんばく質や、検体が相補的リガンドて構成されている場合のリガンド受容体などを始めとする様々な分子範鴫のものであり得る。結合部位の例の一部として、例えばマウス、ラットあるいはヒトのように動物からのポリクローナルかは乳類からのモノクローナルのいずれかである抗ＨＢｓＡｇ抗体、ウィルスから精製されたか、あるいはＤＮＡ組み換え技術により（Ｕられたか、いずれかであるＨＩＶｇＭｌ、コンカナヴアリレＡ、−′ヤクリン、およびヒトのＴリンパ球からのＣＤ４などが含まれる。結合部位で構成される固＋ｏｔｑ体を調整する技術は、この分野の研究者にはかなり知られている。

参考文献は、前記Ｆｕ！ｗｙｌｅｒ、前記５ｈａｐｉｒｏ、前記ＳｉｇｍａＣａｐｐｅｌ前記Ｒｙｌａｔｔおよびその他、前記Ｂｒｉｎｃｈｍａｎおよびその他、前記Ｇｏｓｌｉｎｇ、前記５ａｕｎｄｅｒｓおよびその他、前記Ｂａｎｇｓ。

前記Ｃｕａ　ｔ　ｒｅｃａｓａｓなどであるが、以下の文献も参考にすることができる。前記Ｃａｎ　ｔ　ａ　ｒｅ　ｒｏおよびその他の“Ｔｈｅ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｖｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｏｒ　ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　５１ｇｎ１ｆｉｃａｎｃｅ　ｉｎ　ｓ。

１ｉｄ−ｐｈａｓｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１０５：３７５〜３８２（１９８０年）、Ｈｏ１ｏｄｎｉｙの −Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ＲＮＡ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｓｅｒｕｍ　ｂｙ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ”、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓ、、１６３：８６２−８６６　（１９９１年）、Ｂａｎｇｓ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｏ、２１　”Ｐａｒｔｉｏｌｅｓｕｓｅｄ　ｉｎ　ＤＮＡ　ｐｒｏｂｅｓ”。これらの文献には、主題の発明において結合部位として使用される抗体もしくはモノクローナル抗体の産生方法が掲載されている。例えば、米国特許第４．５７４．１１６号およびその中に引用されている谷文献も参照できる。代案として、モノクローナル抗体および／または結合用部分を市販されているものの中から人手することもできる。

検体が核酸である場合、結合部位はｓ　５ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはその他の天然または合成の一本鎖の核酸を使用することができる。また代案として、結合部位は抗体もしくは抗体に対し特に結合するＤＮＡ結合たんばく質のように、特定ヌクレオチドのシーケンスを識別する非核酸分子であることもできる。

結合部位が核酸分子である場合、部位は通常少なくとも８個のヌクレオチドで構成される。より通常は１０個のヌクレオチドで構成され、望ましいのは少なくとも約１２間のヌクレオチドで構成されることである。結合部位のサイズは、検体の性質、試料中における検体の量、および検出工程で採用される各種条件により様々である。結合部位における使用のための核酸シースケンスは、天然、合成もしくは、この分野で知られており、前記Ｈｏ１ｏｄｎｉｙや前記ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｏ。

２１にも説明されているその他の手段から隔離することにより提供されることができる。

試料は、以前の調整を条件にすることもてきる他、以前の処理を採用せずに利用することもてきる。前記Ｈｏ１ｏｄｎｉｙを参照のこと。試料の調整は試料の特性であり、免疫学的検定法（イムノアッセイ）の特性ではない。検定のためのプロトコルは、抗体と抗原の両方の後続的検出に合わせることができる。例えば、あるミクロスフェアのサブ集団は抗原により覆われ、別の集団は、山羊、マウス。

ラット、ラビットその他の動物種から得られた抗体で覆われている。

第２の試薬は、少なくとも二種類の蛍光表示済抗体を含んでいる。試料がヒトから得られたものである場合は、第二の試薬は抗体で覆われたミクロスフェアに固定されている試料中の検体と選択的に結合する抗ヒト抗体を含む。第二試集中の二つの抗体は、両者間に特在の典型的差があるため、相互に反応しない。表示された抗体は、双方が余分に（Ｔ在している限り試薬中で特定比率を占める必要はない。

その中て試ｆ１中の検体が結合部位と結合できるような状況の下では、普通、以前の試料調整は一切必要とされない。試料中の検体が結合部位と直接結合する能力がない状況の下では、以前の調整が必要となる。例えば、検体が二本鎖の核酸であり、結合部位が相補鎖をｔνっでいる場合には、結合部位に混ぜる前に二本鎖の分子を変性させるために、試穿１の処理が必要になる。変性は、試料を通常約９０”Ｃから約１００℃までの高温に約３分から１５分間さらすことにより、もっとも容易に達成されることができる。試料のアルカリ溶液あるいはホルムアミド濃縮液による処理や、あるいはこの分野で知られるその他の手順を利用することによっても、その池の変性手段を採用することができる。

固相担体は、できれば平均０．２５ミクロンから約１００ミクロンの直径を持つミクロスフェアの粒子−て構成されることが望ましい。おそらくコストが要素であり、最も望ましいのは約２ミクロンから約１５ミクロンの間である（小型ミクロスフェアは大型ミクロスフェアより安い）。ミクロスフェアのサイズは、主題の発明の実施にとり決定的ではない。固相担体用に適した素材には、ポリサッカライド、スチレンポリマー、ポリアクリレートなどのような自然や合成による有機ポリマーや、ポリアクリルアミド、ヒドロキシエチル、ポリメタクリレート、ガラス、セラミック、カーボン、ポリ塩化ビニルクロライド、タンパク、およびそれら同類のものが含まれる。スチレンポリマーには、ポリスチレン、芳香族部分を含むポリマー、ナフタリンやアントラセンなどのようなより高い芳香性の化合物を含む。　固相担体は、できればラテックス化合物で構成されることが望ましい。この技術に通している人々に知られている固相担体の使用を示すものに、例えば以下のような参考文献が挙げられる。Ｍｏｎｔａｇｎｅおよびその他のＰｏ１ｙａｃｒｙｉｉｃ　ｍ１ｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ　ａｓ　ａ　５ｏｌｉｄ　ｐｈａｓｅ　ｆｏｒ　ｍ１ｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｎｅｐｈｅｌ。

ｍｅｔｒｉｃ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ″、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、、１２：１６５−１８３　（１９９１年）、Ｌｉ５ｔおよびその他の“Ａ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　ｆｏｒ　５ｏｌｕｂｌｅ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”、Ｃ１１ｎｉｃａ　Ａｏｔａ　１２０：１７１−１７９（１９８２年）、５ａｕｎｄｅｒｓおよびその他の“Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｌｏｗ　Ｃｙｔ。

ｍｅｔｒｉｃ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ−Ｆｒｅｅ　ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ″ＣＩ　ｉ　ｎ、Ｃｈｅｍ、３１　：　２０２０−２０２３（１９８６年）、Ｗｆｌｓｏｎおよびその他の”Ａ　ｎｅｗ　ｍ１ｃｒｏｓｐｈｅｒｅ−ｂａｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｓｓａｙ　ｕｓｉｎｇ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ”　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏ、Ｍｅｔｈ、１０７　：　２２５−２３０　（１９８８年）相補的結合部位の固）■担体への結合に続き、検定プロトコルの中で使用される組成が調製される。この組成は、固相担体の典型的にミクロスフェアの形をとる複数のサブ集団を含む。この組成を調製するために、いくつかある方法の中の一つの方法を用い、ミクロスフェアの数を数える必要がある。その幾つかの方法には次のようなものが含まれる。顕微鏡とへモサイトメーターを使用する手を使って数える、通常は電気インピーダンスの変化を利用して粒子数を測定するための市販の粒子カウンターを使用する、速度または量で較正されたフローサイトメーターを使用する、あるいはスペクトロフォトメーター内で粒子により発生した光散乱の量を計るなどである。

様々な固相担体が機能化もしくは非機能化されることができ、できれば結合部位に対する共有結合用に機能化されることが望ましい。結合させる要素がポリマー素材である場合は、ポリマー表面の活性化やイムノグロブリン、グリコプロティン、サツカライドを含むｒｆ機分子およびポリヌクレオチドなどの付加のための技術における様々な手順が既に解明されている。以下の文献が参考となるであろう。Ｕ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏｓ、４，４１９，４４４；４，７７５．６１９；３．９５６，２１９　；　３，８６０，４８６、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　ＰａｔｅｎｔＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ、８４３０８１４３、Ｉ　ａｎｄ　５ｃｏｕｔｅｎ　Ｗ、Ｈ，（ｅｄ）、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

Δｎａｌｙｔｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ａｓｐｅｃｔｓ（１９８３年）、Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１４補的結合部位へ付加するために、三機能性の有機結合グループを利用できる。タンパク化学の分野でよく知られているそうしたグループの例として、グルタルアルデヒドのようなジアルデヒド、および１．６−ジアミツヘキサンのようなジアミンが含まれる。

そうしたａ機結合グループは、できればｔ１補を防ぐことができるほど十分な大きさを結合部位が持つ場へに使われることが望ましい。

検定用のプロトコルは、採用されるシステム、検定の感度、検定が実施される速度、検体の性質、およびそれらの同類次第で、非常にまちまちであり得る。結合部位と′：ｉ、Ｉが結合を可能にするために適した条件の下で統合される。試薬は、付随的に統合されるか、または連続的に加えられることができる。順位が連続的である場合、試料を反応用に混合したもの、結合部位および緩衝剤は、混合したものの洗浄や表示試薬の付加を行う前に、できればうないし９０分の間、通常は３０分間、イシキュベートされる二きが望ましい。適した波長のエネルギーで蛍光色素を刺激する際、検出ｉｉＪ能な表示を提供する目的で蛍光色素表示が一般的に使用されており、またそれは望ましい使用である。

試料内の検体の量は、次に検出可能な表示の量と、検体の既知の量の存在の中てし成された量とを比較することにより判断される。

典型的で望ましい方法で利用された蛍光色素は、光の吸収量（光学濃度）の変化や、適切な波長のエネルギーで奢り激された時の検定媒体の放出を結果的にもたらず。望ましい蛍光色素には、フルオレセインイソシアネート、フィコエリスリン、デュオクローム、アロフィコシアニン、ＰＥタンデム、ウルトラライト７００およびテキサスレッドが含まれるが、但しそれらに限らない。また、これらは市販されている。蛍光色素は一般に、蛍光分子対プロティン（Ｐ：）モル比率が約１々Ｉ８で使用されている。より高いＳＮ比を持つ蛍光色素を使用することにより、その他の蛍光色素が検定感度を高めるために使用されることができる。参考文献は次の通り。前記５ｈａｐｉｒｏ、Ｋｒｏｎｉｃｋら、”Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｒｃ４ｕｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔ’ｅｉｎ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ″ＣＩ　ｉｎ、Ｃｈｅｍ、、２９／９　：１５８２−１５８６　（１９８３年）、前記Ｃａｎｔｅｒｅｒｏら、前記ＧｏＳＩｉｎｇら”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　ＦＩｕｏｒｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｏｆ　Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ　ａｎｄ　Ｖａｌｐｒｏｉｃ　Ａｃ１ｄ　ｂｙ　Ｆｌｏｗ−Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｒａｌｙｓｉｓ　ｗｉｔｈ　Ｕｓｅ　ｏｆＨＰＬＣＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ”　Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、、３５：４６９（１９８９年）、Ｇｏｄｉｎｇの”Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｆｌｕｏｒｏｃｊｒｏｍｅｓ；ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ。

本発明は、リン光、化学ルミネセンス、またはバイオルミネセンスなどの部位のような蛍光色素よりもむしろ、光を放出するその他の部位の利用を意図している。これらの光を放出する表示が染料として使用されており、派生装置に流体力学応用制御技術装置や適切な電子とともに光検知器を採用するよう、レーザーは必要とされていない。

試料は、固定されたｔ１補的結合部位の複数のサブ集団を既知の比率で含む混合体と組み合わせられ、特殊結合部位が形成されるまで十分な時間をかけてインキ二ヘートされる。本発明との関連で使用されることができる試料の量は、とりわけ検体の濃度、試料の性質、および検定の感度によって異なる。望ましい反応が終了するまでに要する時間は、検定の詳細によって異なる場合がある。ハイブリダイゼーションつまり結合に要する時間は、試薬および検体の濃度や、シーケンスのｌｉ！ｓ性によって、また、検定温度、溶媒、および塩分濃度によっても異なる。

インキュベートの時間は温度、ｐＨ１イオン強度を始めとする多数の要素により決定される。一般に、ポリペプチドの結合は、３７℃で５分間のように短時間から、最長てし４℃で２４時間を要するにとどまり得る。同様に核酸のハイブリダイゼーションの場合は、同し物理的条件に依存するほか、核酸のＧＣ含有率にも依存する。通常の混成では４２℃で２時間の短時間から最長でも４２℃で４８時間までを要する。一般に、ハイブリダイゼーションは約０．１５Ｍの塩化ナトリウム及び０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウムの中で約２０℃から５０℃の温度で・＼イブリッド１：成を可能にするよう約３０分から約１８時間をかけて遂行される。

