JPH06113894A - 電解質測定試薬のα−アミラーゼ安定化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 α−アミラーゼを利用してカルシウム、塩素
イオン等の電解質を測定する試薬に用いられるα−アミ
ラーゼの安定化剤であって、単糖１〜３個が結合した
糖、単糖が環状に５〜１０個結合した糖、グルコース、
マルトース、マルトトリオース、α−シクロデキストリ
ン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキスト
リンなどから選ばれる少なくとも１種類の少糖類から選
択されることを特徴とする。 【効果】 α−アミラーゼの安定性が増大し、α−アミ
ラーゼを利用する電解質測定試薬の保存性が大巾に向上
するので要時調製の煩雑さのない試薬により体液中の電
解質を精度良く簡単に定量することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はα−アミラーゼの安定化
剤に関する。さらに詳しくは、α−アミラーゼを利用し
て電解質を測定する試薬に用いられる、少糖類から選択
されるα−アミラーゼの安定化剤に関する。

【０００２】

【発明の背景】体液中（血液、尿等）の電解質の濃度
は、ホメオタシスにより通常は厳密に管理されている。
しかしながら、これらの濃度は種々の原因により変化す
る事もよく知られていて、電解質の濃度変化を測定し、
その原因を判断することが臨床検査の場では日常的に行
なわれている。例えば、カルシウムの場合、低カルシウ
ム血症としては、低蛋白血症、低リン血症、腎炎、ネフ
ローゼ、ビタミンＤ欠乏症、副甲状腺機能低下症、クル
病等の疾患、高カルシウム血症としては、骨腫瘍、アジ
ソン病、肺気腫、副甲状腺機能亢進症、腎不全等の疾患
の可能性がある。

【０００３】本発明者らは、先にα−アミラーゼを用い
た体液中のカルシウムの測定法を提案している（特願平
2-1379号）。この方法は、カルシウムによりα−アミラ
ーゼが活性化されることを利用し、分解された糖基質を
測定することにより、体液中のカルシウムを定量するも
のである。α−アミラーゼは、その活性発現に必要なカ
ルシウムをそれ自体に含むため、前記の方法では、キレ
ート剤によりα−アミラーゼをあらかじめトラップし、
不活化している。そのため、α−アミラーゼが不安定と
なり長期の保存ができないこと、測定値にばらつきが出
ること等の欠点を有していた。

【０００４】また、キレート剤によってカルシウムを失
い、不活性状態のα−アミラーゼが、カルシウムを取り
込んで再度活性化されるためには、塩素イオンの存在が
必須であり、その活性化の度合は、塩素イオン濃度に比
例することが知られている（最新検査, 6 (6) 363,(198
9); The Chemical Times, 2, 32 (1989)）。このことを
利用した体液中の塩素イオン濃度の測定法も実用化され
ている（メルクオートＣｌキット、関東化学社製）。

【０００５】

【従来の技術】α−アミラーゼを安定化する方法は、い
くつか知られており、例えば、カルシウムイオンを加え
る方法、塩素イオンを加える方法、アルブミンを加える
方法（臨床病理, 37 (10) 1155,(1990) ）、アミノ酸を
加える方法（特開昭51-26284号）、酸のアルカリ金属塩
等を加える方法（特開昭57-29286号）、メチオニンを加
える方法（特開昭63-17690号）、アルミニウム塩を加え
る方法（特開平1-104173号）等が挙げられる。

【０００６】しかし、これらの方法は、カルシウムを除
去して不安定になったα−アミラーゼを完全に安定化す
るには不十分であり、また金属イオン等の使用は測定対
象が微量のカルシウムであるために、測定に影響を及ぼ
すおそれがあり好ましくない。カルシウムは測定対象で
あるため、当然安定化のためには使用することはできな
い。さらに、アルブミン、アミノ酸、メチオニン等を加
える方法は、腐敗のおそれがあるため好ましいものでは
ない。

