JPH0614766A - 酵母融合株 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 いづれもサッカロミセス・セルビシエに属す
る菌株をプロトプラスト融合し創製してなる酸耐性、高
温醗酵性および優れた香気を有するサッカロミセス・セ
ルビシエ酵母融合体およびこのサッカロミセス・セルビ
シエ酵母融合体を用いて焼酎を製造する方法。 【効果】 本発明によって得られた融合酵母は、焼酎製
造工程において高いアルコール収得量を示す焼酎用酵母
と芳香性に優れた清酒用酵母の性質を合わせ持った酵母
である。これらの融合酵母を使用することによって香り
のよいソフトなタイプの焼酎を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は酸耐性、高温醗酵性お
よび優れた香気を有するサッカロミセス・セルビシエ酵
母融合体及び該酵母融合体を用いた焼酎の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】焼酎は古くから南九州地方で広く飲ま
れ、その地方の文化と深く係わっている。しかし、近年
製造法の改良により、昔のハードなタイプに代わってソ
フトなタイプの焼酎が開発され。ローカルな酒から広く
ホピュラーな酒へとイメージを変えてきている。

【０００３】広く日本中で飲まれている清酒は、寒い地
方でしかも冬期に製造されている。これは清酒の製造に
は微生物の管理を充分に注意しないと雑菌汚染により、
腐醸の心配があるからである。しかし焼酎は南九州沖縄
地方など暑い地方で製造されており、腐醸を防ぐために
様々な工夫がなされている。例えば、麹中にクエン酸を
生成するAsp. awamori, Asp. kawachii 等を使用し、酵
母も酸の多いもろみでも発酵できる耐酸性を有し、また
暑い地方でも発酵できる高温発酵性を有している。発酵
速度も清酒酵母に比べ速い酵母を使用している。

【０００４】一方、清酒酵母はアセチルトランスフェラ
ーゼ活性が強く、吟醸酒のように果実様の香りのする成
分 (酢酸イソアミル・カプロン酸エチル) を多く生成す
る性質を有している。しかし、焼酎用酵母は酵素の活性
が弱く、これまで香りの少ない酒が製造されてきた。今
までのハードなタイプの焼酎であれば、味 (高級脂肪酸
エステル) が多いので香りは重視されていなかった。し
かし現在のようにソフトなタイプの焼酎が多く飲まれる
ようになって香りも重視されるようになった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】このような状況の中で
今までの焼酎の製造法については、その製造法の原点で
あり酒質に大きく影響を及ぼす酵母の改良による新しい
タイプの焼酎の開発が要望されている。この発明は上記
のような実情に鑑みてなされたもので、焼酎用酵母と清
酒用酵母の双方の優れた性質 (耐酸性があり、高温発酵
ができ、発酵速度が速く、香りの優れている) を有する
酵母を製造し、その酵母を使った焼酎製造法を開発する
ことを目的とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】即ち、いづれもサッカロ
ミセス・セルビシエに属する菌株をプロトプラスト融合
し創製してなる酸耐性、高温醗酵性および優れた香気を
有するサッカロミセス・セルビシエ酵母融合体にある。
さらに、本発明は、焼酎製造に際し、酵母として上記サ
ッカロミセス・セルビシエ酵母融合体を用いて焼酎の製
造する方法にある。

【０００７】以下、本発明を詳細に説明する。本発明
は、焼酎の芳香性を高め、かつ焼酎製造工程の条件に適
した酵母を得ることを目的として、吟醸酒用酵母サッカ
ロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)
清酒用熊本酵母 ((株) 熊本県酒造研究所) (以下、熊
本酵母と記す) と焼酎用酵母とをプロトプラスト融合す
ることを試みた。熊本酵母は香気に優れているものの清
酒用酵母のため酸や高温に弱く、焼酎製造には向かない
酵母であるが、焼酎用酵母と融合することによって酸耐
性や高温発酵性が付与される。

【０００８】プロトプラスト融合に供する焼酎用酵母に
は人吉地方の焼酎醸造元から分離した優良酵母サッカロ
マイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) Ｓ
−４(以下、Ｓ−４と記す) を選んだ。プロトプラスト
融合では、酵母融合株の検出のために相補する栄養要求
性あるいは呼吸欠損性の変異株を使用することが望まし
い。このような人工変異株を得るには常法の人工突然変
異処理、例えば紫外線、Ｘ線、γ線を照射する物理的方
法、エチルメタンスルホネート、Ｎ−メチル−Ｎ'−ニ
トロ−Ｎ−ニトロ、グアニジン、エチジウムブロマイド
等の変異誘起剤を用いた化学的方法によって行われる。

