JPH06133657A - ユーカリプタス グロブラスの大量クローン増殖方法 - Google Patents
ユーカリプタス グロブラスの大量クローン増殖方法Info
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- JPH06133657A JPH06133657A JP4309346A JP30934692A JPH06133657A JP H06133657 A JPH06133657 A JP H06133657A JP 4309346 A JP4309346 A JP 4309346A JP 30934692 A JP30934692 A JP 30934692A JP H06133657 A JPH06133657 A JP H06133657A
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
- Y02P60/40—Afforestation or reforestation
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 精英樹等の優良品種の効率的なクローン増殖
方法が確立されていないE.globulusの大量クローン増殖
を可能にすることにある。 【構成】 E.globulusの生長点を無機塩類および植物生
長調節物質を含む人工培地で培養することにより、苗条
原基および不定苗条を誘導させ、苗条原基は静置培養す
ることにより不定苗条を誘導し、得られた不定苗条を前
記人工培地より無機塩類および植物生長調節物質の濃度
を低減させた人工固定培地で静置培養することで不定苗
条を増殖させ、増殖させた不定苗条をさらに前記の人工
培地より無機塩類濃度を低下させ植物生長調節物質を含
む人工固定培地に移植することで植物体に再生させるE.
globulusの生長点培養によるクローン苗の生産方法。 【効果】 特にパルプ材として優れているE.globulusに
おいて、精英樹等の優良品種の大量クローン増殖が可能
になり、植林用の苗の供給も可能になった。
方法が確立されていないE.globulusの大量クローン増殖
を可能にすることにある。 【構成】 E.globulusの生長点を無機塩類および植物生
長調節物質を含む人工培地で培養することにより、苗条
原基および不定苗条を誘導させ、苗条原基は静置培養す
ることにより不定苗条を誘導し、得られた不定苗条を前
記人工培地より無機塩類および植物生長調節物質の濃度
を低減させた人工固定培地で静置培養することで不定苗
条を増殖させ、増殖させた不定苗条をさらに前記の人工
培地より無機塩類濃度を低下させ植物生長調節物質を含
む人工固定培地に移植することで植物体に再生させるE.
globulusの生長点培養によるクローン苗の生産方法。 【効果】 特にパルプ材として優れているE.globulusに
おいて、精英樹等の優良品種の大量クローン増殖が可能
になり、植林用の苗の供給も可能になった。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ユーカリプタス グロ
ブラス(Eucalyptus globulus）（以下単にE.globulusと
いう）の生長点培養による大量クローン増殖に関するも
のであり、生物学・林業・農業・組織培養等に応用され
る。
ブラス(Eucalyptus globulus）（以下単にE.globulusと
いう）の生長点培養による大量クローン増殖に関するも
のであり、生物学・林業・農業・組織培養等に応用され
る。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】E.glob
ulusは、フトモモ科のユーカリ属に属し、オーストラリ
アのタスマニア島原産である。用途は、主としてパルプ
用材であるが、そのほかにも薪炭や建築材として使用さ
れている。ユーカリ種には少なくとも 600種以上の樹種
があると言われているが、そのなかでもE.globulusは、
優れたパルプ適性を示す。つまりパルプあるいは紙を作
る上で重要とされている比重・繊維長・パルプ収率等に
おいて非常に優れており、高い評価を得ている。土壌に
よっても異なるが比較的温暖な気候であれば成長性も良
好である。
ulusは、フトモモ科のユーカリ属に属し、オーストラリ
アのタスマニア島原産である。用途は、主としてパルプ
用材であるが、そのほかにも薪炭や建築材として使用さ
れている。ユーカリ種には少なくとも 600種以上の樹種
があると言われているが、そのなかでもE.globulusは、
優れたパルプ適性を示す。つまりパルプあるいは紙を作
る上で重要とされている比重・繊維長・パルプ収率等に
おいて非常に優れており、高い評価を得ている。土壌に
よっても異なるが比較的温暖な気候であれば成長性も良
好である。
【０００３】このようにE.globulusはパルプ材あるいは
森林資源上、最重要樹種であり、世界各国に植林されて
いる。しかしながらE.globulusは、挿し木や組織培養に
よる効率的な増殖が困難であるため、実生で苗を育成し
植林している現状である。
森林資源上、最重要樹種であり、世界各国に植林されて
いる。しかしながらE.globulusは、挿し木や組織培養に
よる効率的な増殖が困難であるため、実生で苗を育成し
植林している現状である。
【０００４】実生の場合、遺伝的に均一でないため生長
が不揃いになり、収穫量が減少する。あるいは収穫量が
予測できない等の問題を抱えている。また、精英樹など
の優良品種が存在しても効率的なクローン増殖方法がな
い。樹木のクローン増殖は、困難なことが極めて多く、
可能であっても実用化には程遠いのが現状である。
が不揃いになり、収穫量が減少する。あるいは収穫量が
予測できない等の問題を抱えている。また、精英樹など
の優良品種が存在しても効率的なクローン増殖方法がな
い。樹木のクローン増殖は、困難なことが極めて多く、
可能であっても実用化には程遠いのが現状である。
【０００５】ランや野菜等ではクローン増殖は可能にな
り、一部の種に於ては実用化されている。そしてこれら
の方法を樹木に応用したが適していなかったのが現状と
考えられる。特に樹木は生長が遅いことに加えて、培養
時に、組織を調整すると組織が傷害を受け、これらによ
ってフェノール性物質の合成およびこれら物質の溶出が
誘発され、生長などの阻害が起きることで樹木のクロー
ン増殖を困難にしていると考えられている。樹木のクロ
ーン増殖は、個々の樹種に適合した、例えば培地組成や
培養方法などを新たに開発することで可能になると考え
られ、早急な開発が望まれる。
り、一部の種に於ては実用化されている。そしてこれら
の方法を樹木に応用したが適していなかったのが現状と
考えられる。特に樹木は生長が遅いことに加えて、培養
時に、組織を調整すると組織が傷害を受け、これらによ
ってフェノール性物質の合成およびこれら物質の溶出が
誘発され、生長などの阻害が起きることで樹木のクロー
ン増殖を困難にしていると考えられている。樹木のクロ
ーン増殖は、個々の樹種に適合した、例えば培地組成や
培養方法などを新たに開発することで可能になると考え
られ、早急な開発が望まれる。
【０００６】大量クローン増殖が可能になれば、優良木
のクローン増殖によって植林用苗が供給され、生長量の
増大や収穫の予想が可能になり、計画的な施業が可能に
なる。さらに遺伝子組換えなどによる品種改良株の増殖
も可能になるなど、大きな効果が期待される。よって、
早急なるE.globulusの大量クローン増殖方法の確立が望
まれている。
のクローン増殖によって植林用苗が供給され、生長量の