【０００７】

【発明の構成】上記のような状況に於て、体液中の電解
質（特にカルシウム、塩素イオン）測定に用いることの
できるα−アミラーゼの安定化方法を鋭意検討した結
果、本発明者らは少糖類を添加することによってα−ア
ミラーゼが長期にわたって安定化され、またカルシウム
の測定に於いてもなんら影響が出ないことを見いだし、
本発明を完成した。すなわち、本発明はα−アミラーゼ
を利用して電解質を測定する試薬に用いられる、少なく
とも１種類の少糖類から選択されることを特徴とするα
−アミラーゼの安定化剤である。

【０００８】本発明でいう少糖類とは、単糖が１個〜３
個結合したものおよび単糖が環状に５個〜１０個結合し
たものをいう。単糖としては、グルコース、フルクトー
ス、ガラクトース等が挙げられるが、好ましくは、グル
コースである。少糖類の具体例としては、例えば、マル
トース、マルトトリオース、グルコース、α−シクロデ
キストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキ
ストリンが挙げられる。マルトース、マルトトリオー
ス、グルコースを使用する場合には、α−アミラーゼ１
国際単位に対して0.02〜１００μモルの範囲で、好まし
くは、１〜１００μモルの範囲で用いられる。

【０００９】α−、β−またはγ−シクロデキストリン
を使用する場合には、α−アミラーゼ１国際単位に対し
て0.001 〜１００μモルの範囲で、好ましくは、0.002
〜５０μモルの範囲で用いられる。これらの少糖類は、
単独で用いてもよいし、複数組合わせて用いてもよい。
本発明において安定化の対象となるα−アミラーゼはそ
の由来を問わず、豚膵臓、菌由来などいかなるものでも
よい。

【００１０】また、本発明の安定化剤の使用ｐＨ域は、
４〜１０である。さらに、前述したα−アミラーゼによ
る塩素イオンの測定法においても、キレート剤を用いて
α−アミラーゼのカルシウムをトラップする原理は同じ
であり、不安定になったα−アミラーゼを安定化するの
に本発明の安定化剤が有効であることは、当業者であれ
ば容易に理解できることである。

【００１１】

【実施例】以下、本発明を実施例および比較例を挙げて
詳述するが、もちろん本発明はこれらの実施例に限定さ
れるものではない。

【００１２】実施例１：α−シクロデキストリンによる
α−アミラーゼの安定化 酵素試薬および基質試薬よりなる下記のようなカルシウ
ム測定用試薬を調製し、２５℃で１０日間保存した後、
既知濃度の酢酸カルシウム溶液を測定し、保存による影
響を調べた。

【００１３】 酵素試薬 豚膵臓由来α−アミラーゼ 4.8 Ｕ／ｍｌ トリス塩酸バッファー（ｐＨ7.5 ） ５０ｍＭ ドータイトＢＡＰＴＡ（キレート剤） 0.6 ｍＭ 塩化ナトリウム 0.2 Ｍ α−シクロデキストリン 0.15％

【００１４】 基質試薬 ２−クロロ−４−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトトリオース 0.75ｍＭ ＭＥＳバッファー（ｐＨ5.9 ） 0.3 Ｍ 塩化ナトリウム 0.2 Ｍ

【００１５】比較のため、上記の酵素試薬中のα−シク
ロデキストリンを除いた試薬を調製し、同様に保存後、
カルシウムの測定を行なった。なお、カルシウムの測定
は以下のように行なった。酵素試薬（３００μｌ）にサ
ンプルの酢酸カルシウム溶液（2.5, 5.0, 7.5, 10.0 お
よび12.5ｍＭ，１０μｌ）を加え、３７℃で５分静置
し、基質試薬（１５０μｌ）を添加し同温度で遊離され
た２−クロロ−４−ニトロフェノールの４１５ｎｍでの
吸光度変化を経時的に測定した。その結果を図１に
「＋」で示す。

【００１６】 実施例２：マルトースによるα−アミラーゼの安定化 実施例１で用いた酵素試薬のα−シクロデキストリンに
代えてマルトース（0.15Ｍ）を使用したほかは実施例１
と同様にして調製、保存した後カルシウムの測定を行な
った。その結果を図１に「◇」で示す。

