JPH06178685A - ベンジルアミントランスアミナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 下記の理化学的性質を有するベンジルアミン
トランスアミナーゼ。(1)作用：ピルビン酸の存在下で
ベンジルアミンに作用し、Ｌ−アラニンとベンズアルデ
ヒドを生成する (2)基質特異性：ベンジルアミン、β
−フェネチルアミン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシル
アミンに対して作用し、ベンジルアミンに対する活性が
最も高い (3)至適ｐＨ：pH7.5〜8.5 (4)ｐＨ安定性：
30゜CにおいてそれぞれのｐＨで60分間処理したとき、pH
5.5〜8.5まで安定である (5)分子量：125,000±5,000
である。他の発明は、ベンジルアミンを含有する試料に
ピルビン酸の存在下でベンジルアミントランスアミナー
ゼを作用させ、生成するＬ−アラニンを定量することを
特徴とするベンジルアミンの定量法である。 【効果】 本発明により、ベンジルアミンの定量に有用
なベンジルアミントランスアミナーゼ、及び精度の高い
ベンジルアミンの酵素的定量法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ベンジルアミンの定量
に有用なベンジルアミントランスアミナーゼ、及びベン
ジルアミンの酵素的定量方法に関するものであり、特に
臨床検査分野等の用途に使用される。

【０００２】

【従来の技術】これまでに見いだされているベンジルア
ミンをアミノ基供与体とするトランスアミナーゼとして
は、アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Agric.Biol.Chem.)、42巻、2363頁(1978年)、アグリカ
ルチャラル・バイオロジカル・ケミストリー、43巻、10
48頁(1979年)、及びジャーナル・バイオロジカル・ケミ
ストリー(J.Biol.Chem.)、258巻、2260頁(1983年)に記
載のシュードモナスsp.F-126の細菌由来のω−アミノ
酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼがあるのみで
ある。

【０００３】該酵素は、β−アラニンに対して最も高い
活性を示し、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘキシルアミン、
プトレッシンに対しても作用する。このシュードモナス
sp.F-126由来のω−アミノ酸：ピルビン酸アミノトラン
スフェラーゼはベンジルアミンに対して作用を示すの
で、ベンジルアミンの定量分析用の酵素として使用でき
る可能性がある。しかし、実際にベンジルアミンの定量
用酵素として使用した場合、次に示す欠点を有してい
た。すなわち、ベンジルアミンを含有する被検体中にβ
−アラニンあるいはプトレッシンが含有されていると、
これらのアミノ酸あるいはポリアミンは、ω−アミノ
酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの作用により
ピルビン酸と反応して余分のＬ−アラニンを生成する。
結果として、ベンジルアミンの分析値が高く算出され
た。ベンジルアミンを定量する被検体は、多くの場合生
体由来のものであり、これらの被検体中にはβ−アラニ
ンあるいはプトレッシンに代表されるアミノ酸あるいは
ポリアミンが含有されている。従って、体液中のベンジ
ルアミンを定量する目的には、上記のω−アミノ酸：ピ
ルビン酸アミノトランスフェラーゼを使用することは出
来ないという欠点を有しており、実用上問題があった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、ベ
ンジルアミンに対して強い基質特異性を有しβ−アラニ
ンあるいはプトレッシンなどに対しては作用しにくい新
規なベンジルアミントランスアミナーゼ、およびベンジ
ルアミントランスアミナーゼを用いた酵素的なベンジル
アミンの定量方法の開発を課題とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述の従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、エシェリヒア
属に属する細菌が、ベンジルアミンに対して強く作用
し、かつ多くのアミノ酸化合物には反応しないベンジル
アミントランスアミナーゼを生産することを見い出し、
本発明の完成に至った。