【０００９】栄養要求性のある変異株の一つであるリジ
ン要求性変異株は、熊本酵母およびＳ−４を培養し、エ
チルメタンスルホネートで化学的に変異処理を行い、変
異株のみが生育できる培地を使用して変異株を検出分離
することによって得られる。各種の栄養要求性株は、熊
本酵母およびＳ−４を胞子形成処理し、得られた胞子を
エチルメタンスルホネートで変異処理して変異胞子を培
養し、得られたコロニーからレプリカ法によって変異株
を検出分離して得られる。胞子形成処理は常法によって
行われる。通常は酵母をＹＰＤ寒天培地 (表３) で培養
後、胞子形成寒天培地 (表７) に塗布する方法がとられ
る。また単独胞子由来の細胞を得るには、酵母細胞壁溶
解用の溶菌酵素を用いて子のうを溶解した後、超音波処
理により胞子を分散させ、胞子を栄養寒天培地で培養す
る方法がとられる。また、呼吸欠損株は、熊本酵母およ
びＳ−４を培養し、エチジウムブロマイドで化学的に変
異処理を施し、生じた変異株を菌株識別用の色素培地を
用いて分離することによって得られる。

【００１０】プロトプラスト融合は常法によって行われ
る。通常は細胞数10⁷〜10⁸個／mlの濃度のそれぞれのマ
ーカーを有する酵母菌体懸濁液を調製し、これらを酵母
細胞壁溶解酵素を含むプロトプラスト調製液で処理した
後、両方のプロトプラストを等量混合し、これに融合剤
30％ＰＥＧ6000を加え細胞融合を行う。プロトプラスト
混合液を高張最小寒天培地で培養し、生じたコロニーを
融合株として分離する。双方の酵母は異なったマーカー
を持つ変異株であるので分離したコロニーは互いのマー
カーを補い合った融合株である。

【００１１】本発明によって確立された酵母融合株とし
ては、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces
cerevisiae) ＫＳ２、サッカロマイセス・セレビシエＫ
Ｓ３、サッカロマイセス・セレビシエＫＳ４、サッカロ
マイセス・セレビシエＫＳ５の４株をあげることができ
る。そして、これらの酵母融合株は工業技術院微生物工
業技術研究所に下記の寄託番号で寄託されている。 サッカロマイセス・セレビシエ ＫＳ２ 微工研菌
寄 第12233号 サッカロマイセス・セレビシエ ＫＳ３ 微工研菌
寄 第12234号 サッカロマイセス・セレビシエ ＫＳ４ 微工研菌
寄 第12235号 サッカロマイセス・セレビシエ ＫＳ５ 微工研菌
寄 第12236号 次にサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces ce
revisiae) ＫＳ２の菌学的性質を次に示す。 １ ＹＭ寒天培地でクリーム色のコロニーを形成し、栄
養細胞は球形もしくは卵形で出芽で増殖する。 ２ 子のう胞子を良く形成する。 ３ 硝酸塩の資化性なし。 ４ ビタミン要求性なし。 ５ アルブチン分解能なし。 ６ 炭素源の発酵性および資化性

【００１２】

【表１】

【００１３】サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharo
myces cerevisiae) ＫＳ３・ＫＳ５の２株についても上
記の性質と同様の性質を有する。サッカロマイセス・セ
レビシエ (Saccharomyces cerevisiae) ＫＳ４は胞子形
成率が低いことを除いて上記の性質と同様である。次に
本発明によって得られる融合株を用いて60Ｌ規模の小仕
込で米焼酎を製造する。製造法は常法によって行われ
る。すなわち、蒸し米に麹菌を混ぜ製麹した麹に、麹汁
培地で培養した融合酵母液と水を加え、１次仕込みを行
い、６日目に蒸し米と水を加えて２次仕込みを行う。２
週間後、もろみを減圧で蒸留し、製品を得る。もろみお
よび製品を評価するために、分析並びに官能試験を行
う。

【００１４】次に融合酵母を用いて製造した焼酎の官能
評価を示す。評点は６名の焼酎審査員による評価の総合
点〔評点（１：良い，２：普通，３：わるい）×６め
い）である。

【００１５】

【表２】

【００１６】

【発明の効果】本発明によって得られた融合酵母は、焼
酎製造工程において高いアルコール収得量を示す焼酎用
酵母と芳香性に優れた清酒用酵母の性質を合わせ持った
酵母である。これらの融合酵母を使用することによって
香りのよいソフトなタイプの焼酎を製造することができ
る。