増大や収穫の予想が可能になり、計画的な施業が可能に
なる。さらに遺伝子組換えなどによる品種改良株の増殖
も可能になるなど、大きな効果が期待される。よって、
早急なるE.globulusの大量クローン増殖方法の確立が望
まれている。
【０００７】一般にクローンの確認として形態上の観察
あるいは染色体数の算定などが行われているが、これら
の方法は、一手段ではあるが遺伝的に同一とは到底判断
できない。
あるいは染色体数の算定などが行われているが、これら
の方法は、一手段ではあるが遺伝的に同一とは到底判断
できない。
【０００８】なお、特開昭62-55020号公報で、ユーカリ
属の数種において苗条原基法を用いてのクローン増殖が
有効であると開示されている。しかしながら本発明とは
人工培地組成・方法・培養形態など全く異なる。さらに
E.globulusにおける実施例もなく、さらに増殖させた苗
がクローンであることの証明もなされておらず、本発明
とは異なる。
属の数種において苗条原基法を用いてのクローン増殖が
有効であると開示されている。しかしながら本発明とは
人工培地組成・方法・培養形態など全く異なる。さらに
E.globulusにおける実施例もなく、さらに増殖させた苗
がクローンであることの証明もなされておらず、本発明
とは異なる。
【０００９】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、上
記問題点を解決すべく鋭意努力した結果、E.globulusの
生長点あるいは生長点を含む組織を用い、無機塩類中の
各々の合計濃度がカリウム25mM、窒素25mM、燐１mMから
カリウム75mM、窒素75mM、燐２mMまでの濃度範囲を含む
高濃度無機塩類及び植物生長調節物質を含む人工培地で
回転培養・静置培養することにより、苗条原基および不
定苗条を誘導させる。苗条原基は静置培養することによ
り不定苗条を誘導する。
記問題点を解決すべく鋭意努力した結果、E.globulusの
生長点あるいは生長点を含む組織を用い、無機塩類中の
各々の合計濃度がカリウム25mM、窒素25mM、燐１mMから
カリウム75mM、窒素75mM、燐２mMまでの濃度範囲を含む
高濃度無機塩類及び植物生長調節物質を含む人工培地で
回転培養・静置培養することにより、苗条原基および不
定苗条を誘導させる。苗条原基は静置培養することによ
り不定苗条を誘導する。
【００１０】ついで得られた不定苗条は無機塩類中の各
々の合計濃度がカリウム50mM、窒素50mM、燐１mM以下に
調整し、植物生長調節物質を含む人工固定培地で静置培
養することで不定苗条を増殖させる。増殖させた不定苗
条は、無機塩類中の各々の合計濃度がカリウム25mM、窒
素25mM、燐１mM以下に調整し、植物生長調節物質を含む
人工固定培地で静置培養することで発根が誘導され、完
全な植物体が短期間にしかも大量に苗を得ることができ
る。
々の合計濃度がカリウム50mM、窒素50mM、燐１mM以下に
調整し、植物生長調節物質を含む人工固定培地で静置培
養することで不定苗条を増殖させる。増殖させた不定苗
条は、無機塩類中の各々の合計濃度がカリウム25mM、窒
素25mM、燐１mM以下に調整し、植物生長調節物質を含む
人工固定培地で静置培養することで発根が誘導され、完
全な植物体が短期間にしかも大量に苗を得ることができ
る。
【００１１】さらに得られた苗は、その種が持っている
酵素種の検出、つまりアイソザイム分析により、クロー
ンの判定を行う。これらによって短期間に大量のクロー
ン苗を得る方法を見いだした。
酵素種の検出、つまりアイソザイム分析により、クロー
ンの判定を行う。これらによって短期間に大量のクロー
ン苗を得る方法を見いだした。
【００１２】即ち、本発明の要旨とするところは、E.gl
obulusの生長点を窒素、カリウムおよび燐の濃度を高め
た無機塩類および植物生長調節物質を含む人工液体培地
で照明下、回転培養することで苗条原基を誘導し、また
人工固定培地で静置培養することで不定苗条を誘導す
る。苗条原基は不定苗条へ誘導する。
obulusの生長点を窒素、カリウムおよび燐の濃度を高め
た無機塩類および植物生長調節物質を含む人工液体培地
で照明下、回転培養することで苗条原基を誘導し、また
人工固定培地で静置培養することで不定苗条を誘導す
る。苗条原基は不定苗条へ誘導する。
【００１３】これら得られた不定苗条を前記無機塩類組
成より窒素・カリウムおよび燐の濃度を低減させ、植物
生長調節物質を含む人工固定培地に移植することで不定
苗条の増殖をはかる。次いで増殖した不定苗条は、さら
に前記無機塩類組成より窒素・カリウムおよび燐の濃度
を低減させ、植物生長調節物質のオーキシンのみを添加
した人工固定培地に移植することで大量に苗を得ること
を特徴とするE.globulusの生長点培養によるクローン苗
の生産方法に属する。
成より窒素・カリウムおよび燐の濃度を低減させ、植物
生長調節物質を含む人工固定培地に移植することで不定
苗条の増殖をはかる。次いで増殖した不定苗条は、さら
に前記無機塩類組成より窒素・カリウムおよび燐の濃度
を低減させ、植物生長調節物質のオーキシンのみを添加
した人工固定培地に移植することで大量に苗を得ること
を特徴とするE.globulusの生長点培養によるクローン苗
の生産方法に属する。
【００１４】本発明で増殖される苗条原基および不定苗
条は、遺伝的に極めて安定であり、かつ増殖率に優れ、
また植物体への再生も容易にできる培養組織である。即
ち本発明は一種の栄養体生殖による大量クローン増殖方
法であり、精英樹などの優良品種の増殖などによる植林
苗の供給を可能にしている。さらに生長点を用いるため
無病苗の作出による初期生長量の増大を可能にしてい
る。
条は、遺伝的に極めて安定であり、かつ増殖率に優れ、
また植物体への再生も容易にできる培養組織である。即
ち本発明は一種の栄養体生殖による大量クローン増殖方
法であり、精英樹などの優良品種の増殖などによる植林
苗の供給を可能にしている。さらに生長点を用いるため
無病苗の作出による初期生長量の増大を可能にしてい
る。
【００１５】
【作用】本発明をさらに詳しく説明する。E.globulusの
生長点および生長点を含む組織を殺菌した後、無機塩類
および植物生長調節物質、ビタミン、炭素源を含む人工
液体培地に置床する。ついで、照明下回転培養を行い苗
条原基を誘導する。また同一の組織を用い、同一の人工
固定培地で照明下、静置培養を行い不定苗条を誘導す
る。
生長点および生長点を含む組織を殺菌した後、無機塩類
および植物生長調節物質、ビタミン、炭素源を含む人工
液体培地に置床する。ついで、照明下回転培養を行い苗
条原基を誘導する。また同一の組織を用い、同一の人工
固定培地で照明下、静置培養を行い不定苗条を誘導す
る。
【００１６】上記の回転培養条件として、１分間２〜３
回転で照明5000〜10000 ルクス、温度15〜30℃の条件が
あげられる。静置培養条件として、照明 500〜2000ルク
ス、15〜30℃の条件があげられる。
回転で照明5000〜10000 ルクス、温度15〜30℃の条件が
あげられる。静置培養条件として、照明 500〜2000ルク
ス、15〜30℃の条件があげられる。
【００１７】苗条原基または不定苗条を誘導する場合、
無機塩類組成は、培地中の無機塩類中の各々の濃度が窒
素25mM〜75mM、カリウム25mM〜75mM、燐１〜２mMに調製
した培地を用いることを特徴とする。これ以外濃度では
効率的に苗条原基または不定苗条を誘導できない。
無機塩類組成は、培地中の無機塩類中の各々の濃度が窒