【０００６】すなわち、本発明は、ベンジルアミンに対
して強く作用を示し、かつアミノ酸化合物及びポリアミ
ンに対しては反応性が低い新規酵素であるベンジルアミ
ントランスアミナーゼを提供しするものである。更に、
本発明は、ベンジルアミンを含有する試料にピルビン酸
の存在下で微生物由来のベンジルアミントランスアミナ
ーゼを作用させ、生成するＬ−アラニンを測定する酵素
的ベンジルアミンの定量方法を提供するものである。

【０００７】従来、ベンジルアミントランスアミナーゼ
活性を示す酵素としては、前記のシュードモナスsp.F-1
26の細菌が報告されているだけであり、ベンジルアミン
に対して強く作用を示すベンジルアミントランスアミナ
ーゼは報告されておらず、又該酵素の生産菌も知られて
いない。ベンジルアミントランスアミナーゼなる新規な
酵素を生産し、かつ該酵素を単離し理化学的性質を明ら
かにしたのは本発明者らが初めてである。

【０００８】以下、本発明を具体的に説明する。

【０００９】本発明により得られたベンジルアミントラ
ンスアミナーゼは、次の理化学的性質を有する。

【００１０】(1)作用 本酵素は次式に示す通り、ベンジルアミンをアミノ基供
与体とし、ピルビン酸をアミノ基受容体として、ベンズ
アルデヒドとＬ−アラニンを生成せしめる。

【００１１】ベンジルアミン ＋ ピルビン酸 → ベ
ンズアルデヒド ＋ Ｌ−アラニン (2)基質特異性 本酵素は、アミノ基受容体としてピルビン酸を使用した
場合、アミノ基供与体としてベンジルアミンに対して最
も強く作用を示し、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルア
ミンなどに対しても作用する。しかし、本酵素は、β−
アラニン、プトレッシンに対して作用しない。ピルビン
酸5mM存在下、5mMの濃度における各アミノ基供与体に対
する本酵素の相対活性は、ベンジルアミンに対する活性
を100として表示すると表１のようになる。

【００１２】

【表１】

【００１３】また、本酵素は、アミノ基供与体としてベ
ンジルアミンを使用した場合、アミノ基受容体としてピ
ルビン酸に対して最も強く作用をするが、グリオキシル
酸に対しても作用を示す。しかし、オキサル酢酸及びα
−ケトグルタル酸に対しては、作用を示さない。ベンジ
ルアミン5mM存在下、2mMの濃度におけるアミノ基受容体
である各α−ケト酸に対する本酵素の相対活性は、ピル
ビン酸に対する活性を100として表示すると表２のよう
になる。

【００１４】

【表２】

【００１５】(3)至適ｐＨ 本酵素の至適ｐＨは7.5〜8.5である。（図１に示す） (4)ｐＨ安定性 本酵素を、それぞれのｐＨで30゜C、60分間加温したと
き、その残存活性は、pH5.5〜8.5の間で80%以上であ
る。（図２に示す） (5)分子量 125,000±5,000 ［Bio-Sil TSK-250(BIO-RAD社製)によ
るゲル濾過法により］本発明のベンジルアミントランス
アミナーゼが有するその他の理化学的性質は以下の通り
である。

【００１６】(1)Ｋｍ値 0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)、ピルビン酸をアミノ基受容
体とした時、ラインウイバー−バーク(Lineweaver-Bur
k)プロットにより、本酵素のベンジルアミンに対するKm
値を求めたところ、0.2mMである。

【００１７】(2)阻害剤 種々の試薬が本発明の酵素の活性に及ぼす影響を調べ
た。各試薬の本発明の酵素に対する影響を表３に示す。
本酵素は、ヒドロキシアミン、フェニルヒドラジド、Ｄ
−シクロセリン、Ｄ−ペニシラミン、水銀イオン、銅イ
オン、銀イオンにより強く阻害を受ける。