【００１７】実施例３：マルトースおよびα−シクロデ
キストリン共存によるα−アミラーゼの安定化 実施例１で示した酵素試薬にさらにマルトース（0.15
Ｍ）を加えたものを調製し、実施例１と同様にして保存
後、カルシウムの測定を行なった。その結果を図１に
「△」で示す。

【００１８】比較例１：比較のため、実施例１の酵素試
薬中のα−シクロデキストリンを除いた試薬を調製し、
同様に保存後、カルシウムの測定を行なった。その結果
を図１に「×」で示す。図１から明らかなように、少糖
類を安定化剤として添加した実施例１から３の場合には
１０日の保存後も、酵素試薬を調製した後直ちに酢酸カ
ルシウム溶液を所定濃度加えて吸光度変化を測定した発
色度（図１中の□）に比較し、すべて８０％以上の活性
が得られ、特に実施例２および３では、９０％以上の活
性が得られ、少糖類には充分なα−アミラーゼの安定化
作用があることが分かる。

【００１９】 実施例４：少糖類によるα−アミラーゼの安定化 実施例１、２および３で調製し、２５℃で１０日間保存
した酵素試薬中のα−アミラーゼの活性を市販のα−ア
ミラーゼ活性測定試薬（ダイヤカラーＡＭＹレート、東
洋紡績（株）製）で測定し、その経時変化をみた。これ
らの結果を表１に示す。

【００２０】

【表１】

【００２１】少糖類を添加しない場合、保存後１０日目
では、７０％のα−アミラーゼ活性しかないのに対し、
少糖類を添加した実施例１から３では、１０日間の保存
後でも、すべて８０％以上α−アミラーゼの活性が残存
しており、特に実施例２および３では９０％以上の活性
が残存していた。

【００２２】

【発明の効果】本発明の安定化剤によりα−アミラーゼ
の安定性が増大するため、α−アミラーゼを利用してカ
ルシウムや塩素イオン等の電解質を測定する試薬の保存
性が大巾に向上し、電解質測定用試薬の長期保存が可能
となった。これにより、要時調製の煩雑さなしに体液中
の電解質を精度良く簡便に定量することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】少糖類としてα−シクロデキストリン（実施例
１）、マルトース（実施例２）、マルトースとα−シク
ロデキストリン（実施例３）を用い、それぞれ１０日保
存後既知濃度のカルシウム溶液を測定した検量線、少糖
類を添加せず同様に保存した後既知濃度のカルシウム溶
液を測定した検量線（比較例）、および安定化剤を用い
ずに調製直後に既知のカルシウム溶液を測定した検量線
を示す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 α−アミラーゼを利用して電解質を測定
   する試薬に用いられる、少なくとも１種類の少糖類から
   選択されることを特徴とするα−アミラーゼの安定化
   剤。
2. 【請求項２】 少糖類が、単糖１〜３個が結合した糖で
   ある請求項１記載の安定化剤。
3. 【請求項３】 少糖類が、単糖が環状に５〜１０個結合
   した糖である請求項１記載の安定化剤。
4. 【請求項４】 単糖がグルコースである請求項２または
   ３記載の安定化剤。
5. 【請求項５】 少糖類が、グルコース、マルトースまた
   はマルトトリオースである請求項１記載の安定化剤。
6. 【請求項６】 少糖類が、α−、β−またはγ−シクロ
   デキストリンである請求項１記載の安定化剤。
7. 【請求項７】 少糖類が、グルコース、マルトース、マ
   ルトトリオース、α−シクロデキストリン、β−シクロ
   デキストリンおよびγ−シクロデキストリンから選ばれ
   る複数の混合物である請求項１記載の安定化剤。
8. 【請求項８】 少糖類が、マルトースおよびα−シクロ
   デキストリンの混合物である請求項１記載の安定化剤。
9. 【請求項９】 電解質が、カルシウムである請求項１記
   載の安定化剤。
10. 【請求項１０】 電解質が、塩素イオンである請求項１
    記載の安定化剤。