素25mM〜75mM、カリウム25mM〜75mM、燐１〜２mMに調製
した培地を用いることを特徴とする。これ以外濃度では
効率的に苗条原基または不定苗条を誘導できない。
【００１８】苗条原基または不定苗条は、生長点および
生長点を含む組織を用い、人工培地中の植物生長調節の
サイトカイニンとして６−ベンジルアデニン、カイネチ
ンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフタレン酢酸、
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３−インドール酪酸
のいずれか１種を併用することで誘導される。また、炭
素源としてショ糖、ぶどう糖を用いることができる。例
えば、６−ベンジルアデニン 0.2〜5.0ppm、α−ナフタ
レン酢酸０〜8.0ppmおよびショ糖１〜５％を含むものが
用いられる。
生長点を含む組織を用い、人工培地中の植物生長調節の
サイトカイニンとして６−ベンジルアデニン、カイネチ
ンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフタレン酢酸、
２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３−インドール酪酸
のいずれか１種を併用することで誘導される。また、炭
素源としてショ糖、ぶどう糖を用いることができる。例
えば、６−ベンジルアデニン 0.2〜5.0ppm、α−ナフタ
レン酢酸０〜8.0ppmおよびショ糖１〜５％を含むものが
用いられる。
【００１９】誘導された苗条原基は、苗条原基を誘導し
た時に用いた同一組成の人工培地へ移植し、静置培養す
ることで不定苗条が誘導される。上記の培養条件として
照明 500〜2000ルクス、15〜30℃の条件があげられる。
た時に用いた同一組成の人工培地へ移植し、静置培養す
ることで不定苗条が誘導される。上記の培養条件として
照明 500〜2000ルクス、15〜30℃の条件があげられる。
【００２０】誘導された不定苗条の増殖は、培地中の窒
素50mM、カリウム50mM、燐１mM濃度以下に調整された培
地を用いることを特徴とする。これ以上の濃度では不定
苗条の増殖は困難である。
素50mM、カリウム50mM、燐１mM濃度以下に調整された培
地を用いることを特徴とする。これ以上の濃度では不定
苗条の増殖は困難である。
【００２１】不定苗条の増殖は、人工培地中の植物生長
調節物質のサイトカイニンとして６−ベンジルアデニ
ン、カイネチンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフ
タレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキ酢酸、３−イン
ドール酪酸のいずれか１種を併用することで誘導され
る。また、炭素源としてショ糖、ぶどう糖を用いること
ができる。例えば６−ベンジルアデニン 0.2〜3.0ppm、
α−ナフタレン酢酸０〜５ppm およびショ糖１〜５％を
含むものが用いられる。
調節物質のサイトカイニンとして６−ベンジルアデニ
ン、カイネチンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフ
タレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキ酢酸、３−イン
ドール酪酸のいずれか１種を併用することで誘導され
る。また、炭素源としてショ糖、ぶどう糖を用いること
ができる。例えば６−ベンジルアデニン 0.2〜3.0ppm、
α−ナフタレン酢酸０〜５ppm およびショ糖１〜５％を
含むものが用いられる。
【００２２】上記の培養条件として、照明 500〜2000ル
クス、温度15〜30℃の条件があげられる。
クス、温度15〜30℃の条件があげられる。
【００２３】生長点あるいは生長点を含む組織より苗条
原基を経て誘導あるいは直接誘導され増殖した不定苗条
は、人工培地に移植し、照明下、静置培養を行うことで
完全な植物体へ再生させる。上記の培養条件として、照
明 200〜1000ルクス、温度15〜28℃の条件があげられ
る。
原基を経て誘導あるいは直接誘導され増殖した不定苗条
は、人工培地に移植し、照明下、静置培養を行うことで
完全な植物体へ再生させる。上記の培養条件として、照
明 200〜1000ルクス、温度15〜28℃の条件があげられ
る。
【００２４】人工培地中の無機塩類組成は、人工培地中
の各々の濃度を窒素25mM、カリウム25mM、燐１mM濃度以
下に調整した培地を用いることを特徴とする。
の各々の濃度を窒素25mM、カリウム25mM、燐１mM濃度以
下に調整した培地を用いることを特徴とする。
【００２５】植物生長調節物質としてオーキシンを用い
る。例えばα−ナフタレン酢酸あるいは３−インドール
酪酸２ppm 以下含むものが用いられる。炭素源としてシ
ョ糖１〜２％を含むものが用いられる。
る。例えばα−ナフタレン酢酸あるいは３−インドール
酪酸２ppm 以下含むものが用いられる。炭素源としてシ
ョ糖１〜２％を含むものが用いられる。
【００２６】これらの条件にて苗条原基・不定苗条を誘
導、さらには増殖させ、次いで植物体へ分化させること
で培養器中で、一つの生長点より1000万本以上の大量ク
ローン苗が作り出される。得られた植物体は、順化させ
ることで自然界にて育成することができる。得られた植
物体の形態に異常は認められず、同一の形態を示した。
また、アイソザイム分析によっても変異は認められず、
クローンであった。
導、さらには増殖させ、次いで植物体へ分化させること
で培養器中で、一つの生長点より1000万本以上の大量ク
ローン苗が作り出される。得られた植物体は、順化させ
ることで自然界にて育成することができる。得られた植
物体の形態に異常は認められず、同一の形態を示した。
また、アイソザイム分析によっても変異は認められず、
クローンであった。
【００２７】
【実施例】以下、本発明の実施例を詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００２８】（実施例１）５年生のE.globulusのえき芽
を含む組織を採取し、水道水でよく洗浄した後、70％エ
チルアルコールで数秒、さらに５％さらし粉溶液で15分
間殺菌処理し、滅菌水で３〜４回洗浄した。殺菌処理し
たえき芽を含む組織を調整したGanborg のＢ５培地（シ
ョ糖２％、寒天0.85％を含む）に置床した。１週間後に
伸長したえき芽から生長点を摘出し、調整した固定培地
上に置床した。
を含む組織を採取し、水道水でよく洗浄した後、70％エ
チルアルコールで数秒、さらに５％さらし粉溶液で15分
間殺菌処理し、滅菌水で３〜４回洗浄した。殺菌処理し
たえき芽を含む組織を調整したGanborg のＢ５培地（シ
ョ糖２％、寒天0.85％を含む）に置床した。１週間後に
伸長したえき芽から生長点を摘出し、調整した固定培地
上に置床した。
【００２９】培地は、表１の無機塩類・ビタミンなどの
基本培地にＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、ＫＮＯ3 、ＮＨ4
ＮＯ3 添加して、培地中の窒素・カリウム・燐の濃度を
表２に示すようにＥ１〜Ｅ６と称す培地を調整した。さ
らにサイトカイニンとして６−ベンジルアデニン（ＢＡ
Ｐ）、オーキシンとしてα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
を０〜10ppm の範囲で組み合わせてｐＨ 5.6〜5.8 に調