【００１８】

【表３】

【００１９】(5)至適温度 0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)において50゜Cである。（図３
に示す） (6)温度安定性 0.1Mリン酸緩衝液(pH8.0)において、それぞれの温度で1
0分間処理したとき、45゜Cまで安定であり、70゜Cで完全
に失活する。（図４に示す） 上記理化学的性質を有する本発明のベンジルアミントラ
ンスアミナーゼと、従来から知られているベンジルアミ
ンに対して作用を示すシュードモナスsp.F-126由来のω
−アミノ酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼの理
化学的諸性質を比較した結果、本発明の酵素は従来の酵
素とは性質を異にする新規な酵素であることが明らかに
なった。

【００２０】表４に本発明によるベンジルアミントラン
スアミナーゼと従来から知られているシュードモナスs
p.F-126由来のω−アミノ酸：ピルビン酸アミノトラン
スフェラーゼの諸性質の比較を示す。

【００２１】

【表４】

【００２２】表４における従来のシュードモナスsp.F-1
26由来のω−アミノ酸：ピルビン酸アミノトランスフェ
ラーゼとは、アグリカルチャラル・バイオロジカル・ケ
ミストリー(Agric.Biol.Chem.)、42巻(12号)、2363-236
7頁(1978年)、アグリカルチャラル・バイオロジカル・
ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、43巻、1048頁(1979
年)、及びジャーナル・バイオロジカル・ケミストリー
(J.Biol.Chem.)、258巻、2260頁(1983年)に記載の酵素
である。

【００２３】表４から本発明のベンジルアミントランス
アミナーゼと従来のシュードモナスsp.F-126由来のω−
アミノ酸：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼとは、
基質特異性、分子量において明らかな相違があることが
わかる。特に、本酵素は、ベンジルアミンに対する活性
が最も強く、β−アラニンやプトレッシンをアミノ基供
与体としないことが特徴としてあげられる。

【００２４】本発明におけるベンジルアミントランスア
ミナーゼの酵素活性測定方法及び酵素活性値の表示方法
は以下の通りである。

【００２５】酵素活性測定法 酵素反応の進行に伴って生成するＬ−アラニンを検出す
ることによる酵素活性測定法である。Ｌ−アラニンは、
容易に液体クロマトグラフィーにより定量出来る。0.2M
リン酸緩衝液(pH8.0)を0.5ml、5mMのピリドキサールリ
ン酸を0.1ml、50mMのピルビン酸溶液を0.1ml、及び100m
Mのベンジルアミン塩酸塩溶液を0.05ml、それぞれを試
験管に分注し、5分間30゜Cに保った後に適当に希釈した
酵素液0.1mlを分注混和し、反応を開始する。反応開始
後30分間30゜Cで加温した後、反応試験管を沸騰した水浴
に30秒間浸して酵素を失活させる。遠心分離により沈澱
物を除去した後、澄透溶液を液体クロマトグラフィーに
インジェクションしてＬ−アラニンを定量分析する。酵
素活性値は、1分間に1μmoleのＬ−アラニンを生成する
酵素量を1ユニットと表示する。Ｌ−アラニンの定量に
使用した液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りで
ある。

【００２６】 １．装置 1)展開液送液ポンプ(1.0ml/min) Waters 600E 2)カラム恒温槽(50゜C) 島津 CTO-6A 3)ポストラベル用反応液送液ポンプ(0.3ml/min) Waters 510 4)蛍光検出器(λex=340nm, λem=450nm) 島津 RF-535 5)オートサンプラー(30μl) Waters 700 6)ポストラベル反応槽(50゜C) 島津 CRB-6A 7)レコーダーおよびデータ処理機 島津 CR-4A ２．カラム 1)充填樹脂 日立カスタムNo.2618(スルフォン酸型) 2)ステンレスカラム 4φ×150mm ３．展開液組成 Ｉ液 30mM クエン酸ナトリウム 0.4M NaCl 6.7% メタノール 0.05% Brij-35 0.01% n-カフ゜ロン酸 (pH5.3) ＩＩ液 30mM クエン酸ナトリウム 2.6M NaCl 33% メタノール 0.05% Brij-35 0.01% n-カフ゜ロン酸 (pH5.3) ４．ポストラベル用反応液組成(１リットル中) 25.2g ホウ酸 12.8g NaOH 1.0g Brij-35 2.0ml β-メルカフ゜トエタノール 800mg オルソフタルアルテ゛ヒト゛/12ml-エタノール ５．分析条件 展開液Ｉと展開液ＩＩとの直線濃度勾配にてＬ−アラニ
ンを分離し、分離されたＬ−アラニンをオルソフタルア
ルデヒドにより蛍光誘導体化して蛍光モニターにて定量
する。