ＤＮＡのハイブリダイゼーション技術は、以下を始めとする多くの文献で開示Ｍｉｌｌａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ｐ検定媒体は、できれば燐酸、トリスあるいはそれらと同様の使いやすい緩衝剤により約６ないし９の範囲のｐＨて緩衝されることが望ましい。適切な緩衝剤を選定する際の＠要な要素は、緩衝剤が特異結合対の結合を妨げないことである。

検定は、）定している反応を妨げない温度であれば、いかなる適切な温度ても、通帛２０℃て、てきれば約４０℃以下まで高めた温度で実行可能である。また、この検定は通常、そしてできる限り大気圧のもとて実行する。

インキユベーシヨンの後、挿識付き試薬を加えて、インキュベーションは５〜９０分間継続する。出来ることならば、既知濃度の検体による標皇液を準備して、試料と比較するための標準として利用する。このような方法によって定量的測定がなされる。フローサイトメトリーは、検体相補的結合部分複合体の生成を検知し、追加的にその計量も行い、そのデータを試料内に在る関心のある検体の量の検知と決定に関連づける。フローサイトメーター内の蛍光色素と結合した免疫反応性の微小球の検定は、図４　（ＵＫパテント　１５６１０４２参照）に描がれている在来型のフローサイトメーターを使用して決定することが可能である。その代替として、以下に述べるような変型フローサイトメーターを利用してもよい。

多重検体の後続的検定を行う既（ｊの方法は、反射光の側面散乱および／又は前方散乱、そして蛍光色素標識微小球から放射される光を同時に記録するフローサイトメーターの能力に依存している。反射したレーザー光の前方散乱と側面散乱の強度は、光路の中の粒子の大きさによって決定される。光路の右角度から放射される蛍光の強度は、微小球の蛍光色素の量についての関数となる。フローサイトメーターは、光路の中を一度に一回のみ微小球が通過するように仕向けるフルイディクスを取り込むようになっている。このようにして粒子の大きさと、それに一致する蛍光が同時に決定される。

フローサイトメーターの決まりによりフロー微小球（流量微小球）的免疫検定（ＦＭＩＡ）は適切に作られた反応槽の中で行われる。反応した微小球はフローセルの中を通過するが、このフローセルは微小球がレーザー光の中を一度に一つのみ通過するようにさせている。前方散乱光と側面散乱光の両者は二つの検知器に集められる。光の中の粒子の大きさによって決定する前方および側面散乱光の強度は、適当な電子機器を用いて記録され、後々の検定に利用するためにコンピュータに保存される。このレーザーはまた、とりわけ微小球と結合した蛍光色素を励起する。放射光は最大正合の蛍光検知器のうちの一つと照合される。蛍光強度は適切な電子機器に記録されて、将来の検定に活用される。

このようにして、微ＩＪＸ球の大きさと蛍光の両方が記録される。蛍光強度は微小球に関連した蛍光色素分子の数量によって決まるので、同相免疫検定は微小球上で行われ、フローサイトメーターの中で検定されることとなるのである（Ｆｕｌｗｙｌｅｊ　ａｎｄ　ＭｃＨｕｇｈ、細胞生物学における方法、アカデミツク・ブレス３３号、１９９０年）。

前方散乱光および側面散乱光、ないしは前方散乱光のみは微小球の大きさを識別するのに使用された。前方散乱光のみは、１ミクロン以下の違いを持つ粒子を識別することが説明されている（Ｍｃｌｌｕｇｌ＋、Ｉ＋ｗ＋ｇｕｎｏｃｈｅ＊ｌｃａ　Ｖｏｌ、５．１９９１）　ｏ従来すべてのＦＮｌｌＡは、前方散ｘＬ光と側面散乱光の両者、ないしは前方散乱光のみに関連した蛍光検出を利用して行われてきた。

本発明をｆｌｌ用する場合、従来のフローサイトメーターの代わりに図５に示されているような特別設Ｊ１のフローサイトメーターを使用する。というのも、微小球の大きさに基づいた識別を行う必要がないからである。大きさの識別の必要性がない限り蛍光のみを定量すればよくなるのである。本発明を利用する場合、微小球サイズ集団を区別する必要な分析を実行するには、図５に示した機器が図４に示した側面散乱検知器と適切な電子機器を含むように変更せねばならない。

図５に関しては、フローサイトメーターは以下のようなものとなる：ＦＭＩＡ（ないしはＤＮＡプローブ核酸検定のような特定の結合検定）は、適切な反応槽（４）の中で？Ｔわれ、反応微小球（８）はフローセル（３）を通過して廃棄漕（５）に廃棄され、レーザー（２）は検定の中で用いられる難染性物質を励起する（化学ルミネセンスや燐光を使ＩＩ＋するならば、レーザーは不必要である）。

反応槽は試験管、微量滴定プレート、ないしはその他の容器でも構わない。レーザーはアルゴン・レーザー、ＨｅＮｅレーザー、ダイオード善レーザー、ＵＶレーザー、アーク・レーザー、クリプトン・レーザー、または検定中に使用する特定の色素を励起するのに適した波長をもつ光を放射するその他の光源ならば、いずれても購わない。励起した形層によって放射される蛍光は一つ、ないしは多重蛍光険相器（１）において、Ｂ’Ｈ６がなされる。事前選択されである強度と同じ、ないし、はそれを超える蛍光事象の強度の発生は、適当な電子機器（６）に記録されて、その強度の定量化に於ける場合と同様の検定に利用される。コンピュータ（７）でのデータ検定は有効なロジックを持ったソフトウェアによって行われるか、またはマニュアル（手動）によって行われる。

内部制御として、第１番目の結合ベアに被覆されている微小球のサブ集団が試薬混合に含まれている可能性があり、そこでは、この方法で検定されるべき試料の中に、結合ペアの二番目のメンバーが遍在している。したがって陽性の反応生成物か無いということは、当該方法が誤った使われ方をしたことを示しており、それ故に例えば、大容量の試料が手動、ないしは自動的方法で検定される場合の方法再現性の制御としての役割を果たしているのである。このような遍在的検体の例としては、免疫グロブリン、極度に保存されたゲノム、糖たんばく賀状酵素、グリコーゲン、細胞膜の成分などがあるが、限定されているわけではない。

結合部分の多重サブ集団が対照試料（検体は存在しな（りと標識試薬を添加した適切な検定培養液の中で結合している場合、あるいは標１が蛍光である場合、以下のような試料の励起、蛍光活動のバックグラウンドでの計測が行われる場合もある。大抵の場合、低レベルの蛍光は固体支持体に対する標識試薬の不特定結合によって１５られることかある。このバックグラウンドの蛍光は、受は入れ可能というのではなく、試！−１には無いサブ集団検体を識別する方法を提供してくれる、という観点から望ましいものでもある。しかしながら、このバックグラウンド活動の基本的必要条件は、［１下注目している試料の中の検体の実在がもたらす活動と区別可能である、ということである。

本発明では、池の競合免疫検定やあらゆる種類の蛍光抑制検定における場合と同様に、試ｔ４中の検体の存在によって蛍光強度が減少する検定方法を考えている。

これらの場合、ヒストグラムのピーク領域と陰性の試料に関連するピークの平均チャンネル蛍光は試薬配合によって事前に定義されて、検体量の計算が可能となる。

いいかえれば、事前定義閉域のピークの平均チャンネル蛍光は、そのピーク領域に関係する試料内の検体量を直接定量するものとなる、ということである。

本発明は、データの検定にコンピュータを使用する。ここで使用されるソフトウェアは、蛍光強度に対する事象数をヒストグラムに対して問い合わせをし、事前に定義した考えうるすべての組合せと最も良く適合するデータを決定する。同時にこのソフトウェアは、ヒストグラム内に見られるピークのパターンをトレースし、ピークや低点やピークの前後あたりを識別して、蛍光強度×１から×２の領域（事象数）、各ピークないしは多重ピークの組合せの計算ができるようにする。

蛍光ヒストグラム内のデータの検定は、以下に述べるような体裁で段階的に行（１）フローサイトメーターから得られる事象の蛍光強度をプロッティングするとヒストグラムが作成される。段階１を参照のこと。

（２）５ポ・インドのガウス−スムージングを行えば、ヒストグラムが１０倍まてスムージングされる。段階２を参照のこと。

（３）トポグラフィ−についての大事な特性が識別される。低点（谷底）、ピーク、そしてＮｌｊｔｊｌ部（平地）の始点や終点がスムージングされたヒストグラムに配置される（段階３を参照のこと）。一番低い帯は低点（谷底）を表しており、その次に、￥にい帯はピークを表しており、その次に高い帯は平坦部の始点を表しており、最も高い帯は平坦部（平地）の終点を表している。一つの領域が、同時に低・′夫（谷底）であり、平坦部（ＮＴ２地）の始点や終点てもありうる。

（４）段階３において識別された領域は、ピークを分離するマーカーを定義するのに用いられる。ひとつの低、「＼には必ず一つのマーカーが割り当てられる。

平坦部の給入に平坦部の終点か続く場合には、二つの領域間の中はどに一つのマーカーが割り当てられる。一つの領域が同時に一つの低点であり、平坦部の始点や終点である場へには、他の規制を適用してマーカーの割り当てを行うことになっている。段階４を参照のこと。

（５）も【７ｇ・要な場合、マーカーの調整を行う。マーカーとマーカーの間の領域が保Ｈする４５■象数が一定数以Ｆてあった時には、それを隣りに併合する。もし、検定数を超えるピーク数があった場合は、既知のミクロフェア割合と実Ｕ＋のミクロフェア割合との間の最良一致点をえらるれような方法で、マーカーの削除作業を行・）二ととする。

もし、二つのピークが極端にオーバーラツプしている場合、ピーク・オーバーラツプ手続きによって二つのピークの割合を＝１算し、よりよい精度を得られるようにする。（段階５を参照のこと）（６）当該ピークは、ピーク領域と既知の試薬割合に基づいた適切な検定に割りごｊてられる。マーカー間（ピーク間）の領域は、ピーク領域の実測割合と予想されるミクロフェア割合との間の最良適合に基づいた検定に割り当てられる。ピークに対する考えつる全ての検定割り当ての評価が行われて、予想割合の合計が決定される。各検体についての弔均チャンネル蛍光値が、段階６て示されているような形でレポートされる。

ソフトウェアの主だったオペレーションについての概略的フローチャートを図６に示しておいた。加えて、当ソフトウェアのソース・コードを付録Ａとして添付しである。

代替的方法として、市販のフローサイトメーターや粒子計量ＪＩか生成するものと同様に、プリントアウトしたヒストグラムを使用して、手作業でデータの検定を行うことも可能である。

本発明では、当ａす案による方法を実行するための試薬を含んだキットについても考慮している。当キットは、−個の固体が支持する集団に通常結びつく、目下話題になっている多重検体への各々の相補的結合部分の多重サブ集団の容器によって構成されており、その中では、各々の検体と）■補的結合部分が第一番目と第二番目の特定の結合ペア（ｍｓｂｐ）から構成される。固体支持体に結びつく場合、結合部分は個別の事前選択された割合の中に供給されるか、ないしは、事前選択された割合の混合として供給されることとなる。加えて当キットは検出可能の標識、とりわけ励起エネルギーへの照射に際して検出ｄＪ能蛍光を放射する蛍光色素がついた標識つき試薬の個別容器を含んでおり、そこでは既述の試薬は既述の第一番［］、ないしは既述の第二番目のｍ５ｂｐと結合することが可能であると同時に、すべての特定結合ペアの生成を検知することも可能である。

結合部分が固定支持体に付着していない状態で供給される場合、そのキットには、多重固定支持体が追加されるし、特別にそれらの固定支持体に結合部分を付着させるための試薬（複数）が含まれる。特定の結合部分をキットの固定支持体に付着する場合、結合部分の混合は、事前選択した一意の割合の中で生成され、目下話題となっている望ましい試薬が検定されることとなる。

以下の語例は、あくまでも例として示すものであり、限定するためのものではない。

Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、あるいはＭａｌｌｌｎｃｋｒｏｄｔ、ｌｎｃ、　、またはＦｉｓｈｅｒ、Ｉｎｃ、　、などを含む色々なヘングー（を者）から購入する標準的な実験用薬液は、緩衝液を作るのに使用する。

２〜ｌＯミクロンの範囲の一定直径のポリスチレン・ミクロフェアを購入する場合は、　Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ、、　５ｅｒａｄｙｎ、　Ｉｎｃ、、　Ｂａｎｇｓ　１．ａｂｏｒａＬｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、@ＦｌｏｗＣｙｔｏ＊ｅｔｒｙ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　Ｃｏｒｐ、　、およびＤｕｋｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｉｎｃ、などの色々なペングーがある。

従来の抗体や抗原を含むポリスチレン・ミクロフェアを被覆するための精製タンパク質は、組み換えＤＮＡや組織ホモジネートやウィルス性、ノくクチリア性ないしは細胞のライゼート、および尿、血漿、腹水などから得られる。多くの場合これらはヘングーから直接購入することが可能である（　ｒＬｉｎｓｃｏｔｔの免疫学的・生物学的試薬名鑑」第６版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　Ｄ、　Ｌｉｎ５ｃｏｔｔ、　１９９０−１９９１）　ｏ　もしこれらの入子か困難である場合、研究所内において従来の技術を使って精製することもてきる。？照：　Ｃｕａｔｒｃｃａｕｓａｓ　Ｃｔ　ａｉ、「アフィニティークロマトグラフィー（こよる選択的エンザイム精製Ｊ　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．６１　：　６３８−［４（１９６ｇ）　：　Ｇ。