整した。いずれにもショ糖２％と寒天0.82％を加えた。
基本培地にＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、ＫＮＯ3 、ＮＨ4
ＮＯ3 添加して、培地中の窒素・カリウム・燐の濃度を
表２に示すようにＥ１〜Ｅ６と称す培地を調整した。さ
らにサイトカイニンとして６−ベンジルアデニン（ＢＡ
Ｐ）、オーキシンとしてα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
を０〜10ppm の範囲で組み合わせてｐＨ 5.6〜5.8 に調
整した。いずれにもショ糖２％と寒天0.82％を加えた。
【００３０】培養条件は、温度25℃±１℃、1500ルクス
・16時間照明（８時間暗黒）で行った。
・16時間照明（８時間暗黒）で行った。
【００３１】
【表１】
【００３２】
【表２】
【００３３】初代培養から４〜５週間経過した時点よ
り、表３に示すように植物生長調節物質を組み合わせた
Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地に、ＢＡＰ 0.2〜5.0ppmと
ＮＡＡ０〜8.0ppmを添加した組成で、70〜80％の確率で
不定苗条が形成された。特に、Ｅ４培地にＢＡＰ ２pp
m とＮＡＡ ２〜４ppm を添加した区においては、初代
培養から６週間経過した時点で置床した組織当りの発生
した茎葉数は平均で20と最大であった。
り、表３に示すように植物生長調節物質を組み合わせた
Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地に、ＢＡＰ 0.2〜5.0ppmと
ＮＡＡ０〜8.0ppmを添加した組成で、70〜80％の確率で
不定苗条が形成された。特に、Ｅ４培地にＢＡＰ ２pp
m とＮＡＡ ２〜４ppm を添加した区においては、初代
培養から６週間経過した時点で置床した組織当りの発生
した茎葉数は平均で20と最大であった。
【００３４】Ｅ１，Ｅ５培地では、１〜２の苗条が形成
されたにとどまり効率的ではなかった。Ｅ２，Ｅ３，Ｅ
４，Ｅ６培地で形成された不定苗条は、初代培養から７
週目に各々同一組成（植物生長調節物質も同一）の新し
い培地に移植し、同一の条件で培養した。移植後、２〜
３週間経過すると、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡＰ 0.2〜3.0p
pm 及びＮＡＡ ０〜5.0ppm添加した組成では形成され
た不定苗条から新たな茎葉が発生し、不定苗条は以後移
植をすることで増殖を続け、最初に形成されたシュート
は伸長した。不定苗条の増殖は、分割して植え継ぐと１
カ月に約４倍の茎葉数になった。従って１年間に苗とし
て1000万本以上生産される。
されたにとどまり効率的ではなかった。Ｅ２，Ｅ３，Ｅ
４，Ｅ６培地で形成された不定苗条は、初代培養から７
週目に各々同一組成（植物生長調節物質も同一）の新し
い培地に移植し、同一の条件で培養した。移植後、２〜
３週間経過すると、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡＰ 0.2〜3.0p
pm 及びＮＡＡ ０〜5.0ppm添加した組成では形成され
た不定苗条から新たな茎葉が発生し、不定苗条は以後移
植をすることで増殖を続け、最初に形成されたシュート
は伸長した。不定苗条の増殖は、分割して植え継ぐと１
カ月に約４倍の茎葉数になった。従って１年間に苗とし
て1000万本以上生産される。
【００３５】Ｅ４，Ｅ６では植物生長調節物質の添加量
に関わりなくカルス化し、不定苗条の増殖はできなかっ
た。しかしＥ４，Ｅ６培地で初代培養時形成された不定
苗条は、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡＰ 0.2〜3.0ppm及びＮＡ
Ａ ０〜5.0ppm添加した培地に移植するとカルス化は見
られず、新たな茎葉が発生し、不定苗条は以後移植をす
ることで増殖を続けた。また、形成された不定苗条は、
植物生長調節物質を添加していないＥ２，Ｅ３移植する
と各々の茎葉は伸長した。
に関わりなくカルス化し、不定苗条の増殖はできなかっ
た。しかしＥ４，Ｅ６培地で初代培養時形成された不定
苗条は、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡＰ 0.2〜3.0ppm及びＮＡ
Ａ ０〜5.0ppm添加した培地に移植するとカルス化は見
られず、新たな茎葉が発生し、不定苗条は以後移植をす
ることで増殖を続けた。また、形成された不定苗条は、
植物生長調節物質を添加していないＥ２，Ｅ３移植する
と各々の茎葉は伸長した。
【００３６】
【表３】
【００３７】ついで完全な植物体へ再生させるために不
定苗条から伸長している茎葉を用い、発根を促すために
Ｅ１，Ｅ２培地（ショ糖２％・寒天0.85％）にＮＡＡと
３−インドール酪酸（ＩＢＡ）を単独で１〜４ppm 添加
して培養した。培養条件は温度25±１℃、照度 500ルク
スで行った。表４に示すようにＥ１培地にＮＡＡ ２pp
m 添加あるいはＩＢＡ ２ppm 添加した場合、最も高い
発根率を示し、完全な植物体に再生した。
定苗条から伸長している茎葉を用い、発根を促すために
Ｅ１，Ｅ２培地（ショ糖２％・寒天0.85％）にＮＡＡと
３−インドール酪酸（ＩＢＡ）を単独で１〜４ppm 添加
して培養した。培養条件は温度25±１℃、照度 500ルク
スで行った。表４に示すようにＥ１培地にＮＡＡ ２pp
m 添加あるいはＩＢＡ ２ppm 添加した場合、最も高い
発根率を示し、完全な植物体に再生した。
【００３８】
【表４】
【００３９】培養容器内で得られた植物体は、温度25
℃、湿度80％以上に保たれた順化室で２〜３週間順化さ
せた後、屋外に移植した。
℃、湿度80％以上に保たれた順化室で２〜３週間順化さ
せた後、屋外に移植した。
【００４０】再生された植物体についてクローンの確認
を行った。一つの生長点に由来する植物体は、外部形態
上に差異はなく生長性も均一であった。ついでアイソザ
イム分析は、白石の方法（林木育種、142:23〜25、143:
34〜38）に従って行った。検出した酵素種は、ホスホグ
ルコムダーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、６−ホスホ
グルコン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素
酵素、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、アスパラギン
酸アミノ基転移酵素、グルセリン酸脱水素酵素、グルタ
ミン酸脱水素酵素、シキミ酸脱水素酵素の10酵素であ
る。各酵素種ごとにアイソザイムのバンドパターンを比
較した結果、全酵素種において供試固体はすべて同じバ
ンドパターンであり、同一クローンであった。図１に６
−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイソザイムバンドパ
ターンを示す。
を行った。一つの生長点に由来する植物体は、外部形態
上に差異はなく生長性も均一であった。ついでアイソザ
イム分析は、白石の方法（林木育種、142:23〜25、143:
34〜38）に従って行った。検出した酵素種は、ホスホグ
ルコムダーゼ、ホスホグルコイソメラーゼ、６−ホスホ
グルコン酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素