【００２７】本発明のベンジルアミントランスアミナー
ゼは、該ベンジルアミントランスアミナーゼの生産能の
ある微生物の培養物から採取することが出来るが、その
微生物としては、例えばバチルス・ブレビス Ｂ−１７
５ 微工研菌寄第１３３１２号(Bacillus brevis B-175
FERM P-13312)が挙げられる。本菌株の諸性質は以下の
通りである。

【００２８】(Ａ)形態学的性質 (1)細胞の形および大きさ：肉汁寒天培地下、30゜Cで培
養した本菌株を顕微鏡下で観察した結果、細胞の大きさ
は0.8〜1.0×2.0〜3.0μmの均一な桿菌である。

【００２９】(2)運動性の有無：ほとんど無し。

【００３０】(3)グラム染色：陽性。

【００３１】(4)胞子の有無：胞子を形成する。

【００３２】(Ｂ)各培地における生育状態 (1)肉汁寒天平板培養：30゜Cの培養で、直径2〜4mmの円
上コロニーを形成する。星状の中心部から周囲へと拡散
し、円形を形成する。周縁は、なめらかである。コロニ
ーの色は、白黄色不透明で光沢がある。

【００３３】(2)肉汁寒天斜面培養：30゜C培養で拡幅に
良く生育する。

【００３４】(3)肉汁液体培養：30゜C振盪培養で良く生
育する。

【００３５】(4)肉汁寒天穿刺培養：30゜C静置培養で刺
条に沿って生育する。

【００３６】(5)ゼラチン穿刺培養：ゼラチンの液化は
観察されない。

【００３７】(Ｃ)生理学的性質 (1)硝酸塩ｍｐ還元：陰性 (2)脱窒反応：嫌気的生育は見られる。

【００３８】(3)ＭＲテスト：陰性 (4)ＶＰテスト：陽性 (5)インドールの生成：陰性 (6)デンプンの加水分解：陽性 (7)色素の生成：陰性 (8)ウレアーゼ：陰性 (9)カタラーゼ：陽性 (10)オキシダーゼ：陽性 (11)最適生育条件：22〜37゜C、pH6.5〜8.0 (12)炭素源の利用：グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ
−マンノース、Ｄ−マンニトール、マルトース、グルコ
ン酸カリウム等を利用できる。

【００３９】本菌株は該ベンジルアミントランスアミナ
ーゼ生産菌として通商産業省工業技術微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第１３３１２号として寄託されてい
る。

【００４０】本発明のベンジルアミントランスアミナー
ゼを生産する生産菌の培養に際に使用する培地としては
特に限定されないが、炭素源、窒素源、無機塩その他の
栄養源を加えた合成培地または天然培地のいずれでも使
用可能である。例えば炭素源としてはグルコース、シュ
クロース、フルクトース、グリセロール、スターチなど
が使用出来る。窒素源としては例えば、硫酸アンモニウ
ム、硝酸アンモニウム等の無機窒素化合物あるいはペプ
トン、肉エキス、酵母エキス、アスパラギン等の有機窒
素化合物を用いることが出来る。無機塩としては例え
ば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、硫酸マ
グネシウム、塩化ナトリウム等が使用可能である。これ
らの成分の他に消泡剤としてアデカノールＬＧ−２９４
等の界面活性剤を必要に応じて添加する。

