JPH06505149A

JPH06505149A - グルコシドのグルコシル化のための酵素処理

Info

Publication number: JPH06505149A
Application number: JP4504136A
Authority: JP
Inventors: ペデルセン，スベン
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1991-01-31
Filing date: 1992-01-30
Publication date: 1994-06-16
Also published as: WO1992013962A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】グルコシドのグルコシル化のための酵素処理技術分野本発明はグルコシドの酵素的α−１，４グルコシル化のための処理に関する。

技術前景グルコシドのα−１，４グルコシル化、即ち、グルコシドに１又は複数のグルコシル基をα−１，４結合を介して連結させる方法は、様々な有用な生成物を製造するのに利用できる。例えば、スクロースのα−１，４グルコシル化はマルトオリゴシル−スクロースシロップ（いわゆるカップリングＶｔｔ＞を生成せしめ、これは低カロリー甘味料として提唱されている（ＧＢ　１，４７１．６１３）　、更に、天然の甘味料ステビオシト（ｓｔｅｖｉｏｓｉｄｅ）のα−１，４グルコシル化はより好ましい甘味を有する甘味料をもたらすことが報告されている（Ｊ。

Ｊｐｎ、　Ｓｏｃ、　５ｔａｒｃｈ　Ｓｃｉ、第３４巻、第１号、頁７５−８２　（１９８７））　。

酵素的α−１，４グルコシル化は、様々なバチルス属（Ｂａｃｉ　ｆｌｕｓ）の種に由来するシクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（Ｅ、Ｃ，２，４，１，９、以降ＣＧＴａｓｅと呼ぶ）の存在下におけるデンプン又はデンプン加水分解物によるグリコシドのグリコジル交換（トランスグリコシレージタン）により達成されうる（ＧＢ　１．４７１，６１３　；　Ｊ。

Ｊｐｎ、　Ｓｏｃ、　５ｔａｒｃｈ　Ｓｃｉ、、前掲；　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ａｍｙｌａｓｅｓ　ａｎｄ［１ｅｌａｔｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　＋　頁２２６−２２８．　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８８）。典型的な従来の方法はα−アミラーゼによるデンプンスラリーの液化、加熱によるα−アミラーゼの不活性化、冷却、グルコシド及びＣＧＴａｓｅの添加、そして５５〜６５℃ で１〜３日間にわたる酵素的グルコシル交換を含んで成る。

本発明の目的は改善された方法の提供にある。

発明の概要我々は、デンプンの液化及びその後のグルコシル交換のために熱安定性ＣＧＴａｓｅを用いる、並びにグルコシル交換を高い温度で行う方法を開発した。この方法は従来の方法よりも簡単であり、なぜならα−アミラーゼを不活性化するための加熱及び液化後の酵素の添加を省くことができるからである。α−アミラーゼの代わりのＣＧＴａｓｓによる液化は、液化中の還元糖の生成を回避し、そしてこれはグルコース、マルトース等の生成を低めうる。更に、グルコシル交換のための高めの温度は高めの反応速度をもたらし、従って反応時間を短くできる。

従って本発明はグルコシドの酵素的α−１，４グルコシル化のための方法であって、ａ）１００°Ｃ以上での、熱安定性シクロデキストリングリコジルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を伴う処理による水性デンプンスラリーの液化、ｂ）前記液化の前又は後での前記グルコシドの添加、及びｃ）７０−９５℃での前記ＣＧＴａｓｅによるこの混合物の酵素的グルコシ発明の詳細な説明グルコシド本発明の方法はＧｏ−Ｇ−Ｘ（マルトオリゴ糖グリコシド）（式中、Ｇはグルコピラノシル残基であり；Ｘは糖又は糖でない基であり、Ｇにα−１又はβ−エグルコシド結合によって連結しており；ｎは１．２又はそれより大きく；そしてこれらのＧはα−１，４グルコシド結合によって連結している）を生成するための、式Ｇ−Ｘのα−又はβ−グルコシドのα−１，４グルコシル化のために利用される。