酵素、リンゴ酸脱水素酵素、フマラーゼ、アスパラギン
酸アミノ基転移酵素、グルセリン酸脱水素酵素、グルタ
ミン酸脱水素酵素、シキミ酸脱水素酵素の10酵素であ
る。各酵素種ごとにアイソザイムのバンドパターンを比
較した結果、全酵素種において供試固体はすべて同じバ
ンドパターンであり、同一クローンであった。図１に６
−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイソザイムバンドパ
ターンを示す。
【００４１】（実施例２）E.globulusの種子を70％エチ
ルアルコール溶液で数秒、さらに５％さらし粉溶液で60
分間殺菌処理し、滅菌水で３〜４回洗浄した。殺菌処理
した種子を調整したGanborg のＢ５培地（ショ糖２％、
寒天0.85％を含む）に置床した。２週間後、発芽した幼
苗から生長点を摘出し、調整した固定培地上に置床し
た。
ルアルコール溶液で数秒、さらに５％さらし粉溶液で60
分間殺菌処理し、滅菌水で３〜４回洗浄した。殺菌処理
した種子を調整したGanborg のＢ５培地（ショ糖２％、
寒天0.85％を含む）に置床した。２週間後、発芽した幼
苗から生長点を摘出し、調整した固定培地上に置床し
た。
【００４２】培地は、実施例１と同様にＥ１〜Ｅ６と称
す培地を調整した。さらにサイトカイニンとしてカイネ
チン（Ｋ）、オーキシンとしてＮＡＡを０〜10ppm の範
囲で組み合わせてｐＨ 5.6〜5.8 に調整した。いずれに
もショ糖２％と寒天0.82％を加えた。培養条件は、温度
25℃±１℃、1500ルクス・16時間照明（８時間暗黒）で
行った。
す培地を調整した。さらにサイトカイニンとしてカイネ
チン（Ｋ）、オーキシンとしてＮＡＡを０〜10ppm の範
囲で組み合わせてｐＨ 5.6〜5.8 に調整した。いずれに
もショ糖２％と寒天0.82％を加えた。培養条件は、温度
25℃±１℃、1500ルクス・16時間照明（８時間暗黒）で
行った。
【００４３】初代培養から４〜５週間経過した時点よ
り、Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地にＫ0.2 〜5.0ppmとＮ
ＡＡ ０〜8.0ppmを添加した組成において不定苗条の形
成が観察された。特に、Ｅ４培地にＫ ２ppm とＮＡＡ
２〜４ppm を添加した区においては、置床した組織当
りの発生した茎葉数は平均で30と最大であった。Ｅ１，
Ｅ５培地では不定苗条の形成は観察されなかった。
り、Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地にＫ0.2 〜5.0ppmとＮ
ＡＡ ０〜8.0ppmを添加した組成において不定苗条の形
成が観察された。特に、Ｅ４培地にＫ ２ppm とＮＡＡ
２〜４ppm を添加した区においては、置床した組織当
りの発生した茎葉数は平均で30と最大であった。Ｅ１，
Ｅ５培地では不定苗条の形成は観察されなかった。
【００４４】Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地で形成された
不定苗条は、Ｅ３培地にＫ 0.2〜3.0 とＮＡＡ ０〜５
ppm を添加した培地に移植すると不定苗条から新たな茎
葉が発生し、不定苗条は以後移植をすることで増殖を続
け、最初に形成されたシュートは伸長した。
不定苗条は、Ｅ３培地にＫ 0.2〜3.0 とＮＡＡ ０〜５
ppm を添加した培地に移植すると不定苗条から新たな茎
葉が発生し、不定苗条は以後移植をすることで増殖を続
け、最初に形成されたシュートは伸長した。
【００４５】ついで完全な植物体を再生するために不定
苗条から伸長している茎葉、または、植物生長調節物質
を除いた培地に移植し茎葉を伸長させて用いた。発根を
促すためにＥ１培地（ショ糖２％・寒天0.85％）にＩＢ
Ａ ２ppm 添加して培養した。培養条件は温度25℃±１
℃、照度 500ルクスで行った。移植後10日経過した時点
より全ての茎葉から発根が見られ、完全な植物体に再生
した。
苗条から伸長している茎葉、または、植物生長調節物質
を除いた培地に移植し茎葉を伸長させて用いた。発根を
促すためにＥ１培地（ショ糖２％・寒天0.85％）にＩＢ
Ａ ２ppm 添加して培養した。培養条件は温度25℃±１
℃、照度 500ルクスで行った。移植後10日経過した時点
より全ての茎葉から発根が見られ、完全な植物体に再生
した。
【００４６】培養容器内で得られた植物体は、温度25
℃、湿度80％以上に保たれた順化室で２〜３週間順化さ
せた後、屋外に移植した。
℃、湿度80％以上に保たれた順化室で２〜３週間順化さ
せた後、屋外に移植した。
【００４７】再生された植物体について、クローンの確
認を実施例１に示す方法で行った結果、一つの生長点に
由来する植物体は同一クローンであった。
認を実施例１に示す方法で行った結果、一つの生長点に
由来する植物体は同一クローンであった。
【００４８】（実施例３）５年生のE.globulusのえき芽
を含む組織を採取し、水道水でよく洗浄した後、70％エ
チルアルコールで数秒、さらに５％さらし粉溶液で15分
間殺菌処理し、滅菌水で３〜４回洗浄した。殺菌処理し
たえき芽を含む組織を調整したGanborg のＢ５培地（シ
ョ糖２％、寒天0.85％を含む）に置床した。１週間後に
伸長したえき芽から生長点を摘出し、調整した液体培地
中に置床した。
を含む組織を採取し、水道水でよく洗浄した後、70％エ
チルアルコールで数秒、さらに５％さらし粉溶液で15分
間殺菌処理し、滅菌水で３〜４回洗浄した。殺菌処理し
たえき芽を含む組織を調整したGanborg のＢ５培地（シ
ョ糖２％、寒天0.85％を含む）に置床した。１週間後に
伸長したえき芽から生長点を摘出し、調整した液体培地
中に置床した。
【００４９】培地は、実施例１に示すＥ３，Ｅ４，Ｅ５
と称す培地にサイトカイニンとしてカイネチン（Ｋ）、
オーキシンとしてＮＡＡを０〜10ppm の範囲で組み合わ
せて調整した。いずれにもショ糖２％を加えｐＨ 5.6〜
5.8 に調製し、試験管（30×200)に25ml分注した。培養
条件は、温度25℃±１℃、 10000ルクス・16時間照明
（８時間暗黒）で１分間２回転で行った。
と称す培地にサイトカイニンとしてカイネチン（Ｋ）、
オーキシンとしてＮＡＡを０〜10ppm の範囲で組み合わ
せて調整した。いずれにもショ糖２％を加えｐＨ 5.6〜
5.8 に調製し、試験管（30×200)に25ml分注した。培養
条件は、温度25℃±１℃、 10000ルクス・16時間照明
（８時間暗黒）で１分間２回転で行った。
【００５０】初代培養から２〜３週間経過した時点よ
り、Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地にＫ O.2〜5.0ppm、ＮＡＡ
０〜8.0ppmを添加した組成で苗条原基の形成が観察され
た。
り、Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地にＫ O.2〜5.0ppm、ＮＡＡ
０〜8.0ppmを添加した組成で苗条原基の形成が観察され
た。
【００５１】Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地で形成された
苗条原基は、初代培養から４週目に、同一組成の寒天0.
82％を加えた固定培地に移植し、温度25℃±１℃、1000
ルクス・16時間照明（８時間暗黒）で静置培養した。移
植後、２週間経過すると苗条原基から苗条の発生が観察
され不定苗条を形成した。
苗条原基は、初代培養から４週目に、同一組成の寒天0.