【００４１】本発明のベンジルアミントランスアミナー
ゼを生産する生産菌を培養する際の培養条件としては、
通気攪拌条件下で培養温度が15〜40゜Cの範囲、好ましく
は25〜35゜Cの範囲で培養する方法が好適である。培養時
のｐＨ条件は、pH4.0〜9.0の範囲で、好ましくはpH5.0
〜8.0の範囲が好適である。培養時間は、特に限定され
ないが酵素の生産性等の経済性を考慮すると増殖の後期
に達する時間から休止状態に入ってから10時間以内の範
囲が適当である。

【００４２】本発明のベンジルアミントランスアミナー
ゼは、培養物の中の菌体内に蓄積される。培養によって
得られた培養物から菌体を分離する方法としては、従来
から行われている遠心分離法や濾過等の方法が使用出来
るが、遠心分離の方法が好適である。

【００４３】本発明のベンジルアミントランスアミナー
ゼの分離精製は、次のようにして行うことができる。菌
体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出する方法として
は、従来から行われている超音波による菌体破砕、ある
いはガラス・ビーズと共に回転磨砕するダイノミル破砕
機による菌体破砕または、リゾチーム等の酵素やトルエ
ン等の有機溶媒による細胞膜の破砕などの方法があげら
れる。これらの中から適当な方法を選択して菌体から酵
素を抽出することができる。

【００４４】これらの方法で抽出された粗酵素液からベ
ンジルアミントランスアミナーゼをさらに精製する必要
がある場合は、通常実施されている一般的な酵素の精製
手段である硫酸アンモニウム沈殿法、イオン交換カラム
クロマトグラフィー法、ゲル濾過法、疎水結合カラムク
ロマトグラフィー法などの方法を適宜組み合わせるか、
あるいは繰り返すことによって精製を行うことができ
る。

【００４５】次に本発明によるベンジルアミンの酵素的
定量法について具体的に説明する。

【００４６】試料中のベンジルアミンはピルビン酸の存
在下、ベンジルアミントランスアミナーゼの作用によ
り、Ｌ−アラニンとベンズアルデヒドを生成する。生成
したＬ−アラニンは、アミノ酸分析装置に代表される液
体クロマトグラフィーにより容易に定量可能である。生
成したＬ−アラニン量から試料中のベンジルアミンの量
を定量することが出来る。

【００４７】本発明のベンジルアミンの酵素的定量の際
に用いられる緩衝液は、特に限定されず、リン酸緩衝
液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液などが好適に使用出
来る。緩衝液のｐＨとしてはpH6〜9.5の範囲、好ましく
はpH7.5〜8.5の範囲の緩衝液が好適に用いられる。ま
た、ベンジルアミントランスアミナーゼの濃度は、通常
0.01〜50ユニット/mlの範囲で使用されるが、特に0.05〜20ユ
ニット/mlの範囲が好適である。酵素反応温度としては20〜
50゜Cの範囲で測定可能であるが、特に25〜40゜Cの範囲が
好適である。反応時間は特に限定されないが、試料中に
存在するベンジルアミンの濃度および使用するベンジル
アミントランスアミナーゼの酵素量により適宜決定され
るが、特に2〜20分間の範囲が好適である。酵素反応溶
液を加熱あるいはトリクロロ酢酸等に代表される酸の添
加により酵素反応を停止させる。反応溶液を遠心分離に
より透澄液にしたのち、その一部を液体クロマトグラフ
ィーにインジクションし、Ｌ−アラニンを定量する。測
定されたＬ−アラニン量から試料中のベンジルアミンを
算出する。