【００１７】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。ただし、本発明はこれらの実施例により限定される
ものではない。 実施例１ (ａ) リジン要求性変異株の調整 酵母サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces ce
revisiae) 熊本酵母およびＳ−４をそれぞれＹＰＤ培地
(表３) で30℃、16時間培養し、集菌洗浄後、0.１Ｍリ
ン酸緩衝液 (pH７.0) 10mlに懸濁した。ついで懸濁液に
エチルメタンスルフォネート (ＥＭＳ) 0.３mlを添加
し、30℃で45分間振盪した。集菌後、５％チオ硫酸ナト
リウム溶液10mlで洗浄し、変異誘起剤を中和した後、さ
らに滅菌水10mlで２回洗浄した。

【表３】 ＹＰＤ培地 酵母エキス 10ｇ/L ポリペプトン 20ｇ/L グルコース 20ｇ/L この処理菌体を滅菌水10mlに懸濁し、 400μl をＡＡ平
板培地 (表４) に塗布して30℃で７日間培養した。平板
上に生じた大きなコロニーを単離し、ＳＤ平板培地 (表
５) 並びにＳＤ+Lys平板培地 (表６) に植菌して両プレ
ートを30℃、約３日間培養した。ＳＤ培地で生育せず、
ＳＤ+Lys培地で生育した株を目的のリジン要求株として
釣菌した。

【００１８】その結果、熊本酵母については６株、Ｓ−
４については９株のリジン要求株を取得した。

【表４】

【表５】

【表６】 (ｂ) 栄養要求性変異株の調整 酵母サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces ce
revisiae) 熊本酵母及びＳ−４をそれぞれＹＰＤ培地で
30℃、24時間培養し、ついで胞子形成寒天培地(表７)
に塗布し、30℃で３〜５日間培養を行い、胞子を形成さ
せた。

【表７】 胞子形成寒天培地 酢酸ナトリウム 10ｇ/L 寒 天 20ｇ/L 糸のう数が10⁷個／mlになるように子のうを無菌水１ml
に懸濁させ、集菌後0.１Ｍリン酸緩衝液 (pH７.5) で洗
浄した。ついで子のうを溶菌酵素溶液 (表８)２ml中で3
0℃、１時間振盪して子のうを溶解させた後、遊離した
胞子を無菌水１mlで洗浄して0.１Ｍリン酸緩衝液３mlに
懸濁した。この懸濁液にエチルメタンスルホネートを0.
１ml添加し、30℃で１時間振盪後、集菌した。さらに0.
１Ｍリン酸緩衝液0.２mlに懸濁させ、５％チオ硫酸ナト
リウム溶液３mlを添加して30℃で10分間振盪し、ＥＭＳ
を中和した。集菌後、変異胞子をリン酸緩衝液１mlで２
回洗浄して同緩衝液５mlに懸濁させ、懸濁液を氷冷下に
３分間超音波処理することにより、胞子を懸濁液中に分
散させた。ついで集菌後、無菌水で適宜希釈し、各希釈
液0.１mlをＹＰＤ寒天培地に塗布して30℃で48時間培養
した。

【表８】 溶菌酵素溶液 ５mg/ml Zymolyase 20Ｔ溶液 0.2ml ２−メルカプトエタノール 0.4μl 0.１Ｍ リン酸緩衝液 0.8ml このＹＰＤ寒天培地をマスタープレートとしてコロニー
を最小培地にレプリカし、30℃で４日間培養した。最小
培地 (表４) では増殖できない菌株を栄養要求性変異株
としてマスタープレートから釣菌した。

【００１９】その結果、熊本酵母については目的の変異
株を得ることができなかったが、Ｓ−４についてはトリ
プトファン要求株10株とアルギニン要求株１株を得た。 (ｃ) 呼吸欠損変異株の調整 酵母サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces ce
revisiae) 熊本酵母及びＳ−４をそれぞれＹＰＤ培地に
植菌し、終濃度20μg/mlとなるようエチジウムブロマイ
ド (ＥＢ) を添加して30℃で24時間振盪した。集菌後、
無菌水で適宜希釈し、希釈液0.１mlをＰＤＡ培地 (表
９) へ塗布し、30℃で２日間培養してマスタープレート
とした。ついでＰＤＡ培地へレプリカして30℃で１日間
培養し、一方マスタープレートを重層培地 (表10) で重
層し、30℃で２日間培養した。赤変しないコロニーをレ
プリカプレートからGlucose を含む最小培地 (表11) と
Glycelinを含む最小培地 (表12) へ植菌して培養した。
Glucose を含む最小培地で生育できてGlycelinを含む最
小培地で生育できない株を目的株として単離した。