ｄｉｎｇ、ｒ蛍光色素への抗体結合、標準的方法の変法Ｊ　Ｊ、　ｌｌ１ｌａ＋ｕｎ、　Ｍｅｔｈ、　１３：　２１５−２２６　（１９７６）。

アフでニティー精製抗免疫グロブリンＧ抗体標識付きフルオレセイン−イソチオンアネート（ＦＩＴＣ）は、ＣａｌＬａｇ、Ｉｎｃ、　、Ｃａｐｐｅｌ、Ｉｎｃ、　、およびＴａｇｏ。

Ｉｎｃ　を含む何＞Ｌかのヘングーから購入することができる。精製免疫グロブリンに郊１するＦＩＴＣの抗体精製と共合結合は、現行の技術を使用して行うことが可能である（「免疫学と免疫化学における方法Ｊ　、　Ｃｕｒｔｉｓ＾、　ＶｌｌｌｌａｍｓとＭｅｒｒｌ　ｌ　ＩＷ　、　Ｃｈａｓｅ編、Ｖｏｌ、Ｉ　、　ｐｐ、１１２ｏ−１８７、１９６７、＾ｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）　。

ポリスチレンとポリエチレンの試験管は、Ｂａｘｔｅｒ、　Ｉｎｃ、、ＶνＲ，Ｉｎｃ、　、およびＦｉｓｈｅｒ、Ｉｎｃ、を含む何社かのヘングーからの購入力呵能である。フィルター付きの微量滴定プレート、および真空濾過マニホルドは、警１１１ｉｐｏｒｅ、　Ｉｎｃ、　、およびＰａ１ｌ　Ｒｉｏ　Ｃｏｒｐ　Ｓなとから購入することが可能である。

のポリスチレン・ミクロフェアをタンパク質抗原で被覆することによって、免疫反応ビーズ（ＩＲＢ）を精製するＣＦｕｌｖｙｌｅｒ　＆　Ｍｃｈｕｇｈ、ｒ細胞生物学」、１１＾、Ｃｒｉｓｓｍａｎ　ａｎｄ　Ｚ、Ｄａｒｚｙｒ＋ｅｃｋｉｅｗｉｃｚ、　Ｖｏｌ、３３．　ｐｐ、６１３−６１９．１９９０）　、そし■ A （２）いろいろ異なっているＩＲＢを、事前定義した割合で正確に混合する。使用するその他のタイプのミクロフェアには、ポリアクリル・ミクロフェアがある（Ｍｏｎｔａｇｎｅ、　５ｕｐｒａ　；　ｒポリアクリルアミドとデキストラン・ミクロフェア」。

Ｌｉ５ｉ　ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ　）　。

（１，）ＩＲＢ製造会社　ポリスチレン・ミクロフェアの懸濁液を貯蔵ビンから取り出して、５０倍を超える量の脱イオン水（ｄＨ，、Ｏ）の中で再懸濁する。

その後、濾過によって洗浄し、顕微鏡を通して直接に中で行うか、あるいは半自動の粒子カウンターを用いてｆｌＳＴ的に行うかのいずれかによって定量する。

ミクロフェアはその後、適切な緩衝液（例えば５０畦のナトリウム・ホウ酸塩、ｐＨ９，５）で再懸濁されて、ミクロフェアに対する適切な割合の濃度のタンパク質で培養する。培養時間、温度、およびミクロフェアのタンパク質に対する濃度については経験的に決定すればよい。そのミクロフェアはその後、濾過によって未反応のタンパク質と分離され、洗浄されて貯蔵緩衝液の中で再懸濁される。

例えば、ＩＲＢは人体面ｎ′Ｔの中の抗ＨＩＶ　ｇｐ４１　１ｇＧの検出に使用される。

これらは以下の方法で生産されうる：４ミクロンのミクロフェア（Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｉｎｃから）は上記のように洗浄し、５ｈＭのナトリウム・ホウ酸塩緩衝液（ｐｕ　９．５）で濃度４μｇ　ｇ＋）４１／１０７ミクロフエア／１で、４℃にて８時間、精製組み換えＤＮＡ誘導ｇｐ４１　（ＤｕＰｏｎｔ、　Ｉｎｃ、から）とともに培養する。

未反応のｆＪ１４ｉの洗浄と分離ののち、４ミクロンのｇｐ４１　ミクロフェアを４℃にて、２　ＸｌＯ７ミクロフェア／１の濃度て保存する。

（２）走化試薬の準備：特定結合ペアの１メンバーに付着したミクロフェアの貯蔵懸濁液のおのおのの中にある粒子の濃度は、たとえば、血球計（ヘモサイトメーター）とか、コールタ−カウンターなとの粒子カウンターて：１測することがてきる。濃度のＸ＋Ｉ４Ｐ＋は、既知の貯蔵懸濁液の希釈液の濃度を計測することによって、直接的ないしは間接的に；ＩＭｌすることができる。最終的な試薬の中の特定ＩＲＢの望ましい濃度（定１いにもとづく適量は、そのおりに、貯蔵懸濁液から得られ、等分割された他のＩＲＦＩと結合される。

１１１Ｂ検定：血Ｉｎないしはその他の培地の中の検体の検知のために検定は、以下に述べる２段階の手続きをふむのが一般的である。しかしながら、１段階の検定でも可能であり、未発明は２段階の手続きに固執しているわけではないことに留意されたい。

（１）スクリーニングされる培地とＩＲＢの培養二ロ下話題の検体を潜在的に含んでいる血清ないしはその他の培地で、とりわけ検体用の結合部分タイプの検定の試料・プレバレージョンを伴っているもの、あるいは伴っていないものは、室温状部で１５分から６０分間、適切な反応緩衝液（たとえばＰＢＳ）のなかで、ＩＲＢと混合される。これは、ポリプロピレンの試験管、ないしは、９６ウエルのマイクロリットル・プレートでフィルタの付いたもの、あるいは付いていないもの、によっておこなえばよい。培養時間が過ぎれば、ミクロフェアは、通常、未反応の検体を分離し培地の不特定構成要素の結合を最小化する目的のために洗浄される。ミクロフェアの洗浄は、遠心分離によるか、あるいはフィルター付きのマイクロリットル・プレートを使用するならば、真空ろ過による方法を採用する。

（２）　ＦＩＴＣｔＩ［：Ｒタンパク質への反応二目下の検体が人体血清中の免疫グロブリン抗体であるならば、上記のミクロフェアはＦＩＴＣｔｌ識抗ヒト免疫グロブリンを含む緩衝液の中で懸濁される。もしそれらの検体が人体面〆＾中の他のタンパク質であったり、その他の培地である場合、使用されているＦＩＴＣ標識は、とりわけタンパク質検体に反応するＩｇＧ抗体と結合したり、競合的に被覆されたミクロフェアに結合する池の特定結合部分、ないしは非競合的に被覆されたミクロフェアと非結合となる検体に結びつく池の特定結合部分とカノブソリングする蛍光色素に結合するＦＩＴＣＯｎＡ体である。こののちミクロフェアは、室温にて１５〜６０分追加的に培養し、洗浄し、図４で述べるタイプのフローサイトメーターでの分析に備えて、緩衝液で再度懸濁する。

データの分析データの分析は、ヘクトン・ディノキンソン・ＦＡＣ３ｃａｎなどのフローサイトメーターを（り用して以下の方法て行う：（１）フローサイトメーターの中に試料を差し込み、適当な事象数（いいかえれば、選択された閾値［シきいｍｌを越える粒子数）のカウントを行う。たとえば、４０００事象がカウントされる。カウントされる事象数は、おのおのの検定の範囲に含まれる特定結合ベアをともなう個別のサブ集団の数と割合によって決まる。事象は、前方散乱、側面散乱、又は、適切な閾値を越える蛍光によってトリガされる。

たとえば、前方散乱の閾値を、Ｏから１０２４までのチャンネルのスケール上で、３４８のチャンネルに設定すると、その必要がある場合は、２ミクロンのサイズ以下の粒子を除去することができる。

（２）コンピュータは、前方散乱（Ｐ！ｌｉｃまたはＦＡＣ３）　、側面散乱（ＳＳＣ）　、あるいは蛍光１（ＦＬＩ）などの事前選択されたパラメーターのおのおのに対応する個々の粒子についてのデータを集める。

（３）そのデータは、Ｘ軸上にあられれる個々の蛍光チャンネルに対応する事象数がＹ軸上でレポートされると体裁の蛍光ヒストグラムの形で出力するべく構成される。

（４）おのおののピーク領域を分離し計算するために、適切なマーカーを蛍光チャンネルに設定する。おのおののピークの当該領域、および、その平均チャンネル蛍光（ＭＣＦ）は検査される試料の診断となる。

４ミクロンの直径のミクロフェアを使って試薬が準備されたが、そのなかでは、組換１１ＴＶ抗原ｇｐ４１、ないしは、親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧのいずれかでミクロフェアが被覆されていｔ；。排他的に、これらの被覆ミクロフェアのいずれか、ないしは双方を含んだ試薬は、それぞれ、ＧＰ４＋に被覆されているミクロフェアが、試薬中の全ミクロフェア数の（ｆ順上の誤差を見込んだとして）１００％、８９％、７９％、６８％、５８％、４８％、３８％、２鯖、１９％、９％および０％の割合を構成しており、ＩｇＧ抗体によって１ｆｆｌｔｌされているミクロフェアは、（手順上の誤差を見込んだとして）０％　、１１％　、２１％　、３２％、４２％　、５２％　、６２％　、７２％、１１１％　、　９１％および１００％の割合をなしている、という形て走化的に混ぜあわされる。１１個の電比的試薬のそれぞれは、エリザ検査法によってＩｇＧおよびｇｐ４１抗体の両者に対して陽性となることが知られている人体面ｌ＾に接触させて、室温で４０分間培養する。洗浄ののち、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）　？ｊｉ合抗ヒトＩｇＧ抗体（０，００７［を關ｇ／ＩＩ、分子比Ｆ：Ｐ５）を含む二番［１の；Ｘ、薬が反応槽に添加され、室温で２０分間培養された。洗浄ののち、反応したミクロフェアに関係するＦＴＴＣＱが、図４で示すタイプのベクトン・ディケンノン・ＦＡＣ８ｃａｎフローサイトメーターに反応混液を入れることによって分析される。二のフローサイトメーター　では、前方散乱でトリガーすることによって４０００件の事象か＃積され、個々の事象の蛍光強度はコンピュータのメモリー内に保ｎシ己録された。

これらのデータは分析かおこなわれ、事象数（Ｙ軸）に対する蛍光強度のログ（ｘ輔）という形のヒストグラムとして出力された。総数４０００の事象は、前方散乱！・リガによって１１１られた。これらの条件下で、一つないしは二つのヒストグラムのピークは、試薬が、おのおの一つないしは二つの種類のミクロフェアを含んでいるかと−）かによって実測された。これらのピークは、予想されように、ＩｇＧ及びｇｐ４１抗体の両前、（換言すれば、２つのオーバーラツプしないピーク）に対して陽性の血清に向けて実測された。ピーク領域は、ピークとピーク間にマーカーを配置し、マーカーのいずれかの側の事象数を記録することによって、手動で計ｐされた。それらのピークには異なった領域があることが実測され、ピークの平均チャ、ネル蛍光は安定していた。このようにしてｆｌ？＋定されたピークの大きさは、試薬中のミクロフェアの電比にしたがって予測されたように、以下に挙げるような実験中の」差を見込んだとして、区々であった。

ここでのピーク領域は、得られた事象数の・ζ−セ、チー７゛の形でピーク内の１象数を表現している：すなわち、ピーク＾は、それぞれ、得られた事象総計の１００％、７８４％、７６．９％、６２．１％、４９３％　、３９．３〜．３１５〜．２５．７％、１９．７％、１１．０％および０．８％からなっており、これらのペーセシテ−７゛は、上述した最初の方のｇｐ４ｔに被覆されたミクロフェア向ＩＦの試薬ミクロフェアのベーセンテージと、９９２％の相関係数でｔ目間している。

い−）ぼう、ピークＢは、それぞれ０％、１７０％、２８０％、３３．７％、４５．７％、５０．８％、６０６％、６［ｉ、５％、７２．５％　、　８１．６％および９０．５％、となっていて、これらのバーセ；ネー２．は、上述した二番［１の方のＩｇＧに被覆されたミクロフェア向けの試薬ミクロフェアのバーセ；チー、と９９８Ｘの）目間係数でｔ目間している。両者の間の条目違は、ミクロフェア試薬の計算、計量および混合に際しての誤差に起因すると考えられる。