【００４８】

【発明の効果】本発明により、ベンジルアミンの定量に
有用なベンジルアミントランスアミナーゼが得られた。
更に、高速液体クロマトグラフィーによりベンジルアミ
ンを直接定量する方法は、ベンジルアミン中のフェニル
基による分離用担体との疎水作用によりピークが広がり
精度が低いのに対して、本発明のベンジルアミンの酵素
的定量法によると、精度高くＬ−アラニンが定量でき結
果として精度の高いベンジルアミンの定量が可能となっ
た。

【００４９】

【実施例】以下、本発明を実施例によってさらに具体的
に説明するが、本発明はこの実施例に限定されるもので
はない。

【００５０】実施例１ 1.0%グルコース、1.0%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、
0.1%食塩、0.1%ベンジルアミン、及び0.02%消泡剤(エイノー
ル)、pH7.0からなる培地100mlを分注して滅菌(120℃、20
分間)した500mlの坂口フラスコにバチルス・ブレビス B
-175(微工研菌寄第13312号)を接種し、28゜Cで72時間振
とう培養した。この培養物中のベンジルアミントランス
アミナーゼ活性は、培地1.0mlあたり0.18ユニットであっ
た。 実施例２ 1.0%グルコース、1.0%ポリペプトン、0.2%酵母エキス、
0.1%食塩、0.1%ベンジルアミン、及び0.02%消泡剤（エ
イノール）、pH7.0からなる培地1,500mlを5,000mlの三
角フラスコに入れ、120゜Cで20分間滅菌した後、28゜C下
でこの培地にバチルス・ブレビス B-175(微工研菌寄第1
3312号)を植菌した。28゜Cで72時間振とう培養を行った
後この培養液を、あらかじめ上記と同様の組成を有する
培地20lを仕込み滅菌しておいたジャー・ファーメンタ
ーに加えて本培養を行った。培養条件は28゜C、攪拌回数
150rpm、通気速度20リットル/min で、70時間培養の後、培
養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。得られた菌
体150g(湿菌体重量)を10mMリン酸緩衝液(pH7.5)500mlに
懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行
った。その破砕液を遠心分離機を使用して遠心分離し、
上清液を得た。この上清液中のベンジルアミントランス
アミナーゼの総活性は5,100ユニット、比活性は0.14ユニット/mg
-タンハ゜クであった。

【００５１】この上清液をあらかじめ20mMのリン酸緩衝
液(pH7.5)で平衡化したＤＥＡＥ−セルロース（商品
名：ワットマン社製）を充填したカラム(φ7×40cm)に
通して酵素を吸着させた。カラムを5,000mlの10mMの硫
酸アンモニウムを含むリン酸緩衝液(pH7.5)で洗浄後、
硫酸アンモニウム濃度が10mMから230mMである同様のリ
ン酸緩衝液の直線濃度勾配(総容量:10l)にて吸着された
タンパク質を溶出させ、ベンジルアミントランスアミナ
ーゼ活性画分を回収した。本活性画分中のベンジルアミ
ントランスアミナーゼの総活性は1,400ユニット、比活性は
1.25ユニット/mg-タンハ゜クであった。

【００５２】この活性画分を限外濾過装置を用いて、脱
塩及び濃縮した後、あらかじめ0.2Mの硫酸アンモニウム
を含む20mMリン酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したセファク
リルＳ−４００（ファルマシア社製）を充填したカラム
(φ6.5×120cm)に通し、ゲル濾過を行い活性画分を集め
た。この活性画分中のベンジルアミントランスアミナー
ゼの総活性は970ユニット、比活性は2.1ユニット/mg-タンハ゜クであ
った。

【００５３】実施例３ 実施例２において得られた精製酵素を10mMリン酸緩衝液(p
H7.5)にて適当に希釈して調製した酵素標品を用いて本
酵素の基質特異性、至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度、
温度安定性を調べた。