82％を加えた固定培地に移植し、温度25℃±１℃、1000
ルクス・16時間照明（８時間暗黒）で静置培養した。移
植後、２週間経過すると苗条原基から苗条の発生が観察
され不定苗条を形成した。
【００５２】形成された不定苗条は、植物生長調節物質
を除いたＥ３培地に移植したところ２週間で茎葉が伸長
した。伸長した茎葉を切取り、Ｅ１培地（ショ糖２％、
寒天0.85％、ＩＢＡ ２ppm)に差しつけて静置培養し
た。培養条件は温度25℃±１℃、照度 500ルクスで行
い、差しつけた茎葉からすべて発根し完全な植物体が再
生された。
を除いたＥ３培地に移植したところ２週間で茎葉が伸長
した。伸長した茎葉を切取り、Ｅ１培地（ショ糖２％、
寒天0.85％、ＩＢＡ ２ppm)に差しつけて静置培養し
た。培養条件は温度25℃±１℃、照度 500ルクスで行
い、差しつけた茎葉からすべて発根し完全な植物体が再
生された。
【００５３】培養容器内で得られた植物体は、温度25
℃、湿度80％以上に保たれた順化室で２〜３週間順化さ
せた後、屋外に移植した。
℃、湿度80％以上に保たれた順化室で２〜３週間順化さ
せた後、屋外に移植した。
【００５４】再生された植物体についての確認は、実施
例１に示す方法で実施した。一つの生長点に由来する植
物体は、同一クローンであった。
例１に示す方法で実施した。一つの生長点に由来する植
物体は、同一クローンであった。
【００５５】
【発明の効果】本発明によれば、効率的な大量クローン
増殖方法がなかったE.globulusにおいて、生長点あるい
は生長点を含む組織を培養することで苗条原基や不定苗
条を誘導・増殖させ、更に植物体に再生させることで大
量でしかも均一な、いわゆるクローン苗を供給すること
ができる。つまり、エリート木と称される精英樹や改良
品種を植林事業に供給することが可能になり、効果は絶
大である。
増殖方法がなかったE.globulusにおいて、生長点あるい
は生長点を含む組織を培養することで苗条原基や不定苗
条を誘導・増殖させ、更に植物体に再生させることで大
量でしかも均一な、いわゆるクローン苗を供給すること
ができる。つまり、エリート木と称される精英樹や改良
品種を植林事業に供給することが可能になり、効果は絶
大である。
【図１】本発明の実施例１により再生された植物体につ
いての６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイソザイム
バンドパターンを示す写真である。
いての６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイソザイム
バンドパターンを示す写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｅ．ｇ
ｌｏｂｕｌｕｓは、フトモモ科のユーカリ属に属し、オ
ーストラリアのタスマニア島原産である。用途は、主と
してパルプ用材であるが、そのほかにも薪炭や建築材と
して使用されている。ユーカリ種には少なくとも６００
種以上の樹種があると言われているが、そのなかでも
Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓは、優れたパルプ適性を示す。つ
まりパルプあるいは紙を作る上で重要とされている容積
重・繊維長・パルプ収率等において非常に優れており、
高い評価を得ている。土壌によっても異なるが比較的温
暖な気候であれば生長性も良好である。
ｌｏｂｕｌｕｓは、フトモモ科のユーカリ属に属し、オ
ーストラリアのタスマニア島原産である。用途は、主と
してパルプ用材であるが、そのほかにも薪炭や建築材と
して使用されている。ユーカリ種には少なくとも６００
種以上の樹種があると言われているが、そのなかでも
Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓは、優れたパルプ適性を示す。つ
まりパルプあるいは紙を作る上で重要とされている容積
重・繊維長・パルプ収率等において非常に優れており、
高い評価を得ている。土壌によっても異なるが比較的温
暖な気候であれば生長性も良好である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００３】このようにＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓはパルプ
材あるいは森林資源上、最重要樹種であり、世界各国に
植林されている。しかしながらＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ
は、挿し木や組織培養による効率的な増殖が困難である
ため、実生で苗を育成し植林しているのが現状である。
材あるいは森林資源上、最重要樹種であり、世界各国に
植林されている。しかしながらＥ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ
は、挿し木や組織培養による効率的な増殖が困難である
ため、実生で苗を育成し植林しているのが現状である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００４】実生の場合、遺伝的に均一でないため生長
が不揃いになり、収穫量が乏しい。あるいは収穫量が予
測できない等の問題を抱えている。また、精英樹などの
優良品種が存在しても効率的なクローン増殖方法がな
い。樹木のクローン増殖は、困難なことが極めて多く、
可能であっても実用化には程遠いのが現状である。
が不揃いになり、収穫量が乏しい。あるいは収穫量が予
測できない等の問題を抱えている。また、精英樹などの
優良品種が存在しても効率的なクローン増殖方法がな
い。樹木のクローン増殖は、困難なことが極めて多く、
可能であっても実用化には程遠いのが現状である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】ついで得られた不定苗条は無機塩類中の各
々の合計濃度がカリウム５０ｍＭ、窒素５０ｍＭ、燐１
ｍＭ以下に調整し、植物生長調節物質を含む人工固定培
地で静置培養することで不定苗条を増殖させる。増殖さ
せた不定苗条は、無機塩類中の各々の合計濃度がカリウ
ム２５ｍＭ、窒素２５ｍＭ、燐１ｍＭ以下に調整し、植
物生長調節物質を含む人工固定培地で静置培養すること
で根が形成され、完全な植物体が短期間にしかも大量に
苗を得ることができる。
々の合計濃度がカリウム５０ｍＭ、窒素５０ｍＭ、燐１
ｍＭ以下に調整し、植物生長調節物質を含む人工固定培
地で静置培養することで不定苗条を増殖させる。増殖さ
せた不定苗条は、無機塩類中の各々の合計濃度がカリウ
ム２５ｍＭ、窒素２５ｍＭ、燐１ｍＭ以下に調整し、植
物生長調節物質を含む人工固定培地で静置培養すること
で根が形成され、完全な植物体が短期間にしかも大量に
苗を得ることができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】苗条原基または不定苗条を誘導する場合、
無機塩類組成は、培地中の無機塩類中の各々の濃度が窒
素２５ｍＭ〜７５ｍＭ、カリウム２５ｍＭ〜７５ｍＭ、
燐１〜２ｍＭに調整した培地を用いることを特徴とす
る。これ以外の濃度では効率的に苗条原基または不定苗
条を誘導できない。
無機塩類組成は、培地中の無機塩類中の各々の濃度が窒
素２５ｍＭ〜７５ｍＭ、カリウム２５ｍＭ〜７５ｍＭ、
燐１〜２ｍＭに調整した培地を用いることを特徴とす
る。これ以外の濃度では効率的に苗条原基または不定苗
条を誘導できない。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１８】苗条原基または不定苗条は、生長点および
生長点を含む組織を用い、人工培地中の植物生長調節物
質のサイトカイニンとして６−ベンジルアデニン、カイ
ネチンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフタレン酢
酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３−インドール
酪酸のいずれか１種を併用することで誘導される。ま
た、炭素源としてショ糖、ぶどう糖を用いることができ
る。例えば、６−ベンジルアデニン０．２〜５．０ｐｐ
ｍ、α−ナフタレン酢酸０〜８．０ｐｐｍおよびショ糖
１〜５％を含むものが用いられる。
生長点を含む組織を用い、人工培地中の植物生長調節物
質のサイトカイニンとして６−ベンジルアデニン、カイ
ネチンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフタレン酢
酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３−インドール
酪酸のいずれか１種を併用することで誘導される。ま
た、炭素源としてショ糖、ぶどう糖を用いることができ
る。例えば、６−ベンジルアデニン０．２〜５．０ｐｐ
ｍ、α−ナフタレン酢酸０〜８．０ｐｐｍおよびショ糖
１〜５％を含むものが用いられる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】不定苗条の増殖は、人工培地中の植物生長
調節物質のサイトカイニンとして６−ベンジルアデニ
ン、カイネチンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフ
タレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３−イ