本発明に従ってグルコシル化されうるグルコシドの例にはスクロース、ステビオシト、ルブソシド及びヘスベリジンジヒドロカルコングルコシドが挙げられる。

この方法はデンプンとグルコシドとの比、及びその他の反応パラメーターに依存して、様々な値のｎ（グルコシル化の程度）を育する分子の混合物を一般にもたらす、数多くの目的のため、グルコシド分子当たり１〜２個のグルコシル基の平均組込みが適切であろう。

これは一般に１〜３のデンプングルコシル基とグルコシドとのモル比を利用して達成されうる。スクロースのグルコシル化の場合、これは０．５〜１．５のデンプンとスクロースとの重量比に相当する。

この反応混合物は未反応のグルコシドＧ−Ｘ、グルコースＧ及びマルトオリゴ糖も含みうる。数多くの場合において、この反応混合物は精製後に利用されうる；所望するならば、この混合物の成分を既知の方法によって分けてよい。

熱安定性ＣＧＴａｓｅ本発明において用いた熱安定性ＣＧＴａｓｅば、５％のリンドナー（Ｌｉｎｔｎｅｒ）デンプン中での、５　ｐｐｍ　Ｃａ”を伴って、最適ｐＨ（例えばｐＨ５，０）で、９５℃にて５０分間のインキュベージ５ンの後に、初期活性の少なくとも８０％を保持しているものである。

好ましいＣＧＴａｓｅは−０８９７０３４２１に記載されているサーモアネロバクタ−（Ｔｈｅｒｓｏａｒ＋ａｅｒｏｂａｅｔｅｒ）又はサーモアネロビウム（Ｔｈｅｒａｏａｎａｅｒｏｈｉｕ＋ｓ）の株（これら２種の属は異なるものと信じられている）に由来するものである。特定の例は株ＡＴＣＣ５３，６２７又は株ＮＣＩＢ　４０，０５３ないし株ＭＣｌ８４０，０５９に由来するＣＧＴａｓｅである。これらの株は−ｏ　８９１０３４２］　に記載の通り、本発明者によりブタペスト条約の規則に従って寄託されている。

その他の好ましいＣＧＴａｓｅはクロストリジウム（Ｃ１ｏｓｔｒｉｄｉｕ■）の株、例えばＣ，サーモアミロリチカム（Ｃ，ｔｈｅｒｍｏａｍｙｌｏｌｙｔｉ、ｃｕｍ）ＡＴＣＣ３９，２５２又はＣ，サーモヒドロスルフリカム（Ｃ，ｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏ−ｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓ）　ＡＴＣＣ５３，０１６に由来する０両株とも自由に入手できる。

ＵＳ　４，５７８，３５２及びＵＳ　Ａ、１３．５７０はこれらの生物に由来する耐酸性アルファーアミラーゼ酵素について述べているが、しかし我々はこれら２種の株により生産されたＣＧＴａｓｅを発見した。このＣＧＴａｓｅの特徴及び生産についての更なる詳細は我々の係属中の出＠　ＩＩＳ　Ｏ７／４５５、１８８及びＰＣＴ／ＤＫ９０１００３３８に示されている。

ＣＧＴａｓｅ酵素は嫌気的条件のもとで、サーモアネロバクター１．サーモアネロビウム又はクロストリジウムのＣＧＴａｓｅ生産株（例えば上記したもの又はその突然変異体もしくは変異体）の嫌気的培養、又はかかる株に由来する適切な遺伝情報を含む形質転換体の好気培養、その後のこの培養培地からのＣＧＴａｓｃ酵素の回収によって生産されうる。

処理条件液化のための適切な条件は１００〜１１５°Ｃで１〜６０分間の反応時間である。デンプンスラリーの加熱はジェットクツカーの中で行うのが好ましい。

グルコシル交換の反応時間は６〜４８時間、好ましくは２４時間以内、例えば１２〜２４時間である。温度８０〜９０°Ｃが好ましい、低めの温度は熱に不安定なグルコシドに間して利用されうる。