【００５４】［基質特異性］0.2Mリン酸緩衝液(pH7.5)
を0.74ml、50mMのピルビン酸溶液を0.1ml、5mMのピリド
キサールリン酸溶液を0.06ml、及び各種のアミノ基供与
体となるアミン類あるいはアミノ酸類の100mM溶液を0.0
5mlからなる反応液に、酵素標品0.05ml(0.05ユニット)を添
加し、30゜Cで30分間反応させた。反応液を沸騰した水浴
に30秒間浸して酵素を失活させた後、遠心分離により沈
澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄透液を液体クロマ
トグラフィーにインジェクションしてＬ−アラニンを定
量分析した。これらのアミノ基供与体に対するベンジル
アミントランスアミナーゼの作用の強さを、ベンジルア
ミンに対する作用を100%とした相対活性値で表示したも
のを前出の表１に示す。

【００５５】［至適ｐＨ］0.2M各種緩衝液(pH4.5〜6.5:
クエン酸緩衝液;pH6.0〜8.0:リン酸緩衝液;pH7.5〜9.0:
トリス−塩酸緩衝液;pH9.0〜11.5:グリシン−苛性ソー
ダ緩衝液)を0.5ml、5mMのピリドキサールリン酸溶液を
0.1ml、50mMのピルビン酸溶液を0.1ml、100mMのベンジ
ルアミン塩酸溶液を0.05mlからなる反応液に酵素標品0.
1ml(0.05ユニット)を添加し、37゜Cで5分間反応させた。反応
液を沸騰した水浴に30秒間浸して酵素を失活させた後、
遠心分離により沈澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄
透液を液体クロマトグラフィーにインジェクションして
Ｌ−アラニンを定量分析し、酵素活性を求めた。最大の
酵素活性値を100%とした相対活性値を算出して図１を得
た。図１より、本酵素の至適ｐＨは7.0〜9.0の範囲にあ
ることがわかる。

【００５６】［ｐＨ安定性］0.2M各種緩衝液(pH4.5〜6.
5:クエン酸緩衝液;pH6.5〜8.0:リン酸緩衝液;pH7.5〜9.
0:トリス−塩酸緩衝液;pH8.0〜10.5:グリシン−苛性ソ
ーダ緩衝液)0.95mlに0.05mlの酵素標品(0.4ユニット)を混合
し、30゜Cで60分間放置した後、各溶液0.025mlを0.2Mリ
ン酸緩衝液(pH8.0)0.5ml、5mMピリドキサールリン酸溶
液0.1ml、50mMピルビン酸溶液0.1ml、100mMのベンジル
アミン塩酸溶液0.05mlからなる活性測定溶液に分注し混
和し、37゜Cで5分間反応させた。反応液を沸騰した水浴
に30秒間浸して酵素を失活させた後、遠心分離により沈
澱物を除去し澄透溶液を得た。この澄透液を液体クロマ
トグラフィーにインジェクションしてＬ−アラニンを定
量分析し、酵素活性を求めた。最大の酵素活性値を100%
とした相対活性値を算出して図２を得た。図２から明ら
かなように、本酵素はpH5.5〜8.5の範囲で安定である。

【００５７】［至適温度］0.2Mリン酸緩衝液(pH8.0)0.5
ml、5mMピリドキサールリン酸溶液0.1ml、50mMピルビン
酸溶液0.1ml、100mMのベンジルアミン塩酸溶液0.05mlか
らなる活性測定溶液に0.1ml(0.05ユニット)を添加し、25,3
0,35,37,40,45,50,55,60,65,70,75,80゜Cの各温度下にお
いて、5分間反応させた。反応液を沸騰した水浴に30秒
間浸して酵素を失活させた後、遠心分離により沈澱物を
除去し澄透溶液を得た。この澄透液を液体クロマトグラ
フィーにインジェクションしてＬ−アラニンを定量分析
し、酵素活性を求めた。最大の酵素活性値を100%とした
相対活性値を算出して図３を得た。図３より、本酵素の
至適温度は45〜50゜Cの範囲であることがわかる。