上述した方法を用いることによって、ヒストグラム内の陽性のピークの蛍光強度は、成る陽性の血ｌ＾と他の血清では異なっている可能性があることが実測された。蛍光強度は、抗体力価の係数であると言われている。旧ｖ　ｇｐ４１抗体に対して陽性であることが知られている血清は、既知の陰性の血清を使用して、連続的に、１倍、２倍、４倍、８倍、そして６４倍に希釈される。これらの希釈血清の区画は、おのおの、８０．７％、ｅｔ、ｔ％、４１．１％および２０．７％のじｐ４１被覆の４ミクロン・ミクロフェアを含む４つの試薬のうちの一つと個別に接触する。これらの実験では、上に挙げた希釈因子を用いることによって、蛍光強度がおのおの、８９０から７６３から［ｉ１３から４５８から１０２へと減少するにつれて希釈が増加すると、ヒスログラムのピークがＸ軸上を左方向に移動するのが実測された。これらのピークの集団における蛍光強度にはかかわりなく、獲得した事象総数の％として表現されるピーク領域は、上にリストしたｇｐ４１被覆ミクロフエアの電比に関しては、７５．１％　。

５７７％、４０５％および２２．１％であると実測された。

例３（１）オーバーラツプしているピークの領域総数は、その蛍光がヒストグラムの結合ピークの一因となる試薬ミクロフェアの電比によって決まる。

（２）非特定結合、言い換えれば陰性から生じるひとつのヒストグラム・ピークの領域は、試薬の中の各々のミクロフェアの電比によって決まる。

上述の方法を使用することによって、それぞれが一つの異なった抗体に対して陽性となる２つの血清のヒストグラム・ピークが、同一かまたはほとんど同じ蛍光強度値を示すということが実測された。したがって、２つの検体に対して陽性となる血清は一個のピーク（言い換えれば、一つのオーバーラツプするピーク、又は部分的にオーバーラツプするピーク）を示すという可能性がある。ＩｇＧ抗体、又は１ＩＴＶ抗原ｇｌ）２４によって波工される４ミクロンの直径のミクロフェアを含む走化的ミクロフェア試薬が準備された。試薬の第一番目のセットは、２０％のｐ２４１ｆｆｌＩＲＥクロー７エアを含むものがＩ？備され、その中てのｇｐ４１ないしはＩｇＧ抗体のいずれかによって被覆されたミクロフェアの電比は８０％（手順上での誤差を見込んで〉であった。これらの２つの試薬は、おのおのが、ｇｐ４１抗体やＩｇＧに対しては陽性となるが、ｐ２４抗体に対しては陰性となる血清と接触させた。この第一番目の例では、２一つのピークは、２つのヒストグラムのおのおので実ｎ１された。つまり、一方は領域２３％のヒストグラムの左側の領ＦＡ（■ｃｒ３７２）で、陰性のｐ２４抗体合成を示し−Ｃおり、もう一つはずっと右側である。これらの中で一番右側のピーク（群）は、そのおのおのが総討Ｕｌ　１１象数の７６％の領域を有しており、両方がおのおの、８２４と６２８の平均チャンネル蛍光値を提示し、オーバーラツプしているピーク群は、ｇｐ４１およびＩｇＧ抗体によって被覆されているミクロフェアの両方ともが試薬の中に含まれていたことを示している。

二番目の試薬セットは、＋１２４　ミクロフェアの電比が全体の１７．７％（手順上での誤差を見込んで）となるもので準備された。この試薬セットで、ｇｐ４１又はＩｇＧ抗体によって被覆されるミクロフェアは、両方とも、ミクロフェア総数８２．３％を形成するべく金工１されたか、そのおのおのは、０％から８２．３％までの異なった量で相互に合＝１された、おのおの違ったＩｇＧおよびｇｌ＋４１抗体の電比を持つ５つの試薬セットを作った。これらの試薬は、ｐ２４抗体に陰性となり、ＩｇＧおよびｇ１１４１抗体には陽性となる血清に接触させられ、そのうち、ＩｇＧやｇｐ４１から出たピークはオーバーラツプするものとＴ−１１された。これらの５つのケースのおのおのにおいて実測されたパターンは、平均ｌｌＣｒ値３６６の一番左側のピークと、血清に対して陰性となるｐ２４抗体のステータスを示す総事象の２３６％の平均領域を示した。二番目として、右側にある平均ｍｃｆ値６２［の単独ピークは、それら５つのケース全体が、個々のミクロフェア電比にはかかわり無＜　、ｇｐ４１抗体とＩｇＧの組み合わせについての一貫した合計を示す７６４％の平均領域を持つことが実測された。

５組の３ミクロフエア試薬の別のセットの準備が行われ、その中で、１１２４被ｉミクロフエアの電比は７７．６％となっており、ｇｐ４１とＩｇＧ抗体被覆ミクロフェアには全体で２２．４％（平均で、手順上の誤差を見込んで）となるまで色々と１目互的に合計された。これらの５組の試薬が上に述べた同一の血清と接触したところでは、左側のピークが総事象の７９５％の領域を保ａしたことや、右側やｇｐ４１抗体とＩｇＧの陽性のピークか総事象の２０．５％の平均領域を保有したことを除外すれば、上でレボートシたようなパターンが実測された。

血液銀行の伝染性疾患スクリーニングなどの例のように多種多様な抗体に対（７、血清が陽性反応を示す可能性があるということは、すてに知られている。陽性ヒストグラムのピークに関するＭＣＦ（単球走化因子）はここの抗体力価により異なるので、ここに記載した免疫反応ミクロスフェア検定法を使用する際には、多数の陽性反応ピークが重なり合う可能性がある。個別の検体を行うためには、可能性のある重なり合うピークのすべての組合せがヒストグラム上でそれぞれ固有の領域を占めるような方法で、比例反応を調整する必要がある。

ｍｉ＝ミニクロスフェアブ集団をそれぞれ別々に調整、カウントした後に、これらを多重サブ集団試薬中に組合せ、ここでミクロスフェア数による各サブ集団の相対的比率は、独特デザインによる。サブ集団の比率が１　：２：３：　（１Ｂ、［１７９６：　３３．３３％：　５０９６）であるような３要素試薬を調整して、記載されている３種類の標的検体の最初の二つに対して陽性反応を示すような未知の試料と反応するなら、明確な結果が得られないであろう。

陽性反応のピークに関するＭＣＦ値が侶然同しか、またはほぼ同じ、即ち重なり合っているピークであるならば、それぞれが検体の対象となった事象の総数の５００６から成る同しサイズの二つのピークがヒストグラムに表示されるであろう。

これら二つのピークのうちの一つはヒストグラムの左手側の領域、すなわち陰性反応領域に表示され、もう一つは右手側の領域、すなわち陽性反応領域に表示される。このような結果のパターンからでは、記載されている第一と第二の検体の両方に試料が陽性反応を示しているのか、あるいは三番目の検体だけに陽性反応を示しているのかを識別することはできない。ただし、比率が１：２：４（１２，２８？６．２８．５７％、５７．１４％）となるよう試薬をデザインすれば、調整されたヒストグラムに対し個別の解釈を行うことができる。ここに記載されている最初の二つの検体に対して陽性反応を示し、ピークが重なり合っている試料では、４２．８５０６の右手側、陽性反応ピーク領域と５７１４％の左手側、陰性反応ピーク領域を示し、４２．８５９６は単に１４．２８９０と２８．５７％の合ま１値であるので、それぞれの検体を正確かつ明確に識別する。本例では、固有の比率を存する結合試薬のデザインの必要性とその利用法について実証する。

二のような比率の基本的特性は、各比率または比率の組合せが他の想定し得るすべての比率または比率の組合せとは異なっているという点にある。１：２の比率で組み合わされた二つのディテクターのサブ集団を含む試薬が、１：２：４の比率の３要素試薬や１：２・４：８の比率の４要素試薬の場合と同様に、そのような特性をかすてあろう。一般的事例では、サブ集団におけるミクロスフェアの数が以後のサブ集団のミクロスフェアの数の二倍となるような多重サブ集団試薬は、所望の固ｆｆ！、：ｌ特性を示すてあろう。ｎ：２ｎ：４ｎ：８ｎ＝：２”’ −１）　口のアルゴリズムは、同じ直径をもつ被覆ミクロスフェアから成るｍ個のサブ集団を含む試薬の調整に利用でき、ｎは任意の数を表す。

試薬の数が少ない場合には、上記の倍加アルゴリズムにおける比率以外の比率でも十分である。たとえば、２要素試薬では１：１以外の１＝３や１：５のような任會のミクロスフェアサブ集団でも有効である。これは、可能な算術和が一つしかないためである。

同様に、３要素試藁の場合には、１３：５や１：９：１５のような別の比率も有効である。

しかし、サブ集団の数が増加するにつれ、固ａ非集計比率の特性を表す固有アルゴリズムの数かＩ％ｉｉ’Ｊ）する。複数のサブ集団から成る試薬のデザインと調整に用いる潜在的アルゴリズムのどれを利用するかについての選択が事実上問題となるが、これは懸案の検定に関する個々の必要条件に左右される。

上記のミクロスフェアサブ集団面付比率に関する論理は、平均直径が同しミクロスフェアから成るｍ個のサブ集団にも適用される。したがって、多数の個別の後続的検定がｉｉＪ能である。ｔ：たしこの場合、使用するミクロスフェアのサイズは１種類とする。さらに、平均直径が異なるミクロスフェアから成る二つあるいはそれ以上のサブ集団を用いた、このような一般的タイプの試薬の調整が可能である。二の場合、固ａ集計アルゴリズムはミクロスフェア・サイズの異なる集団のそれぞれに灯し、他の集団とは関係なく適用される。たとえば、直径４ミクロンのミクロスフェアから成る比率１：３：５の３要素試薬を、直径１０ミクロンのミクロスフェアから成る比率１：２：４：８の４要素試薬と組合せ、７種類の個別の検体の後続検体に、７要素試薬を構成することができる。直径４ミクロンのミクロスフェアと直径１０ミクロンのミクロスフェアを異なるゲートで検体できるようフローサイトメーターを適切に調整すれば、重なり合ったピークの固ａ比率特性と算術和特性を各ゲートで保持することができる。

試薬が工夫される。ここで、非個別的解析が行われるようにミクロスフェアの比率は個別には判定されない。ここで、一つ又はそれ以上の検体クラスの存在は判定されるが、個々の検体は識別できない。試薬は、一部の検体に関する個別的検体およびその他の検体に関する。非個別的検体を行えるよう構成することもできる。特に、被覆の異なるミクロスフェアのサブ集団を含む単一サイズのミクロスフェアを使用して試薬を調整する。ｌ：１：１：ｌの比率の試薬を調整するときには、ミクロスフェアからなるサブ集団のそれぞれを等量結合する。このような非固有比率の試薬が、標的検体の一つまたはそれ以上で陽性反応を示す試料と接触すると、一つまたはそれ以上のピークがヒストグラムの右手側すなわち陽性反応側に出現する。標的検体が試料中にどれたけ存在するか、および表示されるピークの各ＭＣＦ値により、幾つかの可能なヒストグラム・パターンがこのような状況のもとで出現する。いずれの場合も、単一の非結合ピークの存在は、どの検体が存在するかを提示できない。これは、各個別検体のピーク領域が同じだからである。

例えば、４要素非固有試薬（１：ｌ：１：１　）では各ピークの領域は総事象数の２５％の領域に相当する。ピークが重なりあい、それら重なりあった領域が５０％、７５％等になるような場合には、標的検体のなかの１つ、２つまたは３つのどれが存在しているかが提示されるが、それが実際にどれであるかについては提示されない。

したがってヒストグラムの右手側に表示れるピークの数と領域を使用して、一般的には標的検体の有無と存在する検体の数とを判定することができる。標的検体タイプが１００％荏在するときたけ、標的陽性反応検体を無条件で識別することができる。これは、すべてが存在している、すなわち個別ピークまたは重なりあったピークとしてヒストグラム領域の１００％がヒストグラムの右手側に表示されるためである。

したがって、記載したような非固白比率の試薬を、個々の検体の識別が陽性反応を示す試料すなわちクラス別陽性反応スクリーンの単純な識別はど重要でないようなスクリーニング検定として、採用することが有効である。この場合、１：ｌ：ｌ・１の試薬を特に１Ｆ確に調整する必要はない。例えば、１：１．２：１．１：１．２５のような比率でも十分である。回帰に、各サブ集団内のミクロスフェア数が、例え正確に分からなくてもほぼ似通っていれば十分である。この種の試薬を使用した場合、重線なグループ陽性反応結果だけが得られる。ピーク領域の観察によりいくつの検体が陽性反応を示したかを判断するのは、ヒストグラム領域の１００％が右手側にある場合を除き不可能である。

検体が特定のミクロスフェアによって検出されるよう同じ陽性反応を示す試料と接触させたミクロスフェアのＭＣＰ値は、検体に陰性反応を示す試料のＭＣＰ値より高くなる。ヒストグラムの陽性反応領域におけるピークの検出は、特定の陽性反応検体の存在を表わすものである。陽性反応領域におけるより大きなピークは、検体数のより大きな数を表わす。

ＩｇＧ抗体、組み換えＩＩＩＶ　ｐ２４抗原（ｐ２４）、組み換えＩＩＩＶ抗原ｇｐ４１（ｇｐ４１）またはウシ血清アルブミンに添加したＩＩｃＶ−３３３（ＮＣＶ）を被覆した、実質的に比率の等しい直径４ミクロンのミクロスフェアを含む試薬を調整した。