ンドール酪酸のいずれか１種を併用することで誘導され
る。また、炭素源としてショ糖、ぶどう糖を用いること
ができる。例えば６−ベンジルアデニン０．２〜３．０
ｐｐｍ、α−ナフタレン酢酸０〜５ｐｐｍおよびショ糖
１〜５％を含むものが用いられる。
調節物質のサイトカイニンとして６−ベンジルアデニ
ン、カイネチンのいずれか１種とオーキシンのα−ナフ
タレン酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、３−イ
ンドール酪酸のいずれか１種を併用することで誘導され
る。また、炭素源としてショ糖、ぶどう糖を用いること
ができる。例えば６−ベンジルアデニン０．２〜３．０
ｐｐｍ、α−ナフタレン酢酸０〜５ｐｐｍおよびショ糖
１〜５％を含むものが用いられる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】植物生長調節物質としてオーキシンを用い
る。例えばα−ナフタレン酢酸あるいは３−インドール
酪酸２ｐｐｍ以下を含むものが用いられる。炭素源とし
てショ糖１〜２％を含むものが用いられる。
る。例えばα−ナフタレン酢酸あるいは３−インドール
酪酸２ｐｐｍ以下を含むものが用いられる。炭素源とし
てショ糖１〜２％を含むものが用いられる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】培地は、表１の無機塩類・ビタミンなどの
基本培地にＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＫＮＯ２、ＮＨ４
ＮＯ３を添加して、培地中の窒素・カリウム・燐の濃度
が表２に示すＥ１〜Ｅ６と称す培地を調整した。さらに
サイトカイニンとして６−ベンジルアデニン（ＢＡ
Ｐ）、オーキシンとしてα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
を０〜１０ｐｐｍの範囲で組み合わせてＰＨ５．６〜
５．８に調整した。いずれにもショ糖２％と寒天０．８
２％を加えた。
基本培地にＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、ＫＮＯ２、ＮＨ４
ＮＯ３を添加して、培地中の窒素・カリウム・燐の濃度
が表２に示すＥ１〜Ｅ６と称す培地を調整した。さらに
サイトカイニンとして６−ベンジルアデニン（ＢＡ
Ｐ）、オーキシンとしてα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
を０〜１０ｐｐｍの範囲で組み合わせてＰＨ５．６〜
５．８に調整した。いずれにもショ糖２％と寒天０．８
２％を加えた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】Ｅ１，Ｅ５培地では、１〜２の苗条が形成
されたにとどまり効率的ではなかった。Ｅ２，Ｅ３，Ｅ
４，Ｅ６培地で形成された不定苗条は、初代培養から７
週目に各々同一組成（植物生長調節物質も同一）の新し
い培地に移植し、同一の条件で培養した。移植後、２〜
３週間経過すると、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡＰ０．２〜
３．０ｐｐｍ及びＮＡＡ ０〜５．０ｐｐｍ添加した組
成では形成された不定苗条から新たな茎葉が発生し、不
定苗条は以後移植をすることで増殖を続け、最初に形成
された茎葉は伸長した。不定苗条の増殖は、分割して植
え継ぐと１ケ月に約４倍の茎葉数になった。従って１年
間に苗として１０００万本以上生産される。
されたにとどまり効率的ではなかった。Ｅ２，Ｅ３，Ｅ
４，Ｅ６培地で形成された不定苗条は、初代培養から７
週目に各々同一組成（植物生長調節物質も同一）の新し
い培地に移植し、同一の条件で培養した。移植後、２〜
３週間経過すると、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡＰ０．２〜
３．０ｐｐｍ及びＮＡＡ ０〜５．０ｐｐｍ添加した組
成では形成された不定苗条から新たな茎葉が発生し、不
定苗条は以後移植をすることで増殖を続け、最初に形成
された茎葉は伸長した。不定苗条の増殖は、分割して植
え継ぐと１ケ月に約４倍の茎葉数になった。従って１年
間に苗として１０００万本以上生産される。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】Ｅ４，Ｅ６では植物生長調節物質の添加量
に関わりなくカルス化した。しかしＥ４，Ｅ６培地で初
代培養時形成された不定苗条は、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡ
Ｐ０．２〜３．０ｐｐｍ及びＮＡＡ ０〜５．０ｐｐｍ
添加した培地に移植するとカルス化は見られず、新たな
茎葉が発生し、不定苗条は以後移植をすることで増殖を
続けた。また、形成された不定苗条は、植物生長調節物
質を添加していないＥ２，Ｅ３培地に移植すると各々の
茎葉は伸長した。
に関わりなくカルス化した。しかしＥ４，Ｅ６培地で初
代培養時形成された不定苗条は、Ｅ２，Ｅ３培地にＢＡ
Ｐ０．２〜３．０ｐｐｍ及びＮＡＡ ０〜５．０ｐｐｍ
添加した培地に移植するとカルス化は見られず、新たな
茎葉が発生し、不定苗条は以後移植をすることで増殖を
続けた。また、形成された不定苗条は、植物生長調節物
質を添加していないＥ２，Ｅ３培地に移植すると各々の
茎葉は伸長した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】再生された植物体についてクローンの確認
を行った。一つの生長点に由来する植物体は、外部形態
上に差異はなく生長性も均一であった。ついでアイソザ
イム分析は、白石の方法（林木育種、１４２：２３〜２
５、１４３：３４〜３８）に従って行った。検出した酵
素種は、ホスホグルコムダーゼ、ホスホグルコイソメラ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、グルコース−
６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、フマラー
ゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、グルセリン酸脱
水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、シキミ酸脱水素酵
素の１０酵素である。各酵素種ごとにアイソザイムのバ
ンドパターンを比較した結果、全酵素種において供試個
体はすべて同じバンドパターンであり、同一クローンで
あった。図１に６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイ
ソザイムバンドパターンを示す。
を行った。一つの生長点に由来する植物体は、外部形態
上に差異はなく生長性も均一であった。ついでアイソザ
イム分析は、白石の方法（林木育種、１４２：２３〜２
５、１４３：３４〜３８）に従って行った。検出した酵
素種は、ホスホグルコムダーゼ、ホスホグルコイソメラ
ーゼ、６−ホスホグルコン酸脱水素酵素、グルコース−
６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、フマラー
ゼ、アスパラギン酸アミノ基転移酵素、グルセリン酸脱
水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、シキミ酸脱水素酵
素の１０酵素である。各酵素種ごとにアイソザイムのバ
ンドパターンを比較した結果、全酵素種において供試個
体はすべて同じバンドパターンであり、同一クローンで
あった。図１に６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイ
ソザイムバンドパターンを示す。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地で形成された
不定苗条は、Ｅ３培地にＫ０．２〜３．０とＮＡＡ ０
〜５ｐｐｍを添加した培地に移植すると不定苗条から新
たな茎葉が発生し、不定苗条は以後移植をすることで増
殖を続け、最初に形成された茎葉は伸長した。
不定苗条は、Ｅ３培地にＫ０．２〜３．０とＮＡＡ ０
〜５ｐｐｍを添加した培地に移植すると不定苗条から新
たな茎葉が発生し、不定苗条は以後移植をすることで増
殖を続け、最初に形成された茎葉は伸長した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４９】培地は、実施例１に示すＥ３，Ｅ４，Ｅ５
と称す培地にサイトカイニンとしてカイネチン（Ｋ）、
オーキシンとしてＮＡＡを０〜１０ｐｐｍの範囲で組み
合わせて調整した。いずれにもショ糖２％を加えｐＨ
５．６〜５．８に調整し、試験管（径３０ｍｍ長さ２０
０ｍｍ）に２５ｍｌ分注した。培養条件は、温度２５℃
±１℃、１００００ルクス・１６時間照明（８時間暗
黒）で１分間２回転で行った。
と称す培地にサイトカイニンとしてカイネチン（Ｋ）、
オーキシンとしてＮＡＡを０〜１０ｐｐｍの範囲で組み
合わせて調整した。いずれにもショ糖２％を加えｐＨ
５．６〜５．８に調整し、試験管（径３０ｍｍ長さ２０
０ｍｍ）に２５ｍｌ分注した。培養条件は、温度２５℃
±１℃、１００００ルクス・１６時間照明（８時間暗
黒）で１分間２回転で行った。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５１】Ｅ２，Ｅ３，Ｅ４，Ｅ６培地で形成された