サーモアネロバクター、サーモアネロビウム又はクロストリジウムに由来のＣＧＴａｓｅを用いると、この処理にわたってｐＨは４〜７の範囲に保つのが好ましい。液化後のｐＨ調整は一般には必要でない。

４．０−５．５の範囲におけるｐＨがＣＧＴａｓｅのために最適であり、そしてグルコシドが十分に酸安定性ならば利用できるが、しかしながら酸不安定基質、例えばスクロースについては、５．５〜７．０の範囲におけるｐＨを利用するのが好ましい。

酵素用量は好ましくは５〜２０　Ｐｈａｄｅｂａｓ単位とする（この単位はｉｉｏ　８９１０３４２１に定義されている）　、ＣＧＴａｓｅの良好な熱安定性に基づき、液化後の酵素の再投与は一般に回避できる。必要ならば１．２０〜１００ｐｐ−のカルシウム塩を酵素安定化のためにデンプンスラリーに加えてよい。

デンプンスラリーの濃度は好ましくは１５〜３０乾燥物質％である。

スクロースのグルコシル化の場合、グルコシル交換中でのその濃度は３０〜４０乾燥物質％であろう。

グルコシドは液化の前又は後に加えてよい、スクロースのような十分に熱安定性な基質については、液化前にデンプンスラリ〜にグルコシドを加えることが好都合であるやグルコシドが高温で不安定なら、好適には乾燥状態において液化の後に加えることができる。

実施例１１０．６ｇのアミロペクチンを２４ｇの脱イオン水及び５．３ｇのスクロースと混ぜ合わセ・た、サーモアネロバクタ一種ＡＴＣＣ５３，６２７由来のＣＧＴａｓｅを加えた（１４．３　Ｐｈａｄｅｂａｓ単位／デンプンｇ）、ｐＨを５．０に合わせた。混合物を」０５°で１４分間液化さセ、それに続いて９０”Ｃで２４時間のインキュベージぢンを行った。その生成物のＨＰＬＣ分析は、以下のおよそのＩＩＳ［ｌ成の生成物を示した。

フルクＩ・−ス　〜２％グルコシルスクロース　−・６．５％マノ１Ｎ・［・リオース　−２％マルトシルスクロース　〜６％高級マルトオリゴ糖　〜４０％高級「カップリング垢１　・・−２２％国際調査報告国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．グルコシドの酵素的α−１．４グルコシル化のための方法であって、ａ）１００℃以上での、熱安定性シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を伴う処理による水性デンプンスラリーの液化、ｂ）前記液化の前又は後での前記グルコシドの添加、及びｃ）７０−９５℃での前記ＣＧＴａｓｅによるこの混合物の酵素的グルコシル交換、を含んで成ることを特徴とする方法。
２．前記液化を１００〜１１５℃、ｐＨ４〜７及び１〜６０分間の反応時間で行う、請求項１に記載の方法。
３．前記酵素的グルコシル交換をｐＨ４〜７及び反応時間６〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間で行う、請求項１又は２に記載の方法。
４．前記酵素的グルコシル交換を、液化の後での実質的に中間的なｐＨ調整なしで行う、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
５．前記液化において乾燥デンプンのｇ当たり５〜２０　Ｐｈａｄｅｂｕｓ単位の酵素用量を利用し、そして前記酵素的グルコシル交換を、液化デンプンにＣＧＴａｓｅを再投与することなく行う、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
６．前記ＣＧＴａｓｅが、サーモアネロバクター、サーモアネロビウム又はクロストリジウムの株、好ましくはサーモアネロバクタ一種ＡＴＣＣ　５３，６２７、又は　ＮＣＩＢ　４０，０５３〜４０，０５９のいずれか、又はＣ．サーモアミロリチカム　ＡＴＣＣ　３９，２５２もしくはＣ．サーモヒドロスルフリカム　ＡＴＣＣ　５３，０１６に由来する、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。
７．スクロースのグルコシル化によるマルトオリゴシルスクロースの製造のための先の請求項のいずれか１項に記載の方法。