以Ｆの表に示されているように、各Ｆｌｉ検体に対し陽性反応を示す血清にこの試薬を接触させ、ＦＴＴＣ−ａｌｇＧで染色した。５５０チヤンネルの蛍光に切断マーカーを入れることによって結果を検定した。５５０以下の平均チャンネル蛍光（ＭＣＰ）値のピークは、陰性反応を示すと考えられ、また５５０以上のＭＣＰ値のピークは、陽性反応を示すと考えられた。

烈立必ずしもすべてのミクロスフェアのサイズが同じでないような比例試薬を調整する。使用した異なるサイズのミクロスフェアすべてが事象としてカウントされるよう、前進スキャソタ・トリガを設定する。このような不均一比例試薬は、上記例１〜例５て説明ｌ、た特徴と同じ特徴を示す。

例えば、直径がそれぞれ２ミクロン、４ミクロン、１０ミクロンのミクロスフェアを含む試薬を調整すると二ができる。この場合、３検体多重免疫検体を行えるよう凸集団に冗なる被覆をし１．１・２・４の比率で組合わせる。直径が等しいがまたは２ミクロンより大きいすへてのミクロスフェアの事象が同じヒストグラムに記録されるよう、反応１、た試薬をゲート制御しないフローザイトメータまたはゲート制御付き一アローサイトメ＝りで検体した場合、ピーク領域は予測されている相対的値すなわち１４３％、２８６％、および５７．１％を示すてあろう。

２つまたはそれ以↓、のサイズ・クラスのミクロスフェアが混在する比例試薬を調製する。δミクロスフェア・サイズ・クラスを、上記のように被覆し、事前に決定されている比率に基づいて混合した。次に、各比率にしたがって混合した被覆ミクロスフェア・サイズ−クラスを追加して、δ種ミクロスフェアφサイズのサブ集団を含む試薬を調製する。前に説明したように、図４に例示したタイプの装置内で検定と検体を行う。たたし、δミクロスフェア・サイズ・サブクラスのヒストグラムは、Ｆｕｌνｙｌｃｒ、Ｍｃｌｌｕｇｅ、他が諭している「ゲーティング法」を使用して検体する。ヒストゲラムを個別に検体すると、上記の例！ −５に示されているような固ａのピーク領域分１１１が明らかとなる。したがって、多数の個別的検定をある一つのミクロスフェア・サイズて実行し、後続的に第二の一連の検定を第二のミクロスフェア・サイズて１テう。以後このように検定を継続する。

たとえば、比旧７１４の直径４ミクロンの３要素ミクロスフエアの試薬を比率３４の直径１０Ｅクロシの２要素ミクロスフエア試藁と組み合わせて、５要素免疫検定を構成した。特に、直径４ミクロンのミクロスフェアをＩＩＣＶ抗原、ＩＩＴＬＶ　抗原またはＩＩＩＶｇｐ４１抗原のどれかで被覆し、これらのミクロスフェア試料を組み合わせて、これらのサブ集団がそれぞれ１９．２％、２７．８％および５３％となるような試薬を調製した。直径１０ミクロンのミクロスフェアをＩｇＧ抗体または旧Ｖｐ２４抗体で被覆し組み合わせて、それぞれ４２．７％と５７．３％の試薬を実現した。

次に、この混合試薬を標的検体の１つまたはそれ以上で陽性反応を示す各種血清に作用させた。５マイクロリツトルの血清を総数的２００，０００個のミクロスフェアを含む２００マイクロリツトルの試薬に接触させたが、その内訳は、直径４ミクロンのミクロスフェアが１４０．０００個、直径１０ミクロンのミクロスフェアが８０，０００個であった。第一の反応は、マイクロタイターインキュベート槽内の周囲温度下で約４０分間道行した。第一のインキュベート後数回、緩衝液で槽を洗浄し真空状部ですすいだ。ＦＩＴＣのラベルの付いたヤギの抗ヒトＩｇＧ抗体を含む第二の試薬を添加し、前記のように周囲温度下で約２０分間道行させ、すすいだ。ミクロスフェアを２００マイクロリツター中に再度懸濁し、ＰＡＣ９ｃａｎフローサイトメーターに注入した。フロー細胞中を流れる直径４ミクロンのミクロスフェアと直径１０ミクロンのミクロスフェアのヒストグラムを個別に検体するため、前進スキャッタでトリガするようサイトメーターを設定した。合計１０，０００の事象が記録された。

たとえば、Ｉｇ６．ＨＩＶ　ｇｐ４１抗体とＩＩＩＶ　ｐ２４抗体に対し陽性反応を示すが、ＩＩＴＬＶ抗体とＩＩｃＶ抗体に対しては陰性反応を示す血清に関する検体結果は、以下のとおりである。４ミクロンのゲートを表現するヒストラグラムには、合計６５９７件の事象が含まれ、３つのピークが解明された。これらのピークのＭＣＰ値は、２９０　、４１９および７０９で、各領域にはそれぞれ１３５５．１６２６、および３６１Ｂの事象が含まれている。１０ミクロンのゲートを表現するヒストグラムには、合計２５０４の事象が含まれ、１つのピークが解明された。このピークのＭＣＰ値は７８３で、領域内の事象は２５０４件である。４ミクロンノゲートでは、ＭＣＰ値の小さい順（２９０，４１９，７０９）ｌ：３つのピークが、それぞれ２０．５％（１３５５／６５９７）、２４．６％（１６２Ｂ／６５９７）および５４．８％（３６１６／６５９７）の相対的領域（事象内のピーク領域／全ヒストグラム領域）を占めている。これらの相対的領域は、ＩＩＶＣ、ＨＴＬＶおよび旧Ｖ　ｇｐ４１の各直径４ミクロンのサブ集団比率（１９％、２７％および５３％）と相間関係があるので、このように識別した。

ＩＩｃＶ抗体のＭＣＦ値２９０とＩＩＴＬＶ抗体のＭＣＰ値４１９はともに、事前に決められたカットオフ値以下であったので、これら２つの検体に対して試料は妥当な陰性反応を示した。ＭＣＦ値が７０９のＩＩＩＶ　ｇｐ４１として識別されている第三のそして最大のピークは、この抗体のカットオフＭＣＩ’値を完全に上回っていたので、試料はｌ！ＴＶ　ｇｐ４を抗体に対し陽性反応を示していると判定した。

１０ミクロンのゲートでは、７８３の高いＭＣＦ値を有する、１つのピークの１００％の相対的領域で、ＩｇＧとＩＩＩＶ　ｐ２４抗体の両方の陽性反応が現われた。このピークは、直径１０ミクロンの試薬内の両方のミクロスフェアサブ集団で構成された多重ピークである。

ここに記述したミクロスフェア・サイズが２タイプの５要素試薬を使用してゲート付き検定を行うことにより、ＩｇＧ陽性、ＩＩＴＶ　ｇｐ４１抗体陽性、ＩＩＩＶ　ｇｐ２４抗体陽性、ＩＩＣＶ抗体陰性およびＨＴＬＶ抗体陰性として適正に識別することができた。

第二の例ては、ＩＩＩｖｇｐ４１、ＩＩＴＶ　ｐ２４およびＩＩＴＬＶに対し陰性反応を示す血清を除く、ＩＧＧと）ＩＣＶとに対し陽性反応を示す血清の検定結果は、以下のとおりであった。４ミクロンのゲートを表現しているヒストグラムには、合Ｈ７４５１件の事象が含まれ、３つのピークが解明された。これらのピークのＭＣＦ値は、２７ｇ　、５７Ｂ、および７９７て、領域内事象件数はそれぞれ３７２３．２１９１、および１５３７であった。直径１０ミクロンのミクロスフェアを表現するヒストグラムには、合計１８９４件の事象が含まれ、２つのピークが解明された。これらのピークのＭＣＦ値は５９２および７６２て、領域内事象件数はそれぞれ１０４０および８５４てあった。

４ミクロンのゲートでは、ＭＣＦ値の小さい順（２８７，５８７および７９７）に３つのピークがそれぞれ５０％、２９４％および２０．６％の相対的領域を占めている。これらの相対的領域は、ｔｌｌＶ　ｇｐ４１．１汀ＬＶおよびＩＩＣＶの４ミクロンのサブ集団比率（デザインされた試薬で５３％、２７．８％および１９．２％）と相関関係がある。４ミクロンのゲートにおけるＩＩＣＶピーク（最小のピーク）のＭＣＦ値たけが、試料を陽性として判定できる高い値を示した。１０ミクロンのゲートでは、ＭＣＦ値が５９２と７６２の２つのピークの相対的領域がそれぞれ５５％と４５％であり、そしてそれはこの順にＩＩＩＶｇｐ２４とＩｇＧにｔ口開関係があった。必須カットオフ値による前の判定から、５９２のＭＣＦ　Ｉｎは十分てなく、この試料に陽性のＩＩＩＶ　ｇｐ２４抗体を割り当てることはできなかった。したがって、この試料をＩｇＧ陽性として識別した。この方法により、血清試料をＩＩｃＶ抗体陽性、ＩｇＧ陽性および旧Ｖ　ｇｐ２４とＩＩＩＶ　ｇｐ４１の全抗体陰性と判定した。

前の例では、図４に示したような装置内における前進スキャンタの機能を利用して、事前に選択した数の事象を蛍光強度データセットに捕捉した。このような事例で、直径２ミクロンのような特定の最小サイズのフロー細胞中を流れるミクロスフェアたけをカウント可能な事象として選択するよう、トリが又はしきい値を設定した。その結果、順調に検定を行うことができた。そしてそれによって前進スキャソタを事象トリがとして使用せず、特定の事前に選択した値を越える蛍光強度を使用してデータセット内に事象を捕捉できた。このような検定法の利点の一つとして、前進スキャソタまたはサイド・スキャッタの機能、光学系、エレクトロニクス系を必要としないという点があげられる。

上記例１の場合のようなデザインに関する実験を行った。この場合、直径４ミクロンのミクロスフェアを１１１ｖ抗原ｇｐ４＋またはＩｇＧ抗体でカウントした。ｇｐ４１被覆したミクロスフェアが総ミクロスフェアの１００％、８９％、７９％、６９％、５８％、４８％、３８％、２９％、１９％、９％および０％を占め、ＩｇＧ抗体を被覆したミクロスフェアが試薬内で平衡を保つように比例試薬を調製した。これらの試薬を、ＩｇＧおよびｇｐ４１抗体の両方に対し陽性反応を示すことが判明している血清に接触させた。反応完了時の混合物を、図４に図示したデザインのＦＡＣ３ｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｌｃｋｅｎｓｏｎ）に注入した。検定は、以下の３種類の方法で行った。

１）データセットへの捕捉時に、２ミクロン未満の粒子が除外されるよう、３４８のしきい値の前進スキャソタにトリガを設定した。

２）　すべての細胞に存在する蛍光デブリス源から生しる低強度蛍光ノイズの変化度が、データセットへの捕捉から除外されるよう、４００または４５０のＦｌ、１セツテイングの蛍光強度にトリガを設定した。

各実験で得られたヒストグラムの観察から、上記２つのピークが解明された（ただし、０％のミクロスフェアの比率の場合を除く）。平均ＭＣＦ値が５１７のピークと平均ＭＣＦが７２５の第二のピークが、ＩｇＧおよびｇｌ）４１抗体の両方の血清で陽性反応を・Ｊミした。これらのピークは、いずれの場合も重なり合うことはなかった。最初にプリントされたヒストグラフの観察にもとづいて、２つのピーク間にマーカを設定し、そのほかのヒストグラムでもこの設定を使用した。マーカの各サイドすなわち３ピークの領域における総事象数を記録し、捕捉縁事象数のパーセントとして算出した。

前進スキャンタによるトリガを使用した評砺ては、ヒストグラムの一番右のピークのピーク領域（試薬の比率とピーク領域の一致から次のように推論されるｇｐ４１）　ハ、８９％　、８０％　、７０％　、６０％　、５０％　、４３％　、　３３％　、１７％　、８％及び０％テあった。

上記のｇｐ４１被覆ミクロスフェアの各比率とこれらデータの相関関係係数（１乗）は、０．９９２８てあっｊ：。蛍光トリガを使用した４００の実験例におけるヒストグラムの一番右のピークのピーク領域は、８７％、７７％、６８％、６２％、５４％、４５％、３４％、２６％、１７％、９５％および３％で、上記のようなミクロスフェア試薬比率との相関関係係数の０．９９８２が達成された。

しきい値４５０における蛍光トリガては、相関関係係数０．９９５２でほぼ同数の結果が？１手られた。ヒストグラムの一番左のピーク（推論によればＩｇＧ）に関する同様の数値的検体では、予想された逆数と高い相関関係係数か（すられた。コ・・リアビリティの検体では、絶対的相関関係の欠落の大部分を、ピークを分離するマーカの配置における実質的誤差に基づいて評価することができることか示された。