【００２０】その結果、熊本酵母については２株、Ｓ−
４については５株の呼吸欠損株を取得した。

【表９】 ＰＤＡ培地 Poteto dextrose agar 39ｇ/L

【表10】 重層培地 ＴＴＣ (トリフェニルテトラゾリウムクロライド) 500mg/L グルコース 5ｇ/L Bact Agar 10ｇ/L

【表11】

【表12】 (ｄ) 突然変異株のプロトプラスト融合 熊本酵母の変異株とＳ−４の変異株をそれぞれＹＰＤ培
地10mlで30℃、５時間振盪培養し、集菌後、プロトプラ
スト調整液 (表13) ２mlに懸濁させ、懸濁液を30℃で30
分振盪してプロトプラスト化した。集菌後等張液0.６Ｍ
塩化カリウム溶液１mlで２回洗浄を行い、両方のプロト
プラストをほぼ等量となるように混合し、これに30％Ｐ
ＥＧ6000 (50mM CaCl₂を含む) を２ml添加した。30℃で
15分間静置し、融合を行った。ついで集菌後、菌体を同
等張液１mlに懸濁し、20℃で15分間静置した。懸濁液を
等張液で適宜希釈し、選択培地 (表14) に塗布して重層
用培地 (表15) を重層後、30℃で約４日間培養した。生
じたコロニーは互いの栄養要求性あるいは呼吸欠損性を
補い合った融合株であった。具体的には熊本酵母の変異
株 (リジン要求性株・呼吸欠損株) とＳ−４の変異株
(リジン要求性株・トリプトファン要求性株・アルギニ
ン要求性株・呼吸欠損株) の様々な組合せの融合によっ
て、融合株約180株を取得した。香気成分量及び発酵能
を指標とした発酵試験によって選抜を繰り返し、最終的
に官能評価を参考にして４株 (ＫＳ２・ＫＳ３・ＫＳ４
・ＫＳ５) を優良酵母として選抜した。それぞれの融合
株の親株に付与されたマーカーは表16の通りである。

【表13】 プロトプラスト調整液 1.５Ｍ 塩化カリウム 0.8ml 0.１Ｍ リン酸緩衝液 (pH7.5) 1.0ml ２−メルカプトエタノール 1.4μl 0.25mg/ml Zymolyase 20Ｔ溶液 0.2ml

【表14】

【表15】

【００２１】

【表16】

【００２２】実施例２ (ａ) 融合酵母を用いた仕込試験 融合酵母４株及び親株２株を用いて通常の２段仕込によ
る焼酎の試醸を行い、製品の分析を行った。仕込試験は
１試験区60Ｌの規模で次の条件で行った。 仕込配合；麹歩合40％ 汲み水歩合150％ 原料米 ；多用途米 (破砕米) 仕込日数；１次もろみ６日目に２次仕込を行い、２次も
ろみ14日目に蒸留を行った。室温は20℃恒温で、品温管
理は行わなかった。

【００２３】蒸留条件；減圧蒸留 減圧度 700〜720m
mHg もろみ温度 35〜40℃ もろみおよび製品のアルコール濃度はガスクロマトグラ
フィーによって定量した。香気の指標となる酢酸イソア
ミル及びカプロン酸エチルの２成分はヘッドスペースガ
スクロマトグラフィーによって定量した。結果は下記表
17の通りである。

【００２４】清酒酵母を焼酎製造に用いた場合、酸や高
温の条件下のため、発酵経過が遅れがちでアルコール収
得量が低く、よい香りも出なかった。それに対して融合
酵母は概して親株であるＳ−４と同等かあるいはそれ以
上のアルコール収得量を示しながら、香りの成分も高く
なっている。これらの焼酎の官能による評価は前述の通
りである。

【００２５】

【表17】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 15/04 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 西村 賢了 熊本県熊本市東町３−11 熊本県工業技術 センター内 (72)発明者 中川 優 熊本県熊本市東町３−11 熊本県工業技術 センター内 (72)発明者 八幡 紀美 熊本県熊本市東町３−11 熊本県工業技術 センター内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】いづれもサッカロミセス・セルビシエに属
   する菌株をプロトプラスト融合し創製してなる酸耐性、
   高温醗酵性および優れた香気を有するサッカロミセス・
   セルビシエ酵母融合体。
2. 【請求項２】焼酎製造に際し、酵母として請求項１記載
   のサッカロミセス・セルビシエ酵母融合体を用いること
   を特徴とする焼酎の製造方法。