【００５８】［温度安定性］10mMリン酸緩衝液(pH7.5)
で希釈した酵素標品0.2ml(0.04ユニット)を25,30,35,40,45,
50,55,60,65,70゜Cの各温度で10分間処理した。この酵素
溶液0.05mlを0.2Mリン酸緩衝液(pH8.0)0.5ml、5mMピリ
ドキサールリン酸溶液0.1ml、50mMピルビン酸溶液0.1m
l、100mMのベンジルアミン塩酸溶液0.05mlからなる活性
測定溶液に分注し混和し、37゜Cで5分間反応させた。反
応液を沸騰した水浴に30秒間浸して酵素を失活させた
後、遠心分離により沈澱物を除去し澄透溶液を得た。こ
の澄透液を液体クロマトグラフィーにインジェクション
してＬ−アラニンを定量分析し、酵素活性を求めた。最
大の酵素活性値を100%とした相対活性値を算出して図４
を得た。図４から明らかなように、本酵素は50゜Cまでの
温度において安定である。

【００５９】実施例４ 試料溶液中のベンジルアミンの濃度を、下記組成の試薬
を用い下記方法により定量した。

【００６０】ａ）試薬 測定試液（組成） 0.1M リン酸緩衝液(pH7.5) 0.6mM ピリドキサールリン酸 4.0mM ピルビン酸 5ユニット/ml ベンジルアミントランスアミナーゼ ｂ）測定法 1.0mlの測定試液に試料Ａ溶液を0.1ml添加し、30゜Cで5
分間反応させた。反応液に10%のトリクロロ酢酸水溶液
を0.2ml添加し混和後、氷冷下で30分間静置する。本液
をさらに15,000rpmで30分間遠心分離機にかけ、上清液
を得た。この上清液を30μl液体クロマトフラフィーに
インジェクションしてＬ−アラニンの定量を行った。同
様な操作を行い、試料Ｂ、ＣのＬ−アラニンの定量を行
った。本測定法における酵素反応は、ベンジルアミンか
ら化学量論的にＬ−アラニンを生成する条件であるの
で、これらのＬ−アラニンの定量値に試料の希釈倍率を
乗じ(×１３)、化学量論的計算により試料中のベンジル
アミンの濃度を算出した。一方、同様の試料Ａ、Ｂ、Ｃ
溶液を各々30μl、高速液体クロマトグラフィーに直接
インジクションしてベンジルアミンの濃度を求めた。そ
れぞれの結果を表５に示す。両者の値はよく一致してい
る。

【００６１】

【表５】

【００６２】試料Ａについて、本発明による方法と直接
高速液体クロマトグラフィー法による方法をそれぞれ５
回実施し同時再現性を求めた。結果を表６に示す。本発
明による方法の方が精度高くベンジルアミンを測定でき
ることが確認できる。

【００６３】

【表６】

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明のベンジルアミントランスアミナーゼ
のｐＨ活性曲線を示す図である。

【図２】 同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図３】 同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図４】 同酵素の温度安定性を示す図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の理化学的性質を有するベンジルア
   ミントランスアミナーゼ。 作用：ピルビン酸の存在下でベンジルアミンに作用
   し、Ｌ−アラニンとベンズアルデヒドを生成せしめる。 基質特異性：ベンジルアミン、β−フェネチルアミ
   ン、ｎ−アミルアミン、ｎ−ヘキシルアミンに対して作
   用し、ベンジルアミンに対する活性が最も高い。 至適ｐＨ：pH7.0〜9.0 ｐＨ安定性：30゜CにおいてそれぞれのｐＨで60分間
   処理したとき、pH5.5〜8.5まで安定である。 分子量：125,000±5,000
2. 【請求項２】 ベンジルアミンを含有する試料にピルビ
   ン酸の存在下にベンジルアミントランスアミナーゼを作
   用させ、生成するＬ−アラニンを定量することを特徴と
   するベンジルアミンの定量方法。