これらの結果から、得られたヒストグラフのピークの領域をベアをなす特定の要素て被覆された試薬ミクロスフェアの事前に選択した比率のトークロジ　により、前進スキャッタ（すなオ）ちミクロスフェアのサイズの判別）トリガ又は蛍光強度トリガのとちらを、データセントに捕捉した事象の総数およびタイプの定義に使用したかが判定されることが判明した。したがって、これらの検体のために、他の７０−サイトメーターの応用例で必要な装置（検出器、レンズおよびエレクトロニクス）をフローサイトメータに採用したり、あるいは内蔵させる必要かない。このように、図５に図示したような装置を持たない器械を採用し、良好な結果かえられた。

上述の方法を利用し、また前方散乱をトリガとして用いることにより、既知の陽性血清の分析を行った。当該分析にはＩｇＧ抗体、抗原ＨＩＶ　ｇｐ４１、ＨＩＶ　ｐ２４ならびにＢ型肝炎コアタンパク（ＨＢｃ）を各１３％、５３％、２７％、７％ずつ塗布した径４ミクロンのポリスチレン製ミクロスフェアを使用した。その結果４つの検体のすべてに対し陽性を示した既知の血清について得たヒストグラムには４個所のピークが現れ、その各々のサイズは特有の値を示した。すなわち、プロットの対象とした事象総数５０００のうち６６３事象（１３％　ｓｅｔ　６４０　）　、２５２２事象（５０９６ｌ１ｃｒ　７３１　）　、１４０Ｂ事象（２６９６ｍａｒ　８２２　）　、３２４事象（６，５％　１ｃｒ４２１）という内訳であった。単一または複数の検体に対し、あるいは陽性あるいは陰性の他の血清はそれぞれ独特のピーク・パターンを示したので、血清反応性について正確な定性的解釈が出来た。

平均径４ミクロンのサブ集団５種を１＋２：４：８：１６の比率て混和することによって多重試薬を調整した。ＩｇＧ抗体を塗布したミクロスフェアには３．２％の終末試薬が含まれていた。組み換えＨＣＶ抗原を塗布したミクロスフェアは６゜５５’ｏ、　ＲＥ　５　ＨＴＩＶ抗原を塗布したミクロスフェアは１２．９％、ｔＶｐ２４抗原を塗布したミクロスフェアは２５．８％、ＨＩＶ　ｇｐ４１抗原を塗布したミクロスフェアは５１．６％の混和試薬を各含有していた。ピーク域の可能的組合せをすべて網羅した参照用テーブル（検査表）を作成した。例えばＨＣＶ、ＨＴＬＶおよびＨＩＶ　ｇｐ４１の各抗体について反応したミクロスフェアから成る多重ピークについてはｔ目対領域を４５．２９６と予測し、この値ならびに他の可能的組合せのすべてを上記のテーブルに記載した。

当該試薬は標準プロトコールの下で複数の血清と反応し、前方散乱トリガを用いて全部で２万の事象を記録、結果を手作業で表にまとめた。試験対象とした血清の中には複数の多重陽性血清をつくるために幾つかの既知の陽性血清を混和したものがある。以下に示す２つの代表的な分析を実施例とする。

第１の実権例ではヒストグラムに４つのピークが見られる。最大ピークの相対領域は７７．３［１０６、ｍｅ［は３０２、最小ピークの相対領域は３．９５％、ＩＩｃ「は６０５である。第３のピークの相郊１領域は１１．２９％、ｇｌｃ［ ’は６９Ｇ、第４のピークのｔ目対領域は７．３３’６、ＩＩｃ「は７７６である。

テーブルを参照して最大ピークはＨＩＶ　ｇｐ４１とＨＩＶ　ｐ２４から成る二重ピークと確定した。当該ピークの■ｃｆは先に定めたカットオフ値よりも低いので、本試料は両ＨＩＶ抗体に対して陰性と確定した。最小ピークはＩｇＧと確定し、ｓｅｔは本試料をＩｇＧ陽性として確定するに十分な大きさのものであった。第３および第４のピークの相対領域は各１１．２９％および７．３３％であり、それぞれＨＴＬＶおよびＨＣＶと関係していた。これらのピークの一〇ｆ値はＨＴＬＶおよびＨＣＶいずれの抗体のあらかじめ定められたカットオフ値よりも大きく、シたがって本試料は両者に対し陽性と確定した。血清試料の一覧表を参照することにより本試料は二つの血清を混和したものと決定、うち一つはＩｇＧ以下のすべての抗体に対し陰性、他はＩｇＧ、ＨＣＶおよびＨＴＬＶ抗体に対して陽性とした。

第２の実施例においては、結果として得たヒストグラムに２つのピークが見られた。小ピークの相対領域は５．１％、■ｃ４は３１４、第２のピークは相対領域９３．３％、■ｃｒ　７４４の多重三重ピークであった。テーブルを参照することにより、小ピークはＩ（ＣＶ陰性のものと確定した。大ピークの総領域はＩｇＧｌＨＴＬＶ、ＨＩＶ　ｐ２４及びＨＩＶ　ｇｐ４１の組合せに特異的に関連していた。各ピークトップの平均＊ｃｆ　ｊ：らびに個別１０ｔともにＩｇＧ、ＨＴＬＶ抗体および二つのＨＩＶ抗体のあらかしめ定められたカットオフ値より十分に大きいものであった。したがって、水拭ｌ−１は、はっきり区別出来るピークが二つしかないにも拘らず、ＨＣＶ陰性かつＩｇＧ、ＨＴＬＶ、ＨＩＶ　ｇｐ４１お、、ｌ：びＨＩＶ　ｐ２４陽性であると確定された。

診断−１−重要な意味を持つ抗原および抗体が同一の試料内に見つかることは同層のことである。したがって、抗原と抗体の両者を後続的に確定出来るような試薬を得ることがａ用である。また本実施例では、陽性および陰性ピークのあるものの相々ｊ位置を逆にする時に、検体の確定が可能になることを立証する。

＋１４ミクロシのミクロスフェアを用いてひとつの試薬を調整し、当該ミクロスフェアに組み換えＨＩＶ　ｇｐ４１（ｇｐ４１）、組み換えＨＩＶ　ｐ２４を塗布したもの、ししぐはヒトの繊し性性線刺激ホルモン（ｈ　ＣＧ）のベータ・サブコニノドに対するマウスの単クローン性抗体を含むマウス復水液を塗布したものを組合せ、ｇｐ４１塗布ミクロスフェアがミクロスフェア全量の４７．４％、ｐ２４塗布ミクロスフェアがミクロスフェア全量の１６．７％、ｈｃＧ塗布ミクロスフェアがミクロスフェア全量の３５．５％となるようにした。この試薬を下記の表に示す種々の血清と接触させてから、ヒト繊毛性性腺刺激ホルモンをＰＴＴＣ−抗１ｇＧとフルオレセインで標識した標識試薬に接触させた。したがって、本実施例において得た結果は、二種類のものであった。すなわち、一つはＩｃｆ値の低い陰性試料と■ｃｆ値の高い陽性試料となったものである。いま一つは、これとは逆の種類である。第１の種類はｐ２４塗布ミクロスフェアとｇｐ４１塗布ミクロスフェアによって示され、第２の種類はｈＣＧ塗布ミクロスフェアによって示された。

これらの理論値は、分離程度のよいピークにおけるミクロスフェアの百分率と単一のミクロスフェア種類（■Ｃ「値）の観察に基づくものであった。

ｐ２４　１６．８　４９７　８１６ｈＣＧ　３５．５　４８３　３３６ｇｐ４１　４７．４　２７３　６４くと聾よｌ場合によって多重ピークをも含む多重ピークのあるヒストグラムの情報は、手動方法あるいはカスタム・ソフトウェアを用いたコンピュータ採用方式のいずれかによって解釈する。

手動式問題解決法の場合、ベクトン・ディッヶンソン社がフローサイトメトリデータ表示装置の標準構成要素として市販しているソフトウェアを用いてコンピュータ画面にヒストグラムを表示した。このヒストグラムを目視することにより、各ピークの両側のＸ軸上にディスプレイ・タブを設定し、ヒストグラム全体を複数の領域に分割、各領域が観察可能なピークないしダブレット、トリブレット等々をもてるようにした。コンピュータはこのヒストグラムをプリントするほか、ヒストグラム全体中の事象全数、各タブ対の間の事象数、ならびに各タブの境界域に含まれるヒストグラム全体の百分率をプリントアウトすることになる。このようにして決定した相対ピーク領域と既知の可能的試薬サブ集団の組合せとを比較することにより、各ピークないし多重ピークを確定した。

コンピュータを採用したデータ解析における問題解決法は、カスタム・ソフトウェア・プログラムを用い、以下のような反復的アルゴリズムによりタブを最適位置に設定することを除き手動方法と同じである。すなわち１、ヒストグラムを入力する。

２、平滑ヒストグラム：５点ガウス平滑によって非本質的特性を排除する。

３、特性の抽出：平滑化ヒストグラムのピーク、トラフおよび平坦部を位置づける。

４、ヒストグラムの分割ニドラフおよび平坦部を位置ぎめして、ヒストグラムを複数の部域に分割する。

５、ピークの編集：デブリー・ピークおよびアグリゲート・ピークを抑制し、またバックグランドより突出したマーカセットを抑制する。

６、部域の領域と平均を計算する。

７、検体を指定部域に割り当てる：領域比率を計算し、テーブルを参照して部域を検定検体に割り当てる。

８、検定平均報告：　■ｃｆと検定検体との相関をとる。

９、結果を出力する。

本発明は定性的、半定量的ならびに定量的検定を実行するケイパビリティを曇。

えたものである。本発明に含まれる定性的検定（有無）においては、■Ｃ「値のトストゲラム・ピークがバックグランドより突出しているだけで（非特殊的束縛）試料中に検体が存在することが示され、そこでは当該ヒストグラムピーク域にＪり当該検体を試薬の組成によりあらかじめ定められた一定数の可能的検体からヰξ定的に識別する。半定量的検定（試料内にあらかじめ定められた数量を超えるＦ；画体が存在すること、ないし当該数量の間接的計測）の場合にはあらかじめ定めｔ。

一定の−ｃｆ（打ち切りまたは弁別回路）を超えるヒストグラムピークが存在すイと有意味の最小限界値を超える濃度で試料内に検体が存在することが示され、ｊた当該ヒストグラムピークの部域により当該検体が上記一定数の検体から特定ｒに識別される。類似の諏別ロジックを用いて定量的検定が記述されるが、ここ −（は他の方法によって決定された単一または複数の検体の既知の濃度は、ヒストンラム曲線の−ｃｆ値が試料中の検体の濃度と分析的に関連づけられるようにフルＡレセンス強度の標準曲線と関連づけられる。

上記の方法は個別的検定と言えるもので、検体は試薬中の塗布ミクロスフＪ−７とヒストグラムピーク部域との比率の恒真論理式を用いた方法によって特定的１゜識別される。これらの特異的比率が試薬に用いられない時には、非個別的検定ｉクノロジーを誘導するか、この場合には、単一ないし複数の対象検体の有無はル言されても単一または複数の検体を特定的に識別することは出来ない。

本明細書に述べたすべての刊行物ならびに特許申請は、引用によりあたかもを刊行物ならびに特許申請が特定的かつ個別に本発明書の一部となるべく指示さｔているその限りにおいて本明細書の一部としている。

本発明についてはその全容を述べたので、当業者にとっては各請求項の精神Ｊ範囲から逸脱することなく本発明に多数の修正ならびに変更態様を加えること力出来ることは明らかであろう。

Ｎ　Ｉｎ隠すことができるヒストグラム中のピークのサイズおよび形態の内部的な一貫性を導く。

主題のｆ法において、ミクロスフェアの物理的特性や複数の蛍光色素使用に依存することなく、複数検体のために後続的にスクリーンすることが可能である。

代わりに試料の中に検体の存在の有無を確認することは、リガンド複合体の各サブ個体群を既知の比率で含む混合体を調整することにより行われることができる。

リガンド複合体は、生物学的試料における関心のある単独検体に特に結合する能力を持つ相補的結合部位がそれに対して固定されているフローサイトメトリー技術により検出されることがてきる形態の固相担体の複数として定義されている。

つまり、この構成はフローサイトメトリー技術による検出能力のある複数の個別の試薬の混合を構成する。全体の構成に占める８サブ個体群の比率が明らかでなければならない。なぜなら、後にそれが関心ある検体の識別に使用されるからである。

一旦、全体の組成が調整されると、次に特異的結合対が形成可能となるよう適切な緩衝剤、温度、時間を用いる試料と統合される。特異的結合対は表示媒介物と接触させられ、その後、あらかしめ確認されていた固相担体の数がフローサイトメトリー技術を使い検出される。固相担体と関連する表示の相対的強度が回復され、データが事象数対相対的表示強度のヒストグラムとして描かれる。

次に、検定に使用されている試薬の各サブ集団の比率をベースとした試料中に存在する検体を識別するため、データが分析される。

時には結合部位の二、三種類のサブ集団の組合せも固有であり得るよう、特性を利用することが有益である場合もある。例えば、仮に関心ある検体が３個である場合、３個の固有の非添加の相補的結合部位の比率は１：２；７であり得る。