苗条原基は、初代培養から４週目に、寒天０．８２％を
加えた同一組成の固定培地に移植し、温度２５℃±１
℃、１０００ルクス・１６時間照明（８時間暗黒）で静
置培養した。移植後、２週間経過すると苗条原基から苗
条の発生が観察され不定苗条を形成した。
苗条原基は、初代培養から４週目に、寒天０．８２％を
加えた同一組成の固定培地に移植し、温度２５℃±１
℃、１０００ルクス・１６時間照明（８時間暗黒）で静
置培養した。移植後、２週間経過すると苗条原基から苗
条の発生が観察され不定苗条を形成した。
【手続補正書】
【提出日】平成５年３月２２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１により再生された植物体につ
いての６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイソザイム
バンドパターンを示す電気泳動写真である。
いての６−ホスホグルコン酸脱水素酵素のアイソザイム
バンドパターンを示す電気泳動写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 吉岡 英敏 山口県岩国市桂町２丁目６−８−104 (72)発明者 村上 邦睦 山口県岩国市飯田町２丁目３−３
Claims (17)
- 【請求項１】 ユーカリプタス グロブラス（E.globul
us）の生長点および生長点を含む組織を無機塩類および
植物成長調節物質を含む人工液体培地で照明下、回転培
養することで苗条原基を、あるいは人工固定培地で照明
下、静置培養することにより、不定苗条を各々誘導さ
せ、苗条原基は静置培養へ移植することで不定苗条を誘
導し、ついで不定苗条を前記の人工培地より無機塩類お
よび植物生長調節物質の濃度低減させた人工培地に移植
することで効率的に不定苗条を増殖させ、ついで増殖し
た不定苗条をさらに前記の人工培地より無機塩類濃度を
低減させ、植物生長調節物質を含む人工培地に移植する
ことで、植物体に再生させることを特徴とするE.globul
usの生長点培養によるクローン苗の生産方法。 - 【請求項２】 請求項１記載のユーカリプタス グロブ
ラス（E.globulus）の生長点および生長点を含む組織よ
り苗条原基を誘導する工程。 - 【請求項３】 請求項１記載のユーカリプタス グロブ
ラス（E.globulus）の生長点および生長点を含む組織よ
り不定苗条を誘導する工程。 - 【請求項４】 請求項１記載の苗条原基から不定苗条を
誘導する工程。 - 【請求項５】 請求項１記載の不定苗条を増殖させる工
程。 - 【請求項６】 請求項１記載の不定苗条を植物体に再生
する工程。 - 【請求項７】 ユーカリプタス グロブラス（E.globul
us）の生長点および生長点を含む組織を無機塩類中の各
々の合計濃度がカリウム25mM、窒素25mM、燐１mMからカ
リウム75mM、窒素75mM、燐２mMまでの濃度範囲を含む人
工液体培地で回転培養することにより苗条原基を誘導す
ることを特徴とする請求項１記載の工程。 - 【請求項８】 ユーカリプタス グロブラス（E.globul
us）の生長点および生長点を含む組織を無機塩類中の各
々の合計濃度がカリウム25mM、窒素25mM、燐１mMからカ
リウム75mM、窒素75mM、燐２mMまでの濃度範囲を含む人
工固定培地で静置培養することにより不定苗条を誘導す
ることを特徴とする請求項１記載の工程。 - 【請求項９】 人工培地中の植物生長調節物質がサイト
カイニンとオーキシンの少なくとも両者を一種ずつ含む
人工液体培地あるいは人工固定培地である請求項１また
は請求項７記載および請求項８記載の工程。 - 【請求項１０】 サイトカイニンの濃度が 0.2〜5.0pp
m、オーキシンの濃度が０〜8.0ppmの範囲であることを
特徴とする請求項９記載の工程。 - 【請求項１１】 誘導された苗条原基を同一組成の人工
固定培地へ移植して静置培養することにより不定苗条を
誘導する請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 誘導された不定苗条を無機塩類中の各
々の合計濃度がカリウム50mM、窒素50mM、燐１mM以下に
調製した人工培地で培養することにより、不定苗条を増
殖させる請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 人工培地中の植物生長調節物質がサイ
トカイニンとオーキシンの少なくとも両者を一種ずつ含
む固定培地である請求項１または請求項12記載の工程。 - 【請求項１４】 サイトカイニンの濃度が 0.2〜3.0pp
m、オーキシンの濃度が０〜5.0ppmの範囲であることを
特徴とする請求項13記載の工程。 - 【請求項１５】 誘導された不定苗条を無機塩類中の各
々の合計濃度がカリウム25mM、窒素25mM、燐１mM濃度以
下に調製した人工培地で培養することにより、植物体に
再生させる請求項１記載の工程。 - 【請求項１６】 人工培地中の植物生長調節物質がオー
キシンの一種を含む固定培地である請求項15記載の工
程。 - 【請求項１７】 オーキシンの濃度が２ppm 以下である
請求項16記載の工程。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4309346A JP2696465B2 (ja) | 1992-10-23 | 1992-10-23 | ユーカリプタス グロブラスの大量クローン増殖方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4309346A JP2696465B2 (ja) | 1992-10-23 | 1992-10-23 | ユーカリプタス グロブラスの大量クローン増殖方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06133657A true JPH06133657A (ja) | 1994-05-17 |
| JP2696465B2 JP2696465B2 (ja) | 1998-01-14 |
Family
ID=17991908
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4309346A Expired - Fee Related JP2696465B2 (ja) | 1992-10-23 | 1992-10-23 | ユーカリプタス グロブラスの大量クローン増殖方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2696465B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003049385A (ja) * | 2001-08-03 | 2003-02-21 | Nippon Paper Industries Co Ltd | 新聞用紙 |
| JP2003049386A (ja) * | 2001-08-03 | 2003-02-21 | Nippon Paper Industries Co Ltd | 印刷用紙 |
| JP2007000057A (ja) * | 2005-06-22 | 2007-01-11 | Nippon Paper Industries Co Ltd | ユーカリ属植物の組織培養方法及びクローン苗生産方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6255020A (ja) * | 1985-09-04 | 1987-03-10 | 王子製紙株式会社 | 木本性植物の大量増殖法 |
-
1992
- 1992-10-23 JP JP4309346A patent/JP2696465B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6255020A (ja) * | 1985-09-04 | 1987-03-10 | 王子製紙株式会社 | 木本性植物の大量増殖法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003049385A (ja) * | 2001-08-03 | 2003-02-21 | Nippon Paper Industries Co Ltd | 新聞用紙 |
| JP2003049386A (ja) * | 2001-08-03 | 2003-02-21 | Nippon Paper Industries Co Ltd | 印刷用紙 |
| JP4738662B2 (ja) * | 2001-08-03 | 2011-08-03 | 日本製紙株式会社 | 新聞用紙 |
| JP2007000057A (ja) * | 2005-06-22 | 2007-01-11 | Nippon Paper Industries Co Ltd | ユーカリ属植物の組織培養方法及びクローン苗生産方法 |
| JP4701019B2 (ja) * | 2005-06-22 | 2011-06-15 | 日本製紙株式会社 | ユーカリ属植物の組織培養方法及びクローン苗生産方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2696465B2 (ja) | 1998-01-14 |
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