もし、例えば５０００などの特定数の固相担体が数えられ、次に、元々の試薬に存在する比率に基づく場合、各サブ集団と関連する固相担体の数は５００．１０００及び３５００てあろう。もし、これら全検体が試料に存在しない場合、次に５０００の固相担体の集団は、背景に蛍光を持つものとして定義される。もし検体のうちの２つが試料に存在する場合、また、元々の試薬の組成の１０％および２０％で存在する結合部位により固定されている場合、２つの集団は１つが７０請求の範囲１、多重個別リガンド複合体の混合物からなる試薬を含む組成物であって、各個別リガンド複合体は既知の比率の該組成物から成り、前記各個別リガンド複合体は、特異的結合対のもう１つのメンバーであるリガンドに結合している複数種の微小球（ミクロフェア）から成り、そして、前記混合物の全ての微小球は非標識で物理的には互いに区別することができないことを特徴とする。

２、請求項１記載の組成物であって、前記混合物の各個別リガンド複合体は該混合物の独特の比率がら成り、いがなる２つ、あるいはそれ以上の独特の比率の合計もまた、上記混合物の個別リガンド複合体のあらゆる他の可能な比率あるいは独特の比率の合計に比べて独特であることを特徴とする方法。

３、組成物は、多重個別リガンド複合体の混合物から成り、ここて、各個別のリガンド複合体は上記組成物の既知の比率がら成り、そして、上記混合物の各個別のりガント複合体は上記混合物の独特の比率から成り、いかなる２つ、あるいはそれ以上の独特の比率の合計もまた、上記混合物の個別リガンド腹合体のあらゆる他の可能な比率、あるいは独特の比率の合計に比べて独特であることを特徴とする方法。

４、請求項３記載の組成物であって、そこで、上記の独特の比率は公式、ｎ：２ｎ：　４ｎ：　８ｎ、、、２”’−１）ｎによって選ぶことができ、ここで、ｍは個別のリガンド複合体の数に等しく、ｎは任意の数であることを特徴とする方法。

５、請求項４記載の組成物であって、ｍは４でｎは１であることを特徴とする方法。

６、請求項３記載の組成物であって、その中で、上記個別リガンド複合体の夫々が、生物学的高分子、麻薬物質、非タンパク質生物学的分子及び殺虫剤からなるグループから選ばれた特異的結合対のもう１つのメンバーであるリガンドに結合した複数種の微小球を含み、またそこで、その混合物の微小球は非標ぶて物理的に互いに区別することができないことを特徴とする方法。

７、請求項４記載の組成物であって、上記リガンドが、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｐ２４、肝炎Ｂコアタンパク質及びＨＴＬＶｒｅ−５に対する抗体からなるグループ選ばれた特異的結合対の最初のメンバーである検体に特異的に結合していることを特徴とする方法。

８、請求項４記載の組成物であって、上記リガンドが、ヒトＩｇＧ及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモンからなるグループから選ばれた特異的結合対の最初のメンバーである検体に特異的に結合していることを特徴とする方法。

９、請求項４記載の組成物であって、上記生物学的高分子が抗原あるいは抗体であることを特徴とする方法。

１０、試料中の関心のある多重検体を後続的に検出する方法であって、上記方法が以下のものから成ることを特徴とする、上記試料が、関心のある上記検体に特異的に結合できることを特徴とし、フローサイトメトリー技法によって検出し得る粒子状担体に結合する試薬の多重個別のサブ集団の既知の比率からなる組成物と結合し、そこで、上記サブ集団が上記粒子状担体の物理学的特性に基づいて個別に確認することはできず、それによって特異的結合対の個別集団が関心のある各検体に対して形成され、上記特異的結合対が、蛍光色素で標識され励起エネルギーにさらされて検出できる蛍光を発する試薬に接し、そこで上記試薬に結合することができ、予め選ばれていた数の上記粒子状担体の蛍光強度をフローサイトメトリー技法で検出し、そこで特定の蛍光強度が特異的結合対の各個別集団に対して得られ、そして、関心のある検体の存在を、蛍光ヒストグラムのピーク面積をヒストグラムのピークの総面積と比較することによって、試薬の多重サブ集団の上記既知の比率と連携している特異的結合の形成と関連付けることを特徴とする方法。

１１、請求項１０記載の方法であって、試薬の上記個別サブ集団の１つ以上がほぼ同じ平均の直径を持つ粒子状担体に結合することを特徴とする方法。

１２、請求項１１記載の方法であって、上記既知の比率が独特の比率であり、各比率あるいは比率の合計が、あらゆる他の可能な比率あるいは比率の合計と比べて独特であることを特徴とする方法。

１３、請求項１１記載の方法であって、上記独特の比率がアルゴリズム、ｎ５２ｎ、４ｎ、８ｎ、、、２　（ｍ−１）　ｎによって定義され、ここで、ｍは個別のサブ集団の数に等しく、ｎは任意の数であることを特徴とする方法。

１４、請求項１１記載の方法であって、４つのサブ集団があり、上記既知の比率が１：１：１：１であることを特徴とする方法。

１５、請求項１０記載の方法であって、上記検出は蛍光のみによるが、あるいは、蛍光と側方拡散によることを特徴とする方法。

１６、請求項１０記載の方法であって、単一の蛍光色素がも用いられることを特徴とする方法。

１７、請求項１０記載の方法であって、上記粒子状担体が微小球であることを特徴とする方法。

１８、単−試料中の関心のある少なくとも２つの検体の存在を後続的に同定する方法において、上記試料を、関心のある検体に特異的に結合できることを特徴とし、フローサイトメトリー技法によって検出可能の粒子状担体に結合している試薬の１つ以上の個別のサブ集団からなる組成物と結合して特異的結合対を形成し、これが上記特異的結合対を蛍光色素で標識され上記試薬に体結合できる物質と接触させることで検出し、その改良法が以下のものを含む方法、即ち、既知の比率の上記多重サブ集団を結合して、興味ある上記検体の存在を、試薬の多重サブ集団の上記既知の比率の夫々を持つ上記特異結合対の形成に、蛍光ヒストグラムのピーク面積とヒストグラムの総ピーク面積を比較することによって関連づけることを特徴とする。

１つ、請求項１８記載の方法であって、上記既知の比率が独特の比率であり、各比率あるいは比率の合計があらゆる他の可能な比率あるいは比率の合計が独特であるような方法を特徴とする方法。

２０、請求項１９記載の方法であって、上記独特の比率がアルゴリズム、ｎ５２ｎ、４ｎ、３ｎ、、、２　（ｍ−１）　ｎで定義され、ここでｍは個別のサブ集団の数で、ｎは任意の数であることを特徴とする方法。

２１、請求項１８記載の方法であって、個別解析の数が、同じ平均直径の粒子状担体を用いて行うことのできる解析の数を、個別のゲートで分離できる異なった平均直径の粒子状胆体の数をかけることによって決定することを特徴とする方法。

２２、単−試料中の関心のある多重検体の存在を検出する方法であって、上記の方法が以下のものを含むことを特徴とする方法：上記試料を、上記の関心のある検体に特異的に結合できること特徴とし、フローサイトメトリー法で検出可能の粒子状担体に結合する多重で個別のサブ集団とほぼ同等であるがしかし未知の比率の試薬から成る組成物と結合し、ここで上記粒子状担体の物理的特性に基づいて上記個別のサブ集団は別々に同定することはできないが、特異的結合対の個別の集団が関心のある各検体に対して形成され、上記の特異的結合対を、励起エネルギーにさらすと検出できる蛍光を発する蛍光色素で標識され他物質と接触させ、ここで上記物質は上記試薬と結合することができ、いかなる未結合の物質もこれを除去し、フローサイトメトリー技法を用いて予め選ばれた数の上記粒子状担体の蛍光強度を検出し、ここで特定の蛍光強度が特異的結合対の各個別の集団に対して得られ、そして、関心のある上記検体の存在を、試薬の多重サブ集団の上記の同等であるが未知の比率に関連する再興的結合対の形成に関連付ける。

２３、請求項１０記載の方法であって、ヒストグラムのピークの面積を比較することによって検体の存在を関連づける上記の段階がコンピュータを用いて以下の段階を行うことを特徴とする方法：１つあるいはそれ以上のヒストグラムデータを上記コンピュータに入力データとして供給し、１つあるいはそれ以上の不必要な特徴データを上記人力データから除去して強化入力データを作り、１つあるいはそれ以上の形状特徴関係データ（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅ　ｄａｔａ）を上記強化人力データから抽出して１セツトのデータマーカーを定義し、１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域を上記セットのデータマーカーに対応する上記強化入力データ中に確認し、上記の確認された１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域の面積と平均を計算し、上記の１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域を、上記セットの計算領域及び平均の結果に基づいて１つあるいはそれ以上の検定検体と関連付け、そして検定データ報告を出力（ｏｕｔｐｕｔ）として供給する段階。

２４、請求項２３記載の方法であって、上記入力データから不必要な形状特徴関係データを除去する上記段階が５点式ガウス法を用いることを含むことを特徴とする方法。

２５、、請求項２３に記載のようなヒストグラム解析の方法であって、１つあるいはそれ以上の形状特徴関係データを抽出する上記段階が、上記強化入力データからのピークデータ値、谷底（ｖａｌｌｅｙ）データ値、及び平地（ｐｌａｉｎ）データ値の抽出を含むことを特徴賭する方法。

２６、請求項２３に記載のようなヒストグラム解析の方法であって、上記の１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域を確認する上記段階が、上記の確認された１つあるいはそれ以上のデータマーカーに従って、上記の１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域の各々を連合することを含むことを特徴とする方法。

２７、請求項２３に記載のようなヒストグラム解析の方法が更に上記の強化入力データを上記の面積計算段階前に強化することを含むことを特徴とする方法。

２８、請求項２７に記載のようなヒストグラム解析の方法であって、そこで上記強化人力データをさらに強化する上記の段階が上記ビークデータ値を強化することを含むことを特徴とする方法。

２９、請求項２３に記載のようなヒストグラム解析の方法であって、そこで領域を検体に関連付ける上記段階が、さらに面積比を計算する段階を含むことを特徴とする方法。

３０、請求項１０に従う方法であって、ヒストグラムのピーク面積を比較することによって検体の存在を関連づける上記段階が以下のものを含むことを特徴とする方法コンピュータに複数のヒストグラムを入力し、上記ヒストグラムを５点式ガウス平滑法で平滑化して、そこで非必須の特徴を除去し、ピーク、谷底及び平地の位置を上記の平滑化ヒストグラムに定めることによって特徴を抽出し、上記谷底及び平地に基づいて上記平滑化ヒストグラムを領域に分割し、上記ピークを、残骸及び凝集ピークを抑制し、及びバックグラウンドより極度に高く設置されたマーカーを押さえることによって上記ピークを編集し、領域の面積及び平均を計算し、面積比を計算することによって検体を指定された領域に割り当て、そして検体を検定するために領域割当て用自動照合表を用い、ｍｃｆを検定検体と関連付けることによって検定平均値を報告し、そして結果を出力する。

３１、単−試料中の関心のある５つの検体を後続的に同定する方法であって、前記方法が以下のものを含むことを特徴とする方法：上記試料を試薬の５つ個別のサブ集団の既知の比率からなる組成物と組合わせ、各サブ集団は関心のある上記５つの検体の１つに特異的に結合できることを特徴とし、フローサイトメトリー技法によって検出可能の粒子状担体に連結し、そこで最初の平均直径の粒子状担体に独特の比率で結合している３部試薬を、もう１つの平均直径を持つ粒子状担体に独特の比率で結合している２部試薬と組合わせ、それによって、特異的結合対の個別集団が関心のある各検体に形成され、上記特異的結合対を、励起エネルギーにさらすと検出できる蛍光を発する蛍光色素で標識された物質と結び付け、そこで上記物質が上記試薬と結合でき、予め選ばれた数の上記粒子状担体の蛍光強度を検出し、そこで独特の蛍光強度が特異的結合対の各個別の集団に対して得られ、そして、蛍光ヒストグラムの各ピーク面積及びヒストグラムのピークの総面積を比較することによって、関心のある上記検体の存在を、上記既知比率の多重サブ集団の各々と関連している特異的結合対の形成に関連付ける。

３３、単一試料にある１つの既知遍在検体を検出する方法であって、前記方法が以下のものを含むことを特徴とする特許試料を、前記遍在試料ゐ検体に特異的に結合でき、フローサイトメトリー技法によって検出され得る粒子状担体に連結している試薬の独特のサブ集団の既知の比率と組合わせ、そこで特異的結合対の別個の集団が前記遍在検体と形成され、前記特異的結合対を、励起エネルギーにさらすと検出可能の蛍光を発する蛍光色素で標識された物質と接触させ、そこで前記物質が上記試薬と結合することができ、予め選ばれた数の前記粒子状胆体の蛍光強度をフローサイトメトリーを用いて検出し、ここで特異的結合対の各個別集団に対して特定の蛍光強度が得られ、前記遍在検体の存在を、蛍光ヒストグラムのピーク面積及びヒストグラムのピークの総面積と比較することによって、試薬の多重サブ集団の前記既知の比率の各々と関連する特異的結合対の形成に関連付ける。

３３、組成物が以下のものを含むことを特徴とする方法であって、請求項１記載の組成物の多重集団の混合物であって、そこでは各集団があらゆる他の集団の微小球から区別できる微小球から成り、また、そこでは全混合物が、微小球に付着した相補的結合部位の３〜８０種の別個のサブ集団から成る。

３４、請求項３３記載の組成物であって、そこでは前記混合物が３〜２０種の個別のサブ集団であることを特徴とする方法。

３５．請求項３３記載の組成物であって、そこでは前記混合物が３〜１０種の別個のサブ集団であることを特徴とする特許

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下のものを含む組成物、多重個別リガンド複合体の混合物からなる試薬，各個別リガンド複合体は既知の比率の前記組成物から成る。
２．請求項１記載の組成物であって、前記個別リガンド複合体は物理的には互いに区別することが出来ないことを特徴とする。
３．請求項１記載の組成物であって、上記混合物の各個別リガンド複合体は上記混合物の独特の比率から成り、いかなる２つ、あるいはそれ以上の独特の比率の合計もまた、上記混合物の個別リガンド複合体のあらゆる他の可能な比率あるいは独特の比率の合計に比べて独特であることを特徴とする方法。
４．請求項３記載の組成物であって、そこで、上記の独特の比率は公式、ｎ：２ｎ：４ｎ：８ｎ・・・２（ｍ−１）ｎによって選ぶことが出来、ここで、ｍは個別のリガンド複合体の数に等しく、ｎは任意の数であることを特徴とする方法。
５．請求項３記載の組成物であって、そこで、ｍは４でｎは１であることを特徴とする方法。
６．請求項１記載の組成物であって、その中で上記個別リガンド複合体の夫々が、生物学的高分子、麻薬物質、非タンパク質生物学的分子及び殺虫剤からなるグルーブから選ばれた特異的結合対のもう１つのメンバーであるリガンドに結合した填数種の微小球を含むことを特徴とする方法。
７．請求項６記載の組成物であって、そこで上記リガンドが、ＨＩＶｇｐ４１、ＨＩＶｐ２４、肝炎Ｂコアタンパク質及びＨＴＬＶｒｅ−５に対する抗体からなるグループ選ばれた特異的結合対の最初のメンバーである検体に特異的に結合していることを特徴とする方法。
８．請求項３記載の組成物であって、そこで上記リガンドが、ヒトＩｇＧ及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモンからなるグループから選ばれた特異的結合対の最初のメンバーである検体に特異的に結合していることを特徴とする方法。
９．請求項６記載の組成物であって、そこで上記生物学的高分子が抗原あるいは抗体であることを特徴とする方法。
１０．試料中の関心のある多重検体を後続的に検出する方法であって、上記方法が以下のことから成ることを特徴とする。上記試料が、関心のある上記検体に特異的に結合出来ることを特徴とし、フローサイトメトリー技法によって検出し得る粒子状担体に結合する試薬の多重個別のサブ集団の既知の比率からなる組成と結合し、そこで、上記サブ集団が上記粒子状担体の物理学的特性に基づいて個別に確認することは出来ず、それによって特異的結合対の個別集団が関心のある各検体に対して形成され、上記特異的結合対が、蛍光色素で標識され励起エネルギーにさらされて検出出来る蛍光を発する試薬に接し、そこで上記試薬に結合することが出来、予め選ばれていた数の上記粒子状担体の蛍光強度をフローサイトメトリー技法で検出し、そこで特定の蛍光強度が特異的結合対の各個別集団に対して得られ、そして関心のある検体の存在を、蛍光ヒストグラムのピーク面積をヒストグラムのピークの総面積と比較することによって、試薬の多重サブ集団の上記既知の比率と連携している特異的結合の形成と関連付けることを特徴とする方法。
１１．請求項１０記載の方法であって、そこで試薬の上記個別サブ集団の１つ以上がほぼ同じ平均の直径を持つ粒子状担体に結合することを特徴とする方法。
１２．請求項１１記載の方法であって、そこで、上記既知の比率が独特の比率であり、各比率あるいは比率の合計が、あらゆる他の可能な比率あるいは比率の合計と比べて独特であることを特徴とする方法。
１３．請求項１１記載の方法であって、そこで上記独特の比率がアルゴリズム、ｎ、２ｎ、４ｎ、８ｎ・・・２（ｍ−１）ｎによって定義され、ここでｍは個別のサブ集団の数に聾しく、ｎは任意の数であることを特徴とする方法。
１４．請求項１１記載の方法であって、そこで４つのサブ集団があり、上記既知の比率が１：１：１：１であることを特徴とする方法。
１５．請求項１０記載の方法であって、そこで上記検出は蛍光のみによるか、あるいは、蛍光と側方拡散による二とを特徴とする方法。
１６．請求項１０記載の方法であって、そこで単一の蛍光色素がも用いられることを特徴とする方法。
１７．請求項１０記載の方法であって、そこで上記粒子状担体が微小球であることを特徴とする方法。
１８．単一試料中の関心のある少なくとも２つの検体の存在を後続的に同定する方法において、上記試料を、関心のある検体に特異的に結合出来ることを特徴とし、フローサイトメトリー技法によって検出可能の粒子状担体に結合している試薬の１つ以上の個別のサブ集団からなる組成と結合して特異的結合対を形成し、これが上記特異的結合対を蛍光色素で標識され上記試薬に体結合出来る物質と接触させることで検出し、その改良法が以下のことから成る、即ち、既知の比率の上記多重サブ集団を結合して、興味ある上記検体の存在を、試薬の多重サブ集団の上記既知の比率の夫々を持つ上記特異結合対の形成に、蛍光ヒストグラムのピーク面積とヒストグラムの総ピーク面積を比較することによって関連づけることを特徴とする。
１９．請求項１８記載の方法であって、そこで上記既知の比率が独特の比率であり、各比率あるいは比率の合計があらゆる他の可能な比率あるいは比率の合計が独特であるような方法を特徴とする方法。
２０．請求項１９記載の方法であって、そこで上記独特の比率がアルゴリズム、ｎ、２ｎ、４ｎ、８ｎ・・・２（−１）ｎで定義され、ここでｍは個別のサブ集団の数で、ｎは任意の数であることを特徴とする方法。
２１．請求項１８記載の方法であって、そこで個別分析の数が、同じ平均直径の粒子状担体を用いて行うことの出来る分析の数を、個別のゲートで分離出来る異なった平均直径の粒子状担体の数をかけることによって決定することを特徴とする方法。
２２．以下のものを含む組成物、関心ある検体と特異的に結合する能力として特徴付けられ、フローサイトメトリー技術により検出可能な状態で微粒子担体と結合された試薬の多重個別サブ集団、ここで、前記多重個別サブ集団はほぼ同等であるがしかし未知の比率である。
２３．単一試料中の関心のある多重検体の存在を検出する方法であって、上記の方法が以下のことから成ることを特徴とする：上記試料を、上記の関心のある検体に特異的に結合出来ること特徴とし、フローサイトメトリー法で検出可能の粒子状担体に結合する多重で個別のサブ集団のほぼ同等であるがしかし未知の比率の試薬から成る組成と結合し、ここで上記粒子状担体の物理的特性に基づいて上記個別のサブ集団は別々に同定することは出来ないが、特異的結合対の個別の集団が関心のある各検体に対して形成され、上記の特異的結合対を、励起エネルギーにさらすと検出出来る蛍光を発する蛍光色素で標識され他物質と接触させ、ここで上記物質は上記試薬と結合することが出来、いかなる未結合の物質もこれを除去し、フローサイトメトリー技法を用いて予め選ばれた数の上記粒子状担体の蛍光強度を検出し、ここで特定の蛍光強度が特異的結合対の各個別の集団に対して得られ、そして、関心のある上記検体の存在を、試薬の多重サブ集団の上記の同等であるが未知の比率に関連する得異的結合対の形成に関連付ける。
２４．コンピュータを用いてヒストグラムを解析する方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする：１つあるいはそれ以上のヒストグラムデータを上記コンピュータに入力データとして供給し、１つあるいはそれ以上の不必要な特徴データを上記入力データから除去して強化入力データを作り、１つあるいはそれ以上の形状特徴関係データ（ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃａｌｆｅａｔｕｒｅ　ｄａｔａ）を上記強化入力データから抽出して１セットのデータマーカーを定義し、１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域を上記セットのデータマーカーに対応する上記強化入力データ中に確認し、上記の確認された１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域の面積と平均を計算し、上記の１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域を、上記セットの計算領域及び平均の結果に基づいて１つあるいはそれ以上の検定検体と関連付け、そして検定データ報告を出力（ｏｕｔｐｕｔ）として供給する段階。
２５．請求項２４のようにヒストグラムを解析する方法であって、そこで上記入力データから不必要な形状特徴関係データを除去する上記段階が５点式ガウス法を用いることを含むことを特徴とする方法。
２６．請求項２３に記載のようなヒストグラム分析の方法であって、そこで１つあるいはそれ以上の形状特徴関係データを抽出する上記段階が、上記強化入力データからのピークデータ値、谷底（ｖａｌｌｅｙ）データ値、及び平地（ｐｌａｉｎ）データ値の抽出を含むことを特徴賭する方法。
２７．請求項２３に記載のようなヒストグラム分析の方法であって、そこで上記の１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域を確認する上記段階が、上記の確認された１つあるいはそれ以上のデータマーカーに従って、上記の１つあるいはそれ以上の形状特徴関係領域の各々を連合することから成ることを特徴とする方法。
２８．請求項２３に記載のようなヒストグラム分析の方法がさらに上記の強化入力データを上記の面積計算段階前に強化することから成ることを特徴とする方法。
２９．請求項２８に記載のようなヒストグラム分析の方法であって、そこで上記強化入力データをさらに強化する上記の段階が上記ピークデータ値を強化することから成ることを特徴とする方法。
３０．請求項２３に記載のようなヒストグラム分析の方法であって、そこで領域を検体に関連付ける上記段階が、さらに面積比を計算する段階を含むことを特徴とする方法。
３１．化合物及び重複したピークを含む方法であって、以下の段階を含むことを特徴とする方法：コンピュータに複数のヒストグラムを入力し、上記ヒストグラムを５点式ガウス平滑法で平滑化して、そこで非必須の特徴を除去し、ピーク、谷底及び平地の位置を上記の平滑化ヒストグラムに定めることによって特徴を抽出し、上記谷底及び平地に基づいて上記平滑化ヒストグラムを領域に分割し、上記ピークを、残骸及び凝集ピークを抑制し、及びバックグラウンドより極度に高く設置されたマーカーを押さえることによって上記ピークを編集し、領域の面積及び平均を計算し、面積比を計算することによって検体を指定された領域に割り当て、そして検体を検定するために領域割当て用目動照合表を用い、ｍｃｆを検定検体と関連付けることによって検定平均値を報告し、そして結果を出力する。
３２．単一試料中の関心のある５つの検体を後続的に同定する方法であって、前記方法が以下のことから成ることを特徴とする：上記試料を試薬の５つ個別のサブ楽団の既知の比率からなる組成と組合わせ、各サブ集団は関心のある上記５つの検体の１つに特異的に結合出来ることを特徴とし、フローサイトメトリー技法によって検出可能の粒子状担体に連結し、そこで最初の平均直径の粒子状担体に独特の比率で結合している３部試薬を、もう１つの平均直径を持つ粒子状担体に独特の比率で結合している２部試薬と組合わせ、それによって、特異的結合対の個別集団が関心のある各検体に形成され、上記特異的結合対を、励起エネルギーにさらすと検出出来る蛍光を発する蛍光色素で標識された物質と結び付け、そこで上記物質が上記試薬と結合出来、予め選ばれた数の上記粒子状担体の蛍光強度を検出し、そこで独特の蛍光強度が特異的結合対の各個別の集団に対して得られ、そして、蛍光ヒストグラムの各ピーク面積及びヒストグラムのピークの総面積を比較することによって、関心のある上記検体の存在を、上記既知比率の多重サブ集団の各々と関連している特異的結合対の形成に関連付ける。
３３．単一試料にある１つの既知遍在検体を検出する方法であって、前記方法が以下のことから成ることを特徴とする；試料を、前記遍在試料ゐ検体に特異的に結合出来、フローサイトメトリー技法によって検出され得る粒子状担体に連結している試薬の独特のサブ集団の既知の比率と組合わせ、そこで特異的結合対の別個の集団が前記遍在検体と形成され、前記特異的結合対を、励起エネルギーにさらすと検出可能の蛍光を発する蛍光色素で標識された物質と接触させ、そこで前記物質が上記試薬と結合することが出来、予め選ばれた数の前記粒子状担体の蛍光強度をフローサイトメトリーを用いて検出し、ここで特異的結合対の各個別集団に対して特定の蛍光強度が得られ、前記遍在検体の存在を、蛍光ヒストグラムのピーク面積及びヒストグラムのピークの総面積と比較することによって、試薬の多重サブ集団の前記既知の比率の各々と関連する特異的結合対の形成に関連付ける。
３４．以下のものを含む組成物、微小球に付着した相補的結合部粒の２〜８０種の別個のサブ集団から成る混合物、各サブ集団は複数の微小球を含み、各サブ集団は他の全てのサブ集団と実質的に等しい前記混合物に存在する。
３５．請求項３４記載の組成物であって、そこでは前記混合物が２〜２０種の個別のサブ集団であることを特徴とする方法。
３６．請求項３４記載の組成物であって、そこでは前記混合物が２〜１０種の別個のサブ集団であることを特徴とする方法。